Inligting

Foutfrekwensie van DNA-replikasie sonder proefleesaktiwiteit van DNA-polimerase?

Foutfrekwensie van DNA-replikasie sonder proefleesaktiwiteit van DNA-polimerase?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Verskillende domeine van DNA-polimerase bevat verskillende aktiwiteit, soos5'->3'polimerisasie en3'->5'proefleesaktiwiteit ('n algemene geval), en hierdie domeine kan afsonderlik ontgin word om hulle enkele aktiwiteit op 'n slag te laat uitvoer. As ons byvoorbeeld die opsporing van 'n soort mutasie op 'n DNS-string uitvoer, moet ons die aktiwiteit van DNS-polimerase-proeflees onderdruk, dit wil sê, dit stop om die fout wat dit maak reg te stel.

Aangesien die proefleesaktiwiteit die getrouheid van replikasie tot sowat 99.9% verhoog, wil ek weet wat die doeltreffendheid sal wees as daar geen proefleesaktiwiteit is nie.

Om my vraag te vereenvoudig - As DNA-herstelstelsel 1 foute begaan uit 10^8 basispare wat dit in die nukleotiedketting gevoeg het, hoeveel foute sal voorkom as ons die proefleesmeganisme daarvan verwyder?


Klenow Fragment kan gebruik word om 'n polimerase te hê wat nie die eksonuklease-aktiwiteit het nie: nie net die5' -> 3'maar ook die3' -> 5'.

As die eksonuklease-aktiwiteit ontbreek, word die enigste soort beheer gegee deur die biochemiese eienskap van die ensiem: onthou dat die DNA-polimerase 'n aktiewe plek het soortgelyk aan 'n regterhand, wat dit moontlik maak om die korrekte paar tussen A,G,C,T te hê . Dan, volgens hierdie studie, is die foutkoers iets rond1e-4.


Polimerase Fidelity: Wat is dit, en wat beteken dit vir jou PCR?

Die ontdekking en ontwikkeling van hoëtrou-polimerases is vir baie jare 'n sleutelfokus by New England Biolabs (NEB). Highfidelity-amplifikasie is noodsaaklik vir eksperimente waarvan die uitkoms afhang van die korrekte DNA-volgorde (bv. kloning, SNP-analise, NGS-toepassings). Terwyl tradisionele getrouheidstoetse voldoende is vir Taq en ander matig getroue ensieme, Q5, 'n ultra hoëtrou-ensiem, verskuif die grense van huidige metodes wat gebruik word om hierdie kritieke kenmerk van DNA-polimerases te bepaal.

John A. Pezza, Ph.D., Rebecca Kucera, M.S.,
Luo Sun, Ph.D., New England Biolabs, Inc.


Eukariotiese fout-geneigde DNA-polimerases: die veronderstelde rolle in replikasie, herstel en mutagenese

'n Aantal DNS-polimerases wat geneig is tot foute is in verskeie eukariote gevind, wat wissel van giste tot soogdiere, insluitend mense. Volgens gedeeltelike homologie van die primêre struktuur word hulle in families B, X en Y gegroepeer. Hierdie ensieme vertoon 'n hoë ontrouheid op 'n ongeskonde DNA-sjabloon, maar hulle is akkuraat op 'n beskadigde sjabloon. Fout-geneigde DNA-polimerases word gekenmerk deur waarskynlikhede van basissubstitusie of raamverskuiwingmutasies wat wissel van 10 −3 tot 7.5 · 10 −1 in 'n ongeskonde DNS, terwyl die spontane mutagenesetempo per gerepliseerde nukleotied tussen 10 −10 en 10 −12 wissel. Lae-getrouheid polimerases is terminale deoksinukleotidieltransferase (TdT) en DNA-polimerases β, ζ, κ, η, ι, λ, μ en Rev1. Die hoofkenmerke van hierdie ensieme word hersien. Nie een van hulle vertoon proeflees 3′ → 5′ eksonuklease (PE) aktiwiteit nie. Die spesialisasie van hierdie polimerases bestaan ​​in hul vermoë om teenoorgestelde DNA-letsels te sintetiseer (nie uitgeskakel deur die talle herstelstelsels nie), wat verklaar word deur die buigsaamheid van hul aktiewe sentrums of 'n beperkte vermoë om TdT-aktiwiteit uit te druk. Klassieke DNA-polimerases α, δ, ε en γ kan nie primers verleng met wanaangepaste nukleotiede aan die 3'-kant (wat lei tot replikasieblok), terwyl sommige gespesialiseerde polimerases hierdie verlenging kan kataliseer. Dit gaan gepaard met die oorkoming van die replikasieblok, dikwels ten koste van 'n verhoogde mutagenesetempo. Hoe kan 'n sel bestaan ​​onder die toestande van hierdie hoë ontrouheid van baie DNA-polimerase-aktiwiteite? Nie alle weefsels van die liggaam bevat 'n volledige stel lae-getroue DNA-polimerases nie, hoewel sommige van hierdie ensieme uiters belangrik is. Boonop “moet selle nie toelaat dat” fout-geneigde DNS-polimerases op onbeskadigde DNS werk nie. Nadat 'n letsel op die DNA-sjabloon omseil is, moet die sel oorskakel van DNA-sintese wat deur gespesialiseerde polimerases gekataliseer word na die sintese wat deur relatief hoëtrou-DNA-polimerases δ en ɛ (met 'n foutfrekwensie van 10 −5 tot 10 −6 ) gekataliseer word. so gou as moontlik. Dit word gedoen deur komplekse van polimerase δ of ɛ te vorm met prolifererende selkernantigeen (PCNA) en replikasiefaktore RP-A en RF-C. Hierdie hoogs prosessiewe komplekse toon 'n groter affiniteit vir korrekte primers as wat gespesialiseerde DNA-polimerases doen. Die feit dat gespesialiseerde DNA-polimerases distributief of swak prosessief is, bevoordeel die omskakeling. Die getrouheid van hierdie polimerases word verhoog deur die PE-funksie van DNA-polimerases δ en ε, sowel as outonome 3′ → 5′ eksonukleases, wat wydverspreid oor die hele filogenetiese boom van eukariote voorkom. Die eksonuklease-korreksie vertraag replikasie in die teenwoordigheid van letsels in die DNA-sjabloon, maar verhoog die getrouheid daarvan, wat die waarskynlikheid van mutagenese en karsinogenese verminder.


Materiale en metodes

Proteïen suiwering

'n Afgekapte vorm van hDINB1 (DINB1ΔC) en 'n ooreenstemmende mutant wat 'n aminosuurverandering van asparaginsuur na asparagien by residu 198 bevat, beide met 'n 6xHis-merker aan die karboksielterminus, is oorgeproduseer deur die BAC-tot-BAC Baculovirus-uitdrukkingstelsel te gebruik. kit (GIBCO BRL). Kortliks, afgeleides van die vektorplasmied FASTBAC1 (GIBCO BRL) wat die ooreenstemmende DNA-volgorde bevat, is gekonstrueer deur verskeie stappe van PCR-amplifikasie en subkloning vanaf 'n plasmied wat die volle lengte bevat DINB1 cDNA-volgorde. Die plasmiede is gebruik om die E coli stam DH10BAC om spontaan rekombinante bacmiede te genereer wat die onderskeie proteïenkoderende gebied in 'n Baculovirus-volgorde dra. Hoë-molekulêre gewig DNA's wat die rekombinante bakmied bevat is voorberei en gebruik om die Sf9 selle te transfekteer.

Die Sf9-selle wat met die rekombinante Baculovirus geïnfekteer is, is in Lysisbuffer [20 m m natriumfosfaat (pH 7.4), 0.3 m NaCl, 1% Nonidet-P 40] op ys gelys met af en toe geroer. Die lysaat is vir 1 uur teen 50 000 rpm in Beckman 70Ti-rotor gesentrifugeer en die supernatant wat die afgeknotte DINB1-proteïen bevat is aangevul met imidasool by die finale konsentrasie van 50 mm, en toegedien op 1 ml van 'n Ni-NTA silikahars (Qiagen) verpak in 'n HR5/5 gekoppel aan 'n FPLC-stelsel. Die kolom is gewas met A buffer [20 m m natriumfosfaat (pH7.4), 0.3 m NaCl, 10% gliserol] wat 50 m m imidasool bevat en in 'n gradiënt van 50–500 m m imidasool in A buffer geëlueer. Die afgeknotte DINB1-proteïen is teen ~180 m m imidasool geëlueer.

DNA-polimerase-toets

Die 30meer met die volgorde 5′-CTCGTCAGCATC TT CATCATACAGTCAGTG-3′ is as 'n nie-magd-sjabloon gebruik. Dieselfde 30mer wat 'n bevat cys–syn dimeer (CPD) of (6-4) fotoproduk by die onderstreepte plek is chemies gesintetiseer soos voorheen beskryf (Murata et al. 1990 Iwai et al. 1996). Die twee 30mere wat tetrahidrofuraan bevat in plaas van natuurlike abasiese terrein, AP-A (5'-CTCGTCAGCATCAXCATCATACAGTCAGTG-3') en AP-T (5'-CTCGTCAGCATCTXCATCATACAGTCAGTG-3'), waarin X dui op abasiese terrein soos beskryf, et al. 1999). Die twee AAF-gemodifiseerde sjablone, AAF-A (5′-CTCTTCACCTCTAGTCTCCTACACACTCAATC-3′) en AAF-T (5′-CTCTTCACCTCATGTCTCCTACACACTCAATC-3′) is voorberei deur die ongeskonde 30mere te behandel met N-asetoksie-AAFuuren soos beskryf (VAFuuren) et al. 1993) en die sisplatien-gemodifiseerde sjabloon (5'-CTCGTCACCTC GG TCTCCTACAGTCAGTG-3' met die onderling gekoppelde GG by die onderstreepte plek) is voorberei soos beskryf (Fujiwara et al. 1999). Suiwerheid van die sjablone wat 'n letsel bevat, is nagegaan deurdat geen omleidingsproduk deur Klenow-ensiem waargeneem is nie. Primers van verskillende lengtes en volgordes is by die 5'-end gemerk met behulp van T4 polinuklotiedkinase en [γ- 32P] ATP en uitgegloei met templaat teen 'n molêre verhouding van 1:1. Standaardreaksies (10 μl) het 40 m m Tris-HCl (pH8.0), 5 m m MgCl bevat2, 100 μm elk van vier dNTP's, 10 m m DTT, 250 μg/ml BSA, 60 m m KCl, 2.5% gliserol, 40 nm primer-template, en 'n aangeduide hoeveelheid ensiem. Na inkubasie by 37°C vir 15 min, is reaksies beëindig deur die byvoeging van 10 μl formamied gevolg deur kook. Die produkte is aan 20% poliakrielamied/7 m ureumgelelektroforese onderwerp, gevolg deur outoradiografie.


Resultate

Verskeie metodes is gebruik om die uitwerking van proeflees te ondersoek en om replikasie van die voorste en agterstallige stringe te onderskei. Ons het besluit om gebruik te maak van stamme wat mutasies bevat in 'n noodsaaklike kodon van die TRP5 geen as gevolg van die mutasie-spesifisiteit en lae agtergrond van spontane reversies [37]. Alhoewel hierdie toets ontleding van basispaar-wanpassings in slegs een volgordekonteks toelaat, laat dit die studie van spesifieke wanparings toe op maniere wat nie voorheen moontlik was nie. Omdat ons daarin belang gestel het om die effek van proeflees op replikasie te bestudeer, was dit nodig om stamme te gebruik wat 'n gebrek aan MMR het, aangesien daar 'n sterk sinergisme tussen MMR en proeflees [3,6,7] is, daarbenewens toon MMR replikasiestring-vooroordeel kompliseer analise in die teenwoordigheid van MMR [38,39]. Vir eksperimente wat gebrekkige MMR behels het, in teenstelling met byna alle vorige studies van proeflees, het ons stamme gebruik wat 'n gebrek aan MutSα (msh6) aangesien die algehele mutasielas minder is in sulke stamme in vergelyking met 'n totale tekort aan MMR [18] en daar is hoogstens 'n geringe effek van MutSβ op basispaarsubstitusie-mutagenese [24]. Ons aanname in die gebruik van stamme wat slegs in MutSα gebrekkig was, was dat hulle ietwat gesonder sou wees as dié sonder alle MMR, en daardie aanname is onlangs getoon dat dit waar is vir pol2–4 stamme [40].

Omdat haploïede selle met 'n gebrek aan beide Pol δ-proeflees en MMR nie lewensvatbaar is nie [6], was diploïede stamme nodig vir al ons studies. Ons het die goed bestudeerde gebruik pol2–4 alleel om Pol ε-polimerases sonder proeflees te skep [4], en die pol3–5DV alleel om proeflees te ontwrig in Pol δ [10,41–44]. 'n Stam van teenoorgestelde paringstipe, geskrap vir die TRP5 geen, is met verskeie gekruis trp5 mutante stamme, wat hemisigoties skep trp5 mutante wie se terugkeer gemeet kon word deur op media sonder triptofaan te plaat.

Soos getoon in Fig. 1A, elk van die trp5 allele is teenwoordig in beide voorwaartse en omgekeerde oriëntasies naby 'n betroubare oorsprong van replikasie (ARS306), sodat 'n gegewe DNS-volgorde op die voorste string in een oriëntasie en op die agterblywende string in die ander oriëntasie gerepliseer sal word [37]. As gevolg van die uiters lae terugkeerkoerse in wilde-tipe stamme, en anders as voorheen gebruikte toetse om proeflees te bestudeer, is die waargenome toename in terugkeerkoerse in proeflees-defektiewe stamme byna geheel en al te wyte aan die wanpaar wat op die string geskep word wat deur die proeflees-defekte herhaal word. polimerase. 'n Spesifieke voorbeeld met die trp5-G148T alleel word in Fig. 1B geïllustreer. Die trp5-G148T alleel keer terug na wildtipe via 'n T-A na G-C mutasie wat sal plaasvind deur inkorporering van óf 'n T-C of A-G wanpaar tydens replikasie. Vir die meeste spontane revertante sou daar geen manier wees om vas te stel watter mispair plaasgevind het nie. As mens egter 'n model aanneem waarin Pol ε, wie se katalitiese subeenheid deur die POL2 geen, repliseer die voorste string en Pol δ, waarvan die katalitiese subeenheid gekodeer word deur die POL3 geen, repliseer die agterblywende string, kan die identiteit van die wanpaar wat die terugkeer veroorsaak, bepaal word. Vir stamme in die F-oriëntasie, sal reversie in Pol ε-proeflees gebrekkige stamme te wyte wees aan T-C wanparings, terwyl reversie in Pol δ proeflees gebrekkige stamme as gevolg van A-G wanparings sal wees. Die teenoorgestelde sal waar wees in stamme met die R-oriëntasie.

Soos voorheen beskryf [37], die TRP5 geen is van sy normale chromosomale ligging geskrap en ingevoeg om die te vervang RNQ1 geen op chromosoom III in beide oriëntasies. (A) Die ligging van die verskuifde TRP5 geen relatief tot die ARS306 oorsprong van replikasie word getoon vir beide die voorwaartse (F) en omgekeerde (R) oriëntasieskaal word in kb gemerk. Die ligging van die noodsaaklike GAA-kodon word ook aangedui. (B) Die trp5-G148T alleel kan slegs terugkeer via 'n TA→GC mutasie. As aanvaar word dat Pol ε die voorste string repliseer en Pol δ die agterblywende string herhaal, kan die verkeerde paring wat verantwoordelik was vir 'n omkeergebeurtenis afgelei word in enige proefleesgebeurtenis trp5 mutant. Byvoorbeeld, in die F-oriëntasie sal 'n proefleesdefektiewe Pol ε-mutasie (Pol2 exo-) slegs T-C-wanparings verhoog en nie A-G-wanparings nie, net so sal 'n proefleesdefekte Pol δ-mutasie (Pol3 exo-) net A-G-wanparings verhoog en nie C-T-wanparings nie.

Trp5-G148T en trp5-A149C allele vertoon oriëntasie-afhanklike terugkeerkoerse in stamme wat gebrekkig is in proeflees en MMR

Ons het eers die tempo van spontane terugkeer van die hemisigotiese gemeet trp5-G148T alleel vir die Trp+ fenotipe in verskeie genetiese agtergronde. Oor die algemeen was die enkel-mutant-terugkeerkoerse nie onderskeibaar van mekaar of van wild-tipe nie, deels as gevolg van die baie lae terugkeerkoerse en dienooreenkomstig groot vertrouensintervalle (Fig. 2A en S1 Tabel). Dit is al vir baie jare bekend dat defekte in proeflees en MMR sinergisties was [3,7], en die terugkeerkoerse van stamme wat tekortkom in beide MMR en een proefleesaktiwiteit (Fig. 2A en S1 Tabel) demonstreer hierdie feit sterk. Met een uitsondering (die trp5-G148T msh6 pol2–4 R-stam) was die dubbel-mutant-terugkeertempo's een tot twee ordes van grootte hoër as enige van die enkel-mutant-terugkeerkoerse. Alhoewel gebreke in Pol ε proeflees (pol2–4) lei gewoonlik tot 'n laer mutasietempo as defekte in Pol δ (pol3–01 of pol3–5DV) [7,43], het ons opgemerk dat in msh6 stamme met die F-oriëntasie, die mutasietempo's was ongeveer dieselfde (vergelyk msh6 pol2–4 F met msh6 pol3–5DV F in Fig. 2A), terwyl hulle hemelsbreed verskil het in msh6 stamme met die R-oriëntasie.

Terugkeertempo's van diploïede stamme met die aangeduide genotipes is bepaal soos uiteengesit in Materiale en Metodes. Alle aangeduide mutasies is homosigoties. Foutstawe verteenwoordig 95% vertrouensintervalle. F en R verwys na die oriëntasie van die hemisigoot TRP5 geen relatief tot die ARS306 oorsprong van replikasie. (A) trp5-G148T stamme data word in S1 Tabel gegee. (B) trp5-A149C stamme data word in S2 Tabel gegee.

Gebaseer op voorheen gerapporteerde resultate, sou ons verwag het dat die terugkeerkoerse vir die msh6 pol3–5DV stamme te gewees het baie hoër as die msh6 pol2–4 stamme in enige oriëntasie. As gevolg van die onverwagte verskille in terugkeertempo's van die dubbelmutante, het ons die eksperimente herhaal in 'n tweede stel diploïede stamme, wat die hemizigotiese trp5-A149C alleel (Fig. 2B en S2 Tabel). Terugskrywings van die trp5-A149C alleel vind plaas via dieselfde wanpassings as vir bogenoemde trp5-G148T alleel, maar die basisse op die primer- en sjabloonstringe word omgeskakel. Die patroon van terugkeerkoerse in die trp5-A149C stamme was baie soortgelyk aan dié van die trp5-G148T stamme (vergelyk Fig. 2A tot Fig. 2B) met wilde-tipe of enkel-mutant stamme met lae en oor die algemeen soortgelyke reversietempo's en dubbel-mutant stamme met baie hoër reversietempo's. Dus het ons in twee onafhanklike stelle stamme opvallende effekte van die oriëntasie van die TRP5 merkergeen op terugkeerkoerse as gevolg van proefleesdefekte vir pol2–4 msh6 stamme, terugkeerkoerse was baie hoër in die F-oriëntasie en vir pol3–5DV msh6 stamme-terugkeerkoerse was baie hoër in die R-oriëntasie.

Die effek van TRP5 oriëntasie op terugkeertempo's van die dubbelmutantstamme was beide treffend en onverwags. Hierdie resultate is ontbloot as gevolg van die nuutheid van hierdie toets vorige toetse vir spontane mutasies in proefleesmutante het óf voorwaartse mutasietempo's in gene soos KAN1 of URA3 wat baie verskillende tipes mutasies gee [3,7,8,10,16,18,40,41,43,45–50] of omkeertoetse wat gewoonlik gly in eenvoudige herhalings behels om raamverskuiwings in die sy7–2 of hom3–10 allele of verskeie allele van LYS2 [3,7,10,16–18,41,43,45–49,51,52]. Tensy die replikasierigting van 'n merkergeen bekend is, is daar min inligting te verkry deur mutasiefrekwensies van 'n omgekeerde kopie van die geen te meet. Met slegs twee uitsonderings, het geen van die mutasietoetse waarna hierbo verwys word, die oriëntasie van die merkergeen vir spontane mutasie ondersoek nie. Daardie twee uitsonderings was analise van mutasiespektra in a URA3 geen in beide oriëntasies naby 'n gedefinieerde oorsprong van replikasie in die chromosoom [7] en van die SUP4-o geen in beide oriëntasies op 'n gisplasmied [8]. In beide gevalle was die mutasiespektra verskillend in die twee oriëntasies, wat gebruik is as 'n argument dat die twee polimerases verskillende stringe herhaal het, maar daar was geen ontleding van enige verskille in mutasietempo's in die twee oriëntasies nie [7,8].

Soos hierbo bespreek, met die veronderstelling dat die voorste string gerepliseer is deur Pol ε en die agterblywende string deur Pol δ [11,12], is dit moontlik om af te lei watter mispaar in elke stam verhoog is. Byvoorbeeld, in die trp5-G148T spanning in die F-oriëntasie, 'n defek in Pol2-proeflees behoort die aantal T-C-wanparings te verhoog, maar behoort geen effek op die aantal A-G-wanparings te hê nie (sien Fig. 1B). Vir elke dubbele mutantstam in Fig. 2, kan ons 'n reversiekoers assosieer met die spesifieke mispaar wat tot die reversiegebeurtenis moes gelei het soos in Fig. 3 getoon. Ons het toe twee vergelykings gedoen. Vir 'n gegewe mispaar, het ons die terugkeerkoers vir daardie mispair vergelyk in 'n pol3–5DV spanning tot dieselfde mispaar in a pol2–4 druk. Byvoorbeeld, die trp5-G148T pol3–5DV F-terugkeerkoers (wat vermoedelik via A-G-wanparings plaasvind) is 29 keer groter as die trp5-G148T pol2–4 R omkeerkoers (ook oorheers deur A-G wanparings) (Fig. 3). Hierdie vergelykings toon dat vir dieselfde mispaar, in MMR-tekorte stamme, die terugkeerkoers van die pol3–5DV spanning is groter as die terugkeerkoers in a pol2–4 stam, in ooreenstemming met vorige resultate wat 'n groter mutatoreffek toon in Pol δ-proeflees-defekte stamme in vergelyking met Pol ε-proeflees-defekte stamme. Ons het vervolgens die terugkeerkoerse as gevolg van een verkeerde paring vergelyk in vergelyking met die ander mispaar in stamme met dieselfde proefleesdefek. Byvoorbeeld, die terugkeerkoers van a trp5-G148T F pol2–4 spanning (met verhoogde T-C-wanparings) is 17 keer groter as die terugkeerkoers van die trp5-G148T R pol2–4 spanning (met verhoogde A-G-wanparings) (Fig. 3). In elke geval was die terugkeerkoers as gevolg van verhoogde T-C- of C-T-wanparings groter as dié as gevolg van verhoogde A-G- of G-A-wanparings. Daardie resultaat het voorgestel dat óf T-C wanparings makliker gevorm is as A-G wanparings, óf dat hulle makliker uitgebrei is, en dus meer vatbaar is vir proeflees, as A-G wanparings. Hierdie analise help om die verskil in mutasiespektra wat waargeneem word in stamme wat in Pol δ of Pol ε proeflees is defektief te verduidelik: vir ten minste sekere wanpassings is die frekwensie van die vorming en verlenging van een wanpassing baie groter as die vorming en verlenging van die komplementêre wanpassing. Hierdie eksperimente kan egter nie onderskei of die verskil te wyte is aan die waarskynlikheid van vorming van 'n gegewe mispaar of die relatiewe doeltreffendheid om 'n gegewe mispaar uit te brei nie.

Die wanpassings by die replikasievurk wat nodig is vir terugkeer in die trp5-G148T en trp5-A149C stamme word geïllustreer in die voorwaartse (F) of omgekeerde (R) oriëntasie relatief tot die ARS306 oorsprong van replikasie [37]. Nuwe stringe word in rooi aangedui, en die ingevoegde basis wat nodig is vir terugkeer word ook in rooi aangedui. Die verskil in terugkeertempo's van die proefleesdefekte stamme is te wyte aan verhoogde wanparings op die string wat deur die toepaslike polimerase gerepliseer word, die voorste string deur Pol ε, wie se katalitiese subeenheid Pol2 is, en die agterblywende string deur Pol δ, wie se katalitiese subeenheid Pol3 [12]. Regs van elke aangeduide mispaar is die terugkeerkoers van die msh6 spanning (x 10 -8 ) wat verhoogde vlakke van daardie mispaar behoort te hê (data van Fig. 2 en S1 en S2 Tabelle). Byvoorbeeld, die terugkeerkoers van die trp5-G148T F msh6 pol2–4 spanning is 3.1. Regs van die terugkeerkoerse is vergelykings van terugkeerkoerse vir dieselfde mispaar in msh6 pol3–5DV versus msh6 pol2–4 stamme en vergelykings van terugkeerkoerse as gevolg van T-C in vergelyking met A-G wanparings in óf msh6 pol3–5DV of msh6 pol2–4 stamme. In elke geval is die terugkeerkoers vir 'n gegewe mispaar groter in msh6 pol3–5DV stamme as in msh6 pol2–4 stamme, en die terugkeerkoers as gevolg van T-C-wanparings is groter as vir A-G-wanparings.

Stamme heterosigoties vir proefleesdefekte openbaar cis-proeflees deur Pol δ

Die vergelyking van die effek van 'n Pol δ proeflees defek met 'n Pol ε proeflees defek vir dieselfde verkeerde paring het aan die lig gebring dat die terugkeerkoers vir pol3–5DV msh6 mutante was 19- tot 29-voudig hoër as vir pol2–4 msh6 mutante in trp5-G148T stamme en ongeveer 2- tot 7-voudig hoër in trp5-A149C stamme (Fig. 3), wat kan voorstel dat Pol δ minder akkuraat as Pol ε was in die afwesigheid van proeflees. 'n Ontleding van egter in vitro aktiwiteit dui daarop dat dit nie die geval is nie en dat die akkuraatheid van die proefleesdefekte ensieme soortgelyk is, met dié van Pol ε wat in sekere gevalle effens minder is [33]. As die inherente akkuraatheid van Pol δ en Pol ε sonder proefleesaktiwiteit soortgelyk is, is 'n alternatiewe verduideliking vir die veel hoër terugdraaikoerse van pol3–5DV msh6 stamme in vergelyking met pol2–4 msh6 stamme sou wees dat Pol δ Pol ε foute kon proeflees, maar nie andersom nie. 'n Aanvanklike stap was om te vra of 'n wilde-tipe polimerase molekule in staat was om foute wat deur 'n proeflees-defektiewe molekule van dieselfde tipe geskep is, te proeflees. Ons het hierdie vraag beantwoord deur diploïede stamme te konstrueer wat gebrekkig is in MMR, maar slegs heterosigoties vir proefleesdefekte (msh6/msh6 pol2–4/POL2 verkort pol2–4± of msh6/msh6 pol3–5DV/POL3, afgekort pol3-5DV±). In heterosigotiese stamme sou ons verwag dat die helfte van die polimerasemolekules mutant en die helfte wildtipe sou wees. Indien foute wat deur die mutante polimerase geproduseer word nie onderhewig was aan daaropvolgende proeflees deur wild-tipe polimerases in die heterosigotiese stamme nie, sou ons verwag dat die terugkeertempo van die heterosigotiese stamme die helfte sou wees van die van homosigotiese proeflees gebrekkige stamme.

Die resultate word in Fig. 4 en S3 Tabel getoon en in Tabel 1 vergelyk. Die verskil tussen pol2–4± en pol3-5DV± stamme is opvallend. Vir Pol δ het die verskil tussen heterosigotiese en homosigotiese stamme gewissel van 12- tot 46-voudig (Tabel 1). Hierdie resultaat dui sterk daarop dat wild-tipe Pol δ-molekules die foute wat deur die proefleesdefekte Pol δ-molekules geskep is, kan proeflees, as die teenwoordigheid van een wilde-tipe POL3 alleel verminder terugkeerkoerse met meer as 'n orde van grootte. Hierdie gevolgtrekking stem ook ooreen met die voorstel dat Pol δ Pol α-foute kan proeflees [10]. Proeflees van Pol α-foute deur Pol δ sou impliseer dat DNA-stringe wat deur Pol α geskep word, maar met 'n mate van replikasiefout, onderhewig is aan proeflees deur Pol δ, sowel as uitbreiding deur Pol δ. Net so, cis-proeflees van Pol δ-foute deur Pol δ sou impliseer dat 'n DNA-string gesintetiseer deur Pol δ maar wat foute in replikasie bevat onderhewig sal wees aan proeflees deur Pol δ, sowel as uitbreiding deur Pol δ.

Getoon is die terugkeerkoerse van trp5-G148T en trp5-A149C stamme wat is msh6/msh6 en bevat een kopie van een van die twee pol2–4 of pol3–5DV saam met 'n wildtipe kopie van die ooreenstemmende polimerase geen (pol-/pol+). Foutstawe verteenwoordig 95% vertrouensintervalle. Ook getoon is die ooreenstemmende terugkeerkoerse van die homosigotiese proeflees-defekte stamme van Fig. 2 (pol-/pol-). Alle data word in S3-tabel gegee. In elke geval is die verskil tussen heterosigoties en homosigoties baie groter in pol3–5DV as pol2–4 stamme.

Stamme wat heterosigoties of homosigoties was vir Pol ε proeflees (msh6/msh6 pol2–4/POL2 of msh6/msh6 pol2–4/pol2–4) was baie soortgelyk in terugkeerkoerse. Die toename tussen stamme wat heterosigoties is in Pol ε proeflees (pol2–4±) en dié wat homosigoties is, was ongeveer tweevoudig vir elke stam (Tabel 1). Een kwessie is of daardie verskil statisties betekenisvol is. Alhoewel dit standaard is om aan te neem dat 95% vertrouensintervalle vir twee metings nie moet oorvleuel sodat die verskil betekenisvol kan wees nie, is in werklikheid 95% vertrouensintervalle wat nie oorvleuel nie betekenisvol op die P = 0,005 vlak en dit is 83% vertroue Intervalle wat betekenisvol is op die P = 0.05-vlak as hulle nie oorvleuel nie [53]. Gevolglik is 83% Betroubaarheidsintervalle bereken vir die verskillende stamme wat gebrekkig was in Pol ε-proeflees. Daardie resultate word in S3-tabel gegee en toon dat drie van die vier vergelykings in tabel 1 aansienlik verskil. 'n Onlangse meting van KAN1 mutasietempo's in diploïede wat was pol2–4/pol2–4 of pol2–4/POL2 het ook 'n 2-voudige verskil gevind [49]. 'n 2-voudige verskil is wat verwag sou word as 'n gegewe streek óf deur 'n proeflees-defekte óf proeflees-bevoegde molekule herhaal sou word en daar was geen kompenserende effek van die wild-tipe molekules op die proeflees-defekte molekules nie. As die terugkeerkoerse van die pol2–4 en pol2–4± stamme beskou is as nie beduidend anders nie, sou die implikasie wees dat die pol2–4 alleel was dominant oor die wilde-tipe alleel. In beide gevalle is daar geen bewyse van enige nie cis-proeflees deur Pol ε.

Trp5-G148A en trp5-A149G stamme vertoon ook oriëntasie-afhanklike terugkeerkoerse wanneer hulle heterosigoties is vir proefleesdefekte

Ons het 'n stel van 12 trp5 haploïede stamme, met 6 verskillende allele van TRP5, elk in beide oriëntasies relatief tot die ARS306 oorsprong van replikasie [37]. 'n Ontleding van die oorblywende trp5 stamme wat defektief is in MMR en heterosigoties in een van die proefleesmutante is uitgevoer en die resultate getoon in Fig. 5 met die data gegee in S4 Tabel. Die trp5-G148A en trp5-A149G allele is in sekere opsigte analoog aan die trp5-G148T en trp5-A149C allele soos hulle ook terugkeer via komplementêre mutasies, AT→GC en GC→AT onderskeidelik (Fig. 6). Maar anders as die situasie met die trp5-G148T en trp5-A149C allele, die komplementêre wanparings in die trp5-A149C spanning is in die stam van teenoorgestelde oriëntasie in vergelyking met die mispare in die trp5-G148A vervorming (vergelyk Fig. 3 en 6). Met beide stelle stamme is daar oriëntasievooroordele in terugkeerkoerse en die vooroordele is teenoorgestelde in msh6 pol2-4± stamme in vergelyking met msh6 pol3-5DV± stamme (Fig. 5). Die terugkeerkoerse vir hierdie stamme is in Fig. 6 ontleed op 'n wyse soortgelyk aan dié wat in Fig. 3 vir die trp5-G148T en trp5-A149C stamme. In teenstelling met die stamme met homosigotiese proeflees tekortkominge in Fig. 3, is die relatiewe terugkeerkoerse vir 'n gegewe mispaar in pol3-5DV± in vergelyking met pol2–4± stamme is baie meer soortgelyk, met die terugkeerkoerse in sommige pol2–4± spanning wat hoër is as vir die ekwivalente mispaar in pol3-5DV± stamme (Fig. 6). In elke geval veroorsaak die verlies aan proeflees vir 'n T-G wanpaar 'n hoër terugdraaikoers as die verlies aan proeflees vir 'n A-C wanpaar. Dit blyk dus dat óf T-G wanparings teen 'n hoër tempo as A-C wanparings gevorm word, óf hulle word makliker uitgebrei.


Abstrak

Plasmodium falciparum, 'n parasitiese organisme en een van die veroorsakende middels van malaria, bevat 'n ongewone organel genaamd die apikoplast. Die apikoplast is 'n nie-fotosintetiese plastied wat verantwoordelik is om die parasiet van isoprenoïede eenhede te voorsien en is dus onontbeerlik. Soos mitochondria en die chloroplast, bevat die apikoplast sy eie genoom en huisves die ensieme wat verantwoordelik is vir die replikasie daarvan. In hierdie verslag bepaal ons die relatiewe waarskynlikhede van nukleotied waninkorporasie deur die apikoplast polimerase (apPOL), ondersoek die kinetika en volgorde afhanklikheid van wanpassing verlenging, en bepaal die tempo van wanpassing verwydering deur die 3' tot 5' proeflees aktiwiteit van die DNA polimerase . Terwyl die intrinsieke polimerase-getrouheid met >50-voudig vir die 12 moontlike nukleotied-waninkorporasies verskil, word die mees dominante seleksiestap vir algehele polimerase-getrouheid uitgevoer op die vlak van wanpassing-uitbreiding, wat met >350-voudig wissel. Die doeltreffendheid van wanpassing verlenging hang af van beide die aard van die DNA wanpassing en die sjabloon basis. Die proefleesaktiwiteit van die 12 moontlike wanpassings wissel <3-voudig. Die data vir hierdie drie determinante van polimerase-geïnduseerde mutasies dui aan dat die algehele mutasiefrekwensie van apPOL hoogs afhanklik is van beide die intrinsieke getrouheid van die polimerase en die identiteit van die sjabloon rondom die potensiële wanpassing.


Wat is die foutkoers van DNA-replikasie?

Ek het lankal hieroor gewonder, en kan nie 'n goeie verwysing op die internet kry nie. Wikipedia sê byna perfek, en die aangehaalde verwysings is boeke waartoe ek nie toegang het nie. Elke ander ooptoegangsbron wat Google opduik, is soortgelyk vaag (waarskynlik omdat ek nie die regte soekterme ken nie).

In elektroniese digitale stelsels is dit algemeen om te praat van die bitfouttempo van 'n kommunikasiekanaal of stoorstelsel (berging is 'n spesiale geval van kommunikasie). BER word tipies gedefinieer as die aantal 'inkorrekte' bisse gedeel deur die totale aantal bisse wat oorgedra is.

DNS is ook 'n digitale kommunikasiestelsel, so ek neem aan dat 'n soortgelyke konsep in biologie bestaan. Doen dit? Wat is die BER van DNA-replikasie?

Verwante bonusvraag: Hoeveel van die ɽNA-skade' as gevolg van chemikalieë en bestraling is in-situ-skade op DNA-kopieë, en hoeveel gebeur tydens replikasietyd?

Die DNA-replikasiefoutkoers wissel na gelang van die organisme en presies hoe jy replikasie definieer. Daar is een ensiem wat 'n polimerase genoem word wat die aanvanklike replikasie doen en dikwels 'n tweede ensiem 'n eksonuklease wat proeflees, 'n soort foutkorreksie, vir die polimerase doen. U kan ook 'n derde proses kry, wanpasherstel, wat die foutkoers verder sal verminder.

Die variasie kan heeltemal gaan van 'n foutkoers van 10 -3 (met net 'n polimerase) af tot 10 -10 met al drie prosesse.

Probeer 'n soektog by Bionumbers vir DNA-foutkoers. Dit sal al die getalle en primêre bronne lys.

Dankie, dis net waarna ek gesoek het.

Kan jy 'n goeie beginnersverwysing aanbeveel na hierdie drie prosesse en hoe hulle werk? Is dit byvoorbeeld 'proeflees' werklike foutkorreksie of net foutopsporing?

Nog 'n interessante punt hier, as 'n meer funksionele as numeriese uitlees van replikasiegetrouheid, is dat mutasies in gene wat kodeer vir DNA-replikasie en DNA-herstelfaktore mense (en muise) vatbaar maak vir baie kankers. Replikasiegetrouheid word so streng beheer dat ons dit amper as vanselfsprekend kan aanvaar, totdat iets ophou behoorlik funksioneer en dinge inderhaas buite beheer raak!

Dit word die mutasietempo genoem.

It does vary from place to place in the genome (mostly because non-junk DNA sequences tend to have some degree of ɾrror-checking'.) However, on average, for humans, it seems to be around 2.5×10 -8 per base pair per generation. So basically, a single base pair has a 2.5X10 -8 chance of being replicated incorrectly in a single generation of that cell lineage.

That's much higher than I would have guessed. At those numbers, a 3x10^9 base pair genome would expect about 12 errors per generation. Does that number include the effect of the error checking?

Can you recommend a good place to read about these error checking mechanisms? My questions include:

Are they just error checking (wrong, try again) or error correction (the error is here, now we fix it)?

How do these mechanisms compare, in terms of efficiency, to modern error correction codes?

How close could the DNA replication channel come to the Shannon limit? To what extent is that even a meaningful question?

As you may have guessed, I find biology endlessly fascinating despite my almost total ignorance.

Wel, ja en nee. The error rate of replication is higher than the mutation rate, because errors can be repaired post-replication by DNA repair pathways, especially via DNA mismatch repair.

We have a pretty good idea about the error rates of DNA polymerase as well as the various DNA repair processes that act to keep replication errors to a minimum.

The error rate for the high-fidelity DNA polymerases that take care of most DNA replication ranges from 10 -2 to 10 -6, and these enzymes additionally have proofreading functions that bring their error rate to 10 -7. DNA mismatch repair proteins function on top of that to keep the overall DNA replication error rate to better than 10 -9. McCulloch and Kunkel review this in 2008, if you have access. I will look around later for some sources that are accessible to all.

As far as your bonus question, most DNA damage either occurs during or is exacerbated by DNA replication. UV irradiation and chemicals that cause DNA adducts cause direct damage, but this damage also causes more replication-associated damage because it impedes normal progression of the replication machinery and can lead to double-stranded breaks, which are the most deadly lesion for a cell. In addition to exogenous chemicals and radiation, sources within the cell like reactive oxygen species create DNA damage on a daily basis, and this may very well exceed the amount of damage incurred from outside sources. Luckily for us, cells have evolved DNA damage checkpoints and many DNA repair pathways (such as base excision repair, nucleotide excision repair, mismatch repair, homologous recombination, and nonhomologous end joining) that fend off this DNA damage and help to maintain genome integrity.


MATERIALE EN METODES

Bacterial strains and growth conditions

Bacterial strains used in this study are described in table S1. All strains were derivatives of the E coli K12 MG1655 strain. When needed, mutants were constructed by P1 transduction of alleles from the INSERM U1001 laboratory strain collection or the Keio collection (39).

Overnight liquid cultures were grown in LB medium (Difco) at 37ଌ with 150 rpm shaking. When needed, medium was supplemented with antibiotics (Sigma-Aldrich) at the following concentrations: chloramphenicol (30 μg/ml), ampicillin (100 μg/ml), kanamycin (50 μg/ml), norfloxacin (0.04 μg/ml), paromomycin (5 μg/ml), rifampicin (100 μg/ml), and streptomycin (1 or 5 μg/ml).

Construction of the MutL-based DNA replication error reporter

The construction of mCherry fusions to wild-type mutL expressed from the Plac promoter on the pET-32a–type plasmid is described below. The plasmid encoding mCherry-MutL was made by using primers 5′-GCAGATCTATTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGGTGAGC-3′ and 5′-ATGAATTCGCCAGATCCTGATCCAGATCCTGAGCCGCTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′ to amplify the fragment encoding mCherry from the template p37pRD131 (laboratory collection). These primer pairs contain a Bgl II and an Eco RI restriction site at the N terminus and the C terminus, respectively. The polymerase chain reaction (PCR)𠄺mplified fragments were digested by Bgl II and Eco RI and cloned in the pYFP-MutLCm R (13), creating the plasmid pmCherry-MutLCm R . Then, using the gene replacement technique, the plasmid pmCherry-MutLCm R was used as a template to integrate the mCherry-mutL-cat under a lactose promoter into the chromosome. Primers that include sequences homologous to the chromosomal lactose region were used to amplify the mCherry-mutL-cat. The primer 5′-TGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGGTGAGCAAGGGCGA-3′ contains a 45-bp sequence homologous to the lactose promoter (from 𢄡 to �), and the primer 5′-CACCAGACCAACTGGTAATGGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTG-3′ contains a 40-bp sequence homologous to the lacZ C terminus (from 3026 to 3065). The amplified PCR fragments were introduced to the MG1655 mutL::frt strain by transformation containing the plasmid pKD46. Clones with a chloramphenicol-resistant and nonfunctional lacZ gene were selected and named AW052.

Construction of the translation error reporter

The construction of the translation error reporter is described below. Primers 5′-CGCCATCATACCCAACGTAACAAAACTCAGGCACGTTCCCGATATCAAATTACGCCCCGC-3′ and 5′-GAAAGAATAATGCAAAACAGAAAATGGATTTTGACCTCGCGATGCCTCTAGATTTAAATG-3′ that contain a sequence homologous to yzgL were used to amplify the fragment encoding the kat-sfgfp from strain RB166. The PCR fragments were integrated into the chromosome of strain MG1655, resulting in strain TD049. Primers 5′-CGCCATCATACCCAACGTAACAAAACTCAGGCACGTTCCCGATATCAAATTACGCCCCGC-3′ and 5′-GAAAGAATAATGCAAAACAGAAAATGGATTTTGACCTCGCCATATGAATATCCTCCTTAG-3′ that contain a sequence homologous to yzgL were used to amplify the fragment encoding the kat-sfgfp-kan from strain RB166, and the PCR fragments were integrated into the chromosome of strain MG1655, resulting in strain TD050. Next, the primer 5′-ATGGCCGACTCTGGTGACTACCCTGACCTAGGGTGTTCAGTTAAGACCCACTTTCACATT-3′, which contains a mutated stop codon switched from AAA to UAG at the codon coding for the 53rd amino acid in the flanking homologous regions of the sfgfp gene, and the primer 5′-AATCATGCTGCTTCATGTGATCCGGGTAACGAGAAAAACACTAAGCACTTGTCTCCTG-3′ were used to amplify the tetracycline-resistant gene, tet, and introduced into TD049 by lambda Red recombination (40). By this, the downstream part of the sfgfp gene was replaced by the tet geen. The primer 5′-CTGACCCTGAAATTCATCTGCACTACCGGTTAGCTGCCGG-3′, which also carried a mutated stop codon switched from AAA to UAG in the flanking homologous regions of the sfgfp gene, and the primer 5′-GAAAGAATAATGCAAAACAGAAAATGGATTTTGACCTCGC-3′ were then used to amplify the downstream part of the sfgfp gene and kan from TD050 and introduce it into the kat-sfgfp-tet construct. By this, the tet gene was replaced with the downstream part of the sfgfp gene and kan, resulting in the kanamycin-resistant but tetracycline-sensitive strain TD299. Finally, primers 5′-CGCCATCATACCCAACGTAACAAAACTCAGGCACGTTCCCGATATCGACGTCTAAGAAAC-3′ and 5′-GAAAGAATAATGCAAAACAGAAAATGGATTTTGACCTCGCCATATGAATATCCTCCTTAG-3′ were used to transfer the stop codon-sfgfp-kan construct from TD299 into MG1655, resulting in strain TD339.

Determination of rifampicin-resistant mutant frequencies

LB medium was inoculated with fewer than 100 cells from overnight culture so that there were no preexisting rifampicin mutants in the starting inoculum. Cells were grown in LB medium overnight with shaking at 37ଌ. Cells with appropriate dilutions were plated on LB agar medium to determine the total number of colony-forming units and on a selective medium, LB agar medium supplemented with rifampicin (100 μg/ml), to detect rifampicin-resistant mutants. Colonies were counted after 24 hours of incubation at 37ଌ.

Microscopy and image analysis

Tester strains were grown in LB medium with 0.1 mM isopropyl-β- d -thiogalactopyranoside overnight at 37ଌ with shaking. Overnight culture was diluted 1:400 (v/v) and incubated at 37ଌ with shaking. Cells from exponentially growing culture (OD600 = 0.2) were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and inoculated onto a solid matrix of minimal medium agarose in microscope cavity slides, as described previously (14). Cells were examined with a 100× objective on an Axiovert 200 inverted microscope (Carl Zeiss) equipped with a Photometrics CoolSNAP camera (Princeton Instruments). Images were recorded and analyzed by MetaMorph software and ImageJ software, respectively.

Flow cytometry and cell sorting

Bacterial cultures were grown in LB medium overnight with shaking at 37ଌ. Overnight cultures were diluted 1:400 (v/v) and incubated at 37ଌ with shaking. Different treatments were applied to cells from exponentially growing culture (OD600 = 0.2): streptomycin (1 μg/ml), norfloxacin (0.04 μg/ml), and 5 mM hydrogen peroxide. Cells were washed with PBS and analyzed with a cytometer (Beckman Coulter) when the cultures reached an OD600 of 0.6.

To test the impact of heat shock response on the reporters, cultures were grown overnight with shaking at 30ଌ. Overnight cultures were diluted 1:400 (v/v) and incubated at 30ଌ with shaking until the cultures reached an OD600 of 0.2. Then, cultures were grown at 42ଌ with shaking, and cells were analyzed with a cytometer when cultures reached an OD600 of 0.6. FlowJo (LLC) was used to analyze data.

Samples for cell sorting were incubated overnight at 37ଌ with shaking. Overnight cultures were diluted 1:400 (v/v) and grown at 37ଌ with shaking until cultures reached an OD600 of 0.2. Cultures were then washed and resuspended in PBS before sorting using a cell sorter (BD FACSAria). Cells were analyzed for GFP expression before cell sorting to determine the populations to be sorted. Gates were drawn to separate the 5% of the cells expressing lower levels of GFP and the 5% of the cells expressing higher levels of GFP. Cells (7 × 10 5 ) were collected for each population. Cells were concentrated and analyzed with a microscope after cell sorting.

Statistical analyses

All statistical analyses were performed using the software MATLAB.


Subunits and mechanism of DNA polymerase III

The DNA polymerase III enzyme has four distinct functional components, and several of these contain multiple subunits, as listed in Table 5.2 and illustrated in Figure 5.18. The a and e subunits contain the major polymerizing and proofreading activities, respectively. They combine with the q subunit to form the catalytic core of the polymerase. This core can be dimerized by the t2 linker protein to form a subassembly called DNA polymerase III'. Addition of the third functional component, the g complex, generates another subassembly denoted DNA polymerase III*. All of these subassemblies have been isolated from E. coliand have been characterized extensively. The final component is the b2 dimer, which when combined with DNA polymerase III* forms the holoenzyme.

Figure 5.18.Subunits and subassemblies of DNA polymerase III. The a, e, and q subunits form the catalytic core, and two t subunits are thought to hold the two cores in a single large complex. One g complex is present in the DNA polymerase III* subassembly and in the holoenzyme, forming an asymmetric dimer for the overall structure. Addition of the ring-shaped b2 dimers greatly increases processivity. The arrows between the b2 dimers and the PolIII* subassembly denote the cyclical addition and removal of this subunit during synthesis, which is explored more in more detail in Figure 5.19.

The various activities of DNA polymerase III can be assigned to individual subunits (Table 5.2). For instance, the major polymerase is in the a subunit, which is encoded by the dnaEgeen (ook bekend as polC). The 3' to 5' exonuclease is in the e subunit, which is encoded by the dnaQgene (also known as the mutDgeen). However, maximal activity is obtained with combinations of subunits. The DNA polymerase III core is a complex of the a, e and q subunits, and the activity of the core in both polymerase and 3' to 5' exonuclease assays is higher in than in the isolated subunits.

Table 5.2. Subassemblies of DNA polymerase III, major subunits, genes and functions

The activities of the subunits can be measured in vitroby appropriate biochemical assays. In addition, the phenotype of mutations in the gene encoding a given subunit can show that subunit is required for a particular process. Mutant a subunits are the product of conditional lethal alleles discovered in screens for dnagenes, but they also were discovered as the product of polymerase-defective alleles defining the polCgeen. Dus die dnaEgene is the same as same as the polCgene, showing that this subunit with polymerase activity is needed in replication. Similarly, the phenotype of mutations in the gene encoding the e subunit shows that it is needed for proofreading. Mutant alleles of the dnaQgene were identified in a screen for mutator genes, which generate a high frequency of mutants in bacteria when defective. These alleles defined a gene mutD, which was subsequently shown to be the same as dnaQ. The mutator phenotype of mutant dnaQ/mutDstrains results from a lack of proofreading by the e subunit during replication, allowing more frequent incorporation of incorrect nucleotides into DNA.

The b2 dimer is the key protein that confers hoogprocessivityon DNA polymerase III. Association of the b2 dimer with DNA polymerase III increases the processivity from about 10 nucleotides polymerized per binding event to over 100,000 nucleotides polymerized per binding event (Table 5.1). This dimeric protein forms a ring through which the duplex DNA can pass the ring will slide easily along DNA unless impeded, as, for example, by proteins bound to the template DNA. Thus the b2 dimer acts as a gly klem, holding the polymerase onto the DNA being copied. Once DNA polymerase III is associated with the clamp on DNA, it will polymerize until it reaches the next primer for an Okazaki fragment during lagging strand synthesis. For leading strand synthesis, the DNA polymerase presumably remains associated with the DNA via the b2 clamp until the chromosomal DNA is completely replicated. The 3-D structure of the b2 dimer, determined by X-ray crystallography, shows a macromolecular ring. This structure can be viewed at the web site for the course and at the Online Museum of Macromolecules (www.clunet.edu/BioDev/omm/exh. s.htm#displays).

The g-complex contains several subunits: two molecules of g subunits and one molecule each of d, d', c, and y. Dit vragtethe b2 dimer clamp onto a primer-template, in a process that requires ATP hydrolysis (Figure 5.19). The catalytic core of DNA polymerase III will then link to the template-bound clamp and will initiate highly processive replication. The g-complex also serves to unload the clamp once an Okazaki fragment is completed during lagging strand synthesis hence it is both a clamp loader and unloader, allowing the polymerase and the clamp to cycle repeatedly from one Okazaki fragment to another.

The g-complex carries out these opposite activities on different structures, loading on the clamp at a template-primer and unloading the clamp at the end of a completed Okazaki fragment. For instance, encountering the 5' end of the previously synthesized Okazaki fragment may be the distinctive structure that shifts the g-complex into its unloading mode. It does not unload the clamp while DNA polymerase III is catalyzing polymerization.

Figure 5.19 illustrates the proposed steps in this process. The g-complex in the ATP-bound form binds the b2 clamp, whereas the g-complex in the ADP-bound form releases the b2 clamp. Thus loading and unloading depend on a round of ATP hydrolysis. When the g-complex in the ATP-bound form binds the b2 clamp, the DNA polymerase III holoenzyme is in a conformation that allows it to find a primer-template. The ring of the b2 clamp is held open by the g-complex-ATP, allowing it to bind around a primer-template. Hydrolysis of ATP by the g-complex leaves it in an ADP-bound form. In this new, ADP-bound conformation of the g-complex, it dissociates from the b2 clamp, thereby allowing the b2 clamp to bind to the catalytic core of the holoenzyme and also close around the primer-template. The holoenzyme is now ready to catalyze processive DNA synthesis. Elongation continues until the holoenzyme encounters a previously synthesized Okazaki fragment. Now the g-complex binds ATP (presumably by an ADP-ATP exchange reaction) and shifts into the conformation for binding to the b2 clamp and taking it off the DNA template. This half of the holoenzyme is now able to dissociate from the template and find the next primer-template junction to begin synthesis of another Okazaki fragment.

The clamp loading and unloading activities of the g-complex are a cycle of changes in protein associations. These changes occur because of the enzymatic activities of the complex, which in turn alter the conformations of the proteins and their preferred interactions. As shown in Figure 5.19, the g-complex is an ATPase, which is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of ATP to ADP and phosphate. It is also an ATP-ADP exchange factor.

Figure 5.19. (Previous page)Loading and unloading of the b2 clamp by the g-complex in the DNA polymerase III holoenzyme. The b2 clamp is shown as a ring that can be bound and opened by the ATP-bound form of the g-complex (shown as a pincher shape, but its shape is not known). After initial binding of the b2 clamp, ATP-hydrolysis by the g-complex causes this complex to shift into an ADP-bound conformation that allows it to release the b2 clamp, so that the b2 clamp is loaded onto the primer template and also linked to the catalytic core of the polymerase. After completion of the Okazaki fragment, the g-complex exchanges the ADP for ATP, and is now is a conformation to bind the b2 clamp and unload it. Not all the steps in this model have been demonstrated, but it is useful to illustrate how cycles of ATP hydrolysis could be used in loading and unloading the b2 clamp. The figure shows only the half of the DNA polymerase III holoenzyme engaged in synthesis of the lagging strand the other half is thought to be engaged in synthesis of the leading strand, but is not shown here to keep the diagram relatively simple.

Changes in conformation and activity of proteins depending on whether they are bound to a nucleoside triphosphate (ATP or GTP) or a nucleoside diphosphate (ADP or GDP) is a common theme in biochemistry. The GTP-bound forms of proteins, which can be turned off by GTP-hydrolysis and reactivated by GDP-GTP exchange proteins, mediate critical cell signaling events. As will be seen in Chapter 14, GTP- and GDP-bound forms of translation factors carry out opposite functions. Proteins assume different conformations depending on the cofactor bound (in this case a nucleotide), and each conformation has a distinct activity. The ability to change the conformation by a hydrolytic activity (converting ATP to ADP and phosphate) allows the protein to shift activities readily.

The two catalytic cores of DNA polymerase III are joined together by the t subunits to make an asymmetric dimer (see Figure 5.18). The half of the holoenzyme without the g complex is proposed to synthesize the leading strand of new DNA, and the core with the g complex is proposed to synthesize the lagging strand. Both of the cores in the asymmetric dimer are associated with a b2 clamp at the replication fork. In this model, synthesis of albeithe leading and lagging strands is catalyzed by the dieselfdeDNA polymerase III complex, thereby coordinating synthesis of both new strands strand. Note that if the template for lagging strand synthesis is looped around the enzyme, then leading and lagging strand synthesis would be occurring in the same direction as replication fork movement (Figure 5.20), despite the opposite polarities of the two template strands. Thus the asymmetric dimer model suggests a means to couple both leading strand and lagging strand synthesis.

Replication machinery


An international study reveals how the 'guardian' of the genome works

The background of the illustration is a photograph taken with the electron microscope showing DNA molecules decorated with MutS molecules, scanning the DNA for errors. The lower part shows the MutS structures at different stages of the repair process resolved in this study. Krediet: CNIO

Scientists from the Genomic Integrity and Structural Biology Group led by Rafael Fernández-Leiro at the Spanish National Cancer Research Centre (CNIO) have discovered how certain proteins ensure the repair of errors introduced into the DNA during its replication. Using cryo-electron microscopy, they made the MutS protein, also known as the guardian of our genome, visible. That enabled them to describe how this single protein is able to coordinate the essential DNA repair process from beginning to end.

The study was carried out in collaboration with Meindert Lamers of the Leiden University Medical Center (LUMC, The Netherlands) and Titia Sixma of the Netherlands Cancer Institute and the Oncode Institute. Their results are published in Natuur Strukturele & Molekulêre Biologie.

One of the stages of cell division is DNA replication, during which DNA polymerase duplicates the genetic information of the cell so that it can be transferred to the daughter cell. Although this is a very precise process, errors do sometimes occur. It is essential that these errors are repaired, as they can otherwise lead to the development of tumors.

The researchers had already described in previous publications that DNA polymerase has its own repairer, an exonuclease, which allows it to correct errors that are introduced during DNA replication. But when this corrector is not sufficient, the MutS protein comes into play, which scans the copied DNA for errors and then initiates and completes the repair of any errors it detects. But until now, it was not clear how a single protein could coordinate so many different processes. The international study now published has succeeded in unraveling the mechanism.

"Using cryo-electron microscopy, we were able to observe MutS while it carried out its functions and capture its molecular structure in successive conformations. With this information, we were able to understand how a single protein can coordinate the whole process, which has to be extremely accurate," explains Rafael Fernández-Leiro.

In-depth knowledge of the DNA repair process, in which DNA polymerase, exonuclease and the MutS protein are involved, is essential to understand how alterations in any of these proteins lead to mutations and, therefore, to an increased risk of developing certain types of tumor, such as Lynch syndrome and endometrial cancer.

The researchers emphasize that unraveling protein structures is only possible due to the enormous technological advances in electron microscopy in recent years.

"Electron microscopy allows us to obtain very high-resolution images of proteins as they carry out their functions. With these images, we can reconstruct the three-dimensional structure of the protein in the computer and generate an atomic model that allows us to understand how it works," continues Fernández-Leiro.


Kyk die video: STRUKTUR SEL,STRUKTUR DNA u0026 REPLIKASI DNA (Oktober 2022).