Inligting

4.2: M13 Faag - Biologie

4.2: M13 Faag - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die bakteriofaag bekend as "M13" vorm die basis van kloningstelsels wat ontwerp is om maklik mutasies in te bring in gene wat in die faaggenoom ingevoeg word. Dit is ook gebruik in verskeie "faag vertoon" metodologieë en "kombinatoriese" DNA en peptied biblioteke.

M13 infeksie en replikasie

M13 is 'n filamentagtige bakteriofaag wat besmet E coli gasheer. Die M13-genoom het die volgende kenmerke:

  • Omsendbrief enkelstrengig DNA
  • 6400 basispare lank
  • Die genoom kodeer vir 'n totaal van 10 gene (benoem met behulp van Romeinse syfers I tot X)

Figuur 4.2.1: M13 genoom

  • Gene VIII kodes vir die belangrikste strukturele proteïen van die bakteriofaagdeeltjies
  • Gene III kodes vir die geringe laagproteïen

Figuur 4.2.2: Gene III en geen VIII

  • Die geen VIII-proteïen vorm 'n buisvormige reeks van ongeveer. 2 700 identiese subeenhede rondom die virale genoom
  • Ongeveer vyf tot agt kopieë van die geen III-proteïen is aan die punte van die filamentagtige faag geleë (d.w.s. genoom plus geen VIII-samestelling)
  • Laat binding aan bakteriële "seks" pilus toe
    • Pilus is 'n bakteriese oppervlakstruktuur van E coli wat die "F-faktor" ekstrachromosomale element bevat

Infeksie

  • Enkelstreng genoom (aangewys '+' string) wat aan pilus geheg is, gaan gasheersel binne
    • Hooflaagproteïen (geen VIII) gestroop
    • Klein laagproteïen (geen III) bly geheg
  • Gasheerkomponente skakel enkelstring (+) genoom om na dubbelstring sirkelvormige DNA (genoem die replikatiewe of "RF" vorm)
  • Transkripsie begin
    • Reeks promotors
      • Verskaf 'n gradiënt van transkripsie sodat geen naaste aan die twee transkripsieterminators die meeste getranskribeer word
    • Twee terminators
      • Een aan die einde van geen VIII
      • Een aan die einde van geen IV
    • Transkripsie van al 10 gene verloop in dieselfde rigting

Amplifikasie van virale genoom

  • Gene II-proteïen stel 'nick' in (+) string bekend
  • Pol I verleng die (+) string met behulp van string verplasing (en die '-'-string as sjabloon)
  • Na een reis om die genoom breek die geen II-proteïen weer om 'n voltooide (lineêre) '+'-genoom vry te stel
    • Lineêre (+) genoom is gesirkuleer
  • Gedurende eerste 15-20 minute van DNA-replikasie word die nageslag (+) stringe omgeskakel na dubbelstring (RF) vorm
    • Dit dien as bykomende sjablone vir verdere transkripsie
  • Gene V-proteïen bou op
    • Hierdie is 'n enkelstrengs DNA bindende proteïen
    • Verhoed omskakeling van enkel (+) string na die RF-vorm
  • Kry nou 'n opbou van sirkelvormige enkelstring (+) DNA (M13 genoom)

Figuur 4.2.3: Amplifikasie van genoom

Faag verpakking

  • Hooflaagproteïen (Geen VIII) teenwoordig in E coli membraan
  • M13 (+) genoom, bedek met ss bindende proteïen - Gene V proteïen, beweeg na selmembraan
  • Gene V-proteïen is afgestroop en die hooflaagproteïen (Geen VIII) bedek faag-DNA soos dit uitgedruk word
    • Verpakkingsproses is dus nie gekoppel aan enige groottebeperking nie van die M13-genoom
    • Lengte van die filamentagtige faag word bepaal deur die grootte van die DNA in die genoom
    • Insetsels van tot 42 Kb is in M13-genoom ingebring en verpak (7x genoomgrootte)
  • ~8 kopieë van die Gene III-proteïen word aan die einde van die geëxtrudeerde genoom geheg

Ontwikkeling van M13 in 'n kloningsvektor

M13 is ontwikkel tot 'n bruikbare kloningsvektor deur die volgende elemente in die genoom in te voeg:

  • 'n geen vir die lac onderdrukker (lac ek) proteïen om regulering van die toe te laat lac promotor
  • die operateur-proksimale streek van die lac Z geen (om voorsiening te maak vir a-komplementering in 'n gasheer met operateur-proksimale delesie van die lac Z geen).
  • a lac promotor stroomop van die lac Z geen
  • 'n polylinker (veelvuldige kloningsplek) streek het verskeie kodons in die lac Z geen

Figuur 4.2.4: Invoegings in genoom

  • Die vektore is benoem volgens die spesifieke polyliner-gebied wat hulle bevat het
  • Die vektore is tipies in pare gekonstrueer, met die polylinker-streke in teenoorgestelde oriëntasies

Figuur 4.2.5: Polylinker streke

Kloning in M13mp vektore

  • Die RF (dubbelstrengs) vorm van die M13-faag kan net soos enige ander plasmied geïsoleer en behandel word
  • Die polylinker-gebied kan "oopgemaak" word deur gebruik te maak van beperking-endonukleases wat geskik is vir die aanvaarding van die fragment van belang
  • Die fragment word in die plink-gebied geligeer
  • Die beskikbaarheid van omgekeerde georiënteerde plink's (bv. mp18, mp19) beteken dat ingevoegde fragmente met nie-komplementêre eindes in enige oriëntasie ingevoeg kan word

Enkelstrengs vorms van die faag

Die vermoë om 'n enkelstrengige vorm van die faag te isoleer het voordele in beide volgordebepaling en mutagenese.

  • Enkelstrengs DNA-sjabloon kan verder gelees word as dubbelstrengs-sjabloon

'n Doeltreffende mutagenese-metode (die "Kunkel"-metode) is ontwikkel deur die enkelstrengige vorm van die faag te gebruik.

  • Die M13mp vektor met insetsel word eers in 'n mutant gegroei E coli gasheer (bv. CJ236)wat af en toe uracil in die DNA sou inkorporeer in plaas van timidien.
    • E coli sintetiseer normaalweg 'n ensiem (urasiel-N-glikosidase) wat urasielreste in DNA verwyder. Maar in on- stamme, word die uracil nie verwyder nie
    • Die vlak van urasiel verkeerde inkorporasie in DNA word verhoog in stamme wat 'n tekort aan dUTPase het. Hierdie ensiem skakel dUTP om na dUDP, en daarom, in dut- stamme die vlakke van dUTP is verhoog en verbeter verkeerde inkorporasie van dUTP in gasheer DNA
    • Die E coli druk CJ236 het 'n genotipe wat dut-/ung-kenmerke insluit
  • 'n Mutageniese primer sal aan hierdie enkelstreng-sjabloon gekoppel word (bv. om 'n puntmutasie te produseer)
  • Die primer word verleng deur die vier dNTP's te gebruik, en word geligeer om dupleks DNA te produseer
  • Die dupleks-DNS word in 'n ander gasheer ingevoeg E coli (bv. JM101) wat urasielbevattende DNA herken en uitsny (afbreek) (d.w.s. 'n stam wat ung+)
  • Die ouer (wilde tipe) string word verkieslik afgebreek en die mutageniese string word gerepliseer.
  • Die faag nageslag het tipies 'n hoë voorkoms (80-90%) van die verlangde mutasie.

Figuur 4.2.6: Kunkel metode


1 Nukleïensuurstruktuur en -funksie.

1.1 Struktuur van nukleïensure.

1.1.3 Hidrofobiese interaksies.

1.1.4 Verskillende vorme van die dubbelheliks.

1.1.6 Denaturering en hibridisasie.

1.1.7 Oriëntasie van nukleïensuurstringe.

1.2.1 Ontwikkel en terugspoel.

1.2.2 Getrouheid van replikasie-proeflees.

1.3 Chromosoomreplikasie en seldeling.

1.4.3 Herkombinasie (na-replikasie) herstel.

1.5.3 Post-vertalingsgebeure.

2 Mutasie en variasie.

2.1 Variasie en evolusie.

2.1.3 Gerigte mutasie in bakterieë?

2.2.3 Variasie as gevolg van groterskaalse DNA-veranderings.

2.2.4 Ekstrachromosomale middels en horisontale geenoordrag.

2.3.1 'n Model van die algemene (homologe) rekombinasieproses.

2.3.2 Ensieme betrokke by rekombinasie.

2.4.1 Herstel van fenotipe.

2.5 Meganismes van mutasie.

2.5.3 Ultraviolet bestraling.

2.6 Isolasie en identifikasie van mutante.

2.6.1 Mutasie en seleksie.

2.6.3 Isolasie van ander mutante.

3 Regulering van geenuitdrukking.

3.2 Transkripsiebeheer.

3.2.2 Terminators, verswakkers en anti-terminators.

3.2.3 Induksie en onderdrukking: regulatoriese proteïene.

3.2.4 Twee-komponent regulatoriese stelsels.

3.2.5 Globale regulatoriese stelsels.

4 Genetika van bakteriofage.

4.1 Bakteriofaagstruktuur.

4.2 Enkelstring DNA-bakteriofage.

4.3 RNA-bevattende fage: MS2.

4.4 Dubbelstring DNA-fage.

4.4.3 Litiese en lisogeniese regulering van bakteriofaag λ.

4.5 Beperking en wysiging.

4.6 Bakteriese weerstand teen fage aanval.

4.7 Komplementering en rekombinasie.

4.8 Waarom is bakteriofage belangrik?

4.8.4 Fage in die natuurlike omgewing.

4.8.5 Bakteriële virulensie en fage-omskakeling.

5.1 Sommige bakteriese kenmerke word deur plasmiede bepaal.

5.1.1 Antibiotiese weerstand.

5.1.2 Kolisiene en bakteriosiene.

5.1.3 Virulensie determinante.

5.1.4 Plasmiede in plantgeassosieerde bakterieë.

5.2 Molekulêre eienskappe van plasmiede.

5.2.1 Plasmiedreplikasie en beheer.

5.2.4 Plasmied-onversoenbaarheid.

5.3.3 Differensiële groeikoers.

5.4 Assosiasie van 'n plasmied met 'n fenotipe.

6.2.1 Meganisme van vervoeging.

6.2.3 Konjugasie in ander bakterieë.

6.3.1 Gespesialiseerde transduksie.

6.4.1 Gevolge van rekombinasie.

6.4.2 Terreinspesifieke en nie-homologe (onwettige) herkombinasie.

6.5 Mosaïekgene en chromosoomplastisiteit.

7 Genomiese plastisiteit: beweegbare gene en fasevariasie.

7.1.1 Struktuur van invoegreekse.

7.1.2 Voorkoms van invoegingsreekse.

7.2.1 Struktuur van transposons.

7.3 Meganismes van transposisie.

7.3.1 Replikatiewe transponering.

7.3.2 Nie-replikatiewe (konserwatiewe) transposisie.

7.3.3 Regulering van transposisie.

7.3.4 Aktivering van gene deur transponeerbare elemente.

7.3.5 Mu: 'n Oordraagbare bakteriofaag.

7.3.6 Konjugatiewe transposons.

7.4.1 Variasie bemiddel deur eenvoudige DNA-inversie.

7.4.2 Variasie bemiddel deur geneste DNA-inversie.

7.4.3 Antigeniese variasie in die gonokok.

7.4.4 Fase-variasie deur gegly-string mispaar.

7.4.5 Fasevariasie bemiddel deur differensiële DNA-metilering.

7.5 Gegroepeerde gereeld afgewisselde kort palindromiese herhalings.

8 Genetiese Modifikasie: Ontgin die potensiaal van bakterieë.

8.1.1 Generering van variasie.

8.1.2 Seleksie van gewenste variante.

8.2 Oorproduksie van primêre metaboliete.

8.3 Oorproduksie van sekondêre metaboliete.

8.4.1 Sny en verbind DNA.

8.4.3 Bakteriofaag λ vektore.

8.4.4 Kloning van groter fragmente.

8.4.5 Bakteriofaag M13 vektore.

8.5.1 Konstruksie van genomiese biblioteke.

8.5.2 Sifting van 'n geenbiblioteek.

8.5.4 Konstruksie van 'n cDNA-biblioteek.

8.6 Produkte van gekloonde gene.

8.6.3 Ander bakteriese gashere.

8.7 Ander gebruike van geentegnologie.

9 Genetiese metodes om bakterieë te ondersoek.

9.2.2 Chromatien-immunopresipitasie.

9.2.4 Motiliteit en chemotaksis.

9.3.1 Wye-reeks meganismes van bakteriële patogenese.

9.3.2 Opsporing van virulensiegene.

9.5 Taksonomie, evolusie en epidemiologie.

9.5.4 Denaturerende-gradiënt-gelelektroforese en temperatuurgradiënt-gelelektroforese.


4.2: M13 Faag - Biologie

'n Instituut vir Kanker en Genomiese Wetenskap, Universiteit van Birmingham, Birmingham, Verenigde Koninkryk
E-pos: [email protected]

b Skool vir Ingenieurswese en Materiaalwetenskap, Queen Mary Universiteit van Londen, Londen, VK

c Skool vir Biowetenskappe, Universiteit van Birmingham, Birmingham, Verenigde Koninkryk

d Skool vir Chemiese Ingenieurswese, Universiteit van Birmingham, Birmingham, VK
E-pos: [email protected]

Abstrak

Om die meganismes agter die supramolekulêre selfsamestelling van nanokomponente werklik te verstaan, is die karakterisering van hul oppervlakeienskappe van kardinale belang. M13 het na vore gekom as 'n praktiese nanokomponent vir bio-nanosamestellings van funksionele materiale en toestelle, en die gewildheid daarvan neem toe namate die tyd verbygaan. Die ondersoek wat in hierdie studie uitgevoer is, verskaf belangrike inligting oor die oppervlaklading en die oppervlakte van M13 bepaal deur die vergelyking van strukturele data en die meting van ζ-potensiaal by pH wat wissel tussen 2 en 11. Die ontwikkelde metodologieë tesame met die eksperimentele bevindinge kan vervolgens ontgin word as 'n nuwe en gerieflike voorspellingsinstrument van die totale lading van gemodifiseerde weergawes van M13. Dit sal op sy beurt die ontwerp van die selfsamestellingstrategieë vergemaklik wat die virusboublok met ander mikro- en nanokomponente sal kombineer via intermolekulêre interaksies.


Suiwering van bakteriofaag M13 deur anioonuitruilchromatografie

M13 is 'n nie-litiese filamentagtige bakteriofaag (faag). Dit is wyd gebruik in fage vertoon tegnologie vir die vertoon van vreemde peptiede, en ook vir die bestudering van makromolekule strukture en interaksies. Tradisioneel is hierdie faag gesuiwer deur sesiumchloried (CsCl) digtheidgradiënt ultrasentrifugering wat hoogs moeisaam en tydrowend is. In die huidige studie is 'n eenvoudige, vinnige en doeltreffende metode vir die suiwering van M13 gebaseer op anioonuitruilchromatografie daargestel. 'n Voorafverpakte SepFast™ Super Q-kolom gekoppel aan 'n vinnige proteïenvloeistofchromatografiestelsel (FPLC) is gebruik om vrygestelde fage in verhelderde vas te vang Escherichia coli gefermenteerde sous. 'n Gemiddelde opbrengs van 74% is verkry uit 'n gepakte bedmodus eluering met behulp van sitraatbuffer (pH 4), wat 1.5 M NaCl bevat teen 1 ml/min vloeitempo. Die suiweringsproses is aansienlik verkort tot minder as 2 uur vanaf 18 uur in die konvensionele ultrasentrifugering metode. SDS-PAGE het aan die lig gebring dat die suiwerheid van deeltjies vergelykbaar was met dié van CsCl gradiëntdigtheid ultrasentrifugering metode. Plaakvormende toets het getoon dat die gesuiwerde fage steeds aansteeklik was.


Verkeerd gevoude proteïenaggregate, gekenmerk deur 'n kanoniese amiloïedvou, speel 'n sentrale rol in die patobiologie van neurodegeneratiewe siektes. Middels wat neurotoksiese tussenprodukte van amiloïedsamestelling bind en sekwestreer, die samestelling inhibeer of die destabilisering van sulke proteïenaggregate bevorder, is in kliniese toetsing. Hier wys ons dat die geen 3-proteïen (g3p) van filamentagtige bakteriofaag kragtige generiese binding aan die amiloïedvou bemiddel. Ons het die amiloïedbindings- en konformasie-hermodelleringsaktiwiteite gekenmerk deur 'n verskeidenheid tegnieke, insluitend X-straalveseldiffraksie en KMR. Die meganisme vir g3p-binding met amiloïed blyk sy fisiologiese rol tydens infeksie van Escherichia coli, wat afhanklik is van temperatuur-sensitiewe interdomein ontvou en cistrans prolyl isomerisering van g3p. Daarbenewens meng 'n natuurlike reseptor vir g3p, TolA-C, mededingend in met Aβ-binding aan g3p. KMR-studies toon dat g3p-binding aan Aβ-vesels hoofsaaklik deur middel- en C-terminale residue van die Aβ-subeenheid is, wat β-string-g3p-interaksies aandui. 'n Rekombinante tweewaardige g3p-molekule, 'n immunoglobulien Fc (Ig) samesmelting van die twee N-terminale g3p-domeine, (1) bind sterk Aβ-vesels (fAβ) (KD = 9.4 nM) (2) blokke fAβ samestelling (IC50

50 nM) en (3) dissosieer fAβ (EC50 = 40–100 nM). Die binding van g3p aan verkeerd gevoude proteïensamestellings is generies, en amyloïed-geteikende aktiwiteite kan gedemonstreer word deur ander verkeerd gevoude proteïenstelsels te gebruik. Saamgevat toon ons studies dat g3p(N1N2) as 'n algemene amiloïed-interaksiemotief optree.


4.2: M13 Faag - Biologie

Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA Vol. 75, No. 4, pp. 1754-1758, April 1978 Biochemistry

Sintese van faag M13-laagproteïen en die samestelling daarvan in membrane in vitro (seinhipotese/membraanproteïenvoorloper/proteïenvou/liposome)

WILLIAM WICKNER, GAIL MANDEL, CRAIG ZWIZINSKI, MARJORIE BATES, EN TERESA KILLICK Departement Biologiese Chemie en die Molekulêre Biologie Instituut, Universiteit van Kalifornië, Los Angeles, Kalifornië 90024

Gekommunikeer deur Eugene P. Kennedy, 6 Februarie 1978

OPSOMMING Die pelsproteïen (geen 8-produk) van kolifaag M13 is 'n integrale proteïen van die gasheerselmembraan in alle stadiums van virusinfeksie. Hierdie proteïen, wanneer dit in 'n selvrye reaksie gemaak word, het deur ander getoon dat dit 'n bykomende NH2-terminale peptiedstreek het en word na verwys as "procoat." Dit is aanvanklik nie membraangebonde nie, maar na blootstelling aan Escherichia coli membraanvesikels of aan liposome wat van E. coli lipiede voorberei is, word dit op 'n integrale wyse in die dubbellaag saamgevoeg. Baie van hierdie proteïen word op die binneste oppervlak van die liposoom blootgestel. Ons stel voor dat hervou van procoat soos dit die dubbellaag teëkom voldoende is om groot segmente van die peptiedketting deur die apolêre koolwaterstofkern te vervoer. Membraanproteïene deel sekere strukturele kenmerke wat fundamentele vrae oor hul sintese en samestelling in lipied-dubbellaagse laat ontstaan. Alhoewel baie integrale membraanproteïene uitgebreide polêre domeine op elke membraanoppervlak besit, word hulle aan die dubbellaag geanker deur die interaksies van hul hidrofobiese streke met die koolwaterstofkern van die membraan. Hoe kruis die hidrofiliese gedeeltes van proteïene die dubbellaag op pad vanaf hul sinteseplek binne die sitoplasma na hul finale plek op die seloppervlak? Baie selle groei vinnig, en dus kan hulle nuwe proteïen in hul membrane in 'n kwessie van minute bymekaarmaak. Elke spesie proteïen het 'n kenmerkende asimmetriese verspreiding oor die vlak van die dubbellaag wat vermoedelik gestabiliseer word deur die onmeetlik stadige tempo van proteïenrotasie oor die koolwaterstofkern, wat "flip-flop" genoem word. Waar is die inligting wat 'n membraanproteïen se asimmetriese oriëntasie spesifiseer? Daar is onlangs voorgestel (1) dat NH2-terminale "sein"-volgordes die oriëntasie spesifiseer aangesien hulle met spesifieke membraanproteïenvervoerstelsels in wisselwerking tree. Sodra membraanproteïene uit die dubbellaag onttrek en in die teenwoordigheid van skoonmaakmiddels gesuiwer is, benodig hulle die voortgesette teenwoordigheid van skoonmaakmiddel vir hul verspreiding. Hoe word die hidrofobiese streke van hierdie membraanproteïene in die waterige omgewing van die sitoplasma gesintetiseer sonder denaturasie en aggregasie? Vorige werk (2-5) het hierdie vrae benader deur studies van die klein kolifaag M13. Sewe van die agt M13-virusgekodeerde proteïene is membraangebonde (6-8). Een hiervan, die pelsproteïen (geen 8-produk), word veral deur die besmette sel gemaak (6). Gedurende alle stadiums van infeksie strek dit oor die sitoplasmiese membraan as 'n integrale proteïen (3, 6). Studies van die sintese van hierdie proteïen en die samestelling daarvan in membrane kan help om vrae oor membraan te beantwoord

amiedgelelektroforese het selvrye sintese van byna al die spesifieke M13-proteïene getoon. Die pelsproteïen wat deur sulke ekstrakte gesintetiseer word, het 23 bykomende residue op sy NH2-terminus (10-12) en word "procoat" genoem. In hierdie kommunikasie rapporteer ons toestande vir die byna eksklusiewe sintese van M13 procoat proteïen, ondersoek die fisiese toestand van hierdie nuut gesintetiseerde proteïen, en rapporteer die invoeging daarvan in beide natuurlike membrane en sintetiese liposome. MATERIALE EN METODES Chemikalieë. Foliensuur (leucovorin) is by Lederle gekoop. [35S]Metionien (200 Ci/mmol) was van New England Nuclear. DEAE-sellulose (DE52) is by Whatman gekoop. Chymotrypsien, pankreas RNase en DNase I was van Worthington. Selvrye proteïensintese. Dit is uitgevoer in ekstrakte van Escherichia coli-stam Q-13 (2) wat volgens die metode van Gold en Schweiger (13) voorberei is met die geringe modifikasies wat hieronder beskryf word. Oplosbare proteïene is van nukleïensure bevry deur adsorpsie by 40 tot DEAE-sellulose wat met buffer A [22 mM NH4CH3COO/0.01 M Tris-HCl, pH 7.5/0.01 M Mg(CH3COO) 2/1 mM dithiotreitoll en pluseluering met buffer A geëquilibreer is. 0,35 M NH4CH3COO. Ribosome is verder gesuiwer na differensiële sentrifugering deur sedimentasie vir 2 uur by 40 en 24,000 rpm deur 'n 5-20% sukrose gradiënt in buffer A in 'n Beckman SW 27 rotor. Sintetiese reaksies (30,l) is uitgevoer soos beskryf deur Model en Zinder (9) met 160 mM NH4CH3COO, 10 mM Mg(CHsCO0)2, M13 dupleks DNA (5 Mig), oplosbare proteïene (30 ug), ribosome (0.5) A2j0 eenheid), en ander komponente soos aangedui (9). Na 8 min by 37°C is [3S]metionien (1,Ci) bygevoeg tot 'n spesifieke aktiwiteit van 10 Ci/mmol. RESULTATE Jasproteïensintese. M13 DNA-gerigte proteïensintese in selvrye ekstrakte is gemonitor deur NaDodSO4/poliakrielamiedgelelektroforese. 'n Prominente piek van radioaktiwiteit by RF = 0.86 is geïdentifiseer as procoat-proteïen (10-12) deur die volgende kriteria: (i) dit het saam met gedansileerde laagproteïen (15) gemigreer (Fig. 1A) (ii) dit is nie in ekstrakte gevind nie. geprogrammeer deur M13 DNA met 'n amber mutasie in jas proteïen geen 8 (Fig. 1A) (iii) dit was nie gemerk deur [3H]arginine, 'n aminosuur wat nie in die jas proteïen gevind word nie (11, 16, 17) ( data nie getoon nie) en (v) dit het 'n ekstra chymotriptiese peptied gedra wat nie in volwasse jasproteïen gevind word nie, met die aminosuurreste wat verwag word vir die procoat-leiervolgorde (11). Nadat hierdie sintese geoptimaliseer is, is gevind dat in wese al die in vitro-produk procoat-proteïen is (Fig. 1B). Dit is bevestig deur die identiteit van peptiedkaarte van totaal in vitro

biogenese. M13 dupleks DNA is deur ander (9, 10) gebruik om uittreksels te programmeer wat gekoppelde transkripsie en translasie ondersteun. Ontleding deur natriumdodesielsulfaat (NaDodSO4)/poliakrielDie koste van publikasie van hierdie artikel is gedeeltelik deur die betaling van bladsykoste gedek. Hierdie artikel moet dus hiermee as "advertensie" gemerk word in ooreenstemming met 18 U. S. C. §1734 uitsluitlik om hierdie feit aan te dui.


Protokolle

Deel 1: Patroon vir faagafsetting

Daar is twee gevaarlike dele in vandag se laboratorium. Jy sal met 'n Exact-O-mes werk om 'n patroon versigtig op jou skyfie te sny. Hierdie messe is uiters skerp en almal moet die grootste sorg aan die dag lê in die hantering van hierdie of jy sal by MIT medies beland. Die tweede gevaar is die gekonsentreerde suur behandeling nodig om die skyfies te patroon. Jy moet, moet, moet laboratoriumjas, skoene met geslote tone, handskoene (miskien dubbelhandskoene) en 'n bril dra wanneer jy met die HCl, HNO3-oplossing te doen het. In vandag se laboratorium sal dit die onderwysfakulteit wees wat oppas om dit te doen.

    Versamel 'n ITO-skyfie van die onderwysfakulteit, raak die skyfie met 'n handskoenhand en net aan die rande aan.


Verwysings

Belcher, Angela "Gebruik die natuur om batterye te laat groei." Caltech, Pasedena, CA. 14 Januarie 2011. TED-praatjies.

Belcher A., ​​Mao C., Soils D."Anorganiese nanodrade." Amerikaanse patent 20120273987. 1 Nov. 2012.

Gloso Co. Lithium Ion Battery.Web Graphic.

Mao, C., Solis, D. J., Reiss, B. D., Kottmann, S. T., Sweeney, R. Y., Hayhurst, A., Georgiou, G., Iverson B., & Belcher, A. M.. "Virus-gebaseerde gereedskapstel vir die gerigte sintese van magnetiese en halfgeleidende nanodrade." Science 303.5655 (2004): 213-217.

Nam, K. T., Kim, D. W., Yoo, P. J., Chiang, C. Y., Meethong, N., Hammond, P. T., Chaing, Y. & Belcher, A. M. "Virus-geaktiveerde sintese en samestelling van nanodrade vir litiumioonbattery-elektrodes." wetenskap 312.5775 (2006): 885-888.

Ross, Philip. "Virale nanotegnologie." Wetenskaplike Amerikaner. 295.4 (2006): n. bladsy. Web. 15 Maart 2013.

Slonczewski, J.L., & Foster, J.W. (2011). Mikrobiologie, 'n ontwikkelende wetenskap. (2 uitgawe). New York: W. W. Norton &. Maatskappy.


Geredigeer deur (Justine Oesterle), 'n student van Nora Sullivan in BIOL187S (Microbial Life) in die Keck Science Department van die Claremont Colleges Lente 2013.


INHOUDSOPGAWE

Voorwoord
Erkennings
1. Die basiese beginsels van molekulêre biologie
2. Die gereedskap van die molekulêre bioloog
3. Algemene voorbereidings, prosedures en oorwegings vir die gebruik van handleiding
Afdeling 3-1 Gebruik hierdie handleiding
3-2 Veiligheidsoorwegings
3-3 Toerusting benodig vir molekulêre biologiestudies
4. Kloning van vektore en bakterieselle
Afdeling 4-1 pBR322
4-2 M13
4-3 pUC
4-4 λgtlO
4-5 λgtll
4-6 EMBL3 en EMBL4
4-7 Charon 28
4-8 bakteriese stamme
5. Voorbereiding van DNA vanaf eukariotiese selle
Afdeling 5-1 Vinnige DNA-voorbereiding
5-2 Voorbereiding van DNA uit eukariotiese selle: Algemene metode
5-3 DNA-voorbereiding vanaf gekweekte selle en weefsel
5-4 Beperkingsendonukleases (RE's) en hul gebruik
5-5 Agarose Gel Elektroforese
5-6 Suidelike Blot
6. Ondersoek nukleïensure met gemerkte sintetiese probes
Afdeling 6-1 Maak sintetiese DNA-probes: Algemene beskrywing
6-2 Eindetikettering van sintetiese probes
6-3 Hibridisering met sintetiese 32P eindgemerkte sonde
7. Ondersoek nukleïensure met plasmied-afgeleide probes
Afdeling 7-1 Nick Translation
7-2 DNA Hibridisering (Southern Blot Hibridization)
8. Plasmied DNA Voorbereiding
Afdeling 8-1 Transformasie van bakterieë
8-2 Plasmied DNA Voorbereiding: Triton-Lisozyme Metode
8-3 Grootskaalse alkaliese lysismetode: plasmiedsuiwering
8-4 Plasmied "Mini-Prep" Metode
9. DNA-beperkingsfragmentvoorbereiding
Afdeling 9-1 Minigels 1
9-2 Ontleding van DNA-fragmente na ensiematiese splitsing: Agarosegel-elektroforese
9-3 Elektrolusie
9-4 Poliakrielamied Gel Elektroforese van DNA-beperkingsfragmente
10. Suiwering van DNA
Afdeling 10-1 Spermynsuiwering van DNA
10-2 Glaspoeier-elutie van DNA
10-3 Suiwering van DNA: Ander metodes
11. Voorbereiding en Analise van RNA vanaf eukariotiese selle
Afdeling 11-1 Guanidien Isothiocyanate Voorbereiding van Totale RNA
11-2 RNA Voorbereiding: Mini Metode
11-3 Seleksie van Poli(A+) RNA op Oligo(dT) Sellulose
11-4 formaldehiedgel vir elektroforetiese skeiding van RNA en Northern Blot
11-5 "Dot Blot" Hibridisering van gemerkte sonde na DNA- of RNA-monsters
11-6 Ondersoekende RNA-gels: Algemene notas
11-7 Voorbereiding van RNA-probes vanaf DNA wat in plasmiede gekloneer is
12. Voorbereiding van DNA vanaf Bakteriofageklone
Afdeling 12-1 Groei en voorbereiding van bakteriofage
12-2 Grootskaalse Voorbereiding en Suiwering van DNA van Bakteriofage
13. Kloning van DNA vanaf die Eukariotiese Genoom
Afdeling 13-1 Kloning van DNA vanaf die Eukariotiese Genoom: Inleiding
13-2 Voorbereiding van Genomiese DNA: Gedeeltelike Mbol-verteringsmetode
13-3 Voorbereiding van bakteriofaag-vektor vir genomiese kloning
13-4 Ligering van genomiese DNA in bakteriofaagarms en verpakking om biblioteek te vorm
13-5 Titering en platering van verpakte biblioteek
13-6 Sifting van 'n geplateerde biblioteek met radio-gemerkte probes
13-7 Biblioteekversterking
14. cDNA Kloning in λgtlO en λgt11
Afdeling 14-1 Voorbereiding van λgt10- en λgt11-cDNA-kloningsvektore
14-2 Generasie van cDNA-insetsel vanaf eukariotiese mRNA
14-3 Ligering en verpakking van cDNA-biblioteek in λgt10- of λgt11-arms
14-4 Platering en sifting van λgt10 en λgt11 verpakte insetsels
14-5 Voorbereiding van DNA vanaf λgt10 en λgt11 cDNA klone
15. Subkloning in plasmiede
Afdeling 15-1 Subkloning in plasmiede: Algemene notas
15-2 Voorbereiding van pBR322-plasmiede vir subkloning en afbinding van insetsel
15-3 pBR322 Kolonieverbastering
15-4 Subkloning in pUC-plasmiede
16. M13 Kloning en Opeenvolging
Afdeling 16-1 M13 Kloning en volgordebepaling: Algemene notas
16-2 Voorbereiding van insetsel vir kloning vanaf spesifieke beperkingsterreine
16-3 Voorbereiding van insetsel vir Μ13-kloning deur opeenvolgende BAL 31-eksonuklease-uitwissing
16-4 Μ13 Vektorvoorbereiding en afbinding van insetsel in vektor
16-5 Transformasie van M13 in JM103 E. coli Gasheer
16-6 Sifting Μ13-klone met 'n radio-gemerkte sonde om insetsels vir volgordebepaling te kies
16-7 Voorbereiding van enkelstrengs Μ13 DNA vir volgordebepaling
16-8 Enkelbaan-skermanalise van Μ13-klone
16-9 Voorbereiding van Polyacrylamide Sequencing Gel
16-10 Volgordebepaling Μ13 Klone
17. Verdere karakterisering van gekloonde DNA
Afdeling 17-1 Si Nuclease Protection Assay
18. Transfeksie van soogdierselle in kultuur
Afdeling 18-1 Kalsiumfosfaattransfeksie van nie-aanhangende en aanhangende selle met gesuiwerde plasmiede
18-2 DEAE Dextran-bemiddelde transfeksie van nie-aanhangende en aanhangende soogdierselle
18-3 Elektroporasie
18-4 Seleksie van getransfekteerde soogdierselle: Die G418-metode
18-5 Chlooramfenikol-asetieltransferase (CAT)-toets
19. Proteïenmetodes
Afdeling 19-1 In vitro vertaling en immunopresipitasie
19-2 Polyacrylamide Gels vir Proteïenskeiding
19-3 Western Blot Analise
19-4 Silwerkleuring van gels vir proteïene of RNA
20. Algemene Metodes
Afdeling 20-1 DNS/RNA-ekstraksie en presipitasie
20-2 Plastieksak verseëling
20-3 Optiese Digtheid Analitiese Metings
20-4 fotografeergele of outoradiogramme
20-5 Outoradiografie
20-6 Maak plate vir bakteriese groei
20-7 Titering en platering van faag
21. Gespesialiseerde Metodes
Afdeling 21-1 Transgeniese Muis Voorbereiding
21-2 Monoklonale teenliggaamproduksie: Hibridomafusie
21-3 In Situ Hibridisering van Gemerkte Probes tot Weefselafdelings
21-4 Kloning in gis
Bylaag I Voorraadoplossings
Bylaag II Ensieme
Bylaag III Verskaffers van reagense en toerusting
Indeks


FINANSIERING

Hierdie werk (SR en DM) is befonds deur die Australiese Navorsingsraad (DP110104525) en die Sentrum vir Mariene Bio-innovasie. JGKH is ondersteun deur 'n Australiese Nagraadse Toekenning. Ondersteuning aan die JR-laboratorium is verskaf deur 'n anonieme skenker, die Royal Society of New Zealand Marsden Council-toekenning MAU210, Massey University Research Fund, Palmerston North Medical Research Fund, Lotery Health Board en toekenning 280289 en New Zealand Foundation for Research and Technology-kontrak C03X0701 . Befondsing is ook verskaf deur die NNS en Ministerie van Onderwys Singapoer onder sy Navorsingsentrum van Uitnemendheid-program.

Verklaring van belangebotsing. Geen verklaar nie.

Huidige adres: CSIRO Materials Science and Engineering, Posbus 218, Lindfield NSW 2070, Australië.


Kyk die video: Амёба протей Amoeba proteus (Oktober 2022).