Inligting

Waarom EtBr in die teenoorgestelde rigting migreer?

Waarom EtBr in die teenoorgestelde rigting migreer?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ons het geweet dat DNS na die positiewe elektrode sou hardloop, omdat hulle negatiewe elektrisiteit het. hoekom migreer EtBr dan na die teenoorgestelde rigting as DNA? is omdat hulle positiewe elektrisiteit het?


Etidiumbromied self is neutraal in lading, maar in waterige omgewing is dit 'n positiewe ioon en dit beweeg na die negatiewe elektrode, teenoor DNA, aangesien DNS negatief gelaai is en na die positiewe elektrode beweeg.

Die ding is, dit maak nie soveel saak nie. Of jy 'n jel voorberei met EtBr bygevoeg of jy EtBr by die elektroforesebuffer voeg, dit sal onmiddellik begin interkaleer sodra jy jou monster insit of die jel begin laat loop. Die oomblik wat die elektriese stroom toegepas word, sal EtBr inderdaad na die negatiewe elektrode begin migreer, maar 'n beperkte hoeveelheid sou reeds in die DNA ingeskakel het en dit sal slegs onder UV sigbaar wees wanneer dit aan DNA gebind is. Hou dit in gedagte dat EtBr 'n baie kleiner molekule is en die jel maklik binnedring, maar tussen DNA-basispare vasgevang sal word as dit gebeur om sommige te vind.

Met dit gesê, soos een van die kommentators uitgewys het, as jou monsters blykbaar andersom gereis het, het jy waarskynlik die kabels omgeruil. Die lading van die elektrode hang af van die lading wat toegepas word deur die bron van elektriese stroom en as jy die kabels fouteer, sal jy die monsters eintlik in die teenoorgestelde rigting laat beweeg.


Negatief gelaaide anione migreer na die anode-elektrode tydens elektroforese. Net so migreer positief gelaaide katione na die katode-elektrode in elektroforese. Neutrale molekules, wat enige netto lading hoegenaamd ontbreek, sal in die laaiputte geïmmobiliseer bly. Die netto lading op 'n molekule in 'n waterige buffer hang af van beide die molekulêre struktuur en die pH van die buffer. As jy met al hierdie feite saamstem, dan het jy jou eie vraag beantwoord.


Agarosegelelektroforese vir die skeiding van DNA-fragmente

Agarosegelelektroforese is die doeltreffendste manier om DNA-fragmente van verskillende groottes te skei wat wissel van 100 bp tot 25 kb(1). Agarose is geïsoleer uit die seewier genera Gelidium en Gracilaria, en bestaan ​​uit herhaalde agarobiose (L- en D-galaktose) subeenhede(2). Tydens gelering assosieer agarose polimere nie-kovalent en vorm 'n netwerk van bondels waarvan die poriegroottes 'n gel se molekulêre sif-eienskappe bepaal. Die gebruik van agarosegelelektroforese het 'n rewolusie in die skeiding van DNA veroorsaak. Voor die aanvaarding van agarose-gels, is DNA hoofsaaklik geskei met behulp van sukrosedigtheidgradiëntsentrifugering, wat slegs 'n benadering van grootte verskaf het. Om DNA met behulp van agarosegelelektroforese te skei, word die DNA in voorafgegote putte in die jel gelaai en 'n stroom toegepas. Die fosfaatruggraat van die DNA (en RNA) molekule is negatief gelaai, dus wanneer dit in 'n elektriese veld geplaas word, sal DNA fragmente na die positief gelaaide anode migreer. Omdat DNA 'n eenvormige massa/lading-verhouding het, word DNA-molekules volgens grootte geskei binne 'n agarose-gel in 'n patroon sodanig dat die afstand afgelê omgekeerd eweredig is aan die log van sy molekulêre gewig(3). Die leidende model vir DNS-beweging deur 'n agarosegel is "bevooroordeelde reptasie", waardeur die voorrand vorentoe beweeg en die res van die molekule saamtrek(4). Die migrasietempo van 'n DNS-molekule deur 'n jel word bepaal deur die volgende: 1) grootte van DNS-molekule 2) agarosekonsentrasie 3) DNS-konformasie(5) 4) spanning toegepas, 5) teenwoordigheid van etidiumbromied, 6) tipe agarose en 7) elektroforesebuffer. Na skeiding kan die DNA-molekules onder uv-lig gevisualiseer word nadat dit met 'n toepaslike kleurstof gekleur is. Deur hierdie protokol te volg, behoort studente in staat te wees om: Die meganisme waardeur DNS-fragmente binne 'n jelmatriks geskei word te verstaan ​​Verstaan ​​hoe konformasie van die DNA-molekule sy mobiliteit deur 'n jelmatriks sal bepaal 'n agarose-oplossing met geskikte konsentrasie vir hul behoeftes identifiseer. 'n agarose-gel vir elektroforese van DNA-monsters Stel die gelelektroforese-apparaat en kragtoevoer op Kies 'n gepaste spanning vir die skeiding van DNA-fragmente Verstaan ​​die meganisme waardeur etidiumbromied die visualisering van DNA-bande toelaat Bepaal die groottes van geskeide DNA-fragmente.


1. Volgorde en konformasie van nukleïensuurmonsters

Die basiese beginsels van elektroforese impliseer dat nukleïensuurmonsters verskillende koerse van mobiliteit het wanneer hulle van verskillende groottes is. Nukleïensure met dieselfde aantal nukleotiede maar verskillende volgordesamestelling en konformasie kan egter verskillende mobiliteite hê tydens elektroforese (Figuur 1).

  • Volgorde: AT-ryke DNA kan stadiger migreer as GC-ryke DNA van dieselfde grootte, veral in hoë-resolusie elektroforese. Net so sal DNS-molekules met 4-6 adenosienherhalings by ongeveer elke 10 bp (genoem geboë DNS) onreëlmatig migreer, veral in poliakrielamiedgels [1,2]. Hul abnormale migrasie is waarskynlik as gevolg van volgordesamestelling wat hul molekulêre konformasie beïnvloed.
  • Bouvorm: Die migrasie van DNA-molekules van dieselfde volgorde maar verskillende konformasies, soos sirkelvormige en gelineariseerde plasmiede, word beïnvloed deur die kompaktheid van elke konformasie soos hulle deur die jelporieë beweeg. Hoogs kompakte supergedraaide molekules migreer die vinnigste, gevolg deur buigsame lineêre en oop sirkelvormige molekules (Figuur 1). Hierdie differensiële migrasie kan uitgebuit word om die integriteit van plasmied DNA na isolasie te ondersoek, aangesien ongeskonde plasmied DNA wenslik is in toepassings soos transfeksie van soogdierselle vir geenooruitdrukking.

Figuur 1. Elektroforetiese migrasie van dieselfde DNA in verskeie konformasies. (A) Elektroforese van geknipte sirkelvormige, lineêre en supergedraaide plasmied DNA. (B) Konformasie van ontspanne sirkelvormige, lineêre en supergedraaide plasmied DNA. Geknikte plasmiede neem 'n ontspanne, oop sirkelvormige konformasie aan en neem die meeste volume op, migreer die stadigste deur die jel-gelineariseerde plasmiede beweeg deur die jel teen 'n effens hoër tempo ongeskonde, supergewikkelde plasmiede, synde die mees kompakte, migreer die vinnigste.


Beweging van chromosome tydens anafase (met diagram)

Tydens kerndeling of mitose is daar 'n progressiewe verandering in die struktuur en voorkoms van die chromosome.

Alhoewel mitose 'n deurlopende proses is (Fig. 20-20 en 20-21), word dit gerieflikheidshalwe gewoonlik in vier hoofstadia verdeel: profase, metafase, anafase en telofase.

Profase, die eerste stadium van mitose, word gekenmerk deur die kondensasie van die chromosome, die verdwyning van nukleoli en die kernomhulsel, en die vorming van die mikrotubuli van die spil. As die sel voor die profase 'n sentriool bevat het, dan word 'n tweede sentriool gevorm, die twee sentriole beweeg uitmekaar soos die spil vorm.

Die chromosome word onderskeibaar deur ligmikroskopie as gevolg van hul progressiewe verkorting en verdikking en uiteindelik word gesien dat dit saamgestel is uit twee susterchromatiede wat by die sentromeer of kinetochore bymekaar gehou word. Die susterchromatiede is die produkte van die replikasie van chromosomale DNA tydens die interfase van die selsiklus.

Teen die einde van profase (soms genoem prometafase), strek die spil tussen twee pole wat diametraal oorkant mekaar in die sel geplaas is en die chromosome migreer na die middel van die spil. In metafase is die sentromere van elke chromosoom in lyn met die middel van die spil op 'n vlak wat die ekwatoriale plaat genoem word.

Op hierdie tydstip is die sentromere aan die spilvesels gekoppel. Sommige van die spilvesels vorm nie assosiasies met enige chromosome nie en strek direk van een pool na die ander. Die sentromere word gedupliseer sodat elke chromatied 'n onafhanklike chromosoom word en is geheg aan 'n spilvesel wat aan een van die twee pole gekoppel is.

Die aanvang van anafase word gekenmerk deur die beweging van die chromosome na teenoorgestelde pole van die spil. Tydens anafase begin 'n proses genaamd sitokinese en verdeel die sel in twee helftes, waardeur die twee komplemente van chromosome fisies geskei word. Sitokinese is verskillend van, maar word dikwels gesinchroniseer met kerndeling, wat tydens die latere stadiums van mitose voorkom. In die finale fase van mitose, wat die telofase genoem word, bereik die chromosome die pole van die spil en begin dekondensasie ondergaan. Tydens die telofase verskyn nukleoli weer, asook 'n nuwe kernomhulsel wat die chromosome omsluit.

Beweging van chromosome tydens anafase:

Tydens die anafase van mitose vorder die sentromeer van elke chromosoom na een van die twee pole van die spil, met die arms van die chromosome wat agterbly (Fig. 20-21). Hierdie rangskikking dui daarop dat die chromosome na die pole van die spil getrek word. Vir 'n aantal jare het baie ondersoekers probeer om die aard van die meganisme wat verantwoordelik is vir hierdie beweging te bepaal.

Van die verskillende modelle wat voorgestel is, is:

(2) Die gly sitoplasmiese filament model, en

(3) Die dinamiese ewewigsmodel.

Die mikrotubuli-model is die eerste keer in die laat 1960's deur J. R. Mcintosh voorgestel. Volgens Mcintosh strek die mikrotubuli na binne vanaf die pole van die spil en oorvleuel in die middel van die sel. Tydens anafase gly die mikrotubuli verby mekaar in die gebied van oorvleueling, waardeur die sel verleng word en die pole verder uitmekaar gedruk word.

Terselfdertyd dat die oorvleuelende punte van die mikrotubuli verby mekaar gly, word “ander mikrotubuli wat die sentromere met die pole verbind by die pole uitmekaar gehaal. As gevolg hiervan word die algehele lengte van hierdie mikrotubuli verminder en die chromosome beweeg nader aan die pole. Omdat dit bekend is dat mikrotubuli-gly betrokke is by ander vorme van selbeweging, soos by die klop van silia en flagella, is hierdie model heeltemal aanneemlik. Dit blyk egter nie die volledige storie te wees nie.

In 1974 het A. Forer getoon dat aktienmikrofilamente in die spil aanwesig is, en later is dit ook getoon dat miosienfilamente teenwoordig is. Dit het gelei tot die voorstel dat dit die gly van die aktien- en miosienfilamente verby mekaar is wat verantwoordelik is vir chromosoombeweging.

Die rol van die mikrotubuli is verskuif na dié om te dien as 'n strukturele raamwerk waarop die chromosome gemonteer is. Bewegings van die sitoplasmiese filamente word nie deur ooreenstemmende beweging van die chromosome weerspieël totdat anafase begin en die mikrotubuli by die twee pole van die spil begin afbreek nie. In werklikheid maak die demontage van die mikrotubuli by die pole die chromosome vry om te beweeg in reaksie op die gly van die aktien en miosien.

Volgens die dinamiese ewewigsmodel wat in 1967 deur S. Inoue voorgestel is, is die mikrotubuli wat die spilvesels uitmaak in 'n dinamiese ewewig met 'n poel van mikrotubule subeenhede. Die byvoeging van nuwe subeenhede tot vesels wat van een pool van die spil na die ander strek, maar nie chromosome het nie, dien om die interpolêre afstand te vergroot, terwyl die subeenhede terselfdertyd verwyder word vanaf óf die poolpunte óf die sentromeer punte van ander spilvesels dien om hulle te verkort en die chromosome nader aan die pole te trek.

Benewens biochemiese bewyse wat hierdie laasgenoemde idee ondersteun, is die erkenning dat die beweging van chromosome na die pole van die spil tydens anafase 'n relatiwiteit stadige proses is in vergelyking met die klopbewegings van silia en flagella en die sametrekking van spierselle. Inderdaad, anafase-beweging vind plaas teen 'n tempo wat meer soortgelyk is aan die tempo3 waarteen filamente groei of verkort deur óf 'n invloei óf verlies van subeenhede.

Uit die voorafgaande bespreking is dit duidelik dat verskeie verskillende modelle wat probeer om rekening te hou met chromosoombeweging tydens die anafase van mitose deur onafhanklike waarnemings ondersteun word. Dit beteken nie dat die werklike meganisme nie die een of ander kombinasie van al die modelle behels nie.


Chromosoombeweging in anafase | Selbiologie

Chromosome is betrokke by 'n reeks gerigte bewegings tydens beide mitose en meiose. Met die skeiding van die susterchromatiede/homoloë by anafase word die ewewig verbreek, die chromosome beweeg na die pole teen 'n tempo van ongeveer 1 pm/min.

Deur hidro-dinamiese analise is bereken dat 'n krag van ongeveer 10-11 dyne nodig is en die hele verplasing van die ewenaar na die pool van 'n chromosoom vereis die gebruik van ongeveer 30 ATP-molekules.

Gebeurtenisse van chromosoombeweging:

Tydens mitose, waar chromosoombewegings in detail bestudeer is, is volgende gebeurtenisse waargeneem. In prometafase word die chro­matid-paar eers na die spilpaal getrek, en migreer dan na die middel van die spil.

Met die aanvang van anafase skei die chromatiede en migreer stadig na die spilpole (Fig. 5.18). Anafasebeweging van chromosome bestaan ​​uit twee afsonderlike prosesse - Anafase A en Anafase B.

Anafase A (vroeë anafase) behels die verkorting van mikrotubuli wat geassosieer word met kinetochore (diskontinue mikrotubuli)

Anafase B (laat anafase) behels verlenging en verskuiwing van hele spilvesels byna tot dubbel lengte om tot by die pole te bereik (aaneenlopende mikrotubuli).

Kinetochore is 'n trilaminêre plaatagtige struktuur wat by die primêre vernouing van chromosoom geleë is. Die chro&shimosome word deur kinetochore met mikrotubuli geheg voordat hulle na pole beweeg. Kontak tussen mikrotubuli en kinetochoor vind lateraal plaas en skakel dan oor na polêre aanhegting (Fig. 5.19).

Kinetochore is veronderstel om 'n passiewe struktuur te wees wat aan mikrotubuli-punte geheg bly terwyl mikrotubuli verkort word tydens chro- en sjimosomale beweging in anafase. Hierdie kortheid kan wees as gevolg van demontage of de-polimerisasie.

Kinetochore-spilpool-aantreklikhede lei tot chromosoombeweging sodat wanneer twee chromatiede skei, hulle outomaties sku na die pole beweeg as gevolg van de-polimerisasie. Die diskontinue spilvesels wat die kinetochore dra, trek saam en trek die chromosome na die pole terwyl die aaneenlopende vesels verleng en die pole uitmekaar hou.

Verwydering van spilpoolgebied beïnvloed die beweging van chromosome, terwyl verwydering van spilvesels nie die chromosomale beweging na die pool beïnvloed nie. Hierdie bevindinge dui daarop dat die kinetochore-streek meestal verantwoordelik is vir anafasiese beweging wat die dryfkrag hiervoor verskaf.

Meganisme van chromosoombeweging:

Verskeie hipoteses is gepoog om die molekulêre meganisme van beweging van chromosoom te vertolk (Fig. 5.20).

Ostergreen (1949) het die dinamiese ewewighipotese voorgestel waar die gebeure van poli&shimerisasie en de-polimerisasie van mikro­tubules direk verantwoordelik is vir die beweging van chromosome. Volgens hierdie hipotese is die energie wat vrygestel word (vanaf GTP-hidrolise) voldoende om die chromosoombeweging tydens anafase aan te dryf.

Hierdie hipotese postuleer dat die mikrotubuli stewig geanker is by kinetochore, terwyl die poolpunte vry is van demontage. In hierdie anker-translokasiestelsel sal die dryfkrag verskaf word deur die gepolariseerde samestelling-demontage van die mikrotubuli.

Volgens glyhipotese word die spilmikrotubuli bymekaargemaak en uitmekaar gehaal, maar die dryfkrag word nie direk gegenereer om die chromosome te beweeg nie. Hierdie hipotese postuleer dat betrokkenheid van laterale interaksies van mikro- en shytubules 'n rol kan speel analoog aan dyneïen in flagella.

Baie van die waarnemings, na die gebruik van die proteïen soos aktien en miosien, het voorgestel dat die interaksie van spilaktien met miosien of dineïen met mikrotubuli die beweegkrag kan verskaf terwyl die rigting deur die mikrotubuli verskaf word.

Rol van motorproteïen:

Onlangs is twee pro­teïnes geïdentifiseer, naamlik kinesien en sitoplasmiese dyneïen (Fig. 5.21), wat met kinetochore geassosieer word, het getoon dat dit dinamiese strukture is. Die kragte wat deur hierdie proteïene gegenereer word, is teenoorgestelde in rigting - een is na die pool gerig en die ander is weg daarvan.

Die sitoplasmiese dineïen kan betrokke wees by poolwykbewegings, terwyl kinesien betrokke kan wees by omgekeerde beweging na die middel tydens kongres. Beide hierdie proteïene is lede van groter families en dat mikrotubuli-gebaseerde bewegings 'n verskeidenheid motorproteïene vereis, wat geteiken en geaktiveer moet word vir die aanvang van hul funksie.

Kinesien het tweekoppige motoriese domeine wat 'n ATPase-aktiwiteit het en dus beweging deur hidrolise van ATP kataliseer. Dynein bestaan ​​uit kragproduserende swaar kettings en 'n verskeidenheid bykomstige subeenhede.

Rol van fosforilering en defosforilering:

Onlangse ondersoeke oor die kragte betrokke by chromosoombewegings is bestudeer deur gebruik te maak van in vitro tegnieke wat assosiasie van geïsoleerde chromosome en mikro­tubuli behels. Dit is getoon dat mikrotubuli geassosieer word met kinetochore en in teenwoordigheid van ATP beweeg na die minuskant (poolwykrigting).

Deur gebruik te maak van die teenliggaam (anti-tiofosfaat) tegniek, kan die tiofosfaatgroep in die kinetochoor gelokaliseer word, wat daarop dui dat fosforilering van 'n proteïenkomponent van kinetochoor eintlik lei tot omkeer van die rigting van chromosoombeweging en verskuiwing.

Daar word voorgestel dat beide kinase en fos&shifatase met kinetochore geassosieer kan word en twee motoriese proteïene (dineïen en kinesien) is betrokke by die ontwikkeling van kragte in oppo­siet rigtings (Fig. 5.22).

Dit is getoon dat differensiële fosforilering en defosforilering van twee ATPases (fosforilering gefasiliteer deur kinase en defosforilering gefasiliteer deur fosfatase) 'n unieke balans maak om die beweging van chromosoom te ondersteun. Alhoewel die minus-eindmotoriese aktiwiteit gegee word deur dyneïen wat by kine­tochore geleë is, maar die plus-end motoriese aktiwiteit kan te wyte wees aan 'n ander proteïen soos kinesien.

Rol van de-polimerisasie en polimerisasie van mikrotubuli:

Benewens fosforilering en de-fosforilering, groei en krimp mikrotubuli as gevolg van polimerisasie en de-polimerisasie by die kinetochoor. Hierdie verskynsel dui daarop dat motoriese aktiwiteit en mikrotubuli-dinamika tydens seldeling weg van en na die spilpool gekoördineer word.

Twee modelle is voorgestel om die de-polimeri­sering van mikrotubuli te verduidelik:

(i) Pac-man model (mikrotubuli word opgekou aan die kinetochore punt)

(ii) Poolafdeling vloedmodel (mikrotubules word by die pole gedepolimeriseer) (Fig. 5.23).


Wat is 'n voorbeeld van negatiewe fototropisme?

Voorbeelde van fototropisme Plantwortels vertoon ook gravitropisme, wat groei in reaksie op swaartekrag is. Sonneblomme is 'n goeie voorbeeld van positiewe fototropisme, want nie net krom hul stamme na die lig maar hulle blomme draai ook na die sonlig.

Tweedens, wat word bedoel met positiewe fototropisme en negatiewe fototropisme gee een voorbeeld van elke tipe? Gee een voorbeeld van elke tipe. Antwoord: Positiewe fototropisme is die beweging van 'n plantdeel in reaksie op 'n stimulus (lig). Die stam van 'n plant groei en buig na lig verteenwoordig die positiewe fototropisme terwyl beweging van wortel weg van lig binne die grond 'n is voorbeeld van negatiewe fototropisme.

As u dit in ag neem, waar kom negatiewe fototropisme in plant voor?

Resultate van die teenwoordig studie dui daarop dat negatiewe fototropisme kan voorkom wanneer die vlak van ouksien of van ouksien sein is verminder tot 'n minimale vlak, en dit negatiewe fototropisme is die basale reaksie op eensydige blouligbestraling in plant aksiale organe.

Wat is negatief Fototroop?

Fototropisme is die groei van 'n organisme in reaksie op 'n ligstimulus. Groei na 'n ligbron word positief genoem fototropisme, terwyl groei weg van lig genoem word negatiewe fototropisme (skototropisme).


Waar het hierdie vesels vandaan gekom?

Die sitoskelet het waarskynlik sy oorsprong in bakteriële en/of argaeale afkoms. Daar is antieke familielede van beide aktien en tubulien in bakteriese stelsels. In bakterieë word geglo dat die MreB-proteïen en die ParM-proteïen vroeë voorouers van Actin is. MreB funksioneer in die handhawing van selvorm en ParM funksies in plasmied (DNA) verdeling. Die FtsZ-proteïen in bakterieë funksioneer in sitokinese, dit is 'n GTPase, vorm spontaan filamente en word veronderstel om 'n antieke vorm van tubulien te wees. Hierdie bevindings ondersteun die hipotese dat die eukariotiese sitoskelet sy oorsprong in die bakteriese wêreld het.


Hoekom is my kleiner band te flou? Genomiese PCR werk nie! nie - Probeer net om sommige muise te genotipeer. (01/01/2006)

Ek is op my punt en sal enige raad waardeer. Ek probeer om 'n muis genotipering PCR-protokol te laat werk. Die muise en die protokol kom van 'n uiters gerespekteerde genetika-laboratorium - maar ek kry nie die protokol om te werk nie, ek is nie 'n molekulêre bioloog nie, maar ek het probeer om soveel as moontlik te leer om dit te maak werk.

Hier is 'n opsomming van wat ek doen:
DNS-ekstraksie met behulp van 'n Qiagen-stel - ander het hierdie kit gebruik en is mal daaroor, die laboratorium wat die muise ontwikkel het, beskerm K-verterings- en fenol/chloroform-ekstraksies sonder 'n kit.
Outoklaaf buise vir DNA, PCR, PCR primer aliquots.
PCR aan

300-900 ng muis genomiese DNA.
Gebruik dieselfde PCR-reagense van dieselfde verskaffers as beskryf deur die laboratorium waarin die protokol ontwikkel is: gewone Taq van Promega, Invitrogen Buffer E (het 'n spesifieke Mg2+ kons. & pH wat vir my sê dat hulle ook ten minste 'n soort probleem gehad het& #33), DMSO, geen ekstra Mg2+, ens.
Totale rxn volume: 25 ul.
Stel rxns op ys op, voeg Taq op die laaste oomblik by, en begin PCR.
Termofietstoestande: 1 siklus: 2 min @ 94C 35-38 siklusse: 30 sek @ 94C, 30 sek @ 60C, 1 min @ 72C dan 4C.
Begin PCR-produkte op 'n 1,5% agarosegel, gemaak en laat loop met LB Buffer (Faster Better Media), elke keer vars gemaak. Ek voeg gewoonlik 25-50 ug EtBr by die jel.
(En. Ek dra altyd handskoene, en ek is 'n versigtige en ervare pipetter.)

Ek gebruik 3 primers: 1 spesifiek vir WT muise, 1 spesifiek vir die KO muise, en 1 algemene primer. Die gewone primer is by twee keer die konsentrasie van die ander 2 primers (0,3 ul, 100 uM).

Waarna ek soek: KO-band: 600 bp. WT-band: 400 bp. Ek paring heterosigotiese muise wat normale proporsies van elke genotipe het as nageslag. So, ek behoort 'n KO-groep in te sien

In plaas daarvan sien ek 'n sterk-tot-brandende KO (boonste) band in

75% van my muise, en 'n swak tot skaars-daar WT (onderste) band in hoogstens 1/8 tot 1/4 van my muise. Ek het *een keer* beter reaksies gekry en 'n paar duidelike hets en WT-muise geïdentifiseer - hoewel die WT-band nog 'n bietjie te flou was vir troos by sommige muise. Maar sedertdien kon ek nog nooit my reaksies so goed laat verloop nie, met dieselfde en nuwe DNA.

Op hierdie stadium het ek omtrent alles probeer wat ek weet om te doen. Ek het probeer om die uitgloeitemperatuur van 47-60C te verander - het 'n paar nie-spesifieke bande by laer temps gekry, maar verbasend genoeg, nie 'n helderder WT-band nie. Ek het probeer om die WT-onderlaagkonsentrasie na 2x & 10x te verhoog - dit het net my KO-band dowwer gemaak. Ek het al meer as een keer nuwe buise van alles probeer. Ek het die protokol in 'n Stratagene PCR-masjien met 'n robotarm en in 'n gewone Perkin-Elmer-masjien probeer - geen verskil nie. Ek het al meer DNA probeer gebruik - dit help, totdat die bande verdwyn en vervang word met 'n smeer en miskien 'n mega-kb band wanneer ek opstaan

1,2 ug DNA of meer. Ek het probeer om die tye teen 94C, 60C en 72C met 30 sek. te verleng - geen verskil nie. Ek het probeer om meer EtBr en amp by te voeg wat langer foto's neem - dit help tot 'n beperkte mate, maar regtig, die band is net nie daar nie, ek kry net meer agtergrond.

Wat doen ek verkeerd? Wat kan ek doen om dit te laat werk. Enige hulp sal waardeer word!

Dit is net raaiskote, maar 'n paar dinge om na te gaan:

* Ek was onseker oor wat jy bedoel het toe jy gesê het jy het buise geoutoklaveer vir jou primer en DNA. Bedoel jy dat jy hulle geoutoklaveer het voordat jy dit gevul het, of dat jy jou primers outoklaveer? Oor die algemeen doen ek niks met my buise nie -- hulle kom skoon, en as jy dit regtig steriel (skaars) nodig het, kan jy dit steriel koop. Outoklawe veroorsaak kruisbesmetting.

* Jou bande kan dalk verdwyn as gevolg van migrasie van EtBr uit jou jel. Jy kan dit toets deur jou jel in buffer + EtBr te vlek, of deur EtBr by die positiewe bufferput in jou jelboks te voeg. EtBr migreer na die negatiewe elektrode (teenoor die rigting van DNS) en kan bande van kort lengte ontbind.

* Jy sê nie watter Qiagen-stel jy gebruik nie. Ek neem aan dit is vir die voorbereiding van genomiese DNA, nie plasmiede nie.
Ek sal self met prot K en fenol/chloroform gaan.

Baie dankie vir jou antwoord.

--------
* Ek was onseker oor wat jy bedoel het toe jy gesê het jy het buise geoutoklaveer vir jou primer en DNA. Bedoel jy jy het hulle geoutoklaveer voordat jy dit gevul het, of dat jy jou primers outoklaveer? Oor die algemeen doen ek niks met my buise nie -- hulle kom skoon, en as jy dit regtig steriel (skaars) nodig het, kan jy dit steriel koop. Outoklawe veroorsaak kruisbesmetting.
--------

Ek het my buise geoutoklaveer voordat ek dit gevul het. Uit die gesprekke wat ek met verskeie mense gehad het oor outoklaafbuise, blyk dit dat menings so baie verskil. Jy is die eerste wat die kwessie van potensiële kruiskontaminasie noem. Ander het beslis gesê om buise te outoklaveer (skakel potensiële organismes uit), en ander het beslis gesê om nie buise te outoklaveer nie (kan buise skeeftrek). Dit is duidelik dat dit nie so erg kan wees om dit nie te doen nie, aangesien so baie mense, jy inkluis, sweer deur dit nie te doen nie!

---------
* Jou bande kan dalk verdwyn as gevolg van migrasie van EtBr uit jou jel. Jy kan dit toets deur jou jel in buffer + EtBr te vlek, of deur EtBr by die positiewe bufferput in jou jelboks te voeg. EtBr migreer na die negatiewe elektrode (teenoor die rigting van DNS) en kan bande van kort lengte ontbind.
---------

Ek vermoed dit is dalk 'n baie relevante punt - dankie!

--------
* Jy sê nie watter Qiagen-stel jy gebruik nie. Ek neem aan dit is vir die voorbereiding van genomiese DNA, nie plasmiede nie.
--------

Ja, dit is vir die voorbereiding van genomiese DNA van diereweefsels.

Weereens baie dankie vir jou hulp, en dat jy die tyd geneem het om te skryf. Ek waardeer dit regtig.


Opkoms van bakteriële draaikolk verduidelik

Bakterieë in 'n druppel water vorm spontaan 'n tweerigtingkolk, met bakterieë naby die middel van die druppel wat in die teenoorgestelde rigting swem as wat bakterieë naby die rand swem. Nuwe rekenaarsimulasies, bevestig deur 'n nuwe eksperiment, verduidelik hoe daardie draaikolk ontstaan.

Wanneer 'n klomp van B. subtilis bakterieë in 'n druppel water opgesluit is, gebeur 'n baie vreemde ding. Die chaotiese beweging van al daardie individuele swemmers organiseer spontaan in 'n kolkende draaikolk, met bakterieë aan die buitenste rand van die druppel wat in een rigting beweeg terwyl dié aan die binnekant die teenoorgestelde rigting beweeg.

Navorsers van die Brown Universiteit en die Universiteit van Cambridge het vir die eerste keer verduidelik hoe daardie dubbelbewegingskolk gegenereer word. Deur rekenaarmodellering en 'n slim eksperiment te gebruik, wys die navorsers dat die vloeistofvloei wat deur al daardie klein swemmers gegenereer word, daardie vreemde tweerigtingbeweging verduidelik.

Die navorsing word gepubliseer in Verrigtinge van die National Academy of Sciences.

Hugo Wioland en en ander in die laboratorium van Raymond Goldstein by Cambridge het die verskynsel die eerste keer eksperimenteel in 2013 gedemonstreer. Maar destyds was die dinamika van die stelsel - veral die tweerigtingbeweging - nie ten volle verstaan ​​nie. Enkeleida Lushi, nou 'n postdoktorale navorser in Brown se Skool vir Ingenieurswese en 'n kenner in teoretiese modellering, het oor hierdie probleem begin dink terwyl hy verlede jaar by Cambridge op 'n beurs was.

"Dit is baie eenvoudige organismes," het Lushi gesê. "Hulle besluit nie bewustelik waarheen om te gaan en hoe om te organiseer nie. Die meeste van die dinamika vind plaas net as gevolg van fisiese meganismes, soos botsings met mekaar en die grens. Maar daar was geen intuïtiewe manier om te verduidelik wat met die dubbelbeweging gebeur het nie. draaikolk. Dit was baie raaiselagtig."

Die aanvanklike model wat probeer het om die verskynsel te reproduseer, het gefokus op die meganiese interaksies tussen individuele bakterieë. Daardie simulasies het getoon dat wanneer individue wat in ewekansige trajekte swem, in 'n beperkte sirkelvormige ruimte teen mekaar begin stamp, hulle geneig is om mekaar te oriënteer na dieselfde hoek relatief tot die sirkelvormige grens. Dit help om te verduidelik hoe 'n gekoördineerde beweging begin, maar kan nie verduidelik waarom individue na die buitekant van die sirkel in die teenoorgestelde rigting van dié aan die binnekant beweeg nie.

Daardie deel van die verskynsel, blyk dit, is 'n kwessie van vloeistofvloei.

"Hierdie bakterieë is net 'n paar mikrometer lank," het Lushi gesê. "Op daardie skaal voel die vloeistofvloei na hulle baie viskeus -- baie anders as wat ons in lug of selfs in water ervaar. Die effek is dat enige beweging wat die bakterieë maak, versteurings in die vloei veroorsaak wat sterk deur hulle gevoel sal word. bure."

Lushi en haar kollegas het dus 'n rekenaarsimulasie ontwikkel, reg, wat die vloeistofvloei ingesluit het wat geskep word wanneer die bakterieë swem. B. subtilis swem deur klein kurktrekkeragtige aanhangsels wat flagella genoem word, te draai. Die flagellêre bondel druk teen die vloeistof, wat die bakterieë vorentoe dryf en die vloeistof in die teenoorgestelde rigting stoot.

Toe Lushi daardie dinamika in haar simulasie ingesluit het, het die bron van die tweerigtingbeweging duidelik geword. Die bakterieë is almal geneig om hulself in dieselfde rigting te belyn, het die simulasie getoon. Maar individue wat langs die buitekant van die sirkel swem, het 'n vloei in die vloeistof geskep in die teenoorgestelde rigting van die rigting waarin hulle swem. Bakterieë na die binnekant van die sirkel word gedwing om teen daardie vloei te swem, maar kan nie heeltemal tred hou nie. Hulle beweeg uiteindelik in dieselfde rigting as die vloei -- die teenoorgestelde rigting van die swemmers aan die buitekant.

Om die model te bevestig, het die navorsers 'n eksperiment met regte bakterieë opgestel, reg, met behulp van gekleurde kleurstowwe op die bakteriese liggaam en flagella om te bepaal watter rigting die bakterieë in die gesig staar. Die eksperiment het getoon dat al die bakterieë inderdaad in dieselfde rigting probeer swem het. Maar diegene in die middel is agteruit gevee, blykbaar deur die vloeistofvloei wat langs die buitekant geskep is. Dit was net soos die model voorspel het.

"Dit is 'n baie basiese model," het Lushi gesê, "maar op die ou end vang dit hierdie verskynsel baie goed vas. Dit het gewys dat enige studie van mikrobes wat in 'n vloeistof gesuspendeer is nie die beweging van daardie vloeistof moet ignoreer nie - dit kan belangrike gevolge hê op die mikrobes."

So hoekom bestudeer die vreemde beweging van bakterieë in 'n waterdruppel?

"Ons wil die natuur verstaan ​​waar daar baie voorvalle is van onafhanklike individuele eenhede wat gesamentlik organiseer - hierdie bakteriële draaikolk is maar een voorbeeld," het Lushi gesê. "Maar ook, ons wil dalk uiteindelik bakteriese kolonies beheer, byvoorbeeld om hul verspreiding te beperk. Hoe meer ons verstaan ​​hoe hulle interaksie het en hoe hulle gesamentlik beweeg, hoe beter kan ons maniere bedink om hul beweging te beheer."


Southern Blotting: Teorie en Praktyk

Gel voorbehandeling

Die oordrag van die DNA van gel na membraan

Die klad- of oordragprosedure het in wese onveranderd gebly sedert dit die eerste keer in 1975 beskryf is en word in Figuur 2 getoon. Basies word die jel bo-op 'n stuk filtreerpapier geplaas wat op 'n steun lê in 'n skinkbord wat oordragbuffer bevat ('n hoë soutoplossing). Die membraan word bo-op die jel geplaas, gevolg deur nog filtreerpapier, 'n groot hoop papierhanddoeke, en laastens 'n swaar voorwerp soos 'n handboek.

Die Suidelike oordragapparaat. As the buffer travels up the filter paper wick through the layers of filter paper, gel, membrane and paper towels, the DNA is deposited from the gel to the membrane. The weight (say, a textbook) ensures that all of the layers remain in close contact during the transfer process.

There have been several modifications of the original blotting procedure described by Southern. These modified procedures attempt to decrease the transfer time and increase the efficiency of transfer. One procedure involves setting the transfer apparatus upside down so the gel is on the top. This downward capillary transfer aided by gravity, in addition to being faster than the conventional procedure, does not place excessive pressure on the gel, and thus there is no possibility of crushing it. Another modification, electroblotting, involves using an electrophoresis apparatus to mobilize the DNA from the gel on to the membrane. Vacuum blotting uses vacuum pressure to draw the transfer buffer through the gel.

DNA hybridization

Before hybridization is carried out, the membrane is treated with a blocking agent to prevent nonspecific association of probe with the membrane. A variety of polymeric inert agents, such as skim milk powder, Denhardt's reagent (a mixture of Ficoll, polyvinylpyrrolidone and bovine serum albumin), denatured fragmented salmon sperm DNA or heparin can be used to bind the unused DNA binding sites on the membrane. Skim milk powder and Denhardt's reagent are two most commonly used blocking agents. Skim milk powder is the cheapest and easiest to use, whereas Denhardt's reagent can more effectively block nylon membranes.

Opsporing


Kyk die video: ETBR (Oktober 2022).