Inligting

19.3: Epigenomiese toetse - Biologie

19.3: Epigenomiese toetse - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ChIP: 'n metode om te bepaal waar proteïene aan DNA bind of waar histone gemodifiseer word

Gegewe die belangrikheid van epigenomiese inligting in biologie, is groot pogings aangewend om seine te bestudeer wat hierdie inligting kwantifiseer. Die prosedures van ChIP word soos volg beskryf en word in Figuur 19.2 uitgebeeld:

  1. Selle word blootgestel aan 'n kruisbindingsmiddel soos formaldehied, wat veroorsaak dat kovalente bindings tussen DNA en sy gebonde proteïene vorm (bv. histone met spesifieke modifikasies).
  2. Genomiese DNA word uit die selkern geïsoleer.
  3. Geïsoleerde DNA word geskeer deur sonikasie of ensieme.
  4. Teenliggaampies word gegroei om 'n spesifieke proteïen te herken, soos dié wat by histoonmodifikasie betrokke is. Die teenliggaampies word gekweek deur die proteïene van belang bloot te stel aan soogdiere, soos bokke of rotte, wie se immuunrespons dan die produksie van die verlangde teenliggaampies veroorsaak.
  5. Teenliggaampies word by die oplossing gevoeg om die komplekse te immunopresipiteer en te suiwer.
  6. Die kruisbinding tussen die proteïen en DNS word omgekeer en die DNS-fragmente spesifiek vir die epigenetiese merke word gesuiwer.

Na 'n chip-eksperiment het ons kort reekse van DNS wat ooreenstem met plekke waar histone aan die DNS gebind was. Om die ligging van hierdie DNS-fragmente in die genoom te identifiseer, kan 'n mens hulle hibridiseer met bekende DNS-segmente op 'n skikking of geenskyfie en dit met fluoresserende merke visualiseer; hierdie metode staan ​​bekend as Chip-chip. Alternatiewelik kan 'n mens massiewe parallelle volgende-generasie volgordebepaling van hierdie fragmente doen; dit staan ​​bekend as ChIP-seq. Laasgenoemde benadering, ChIP-seq, is 'n nuwer benadering wat baie meer gereeld gebruik word. Dit word verkies omdat dit 'n wyer dinamiese reeks opsporing het en probleme soos kruisverbastering in Chip-chip vermy.

Elke volgordemerker is 30 basispare lank. Hierdie merkers word gekarteer na unieke posisies in die verwysingsgenoom van 3 miljard basisse. Die aantal lesings hang af van volgorde-diepte, maar tipies is daar in die orde van 10 miljoen gekarteer-lesings vir elke ChIP-volgorde-eksperiment.

Daar is 'n redelik standaard pyplyn wat gebruik word om die verryking van die proteïen van belang by elke plek in die genoom af te lei, gegewe 'n stel kort opeenvolgingslesings uit 'n ChIP-seq eksperiment. Eerstens moet die DNS-fragmente na die DNS gekarteer word (genoem leeskartering). Vervolgens moet ons bepaal watter streke van die genoom statisties beduidende verryking van die proteïen van belang het (genoem piekroeping). Na hierdie voorverwerkingstappe kan ons verskillende modelle onder toesig en sonder toesig bou om chromatientoestande en hul verband met biologiese funksie te bestudeer. Ons kyk om die beurt na elkeen van hierdie stappe.

Bisulfiet-volgordebepaling: 'n metode om te bepaal waar DNA gemetileer is

DNA-metilering was die eerste epigenomiese modifikasie wat ontdek is en is 'n belangrike transkripsiereguleerder deurdat die metilering van sitosienreste in CpG-dinukleotiede 'stilte' of onderdrukking van transkripsie tot gevolg het. Bisulfiet-volgordebepaling is 'n metode waardeur DNS voor volgordebepaling met bisulfiet behandel word, wat die presiese bepaling moontlik maak van die nukleotiede waarteen die DNS gemetileer is. Bisulfietbehandeling skakel ongemetileerde sitosienreste om na urasiel, maar beïnvloed nie gemetileerde sitosiene nie. Gevolglik kan genomiese DNS in volgorde met of sonder bisulfietbehandeling geskeduleer word, en die volgordes kan vergelyk word, en die plekke waar sitosien nie in die behandelde DNS na urasil omgeskakel is nie (of, ekwivalent, plekke waar daar bisulfiet is) gegenereerde verskil tussen die behandelde en onbehandelde volgordes) is plekke waar sitosien gemetileer is. Hierdie analise veronderstel volledige omskakeling van ongemetileerde sitosienreste na urasiel, so onvolledige omskakeling kan lei tot vals positiewes (d.w.s. nukleotiede wat geïdentifiseer is as gemetileerde, maar wat in werklikheid nie gemetileerd was nie) [11].


Kyk die video: Lewenswetenskap - Perifere senuweestelsel (Oktober 2022).