Inligting

Hoe om Na/K-kanaalaktivering op membraanvlak te meet?

Hoe om Na/K-kanaalaktivering op membraanvlak te meet?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aanvaar dat daar twee verskillende seine op die EKG voorkom - tydens depolarisasie en repolarisasie in die standaard EKG. Ek is aangeraai om nie die standaard EKG te gebruik om die presiese elektriese gebeure te meet tydens:

  • fases 0-2
  • 3-4

Ons kan data kry oor die elektriese aktiwiteit van neurone in vivo in Fig. 1 waar sommige data oor die elektriese aktiwiteit van neurone teenwoordig is. So my gedagte is dat 'n soortgelyke tegniek waarskynlik met kardiomiosiete kan werk.

Fig. 1 Voorbeeld van meting vir elektriese aktiwiteit van neurone in vivo

Ek skat dat daar ongeveer 18% onsekerheid is wanneer die standaard EKG gebruik word as gevolg van die piek in die stadium 1 (Gibbs-verskynsel) en daardie twee volledige verskillende fases.


Grense in Cellularen Infeksiemikrobiologie

Die redakteur en beoordelaars se affiliasies is die nuutste wat op hul Loop-navorsingsprofiele verskaf word en sal moontlik nie hul situasie ten tyde van hersiening weerspieël nie.



DEEL OP

Materiale en Metodes

Diere- en Selkultuur

Alle diere-eksperimente is goedgekeur deur die Dieresorgkomitee van Miyazaki Mediese Kollege (Kiyotake, Miyazaki, Japan). Die selkultuurprosedures is van Syed oorgeneem et al. 11 Spesifiek, ons het individueel identifiseerbare RPeD1-neurone van laboratorium-verhoog gebruik L. stagnalis (varswaterslak) by kamertemperatuur. Vir hierdie studie is 2- tot 3 maande oue slakke (doplengte, 20– 30 mm) geselekteer. Slakke is ontdop en oorgeplaas na 'n steriele disseksieskottel in antibiotika normale soutoplossing (150 μg/ml Gentamicin [G3632 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO] in normaal Lymnaea sout: 51,3 mm NaCl, 1,7 mm KCl, 4,1 mm CaCl 2, 1,5 mm MgCl 2, 5,0 mm HEPES, pH 7,9). Die sentrale ganglioniese ringe is geïsoleer deur gebruik te maak van standaard disseksieprosedures en daarna aan die silikoonrubberbasis van 'n weefselkultuurplaat vasgespeld. Die buitenste bindweefsel van die ganglia is verwyder voor ensiematiese behandeling. Ganglia is behandel in gedefinieerde medium (serumvrye 50% Leibovitz L-15 medium [GIBCO-BRL Life Technologies, Burlington, Ontario, Kanada] met bygevoegde anorganiese soute, 20 μg/ml gentamisien, pH 7.9) vir 25 minute met 0.2% tripsien (tipe III Sigma Chemical Co.). Vervolgens is ganglia ook behandel met 0.2% sojaboon tripsien inhibeerder (Sigma Chemical Co.) vir 15 min in die gedefinieerde medium. Voor verwydering van geïdentifiseerde neurone is die binneste bindweefselskede met fyn tang van die ganglia gedissekteer. Neurone is verwyder deur sagte suiging met 'n gesilikoniseerde, mikrosmede fyn gepoleerde pipet met 'n buitedeursnee van 1.5 mm (IB-150 F WPI, Sarasota, FL), en dan is hierdie neurone in 'n hoë-osmolariteit medium wat 30 mm glukose bevat, onderhou. . Hierna is neurone oorgedra na poli-l-lisien-bedekte kultuurskottels (Falcon Plastics, Los Angeles, CA) met 3 ml van die gedefinieerde medium.

Intrasellulêre opname en [Na + ] i Beelding

Die volgende neuronale aktiwiteit is gemonitor deur gebruik te maak van konvensionele intrasellulêre opname. 'n Glasmikro-elektrode, buitedeursnee van 1.0 mm (GC100-10 CEI, Londen, Engeland) is gevul met 'n versadigde oplossing van K 2 SO 4, wat 'n puntweerstand van 20-60 MΩ gelewer het. 'n Neuron is onder 'n omgekeerde mikroskoop (TE-300 Nikon, Tokio, Japan) waargeneem en deur 'n mikro-elektrode met behulp van 'n manipuleerder vasgespel (MM 202 M 204, Narishige, Japan). Elektriese seine is versterk (IR-283 Cygnus Technologies, Delaware Water Gap, PA), vertoon op 'n ossilloskoop (VC-11 Nihon Kohden, Tokio, Japan), en gestoor op rekenaar (G4 Apple Computer Inc., Cupertino, CA) deur 'n A/D-omskakelaar (Powerlab ADInstruments, Colorado Springs, CO) en 'n termiese steegopnemer (RTA1200 Nihon Kohden).

Vir die meting van [Na + ] i, die radiometriese fluoresserende indikator, is 'n asetoksimetiel ester vorm van natriumbindende benzofuran isoftalaat (SBFI-AM) (Molecular Probes, Eugene, OR) gebruik. SBFI-AM, 1 mm, in dimetielsulfoksied (DMSO) is gemeng met die gedefinieerde medium wat die neuron bevat teen 'n volume van 0.1%. Na inkubasie by 20°C vir 60 minute, is hierdie gedefinieerde medium verwyder, en die neuron is vir 1 uur in normale soutoplossing gesuspendeer om hidrolise van AM-esters en diasetate uit te haal. Metings is gemaak deur hierdie aanwyserkleurstof by 340 nm, waar fluoressensie besonder sensitief is vir die natriumioonkonsentrasie, en 390 nm, waar baie naby aan die isosbestiese punt is.20–22Daarom is die intensiteit van intrasellulêre SBFI-fluoressensie gemeet vinnig wisselende opwekkingsgolflengtes (340/390 nm) en deurlopend opgeneem by 510 nm deur 'n omgekeerde fluoresserende mikroskoop (TE-300), 'n afgekoelde hoëspoed-ladinggekoppelde toestelvideokamera (C-6970 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan), en 'n fluoressensiebeeldingstelsel (Argus-Hisca Hamamatsu Photonics). Die blootstellingstyd vir 'n enkele beeld was 159 ms, wat gelei het tot 'n totale tyd van 600 ms wat nodig is vir 'n 340/390-nm paar beeld. Agtergrond fluoresserende beelde is afgetrek voor analise.

In vivo Kalibrasie vir [Na +] i

Twee fluoressensieverhoudings met SBFI is omgeskakel na die gebruik van die kalibrasiekurwe vir RPeD1 in vivo .23–25Die kalibrasiekurwe vir [Na + ] i is gekonstrueer deur die fluoressensieverhouding te plot versus Na + konsentrasie van die kalibrasie-oplossings (fig. 1). Om die [Na + ] i met ekstra ([Na + ] o ), 30 min voor die eksperiment te equilibreer, is 10 μm van die Na + ionofoor gramicidien D (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) bygevoeg, en dan RPeD1 neurone is vir 30 min blootgestel aan Na + -vrye konsentrasie soutoplossing met gramicidien D oplossing. Fluorescerende beeldpare is geneem, en dan is RPeD1-neurone blootgestel aan soutoplossings met toenemende natriumkonsentrasie (1, 25, 50, 100, 150 mm) vir 10 minute elk. Beeldpare is weer aan die einde van elke blootstelling geneem.

Fig. 1. Die in vivokalibrasiekurwe van natriumbindende benzofuraan-isoftalaat 340/390-nm intensiteitsverhouding versusintrasellulêre natriumkonsentrasies ([Na + ] i ) in regterpedaal dorsale 1 neuron. Elke waarde verteenwoordig gemiddelde ± SEM n =10.

Fig. 1. Die in vivokalibrasiekurwe van natriumbindende benzofuraan-isoftalaat 340/390-nm intensiteitsverhouding versusintrasellulêre natriumkonsentrasies ([Na + ] i ) in regterpedaal dorsale 1 neuron. Elke waarde verteenwoordig gemiddelde ± SEM n =10.

Eksperimentele prosedure vir intrasellulêre opname en [Na + ] i-beelding

Neurone is in vyf proewe verdeel: normale sout, hoë-Na + sout, Na + -vrye sout, membraan hiperpolarisasie en tetrodotoksien (Sankyo, Tokio, Japan 30 μm) voorbehandeling. Vir die membraanhiperpolarisasieproewe is die membraanpotensiaal op -80 mV gehou deur huidige inspuiting 2 minute voor lidokaïenperfusie. In die hoë-Na + sout proewe is hoë-Na + sout (103 mm NaCl, 1.7 mm KCl, 4.1 mm CaCl 2, 1.5 mm MgCl 2, 5.0 mm HEPES, pH 7.9) as die ekstrasellulêre vloeistof gebruik. In die Na + -vrye soutproewe, Na + -vrye soutoplossing (0 mm NaCl, 50 mm N -metiel-d-glukamien, 1,7 mm KCl, 4,1 mm CaCl 2, 1,5 mm MgCl 2, 5,0 mm HEPES, pH 7,9) is gebruik. In die normale sout-, membraanhiperpolarisasie- en tetrodotoksien-voorbehandelingsproewe is normale soutoplossing gebruik.

In die normale soutproewe is lidokaïen (0.01, 0.1 en 1 mm) in die kultuurbak geperfuseer na metings van basislynwaardes. In die hoë-Na + sout, Na + -vrye sout, membraan hiperpolarisasie en tetrodotoksien voorbehandeling proewe, is 1 mm lidokaïen geperfuseer. In die tetrodotoksien-voorbehandelingsproewe is tetrodotoksien (30 μm) vir 4-6 minute geperfuseer voor lidokaïenperfusie.

In die normale soutproewe is membraanpotensiaal en [Na + ] i gemeet vir 5 min na elke dosis lidokaïen. In die hoë-Na + sout en die Na + -vrye sout proewe, is die normale soutoplossings na óf hoë-Na + of Na + -vrye sout op 2 min verander, en membraanpotensiaal en [Na + ] i is gemeet vir 7 min na lidokaïen toediening. In die normale sout- en membraanhiperpolarisasieproewe is die basislynwaardes gedurende die 4 min voor lidokaïenperfusie (teen 0 min in die figure) versamel. In die hoë-Na + sout, Na + -vrye sout en tetrodotoksien voorbehandeling proewe, is die basislyn waardes gemeet 2 min voor lidokaïen perfusie (teen 0 min in die figure). In elke proef is die membraanpotensiaal gemeet relatief tot die rustende membraanpotensiaal van -60 mV in RPeD1.

Hele sel Patch Clamp opnames

Heelselspanningsklem-opnames in RPeD1-neurone26,27 is gemaak met 'n EPC9-versterker (HEKA elektronika, Lambrecht, Duitsland). Pleisterelektrodes (puntdeursnee aangepas na 1.0 μm, weerstand van 1–3 MΩ) is uit glasbuis (buitedeursnee van 1.5 mm) getrek sonder filament (PG-150T-7.5 Warner Instrument, Hamden, CT) op 'n vertikale pipettrekker (Kopf 750, Tujunga, CA). Vir eksperimentbeheer en dataverkryging is 'n A/D- en D/A-omskakelaar-koppelvlakbord (PCI-16 HEKA elektronika) in 'n persoonlike rekenaar (G4) geplaas. Data-verkryging en -analise is uitgevoer met behulp van Pulse-sagteware (weergawe 8.66 HEKA elektronika). Die stroom is gefiltreer teen 1 kHz met behulp van 'n vier-pool Bessel filter en gedigitaliseer teen 'n monsterfrekwensie van 20 kHz. Om INa te bestudeer, is pipette gevul met gefiltreerde (0.22-μm filter) sesiumpipetoplossing bestaande uit 50 mm CsCl, 5 mm EGTA, 5 mm MgCl 2, 10 mm HEPES, 2 mm ATP-Mg en 0.1 mm GTP-Tris, en die pH is aangepas na 7.4 (met CsOH). Die badoplossing het bestaan ​​uit 40 mm NaCl, 10 mm TEACl, 4,0 mm MgCl 2, 1,0 mm CaCl 2, 1,0 mm 4-aminopiridien, 1,0 mm CdCl 2 en 10 mm HEPES (pH 7,9).26,27Alle eksperimente is uitgevoer by kamertemperatuur (20°–22°C). Nadat 'n gigaohm-seël verkry is, is die reeksweerstand ongeveer 70–80% vergoed deur gebruik te maak van die reeksweerstandskompensasie van die pulssagteware, en die finale reeksweerstandswaai is onder 1 MΩ vergoed. Die lekstrome is afgetrek deur lekkompensasie binne die pulssagteware vir elke eksperiment.

Eksperimentele prosedure vir opnames van heel sel pleisterklem

In heelselspanningsklemopnames is neurone in drie groepe verdeel: kontrole-, 0.1- en 1 mm lidokaïenperfusiegroepe. Stroom is gemeet 6 min na elke dosis lidokaïen. Die stroom-spanning kurwe, bestendige toestand aktivering kurwe, en bestendige toestand inaktivering kurwe is geplot.

Stroom-spanningskromme

Vir die stroom-spanningkromme is INa gemeet in reaksie op 10-mV, 20-ms stappe vanaf 'n houpotensiaal van -120 mV (1 s) en 10-mV inkrementele stappe na potensiale tussen -80 en +40 mV.26 ,27Strome is in beheer tot die maksimum genormaliseer en as 'n funksie van membraanpotensiaal geplot.

Bestendige toestand aktiveringskurwe

Vir die bestendige toestand aktiveringskurwe, is piek INa gemeet in reaksie op 20-ms, 10-mV inkrementele depolariserende stappe van -120 tot +40 mV vanaf 'n houpotensiaal van -120 mV vir 1 s. Vanaf die piek INa is die konduktansiewaardes (G) bereken volgens die vergelyking G = INa/(V − ENa), waar INa die piek Na + stroom was gemeet by elke membraanpotensiaal (V), en ENa die omkeerpotensiaal is. beraam deur die stroom–spanningskromme.28Berekende G-waardes is genormaliseer tot die maksimum van die kontrole of tot die maksimum van elke groep en as 'n funksie van membraanpotensiaal geplot. Plotte is gepas by Boltzmann-verhoudings van die vorm y = G min + (G maks − G min )/<1 + exp[(V− V 50 )/K]>, waar y genormaliseerde GNa is, G min die G van is basislyn, G maks is die G van maksimum, V is elke membraanpotensiaal, V 50 is die membraanpotensiaal waarby geleiding halfpad tussen G min en G maks is, en K is die hellingsfaktor.10,28,29

Bestendige toestand inaktiveringskurwe

Vir die bestendige toestand inaktiveringskurwe, is die membraanpotensiaal van -120 tot 40 mV teen 10-mV inkremente vir 5 s voorgepuls. INa is gemeet met 'n 20-ms toetspuls tot -10 mV. Strome is genormaliseer tot die maksimum in beheer en geplot as 'n funksie van voorpulspotensiaal. Plotte is gepas by Boltzmann-verhoudings van die vorm y = I min + (I maks − I min )/<1 + exp[(V − V 50 )/K]>, waar y genormaliseer is INa van die maksimum in beheer of in elke groep, I min is die INa van basislyn, I maks is die INa van maksimum, V is elke voorpulspotensiaal, V 50 is die membraanpotensiaal waarby geleiding halfpad tussen I min en I maks is, en K 'n hellingsfaktor is. 10,28,29In bestendige toestand aktivering en inaktivering kurwes is ontledings uitgevoer met behulp van Kaleida grafiek (weergawe 3.52 Synergy Software, Reading, PA).

Statistiese analise

Resultate word uitgedruk as gemiddelde ± SEM. Die resultate van herhaalde metings in elke dosis in elke groep proewe is ontleed deur herhaalde-meting eenrigting-analise van variansie, gevolg deur die Scheffé-toets. Onder die drie dosisse lidokaïen in die normale sout proewe en onder die hoë-Na + sout, Na + -vrye sout, hiperpolarized en tetrodotoksien voorbehandeling proewe, is die drie groepe in die stroom-spanning kurwe van heelsel pleister klamp opnames ontleed deur variansieanalise, gevolg deur die Scheffé-toets. Stat-aansig (weergawe 4.5 Abacus, Berkeley, CA) is vir hierdie ontledings gebruik. P & lt 0,05 is as statisties beduidend beskou.


Resultate

Effek van 'n toename in Δψ op Flagellar Proteïen-uitvoer deur die Transmembraan-uitvoerhekkompleks.

Die ∆pH- en ∆pNa-komponente word benodig vir doeltreffende deurvoer van H + en Na + deur die FlhA-ioonkanaal, onderskeidelik, wanneer FliH en FliI ontbreek (13, 17). In Salmonella, word intrasellulêre pH gehandhaaf op ongeveer 7.5 oor 'n wye reeks eksterne pH (21). Omdat 'n eksterne pH hoër as 7.5 'n negatiewe waarde van ΔpH tot gevolg het, verhoog bakteriese selle outonoom Δψ om die totale PMF konstant so veel as moontlik te handhaaf (22, 23). Konsekwent het 'n opwaartse verskuiwing van eksterne pH van 7.0 na 8.5 Δψ aansienlik verhoog maar die totale PMF verlaag (Fig. 1)A en SI Aanhangsel, Tabel S1). Daar is getoon dat FliH en FliI die transmembraan-uitvoerhekkompleks robuust maak teen 'n verskeidenheid versteurings. Die uitvoerhekkompleks handhaaf dus proteïenvervoeraktiwiteit oor 'n wye reeks eksterne pH van 6.0 tot 8.0 (13, 17).

Die effek van Δψ op flagellêre proteïenuitvoer. (A) Die relatiewe afskeidingsvlak van FlgD oor 'n eksterne pH-reeks van 7.0–8.5. Die Salmonella SJW1103 (wilde tipe, aangedui as WT) en MMHI0117 [∆fliH-fliI flhB(P28T), aangedui as ∆HI B*]-selle is by 30 °C in T-bouillon gekweek by eksterne pH-waardes van 7.0, 7.5, 8.0 of 8.5. Heelsel en kultuur-supernatant fraksies is voorberei, gevolg deur SDS-PAGE en immunoblotting met poliklonale anti-FlgD teenliggaampies. Relatiewe afskeidingsvlakke van FlgD is gemeet. Hierdie data is die gemiddelde van ses onafhanklike eksperimente. Die membraanpotensiaalverskil (in millivolts) is gemeet deur tetrametielrodamienmetielester te gebruik. Die vertikale stawe dui SD's aan. Die intrasellulêre pH is gemeet met behulp van pHluorien(M153R), en dan is die totale PMF bereken (SI Aanhangsel, Tabel S1). (B) Die effek van verlaagde Δψ op flagellêre proteïenuitvoer deur die ∆HI B* mutant. Die ∆HI B*-selle is by 30 °C in T-bouillon (pH 8.5) gekweek. Nadat die selle twee keer met T-bouillon (pH 7.5) gewas is, is die selle in T-bouillon teen 'n pH-waarde van 7.5 of 8.5 hersuspendeer en vir 1 uur by 30 °C geïnkubeer. Die heelsel (Sel) en kultuur-supernatant fraksies (Sup) is geanaliseer deur immunoblotting met poliklonale anti-FlgD teenliggaampies. Die relatiewe afskeidingsvlakke van FlgD is gemeet. Hierdie data is die gemiddelde van ses onafhanklike eksperimente.

Om die rol van Δψ in flagellêre proteïenuitvoer te verduidelik, het ons die Salmonella ΔHI B* stam, waarin die B * mutasie aansienlik verhoog die waarskynlikheid van die substraat toetrede tot die polipeptied kanaal in die afwesigheid van FliH en FliI (20). Ons het die haakkappende proteïen FlgD as 'n verteenwoordigende uitvoersubstraat gekies omdat die vlak van FlgD-afskeiding deur hierdie mutantstam selfs hoër is as die wilde-tipe vlak (20). Die transmembraan-uitvoerhekkompleks van die ΔHI B* stam verkies Na + bo H + as die koppelingsioon in 'n eksterne pH-reeks van 6.0–8.0 (17, 18). Daarom is die ΔHI B* selle is in T-bouillon gekweek by eksterne pH-waardes van 7.0, 7.5, 8.0 of 8.5 in die afwesigheid van eksterne Na + om die Δψ-afhanklikheid van proteïenuitvoer te ondersoek. Die hoeveelheid FlgD wat deur die ΔHI B afgeskei word* mutant is ontleed deur kwantitatiewe immunoblotting met poliklonale anti-FlgD teenliggaampie (SI Aanhangsel, Fig. S2). Die resultate vir alle stamme word kwalitatief in Tabel 1 opgesom.

In die ΔfliH-fliI flhB(P28T) ΔflhA stam (ΔHI B* ΔA Tabel 1), die negatiewe kontrole, geen FlgD is in die kultuursupernatant opgespoor nie (SI Aanhangsel, Fig. S2B). Die relatiewe vlakke van FlgD wat deur die ΔHI B afgeskei word* selle het toegeneem met 'n toename in Δψ bo 'n drempelwaarde (Fig. 1 A, Reg, en SI Aanhangsel, Fig. S2C). Die volle aktiwiteit van die uitvoerhekkompleks is bereik toe Δψ 1.5-voudig bo die drempelwaarde bereik het.

Die Δψ-komponent is noodsaaklik vir flagellêre proteïenuitvoer deur Salmonella wildtipe selle (13, 19). Daarom het ons getoets of Δψ bo die drempelwaarde ook die afskeidingsvlak van FlgD deur wildtipe selle verhoog het. Die afskeidingsvlakke van FlgD deur wildtipe selle was byna konstant oor 'n eksterne pH-reeks van 7.0–8.5 (Fig. 1) A, Links, en SI Aanhangsel, Fig. S2A), wat aandui dat 'n toename in Δψ nie flagellêre proteïenuitvoer deur die wildtipe proteïenvervoerder fasiliteer nie. Dus, die tempo van H +-gekoppelde proteïentranslokasie deur die uitvoerhekkompleks is hoog genoeg om die effek van verhoogde Δψ te masker wanneer FliH en FliI teenwoordig is.

Ons het gevind dat die hoeveelheid FlgD wat deur die ΔHI B*-selle afgeskei word, toegeneem het met 'n toename in Δψ (Fig. 1) A, Reg). Daarom het ons ondersoek of 'n afname in Δψ deur 'n afwaartse pH-verskuiwing van 8.5 na 7.0 die Δψ-afhanklike flagellêre proteïentransportaktiwiteit van die ΔHI B*-selle omkeerbaar verlaag. Die selle is eers by pH 8.5 gegroei, en daarna is die eksterne pH-waarde van 8.5 na 7.5 verskuif. Hierdie afwaartse pH-verskuiwing het die afskeidingsvlak van FlgD met ongeveer 3,3-voudig verlaag (Fig. 1) B, Reg), wat ooreenstem met die data wat in Fig. 1 getoon word A, Regs Laer. Dit bevestig dat die uitvoerhekkompleks 'n Δψ-afhanklike uitvoerenjin word wanneer Δψ bo die drumpel toeneem.

Effek van verhoogde Δψ op die filamentgroeitempo.

Flagelvormige boublokke word oor die sitoplasmiese membraan getranslokeer via die PMF-gedrewe uitvoerhekkompleks, diffundeer af in die sentrale kanaal van die groeiende flagellêre struktuur en monteer by sy distale einde (24). Daarom word die flagellêre groeitempo bepaal deur die tempo van PMF-gedrewe proteïentranslokasie deur die uitvoerhekkompleks asook deur die diffusietempo van die flagellêre boustene. 'n Afname in die PMF verlaag die tempo van filamentgroei aansienlik (24). Om die Δψ-afhanklikheid van die uitvoeraktiwiteit in die ΔHI B*-mutant te monitor, is ΔHI B*-selle in T-bouillon gekweek by 'n eksterne pH van 7.5 of 8.5, en hul flagellêre filamente is gemerk met 'n fluoresserende kleurstof, Alexa Fluor 594, om die aantal en lengtes van die filamente te meet (Fig. 2 en SI Aanhangsel, Tabel S2). Die meeste van die ΔHI B*-selle het geen filamente gehad nie, maar 1.0% het 'n enkele filament gehad by eksterne pH 7.5 (n = 198). In teenstelling hiermee, by 'n eksterne pH van 8.5, het 60.5% van die HI B*-selle filamente geproduseer, met 'n gemiddeld van 1.3 ± 0.5 per sel (gemiddeld ± SD n = 107) (Fig. 2B). Die gemiddelde filamentlengte was 4,8 ± 1,5 μm (n = 50). Hierdie resultate dui daarop dat die ΔHI B*-selle flagellêre boublokke op 'n Δψ-afhanklike wyse vervoer sodra hul uitvoerhekkomplekse geaktiveer is deur 'n toename in Δψ bo 'n drempelwaarde.

Die effek van verhoogde Δψ op flagellêre vorming. (A) Fluorescerende beelde van ∆HI B*-selle gegroei in TB by pH 7.5 of TB by pH 8.5 met of sonder 100 mM NaCl. Vlagfilamente is gemerk met Alexa Fluor 594. Die fluoressensiebeelde van die filamente gemerk met Alexa Fluor 594 (magenta) is saamgevoeg met die helderveldbeelde van die selliggame. (B) Boksplotte van die flagellêre filamente in die ∆HI B*-selle. Die onderste en boonste boksgrense is onderskeidelik 25ste en 75ste persentiele. Die lyn in die middel van die blokkie wys die mediaangetal. Die onderste en boonste foutlyne dui onderskeidelik die kleinste en grootste waardes aan. Meer as 150 selle is getel. (C) Strooidiagramme van die lengte van die vlagfilamente. Die filamentlengte is die gemiddelde van 50 filamente, en lyne verteenwoordig gemiddelde waardes met SD's. Slegs twee van die ∆HI B*-selle het filamente by pH 7.5 in die afwesigheid van NaCl gehad. Vergelykings tussen datastelle is uitgevoer met behulp van 'n twee-stert Student's t toets. 'n Waarde van P < 0.05 is as statisties beduidend beskou. **P < 0,01***P < 0,001 (SI Aanhangsel, Tabel S2).

Multikopie-effek van FliJ op Δψ-afhanklike vlagproteïen-uitvoer deur ΔHI B*-selle.

'n Interaksie tussen FliJ en FlhAC, wat normaalweg afhanklik is van FliH en FliI, verander die transmembraan-uitvoerhekkompleks in 'n hoogs doeltreffende Δψ-gedrewe uitvoerenjin (13). Daarom het ons ondersoek of ooruitdrukking van FliJ die Δψ-afhanklikheid van flagellêre proteïenuitvoer deur die ΔHI B*-mutant beïnvloed. Ooruitdrukking van FliJ het die afskeidingsvlak van FlgD by 'n eksterne pH van 7.0 tot ongeveer 60% van die maksimum vlak aansienlik verhoog. 'n Verhoging in die eksterne pH van 7.0 tot 8.5 het die FlgD-afskeidingsvlak verder met ongeveer 1.7-voudig verhoog relatief tot die vlak by pH 7.0 (Fig. 3)A en SI Aanhangsel, Fig. S3). Skraping van fliJ vanaf die ΔHI B* mutant het die maksimum Δψ-afhanklike proteïenvervoeraktiwiteit met ongeveer viervoudig verminder (Fig. 3B), maar 'n toename in die eksterne pH van 7.0 tot 8.5 het steeds 'n toename in die FlgD-afskeidingsvlak veroorsaak (Fig. 3)C en SI Aanhangsel, Fig. S2D). Hierdie resultate gee verdere ondersteuning aan die idee dat die transmembraan-uitvoerhek 'n spanninggehekte proteïenvervoerder is en demonstreer dat FliJ benodig word vir die membraanspanningsafhanklike aktiveringsmeganisme van die uitvoerhekkompleks.

Identifikasie van flagellêre proteïene betrokke by die Δψ-afhanklike aktiveringsmeganisme van die transmembraan-uitvoerhekkompleks. (A) Die effek van FliJ-ooruitdrukking op flagellêre proteïenuitvoer deur ∆HI B*-selle. Die HI B*-selle wat FliJ ooruitdruk, is by 30 °C in T-bouillon gekweek teen eksterne pH-waardes van 7.0, 7.5, 8.0 of 8.5. Die heelsel- en kultuur-supernatant-fraksies is ontleed deur immunoblotting met poliklonale anti-FlgD-teenliggaampies, en die relatiewe afskeidingsvlakke van FlgD is bereken. Hierdie data is die gemiddelde van drie onafhanklike eksperimente. Die vertikale stawe dui SD's aan. (B en C) Effek van die skrap van fliJ op flagellêre proteïenuitvoer deur ∆HI B*-selle. Die ∆HI B*(+ FliJ) en ∆HIJ B* (− FliJ) selle is by 30 °C in T-bouillon gekweek teen eksterne pH-waardes van 7.0, 7.5, 8.0 of 8.5. Die heelsel- en kultuur-supernatant-fraksies is ontleed deur immunoblotting met poliklonale anti-FlgD-teenliggaampies, en die relatiewe afskeidingsvlakke van FlgD is bereken. Hierdie data is die gemiddelde van drie onafhanklike eksperimente. Die rooi lyn is geneem uit Fig. 1A.

Effek van 'n wins-van-funksie mutasie in FlhA op Δψ-afhanklike vlaggelêre proteïen-uitvoer deur die ΔHI B*-mutant.

FliJ bind aan FlhAC om H +-gekoppelde proteïenuitvoer deur die transmembraan-uitvoerhekkompleks te fasiliteer (13, 25). 'n Wins-van-funksie mutasie, flhA(T490M), geleë in FlhAC (Fig. 4A), oorkom die FliJ-defek in 'n aansienlike mate (18, 26). Daarom het ons ondersoek of hierdie wins-van-funksie mutasie die Δψ afhanklikheid van flagellêre proteïenuitvoer deur die ΔHI B* mutant beïnvloed. Om dit te doen, het ons die ΔHI B*-selle gebruik wat die flhA(T490M) mutasie (ΔHI B* A*). Hierdie mutant het 'n beduidende hoeveelheid FlgD in die kultuursupernatant afgeskei selfs by 'n eksterne pH van 7.0 (Fig. 4)B en SI Aanhangsel, Fig. S4A). Die hoeveelheid FlgD wat afgeskei is, het byna konstant gebly in die ΔHI B* A* mutant (Fig. 4)B). Soos verwag, die fliJ delesie het nie die afskeidingsvlakke van FlgD deur die ΔHI B* A* mutant betekenisvol beïnvloed nie (Fig. 4B en SI Aanhangsel, Fig. S4B). Hierdie resultate dui daarop dat die flhA(T490M) mutasie laat FlhA toe om 'n konformasie aan te neem wat die FliJ-gebonde toestand van FlhA naboots, waardeur die Δψ-afhanklikheid van flagellêre proteïenuitvoer deur die uitvoerhekkompleks uitgeskakel word.

Die effek van 'n wins-van-funksie mutasie in FlhA op Δψ-afhanklike flagellêre proteïen uitvoer. (A) Die struktuur van FlhA. FlhA is saamgestel uit 'n N-terminale transmembraangebied (FlhATM) en 'n groot C-terminale sitoplasmiese domein (FlhAC). FlhAC vorm 'n dokplatform vir FliH, FliI, FliJ, uitvoerchaperones en uitvoersubstrate. FlhAC (PDB ID 3A5I) bestaan ​​uit vier domeine, D1, D2, D3 en D4, en 'n buigsame skakelaar (FlhA)L). Die Cα-ruggraat is kleurgekodeer van blou na rooi, en gaan deur die reënboogkleure vanaf die N-terminus tot by die C-terminus. Die goed bewaarde Asp-456, Phe-459 en Thr-490 residue van FlhA is verantwoordelik vir die interaksie van FlhAC met flagellêre uitvoerchaperone in kompleks met hul verwante substrate. Die hoogs bewaarde Arg-94, Lys-203, Asp-208 en Asp-249 residue is krities vir H + -gekoppelde flagellêre proteïenuitvoer. 'n Hoogs bewaarde FHIPEP-lus tussen transmembraanhelikse 4 en 5 van FlhATM bind aan FlhAC om die vloed van H + na flagellêre proteïenuitvoer te koördineer. (B) Die effek van die flhA(T490M) mutasie (A*) op Δψ-afhanklike flagellêre proteïenuitvoer. Die ∆HI B* A* (+ FliJ) en ∆HIJ B* A* (− FliJ) selle is by 30 °C in T-bouillon gekweek teen eksterne pH-waardes van 7.0, 7.5, 8.0 of 8.5. Die heelsel- en kultuur-supernatant-fraksies is ontleed deur immunoblotting met poliklonale anti-FlgD-teenliggaampies, en die relatiewe afskeidingsvlakke van FlgD is bereken. Hierdie data is die gemiddelde van drie onafhanklike eksperimente. (C) Model van die FlhAC ring. Die bindingsplekke vir flagellêre uitvoerchaperone in kompleks met hul verwante uitvoersubstrate word in magenta getoon. FliJ bind aan 'n spleet tussen D4-domeine van naburige FlhAC subeenhede.

Effek van flhA(T490M) op die H + en Na + Kanaalaktiwiteite van FlhA.

Ons het gevind dat die ΔHI B* A* mutant 'n beduidende hoeveelheid FlgD in die kultuurmedia afgeskei het by 'n eksterne pH van 7.0 (Fig. 4)B en SI Aanhangsel, Fig. S4A), wat die moontlikheid verhoog dat die flhA(T490M) mutasie kan die H + en Na + kanaalaktiwiteite van FlhA beïnvloed. Omdat daar gerapporteer is dat vrylik verspreidende FlhA-molekules in die selmembraan beide H + en Na + gelei (17), het ons wild-tipe FlhA en FlhA(T490M) ooruitgedruk in Escherichia coli BL21 (DE3) selle en gemeet intrasellulêre pH en intrasellulêre Na + konsentrasie met behulp van 'n verhoudingsmetriese pH-aanwysersonde, pHluorien(M153R) (27, 28), en 'n fluoresserende Na + aanwyserkleurstof, CoroNa Groen (17), onderskeidelik. Die intrasellulêre pH van die FlhA-ooruitdrukkingselle was 7.10 ± 0.06 (gemiddeld ± SD), wat ~0.06 pH-eenhede laer was as die interne pH van die vektorkontrole (7.16 ± 0.06) (SI Aanhangsel, Fig. S5A en Tabel S3). Hierdie klein pH-daling was 'n statisties beduidende waarde (P = 0.037), wat aandui dat vrye FlhA H + kanaalaktiwiteit het. Die intrasellulêre pH van die selle wat FlhA uitdruk met die flhA(T490M) mutasie was in wese dieselfde as dié van die selle wat wildtipe FlhA uitdruk (SI Aanhangsel, Fig. S5A), wat aandui dat dit flhA mutasie verhoog nie die H + kanaal aktiwiteit van FlhA nie.

Ooruitdrukking van wild-tipe FlhA het 'n beduidende toename in die intrasellulêre Na + konsentrasie veroorsaak in die teenwoordigheid van 100 mM NaCl, maar nie in die afwesigheid daarvan nie (SI Aanhangsel, Fig. S5B en Tabel S3), in ooreenstemming met 'n vorige verslag (17). Die intrasellulêre Na + konsentrasie van die FlhA-ooruitdrukkingselle het toegeneem vanaf 4.5 ± 2.1 mM (gemiddeld ± SE n = 30) tot 73,1 ± 10,8 mM (n = 30) (SI Aanhangsel, Fig. S5B en Tabel S3). Die intrasellulêre Na + konsentrasie van selle wat FlhA met die flhA(T490M) mutasie het 75.6 ± 13.7 mM bereik (n = 30) (SI Aanhangsel, Fig. S5B en Tabel S3), wat weereens aandui dat hierdie residuverandering nie die intrinsieke Na +-kanaalaktiwiteit van FlhA verhoog nie. Konsekwent het die ΔHI B* A* mutant steeds 'n duidelike Na + afhanklikheid getoon vir flagellêre proteïenuitvoer by 'n eksterne pH van 7.5 soos die ΔHI B* mutant (SI Aanhangsel, Fig. S6). Daarom stel ons voor dat Δψ bo die drempelwaarde op FlhA kan inwerkC om sy interaksie met FliJ te stabiliseer om die FlhA-ioonkanaal doeltreffend oop te maak om protone te gelei om flagellêre proteïenuitvoer op 'n Δψ-afhanklike wyse aan te dryf.

Effek van die SMF op Flagellar Proteïen Uitvoer deur die ΔHI B* Mutant.

Flagelêre proteïenuitvoer deur die ΔHI B*-mutant toon 'n duidelike afhanklikheid van die eksterne Na +-konsentrasie oor 'n eksterne pH-reeks van 6.0-8.0 (17, 18). Konsekwent het die afskeidingsvlak van FlgD aansienlik toegeneem wanneer 100 mM NaCl teenwoordig was in die medium (SI Aanhangsel, Fig. S6). Nóg Δψ nóg totale PMF het verander met byvoeging van 100 mM NaCl (SI Aanhangsel, Tabel S4). Om die impak van die SMF op die hele flagellêre proteïen-uitvoerproses te ontleed, het ons die aantal en lengte van die flagellêre filamente wat deur die ΔHI B*-selle geproduseer word in die teenwoordigheid van 100 mM NaCl ontleed (Fig. 2 en SI Aanhangsel, Tabel S2). Die totale SMF oor die selmembraan was ongeveer 45 mV groter by 'n eksterne pH van 8.5 as dié by 'n eksterne pH van 7.5 (SI Aanhangsel, Fig. S7 en Tabel S4). Ongeveer 73,5% van die Δ HI B*-selle het flagellêre filamente geproduseer, met 'n gemiddeld van 1,4 ± 0,6 filamente per sel (gemiddeld ± SD n = 125) by eksterne pH 7.5 (Fig. 2B). Die gemiddelde filamentlengte was 7.6 ± 2.5 μm (n = 50) (Fig. 2C). Ongeveer 96.3% van die Δ HI B*-selle het filamente geproduseer by 'n eksterne pH van 8.5, met 'n gemiddeld van 1.8 ± 0.8 per sel (n = 180) (Fig. 2B). Die gemiddelde filamentlengte het ook aansienlik toegeneem (9.0 ± 2.6 μm [n = 50]) by pH 8.5 (Fig. 2C). Dus, 'n verhoogde Δψ fasiliteer ook Na + -gekoppelde proteïenuitvoer. By pH 8.5 was die gemiddelde filamentlengte aansienlik langer in die teenwoordigheid van 100 mM NaCl as in die afwesigheid daarvan (Fig. 2)C). Omdat die SMF groter was as die PMF onder ons eksperimentele toestande (SI Aanhangsel, Tabel S4), stel ons voor dat die verhoogde Δψ op die FlhA-ioonkanaal inwerk om die inwaarts-gerigte vloei van beide H + en Na + te vergemaklik wanneer hulle gekoppel word aan uitwaarts-gerigte proteïentranslokasie.


Molekulêre basis van funksie

Klassieke werk deur Hodgkin en Huxley [1] het die drie sleutelkenmerke van natriumkanale omskryf: spanningsafhanklike aktivering, vinnige inaktivering en selektiewe ioongeleiding. Om op hierdie grondslag te bou, het meer onlangse struktuurfunksiestudies wat molekulêre, biochemiese en elektrofisiologiese tegnieke gebruik het, ons 'n goeie begrip gegee van die molekulêre basis van natriumkanaalfunksie. Kritiek hiervoor was die neurotoksiene tetrodotoksien en saxitoksien, waarvan die porieblokkerende eienskappe ontgin is om die natriumkanaalproteïene te suiwer en om die aminosuurreste wat betrokke is in die buitenste porie en in die selektiwiteitsfilter te openbaar. Die buitenste porie word gevorm deur die herintredende lusse tussen transmembraansegmente S5 en S6 van elke domein. Twee belangrike aminosure in analoog posisies in al vier domeine word vermoedelik die negatief gelaaide buitenste en binneste ringe vorm wat dien as 'n reseptorplek vir porieblokkeerders en die selektiwiteitsfilter (Figuur 1a). Mutasies van hierdie residue het beduidende effekte op die binding van tetrodotoksien en saxitoksien [20], en het ook merkbare effekte op die selektiwiteit van deurdringing van organiese en anorganiese monovalente katione deur die natriumkanaal [21, 22]. Die mees oortuigende bewyse kom uit 'n studie deur Heinemann et al. [23], wat 'n kalsium-selektiewe natriumkanaal geproduseer het deur die binneringreste (DEKA in die enkelletter-aminosuurkode) te muteer na hul eweknieë in kalsiumkanale (EEEE).

Soos die geval is vir ander spanningsgehekte ioonkanale, is die spanningsafhanklikheid van aktivering van natriumkanale afgelei van die uitwaartse beweging van gelaaide residue as gevolg van 'n veranderde elektriese veld oor die membraan [1]. Die S4-segmente van elke homoloë domein dien as die spanningsensors vir aktivering. Hulle is saamgestel uit herhaalde motiewe van een positief gelaaide oorblyfsel gevolg deur twee hidrofobiese residue, wat moontlik 'n heliese rangskikking van positiewe ladings deur die membraan skep. By depolarisasie begin die uitwaartse beweging van die S4-helikse en hul gelyktydige rotasie 'n konformasieverandering wat die natriumkanaalporie oopmaak. Hierdie 'glyheliks' [24] of 'heliese skroef' [25] model word deur sterk bewyse [3] ondersteun. Byvoorbeeld, neutralisering van die sleutel positief gelaaide oorblyfsels in S4 verminder die spanningsafhanklikheid van hek [26] merkbaar. Die uitwaartse poortbeweging van die S4-segmente is ook direk opgespoor deur die feit dat, wanneer sommige oorblyfsels in hierdie helikse met sisteïene vervang word, ekstrasellulêre sulfhidrielreagense slegs met hulle reageer na kanaalaktivering [27-29].

Inaktivering van die natriumkanaal is 'n kritieke proses wat binne millisekondes van kanaalopening plaasvind. In die algemeen aanvaarde model van hierdie proses, dien die hoogs bewaarde intrasellulêre lus wat domeine III en IV verbind as 'n inaktiveringshek, baie soos 'n skarnierdeksel, wat aan die intrasellulêre porie van die kanaal bind om dit te inaktiveer (Figuur 2a). Intrasellulêre perfusie van proteases [30] of intrasellulêre toediening van teenliggaampies wat hierdie lus herken, maar nie teenliggaampies teen ander intrasellulêre strukture nie [31], verhoed vinnige inaktivering. Die 'grendel' van die inaktiveringshek word gevorm deur drie sleutel hidrofobiese residue (IFM Figuur 2), en peptiede wat hierdie motief bevat, kan inaktivering herstel na natriumkanale wat 'n gemuteerde inaktiveringshek het [32]. Mutasies van die sleutelfenielalanienresidu (Phe1489) na verskeie hidrofiele residue benadeel inaktivering in verskillende mate. Verder, as dit vervang word met 'n sisteïenresidu, word kovalente modifikasie van die sisteïen voorkom wanneer die inaktiveringshek gesluit is [33]. Strukturele bepaling en KMR-analise van die kerngedeelte van die inaktiveringshek openbaar 'n rigiede α-helikale struktuur omring deur die IFM-motief [4] (Figuur 2b). In hierdie struktuur wys die syketting van Phe1489 weg van die kern van die peptied op dieselfde gesig as 'n nabygeleë threonien (Thr1491), nog 'n kritieke oorblyfsel vir inaktivering [33]. In teenstelling met die kort IFM-motief wat die inaktiveringshek vorm, kan die reseptor vir die inaktiveringshek op die liggaam van die kanaal uit veelvuldige hidrofobiese residue naby die intrasellulêre mond van die porie saamgestel word. Skandering mutagenese eksperimente impliseer hidrofobiese residue in intrasellulêre lusse S4-S5 van domeine III en IV, sowel as die intrasellulêre einde van die S6 transmembraan segmente van hierdie domeine, as komponente van die inaktivering hek reseptor [3].

Die opwindende ontdekking van 'n bakteriële natriumkanaal (NaChBac Figuur 1c), bestaande uit 'n enkele domein van ses transmembraan α-helikale segmente [10], bied potensieel nuwe hulpmiddels vir die studie van die natriumkanaal struktuur-funksie verhoudings. Die NaChBac-kanaal vorm blykbaar 'n homotetramer wat 'n funksionele spanning-gehekte natriumkanaal is. Dit het 'n 100 keer stadiger tempo van inaktivering as die Nav kanale (omdat dit geen ekwivalent van die inaktiveringshek het nie). Verder blyk sy natriumselektiwiteitsfilter simmetries te wees, gevorm deur vier glutamaatresidue in sleutelposisies in al vier porielusse, wat soos dié van die Ca 2+ kanaal lyk. Hierdie bakteriële natriumkanaal sal 'n eenvoudiger raamwerk as die soogdierkanale vir mutagenese-eksperimente verskaf om hipoteses te toets aangaande die struktuur en funksie van spanningsbeheerde natriumkanale. Daarbenewens kan die klein grootte van die kanaal dit makliker maak om kristalstruktuur-inligting te bekom, soos die geval was vir die porie-gebied van die bakteriese kaliumkanaal (KcsA) [5].


Deel V: Die vertraagde gelykrigter

Skakel die geel plot af (kies "-") in die opwipkieslys en stel die groen plot na "I_K", die vertraagde gelykrigterstroom.

Roep die Stimulus-venster op en stel Stim1 op 'n 100 nA-stimulus wat 5 msek. Druk die Stimuleer 1 knoppie in die hoofsimulatorvenster om die sel te depolariseer, en kyk wat gebeur.

    Vraag 1. Gebaseer op die Vm plot (rooi lyn), wat is die piekwaarde wat deur die membraanspanning bereik word? Klik op die lyn regs van die piek, en gebruik die < knoppie om die maksimum te vind.


Uitgebreide data Fig. 1 Strukturele en funksionele diversiteit van tetrameriese ioonkanale.

a, Twee hoofklasse kanale, domein-omgeruil en nie-domein-omgeruil word onderskei deur die relatiewe posisies van spanningswaarneming en poriedomeine. b, Opgeloste strukture van nie-domein-omgeruilde ioonkanale, twee subeenhede getoon vir duidelikheid c, G(V) verhoudings van elke kanaal subklas d, Gradiëntuitbeelding van sikliese-nukleotied- en spanningsensitiwiteit vir subklaslede. Figuur geïnspireer deur ref. 75 .

Uitgebreide data Fig. 2 KAT1em biochemie en cryo-EM werkvloei.

a, SEC van KAT1em gesuiwer in digitonien, loop op 'n Superose 6 kolom. b, Vlekvrye SDS–BLADSY van gesuiwerde KAT1em. SEC en SDS–PAGE resultate stem ooreen met die voorbereiding wat vir beelding gebruik word (d) en is verteenwoordigend van drie onafhanklike suiwerings. c, SEC van KAT1em in 2N2-nanoskyfies (geel spoor), wat vermoedelike oktameer, tetrameer en leë nanodiese toon. Fluoresensie-opsporing SEC van vollengte KAT1-GFP (blou spoor) wat vermoedelike oktameer en tetrameer toon. Hierdie twee monsters is nie aan enige cryo-EM-eksperimente onderwerp nie, en word slegs ingesluit vir die doel van vergelyking. d, KAT1em cryo-EM werkvloei. From 1,500 movies, 120,000 particles were picked and subjected to 2D classification, which then yielded 110,000 particles, which were classified in 3D without imposing symmetry (4 coloured classes). Particles from the best two classes (blue and green classes, 91,000 total) were subsequently refined, imposing C4 symmetry, and using successive masks to focus on one of the tetramers and finally on the transmembrane region of one of the tetramers. Additional details are given in Methods.

Extended Data Fig. 3 Cryo-EM map and model validation.

a, ResMap colouring of unfiltered half map of full molecule b, Same ResMap colouring as a on sharpened full molecule map. c, d, Ninety-degrees-rotated angular-distribution plots for refined full molecule. e, FSC plot for map focused on the transmembrane region. FSC 0.143 criterion is used for resolution determination 41 . f, FSC (map and model) plot from phenix.mtriage 76 , indicating correspondence of tetramer atomic model to transmembrane domain-focused-refined density map. g, Details of sharpened cryo-EM density map are shown with fitted atomic model.

Extended Data Fig. 4 KAT1em pore domain and pseudo cyclic nucleotide-binding domain.

a, Side view of pore, with only two subunits shown for clarity. Permeation pathway is shown in blue, with inner gate radius calculated by MOLE 74 (1.4 Å) or HOLE 77 (1 Å), inner gate-forming I292 side chains shown as sticks. b, G(V) relations of pore alanine scan. Shaded error regions represent s.d., surrounding the symbols which represent the mean. Wild type (n = 11), L287A (n = 19), T288A (n = 4), L291A (n = 10), I292A (n = 10), T296A (n = 10), V299A (n = 8) and H301A (n = 10) are shown n is the number of biologically independent cells. c, Overlay of KAT1em pseudo-CNBD (tan) and holoHCN1 CNBD (green, PDB ID: 5U6P). The ligand, HCN1-cAMP is shown as sticks in the cAMP-binding pocket. d, Overlay of KAT1em (tan) and EAG1 (blue, PDB ID: 5K7L). KAT1 lacks the ‘intrinsic ligand’ loop of EAG1. e, Top-down view of KAT1em (tan), holo HCN1 (green) and EAG1 (blue) overlay. Structures were aligned and superimposed on the basis of the transmembrane helices. Only C-linker hairpins are shown for clarity to compare relative rotation of the C-linker to the transmembrane domain for each structure. The relative rotation of the KAT1 C-linker matches that of EAG1 and not HCN1. f, g, Surface electrostatic potential of HCN1 (f) and KAT1 (g), onderskeidelik. Ligand-binding pockets are circled in black. KAT1 lacks a deep electropositive (blue) pocket as seen in HCN1.

Extended Data Fig. 5 The voltage-sensing domain of KAT1em in the up conformation.

a, Diagram of key VSD features, showing hydrophobic gasket (F102 and V70, yellow) as well as all S4 charges (blue) and distributed countercharges (or counter dipoles) (red). Dashed lines indicate likely interactions in the up conformation. b, c, Overlays of KAT1em (tan) with HCN (green, PDB ID: 5U6O) and Kv1.2/2.1 (pink, PDB ID: 2R9R), respectively, highlighting structural differences between S4 helices. Cα atoms of the positively charged residues of S4 are shown as spheres.

Extended Data Fig. 6 Structural and functional characterization of KAT1 VSD–pore interfaces.

a, G(V) relations of S4–S5–C-linker interfacial mutants. Wild type (n = 11) and K187A (n = 8), D188A (n = 9), R190A (n = 6), F191A (n = 12), N192A (9), T303A (n = 13), R307A (n = 14), R314A (n = 31) and R314E (n = 9) mutants are shown n is the number of biologically independent cells. Shaded regions represent s.d. and symbols represent the mean. b, G(V) relations of upper-interface mutants. Wild type (n = 11) and F81A (n = 12), F81L (n = 19), I166A (n = 18), M169A (n = 5), V178A (n = 19) and F215A (n = 19) mutants are shown n is the number of biologically independent cells. Shaded regions represent s.d. and symbols represent the mean. c, Deactivation energies of upper-interface mutants calculated from G(V) relations in b (same sample sizes). d, Mapping of upper-interface functional data (shown in c). Displayed as sticks are key residues on S1: F80, F81, F83, key S4 residues: I166, M169, L172, V178, and key S5 residues: Y193, R197, K200, F207, C211, F215. e, f, Comparison of similar lipid-binding conformations observed in the structure (e) and after about 3.5 μs molecular dynamics simulation (f). g, Cryo-EM density map, with one bound lipid coloured green, contoured at the same contour level as the full map. h, SDS–PAGE and GFP in-gel imaging of Xenopus oocyte membrane fractions, extracted in gentle detergent (Methods). The experiment was performed once and each lane is derived from ten cells. ek, Confocal imaging of Xenopus oocyte animal poles expressing various GFP-tagged constructs. Imaging was performed in a single session with normalized exposure times, and each image is representative of five independent oocytes.

Extended Data Fig. 7 Detailed functional characterization of selected VSD–pore interface mutants.

a, G(V) relations for cRNA mixing-coinjection experiments. cRNA encoding loss-of-function mutants (I189A, R197K, K200Q, T306A and R310K), for which no currents were observed were selected. These loss-of-function mutant cRNAs were each individually mixed with cRNA encoding a gain-of-function double mutant (Q80A–177K). Data are mean ± s.e.m. Q80A–R177K (n = 12), I189A + Q80A–R177K (n = 7), K200Q + Q80A–R177K (n = 8), R197K + Q80A–R177K (n = 9), R310K + Q80A–R177K (n = 8) and T306A + Q80A–R177K (n = 9) are shown. b, Plot of activation midpoints (Vh) van G(V) relations shown in a. c, d, Limiting-slope analyses for wild-type KAT1 (c) and D188A (d). Top, raw currents evoked by voltage ramp protocol. Middle, conductance–voltage relations, with conductance plotted on a log scale. Data points are black, fits are red. Blue vertical lines mark the first and second inflection points of the curve, the region between which was used to calculate limiting-slope (Z) values (Methods). Wild type, Z = 2.83 ± 0.5 D188A, Z = 3.28 ± 0.2. data are mean ± s.d. Bottom, data (black) and fits (red) on a linear scale. n is the number of biologically independent cells.

Extended Data Fig. 8 VSD movement during gating.

a, Schematic of double-mutant cycle analysis. The difference between ΔΔGx,y and the quantity (ΔΔGx + ΔΔGy) determines the extent of differential interaction between residues x en y in the up and down states. b, G(V) relations for single and double mutants, illustrating residue–residue pairs displaying additivity (gray) and non-additivity in different directions (green, up-state interaction red, down-state interaction). Shaded regions represent s.d. and symbols represent the mean. Wild type (n = 11) and M64A (n = 11), V67A (n = 33), C77A (n = 15), Q80A (n = 11), D95A (n = 12), Q149A (n = 21), R165A (n = 21), S168A (n = 17), V178A (n = 19), M64A/V178A (n = 15), V67A/Q80A (n = 13), V67A/S168A (n = 16), V67A/V178A (n = 10), C77A/S168A (n = 14), Q80A/R165A (n = 6), D95A/R165A (n = 5) and Q149A/R165A (n = 14) mutants are shown n is the number of biologically independent cells. c, Displacement of charge for the isolated VSD in the up, one-click down and two-click down conformations at different transmembrane potentials. Data are mean ± s.d. calculated using the last 40-ns snapshots (n = 4,000) of 50-ns trajectories. Each system was simulated once at each chosen potential. The gating charge was then calculated as the offset constant between the linear fits, resulting in a gating charge of 1.02 e and 0.55 e between the up and one-click down, and one-click down and two-click down states, respectively. d, Mapping of double-mutant cycle constraints onto up VSD structure. Thick red and green lines connect Cα carbons of interacting pairs. Thin grey lines connect negative-control pairs. e, Mapping of literature KAT1 down-state interacting pairs 21 onto up structure. Thick red lines connect Cα carbons of interacting pairs.

Extended Data Fig. 9 A cysteine–Cd 2+ –cysteine bridge in the KAT1 VSD promotes channel opening.

a, Raw current traces for all four combinations of C77(S) and R165(C). On washing with 100 μM CdCl2, current increases only in the C77/R165C condition (red box, middle), and then decreases again upon EDTA wash. Representative data are shown from the same oocyte, and each experiment was repeated five independent times (five biologically independent oocytes) with similar results. b, Pulse protocol used during experiment. c, Mapping of C77 (on S1) and R165 (on S4) onto the up VSD structure of KAT1. Cα atoms are indicated by a red line.


How to measure Na/K channel activation at the membrane level? - Biologie

Ion Channels: Structure and Function

Ion channels are membrane protein complexes and their function is to facilitate the diffusion of ions across biological membranes. Membranes, or phospholipid bilayers, build a hydrophobic, low dielectric barrier to hydrophilic and charged molecules. Hulle is electrical insulators. Ion channels provide a high conducting, hydrophilic pathway across the hydrophobic interior of the membrane. The channel, or pore structure, is said to catalyze the 'reaction' of transporting charged molecules across a low dielectric medium. The 'catalytic site', the central channel, is either oopmaak of gesluit. The open channel conformation can be compared to the transition state of the enzyme-substrate complex, where ions are tightly associated to the catalytic site. The conformational change between closed and open state is called gating, as in opening and closing a gate. Channel gating is controlled by external factors like enzymes are controlled by modulators and effectors. Ion channels can be classified according to which chemical or physical modulator controls their gating activity. Thus we have different groups of channels as summarized below:

- ligand gated channels neurotransmitters

- voltage gated channels transmembrane potential (electric field)

- second messenger gated channels nucleotides, G-proteins

- mechanosensitive channels osmotic pressure, membrane curvature

- gap junctions, porins not gated


Channels are also ion selective. They can discriminate between size and charge of the permeant molecule. All ion channels are complexes of transmembrane proteins, sometimes they contain cytoplasmic subunits, often they are glycosylated. The 3-D structure of most ion channels, is not known, with two notable exceptions, porins and a K-channel, both of bacterial origin. There exists, however, a multitude of biochemical and functional data, combined with mutagenesis experiments that give information about the transmembrane topology of these proteins, dividing it into transmembrane segments and extramembraneous loops/domains. Often size and location of loops on one side or the other of the membrane can be determined by chemically modifying the protein and analyzing which amino acids have been modified.

The first structure (in 1990) of an ion channel solved at atomic resolution <0.3nm is that of the bacterial porins, a family of homo-trimeric channel proteins. Each subunit contains 16 to 18 transmembrane, anti-parallel b -strands forming a b -barrel structure. The b -strands are amphipathic, they contain alternating polar and non-polar residues and the inter-strand interaction is fully saturated with H-bonding. This creates a hydrophilic pore interior providing a water filled channel. The channel has a large diameter of 0.8x1.1nm, and is non-selective for small ions. However, it has an upper exclusion size limit corresponding to molecular weights of about 600 Dalton of permeants. Because most metabolites have molecular weights lower than 600 Da and have been shown to pass through porin channels, porins are called general diffusion pores.

Fig. Ribbon diagram of porin barrel and projection of outer face of this barrel

Fig. Projection map of porin barrel

from Weiss and Schulz, 1992

3. Nicotinic Acetylcholine Receptor - nAChR

The structure of another ion channel, the nicotinic acetylcholine receptor, has been determined to 0.9nm resolution by cryo-electron microscopy. The nAChR is a heteromeric glycoprotein complex composed of five integral membrane proteins in a stoichiometry of a2bgd .

The five subunits are arranged in a circular fashion around a central hole that provides an ion pathway across the post-synaptic cell membrane. The pentameric complex has a five fold pseudo-symmetry because its subunits are not identical. The receptor complex binds two molecules of acetylcholine. Acetylcholine binding induces the opening of the channel. Coupling between the two ACh binding sites and the channel gate is an allosteric mechanism because the binding of a ligand causes a structural change on a distant place in the receptor unit.

Fig. Pentameric arrangement of nAChR subunits

Die transmembrane topology of the AChR has been inferred from hydrophobicity analysis en secondary structure prediction of the primary sequence. So called hydropathy plots indicate the grouping of hydrophobic stretches in the sequence that are identified as spanning the membrane, usually in the form of a -helices. Four transmembrane segments have been proposed for the nAChR subunits, and the orientation of the receptor within the post-synaptic membrane has been modeled has having a large N-terminal domain outside the cell facing the synaptic cleft. This is also the location of the agonist binding site in the alpha subunits discussed above.

Fig. Two hydrophobicity scales of amino acids

The figure compares two hydrophobicity scales showing the sometimes different results obtained by different groups. Upper scale by Kyte and Doolittle, 1982, A simple method for displaying the hydropathic character of a protein, J.Mol.Biol. 157:105-132. The lower scale by Rose et. al., 1985, Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins, Science 229:834. Fig. Hydropathy plot for acetylcholine receptor subunit

Afkortings: LSS-leader signal sequence ED-extracellular domain CL-cytoplasmic domain M1-M4-transmembrane spanning segments positive hydropathy means non-polar, negative values polar domains Early experiments on identifying the amino acids involved in ion flux through the nAChR channel indicated that residues in transmembrane segment 2, or M2, form the channel lining structure of the receptor. Each of the five subunits contributes its M2 segment to the channel thus forming a five fold symmetry. Rings of identical (or similar, because M2 sequences of different subunits are not totally conserved) amino acids thought to be part of the channel thereby determining its selectivity eiendomme. The M2 segment is likely to line the pore also because it is the only transmembrane segment that could form an amfipaties a -helix. The hydrophilic residues are aligned on the side of the helical cylinder that faces the channel interior.

Electron microscopy providing a high resolution of 0.9nm shows the presence of such an a -helix surrounding the central pore. It also shows that the helix is found in a linear form when the channel is open, but exhibits a kink in the middle of the membrane when the channel is closed. A leusien residue in each subunit is located at this kink. The large part of the membrane buried structure, however, does not seem to exhibit any a -helices. It has tentatively been proposed (but not shown) to form a b -barrel structure giving the nAChR pentamer a similar membrane anchoring structure as found in porin trimers. Fig. Channel cross section (electron density map) with positions of the pore lining transmembrane segment M2 (left solid bars) and helical plot of the amino acid sequence of transmembrane segment M2.

4. The acetylcholine binding site

Acetylcholine is a neurotransmitter and the natural agonist of the acetylcholine receptor.

Fig. Chemical structure of acetylcholine

Besides ACh there are many other agonists that are important pharmacological agents or drugs that affect the activity of the receptor. The most important one is nikotien, which also gave this receptor type its specific name, nicotinic acetylcholine receptor. Agoniste are positive modulators of the receptor activity. Antagoniste are molecules that have the opposite effect of agonists, they inhibit receptor activity. The most commonly known inhibitors are the curare alkaloids en a -bungarotoxin, a small protein that irreversibly binds to the agonist binding pocket thus inactivating the receptor by blocking access for the agonist.

There are two ACh binding pockets in the receptor complex located in the clefts (subunit interface) between the a subunits and the g and b subunits respectively. Two molecules of ACh must bind to activate the receptor, i.e., to open the channel for ions to flow across the membrane. Labeling experiments, where small detector molecules can be covalently linked to amino acid side chains, showed that 5 residues in the N-terminal part (extracellular) of the a subunits are involved in agonist binding. These are residues Tyr93, Trp149, Tyr190, Cys192, and Cys193. The location of the amino acids in the polypeptide indicates that loops from different sites in the sequence are forming the binding pocket, similar to the catalytic triade of serine proteases and the heme binding pocket in globins.

The mechanism to open the channel is a long range effect of a conformational change that starts out as a small local conformational change as described for the oxygen binding to the heme group in globins. The distance between two heme binding sites in hemoglobin is about 2.5nm and the distance between the acetylcholine binding sites and the channel gate (distance between ACh binding site and membrane), the structure in the complex that opens and closes the ion pathway across the membrane, is about 2.5nm as well. This allosteric mechanism can be summarized in the following reaction scheme:

CLOSED R + A <=> RA + A <=> RA2 <=> R*A2 OPEN

The scheme shows that the combined effect of two bound agonists brings the receptor into its transition, or open state (R*), where the receptor exhibits an equilibrium between the closed and open channel. This equilibrium is measured as open probability of the channel P(open).

In addition to the kinetic scheme of ligand binding and channel opening, the receptor can switch into a desensitized state, i.e., a conformation where the channel is closed in the presence of two bound acetylcholine molecules. The channel is unable to reopen until the ligands first dissociate from their binding site. It could be shown that the affinity of the ligand to the receptor in the desensitized state, D, is much higher than in the normal, open or closed state R therbey preventing the postsynaptic membrane from overstimulation.

The crystal structure of a non-voltage gated, two-transmembrane spanning K-channel from the bacteria Streptomyces lividans (KcsA K + channel) has been solved to 3.2 angstrom resolution (amino acids 126-158 at the carboxy terminal end have been cleaved off). Like several other membrane proteins (see projection map for porin barrel), it has two rings of aromatic amino acids positioned to extend into the lipid bilayer, presumably near the membrane-water interfaces. A subunit is inserted into the tetramer such that one transmembrane helix (inner helix) partially facing the central pore (45Å long) while the other (outer helix) faces the lipid membrane. The inner helices are tilted with respect to the membrane normal by about 25° and are slightly kinked with the wider part facing the outside of the cell allowing the structure to form the pore region near the extracellular surface of the membrane. This region contains the K + channel signature sequence, which forms the selectivity filter. Within the selectivity filter the side chain orientation preclude their participation in ion coordination, leaving this function to the oxygen atoms of the main chain carbonyls. They are forming an oxygen ring coordinating a dehydrated K + ion. The K + ion thus has only a very small distance to diffuse from one site to the next within the selectivity filter. Fig. Three different views of the K-channel structure from Streptomyces lividans (KcsA K + channel)

electrostatic surface pore volume selectivity filter & ion binding sites
(from Doyle, 1998)

The crystal structure includes permeating ions (Rb + or Cs + ) and shows three binding sites. One of three cations is stabilized in the middle of the membrane within an aqueous cavity (10 Å diameter) at the negatively charged carboxyl end (helix dipole) of four central a -helices, one from each subunit. Because of the size of the cavity, this central ion is proposed to be hydrated. Furthermore, the structure shows that, with the exception of the selectivity filter (12Å long), the pore lining is mainly hydrophobic (cytoplasmic side of channel lumen, corresponds to lower half of pore in above figure), a general property of K-channels. This might explain why most K-channels have a very high flux rate, or ion conductance.

Potassium channels form a family of K + selective, voltage-gated channels in excitable membranes such as neuronal and muscle cell membranes. So far over 50 different genes have been cloned and sequenced from mammals, plants, and microorganisms. Most potassium channels form homo- or hetero-tetrameric protein complexes with each subunit having 6 transmembrane segments (S1 - S6) and a pore loop structure connecting the fifth and sixth segments. Transmembrane segment S4 contains a series of positively charges amino acids which have been shown to be essential for voltage-sensing. Although the crystal structure of KcsA is a non-voltage-gated type, the sequence similarities of the pore loop strongly suggest that all potassium channels have the same quaternary pore architecture.

6. Measuring single channel activity

How are ion channels studied experimentally? Ion channels catalyze the diffusion of ions across membranes with electrical currents in the order of pico Amperes (10 -12 A). The recording of single channel currents shows two current levels corresponding to the closed and open state respectively. Transitions between these two states are very fast and in the order of fractions of a millisecond, and appear in the recordings as rectangular jumps from one level to the other. The amplitude of the jump corresponds to the current. The current can be normalized and expressed as resistance (or its inverse, the conductance) because it is proportional to the membrane potential as defined by Ohm's law (E = R*I). Channels have ion flux rates of up to 10 6 ions/second.

Normally, the channels stay open for only a fraction of seconds, allowing the flux of tens of thousands of ions through the pore. The activity of the channel can be quantified as open probability, the fraction of time it stays in the open conformation. The open probability of a channel can be compared to the fractional saturation of hemoglobin with molecular oxygen. Whereas in hemoglobin the fractional saturation is related to the saturation pressure of the oxygen (the ligand of the heme), the open probability is related to the concentration of the acetylcholine in the synaptic cleft.

Fig. Single channel activity and voltage dependence of a Na-channel (from Catterall, 1988)


This work is funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) Projektnummer 374031971 TRR 240 A04 and DFG Projektnummer 417451587, as well as supported by the Prix-Louis-Jeantet foundation to GN. This publication was supported by the Open Access Publication Fund of the University of Wuerzburg. Ooptoegang-befondsing geaktiveer en georganiseer deur Projekt DEAL.

Affiliasies

Department of Neurophysiology, Institute of Physiology, Biocenter, University of Wuerzburg, 97070, Wuerzburg, Germany

Yuehui Tian, Georg Nagel & Shiqiang Gao

Present address: Environmental Microbiomics Research Center, School of Environmental Science and Engineering, Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhuhai), Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510006, China


Bespreking

We have combined LLSM with optogenetic activation for measuring the morphodynamics of PA-Rac1-based ruffling processes with high spatio-temporal resolution. Processes on the dorsal side of the cell are difficult to measure by many traditional geometries of imaging. We demonstrate that optogenetic approaches to study processes, where a threshold number of molecules need to be activated over time, can be achieved using simpler optical arrangements of wide-field photoactivation, even though use of SLMs offers precision control over space and time.

The results presented here clearly demonstrate that to achieve efficient ruffling, the photoactivation needs to be continuous. This is in line with previous studies that postulate a concentration dependence of Rac1 by virtue of its bivalent interaction with the wave regulatory complex (WRC). Chen et al. [34] propose a model where maximal WRC activation is evinced by simultaneous engagement of two Rac1 molecules per WRC and may control actin dynamics by sensing the local density of Rac1 [37]. From the results demonstrated in this study, along with previously reported molecular interactions that govern branched actin formation downstream of Rac1, a multi-step process can be envisaged. Photoactivation of Rac1 triggers Arp2/3-mediated actin branching, which is mediated through the WRC [48, 49]. However, Arp2/3’s mediation and suggested role in dictating ruffle morphology would require time for further molecular rearrangements in specific patterns [18]. A study complementary to ours, where the authors use single particle tracking of Rac1 coupled with optogenetic activation of Rac1 (albeit, indirect, using Tiam1 recruitment to membrane) demonstrates that activated Rac1 immobilizes at the protrusion tip [50]. With actin polymerization generating pushing forces against the membrane that can generate negative curvature, I-Bar protein IRSp53, which is known to interact with Rac1, and WAVE is recruited, which positively reinforces the protrusion geometry [25, 51, 52]. This positive feedback loop of curvature seeded by stimulated PA-Rac1 promoting I-Bar sensing would presumably enable sustained activation of Rac1. However, the extent of this reinforcement via IRSp53 may potentially be limited by a recently described mode of action of the I-Bar protein. The mechanism entails IRSp53 forming a higher order oligomer structure to enhance favourable protrusion geometry a process which may also present a threshold. Taken together, a complex interplay between the membrane tension, polymerization forces of actin and organization of the branched actin meshwork through PA-Rac1-IRSp53-Wave-Arp2/3, positive feedback to reinforce protrusion geometry and Rac1-WRC activation kinetics is envisaged that leads to generation of lamellar protrusion (Fig. 6). This complex interaction cycle is sustained as long as PA-Rac1 is active and the local concentration of active Rac1 is constantly maintained. This organizational architecture is maintained at least for a few minutes even after switching off the photoactivation laser, which results in re-initiation of protrusion upon re-activating PA-Rac1. As has been highlighted, it is clear that polymerization events and ruffle formation is a complex, multifaceted process whereby the multitude of events imposes a time-based limitation, attributing for the lack of ruffling under a discontinuous excitation mode. Our approach will be valuable to decipher the roles of other molecular effectors of the acto-myosin protrusion machinery such as Cdc42, formins and specific myosins [53].

Summary figure of threshold-based assembly of lamellar ruffles generated by PA-Rac1


Kyk die video: GEOPLUS - Instalacija i aktivacija GEOPLUS-a (Oktober 2022).