Inligting

3.5: Proteïenvolgordebepaling, Peptiedkartering, Sintetiese Gene - Biologie

3.5: Proteïenvolgordebepaling, Peptiedkartering, Sintetiese Gene - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Histories is 'n paar belangrike siektetoestande geïdentifiseer as veroorsaak deur die gebrek van 'n belangrike proteïen, of die teenwoordigheid van 'n disfunksionele gemuteerde vorm van 'n proteïen.

  • Byvoorbeeld, suikersiekte, tipes dwergisme en hemofilie is gevind as gevolg van tekortkominge in insulien, groei hormoonen stollingsfaktor VIII, onderskeidelik.

Hierdie siektes kan behandel word deur inspuiting aanvullende dosisse gesuiwerde, of gedeeltelik gesuiwerde, preparate van hierdie proteïene.

  • Hierdie proteïene is uit natuurlike materiale geïsoleer, bv. vark (insulien), hipofise van menslike kadawer (menslike groeihormoon) of bloedfraksies saamgevoeg van normale skenkers (faktor VIII).
  • In die meeste gevalle, selfs al is die proteïen in 'n relatief oorvloedige voorraad gevind, die produksiekoste was aansienlik.

Meer dikwels as nie, is interessante bioaktiewe eienskappe geassosieer met proteïene wat slegs in geïsoleer kon word minuut hoeveelhede(bv. die bloedklont wat proteïen oplos weefselplasminogeenaktiveerder).

Ook, nie-menslike proteïene tipies ontlok 'n immuunrespons wanneer dit by mense ingespuit word, dus die menslike vorm van 'n proteïen was die enigste bruikbare vorm.

  • As die proteïen nie geredelik beskikbaar was uit bloed of urine nie, sou dit onprakties wees om te verkry voldoende begin materiaalvir produksie.
  • Ongelukkig, as die materiaal van menslike bronne afkomstig was, het die moontlikheid bestaan ​​vir die verspreiding van menslike siekte (bv. hepatitis en die VIGS-virus).

As die genetiese inligting vir hierdie proteïene geïsoleer kon word, en dan in 'n maklik skaalbare biologiese stelsel getranskribeer en vertaal kon word, kan potensieel groot hoeveelhede proteïene verkry word - en hopelik relatief goedkoop.

Met die ontwikkeling van "molekulêre biologie", d.w.s.

  • die struktuur van DNA,
  • die verduideliking van die genetiese kode,
  • die identifikasie van transkripsionele promotors en ribosoombindingsplekke,
  • die isolasie van restriksie endonuklase,
  • die identifikasie van die oorsprong van DNA-replikasie
  • die ontwikkeling van plasmiede met selekteerbare merkers, en
  • die kweek van E coli,

die moontlikheid het in die middel 1970's bestaan ​​om dit alles saam te voeg en relatief groot hoeveelhede te produseer enige menslike proteïen vir terapeutiese gebruik.

Hoe sal jy te werk gaan om groot hoeveelhede van 'n belangrike menslike proteïen te produseer? (m.a.w. proteïen suiwering)

Die beginpunt is tipies 'n toets vir 'n funksionaliteit van belang. Ons kan byvoorbeeld 'n hemofilie hê wie se bloed nie stol nie. Ons vind egter dat as ons 'n monster van sy bloed neem en 'n klein hoeveelheid bloed van 'n "normale" individu daarby voeg, die hemofilie se bloed nou sal stol. Dit sal die basis wees vir ons toets.

Deur hierdie toets te gebruik, sal ons normale bloed op verskillende maniere fraksioneer - chemiese presipitasie (met etanol, of ammoniumsulfaat), en dan verskeie vloeistofchromatografiestappe, ens.

  • Langs die pad sal ons volg waar ons stollingsaktiwiteit gaan.
  • Hopelik sal ons op 'n stadium nie in staat wees om dit verder te fraksioneer nie en sal 'n suiwer proteïen.

Sodra ons 'n suiwer proteïen het, kan ons begin om dit te karakteriseer met betrekking tot sy aminosuur volgorde. Van daar af kan ons uiteindelik die geen vir die proteïen kry en dit uitdruk.

Figuur 3.5.1: Proteïenproduksie

N-terminale peptiedvolgorde-analise

Polipeptiede kan van hul amino-terminus gevolg word deur geoutomatiseerde prosedures gebaseer op die Edman agteruitgang reaksie:

Figuur 3.5.2: Edman agteruitgang

  • Let daarop dat met Edman-chemie slegs die N-terminale oorblyfsel aangeheg en verwyder word, die res van die polipeptied bly ongeskonde na die reaksie.
  • Die nuwe aminoterminale groep (voorheen die tweede aminosuur in die polipeptiedketting) is nou beskikbaar vir nog 'n rondte reaksies. So, die metode kan wees outomatiese.
  • Die aminosuursyketting van die fenieltiohidantoïenderivaat kan met behulp van vloeistofchromatografie geïdentifiseer word. Moderne aminosuurvolgorders kan waarskynlik in volgorde van twee tot drie dosyn siklusse (aminosure) van 'n polipeptied.
  • Let daarop dat die reaksie 'n vrye aminogroep op die N-terminaal van die proteïen vereis. As die amino-terminale oorblyfsel gemetileer of geformileer is, sal die reaksie nie voortgaan nie (en daar word gesê dat die polipeptied 'n "geblokkeerde" N-terminaal het).

C-terminale peptiedvolgorde-analise

C-terminale peptiedvolgorde-analise is nie so goed ontwikkel as aminoterminale analise nie.

  • Die metode maak gewoonlik gebruik van nie-spesifieke karboksipeptidases.
  • Karboksipeptidases sal opeenvolgend hidroliseer polipeptiede uit die karboksie-terminus einde. Die vrygestelde aminosuur kan met behulp van vloeistofchromatografiese metodes geïdentifiseer word, en die oorblywende polipeptied is beskikbaar vir verdere reaksies.
  • Verskeie karboksipeptidases is beskikbaar, gewoonlik is hulle nie heeltemal nie-spesifiek nie (d.w.s. hulle het sekere voorkeure):

Naam

Bron

Spesifisiteit

Karboksipeptidase A

Bees Pankreas

Aromatiese, alifaties (hidrofobies)

Karboksipeptidase B

Vark Pankreas

Arginien, Lysine, Ornitine

Karboksipeptidase P

Penisillium

Oor die algemeen nie-spesifiek

Karboksipeptidase Y

Gis

Aromatiese, alifaties

Soms is die keuse van watter karboksipeptase om te gebruik gebaseer op die verwagte volgorde-inligting. In hierdie tipe eksperimente:

  1. monsters word op verskillende tye tydens die vertering geneem
  2. vrye aminosure word van polipeptiede geskei
  3. die vrygestelde aminosure word deur aminosuuranalise (vloeistofchromatografie) geïdentifiseer.

C-terminale analise is gewoonlik net akkuraat vir identifikasie van die laaste halfdosyn residue of so in 'n polipeptied.

Peptied kartering

Een van die ooglopende probleme met proteïenvolgordebepaling is dat selfs as die N-terminaal nie "geblokkeer" is nie, slegs beperkte volgorde-inligting verkry kan word vanaf 'n ongeskonde polipeptied (dws slegs sowat twee dosyn vanaf die N-terminaal en 'n halfdosyn van die C -terminaal).

Hoe kan volgorde-inligting vir die hele polipeptied verkry word?

Een metode is dié van peptied kartering. Peptied kartering maak gebruik van proteolitiese splytings van die polipeptied om kleiner polipeptied te produseer. Hierdie kleiner polipeptiede kan dan van mekaar geïsoleer word en aan volgorde-analise onderwerp word.

Hoe orden ons die verskillende rye wat ons verkry?

Een van die maklikste maniere is om die eksperiment te herhaal, maar met 'n protease met 'n ander spesifisiteit, en op hierdie manier te verkry oorvleuelende volgorde inligting.

Naam

Bron

Spesifisiteit

Chimotripsien

Bees Pankreas

Splyting na Tyr, Phe en Trp; 'n mate van splitsing na Leu, Met en Ala

Bromelain

Pynappel

Splyting na Lys, Ala en Tyr

Tripsien

Bees Pankreas

Splyting na Arg, minder na Lys

V8 protease

Staphylococcus aureus

Splyting na Glu, minder na Asp

Figuur 3.5.3: Oorvleuelende splitsingsprodukte

Oorvleuelende volgorde-inligting kan jou toelaat om die peptiede in die korrekte volgorde te belyn en die volgorde van die oorspronklike groot polipeptied (d.w.s. proteïen) te bepaal.

Een probleem wat kan ontstaan, handel oor Sisteïen reste en die aard van enige kovalente disulfiedbrûe in die proteïen.

  • Enige "peptied" mobiliteite (op óf vloeistofchromatografiese óf PAGE ontledings) wat verdeel in twee kleiner peptiede na behandeling met 'n reduseermiddel (soos b-ME) dui die teenwoordigheid van 'n sisteïen-gemedieerde disulfiedbinding aan.
  • By volgordebepaling moet hierdie peptiede elk 'n sisteïenresidu bevat. As elke peptied slegs een sisteïen het, is die disulfiedbindingstoewysing ondubbelsinnig.

Figuur 3.5.4: Sisteïenreste in splitsingsprodukte

Ooreenstemmende genetiese inligting

Sodra ons gedeeltelike, of volledige, peptiedvolgorde-inligting het, kan ons begin om die ooreenstemmende te identifiseer en te isoleer genetiese inligting. Dit is die hoofdoel. Sodra ons die ooreenstemmende genetiese inligting het, kan dit moontlik wees om relatief groot hoeveelhede van die verlangde polipeptied te produseer.

Terug vertaling

Aangesien ons die genetiese kode ken, kan ons enige polipeptiedvolgorde terugvertaal in 'n ooreenstemmende genetiese volgorde.

  • Dus, uit die aminosuurvolgorde kon ons 'n sintetiseer kunsmatige geen wat vir die proteïen van belang sal kodeer.
  • Aangesien baie aminosure deur meer as een kodon gekodeer word, is daar potensiaal dubbelsinnigheid met betrekking tot die oorspronklike presiese genetiese volgorde.

Aminosuur

Aantal kodons

Ontmoet, Trp

1

Phe, Tyr, His, Gln, Asn, Lys, Asp, Glu, Cys

2

Ile

3

Val, Pro, Thr, Ala, Gly

4

Leu, Arg, Ser

6

Om seker te maak dat ons terugvertaal op so 'n manier om die oorspronklike genetiese volgorde getrou te dupliseer is dalk nie krities nie - 'n korrekte proteïenvolgorde is die algehele doelwit.

Trouens, as ons probeer om die proteïen in 'n ander organisme uit te druk (sê 'n soogdiergeen in 'n bakteriese sisteem uit te druk), kan ons eintlik verkies om 'n kodon vooroordeel toepaslik vir die uitdrukking gasheer organisme.

Sintetiese gene vir klein proteïene is 'n redelike manier om voort te gaan; dit is een manier waarop menslike insulien is uitgedruk in bakteriese sisteme.

  • Geoutomatiseerde sintese van DNA-oligonukleotiede is egter prakties vir polimeerlengtes van ongeveer 60-90 basisse of minder (ongeveer 20-30 aminosure).
  • Verder vereis die metode van konstruksie van sintetiese gene tipies oorvleuelende komplementêre oligonukleotiede (om in 'n enkele dupleks DNA geen "kasset" geligeer te word).

Dus, baie oligonukleotiede word benodig vir selfs 'n enkele klein sintetiese geen.

Figuur 3.5.5: Sintetiese geenkonstruksie

Een manier om die bogenoemde metode van sintetiese geenkonstruksie te verbeter, is met a direkte PCR benadering. Hierdie metode maak nie gebruik van ligase, of selfs oligonukleotiede wat saamstamp nie. In plaas daarvan, met hierdie metode word baie (~100) verskillende oorvleuelende oligonukleotiede gelyktydig in 'n PCR-reaksie gebruik. Hul volgorde komplementariteit kan soos volg voorgestel word:

Die hele stel oligonukleotiede mag nie in lyn wees om die hele geen te gee nie, maar dit is in orde. Ons sal verskeie rondtes PCR doen met die idee dat sommige komplementêre oligo's sal uitgloei en uitgebrei word en sal, bietjie vir bietjie, lei tot die konstruksie van 'n aaneenlopende sintetiese geen:

Op die volgende PCR-siklus sal sommige van hierdie uitgebreide fragmente met ander uitgloei:

Hierdie sal uitgebrei word via die PCR en kan voortgaan om met ander groter PCR-fragmente te uitgloei. Uiteindelik sal die hele geen gekonstrueer word. Aangesien die doeltreffendheid van konstruksie van die vollengte-geen egter waarskynlik nie baie goed gaan wees nie, moet ons 'n daaropvolgende PCR-eksperiment uitvoer om die vollengte-geen te amplifiseer (met behulp van buitenste primers). Die belangrikste kenmerke van hierdie metode word soos volg opgesom:

  • Baie (soveel as 1-2 honderd) oorvleuelende oligo's word gekombineer in 'n enkele PCR-reaksie
  • Die oligo's is ontwerp om so lank as moontlik te wees (~100mers) met beperkte oorvleueling (~20 basisse)
  • Die vollengte geen word in 'n aanvanklike (lae opbrengs) PKR-eksperiment gekonstrueer
  • Hierdie volle lengte geen word geamplifiseer met 'n daaropvolgende tipiese PCR-eksperiment wat buitenste primers gebruik.

3.5: Proteïenvolgordebepaling, Peptiedkartering, Sintetiese Gene - Biologie

PROTEÏEN CHEMIE

AGTERGRONDINLIGTING: Jy sal dalk Robert Russell se Gids tot Struktuurvoorspelling wil raadpleeg. Vir die biochemiese eienskappe van aminosure sien PROWL, Amino Acid Hydrophobicity and Amino Acid Chart and Reference Table (GenScript). As jy spesifiek in teenliggaampies belangstel, sal ek aanbeveel dat jy "The Antibody Resource Page." besoek

Aminosuur samestelling en massa &ndash ProtParam (ExPASy, Switserland)
Iso-elektriese punt - Bereken pI/Mw-instrument (ExPASy, Switserland). As jy 'n plot wil hê van die verhouding tussen lading en pH, gebruik ProteinChemist (ProteinChemist.com) of JVirGel Proteomic Tools (PRODORIC Net, Duitsland).
Massa, pI, samestelling en mol% suur, basiese, aromatiese, polêre ens. aminosure - PEPSTATS (GELIF). Biochemie-aanlyn (Vitalonic, Rusland) gee een % samestelling, molekulêre gewig, pI en lading by enige gewenste pH.

Peptied molekulêre gewig sakrekenaar (GenScript) - die aanlyn sakrekenaar bepaal die chemiese formule en molekulêre gewig van jou peptied van belang. Jy kan ook post-translasionele wysigings spesifiseer, soos N- en C-terminale wysigings en posisionering van disulfiedbrûe, om meer akkurate uitsette te verkry.

Iso-elektriese punt sakrekenaar 2.0 (IPC 2.0) - is 'n bediener vir die voorspelling van iso-elektriese punte en pKa waardes met behulp van 'n mengsel van diep leer en ondersteun vektorregressie modelle. Die voorspelling akkuraatheid (RMSD) van IPC 2.0 vir proteïene en peptiede vaar beter as vorige algoritmes. (Verwysing: Kozlowski LP (2021) Nucl. Acids Res. Web Server-kwessie).

Samestelling/molekulêre gewigsberekening (Georgetown Universiteit Mediese Sentrum, V.S.A.) - die enigste probleem met hierdie webwerf is dat wanneer dit in bondelmodus uitgevoer word, dit nie die volgorde met die naam identifiseer nie, bloot opeenvolgende nommer

Proteïen sakrekenaar (C. Putnam, The Scripps Research Institute, V.S.A.) - bereken massa, pI, lading by 'n gegewe pH, tel aminosuurreste ens.

Tm Voorspeller (P.C. Lyu Lab., Nasionale Tsing-Hua Universiteit, Taiwan) - bereken die teoretiese proteïensmelttemperatuur.

Antigenisiteit en allergenisiteit: 'n goeie plek om te begin is The Immune Epitope Database (IEDB)

Abie Pro Peptide Antibody Design (Chang Bioscience)

Allergenisiteitbedieners: AllerTOP (Verwysing: Dimitrov, I. et al. 2013. BMC Bioinformatics 14(Suppl 6): S4), AlgPred - voorspelling van allergene proteïene en kartering van IgE-epitope (Verwysing: Saha, S. en Raghava, G.P.S. 2006. Nucleic Acids Research 34: W202-W209.), en SDAP - Strukturele Databasis van Allergene Proteïene (Verwysing: Ivanciuc, O. et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31: 359-362).

EpiToolKit - is 'n virtuele werkbank vir immunologiese vrae met 'n fokus op entstofontwerp. Dit bied 'n verskeidenheid immunoinformatika-instrumente wat MHC genotipering, epitoop- en neo-epitope-voorspelling, epitoopseleksie vir entstofontwerp en epitoopsamestelling dek. In sy onlangs hergeïmplementeerde weergawe 2.0, bied EpiToolKit 'n reeks nuwe funksionaliteit en laat dit vir die eerste keer toe om gereedskap in komplekse werkvloei te kombineer. Vir onervare gebruikers bied dit vereenvoudigde koppelvlakke om die gebruikers deur die ontleding van komplekse immunologiese datastelle te lei. ( Verwysing: Schubert S et al. (2015) Bioinformatika 31(13): 2211&ndash2213).

VIOOL - Vaksyn ekondersoek en OnLine ekinligting Network - laat maklike samestelling, vergelyking en ontleding van entstofverwante navorsingsdata oor verskeie menslike patogene toe. VIOLIN sal na verwagting 'n gesentraliseerde bron van entstofinligting word en om ondersoekers in basiese en kliniese wetenskappe te voorsien van saamgestelde data en bioinformatika-instrumente vir entstofnavorsing en -ontwikkeling . VBLAST: Pasgemaakte BLAST Search for Vaccine Research laat verskeie soekstrategieë toe teen 77 genome van 34 patogene. (Verwysing: He, Y. et al. 2014. Nucleic Acids Res. 42 (Databasiskwessie): D1124-32).

SVMTriP - is 'n nuwe metode om antigeniese epitoop te voorspel met die nuutste volgorde-invoer vanaf IEDB-databasis. In ons metode is Support Vector Machine (SVM) gebruik deur die Tri-peptied-ooreenkoms en Propensity-tellings (SVMTriP) te kombineer om die beter voorspellingsprestasie te behaal. Verder is SVMTriP in staat om virale peptiede uit 'n menslike proteïenvolgorde agtergrond te herken. (Verwysing: Yao B et al. (2012) PLoS One 7(9): e45152).

Oplosbaarheid en kristalliseerbaarheid:

EnzymeMiner - bied outomatiese ontginning van oplosbare ensieme met uiteenlopende strukture, katalitiese eienskappe en stabiliteit. Die oplosbaarheidsvoorspelling maak gebruik van die interne SoluProt-voorspeller wat ontwikkel is deur gebruik te maak van masjienleer.( Verwysing: Hon J et al. 2020. Nucl Acids Res 48 (W1): W104&ndashW109).

ESPRESSO (EStydsberekening van PRotein ExpreSsie en SOlubility) - is 'n volgorde-gebaseerde voorspeller vir die skatting van proteïenuitdrukking en oplosbaarheid vir drie verskillende proteïenuitdrukkingstelsels: in vivo Escherichia coli, Brevibacillus, en koringkiem selvry. (Verwysing: Hirose S, & Noguchi T. 2013. Proteomics. 13:1444-1456).

SABLE - Akkurate volgorde-gebaseerde voorspelling van relatiewe oplosmiddeltoeganklikheid, sekondêre strukture en transmembraandomeine vir proteïene van onbekende struktuur. (Verwysing: Adamczak R et al. 2004. Proteïene 56:753-767).

SPpred (Sonoplosbaar Protein voorspelling) (Bioinformatika Sentrum, Instituut vir Mikrobiese Tegnologie, Chandigarh, Indië) - is 'n webbediener vir die voorspelling van oplosbaarheid van 'n proteïen by ooruitdrukking in E coli. Die voorspelling word gedoen deur baster van SVM-model opgelei op PSSM-profiel gegenereer deur PSI-BLAST-soektog van 'nr' proteïendatabasis en gesplete aminosuursamestelling.

Protein&ndashSol - is 'n webbediener om proteïenoplosbaarheid te voorspel. Deur beskikbare data vir Escherichia coli-proteïenoplosbaarheid in 'n selvrye uitdrukkingstelsel te gebruik, word 35 volgorde-gebaseerde eienskappe bereken. Eienskapgewigte word bepaal uit skeiding van lae en hoë oplosbaarheid subversamelings. Die model gee 'n voorspelde oplosbaarheid en 'n aanduiding van die kenmerke wat die meeste van gemiddelde waardes afwyk. ( Verwysing: Hebditch M et al. 2017. Bioinformatika 33(19): 3098&ndash3100).

CamSol - vir die rasionele ontwerp van proteïenvariante met verbeterde oplosbaarheid. Die metode werk deur 'n vinnige berekeningsifting van tienduisende mutasies uit te voer om diegene met die grootste impak op die oplosbaarheid van die teikenproteïen te identifiseer, terwyl sy inheemse toestand en biologiese aktiwiteit behou word. ( Verwysing: Sormanni P et al. (2015) J Molec Biol 427(2): 478-490). N.B. Vereis registrasie.

Soppervlak Entropie Ropvoeding bl rediction (SERp) - hierdie verkennende hulpmiddel is daarop gemik om die identifisering van terreine te help wat die beste geskik is vir mutasie wat ontwerp is om kristalliseerbaarheid te verbeter deur 'n Surface Entropy Reduction-benadering. (Verwysing: Goldschmidt L. et al. 2007. Proteïenwetenskap. 16:1569-1576)

CRYSTALP2 - vir in silico voorspelling van proteïen kristallisasie geneigdheid. (Verwysing: Kurgan L, et al. 2009. BMC Structural Biology 9: 50) en, PPCpred - volgorde-gebaseerde voorspelling van geneigdheid vir die produksie van diffraksie-kwaliteit kristalle, produksie van kristalle, suiwering en produksie van die proteïen materiaal. (Verwysing: M.J. Mizianty & L. Kurgan. 2011. Bioinformatika 27: i24-i33).

Antimikrobiese peptiede, entstowwe en gifstowwe:

APD (Antimikrobiese Pepide Database) (Verwysing: Wang, Z. en Wang, G 2004. Nucl. Acids Res.32: D590-D592)

Die Tipe III Sekresiestelsel (T3SS) is 'n noodsaaklike meganisme vir gasheer-patogeen-interaksie in die infeksieproses. Die proteïene wat deur die T3SS-masjinerie van baie Gram-negatiewe bakterieë afgeskei word, staan ​​bekend as T3SS-effektore (T3SE's). Dit kan óf subsellulêr in die gasheer gelokaliseer word, óf deel wees van die naaldpunt van die T3SS wat direk met die gasheermembraan in wisselwerking tree om ander effektore in die teikensel in te bring. T3SEdb verteenwoordig so 'n poging om 'n omvattende databasis van alle eksperimenteel bepaalde en vermeende T3SE's saam te stel in 'n webtoeganklike webwerf. BLAST-soektog is beskikbaar. (Verwysing: Tay DM et al. 2010. BMC Bioinformatics. 11 Suppl 7:S4).

Effektief (Universiteit van Wene, Oostenryk & Tegniese Universiteit van München, Duitsland) - Bakteriële proteïenafskeiding is die sleutel virulensiemeganisme van simbiotiese en patogene bakterieë. Daardeur word effektorproteïene vanaf die bakteriële sitosol na die ekstrasellulêre medium of direk na die eukariotiese gasheersel vervoer. Die Effektiewe portaal verskaf vooraf berekende voorspellings oor bakteriese effektore in alle publiek beskikbare patogeniese en simbiontiese genome sowel as die moontlikheid vir die gebruiker om effektors in eie proteïenvolgordedata te voorspel.

Vaxign is die eerste webgebaseerde entstofontwerpstelsel wat entstofteikens voorspel gebaseer op genoomvolgorde deur die strategie van omgekeerde inentingologie te gebruik. Voorspelde kenmerke in die Vaxign-pyplyn sluit in proteïen subsellulêre ligging, transmembraanhelikse, adhesienwaarskynlikheid, bewaring aan menslike en/of muisproteïene, volgorde-uitsluiting van genoom(e) van nie-patogeniese stam(me), en epitoopbinding aan MHC klas I en klas II . Die vooraf berekende Vaxign-databasis bevat voorspelling van entstofteikens vir >350-genome. (Verwysing: He Y et al. 2010. J Biomed Biotechnol. 2010: 297505). 'n Nuwer weergawe Vaxign 2 Beta is hier beskikbaar.

VacTarBac is 'n platform wat entstofkandidaat teen verskeie patogene bakterieë stoor. Die entstof is ontwerp op grond van hul waarskynlikheid om as epitoop op te tree, en het dus die potensiaal om enige van die verskeie arms van die immuunstelsel te induseer. Hierdie epitope is voorspel teen die virulensiefaktor en essentiel-gene van 14 bakteriese spesies. (Verwysing: Nagpal G et al. (2018) Front Immunol. 9: 2280).

Abpred - sal 'n enkele aminosuurvolgorde vir 'n Fv neem en die voorspelde prestasie op bereken 12 biofisiese platforms (Verwysing: Hebditch M & J Warwicker (2019) PeerJ. 7: e8199).

T3SE - Tipe III sekresiestelsel effektor voorspelling (Verwysing: Löwer M, & Schneider G. 2009. PLoS One. 4:e5917. Erratum in: PLoS One. 20094(7).

SIEVE Server is 'n publieke webhulpmiddel vir voorspelling van tipe III afgeskeide effektors. Die SIEVE Server beoordeel potensiële afgeskeide effektore vanaf genome van bakteriële patogene met tipe III afskeidingstelsels deur gebruik te maak van 'n model wat van bekende afgeskeide proteïene geleer is. Die SIEVE-bediener vereis dat slegs proteïenreekse van proteïene gekeur word en gee 'n konserwatiewe waarskynlikheid dat elke insetproteïen 'n tipe III-afgeskeide effektor is. (Verwysing: McDermott JE et al. 2011. Infect Immun. 79:23-32).

Sirkulêre dichroïsme:

Sirkulêre digroïsme (Birkbeck College, Skool vir Kristalografie, Engeland) DICHROWEB is 'n interaktiewe webwerf wat die dekonvolusie van data van Circular Dichroism spektroskopie-eksperimente moontlik maak. Dit bied 'n koppelvlak tot 'n reeks dekonvolusie-algoritmes (CONTINLL, SELCON3, CDSSTR, VARSLC, K2D).

K2D2: Voorspelling van persentasies proteïen sekondêre struktuur vanaf CD-spektra - laat ontleding toe van 41 CD-spektrumdatapunte wat wissel van 200 nm tot 240 nm of of 51 datapunte vir die 190-240 nm-reeks (Verwysing: Perez-Iratxeta C & Andrade- Navarro MA. 2008. BMC Strukturele Biologie 2008, 8:25)

K2D3 is 'n webbediener om die 'n heliks- en ß-string-inhoud van 'n proteïen uit sy sirkelvormige dichroïsme-spektrum te skat. K2D3 gebruik 'n databasis van teoretiese spektra afgelei met Dichrocalc (Verwysing: Louis-Jeune C et al. 2012. Proteins: Structure, Function, & Bioinformatics 80: 374&ndash381)

Sisteïenreste:

DiANNA - sal sisteïen oksidasie toestand (76% akkuraatheid), sisteien pare (81% akkuraatheid) en disulfiedbinding konnektiwiteit (86% akkuraatheid) voorspel. (Verwysing: Nucl. Acids Res. 33: W230-W232).

CYSREDOX (Rockefeller Universiteit, V.S.A.) en CYSPRED (CIRB Biocomputing Group, Universiteit van Bologna, Italië) die redokstoestand van sisteïenresidu in proteïene te bereken.

Hidrofobiese plotter ( Innovagen ) - en proteïen hidroplotter - kies onder Tools (ProteinLounge, San Diego, CA ).

Proteolise en massaspektrometrie:

Proteolise - PeptideCutter (ExPASy, Switserland) wat ook splitsingsplekke vir ensieme en chemikalieë voorspel. 'n Alternatiewe proteolise-terrein is Mobility_plot 4.1 (Gevorderde Proteolitiese Vingerafdruk, IGH, Frankryk).
Vir meer gesofistikeerde proteïenanalise wat massaspektroskopie behels, het ExPasy FindMod bekendgestel om potensiële proteïen post-translasionele modifikasies in peptiede te voorspel en, GlycoMod wat die moontlike oligosakkariedstrukture wat op proteïene voorkom vanaf hul eksperimenteel bepaalde massas kan voorspel.

ProFound - is 'n hulpmiddel om 'n proteïenvolgordedatabasis te soek deur inligting van massaspektra van peptiedkaarte te gebruik. 'n Bayesiese algoritme word gebruik om die proteïenvolgordes in die databasis te rangskik volgens hul waarskynlikheid om die peptiedkaart te produseer. 'n Vereenvoudigde weergawe kan hier verkry word (Rockefeller Universiteit, New York, V.S.A.). 'n Mens kan nie jou eie proteïendatabasis gebruik nie.

ProteinProspector (Universiteit van Kalifornië) - bied 'n wye verskeidenheid gereedskap (bv. MS-Fit, MS-Tag, MS-Seq, MS-Pattern, MS-Homology) vir die proteïenmassaspektroskoop.

Herhalings in proteïenvolgordes kan ontdek word met behulp van Radar ( R suur A utomatiese D eteksie en A lignment van R eet, Europese Bioinformatika Instituut) of REPRO (Verwysing: George RA. & Heringa J. 2000. Trends Biochem. Sci. 25: 515-517).

REPPER (REPeet en hulle PERiodicities) - bespeur en ontleed streke met kort gapingslose herhalings in proteïene. Dit vind periodisiteite deur Fourier Transform (FTwin) en interne ooreenkoms analise (REPwin). FTwin ken numeriese waardes toe aan aminosure wat sekere eienskappe weerspieël, byvoorbeeld hidrofobisiteit, en gee inligting oor ooreenstemmende periodisiteite. REPwin gebruik selfbelynings en vertoon herhalings wat beduidende interne ooreenkomste openbaar. Hulle word aangevul deur PSIPRED en opgerolde spoelvoorspelling (COILS), wat die bediener 'n nuttige analitiese hulpmiddel vir veselagtige proteïene maak. (Verwysing: M. Gruber et al. 2005. Nucl. Acids Res. 33: W239-W243).

Tweedimensionele gels:

JVirGel-berekening van virtuele tweedimensionele proteïengels - skep virtuele 2D-proteome uit 'n groot lys eukariote en prokariote (of 'n individuele proteïen). Twee weergawes: html (beperk) en Java-applet (ongelooflik, maar jy moet Java Runtime Environment installeer. (Verwysing: K. Hiller et al. 2003. Nucl. Acids Res. 31: 3862-3865).

Teken virtuele tweedimensionele proteïengels (PRODORIC Net, Duitsland) - gebruik jou eie proteïenvolgordedata of vir verskillende organismes.

Krasproteïenvoorspeller - (Instituut vir Genomika en Bioinformatika, Universiteit Kalifornië, Irvine) - programme sluit in: ACCpro: die relatiewe oplosmiddeltoeganklikheid van proteïenreste CMAPpro: Voorspelling van aminosuurkontakkaarte COBEpro: Voorspelling van kontinue B-sel-epitope CONpro: voorspel of die aantal kontakte van elke residu in 'n proteïen bo of onder die gemiddelde is vir daardie oorblyfsel DIpro: Voorspelling van disulfiedbrûe DISpro: Voorspelling van wanordelike streke DOMpro: Voorspelling van domeine SSpro: Voorspelling van proteïen sekondêre struktuur SVMcon: Voorspelling van aminosuurkontakkaarte met behulp van Support Vector Machines en, 3Dpro: Voorspelling van proteïen tersiêre struktuur (Ab Initio).

Mutagenese:

Gene Mutagenese Ontwerper (GenScript) is ontwikkel om jou ontwerp van punt-DNA-mutagenese eenvoudig te maak om geenmutasie te fasiliteer. Om DNA-mutagenese vanaf wilde tipe uit te voer, voer eenvoudig jou beginvolgorde van wildtipe geen in die veld hieronder in, en klik dan op die &ldquovan seleksie&rdquo-knoppie om die aminosuur(e) van belang te kies. Gevolglik sal die nuwe geenvolgorde wat gemuteerde proteïen kodeer gegenereer word met 'n klik &ldquosubmit&rdquo. Jy kan 'n aantal uitdrukkingstelsels kies.

I-Mutant2.0: voorspeller van veranderinge in proteïenstabiliteit by mutasie - kies óf 'n PDB-verwysingsnommer óf plak jou eie proteïen. Die antwoord (per e-pos) dui aan of die proteïen min of meer stabiel is, 'n feit wat van nut kan wees in die ontwerp van "beter" proteïene. (Verwysing: E. Capriotti et al. 2005. Nucl. Sure Res. 33: W306-W310).

SIFT - Die Sortering ekverdraagsaam fRom Tolerant (SIFT) algoritme voorspel die effek van koderende variante op proteïenfunksie d.w.s. dit voorspel of 'n aminosuurvervanging proteïenfunksie beïnvloed gebaseer op volgordehomologie en die fisiese eienskappe van aminosure. SIFT kan toegepas word op natuurlik voorkomende nie-sinonieme polimorfismes en laboratorium-geïnduseerde missense mutasies. (Verwysing: N-L Sim et al. 2012. Nukleïensuurnavorsing 40(1): W452&ndashW457).

mCSM-membraan - voorspel die uitwerking van mutasies op transmembraanproteïene. ( Verwysing: Pires DEV et al. 2020. Nucl Acids Res 48 (W1): W147&ndashW153).


3.5: Proteïenvolgordebepaling, Peptiedkartering, Sintetiese Gene - Biologie

Die cDNA kloning en uitdrukking in vitro en in eukariotiese selle van 'n nuwe proteïen wat uit menslike artikulêre kraakbeen geïsoleer is, word kraakbeen-intermediêre laagproteïen (CILP) beskryf. 'n Enkele 4,2-kilobase-mRNA wat in menslike gewrigskraakbeen opgespoor word, kodeer 'n polipeptied van 1184 aminosure met 'n berekende molekulêre massa van 132,5 kDa. Die proteïen het 'n vermoedelike seinpeptied van 21 aminosure, en is 'n proform van twee polipeptied. Die amino-terminale helfte stem ooreen met CILP (molekulêre massa van 78,5 kDa, nie post-translasie-modifikasies ingesluit nie) en die karboksiel-terminale helfte stem ooreen met 'n proteïen wat homoloog is aan 'n varknukleotied pirofosfohidrolase, NTPPHase (molekulêre massa van 51,8 kDa, nie ingesluit poste) -vertaalwysigings). CILP het 30 sisteïene en ses vermoedelik N-glikosileringsplekke. Die menslike homoloog van vark NTPPHase wat hier beskryf word, bevat 10 sisteïenreste en twee vermoedelike N-glikosileringsplekke. In die voorloperproteïen word die NTPPHase-gebied onmiddellik voorafgegaan deur 'n tetrapeptied wat ooreenstem met 'n furienproteïenase-klowing-konsensusvolgorde. Uitdrukking van die vollengte-cDNA in 'n selvrye translasiestelsel en in COS-7 of EBNA-selle dui daarop dat die voorloperproteïen gesintetiseer word as 'n enkele polipeptiedketting wat, moontlik deur 'n furienagtige protease, in twee polipeptiede verwerk word. of voorafgaande afskeiding.

Hierdie werk is ondersteun deur die Sweedse Mediese Navorsingsraad, Konung Gustaf V's 80-årsfond, Greta en Johan Kock's stiftelser, Axel en Margaret Ax:son Johnsons stiftelse, AlfredÖsterlund's Stiftelse en die Mediese Fakulteit, Lund Universiteit. koste van publikasie van hierdie artikel is gedeeltelik deur die betaling van bladsykoste gedek. Die artikel moet dus hiermee gemerk word "advertensie” in ooreenstemming met 18 U.S.C. Artikel 1734 uitsluitlik om hierdie feit aan te dui.

Die nukleotiedvolgorde(s) wat in hierdie vraestel gerapporteer word, is by die GenBank™/EMBL Databank ingedien met toegangsnommer(s) AF035408.


3.5: Proteïenvolgordebepaling, Peptiedkartering, Sintetiese Gene - Biologie

Gevorderde laboratoriums en fasiliteite is noodsaaklik vir die kollege se baanbrekersnavorsingsprogramme. Verken die kollege se kernfasiliteite hieronder.

Kernfasiliteite

Chemie Fasiliteite

Daar is 'n aantal fasiliteite wat Universiteit van Texas in Austin navorsers in chemie en verwante gebiede ondersteun.

Biomediese navorsingsfasiliteite

Daar is 'n aantal fasiliteite wat sellulêre en molekulêre biologie-navorsing en berekeningsbiologie by die Universiteit van Texas in Austin ondersteun. Hierdie fasiliteite word meestal in die Kollege se Sentrum vir Biomediese Navorsingsondersteuning gehuisves, en bied 'n volledige reeks dienste in nukleïensuur- en proteïenvolgordebepaling, peptiedsintese, massaspektrometrie, proteïensuiwering en -analise, DNA-mikroskikkings, x-straal-kristallografie en transgeniese uitklopmuise . Hierdie fasiliteite sluit in:

Navorsing Kweekhuis

Die NHB Navorsingskweekhuis, geleë op die dak van die Norman Hackerman-gebou (NHB), verskaf groot kweekhuiskamers sowel as in- en reik-groeikamers vir plantnavorsers regoor die universiteit.

Beeldnavorsing

Die Biomediese Beeldingsentrum (BIC) is die tuiste van 'n hoëveld (3 Tesla) MRIt, 'n beeldanalise-rekenaarsuite, toetskamers, volledig toegeruste elektroniese en masjienwinkels, kantore en 'n konferensie-/klaskamerarea.

Nanotegnologie Kernfasiliteite

Die Texas Materials Institute is die tuiste van wat voorheen die Sentrum vir Nano en Molekulêre Wetenskap en Tegnologie was. Fasiliteite sluit in skanderingsondersoekmikroskopie, vervaardiging en toetsing van nanotoestelle, en elektroniese en vibrasiespektroskopie.

  • Nano vervaardiging en karakterisering Fasiliteit
  • Mikro-elektroniese Navorsingsfasiliteit
  • X-straal Analise Fasiliteit
  • Oppervlakanalisefasiliteit
  • Elektron- en skanderingsondersoekmikroskopie
  • Polimeer Karakterisering Fasiliteit
  • Cryo-EM

Masjien winkel

Die Fisika-masjienwinkel, geleë in RL Moore, ontwerp en vervaardig gespesialiseerde navorsingstoerusting en -instrumente vir navorsingslaboratoriums regoor die kampus. Die Fisika-masjienwinkel bestuur ook 'n Cryogenics-winkel.


Peptiedkartering deur LC-MS/MS Services

'n Opstelfooi kan van toepassing wees, afhangende van die aantal monsters en monstervoorbereidingstyd. Bogenoemde pryse is gebaseer op ontleding deur gebruik te maak van ons gestandaardiseerde metodes, wat bewys is om vir die meeste teenliggaampies en proteïene te werk. Metode-ontwikkelingsopsies kan nodig wees vir atipiese proteïene met unieke eienskappe.

Prys/beskikbaarheid/spesifikasies onderhewig aan verandering sonder kennisgewing. Tensy anders aangedui, is ons katalogus en pasgemaakte produkte slegs vir navorsingsgebruik en nie bedoel vir menslike of dierdiagnostiese of terapeutiese gebruik nie.

Bestel vanlyn

Of los 'n boodskap met 'n formele aankoop

Deur peptiedkartering te gebruik, kan subtiele veranderinge aan die primêre struktuur van 'n proteïen of teenliggaam geïdentifiseer word wat die aktiwiteit van die proteïen of die bindingsaffiniteit kan beïnvloed. Peptiedkartering deur LC-MS/MS is een van die kragtigste kwalitatiewe toetse om die primêre volgorde van proteïene of teenliggaampies te bevestig. Hierdie diens kan gebruik word om verskillende lotte van dieselfde proteïene, teenliggaampies of biosimilars te vergelyk.

Diens van peptied kartering analise deur LC-MS/MS sluit in:

A. Die teenliggaam/proteïen van belang word gedenatureer, verminder en verteer met 'n proteolitiese ensiem soos LysC of tripsien.
B. Opsioneel: 'n tweede proteolitiese ensiem word gebruik om die volgordebedekking van die proteïen te verhoog.
C. Die resulterende peptiedmengsels word op 'n omgekeerde-fase HPLC geskei. Die chromatograaf van UV-absorbansie word gegenereer by UV 214 nm.
D. Na HPLC skeiding word verdere analise uitgevoer deur 'n hoë resolusie massaspektrometrie (Thermo Fisher Orbitrap Velos of Fusion).
E. 'n Peptiedkaart van die proteïen word gegenereer vir vergelyking met 'n verwysingsproteïen.
F. Die pieke word na die primêre volgorde geanaliseer.
G. Optional (two or more samples): a comparability evaluation is performed to assess lot-to-lot variation between proteins or to compare biosimilars.

Deliverable information:
- Confirmation of primary sequences (sequence coverage: 60-90% using one enzyme > 98% using two or more enzymes).
- Glycoprofiling of N-linked oligosaccharides (heterogeneity of glycoforms & approximation of site occupancy).
- Identification & approx quantification of PTMs such as deamidation, oxidation, N-term pyroglutamate formation and C-term Lys processing (modified amino acid position and % modification can be detected).
- Similarity assessment between different lots.
- Comparability assessment for biosimilars.

Sample treatment: Denaturation, reduction/alkylation and enzymatic digestion followed by LC-MS or LC-MS/MS.


3.5: Protein Sequencing, Peptide Mapping, Synthetic Genes - Biology

Molekulêre Biologie Dienste

Sangon Biotech have developed particular technology for obtain DNA fragments ("gene") with specific functions either by cloning from natural existing organism or by chemical gene synthesis. Cloning is usually more convenient than gene synthesis, but cloning is also time-consuming and sometimes can be difficult. Sangon Biotech not only help you to obtain the desired gene, but also help you to subcloning the desired gene into any vectors to save your time and money.

  • Direct gene cloning with known sequence from known source
  • Norvel gene cloning using RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) technology

Gene expression is the process by which information from a gene is used in the synthesis of a functional gene product (either proteins or non-protein coding genes such as miRNA). The regulation of gene expression process was strictly controlled in a complicated network in vivo. Gene expression profiling indicates the role of a particular gene and the changes in gene expression is associated with many biological process such as disease developing. So monitor the changes in gene expression becoming an more and more important method to monitor the "action" of particular genes.

Real-time PCR analysis is the gold standard for quantifying gene expression. We have developed methods for sensitive, accurate quantification of mRNA or microRNA using real-time PCR. Both TaqMan probe-based analysis and SYBR Green dye-based analysis are available. Individual samples or 96 or 384 well plates can be analyzed.

  • mRNA Real Time Fluorescent Quantitative RT-PCR
  • microRNA Real Time Fluorescent Quantitative RT-PCR

Microsatellite (STR) Genotyping

Microsatellites, also known as short tandem repeats (STR), are widely used molecular markers in genetics. Sangon Biotech offers a complete microsatellite (MS) genotyping service.

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Genotying

SNPs are one of the most common types of genetic variation which is associated with many diseases. SNP genotyping is the measurement of genetic variations of single nucleotide polymorphisms (SNPs) between members of a species. Sangon Biotech have developed several SNP genotyping platforms for different requirement including:

  • Direct Sequencing
  • Restricted Fragment Length Polymorphisms (RFLP)
  • TaqMan Probe
  • Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)

cDNA library construction is a powful tool for gene expression, gene function research, norvel gene characterization, and many other applications. But obtain high-quality cDNA libraries is time-consuming and can be very challenging. Sangon Biotech has over 10 years of experience in generating cDNA libraries from various of samples. Thanks to our comprehensive sequencing platform. cDNA libraries with ESTs (expressed sequence tag) can also be sequenced and analysized here.

  • Identification of Bacteria or Fungi
  • PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) analysis for the identification of microbial populations of Bacteria
  • Microbial Population Analyzing

SNP service content price and procedure

SNP testing service platform

  • Direct sequencing
  • Restricted fragment length polymorphisms (RLFP)
  • TaqMan Probe
  • MALDI-TOF MS
  • Illumina beadchip SNP genotyping
  • Illumina beadchip methylation
  • Illumina beadchip gene expression profiles
  • Illumina beadchip microRNA expression profiles

Dienste Price ($) Turnaround Time Opmerkings
Known gene cloning from Prokaryotic or eukaryotic genome Minimum charge at $80 (
Tik Styl Werwe Price(dollar /case) samples/ chip
Human genome SNP genotyping chip Human Omni5-Quad (new) 5000,000 2,000 4 samples
Human Omni2.5-8 2500,000 1333.5 8 samples
Human Omni1-Quad 1140,000 916.7 4 samples
Human OmniZhongHua-8 (new) 900,000 750 8 samples
Human OmniExpress-12 700,000 666.7 12 samples
Human CytoSNP-12 300,000 583.5 12 samples
Human Exome-12(new) 250,000 366.7 12 samples
Human Linkage-24 6056 533.5 24 samples
Animal plant genome SNP genotyping chip Cow HD chip 70 800 8 samples
Cow SNP50 chip 50,000 666.7 24 samples
Cow LD chain chip 6000 366.7 24 samples
Dog HD chip 170,000 800 12 samples
Sheep SNP50 chip 50,000 666.7 12 samples
Horse SNP50 chip 50,000 666.7 12 samples
Pig SNP60 chip 60,000 666.7 12 samples
Corn SNP50 chip 50,000 666.7 24 samples
Methylation detection chip Human Methylation 27K 27,578 833.5 12 samples
Human Methylation 450K 480,000 1133.5 12 samples
Microarray HumanHT-12 V4 47,231 633.5 12 samples
MouseWG-6 45,281 700 6 samples
Custom SNP chip(more than 480 samples)
Werwe 96 144 192 384 768 1,152 1536
Price($) 4167 5,000 6700 11670 15300 20834 2250
Custom methylation chip(more than 480 samples)
Werwe 96 methylation sites 384 methylation sites ander
Price($) 41700 100000 inquriy

Bisulfite modification and sequencing method (BSP)

Frommer et al (1992) proposed methods of DNA methylation analysis, this method is reliable and precise. procedures:

  • Prepare genomic DNA of Sample
  • Bisulfite treatment (including purification and de-sulfosalicylic reaction) to convert unmethylated cytosine to uracil, while methylated cytosine remains unchanged.
  • Using methylation primer design software to design primers at the both ends of methylated regions.
  • Fragment amplification and PCR product recovery.
  • PCR products were sequenced directly or after cloned (quantitative analysis), analysis of each CpG island methylation.
  • Data Statistics. unmethylated DNA samples are used as a control.

Methylation specific PCR method (Methylation-Specific PCR, MS-PCR)

Herman et al (1996) in the use of bisulfite treatment on the basis of the new methods. High sensitivity of this method is mainly used for qualitative research. Prosedures:

  • Prepare genomic DNA of Sample
  • Bisulfite treatment (including the purification and de-sulfosalicylic reaction).
  • Using methylation primer design software design methylation specific primers (primer 1) or non-methylated primers in methylated regions (primer 2) 2 pairs.
  • For specific PCR amplification, only the fragments fully combinate with methylated or non-methylation specific primers can amplify the product.
  • Detection of MSP amplification, if DNA methylation for the treatment chain primers amplified fragments, it shows that the detected methylation sites exist if used for the treatment of non-methylated DNA chain The primers amplified fragments, then the detected methylation sites does not exist.

Dienste Hoeveelheid Unit price ($) Tydlyn Hoeveelheid Price
Bisulfite modification and sequencing method 50 Inquire
$165/sample/gene
(offer sequencing results of 10 clones)
20 to 25 business days >50 Inquire
methylation specific PCR method 100 Inquire
Combined Bisulfite Restriction Analysis 100 Inquire
High Resolution Melting method 200 Inquire
Pyrosequencing 200 Inquire
Methylation detection chip Sites of the amount of information Unit price /sample ($) The number of samples / chip Tydlyn
Human Methylation 450K 480000 $1,135 12 samples 4 weke
Customized methylation chip 96 methylation sites Inquire 15 weeks
384 methylation sites Inquire 20 weke

Lab report (experimental steps, including the BSP method statistical results of 5 clones), PCR electrophoresis photographs, sequencing trace files.

10.1 Adenovirus packaging services

10.2 Lentiviral packaging services

Dienste Hoeveelheid resultate Price($) Siklus
Vector construction ShRNA vector of the target gene 1 Rapporteer 166.7 1 to 2 weeks
Target gene shRNA vector Subscription 5 Report(4 object +1 negative contrast) 666.7 2 to 3 weeks
siRNA lentiviral screening Buy cell recovery and training 1 Cell state Image 83.5 2 working days
Slow virus infection experiments 1 The infection efficiency images and analysis 83.5 3 working days
shRNA design 3 Target information Vry 1 working days
shRNA vector construction 4 Vector Construction Report 666.7 2 to 3 weeks
Lentiviral packaging
(10e8TU/ml)
5 The virus liquid and the titer test report 1333.5 2 to 3 weeks
The slower virus infection ( interference filter) 4 Picture 333.5 1 to 2 weeks
qRT-PCR primer design and verification 2 Primer sequences ( containing an internal reference ) 33.5 1 weeks
qRT-PCR detect 3*5 Experimental data and analysis 300 1 to 2 weeks
Western Blot detect 5 Experimental data and analysis ( primary antibody ) 333.5 1 to 2 weeks
Total price / / 3500 7 to 10 weeks
Establish stable Filter cell lines The effective siRNA lentiviral repeated infection ( positive + negative ) 2 Picture 266.7 1 to 2 weeks
Stable cell strain was amplified ( positive + negative ) 2 Cell picture 333.5 3 to 4 weeks
qRT-PCR detect 3*2 Experimental data and analysis 200 1 to 2 weeks
Western Blot detect 3*2 To provide an anti- experimental data analysis (customer ) 200 1 to 2 weeks
Infected cells (25T flasks , positive ( two kinds ) + negative , each bottle ) Cells and photo 333.5 1 to 2 weeks
Total price / / 1333.5 6 to 9 weeks

11.RNA Interference Service

Dienste Hoeveelheid Resultate Price ($) Tydlyn
shRNA vector construction Gene specific shRNA sequence is designed according to the target gene and cloned to shRNA expression vector 1 Rapporteer $165 1 to 2 weeks
Gene specific shRNA vector set 5 Report(4 gene specific shRNA vector +1 negative contrast) $665 2 to 3 weeks
siRNA lentiviral screening Cell culture 1 Image of cultured cells $85 2 business days
Lentiviral infection 1 Infection efficiency images and analysis $85 3 business days
shRNA design 3 Target information Vry 1 business days
shRNA vector construction 4 Vector Construction Report $665 2 to 3 weeks
Lentiviral packaging
(10e8TU/ml)
5 The virus liquid and the titer test report $1330 2 to 3 weeks
The Lentiviral infection ( interference filter) 4 Picture $330 1 to 2 weeks
qRT-PCR primer design and verification 2 Primer sequences ( containing an internal reference ) $30 1 weeks
qRT-PCR detection 3*5 Experimental data and analysis $300 1 to 2 weeks
Western Blot detection 5 Experimental data and analysis ( primary antibody ) $330 1 to 2 weeks
Total price / / $3,500 7 to 10 weeks
Establish stable cell lines The effective siRNA lentiviral repeated infection ( positive + negative control) 2 Picture $265 1 to 2 weeks
Stable cell strain was amplified ( positive + negative control) 2 Cell picture $330 3 to 4 weeks
qRT-PCR detection 3*2 Experimental data and analysis $200 1 to 2 weeks
Western Blot detection 3*2 To provide an anti- experimental data analysis (customer ) $200 1 to 2 weeks
Infected cells (25T flasks , positive ( two kinds ) + negative , each bottle ) Cells and photo $330 1 to 2 weeks
Total price / / $1,330 6 to 9 weeks

Reports include: siRNA sequences, construct vectors sequencing report, quantitative PCR test report, Western Blot image and all the experimental data and detailed experimental procedures


3.5: Protein Sequencing, Peptide Mapping, Synthetic Genes - Biology

One of the Largest Professionals in Oligo Synthesis

  • Worldwide Services
  • One of the Largest and the Most Experienced Suppliers
  • Wide Range Product Lines
  • All Oligos Passed QC by Mass Spectrometry Analysis
  • One of the Largest and the Most Experienced Suppliers
  • Highest Purity at Lowest Price
  • Specializing in HAP* (High Affinity Purification) and PAGE Purification (No Purification Charges)
  • Fast Services: Synthesis Completed within 24 or 36 Hours (for HAP* or PAGE)
  • All oligos with modified base are purified by HPLC (WAVE system)

Oligonucleotide synthesis is the chemical synthesis of short nucleic acids chains with desired sequence . The capability of "create" nucleic acids from building blocks (2'-deoxynucleosides, ribonucleosides, or chemically modified nucleosides, e.g. Florescence labeled deoxynucleosides.) has speeded up research in molecular biology. Oligonucleotides are widely used in most laboratory and it is extremely useful in various applications in molecular biology and medicine.

The development of oligonucleotide synthesis technology started in the early 1950s. The most widely used technique for oligonucleotide synthesis currently is the solid-phase synthesis using phosphoramidite modified nucleosides as primary elements. The synthesis of DNA and RNA is carried our in 3'-5'direction, on the opposite of the natural 5'-3' direction. The synthesis process has been used since the late 1970s and become more and more automated during the past 30 years. Now the major steps of oligonucleotide synthesis are performed by automated synthesizers. The limits for the length of oligonucleotide being synthesized and the purity of oligonucleotides also increases.

As the world's leading supplier of custom oligonucleotides, Sangon Biotech have over 15 years of experience perfecting the process of making oligos. The process of oligonucleotide synthesis in Sangon Biotech was fully automated and integrated and now we have a capacity of 10,000 oligos per day, with a length limit up to 130-bp and 3 kinds of purification methods (HAP, PAGE and HPLC). We also able to successfully synthesize difficult and unusual oligonucleotides. A complicated quality assurance system was established to ensure the process was carried under strict control.

Frequently Asked Questions and Answers

Q: What's the storage condition of oligonucleotide ?

Synthesized oligonucleotides are provided in lyophilized powder. Oligonucleotides in the form of lyophilized powder are relatively stable, it can be transported at ambient temperature and stored at room temperature for a couple of days. Oligos in lyophilized powder is stable for years when stored at -20℃. After reception, oligonucleotides are recommended to be dissolved in TE buffer to 100 ?M and stored at -20℃. It is stable for several months and freeze-thraw cycles should be avoided. A work solution in 10 ?M is always stable for several days if stored at 2-8℃.

Q: How do I measure the amount of oligonucleotides ?

An OD reading is a quick way of estimating how much DNA is contained in the solution, by measuring the absorbance at 260 nm. 1 OD is approximately 33 ?g of crude oligo DNA. It should be noted that, for especially desalted oligos, the OD reading is a measurement of the total amount of nucleic acid which includes both the full-length and failed sequences.

Q: What is HAP purification and how do I choose it ?

High Affinity Purification (HAP) is a patented, novel purification method for custom oligos developed by Sangon Biotech. DMT-ON-Oligo in the crude oligo mixture is first selectively absorbed on a high affinity resin in HAP column while incomplete oligos pass through. Final products is obtained by removing the protection group of DMT under mild acidic conditions. HAP method provides two major advantages, high purity superior to De-Salted method (Purity of a standard 20 bases-HAP is >85%, 30 bases-HAP > 80% etc. ), and low cost compare to PAGE or HPLC methods. Oligos produced by the HAP method has such high purity that they can be directly used for any downstream experiments such as PCR, DNA Sequencing, Gene Synthesis, and Mutagenesis. At present, the most economic method to produce oligos is the De-Salted method, which however, yields products poor in purity. For example, the purity of 20-mer, 40-mer and 60-mer is approximately 68%, 45% and 30% respectively. This is calculated based on the 4 steps in DNA synthesis: De-DMT, Coupling, Oxidation and Capping. The average yield of each cycle is about 98%. The purity of 20-mer is therefore (0.98)20-1 = 68% of 40-mer = (0.98)40-1 = 45% and of 60-mer = (0.98)60-1 = 30%. Most laboratories use De-Salted oligos despite of their inferior purity because higher quality oligos produced by alternative methods such as PAGE, HPLC, and OPC are too costly. HAP presents the perfect alternative for high purity oligos at lowest prices. In fact, price is even lower than those of De-Salted method in some cases.

Q: What are the various purification options ?

During the synthesis of oligonucleotides, the crude products contain undesired oligos caused by side reaction as well as full-length oligos. Purification procedures are required to remove these undesired products and/or other component such as salts. Sangon Biotech offer 3 kinds of purification options for oligonucleotides.
HAP (High Affinity Purification): As described above.
PAGE polyacrylamide gel electrophoresis ) : Oligos purified by (PAGE) are run on a gel and the full-length product is excised and recovered by electroelution. Resolution of 1 base differences are possible. PAGE pure oligos are generally 96 to 99% pure.

Reverse Phase HPLC: This method also uses the 5' trityl protecting group as a means of binding to the column. This method works well for oligos up to 55 bases and generally 90 to 95% pure.


Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics

Most advances in biology can usually be traced back to the development of a new technique: the recent explosion in sequence information in the databases arose from the pioneering work on separation methods by Frederick Sanger which paved the way for the development of protein (Sanger, 1945) and DNA/RNA (Maxam & Gilbert, 1977 Sanger, 1981) sequencing and culminated in the receipt of two Nobel prizes by Sanger. The initial phase of sequence database expansion was slow due to the tedious and slow nature of protein sequencing. Peptide sequencing was carried out manually and the complete analysis of a protein was tiresome, requiring the isolation of sufficient peptides from several digests of the target protein using proteases of different specialities to collect an overlapping set of fragments which cover the whole sequence. Protein sequencing gained momentum when the phenylisothiocyanate sequencing chemistry developed by Edman in 1949 was automated (Edman & Begg, 1967) and a commercial instrument requiring lower amounts (nanomoles) of sample was put on the market. Further technical advances such as novel valves to deal with small volumes of aggressive chemicals, the introduction of high pressure liquid chromatography (HPLC), and novel supports for sample immobilization, were all combined in the first gas phase sequencers, greatly increasing the sensitivity and allowing automated data collection (Hewick et al . 1981) and analysis. The new instruments with a sensitivity in the low picomole range appeared as rapid advances in DNA technology such as the development of restriction mapping (Danna et al . 1973), cloning (Cohen et al . 1973) and the dideoxynucleotide sequencing chemistry were threatening to make protein chemistry a relic of the past (Malcolm, 1978).


Manual sequence workflows

Using the tools within the Bio Tool Kit, users can “walk” up or down an MS/MS spectrum to determine the sequence of a peptide (Figure 3). This process is straightforward and is accomplished by following these steps:

  1. Highlight a fragment ion as the starting point for manual sequencing.
  2. Double-click on the caption for the next peak to consider in the sequence.
  3. Continue selecting peaks until finished. The final result shows the peptide sequence ladder.

Peptide sequences can also be matched to MS/MS data with the peptide fragment pane. Here, a table of theoretical fragment ions from the proposed sequence is matched to ions found in the data. All matches are highlighted within the table and labeled in the MS/MS spectrum. The tool considers multiple different fragment ion types and will also find and highlight modifications (Figure 4).

Figure 3. Manual peptide sequencing. The peak with nominal mass 1092 was highlighted as the starting point for sequencing the peptide from the MS/MS data. The next peaks were then selected for consideration, one after another, with the final sequence shown above the spectrum.

× Close

Figure 4: Peptide fragment pane. The theoretical fragment ions from the proposed sequence are matched to the fragment ions found in the MS/MS data. All matches are highlighted in the table and annotated in the spectrum.

× Close

3.5: Protein Sequencing, Peptide Mapping, Synthetic Genes - Biology

Below is a list of core facilities and advanced laboratories in the college.

DEPARTMENT OF CHEMISTRY

Interdisciplinary Life Sciences Graduate Programs

The ILS core facilities support cellular and molecular biology research at The University of Texas at Austin. The facilities offer a full range of services in nucleic acid and protein sequencing, peptide synthesis, mass spectrometry, protein purification and analysis, DNA microarrays, x-ray chrystallography, and transgenic - knockout mice. The ICMB core facilities include:

IMAGING RESEARCH CENTER

The Imaging Research Center is home to a high-field (3 Tesla) MRIt, an image analysis computer suite, test rooms, fully outfitted electronics & machine shops, offices, and a conference/classroom area.

NANOTECHNOLOGY CORE FACILITIES

The Center for Nano and Molecular Science and Technology facilities located in the FNT building features a variety of facilities that support state-of-the-art teaching activities and high-level scientific research.

  • Nano/Micro Fabrication and Inspection
  • Electronic and Optoelectronic Testing
  • Spectroscopy
  • Electron and Scanning Probe Microscopy

PHYSICS DEPARTMENT

The Department of Physics provides a number of facilities and services for use by faculty, staff, and students within the Department. Many facilities are also available for use by other university-affiliated students and staff.

    Mechanical Section is located on the third floor (first basement level) of the Physics, Math and Astronomy Building (PMA) and comprises four groups—the Machine Shop, die Student Machine Shop, die Cryogenics Shop, en die Electronics Shop. is a cross-college collaborative laboratory aiming to advance the fundamental understanding of new materials, particularly complex oxides.

PLANT RESOURCES CENTER

The Plant Resources Center (TEX-LL) with over 1,000,000 specimens is the largest herbarium in the southwestern United States and ranks fifth among U.S. university herbaria and twelfth across the nation. TEX-LL, with about a quarter of its specimens from Texas, has the largest holdings of Texas plants in the world. Nearly one half of the specimens at TEX-LL are from Latin America, with an especially strong representation of Mexico and northern Central America. Presently the number of vascular plant collections inserted in the herbarium is growing at an approximate rate of 16,400 specimens per year.

TEXAS PETAWATT LASER

The college is currently home to the highest power laser in the world, the Texas Petawatt Laser, which, when turned on, has the power output of more than 2,000 times the output of all power plants in the United States. (A petawatt is one quadrillion watts.) The laser is brighter than sunlight on the surface of the sun, but it only lasts for an instant, a 10th of a trillionth of a second (0.0000000000001 second).

TEXAS NATURAL SCIENCE CENTER

With many facilities at the J.J. Pickle research campus in North Austin, the Texas Natural Science Center is home to some of the most extensive collections of invertebrate and vertebrate fossils and natural history collections in the country. A high-resolution X-ray CT (Computed Tomography) scanner is available at the Vertebrate Paleontology Lab.

UTEX CULTURE COLLECTION OF ALGAE

The Culture Collection includes approximately 3,000 different strains of living algae, representing most major algal taxa. The primary function of UTEX is to provide algal cultures at modest cost to a user community. Cultures in the Collection are used for research, teaching, biotechnology development, and various other projects throughout the world.


Kyk die video: Protein SequencingEdman Degradation, Peptide Mapping, and De Novo Protein Sequencing (September 2022).