Inligting

Verwagte bande in poliakrielamiedgel

Verwagte bande in poliakrielamiedgel


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek het iets in my notas wat nie reg lyk nie.

As ek beperkingsensieme op 'n PCR-produk gebruik, hoeveel bande moet ek sien mits ek weet die beperkingsensieme sal die DNA sny? As ek twee beperkingsensieme gebruik verwag ek twee snitte dan moet gel drie bande wys. Dan, as ek net een ensiem gebruik en ek weet die ensiem sal net een keer sny, moet ek dan twee bande verwag? Volgens my notas word een band verwag.


As jou beperkingsensiem slegs 'n enkele plek op die DNA-volgorde teiken, sal dit elke DNA-string in twee fragmente verdeel. As die beperkingsensiem elke string sny, sal jy daardie twee fragmente sien. Let daarop dat as die twee fragmente dieselfde lengte het, hulle as 'n enkele band kan verskyn wanneer dit met behulp van gelelektroforese geskei word.

As die ensiem nie alles sny nie, sal die ongesnyde DNA ook teenwoordig wees. Dit is hoekom jy altyd ongesnyde DNA in die jelelektroforese moet skei.


Tegnologieë om selsubstraatmeganika in hidrogels te ontwerp

Makoto Funaki, Paul A. Janmey, in biologie en ingenieurswese van stamselnisse, 2017

8.1 Poliakrielamiedgels

Poliakrielamiedgels het as 'n belangrike hulpmiddel gedien om die effek van substraatstyfheid op sellulêre funksies in verskeie seltipes te ondersoek sedert Pelham et al. berig dat selmotiliteit en fokale adhesie in fibroblaste gereguleer word deur die styfheid van kollageen-bedekte poliakrielamied gels. 62 Een van die voordele van poliakrielamiedgels is dat hulle biologies inert is. As gevolg hiervan, die afstemming van die styfheid van poliakrielamiedgels deur die konsentrasies van akrilamied en bisakrielamied aan te pas, wat die digtheid van die poliakrielamiednetwerk beïnvloed, beïnvloed nie die biochemiese eienskap van die gels nie. Dit is dus moontlik om aan te neem dat enige verskil in sellulêre funksies waargeneem tussen selle wat op poliakrielamiedgels met verskillende styfheid gesaai is, toegeskryf kan word aan die verskil in die styfheid van gels. Deur die konsentrasies van akrielamied en bisakrielamied te wissel, kan die omvang van styfheid dié van die meeste sagte weefsels dek (Fig. 23.2). 63 Hierdie biologiese traagheid van poliakrielamied verhoed egter binding van seloppervlakreseptore en adhesiemolekules wat in die medium teenwoordig is. Om dus by selle betrokke te raak, moet kleefstofmolekules kovalent aan die jel gekoppel word deur gebruik te maak van kruisbinders, wat twee funksionele groepe het, een bind aan poliakrielamied en 'n ander bind aan adhesiemolekules, soos kollageen en fibronektien. 6,64 Een nadeel van poliakrielamiedgels is die beperking daarvan tot 2-D kultuur omdat akrilamied hoogs giftig is voor polimerisasie.

Figuur 23.2 . Meganiese eienskappe van poliakrielamied substrate.

Die skuifmodulus van poliakrielamied gels met 'n reeks akrilamied (aangedui as persente naby data lyne) tot bis-akrielamied (aangedui as kruisbinder) proporsies gemeet is. Die skuifmodulus (G), uitgedruk in Pascal, neem toe by konstante polimeermassa met toenemende kruisbinder. Die verhoging van die konsentrasie akrielamied van 3% tot 12% skep ook 'n groot styfheidsreeks van 10 tot 50 000 Pa. soliede lyn dui die teoretiese styfheid van 'n rubberagtige netwerk aan as elke dwarsskakel elasties effektief was.


PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophorese), is 'n analitiese metode wat gebruik word om komponente van 'n proteïenmengsel te skei op grond van hul grootte. Die tegniek is gebaseer op die beginsel dat 'n gelaaide molekule in 'n elektriese veld na 'n elektrode met teenoorgestelde teken sal migreer. Die algemene elektroforese tegnieke kan nie gebruik word om die molekulêre gewig van biologiese molekules te bepaal nie omdat die mobiliteit van 'n stof in die gel afhang van beide lading en grootte. Om dit te oorkom, moet die biologiese monsters behandel word sodat hulle eenvormige lading verkry, dan hang die elektroforetiese mobiliteit hoofsaaklik van grootte af. Hiervoor moet verskillende proteïenmolekules met verskillende vorms en groottes gedenatureer word (met behulp van SDS gedoen) sodat die proteïene hul sekondêre, tersiêre of kwaternêre struktuur verloor het. Die proteïene wat deur SDS bedek word, is negatief gelaai en wanneer dit op 'n gel en in 'n elektriese veld geplaas word, sal dit migreer na die anode (positief gelaaide elektrode) word geskei deur 'n molekulêre sif effek gebaseer op grootte. Na die visualisering deur 'n kleuring (proteïen-spesifieke) tegniek, kan die grootte van 'n proteïen bereken word deur sy migrasieafstand te vergelyk met dié van 'n bekende molekulêre gewig leer (merker).


DNA-kleuring in agarose- en poliakrielamiedgels deur metielgroen

Metielgroen (MG) is 'n goedkoop, nie-eiendomsregtelike, tradisionele histologiese vlek vir selkerne. Wanneer dit aan DNA gebind word en by opwekking met oranje-rooi lig, fluoresseer dit helder in die verste rooi gebied. Ons het MG vergelyk met etidiumbromied (EtBr), die konvensionele vlek vir DNA in gels, en Serva DNA stain G™ (SDsG), 'n eie vlek wat bemark word as 'n veiliger alternatief vir EtBr vir kleuring van elektroforese DNA-bande in agarose en poliakrielamied gels. DNA-MG fluoressensie is aangeteken en 2.4 μg/ml MG het skerp beelde van geëlektroforeerde DNA geproduseer na inkubasie vir 10 min. Kleuroplossings was stabiel en deteksielimiete vir dowwe bande sowel as relatiewe densitometriese kwantifisering was gelykstaande aan EtBr. MG, EtBr en SDsG kos onderskeidelik 0,0192, 0,024 en 157,5 Amerikaanse sent/toets. MG is 'n effektiewe vlek vir die visualisering van DNA in agarose en poliakrielamied gels. Die belangrikste voordele daarvan, insluitend lae koste, vergelykbare kwaliteit van kleuring, berging by kamertemperatuur, foto-weerstand en lae mutageniese profiel weeg swaarder as die nadele soos kleuring van opsporingskleurstof en die vereiste vir 'n jeldokumentasiestelsel met 'n rooi filter.

Sleutelwoorde: DNS-binding Serva DNS-vlek G™ etidiumbromied verrooi fluoressensiegeldokumentasiestelsel interkalasiemiddel metielgroen molekulêre biologie.


Switzer, R.C. III, Merril, C.R. & Shifrin, S. 'n Hoogs sensitiewe silwer vlek vir die opsporing van proteïene en peptiede in poliakrielamied gels. Anaal. Biochem. 98, 231–237 (1979).

Merril, C.R., Dunau, M.L. & Goldman, D. 'n Vinnige sensitiewe silwer vlek vir polipeptiede in polyacrylamide gels. Anaal. Biochem. 110, 201–207 (1981).

Heukeshoven, J. & Dernick, R. Vereenvoudigde metode vir kleuring van proteïene in poliakrielamiedgels en die meganisme van silwerkleuring. Elektroforese 6, 103–112 (1985).

Somerville, L.L. & Wang, K. Die ultrasensitiewe silwer 'proteïen'-vlek bespeur ook nanogramme van nukleïensure. Biochem. Biofis. Res. Commun. 102, 53–58 (1981).

Boulikas, T. & Hancock, R. 'n Hoogs sensitiewe tegniek vir die kleuring van DNA en RNA in poliakrielamiedgels met behulp van silwer. J. Biochem. Biofis. Metodes 4, 219–228 (1981).

Tsai, C.M. & Frasch, C.E. 'n Sensitiewe silwer vlek vir die opsporing van lipopolisakkariede in poliakrielamiedgels. Anaal. Biochem. 119, 115–119 (1982).

Dubray, G. & Bezard, G. 'n Hoogs sensitiewe periodiese suur-silwer vlek vir 1,2-diol groepe van glikoproteïene en polisakkariede in poliakrielamied gels. Anaal. Biochem. 119, 325–329 (1982).

Caetano-Anollés, G., Bassam, B.J. & Gresshoff, P.M. DNA-amplifikasie-vingerafdrukke met behulp van baie kort arbitrêre oligonukleotied-inleiders. Biotegnologie (NY) 9, 553–557 (1991).

Bassam, B.J., Caetano-Anollés, G. & Gresshoff, P.M. Vinnige en sensitiewe silwerkleuring van DNA in poliakrielamiedgels. Anaal. Biochem. 196, 80–83 (1991).

Bassam, B.J. & Bentley, S. Elektroforese van poliëster-gesteunde poliakrielamiedgels. Biotegnieke 19, 568–573 (1995).

Merril, C.R. Silwerkleuring van proteïene en DNA. Natuur 343, 779–780 (1990).

Rabilloud, T. Meganismes van proteïen silwer kleuring in polyacrylamide gels: 'n 10-jaar sintese. Elektroforese 10, 785–794 (1990).

Guillemette, J.G. & Lewis, P.N. Opsporing van subnanogram hoeveelhede DNA en RNA op inheemse en denaturerende poliakrielamied en agarose gels deur silwer kleuring. Elektroforese 4, 92–94 (1983).

Kolodny, G.M. 'n Verbeterde metode om die resolusie en sensitiwiteit van silwerkleuring van nukleïensuurbande in poliakrielamiedgels te verhoog. Anaal. Biochem. 138, 66–67 (1984).

Beidler, J.L., Hilliard, P.R. & Rill, R.L. Ultrasensitiewe kleuring van nukleïensure met silwer. Anaal. Biochem. 126, 374–380 (1982).

Goldman, D. & Merril, C. R. Silwerkleuring van DNA in poliakrielamiedgels: lineariteit en effek van fragmentgrootte. Elektroforese 3, 24–26 (1982).

Merril, C.R., Harrington, M. & Alley, V. 'n Foto-ontwikkeling silwer vlek vir die vinnige visualisering van proteïene geskei op poliakrielamied gels. Elektroforese 5, 289–297 (1984).

Blum, H., Beier, H. & Gross, H.J. Verbeterde silwerkleuring van plantproteïene, RNA en DNA in poliakrielamiedgels. Elektroforese 8, 93–99 (1987).

Merril, C.R., Goldman, D., Sedman, S.A. & Ebert, M.H. Ultrasensitiewe vlek vir proteïene in poliakrielamiedgels toon streeksvariasie in serebrospinale vloeistofproteïene. Wetenskap 211, 1437–1438 (1981).

Kruchinina, N.G. & Gresshoff, P.M. Skoonmaakmiddel beïnvloed silwer volgorde. Biotegnieke 17, 280–282 (1994).


Gelelektroforesemetode om die konsentrasie van enkelwandige koolstofnanobuise te meet wat uit biologiese weefsel onttrek word

'n Vinnige en sensitiewe metode om enkelwandige koolstofnanobuise (SWNT's) in biologiese monsters op te spoor word aangebied. Die metode gebruik poliakrielamiedgelelektroforese (PAGE) gevolg deur kwantifisering van SWNT-bande. SWNTs versprei in bees serum albumien (BSA) is gebruik om die metode te ontwikkel. Wanneer BSA-SWNT-dispersies aan natriumdodesielsulfaat (SDS)-PAGE onderwerp is, het BSA deur die stapelgel gegaan, die oplosgel binnegegaan en na die anode gemigreer soos verwag is. Die SWNTs het egter in 'n skerp band by die koppelvlak tussen die laaiput en die stapelgel opgehoop. Die intensiteite van gedigitaliseerde beelde van hierdie bande was eweredig aan die hoeveelheid SWNTs wat op die gel gelaai is met 'n opsporingslimiet van 5 ng SWNTs. Om die metode te toets, is normale rotnier (NRK) selle in kultuur toegelaat om SWNTs op te neem na blootstelling aan medium wat verskeie konsentrasies BSA-SWNTs bevat vir verskillende tye en temperature. Die SDS-PAGE-ontledings van sellisaatmonsters dui daarop dat BSA-SWNTs NRK-selle binnedring deur vloeistoffase-endositose teen 'n tempo van 30 fg/dag/sel by blootstelling aan medium wat 98 mikrog/mL SWNTs bevat.


"Wavy" bands in SDS-PAGE gel - (19/07/2013)

Ek het hierdie somer vir die eerste keer SDS-PAGE-gels gebruik om myosien-swaar kettings wat in skeletspiere teenwoordig is, te skei. Ek het opgemerk dat ek soms ongelyke en golwende bande kry. Soms is dit 'n werklike kromheid in die band, soms is dit net die band wat in die baan kantel. Ek kan gels kry waar ek glad nie golwend is nie, maar ek het nie uitgepluis wat ek anders doen nie. Is die golwendheid net te wyte aan die skeur van die putte? Of moontlike borrels aan die onderkant van die skei-/oplosgel?

Vir my gels hardloop ek twee gels gelyktydig op 'n Hoefer SE600-stelsel. Omdat ek sulke swaar proteïene skei, laat ek die jel teen ongeveer 7C vir ongeveer 45 uur laat loop. My spanning in die stapelgel is 70V en dan verhoog ek dit na 200V in die skei/oplosgel.

Hier is twee gels wat ek gister gehardloop het, wat albei my probleem illustreer:
' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4861" target="_blank">
' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4862" target="_blank">

as dit 'n ru-ekstrak is, kan dit sout bevat wat die prestasie van SDS-PAGE versteur

Maar dit gebeur nie altyd met dieselfde monsters nie.

Byvoorbeeld, in die eerste jel-beeld is bane 3, 7 en 13 almal presies dieselfde ding, maar net baan 7 het 'n golf.

Jy kan ook na hierdie SDS-BLADSY &ldquoHall of Shameful Gels&rdquo http://www.ruf.rice.edu/ kyk

Dankie vir die wenk. Ek het al voorheen die saal van skandelike gels gesien, maar ek is redelik seker my stapel-/skei-koppelvlak is skoon en reguit. Ek spoel ook 'n paar keer my putte uit met lopende buffer voor laai.

Ek gaan probeer om die gels vir 'n bietjie langer te laat polimeer, asook om te verseker dat putte reguit is en ek nie die kam te vinnig of min verwyder nie. Ons sal kyk of dit help.

Benewens die raad in die gekoppelde pos, as jy die jel by 7C gaan laat loop, sal jy litium dodecyl sulfate (lds) moet gebruik in plaas van sds. sds kristalliseer by laer temperature en kan allerhande onheil veroorsaak.

ons gebruik om miosien swaar kettings (van die brein) te skei deur 3.5-5% gradiënt gels met 'n 8-0M ureum gradiënt oornag lopies by 5mA (ek dink, dit was baie lank gelede).


Verwagte bande in poliakrielamiedgel - Biologie

Inheemse BLADSY-beginsel:

Inheemse PAGE gebruik dieselfde diskontinue chloried- en glisienioonfronte as SDS-PAGE om bewegende grense te vorm wat polipeptiede stapel en dan skei deur lading tot massa verhouding. Proteïene word voorberei in 'n nie-reduserende nie-denaturerende monsterbuffer, wat die proteïene se sekondêre struktuur en inheemse ladingsdigtheid handhaaf. Daarom kan jy maklik veelvuldige bande van die foto van jou oorspronklike PAGE-gel sien as jou teikenproteïen gepolimeriseerde vorms in jou monster het. In inheemse PAGE-elektroforese het die meeste proteïene 'n suur of effens basiese pl (iso-elektriese punt) (

3–8) en migreer na die negatiewe pool. As jou proteïen se pl byvoorbeeld groter as 8,9 is, moet jy waarskynlik die anode omkeer en die inheemse PAGE-gel laat loop.

Kom meer te wete oor Native-PAGE:

  • Vir die elektroforesestelsel word 'n bio-radstelsel aanbeveel.
  • Vir 'n 5ml inheemse PAGE-stapelgel

*: Bygevoeg net voor elke gebruik.

Vir 'n 10ml inheemse PAGE-skeigel:

Asielamied persentasie 6% 8% 10% 12% 15%
Akrielamied/bis-akrielamied (30%/0,8% w/v) 2ml 2,6 ml 3,4 ml 4ml 5 ml
0,375 M Tris-HCl (pH=8,8) 7,89ml 7,29 ml 6,49ml 5,89 ml 4,89 ml
*10% (w/v) ammoniumpersulfaat (AP) 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl
*TEMED 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl

*: Bygevoeg net voor elke gebruik.

Monsterbuffer (2x):

62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8
25% gliserol gliserol
1% Broomfenol Blou

25 mM Tris
192 mM glisien

Let wel: lopende buffer moet wees

pH 8,3. Moenie die pH aanpas nie.

Gel loop protokol:

1. Berei gepaste hoeveelheid skeigel in 'n klein beker, voeg dan spesifieke vol. van AP en TEMED en draai die beker liggies om om voldoende vermenging te verseker. Pipetteer die geloplossing in die gaping tussen die glasplate van gelgietwerk (Moenie volledig vul nie). Vul die russpasie met water (alternatiewelik isopropanol). Laat 20-30 minute toe vir 'n volledige gelering.

2. Jy kan die stapelgel-oplossing voorberei terwyl die skei-gel gel. Berei toepaslike hoeveelheid stapelgel in 'n bekers voor en meng met 10% AP en 1% TEMED. Gooi die water in die eerste stap uit en pipet die stapelgeloplossing in die gaping en steek die kam in. Laat 20-30min toe om dit te laat gel.

3. Meng jou monster met monsterbuffer. Moenie jou monster verhit nie!

4. Laai die monstermengsel en stel 'n toepaslike spanning in om die elektroforese uit te voer.

Let wel: Dit is beter om die stelsel op ys te plaas en nie 'n relatiewe hoë Volt in te stel as die proteïene afbreek nie.

5. Kleur soos 'n standaard Coomassie-blou protokol of gaan voort na 'n immuno-blotting prosedure (western-blot).


Let wel: Voordat jy die jel laat loop, maak seker dat die jel, jelapparaat en monsters gereed is.

  1. Om te monteer, haal die gels uit die gietraam en klem dit in die jel-apparaat vas.( Maak seker dat die kortplaat altyd na binne wys en as jy net een jel het om te loop gebruik die dummy-plaat wat beskikbaar is om te balanseer).
  2. Wanneer die plate vasgemaak is, plaas dit in die kasset en sluit dit dan.
  3. Plaas hulle in die jel-tenk.
  4. Vul die binnekamer van die tenk met buffer.(Nou is dit maklik om die kam te verwyder, aangesien dit gesmeer is).
  5. Verwyder die kam VERSIGTIG (sonder om die put te breek).
    [Nou is die gel gereed om die monsters te laai]
  6. Spoel die laaipunt 'n paar keer uit met gedistilleerde water. (Maak seker dat al die water uitgegooi is voordat die monsters gelaai word.)
  7. Plaas die laaipunt tot 'n paar mm van die put onder en lewer die monsters in die put. Spoel die spuit uit met gedistilleerde water nadat dit vir 'n paar keer gelaai is.
  8. Heg die kragtoevoer aan deur die deksel te sit (Maak seker dat die verbinding korrek is, bv. swart - swart en rooi - rooi). Stel die spanning op tot 180 V en laat loop vir 1 uur.(Moenie toelaat dat die kleurstoffront uit die jel gaan nie).

GEVOLGTREKKINGS

Die gebruik van kleurstowwe en ander alternatiewe materiale in die simulering van DNA-gelelektroforese bied baie voordele bo kostebesparings. Die meeste materiaal wat beskryf word, is dalk reeds in die meeste skoollaboratoriums beskikbaar of moet geredelik deur algemene laboratoriumverskaffers gekoop word. Tyd en moeite kan ook bespaar word deur die behoefte vir die voorbereiding van werklike DNS-monsters weg te laat. Selfs meer waardevolle klaskamertyd word bespaar deur die bykomende stappe uit te skakel wat nodig is om DNA-gels te vlek en te ontkleur om die bande te visualiseer, terwyl laboratoriumveiligheid verbeter word.

Die gebruik van kleurstowwe omskep ook gelelektroforese in 'n "intydse," visueel intuïtiewe demonstrasie van die proses en uitkoms van elektroforese. Aangesien die kleurstowwe sigbaar binne die eerste paar minute migreer en skei, kan studente vinnig betrek word en dit makliker vind om belangstelling te behou, terwyl die instrukteur verkenning aanmoedig tydens die tyd wat geneem word vir elektroforese met toepaslike vrae. Dit is nie nodig om te wag totdat die gel gekleur is om die effek van elektroforese te sien nie.

Die voordele van die gebruik van kleurstofgebaseerde gelelektroforese word wyd waardeer, deur verskeie informele weergawes en anekdotiese getuienisse deur skoolstudente, onderwysers en voorgraadse studente wat aan die skrywers oorgedra is. Ons bied hier 'n volledige stel effektiewe plaasvervangermateriaal aan vir die simulering van DNA-gelelektroforese in skole. Daar word ook gehoop dat dit opvoeders sal ondersteun om hul eie nuttige en opwindende praktiese onderrigprotokolle te ontwerp.


Kyk die video: Домашние следки спицами. УЗОР ПЛЕТЕНАЯ КОРЗИНА.Простые тапочки без швов на подошве. (Oktober 2022).