Inligting

Sephadex kolom vir alfa-amilase

Sephadex kolom vir alfa-amilase


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek wil ru-alfa-amilase met kolomchromatografie suiwer. Ek gebruik 'n spehadex 75, maar om een ​​of ander rede kan ek geen inligting kry oor hoe om die suspensie te maak nie.

Ek kan vinnig tonne inligting vind oor hoe om 'n kolom te pak en te stoor, maar wat ek regtig wil weet, is hoeveel poeier en buffer moet ek saam meng?


Die '75' van Sephadex G-75 verwys na die water herwin waarde, wat gedefinieer word as die gram water wat by hidrasie van 1g droë poeier geabsorbeer word, vermenigvuldig met 10 (sien Reiland). Dus is die waterherwinningswaarde van Sephadex G-75 ongeveer 7.5ml. Hierdie waarde verwys slegs na die water vervat in die gel deeltjies en nie na die water wat buite die deeltjies in 'n gepakte jel (Reiland) vasgevang is. As 'n duimreël kan laasgenoemde syfer op 50% geskat word.

Dus... 1g droë Sephadex sal ongeveer 15 ml verpakte jel gee

Van hier af: 1 g swel tot 12-15 ml jel

Net 'n gedagte ... Is alfa-amilase in wisselwerking met Sephadex? Miskien 'dink' dit soos 'n substraat, en (omkeerbaar) daaraan bind of andersins interaksie hê om effekte bykomend tot gelfiltrasie te veroorsaak?


Sephadex G-25 DNA Graad

Geskik vir gebruik in die voorbereiding van spinkolomme vir die suiwering van DNA (≥ 10 basisse in lengte) van klein molekules deur SEC.

Sephadex G-25 DNA-graad SF is geskik vir gebruik in die voorbereiding van spinkolomme vir DNA-suiwering.

  • Vir suiwering van DNA (≥ 10 basisse in lengte) van klein molekules deur SEC
  • Getoets om reproduseerbare hoë herstel van DNA te verseker
  • Word gebruik in MicroSpin-kolomme en NAP-kolomme
  • Geskik vir navorsers wat verkies om hul eie kolomme vir nukleïensuursuiwering voor te berei

Sephadex G-25 is een van vyf verskillende G-tipes wat wissel van G-10 vir klein molekules tot G-75 vir groter molekules. Sephadex G-25 het 'n uitsluitingslimiet van ongeveer Mnr 5000, en wanneer dit in leë MicroSpin-kolomme verpak word, kan die resulterende ontsoutingkolomme gebruik word in 'n spinprotokol vir DNS- en oligo-suiwering van enige DNS langer as 10 basisse.

Sephadex G-50 is 'n goed-gevestigde grootte uitsluiting chromatografie hars vir ontsouting en buffer uitruiling van biomolekules > 30 000 molekulêre gewig, en met 'n spin protokol kan gebruik word vir DNA en oligo suiwering van molekules groter as 20 basisse in lengte.

Alternatiewelik kan Sephadex G-100 DNA Graad gebruik word. Sephadex G-100 DNA Graad het 'n uitsluitingslimiet van 25bp ds DNA.

Al hierdie Sephadex-tipes is dus hoogs geskik vir die suiwering van oligonukleotiede of klein DNA-fragmente na sintese of in etikettering toepassings.


Murphy, B.E.P., Natuur, 201, 679 (1964).

Murphy, B.E.P., Rec. Prog. Horm. Res., 25, 563 (1969).

Murphy, B.E.P., Acta Endocrinol., 64, Suppl. 147, 37 (1970).

Sjövall, J., Nystrom, E., en Haahti, E., Adv. Chromatog., 6, 119 (1968).

Eneroth, P., en Nystrom, E., Biochim. Biofis. Acta, 144, 149 (1967).

Mikhail, G., Wu, C. H., Ferin, M., en Van de Wiele, R. L., Steroïede, 15, 333 (1970).

Murphy, B.E.P., J. Clin. Endokrinol., 27, 973 (1967).

Ganjam, V.K., Currie, P.A., en Chan, T.H., J. Steroid Chem. (in die pers).


MicroSpin G-50 kolomme, vinnige suiwering van DNA wat skoonmaak vereis

Goeie produkopbrengs en suiwerheid word verkry met monstervolumes van 12-50 &muL. Hulle is geskik vir enige DNA groter as 20 basisse in lengte en sal nie ensieme verwyder of denatureer nie.

Die hars wat in hierdie kolomme gebruik word, Sephadex G-50 DNA Graad, kan vir 'n wye reeks toepassings gebruik word, insluitend ontsouting van DNA, bufferuitruiling en verwydering van nie-geïnkorporeerde nukleotiede vanaf eindgemerkte oligonukleotiede.

Sephadex G-50 is een van vyf verskillende G-tipes wat wissel van G-10 vir klein molekules tot G-75 vir groter molekules. Sephadex G-50 is 'n goed-gevestigde grootte uitsluiting hars vir ontsouting en buffer uitruiling van biomolekules > 30 000 molekulêre gewig, en met 'n spin protokol kan gebruik word vir DNA en oligo suiwering van molekules groter as 20 basisse in lengte.

Alternatiewelik kan Sephadex G-25 of Sephadex G-100 gebruik word. Sephadex G-25 het 'n uitsluitingslimiet van ongeveer Mnr 5000, en met 'n spin-protokol beteken dit dat dit vir enige DNA langer as 10 basisse lank gebruik kan word.

Sephadex G-100 DNA Graad het 'n uitsluitingslimiet van 25bp ds DNA.

Al hierdie Sephadex-tipes is dus geskik vir die suiwering van oligonukleotiede of klein DNA-fragmente na sintese of 'n merkerreaksie.


NICK-kolomme

Word gebruik vir die suiwering van nick-getransleerde DNA-fragmente en vir die skeiding van enige gemerkte sonde van nie-geïnkorporeerde gemerkte nukleotiede.

Kies Model

NICK-kolomme word gebruik vir die suiwering van nick-getransleerde DNA-fragmente en vir skeiding van enige gemerkte probe van nie-geïnkorporeerde gemerkte nukleotiede.

  • Vir vinnige suiwering van gemerkte DNA (≥ 20 basisse in lengte) vanaf nie-geïnkorporeerde radio-gemerkte nukleotiede deur gravitasievloeichromatografie
  • Vooraf verpak met Sephadex G-50 DNA Graad (sienSephadex G-50 DNA Graad en Sephadex G-100 DNA Graad) in gedistilleerde water met 0,15% Kathon CG/ICP Biocide
  • Kan monstervolumes tot 100 μl akkommodeer

NICK-kolomme is gereed vir onmiddellike gebruik en werk deur swaartekragvloei. Toetse toon dat ten minste 97% van radioaktiwiteit wat in 'n nick-vertaalde mengsel toegedien word, elueer in twee goed geskeide pieke, wat ooreenstem met onderskeidelik gemerkte DNA-molekules en nie-geïnkorporeerde nukleotiede. Minstens 90% van die toegediende DNS word herwin en kan dan in DNS-hibridisasieprotokolle gebruik word. Maksimum monstervolume is 100 &muL.

Nick-vertaling is 'n tegniek waarin DNA-polimerase I gebruik word om sommige van die nukleotiede van 'n DNA-volgorde met hul gemerkte analoë te vervang, wat 'n gemerkte DNA-volgorde skep wat as 'n probe in fluoresserende in situ hibridisasie (FISH) of kladtegnieke gebruik kan word . Dit kan ook gebruik word vir radioaktiewe etikettering in tegnieke soos Southern blotting.

Hierdie proses word nick-translasie genoem omdat die DNA wat gemerk moet word met DNase behandel word om enkelstrengige "nicks te produseer." Dit word gevolg deur vervanging in nick-plekke deur DNA-polimerase I, wat die 3' einde verleng, wat nukleotiede met 5&# verwyder 39-3' eksonuklease-aktiwiteit, en vervang hulle met dNTP's. Om 'n DNA-fragment te merk vir gebruik as 'n probe in klad word een van die ingeboude nukleotiede wat in die reaksie voorsien word, radio-gemerk, of 'n fluorofoor kan in plaas daarvan geheg word vir fluoresserende etikettering, of word gebruik as 'n antigeen vir immunodeteksie.

Sephadex G-50 DNA Graad kan in 'n wye reeks toepassings gebruik word, insluitend ontsouting van DNA, bufferuitruiling en verwydering van nie-geïnkorporeerde nukleotiede vanaf eindgemerkte oligonukleotiede. Sephadex G-50 kan in leë MicroSpin-kolomme verpak word vir gebruik in hierdie toepassings.

Sephadex G-50 is een van vyf verskillende G-tipes wat wissel van G-10 vir klein molekules tot G-75 vir groter molekules. Sephadex G-50 is 'n goed gevestigde gel filtrasie hars vir ontsouting en buffer uitruiling van biomolekules > 30 000 molekulêre gewig, en met 'n spin protokol kan gebruik word vir DNA en oligo suiwering van molekules groter as 20 basisse in lengte. Alternatiewelik kan Sephadex G-25 gebruik word. Sephadex G-25 het 'n uitsluitingslimiet van ongeveer Mnr 5000, en met 'n spin-protokol beteken dit dat dit vir enige DNS langer as 10 basisse lank gebruik kan word.

Beide tipes Sephadex is dus uiters geskik vir die suiwering van oligonukleotiede of baie klein DNA-fragmente na sintese of in radioaktiewe etikettering.


Fisiologie en Molekulêre Biologie van die Relaxin Peptide Familie

Ontspan

Gelfiltrering van sog-ovariumekstrakte het die eerste aanduiding gegee dat relaxien oorspronklik in voorlopervorms gesintetiseer word en dat die vermeende relaxienvoorlopers groter is as preproinsulien en proinsulien (146, 147). Vervolgens het Kwok et al. (147) het gerapporteer dat 'n klein gedeelte van die relaxin in 'n suur-asetoon uittreksel van vark eierstokke geassosieer is met 'n biologies aktiewe fraksie wat 'n oënskynlike molekulêre gewig van 19,000 Da gehad het. In beide studies het behandeling van die groot, relaxien-agtige fraksie met die proteolitiese ensiem tripsien blykbaar die vermeende voorloper na 6 000-Da relaxin omskep. Gast en medewerkers (148, 149) het gepostuleer dat 23,000-Da preprorelaxin die primêre translasieproduk is en dat die eerste stap in relaxien-biosintese die membraanafhanklike splitsing van 'n 3,000-Da-seinpeptied is om prorelaxin te vorm (148, 149) . 10). Daaropvolgende kloning van die rot-, vark- en menslike relaxiengene (8-11) het hierdie voorlopige werk bevestig en gedemonstreer dat relaxin, soos insulien, aanvanklik gesintetiseer word as 'n enkelketting preprohormoon met die volgende algehele struktuur: seinpeptied/B-ketting/ verbindende peptied/A-ketting, soos diagrammaties in Fig. 10 getoon. Die grootte verskil tussen relaxien en insulienvoorlopers is grootliks toe te skryf aan merkbare verskille in die lengtes van die verbindende C-peptiede. Die C-peptiede in vark (9) en rotrelaksien (8), byvoorbeeld, bevat 104 of 105 residue, onderskeidelik in vark en rot proinsulien, maar hulle bevat slegs ongeveer 30 residue (150). Die funksie van die C-peptied in relaxien is onbekend. Een funksie is vermoedelik om die vou van die voorlopers te rig sodat die korrekte disulfiedbindings tussen die B- en A-kettings gevorm word. Studies wat egter 'n mutante menslike relaxien in gis (151) of Escherichia coli (152) met verbindende peptiede van slegs 6 of 13 aminosure, onderskeidelik, is gedemonstreer om gevoude bioaktiewe relaxienpeptiede te produseer. Daar is gepostuleer dat die C-peptied peptiedvolgordes met hormonale aktiwiteite kan bevat (8, 90), maar daar is geen eksperimentele bewyse om dit te ondersteun nie.

FIG. 10 . Skematiese opsomming van die verwerking van varkpreprorelaksien na relaxien deur die opeenvolgende verwydering van die seinpeptied (S) en die verbindende peptied (C) deur proteolitiese vertering.

(Gewysig vanaf Kemp, B. E., en Niall, H. D. [1984]. Relaxin. Vitam. Horm. 41, 79–115, met toestemming.) Kopiereg © 1984

Alhoewel prorelaksienproteïene gedemonstreer is om bioaktief te wees (153-156), en wel in die plasma in sommige spesies sirkuleer [bv. mense (152)], is dit nie bekend of hulle 'n biologiese funksie het nie. Generering van volwasse relaxienpeptiede vereis splitsing van die C-peptied, en hierdie proses is minder goed gedefinieer vir prorelaksien en blyk minder streng beheer te word as met proinsulien. Baie relaxiene bevat dibasiese residue by óf die B/C- óf C/A-aansluitings wat waarskynlik splitsing rig, hoewel ander nie. Sommige relaxiene bevat eintlik 'n motief by hul B/C of C/A ketting aansluitings wat 'n konsensus motief is vir die proproteïen convertase furien (R-X-K/R-R) (157). Daarteenoor blyk dit dat splitsing by die C-terminus van die B-ketting in vark- en rotrelaksien 'n ensiem met chymotripsien-agtige spesifisiteit vereis wat die neutrale alifatiese sykettings van leusien by posisie 32 (32 Leu) in prorelaksien herken (9). As dit die geval is met varkrelaksien, moet daaropvolgende splitsing van drie aminosure plaasvind om die oorheersende B29-vorm te gee (65, 66). Hudson et al. (11) het oorspronklik voorgestel dat H2 relaxin ook verwerk is deur 'n chymotrypsien-agtige ensiem by 32 Leu, maar H2 relaxin geïsoleer uit die corpus luteum van swangerskap is 'n B29 vorm (158). Daaropvolgende studies wat H2 relaxin saam met muriene prohormoon convertase 1 (PC1) saam uitdruk, het produksie van outentieke B29 relaxin getoon, terwyl uitdrukking sonder PC1 slegs tot prohormoonproduksie gelei het (159). Die skrywers het gepostuleer dat 'n soortgelyke ensiem in menslike luteale selle kan bestaan ​​en dat die resulterende basiese aminosure Lys-Arg op die C-terminus van die B-ketting later deur 'n karboksipeptase-ensiem in die luteale selle gesplit kan word. Dit is dus waarskynlik dat die splitsing van die prorelaxin C-peptied verskil tussen spesies.


MATERIALE EN METODES

Aan die begin van hierdie 3-week eksperiment dek 'n pre-lab bespreking in wese al die verskillende aspekte van die eksperiment. Ons gebruik 'n interne laboratoriumhandleiding soos die meeste gepubliseerde laboratoriumhandleidings, dit bevat aparte afdelings oor spektroskopie, chromatografie en elektroforese. Benewens dat die studente hierdie afdelings moet hersien, word die studente daaraan herinner om die proteïensuiwerings- en karakteriseringsafdelings wat in hul handboek gevind word, te hersien.

Periode 1, isolasie van ru-Mb en ondersoek na die redokseienskappe daarvan.

Periode 2, gedeeltelike suiwering van ru-Mb deur ioonuitruiling en gelpermeasiechromatografie.

Periode 3, SDS-BLADSY van ru- en gedeeltelik gesuiwerde monsters.

Periode 1—

In die eerste periode word die aanvanklike isolasie van Mb bewerkstellig deur die metode van Bylkas en Anderson [9] waarin 10,0 g varsgemaalde maer hamburger (verkieslik boonste ronde, met sy laer vetinhoud) in 20,0 ml van 20 mm opgeskort word, pH 5.6, kaliumfosfaat (KPi) 1 1 Die afkortings wat gebruik word is: KPi, kaliumfosfaat RP, relatiewe suiwerheid CMC, karboksimetielsellulose MW, molekulêre gewig. buffer. Hierdie suspensie word vir 20 minute by 20.0 °C gesentrifugeer by 10 000 × g (15 300 rpm met 'n Beckman JA-14 rotor). Die supernatant word dan deur glaswol gefiltreer, en die resulterende filtraat word deur 'n 0.45-μm spuitfilter gevoer. Volume word gemeet tot die naaste 0,1 ml, en totale mg proteïeninhoud word bepaal deur die uitsterwingskoëffisiënt by 595 nm te gebruik wat gegenereer word uit die reaksie van beeserumalbumien met die Bradford-reagens [10]. Die Bradford-reagens word voorberei deur 100 mg Coomassie Brilliant Blue G in 100 ml 95% etanol op te los, 100 ml 85% (w/v) fosforsuur by te voeg, tot 1.0 liter met water te verdun en te filter. Die standaardkurwe word voorberei soos in Tabel I getoon.

Die totale mg Mb word bepaal by 417 nm met behulp van 'n uitsterwingskoëffisiënt van K = 7.57 ml·mg −1 ·cm −1 (van berekeninge gebaseer op Verw. 9 ). Normaalweg word die term spesifieke aktiwiteit (totale eenhede ensiematiese aktiwiteit/mg totale proteïen) gebruik om die suiwering van 'n ensiem te volg. Aangesien Mb nie 'n ensiem is nie, het ons die term "relatiewe suiwerheid" aangeneem. Die relatiewe suiwerheid (R.P.) van die ru Mb oplossing (en daaropvolgende gesuiwerde fraksies) word gedefinieer as die totale mg Mb gedeel deur die totale mg proteïen. Gedurende die res van die periode ondersoek die studente die redokseienskappe van Mb met die reduseermiddel natriumditioniet en die oksideermiddel kaliumferrisianied wat breedvoerig deur Bylkas en Anderson [9] beskryf is. Basies behels dit die byvoeging van 'n paar klein kristalle van óf natriumditioniet óf kaliumferrisianied by afsonderlike 1,5 ml hoeveelhede van die ru Mb-supernatant. Die verminderde Mb-oplossing word dan 1 tot 8 verdun en van 300 tot 700 nm geskandeer. Hierdie prosedure verskil van dié van Bylkas en Anderson [9] deurdat die ontsoutingstap uitgeskakel word aangesien die reduseermiddel nie met die daaropvolgende spektra inmeng nie. Aangesien die kaliumferrisianied wel inmeng met die spektrale skanderings, word die geoksideerde Mb-oplossing onderwerp aan 'n ontsoutingstap waarin die 1,5 ml-oplossing by 'n ontsoutingskolom gevoeg word (10,0 ml ontgaste Sigma Sephadex G-25 wat met die 20 geëquilibreer is) mm , pH 5.6, KPi-buffer in 'n 12-cm × 1.5-cm binnedeursnee Bio-Rad Econo-Pac-kolom). ’n 0.5-ml-aliquot van die voorste geelkleurige Mb-band word versamel, 1 tot 6 verdun met die KPi-buffer, en van 300 tot 700 nm geskandeer. Oorblywende Mb-oplossings word gemerk en gevries tot die volgende laboratoriumperiode.

Periode 2—

Bevrore ru Mb oplossings word ontdooi, en 5,0 ml word deur 'n 0,45-μm spuitfilter gefiltreer. vooraf-geëquilibreerde karboksimielsellulose (CMC) kolom (10.0 ml van gedefinieerde Sigma CMC in 'n 12-cm × 1.5-cm binnedeursnee Bio-Rad Econo-Pac kolom) met 'n 20 mm, pH 5.6, KPi buffer. Tydens hierdie ekwilibrasiestap word die aantal druppels om 2,0 ml te versamel, bepaal. 'n Tweede groeplid ekwilibreer 'n vooraf-gegote, ontgaste, vooraf-geëquilibreerde Sephadex G-75-kolom (~38.0 ml ontgaste Sigma G-75–120 in 'n Bio-Rad 50.0-cm × 1.0-cm binnedeursnee Econo- Kolom tot 'n hoogte van ~48.0 cm) met 'n 20 mm KPi, 0.10 m KCl, pH 5.6, buffer. Die kophoogte van hierdie buffer word konstant gehou op 2.0 cm bokant die G-75 kolommateriaal sodat die vloeitempo bepaal kan word. Daarbenewens word die aantal druppels om 1,0 ml te versamel bepaal.

Ru-Mb (1,0 ml) word op die CMC gepipetteer en toegelaat om die CMC-matriks binne te gaan. Een kolomvolume (~10.0 ml) van die 20 m m , pH 5.6, KPi-buffer word dan by die CMC-kolom gevoeg, en 2.0 ml fraksies word versamel. Nadat al die KPi-buffer die kolom binnegekom het, word 'n 20 m m Tris, pH 7.5, buffer bygevoeg, en 2.0 ml fraksies word versamel totdat al die rooi kleur (Mb) wat deur die kolom beweeg, geëlueer is. By elke versamelde fraksie word 2.0 ml gedistilleerde of molekulêre biologie graad water gevoeg. Absorbansie by 417 en 280 nm word gemeet vir elke breuk drie opeenvolgende breuke met die hoogste A417/A280 verhouding word saamgevoeg, en die gekombineerde volume vir hierdie saamgevoegde fraksies (gemerkte CMC-fraksie) word bepaal. Die totale Mb en totale proteïen in die saamgevoegde CMC fraksie word bepaal soos hierbo beskryf. Benewens die bepaling van die R.P., 'n dubbel Y plot van A417 en A280 versus breukgetal gekonstrueer word. Die saamgevoegde CMC-fraksie word vir die volgende tydperk gevries.

Nadat die vloeitempo (tipies 0,3–0,7 ml/min) bepaal is, word 1,0 ml van die ru-Mb op die bokant van die G-75-kolom gepipetteer en toegelaat om die kolommatriks 20 mm KPi, 0,10 m KCl, pH 5,6, binne te gaan. buffer word by die kolom gevoeg tot 'n vlak 2.0 cm bokant die jelmatriks. Terwyl 'n konstante bufferkophoogte gehandhaaf word, word 1.0-ml fraksies versamel totdat al die rooi kleur (Mb) geëlueer is. By elke versamelde fraksie word 1,5 ml gedistilleerde of molekulêre biologie graad water gevoeg. Absorbansie by 417 en 280 nm word vir elke breuk gemeet, en die drie opeenvolgende breuke met die hoogste A417/A280 verhouding word saamgevoeg, en die gekombineerde volume vir hierdie saamgevoegde fraksies (gemerk G-75 fraksie) word bepaal. Die totale Mb en totale proteïen in die saamgevoegde G-75 fraksie word bepaal soos hierbo beskryf. Benewens die bepaling van die R.P., 'n dubbele Y plot van A417 en A280 versus breukgetal gekonstrueer word. Die saamgevoegde G-75 fraksie word vir die volgende tydperk gevries.

Periode 3—

Berekeninge vir die ru-Mb, die CMC-fraksie en die G-75-fraksies word uitgevoer om die volume monster te bepaal wat nodig is om 10 μg totale proteïen te gee (sonder om 'n volume van 25 μl te oorskry). Tipies moet die ru-Mb-fraksie 1:10 verdun word (met ~3,3 μg by die SDS-PAGE-gel gevoeg), en die CMC- en G-75-fraksies word sonder verdunning gebruik aangesien 10 μg nie verkry kan word nie, en die werklike hoeveelheid proteïen in die 25 μl word bepaal. Alle monsters word tot 25 μl gemaak en word by 1.5-ml mikrofugbuise gevoeg. 50 μl Bio-Rad Laemmli monsterverdunner (wat die opsporingskleurstof bromfenolblou bevat) word by elke monster gevoeg. 'n Bio-Rad lae MW SDS-standaard wat ses proteïene bevat, 'n suiwer perdehart-mioglobienstandaard en 'n waterblanko word ook op dieselfde manier voorberei. Die blanko, standaarde en monsters word dan vir 5 min in 'n kookwaterbad geplaas. Bio-Rad Ready Gels (10 putte 4–15% T-gradiënt SDS-gels) en die elektroforese-apparaat word voorberei vir gebruik. Die gebruik van voorafgegote Bio-Rad gels verhoed blootstelling van die studente aan akrielamied, wat in die ongepolimeriseerde vorm 'n neurotoksien is. Leë, ru-Mb-fraksie, SDS MW-standaard en Mb-standaard (25 μl elk) en CMC- en G-75-fraksies (45 μl elk) word by die jel gevoeg twee groepe kan hul monsters op een jel plaas met een stel standaarde. Die elektroforese word voltooi in ~30 min by 'n konstante 200 V. Na elektroforese word die jel verwyder en gekleur in Coomassie Blue G-250 (0.04% (w/v) en 3.5% (w/v) perchloorsuur) vir 30 min en verder ontkleur oornag in 5.0% (v/v) asynsuur. Toepaslike metings van die proteïenbande op foto's van die gels wat met 'n Photodyne Visionary fotodokumentasiestelsel vasgevang is, word geneem, en 'n log MW versus relatiewe mobiliteit (Rm) standaardkromme gekonstrueer word.


Ioonuitruilchromatografie Harseleksie

Ioonuitruilchromatografieharse is saamgestel uit positief of negatief gelaaide funksionele groepe wat kovalent aan 'n vaste matriks gebind is. Algemene matrikse is sellulose, agarose, polimetakrilaat, polistireen en poliakrielamied. Laasgenoemde drie matrikse laat hoër vloeitempo's toe.

Verskeie faktore bepaal die keuse van hars:

Besluit tussen 'n anioonuitruiler en 'n katioonuitruiler

Vir baie proteïensuiweringswerkstrome is proteïenvou en stabiliteit 'n bekommernis. In hierdie scenario's hang die keuse van 'n anioon of 'n katioonuitruiler af van die proteïen van belang en stabiliteit.

Sommige proteïene is stabiel bo en onder hul pI. Hierdie proteïene kan met óf 'n anioon- óf katioonuitruiler gesuiwer word. Ander proteïene is slegs stabiel bo of onder hul pI. Vir hierdie proteïene dikteer stabiliteit harskeuse as 'n proteïen byvoorbeeld net bo sy pI stabiel is, moet 'n anioonuitruilhars gekies word. Wanneer proteïenstabiliteit nie kommerwekkend is nie, kan 'n anioon- of katioonuitruiler gebruik word.

Swak vs. Sterk ioonuitruilers

Ioonuitruilharse kom in twee tipes voor: sterk en swak.

Die aantal aanklagte op 'n sterk ioonwisselaar bly konstant ongeag die buffer pH. Hierdie tipe harse behou hul selektiwiteit en kapasiteit oor 'n wye pH-reeks. Voorbeelde van sterk ioonuitruilers is kwaternêre ammonium (Q), sulfonaat (S) en sulfopropyl (SP) harse.

Swak ioonuitruilers, daarenteen, vertoon pH-afhanklike funksie en lewer dus optimale werkverrigting oor slegs 'n klein pH-reeks. Wanneer die pH van die buffer nie meer ooreenstem met die suurdissosiasiekonstante (pKa) van die harsfunksionele groep nie, ly hierdie harse aansienlike kapasiteitsverlies. Swak anioonuitruilers funksioneer swak bo 'n pH van 9 en swak katioonuitruilers begin hul ionisasie onder pH 6 verloor. Wanneer daar met swak ioonuitruilharse soos diethylaminoethyl (DEAE) of carboxymethyl (CM) harse gewerk word, is dit belangrik om binne die verskaffer-verskafde werkende pH-reeks.

Ondersteuning DEAE Hoë Q CM Hoë S
Tipe ruil Swak anioon Sterk anioon Swak katioon Sterk katioon
Funksionele groep -N+(C2H5)2 -N+(CH3)3 - COO - -SO 3 -
pH-reeks* 5&ndash9 0&ndash14 5&ndash9 0&ndash14

* Gaan vervaardiger se instruksies na vir pH-reeks vir elke individuele hars. Proteïene van belang is dalk nie stabiel oor die volle pH-reeks nie.

Sterk ioonuitruilers is dikwels voorkeurharse vir baie toepassings omdat hul werkverrigting nie deur pH beïnvloed word nie. Swak ioonuitruilers kan egter kragtige skeidingsinstrumente wees in gevalle waar sterk ioonuitruilers misluk omdat die selektiwiteite van swak en sterk ioonuitruilers dikwels verskil.

Ioniese vorm van IEX-hars

Die ioniese vorm van 'n ondersteuning verwys na die teenioon wat op die hars se funksionele groepe geadsorbeer word. Hierdie ioon kan verander word deur die kolom-ekwilibrasiebuffer om te ruil. Algemene teenione vir anioon- en katioonuitruilers is onderskeidelik Na + en Cl -.

Die sterkte van die interaksie met 'n gegewe hars verskil vir verskillende teenione. Hoe laer die selektiwiteit van 'n teenioon vir die ondersteuning, hoe makliker kan dit omgeruil word vir 'n ander ioon met soortgelyke lading (byvoorbeeld die proteïen van belang). Net so sal elueringsbuffer wat 'n teenioon met 'n relatief laer selektiwiteit vir die ondersteuning bevat, minder maklik proteïene uit die kolomhars verplaas tydens eluering. In sommige gevalle kan hierdie verskil uitgebuit word, en teenione soos Li + , Br - en SO4 2- word dikwels gebruik om harselektiwiteit te verbeter.

Harspartikelgrootte

Harspartikelgrootte verwys na die grootte van die hars vaste ondersteuning. Deeltjiegrootte beïnvloed nie die selektiwiteit van die hars nie, maar dit beïnvloed wel resolusie.

Fig. 6. Verwantskap tussen harspartikelgrootte, druk en resolusie.

Kleiner deeltjies bied hoër resolusie, maar vereis tipies ook laer vloeitempo's. Hoë-resolusie media word algemeen gebruik vir analitiese en kleinskaalse werk sowel as vir die finale poleerstappe van voorbereidende chromatografie. Baie viskeuse monsters soos skoongemaak E coli lysate of monsters wat gliserol bevat, kan dikwels nie geskei word met behulp van klein-deeltjie IEX harse as gevolg van die verhoogde terugdruk van klein-deeltjie harse, wat die kolom & rsquos bedryfsdruk limiet kan oorskry.

Groter deeltjies laat hoër vloeitempo's toe, maar lewer laer resolusie. 'n Metode wat skerp, duidelike pieke lewer deur 'n klein-deeltjie IEX-hars te gebruik, sal breër, minder gedefinieerde pieke lewer wanneer 'n groter-deeltjie-hars gebruik word. Grootdeeltjie IEX-harse is 'n uitstekende keuse vir grootskaalse en voorbereidende werk. Groter deeltjiegroottes is ook die beste keuse wanneer monsters viskeus is, soos wanneer IEX as 'n eerste stap in 'n proteïensuiweringswerkvloei gebruik word.

Vloeitempo

Vloeitempo verwys na hoe vinnig buffer oor 'n hars gevoer word. Die vloeitempo bepaal dus die hoeveelheid tyd waarin proteïene in wisselwerking kan tree met die kolomhars, wat die genoem word verblyftyd van 'n spesifieke kolom teen 'n gegewe vloeitempo. Anders as deeltjiegrootte, beïnvloed vloeitempo beide resolusie en kapasiteit: langer verblyftye verhoog beide die kapasiteit en die resolusie van 'n hars.

Fig. 7. Effek van vloeitempo op IEX-resolusie. Skeiding van 'n 5 ml monster van mioglobien (piek 1), ribonuklease A (piek 2), en sitochroom c (piek 3) op 'n 1 x 13 cm (8.7 ml) Makro-Prep & reg High Q katioonuitruilkolom.

Vloeitempo's word nie net beperk deur die verlies aan resolusie en kapasiteit by hoër vloeitempo's nie, maar ook deur die hars self. Soos vloeitempo's toeneem, neem die druk op die hars toe. As die terugdruk te hoog is, kan dit die kolomhars verpletter. Vervaardigers verskaf dus 'n druklimiet vir al hul harse.

Oor die algemeen word die vinnigste vloeitempo wat steeds die verlangde kapasiteit en resolusie lewer, gekies. Alhoewel stadiger vloeitempo's selfs beter resolusie en kapasiteit kan verskaf, is dit dikwels ten koste van proteïenaktiwiteit, aangesien baie proteïene aktiwiteit met tyd verloor onder die toestande in die chromatografiesisteem.

Dinamiese bindingskapasiteit van hars

Die dinamiese bindingskapasiteit van 'n hars verwys na die hoeveelheid proteïen wat die hars teen 'n gegewe vloeitempo kan bind, dit word gewoonlik gerapporteer as mg/ml proteïen gebind teen 'n sekere vloeitempo. Hierdie waarde verskil van hars tot hars en kan belangrik wees wanneer vinnige vloeitempo's vereis word om proteïenaktiwiteit te handhaaf.


Sephadex kolom vir alfa-amilase - Biologie

Gelfiltrering (Sephadex) Chromatografie

Deel A: Die kolom is op 'n ringstaander gemonteer. 50mL Tris-buffer is bygevoeg terwyl die uitlaat is gesluit. Nou word die kolom gevul met 'n suspensie Sephadex G-75 (let daarop dat dit geroer moet word net voordat dit in die kolom gegooi word).

Deel B: Die sephadex het gesak en die uitlaat is net onder die bokant van die kolom vasgeplak en oopgemaak sodat buffer deur die kolom sal vloei. Let daarop dat die uitvloeisel stadig uit die uitlaat drup. Tydens deel C word die uitlaat verlaag om die drup te vertraag.

Deel C: Meer suspensie word gereeld bygevoeg, en hou die boonste oppervlak van die jel 1-2 cm onder dié van die kolom (ons monsterkolom is laer om dit meer sigbaar te maak). Let op 'n duidelike verskil tussen verpakte materiaal en onverpakte flodder. Videoskote is op verskeie punte tydens die verpakking geneem.

Deel D: Die bokant van die kolom is toe en die Mariotte-fles bokant die kolom word deur buise aan die bokant van die kolom gekoppel. Die kolom word met ongeveer 300 ml buffer gewas. Sodra die was voltooi is, word die kolomopstelling na die koelkamer geneem en oornag laat loop om te ewewig. Let wel: dit is noodsaaklik dat die kolom behoorlik opgestel word sodat dit nie uitdroog nie, veral as dit sonder toesig gelaat word. Die drukkop (spasie tussen die buffer en uitlaat) moet nooit meer as 20 cm wees.

Deel E: Die uitvloei is toe en die Mariotte-fles ontkoppel. Die doppie word afgehaal en die buffer bokant die jel word met 'n pipet verwyder.

Deel F: Die monster wat geloop moet word, word liggies gelaai deur 'n pasteurpipet te gebruik. Die punt van die pipet word teen die wand van die kolom gehou en in 'n sirkelbeweging beweeg sodat die monster stadig op die jelbed lê. MOENIE die pasteurpipet breek nie!

Deel G: Die monster word in die jelbed getrek. Let op die hoogte van die vloeistof verminder gedurende hierdie deel.

Nie gewys nie: Die kolom word 2-3 keer gewas met 2 ml hoeveelhede buffer. Sodra dit gewas is, word die uitlaat gesluit en die kolom word met buffer gevul. Die Mariotte-fles met 400-500 ml buffer is aangeheg. ’n Drukkop van 15 cm word gebruik. Die uitlaat is aan 'n outomatiese fraksieversamelaar gekoppel. Die kolom moet stadig loop en moet so opgestel word dat dit NIE uitdroog nie.


Individuele proteïen immunopresipitasie (IP) Edit

Behels die gebruik van 'n teenliggaam wat spesifiek is vir 'n bekende proteïen om daardie spesifieke proteïen te isoleer uit 'n oplossing wat baie verskillende proteïene bevat. Hierdie oplossings sal dikwels in die vorm van 'n ru-lisaat van 'n plant- of dierweefsel wees. Ander monstertipes kan liggaamsvloeistowwe of ander monsters van biologiese oorsprong wees.

Proteïenkompleks immunopresipitasie (Co-IP) Edit

Immunopresipitasie van ongeskonde proteïenkomplekse (d.w.s. antigeen saam met enige proteïene of ligande wat daaraan gebind is) staan ​​bekend as ko-immunopresipitasie (Co-IP). Co-IP werk deur 'n teenliggaam te kies wat 'n bekende proteïen teiken wat vermoedelik 'n lid van 'n groter kompleks van proteïene is. Deur dit te teiken bekend lid met 'n teenliggaam kan dit moontlik word om die hele proteïenkompleks uit oplossing te trek en sodoende te identifiseer onbekend lede van die kompleks.

Dit werk wanneer die proteïene wat by die kompleks betrokke is, styf aan mekaar bind, wat dit moontlik maak om verskeie lede van die kompleks uit oplossing te trek deur aan een lid met 'n teenliggaam vas te heg. Hierdie konsep om proteïenkomplekse uit oplossing te trek, word soms na verwys as 'n "aftrek". Co-IP is 'n kragtige tegniek wat gereeld deur molekulêre bioloë gebruik word om proteïen-proteïen-interaksies te ontleed.

  • 'n Spesifieke teenliggaam selekteer dikwels vir 'n subpopulasie van sy teikenproteïen wat die epitoop blootgestel het, en versuim dus om enige proteïene in komplekse te identifiseer wat die epitoop verberg. Dit kan gesien word deurdat dit selde moontlik is om selfs die helfte van 'n gegewe proteïen uit 'n monster met 'n enkele teenliggaam te presipiteer, selfs wanneer 'n groot oormaat teenliggaam gebruik word.
  • Soos opeenvolgende rondes van teiken en immunopresipitasies plaasvind, kan die aantal geïdentifiseerde proteïene aanhou groei. Die geïdentifiseerde proteïene bestaan ​​moontlik nooit in 'n enkele kompleks op 'n gegewe tydstip nie, maar kan eerder 'n netwerk van proteïene verteenwoordig wat op verskillende tye vir verskillende doeleindes met mekaar in wisselwerking is.
  • Deur die eksperiment te herhaal deur verskillende lede van die proteïenkompleks te teiken, kan die navorser die resultaat dubbel kontroleer. Elke rondte van aftrekkings moet lei tot die herstel van beide die oorspronklike bekende proteïen sowel as ander voorheen geïdentifiseerde lede van die kompleks (en selfs nuwe bykomende lede). Deur die immunopresipitasie op hierdie manier te herhaal, verifieer die navorser dat elke geïdentifiseerde lid van die proteïenkompleks 'n geldige identifikasie was. If a particular protein can only be recovered by targeting one of the known members but not by targeting other of the known members then that protein's status as a member of the complex may be subject to question.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) Edit

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a method used to determine the location of DNA binding sites on the genome for a particular protein of interest. This technique gives a picture of the protein–DNA interactions that occur inside the nucleus of living cells or tissues. Die in vivo nature of this method is in contrast to other approaches traditionally employed to answer the same questions.

The principle underpinning this assay is that DNA-binding proteins (including transcription factors and histones) in living cells can be cross-linked to the DNA that they are binding. By using an antibody that is specific to a putative DNA binding protein, one can immunoprecipitate the protein–DNA complex out of cellular lysates. The crosslinking is often accomplished by applying formaldehyde to the cells (or tissue), although it is sometimes advantageous to use a more defined and consistent crosslinker such as di-tert-butyl peroxide (DTBP). Following crosslinking, the cells are lysed and the DNA is broken into pieces 0.2–1.0 kb in length by sonication. At this point the immunoprecipitation is performed resulting in the purification of protein–DNA complexes. The purified protein–DNA complexes are then heated to reverse the formaldehyde cross-linking of the protein and DNA complexes, allowing the DNA to be separated from the proteins. The identity and quantity of the DNA fragments isolated can then be determined by polymerase chain reaction (PCR). The limitation of performing PCR on the isolated fragments is that one must have an idea which genomic region is being targeted in order to generate the correct PCR primers. Sometimes this limitation is circumvented simply by cloning the isolated genomic DNA into a plasmid vector and then using primers that are specific to the cloning region of that vector. Alternatively, when one wants to find where the protein binds on a genome-wide scale, ChIP-sequencing is used and has recently emerged as a standard technology that can localize protein binding sites in a high-throughput, cost-effective fashion, allowing also for the characterization of the cistrome. Previously, DNA microarray was also used (ChIP-on-chip or ChIP-chip).

RNP immunoprecipitation (RIP) Edit

Similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP) outlined above, but rather than targeting DNA binding proteins as in ChIP, an RNP immunoprecipitation targets ribonucleoproteins (RNPs). [1] Live cells are first lysed and then the target protein and associated RNA are immunoprecipitated using an antibody targeting the protein of interest. The purified RNA-protein complexes can be separated by performing an RNA extraction and the identity of the RNA can be determined by cDNA sequencing [2] or RT-PCR. Some variants of RIP, such as PAR-CLIP include cross-linking steps, which then require less careful lysis conditions.

Tagged proteins Edit

One of the major technical hurdles with immunoprecipitation is the great difficulty in generating an antibody that specifically targets a single known protein. To get around this obstacle, many groups will engineer tags onto either the C- or N- terminal end of the protein of interest. The advantage here is that the same tag can be used time and again on many different proteins and the researcher can use the same antibody each time. The advantages with using tagged proteins are so great that this technique has become commonplace for all types of immunoprecipitation including all of the types of IP detailed above. Examples of tags in use are the green fluorescent protein (GFP) tag, glutathione-S-transferase (GST) tag and the FLAG-tag tag. While the use of a tag to enable pull-downs is convenient, it raises some concerns regarding biological relevance because the tag itself may either obscure native interactions or introduce new and unnatural interactions.

The two general methods for immunoprecipitation are the direct capture method and the indirect capture method.

Direkte wysiging

Antibodies that are specific for a particular protein (or group of proteins) are immobilized on a solid-phase substrate such as superparamagnetic microbeads or on microscopic agarose (non-magnetic) beads. The beads with bound antibodies are then added to the protein mixture, and the proteins that are targeted by the antibodies are captured onto the beads via the antibodies in other words, they become immunoprecipitated.

Indirekte wysig

Antibodies that are specific for a particular protein, or a group of proteins, are added directly to the mixture of protein. The antibodies have not been attached to a solid-phase support yet. The antibodies are free to float around the protein mixture and bind their targets. As time passes, beads coated in Protein A/G are added to the mixture of antibody and protein. At this point, the antibodies, which are now bound to their targets, will stick to the beads.

From this point on, the direct and indirect protocols converge because the samples now have the same ingredients. Both methods give the same end-result with the protein or protein complexes bound to the antibodies which themselves are immobilized onto the beads.

Seleksie Wysig

An indirect approach is sometimes preferred when the concentration of the protein target is low or when the specific affinity of the antibody for the protein is weak. The indirect method is also used when the binding kinetics of the antibody to the protein is slow for a variety of reasons. In most situations, the direct method is the default, and the preferred, choice.

Agarose Edit

Historically the solid-phase support for immunoprecipitation used by the majority of scientists has been highly-porous agarose beads (also known as agarose resins or slurries). The advantage of this technology is a very high potential binding capacity, as virtually the entire sponge-like structure of the agarose particle (50 to 150μm in size) is available for binding antibodies (which will in turn bind the target proteins) and the use of standard laboratory equipment for all aspects of the IP protocol without the need for any specialized equipment. The advantage of an extremely high binding capacity must be carefully balanced with the quantity of antibody that the researcher is prepared to use to coat the agarose beads. Because antibodies can be a cost-limiting factor, it is best to calculate backward van the amount of protein that needs to be captured (depending upon the analysis to be performed downstream), aan the amount of antibody that is required to bind that quantity of protein (with a small excess added in order to account for inefficiencies of the system), and back still further aan the quantity of agarose that is needed to bind that particular quantity of antibody. In cases where antibody saturation is not required, this technology is unmatched in its ability to capture extremely large quantities of captured target proteins. The caveat here is that the "high capacity advantage" can become a "high capacity disadvantage" that is manifested when the enormous binding capacity of the sepharose/agarose beads is not completely saturated with antibodies. It often happens that the amount of antibody available to the researcher for their immunoprecipitation experiment is less than sufficient to saturate the agarose beads to be used in the immunoprecipitation. In these cases the researcher can end up with agarose particles that are only partially coated with antibodies, and the portion of the binding capacity of the agarose beads that is not coated with antibody is then free to bind anything that will stick, resulting in an elevated background signal due to non-specific binding of lysate components to the beads, which can make data interpretation difficult. While some may argue that for these reasons it is prudent to match the quantity of agarose (in terms of binding capacity) to the quantity of antibody that one wishes to be bound for the immunoprecipitation, a simple way to reduce the issue of non-specific binding to agarose beads and increase specificity is to preclear the lysate, which for any immunoprecipitation is highly recommended. [3] [4]

Preclearing Edit

Lysates are complex mixtures of proteins, lipids, carbohydrates and nucleic acids, and one must assume that some amount of non-specific binding to the IP antibody, Protein A/G or the beaded support will occur and negatively affect the detection of the immunoprecipitated target(s). In die meeste gevalle, preclearing the lysate at the start of each immunoprecipitation experiment (see step 2 in the "protocol" section below) [5] is a way to remove potentially reactive components from the cell lysate prior to the immunoprecipitation to prevent the non-specific binding of these components to the IP beads or antibody. The basic preclearing procedure is described below, wherein the lysate is incubated with beads alone, which are then removed and discarded prior to the immunoprecipitation. [5] This approach, though, does not account for non-specific binding to the IP antibody, which can be considerable. Therefore, an alternative method of preclearing is to incubate the protein mixture with exactly the same components that will be used in the immunoprecipitation, except that a non-target, irrelevant antibody of the same antibody subclass as the IP antibody is used instead of the IP antibody itself. [4] This approach attempts to use as close to the exact IP conditions and components as the actual immunoprecipitation to remove any non-specific cell constituent without capturing the target protein (unless, of course, the target protein non-specifically binds to some other IP component, which should be properly controlled for by analyzing the discarded beads used to preclear the lysate). The target protein can then be immunoprecipitated with the reduced risk of non-specific binding interfering with data interpretation.

Superparamagnetic beads Edit

While the vast majority of immunoprecipitations are performed with agarose beads, the use of superparamagnetic beads for immunoprecipitation is a newer approach that is gaining in popularity as an alternative to agarose beads for IP applications. Unlike agarose, magnetic beads are solid and can be spherical, depending on the type of bead, and antibody binding is limited to the surface of each bead. While these beads do not have the advantage of a porous center to increase the binding capacity, magnetic beads are significantly smaller than agarose beads (1 to 4μm), and the greater number of magnetic beads per volume than agarose beads collectively gives magnetic beads an effective surface area-to-volume ratio for optimum antibody binding.

Commercially available magnetic beads can be separated based by size uniformity into monodisperse and polydisperse beads. Monodisperse beads, also called microbeads, exhibit exact uniformity, and therefore all beads exhibit identical physical characteristics, including the binding capacity and the level of attraction to magnets. Polydisperse beads, while similar in size to monodisperse beads, show a wide range in size variability (1 to 4μm) that can influence their binding capacity and magnetic capture. Although both types of beads are commercially available for immunoprecipitation applications, the higher quality monodisperse superparamagnetic beads are more ideal for automatic protocols because of their consistent size, shape and performance. Monodisperse and polydisperse superparamagnetic beads are offered by many companies, including Invitrogen, Thermo Scientific, and Millipore.

Agarose vs. magnetic beads Edit

Proponents of magnetic beads claim that the beads exhibit a faster rate of protein binding [6] [7] [8] over agarose beads for immunoprecipitation applications, although standard agarose bead-based immunoprecipitations have been performed in 1 hour. [4] Claims have also been made that magnetic beads are better for immunoprecipitating extremely large protein complexes because of the complete lack of an upper size limit for such complexes, [6] [7] [9] although there is no unbiased evidence stating this claim. The nature of magnetic bead technology does result in less sample handling [7] due to the reduced physical stress on samples of magnetic separation versus repeated centrifugation when using agarose, which may contribute greatly to increasing the yield of labile (fragile) protein complexes. [7] [8] [9] Additional factors, though, such as the binding capacity, cost of the reagent, the requirement of extra equipment and the capability to automate IP processes should be considered in the selection of an immunoprecipitation support.

Binding capacity Edit

Proponents of both agarose and magnetic beads can argue whether the vast difference in the binding capacities of the two beads favors one particular type of bead. In a bead-to-bead comparison, agarose beads have significantly greater surface area and therefore a greater binding capacity than magnetic beads due to the large bead size and sponge-like structure. But the variable pore size of the agarose causes a potential upper size limit that may affect the binding of extremely large proteins or protein complexes to internal binding sites, and therefore magnetic beads may be better suited for immunoprecipitating large proteins or protein complexes than agarose beads, although there is a lack of independent comparative evidence that proves either case.

Some argue that the significantly greater binding capacity of agarose beads may be a disadvantage because of the larger capacity of non-specific binding. Others may argue for the use of magnetic beads because of the greater quantity of antibody required to saturate the total binding capacity of agarose beads, which would obviously be an economical disadvantage of using agarose. While these arguments are correct outside the context of their practical use, these lines of reasoning ignore two key aspects of the principle of immunoprecipitation that demonstrates that the decision to use agarose or magnetic beads is not simply determined by binding capacity.

First, non-specific binding is not limited to the antibody-binding sites on the immobilized support any surface of the antibody or component of the immunoprecipitation reaction can bind to nonspecific lysate constituents, and therefore nonspecific binding will still occur even when completely saturated beads are used. This is why it is important to preclear the sample before the immunoprecipitation is performed.

Second, the ability to capture the target protein is directly dependent upon the amount of immobilized antibody used, and therefore, in a side-by-side comparison of agarose and magnetic bead immunoprecipitation, the most protein that either support can capture is limited by the amount of antibody added. So the decision to saturate any type of support depends on the amount of protein required, as described above in the Agarose section of this page.

Cost Edit

The price of using either type of support is a key determining factor in using agarose or magnetic beads for immunoprecipitation applications. A typical first-glance calculation on the cost of magnetic beads compared to sepharose beads may make the sepharose beads appear less expensive. But magnetic beads may be competitively priced compared to agarose for analytical-scale immunoprecipitations depending on the IP method used and the volume of beads required per IP reaction.

Using the traditional batch method of immunoprecipitation as listed below, where all components are added to a tube during the IP reaction, the physical handling characteristics of agarose beads necessitate a minimum quantity of beads for each IP experiment (typically in the range of 25 to 50μl beads per IP). This is because sepharose beads must be concentrated at the bottom of the tube by centrifugation and the supernatant removed after each incubation, wash, etc. This imposes absolute physical limitations on the process, as pellets of agarose beads less than 25 to 50μl are difficult if not impossible to visually identify at the bottom of the tube. With magnetic beads, there is no minimum quantity of beads required due to magnetic handling, and therefore, depending on the target antigen and IP antibody, it is possible to use considerably less magnetic beads.

Conversely, spin columns may be employed instead of normal microfuge tubes to significantly reduce the amount of agarose beads required per reaction. Spin columns contain a filter that allows all IP components except the beads to flow through using a brief centrifugation and therefore provide a method to use significantly less agarose beads with minimal loss.

Equipment Edit

As mentioned above, only standard laboratory equipment is required for the use of agarose beads in immunoprecipitation applications, while high-power magnets are required for magnetic bead-based IP reactions. While the magnetic capture equipment may be cost-prohibitive, the rapid completion of immunoprecipitations using magnetic beads may be a financially beneficial approach when grants are due, because a 30-minute protocol with magnetic beads compared to overnight incubation at 4 °C with agarose beads may result in more data generated in a shorter length of time. [6] [7] [8]

Automation Edit

An added benefit of using magnetic beads is that automated immunoprecipitation devices are becoming more readily available. These devices not only reduce the amount of work and time to perform an IP, but they can also be used for high-throughput applications.

Opsomming Wysig

While clear benefits of using magnetic beads include the increased reaction speed, more gentle sample handling and the potential for automation, the choice of using agarose or magnetic beads based on the binding capacity of the support medium and the cost of the product may depend on the protein of interest and the IP method used. As with all assays, empirical testing is required to determine which method is optimal for a given application.

Background Edit

Once the solid substrate bead technology has been chosen, antibodies are coupled to the beads and the antibody-coated-beads can be added to the heterogeneous protein sample (e.g. homogenized tissue). At this point, antibodies that are immobilized to the beads will bind to the proteins that they specifically recognize. Once this has occurred the immunoprecipitation portion of the protocol is actually complete, as the specific proteins of interest are bound to the antibodies that are themselves immobilized to the beads. Separation of the immunocomplexes from the lysate is an extremely important series of steps, because the protein(s) must remain bound to each other (in the case of co-IP) and bound to the antibody during the wash steps to remove non-bound proteins and reduce background.

When working with agarose beads, the beads must be pelleted out of the sample by briefly spinning in a centrifuge with forces between 600–3,000 x g (times the standard gravitational force). This step may be performed in a standard microcentrifuge tube, but for faster separation, greater consistency and higher recoveries, the process is often performed in small spin columns with a pore size that allows liquid, but not agarose beads, to pass through. After centrifugation, the agarose beads will form a very loose fluffy pellet at the bottom of the tube. The supernatant containing contaminants can be carefully removed so as not to disturb the beads. The wash buffer can then be added to the beads and after mixing, the beads are again separated by centrifugation.

With superparamagnetic beads, the sample is placed in a magnetic field so that the beads can collect on the side of the tube. This procedure is generally complete in approximately 30 seconds, and the remaining (unwanted) liquid is pipetted away. Washes are accomplished by resuspending the beads (off the magnet) with the washing solution and then concentrating the beads back on the tube wall (by placing the tube back on the magnet). The washing is generally repeated several times to ensure adequate removal of contaminants. If the superparamagnetic beads are homogeneous in size and the magnet has been designed properly, the beads will concentrate uniformly on the side of the tube and the washing solution can be easily and completely removed.

After washing, the precipitated protein(s) are eluted and analyzed by gel electrophoresis, mass spectrometry, western blotting, or any number of other methods for identifying constituents in the complex. Protocol times for immunoprecipitation vary greatly due to a variety of factors, with protocol times increasing with the number of washes necessary or with the slower reaction kinetics of porous agarose beads.


Kyk die video: Protein Purification (Oktober 2022).