Inligting

SARS-COV-2 replikasie spoed

SARS-COV-2 replikasie spoed


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wat is die spoed van replikasie van SC2? Enige inligting, insluitend in vitro data sal waardeer word.

Ek sal belangstel om die lengte van SC2-verduisteringperiode, latente periode en iets soos barsgrootte te weet.

Alternatiewelik sal CT-waardes van qtPCR van COVID+-vakke per dag ook nuttig wees.


Volgens Amy Rosenfeld is dit ongeveer 8 uur verduistering en 18-24 uur totdat dit "klaar is". Nie seker of dit beteken tot bars of totdat die latente tydperk verby is nie. Hierdie tye is in vitro en is sellynafhanklik. In vivo kan anders wees. Burstgrootte is ook selafhanklik. Bron: https://youtu.be/NP56XjzyPfQ?t=1301

In hierdie video https://youtu.be/4S3DXXtRZZg?t=152 word gesê dat elke sel tot 600k virale deeltjies van SC2 kan produseer, maar ek is nie seker wat presies met die getal bedoel word nie. Later in daardie video: https://youtu.be/4S3DXXtRZZg?t=187 word gesê dat die virus blykbaar nie selle doodmaak vir ongeveer 5-6 dae nie.


Replikasiesiklus van SARS-CoV-2 in 3D

Terwyl die wêreldwye koronaviruspandemie voortduur, probeer wetenskaplikes nie net om entstowwe en middels te vind om dit te bekamp nie, maar ook om voortdurend meer oor die virus self te leer. "Teen hierdie tyd kan ons verwag dat die koronavirus seisoenaal sal word," verduidelik Ralf Bartenschlager, professor in die departement van aansteeklike siektes, molekulêre virologie, aan die Heidelberg Universiteit. "Daar is dus 'n dringende behoefte om beide profilaktiese en terapeutiese strategieë teen hierdie virus te ontwikkel en te implementeer." In 'n nuwe studie het Bartenschlager, bygestaan ​​deur die Schwab-span by EMBL Heidelberg en met behulp van EMBL se elektronmikroskopie-kernfasiliteit, 'n gedetailleerde beeldontleding gedoen om te bepaal hoe die virus besmette selle herprogrammeer.

Selle wat deur SARS-CoV-2 besmet raak, sterf redelik vinnig, binne slegs 24 tot 48 uur. Dit dui daarop dat die virus die menslike sel op so 'n manier benadeel dat dit herbedraad word en in wese gedwing word om virale nageslag te produseer. Die hoofdoel van die projek was dus om die morfologiese veranderinge binne 'n sel te identifiseer wat inherent is aan hierdie herprogrammering. “Om middels te ontwikkel wat die virale replikasie en sodoende die gevolg van die infeksie onderdruk, sowel as die virus-geïnduseerde seldood, is die sleutel om ’n beter begrip te hê van die biologiese meganismes wat die virus se replikasiesiklus aandryf,” verduidelik Bartenschlager. Die span het die beeldfasiliteite by EMBL en moderne beeldtegnieke gebruik om die 3D-argitektuur van SARS-CoV-2-geïnfekteerde selle te bepaal, sowel as veranderinge van sellulêre argitektuur wat deur die virus veroorsaak word.

Die span kon 3D-rekonstruksies van heel selle en hul subsellulêre kompartemente skep. "Ons verskaf kritiese insigte oor virus-geïnduseerde strukturele veranderinge in die bestudeerde menslike selle," verduidelik Ralf Bartenschlager. Die beelde het 'n duidelike en massiewe verandering in die endomembraanstelsels van die besmette selle aan die lig gebring - 'n stelsel wat die sel in staat stel om verskillende kompartemente en plekke te definieer. Die virus veroorsaak membraanveranderinge op so 'n manier dat dit sy eie replikasie-organelle kan produseer. Dit is mini-replikasie-kompartemente waar die virale genoom geweldig versterk word. Om dit te doen, benodig die virus membraanoppervlaktes. Dit word geskep deur 'n sellulêre membraanstelsel te ontgin en 'n organel te skep, wat 'n baie duidelike voorkoms het. Die wetenskaplikes beskryf dit as 'n massiewe opeenhoping van borrels: twee membraanlae wat 'n groot ballon vorm. Binne hierdie ballonne - wat 'n baie afgeskermde kompartement vorm - word die virale genome vermenigvuldig en vrygestel om in nuwe virusdeeltjies opgeneem te word.

Hierdie opvallende verandering kan slegs 'n paar uur na infeksie in die selle gesien word. "Ons het gesien hoe en waar die virus in die sel repliseer, en hoe dit sy gasheermasjinerie kaap om na vermenigvuldiging vrygestel te word," sê Schwab. Tot dusver was min bekend oor die oorsprong en ontwikkeling van die effekte wat SARS-CoV-2 in die menslike liggaam veroorsaak. Dit sluit in 'n gebrek aan kennis oor die meganisme waardeur die infeksie lei tot die dood van besmette selle. Om hierdie inligting nou te hê, sal die ontwikkeling van terapieë bevorder wat virusreplikasie en dus die erns van die siekte verminder.

Die span het seker gemaak dat die versamelde inligting en veral die ongekende bewaarplek van 3D-strukturele inligting oor virusgeïnduseerde substrukture deur almal gebruik kan word. "Ek glo ons skep 'n presedent oor die feit dat ons alle data wat ons geproduseer het met die wetenskaplike gemeenskap deel. Dit verteenwoordig 'n indrukwekkende hulpbron vir die gemeenskap," sê Yannick Schwab. "Op hierdie manier kan ons die wêreldwye poging ondersteun om te bestudeer hoe SARS-CoV-2 in wisselwerking met sy gasheer is." Die span hoop dat hul versamelde inligting sal help met die ontwikkeling van antivirale middels.

Die span het daarin geslaag om die studie in 'n ongelooflike kort tyd te produseer, ten spyte van die uitdagende omstandighede. "Die helfte van die wêreld - en natuurlik ook Heidelberg - was in volle inperking en ons moes byna daagliks improviseer om by die situasie aan te pas. Of dit nou by EMBL of van die huis af was, almal was diep betrokke en het mildelik hul tyd gegee. en diep kennis,” sê Schwab. "Die spoed waarteen ons gewerk het, en die hoeveelheid data wat geproduseer is, is merkwaardig."


Biologie van SARS-CoV-2

Hierdie driedelige animasiereeks ondersoek die biologie van die virus SARS-CoV-2, wat 'n wêreldwye pandemie van die siekte COVID-19 veroorsaak het.

SARS-CoV-2 is deel van 'n familie virusse wat koronavirusse genoem word. Die eerste animasie, Infeksie, beskryf die struktuur van koronavirusse soos SARS-CoV-2 en hoe hulle mense besmet en binne selle repliseer. Die tweede animasie, Evolusie, beskryf hoe hierdie virusse ontwikkel en bespreek positiewe, negatiewe en neutrale mutasies. Die derde animasie, Opsporing, beskryf die metodes wat gebruik word om aktiewe en vorige SARS-CoV-2-infeksies op te spoor. Hierdie animasies is ook in 'n YouTube-snitlys beskikbaar.

Die meegaande "Student Worksheets" bevat konsepte en inligting uit die animasies. Die "Weergawe 1"-werkblad is geskik vir algemene hoërskoolbiologiestudente, en die "Weergawe 2"-werkblad is geskik vir AP/IB Biologie en voorgraadse studente.

Die skakel 'Resource Google Folder' lei na 'n Google Drive -gids met brondokumente in die Google Docs -formaat. Nie alle aflaaibare dokumente vir die hulpbron is moontlik in hierdie formaat beskikbaar nie. Die Google Drive-lêergids is gestel as "View Only" om 'n kopie van 'n dokument in hierdie vouer na jou Google Drive te stoor, maak daardie dokument oop en kies dan Lêer → "Maak 'n kopie." Hierdie dokumente kan gekopieer, gewysig en aanlyn versprei word volgens die Gebruiksvoorwaardes wat in die "Besonderhede"-afdeling hieronder gelys word, insluitend die kreditering van BioInteractive.

'n Oudiobeskrywende weergawe van die animasie is beskikbaar via ons mediaspeler deur op die "AD"-knoppie in die onderste linkerhoek van die mediaspeler te klik.

Studente-leerteikens
  • Identifiseer strukturele komponente van SARS-CoV-2.
  • Beskryf die stappe in die SARS-CoV-2-replikasiesiklus.
  • Verduidelik hoe mutasies in 'n virale genoom ontstaan.
  • Beskryf hoe 'n virus oor tyd kan verander as gevolg van mutasies.
  • Beskryf verskillende maniere om 'n virusinfeksie op te spoor.
Besonderhede

teenliggaam, antigeen, COVID-19, koronavirus, koevert, mutasie, replikasie, RT-PCR, SARS-CoV-2 (ernstige akute respiratoriese sindroom koronavirus 2), piekproteïen

Cui, Jie, Fang Li en Zheng-Li Shi. "Oorsprong en evolusie van patogeniese koronavirusse." Nature Resensies Mikrobiologie 17, 3 (2019): 181–192. https://doi.org/10.1038/s41579-018-0118-9.

Fehr, Anthony R., en Stanley Perlman. "Coronavirusse: 'n Oorsig van hul replikasie en patogenese." In Coronaviruses: Metodes en protokolle, eds. Helena J. Maier, Erica Bickerton en Paul Birtton, 1–23. Vol. 1282 van Metodes in molekulêre biologie. New York: Humana Press, 2015. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2438-7_1.

Khailany, Rozhgar A., ​​Muhamad Safdar en Mehmet Ozaslan. "Genomiese karakterisering van 'n roman SARS-CoV-2." Gene verslae 19 (2020): 100682. https://doi.org/10.1016/j.genrep.2020.100682.

Die hulpbron is gelisensieer onder 'n Creative Commons Erkenning-Niekommersieel-Insgelyks Deel 4.0 Internasionale lisensie. Geen regte word verleen om HHMI's of BioInteractive se name of logo's onafhanklik van hierdie hulpbron of in enige afgeleide werke te gebruik nie.


Replikasiesiklus van SARS-CoV-2 in 3D

Terwyl die wêreldwye koronaviruspandemie voortduur, probeer wetenskaplikes nie net entstowwe en middels vind om dit te bekamp nie, maar ook om voortdurend meer oor die virus self te leer. "Ons kan nou verwag dat die koronavirus seisoenaal sal word," verduidelik Ralf Bartenschlager, professor in die departement van aansteeklike siektes, molekulêre virologie, aan die Heidelberg Universiteit. "Daar is dus 'n dringende behoefte om beide profilaktiese en terapeutiese strategieë teen hierdie virus te ontwikkel en te implementeer." In 'n nuwe studie het Bartenschlager, bygestaan ​​deur die Schwab-span by EMBL Heidelberg en met behulp van EMBL se elektronmikroskopie-kernfasiliteit, 'n gedetailleerde beeldontleding gedoen om te bepaal hoe die virus besmette selle herprogrammeer.

Selle wat deur SARS-CoV-2 besmet raak, sterf redelik vinnig, binne slegs 24 tot 48 uur. Dit dui daarop dat die virus die menslike sel op so 'n manier benadeel dat dit herbedraad word en in wese gedwing word om virale nageslag te produseer. Die hoofdoel van die projek was dus om die morfologiese veranderinge binne 'n sel te identifiseer wat inherent aan hierdie herprogrammering is. “Om middels te ontwikkel wat die virale replikasie en sodoende die gevolg van die infeksie onderdruk, sowel as die virus-geïnduseerde seldood, is die sleutel om ’n beter begrip te hê van die biologiese meganismes wat die virus se replikasiesiklus aandryf,” verduidelik Bartenschlager. Die span het die beeldfasiliteite by EMBL en moderne beeldtegnieke gebruik om die 3D-argitektuur van SARS-CoV-2-geïnfekteerde selle te bepaal, sowel as veranderinge van sellulêre argitektuur wat deur die virus veroorsaak word.

Die span kon 3D-rekonstruksies van heel selle en hul subsellulêre kompartemente skep. "Ons verskaf kritiese insigte oor virus-geïnduseerde strukturele veranderinge in die bestudeerde menslike selle," verduidelik Ralf Bartenschlager. Die beelde het 'n duidelike en massiewe verandering in die endomembraanstelsels van die besmette selle geopenbaar - 'n stelsel wat die sel in staat stel om verskillende kompartemente en plekke te definieer. Die virus veroorsaak membraanveranderinge op so 'n manier dat dit sy eie replikasie-organelle kan produseer. Dit is mini-replikasie-kompartemente waar die virale genoom geweldig versterk word. Om dit te doen, benodig die virus membraanoppervlaktes. Dit word geskep deur 'n sellulêre membraanstelsel te ontgin en 'n organel te skep, wat 'n baie duidelike voorkoms het. Die wetenskaplikes beskryf dit as 'n massiewe opeenhoping van borrels: twee membraanlae wat 'n groot ballon vorm. Binne hierdie ballonne - wat 'n baie afgeskermde kompartement vorm - word die virale genome vermenigvuldig en vrygestel om in nuwe virusdeeltjies geïnkorporeer te word.

Hierdie opvallende verandering kan slegs 'n paar uur na infeksie in die selle gesien word. "Ons het gesien hoe en waar die virus in die sel repliseer, en hoe dit sy gasheermasjinerie kaap om na vermenigvuldiging vrygestel te word," sê Schwab. Tot nou toe was min bekend oor die oorsprong en ontwikkeling van die effekte wat SARS-CoV-2 in die menslike liggaam veroorsaak. Dit sluit in 'n gebrek aan kennis oor die meganisme waardeur die infeksie lei tot die dood van besmette selle. Om hierdie inligting nou te hê, sal die ontwikkeling van terapieë bevorder wat virusreplikasie en dus die erns van die siekte verminder.

Die span het seker gemaak dat die versamelde inligting en veral die ongekende bewaarplek van 3D-strukturele inligting oor virusgeïnduseerde substrukture deur almal gebruik kan word. "Ek glo ons skep 'n presedent oor die feit dat ons alle data wat ons geproduseer het met die wetenskaplike gemeenskap deel. Dit verteenwoordig 'n indrukwekkende hulpbron vir die gemeenskap," sê Yannick Schwab. "Op hierdie manier kan ons die wêreldwye poging ondersteun om te bestudeer hoe SARS-CoV-2 in wisselwerking met sy gasheer is." Die span hoop dat hul versamelde inligting sal help met die ontwikkeling van antivirale middels.

Die span het daarin geslaag om die studie in 'n ongelooflike kort tyd te produseer, ten spyte van die uitdagende omstandighede. "Die helfte van die wêreld - en natuurlik ook Heidelberg - was in volle inperking en ons moes amper daagliks improviseer om by die situasie aan te pas. Of dit nou by EMBL of van die huis af was, almal was diep betrokke en het mildelik hul tyd en diep gegee. kennis,” sê Schwab. "Die spoed waarteen ons gewerk het, en die hoeveelheid data wat geproduseer is, is merkwaardig."

Vrywaring: AAAS en EurekAlert! is nie verantwoordelik vir die akkuraatheid van nuusvrystellings wat op EurekAlert geplaas is nie! deur bydraende instellings of vir die gebruik van enige inligting deur die EurekAlert-stelsel.


Inhoud

Tydens die aanvanklike uitbraak in Wuhan, China, is verskeie name vir die virus gebruik, sommige name wat deur verskillende bronne gebruik word, sluit die "coronavirus" of "Wuhan-koronavirus" in. [25] [26] In Januarie 2020 het die Wêreldgesondheidsorganisasie "2019 novel coronavirus" (2019-nCov) [5] [27] aanbeveel as die voorlopige naam vir die virus. Dit was in ooreenstemming met die WGO se 2015-leiding [28] teen die gebruik van geografiese liggings, dierspesies of groepe mense in siekte- en virusname. [29] [30]

Op 11 Februarie 2020 het die Internasionale Komitee vir Taksonomie van Virusse die amptelike naam "ernstige akute respiratoriese sindroom coronavirus 2" (SARS-CoV-2) aangeneem. [31] Om verwarring met die siekte SARS te vermy, verwys die WGO soms na SARS-CoV-2 as "die COVID-19-virus" in openbare gesondheidskommunikasie [32] [33] en die naam HCoV-19 is in sommige navorsing ingesluit artikels. [8] [9] [10]

Mens-tot-mens-oordrag van SARS‑CoV‑2 is op 20 Januarie 2020, tydens die COVID-19-pandemie, bevestig. [15] [34] [35] [36] Oordrag is aanvanklik aanvaar dat dit hoofsaaklik plaasvind via respiratoriese druppels van hoes en nies binne 'n reeks van ongeveer 1,8 meter (6 voet). [37] [38] Eksperimente met laserligverstrooiing dui daarop dat praat 'n bykomende wyse van oordrag [39] [40] en 'n verreikende [41] en onder-navorsde [42] een is, binnenshuis, met min lugvloei. [43] [44] Ander studies het voorgestel dat die virus ook in die lug kan wees, met aërosols wat moontlik die virus kan oordra. [45] [46] [47] Tydens mens-tot-mens-oordrag word vermoedelik 'n gemiddeld 1000 aansteeklike SARS-CoV-2 virions 'n nuwe infeksie inisieer. [48] ​​[49]

Indirekte kontak via besmette oppervlaktes is nog 'n moontlike oorsaak van infeksie. [50] Voorlopige navorsing dui daarop dat die virus vir tot drie dae lewensvatbaar op plastiek (polipropileen) en vlekvrye staal (AISI 304) kan bly, maar nie langer as een dag op karton of langer as vier uur op koper oorleef nie [50] 10] die virus word geïnaktiveer deur seep, wat sy lipied-dubbellaag destabiliseer. [51] [52] Virale RNA is ook gevind in stoelgangmonsters en semen van besmette individue. [53] [54]

Die mate waarin die virus aansteeklik is tydens die inkubasietydperk is onseker, maar navorsing het aangedui dat die farinks die piek virale lading bereik ongeveer vier dae na infeksie [55] [56] of die eerste week van simptome, en daarna afneem. [57] Die duur van SARS-CoV-2 RNA-afskeiding is gewoonlik tussen 3 en 46 dae na simptoomaanvang. [58]

'n Studie deur 'n span navorsers van die Universiteit van Noord-Carolina het bevind dat die neusholte skynbaar die dominante aanvanklike plek is vir infeksie met daaropvolgende aspirasie-gemedieerde virus wat in die longe in SARS-CoV-2-patogenese insaai. [59] Hulle het gevind dat daar 'n infeksiegradiënt van hoog in proksimale na laag was in distale pulmonêre epiteelkulture, met 'n fokusinfeksie in gesilieerde selle en tipe 2 pneumosiete in die lugweg en alveolêre streke onderskeidelik. [59]

Daar is 'n paar bewyse van mens-tot-dier-oordrag van SARS-CoV-2, insluitend voorbeelde in katdiere. [60] [61] Sommige instellings het diegene wat met SARS-CoV-2 besmet is aangeraai om kontak met diere te beperk. [62] [63]

Asimptomatiese oordrag

Op 1 Februarie 2020 het die Wêreldgesondheidsorganisasie (WGO) aangedui dat "oordrag van asimptomatiese gevalle waarskynlik nie 'n groot aandrywer van oordrag is nie". [64] Een meta-analise het bevind dat 17% van infeksies asimptomaties is, en asimptomatiese individue was 42% minder geneig om die virus oor te dra. [65]

'n Epidemiologiese model van die begin van die uitbreking in China het egter voorgestel dat "pre-simptomatiese afskeiding tipies kan wees onder gedokumenteerde infeksies" en dat subkliniese infeksies moontlik die bron van 'n meerderheid infeksies was. [66] Dit kan verduidelik hoe uit 217 aan boord van 'n vaartuig wat by Montevideo vasgemeer het, slegs 24 van 128 wat positief getoets het vir virale RNA simptome getoon het. [67] Net so het 'n studie van vier-en-negentig pasiënte wat in Januarie en Februarie 2020 in die hospitaal opgeneem is, geskat dat pasiënte die grootste hoeveelheid virus afgeskei het twee tot drie dae voordat simptome verskyn en dat "'n aansienlike deel van die oordrag waarskynlik voor die eerste simptome in die indeksgeval plaasgevind het. ". [68]

Herinfeksie

Daar is onsekerheid oor herinfeksie en langtermyn-immuniteit. [69] Dit is nie bekend hoe algemeen herinfeksie is nie, maar verslae het aangedui dat dit met wisselende erns voorkom. [69]

Die eerste aangemelde geval van herinfeksie was 'n 33-jarige man van Hong Kong wat die eerste keer positief getoets het op 26 Maart 2020, op 15 April 2020 na twee negatiewe toetse ontslaan is en weer positief getoets het op 15 Augustus 2020 (142 dae later) , wat bevestig is deur heelgenoomvolgordebepaling wat toon dat die virale genome tussen die episodes aan verskillende klades behoort. [70] Die bevindings het die implikasies gehad dat kudde-immuniteit dalk nie die virus uitskakel as herinfeksie nie 'n ongewone voorkoms is nie en dat entstowwe moontlik nie lewenslange beskerming teen die virus kan bied nie. [70]

Nog 'n gevallestudie beskryf 'n 25-jarige man van Nevada wat positief getoets het vir SARS-CoV-2 op 18 April 2020 en op 5 Junie 2020 (geskei deur twee negatiewe toetse). Aangesien genomiese ontledings beduidende genetiese verskille getoon het tussen die SARS-CoV-2-variant wat op daardie twee datums gemonster is, het die gevallestudie-outeurs vasgestel dat dit 'n herinfeksie was. [71] Die man se tweede infeksie was simptomaties ernstiger as die eerste infeksie, maar die meganismes wat hiervoor kan verklaar is nie bekend nie. [71]

Die eerste bekende infeksies van SARS‑CoV‑2 is in Wuhan, China, ontdek.[17] Die oorspronklike bron van virale oordrag na mense bly onduidelik, asook of die virus patogenies geword het voor of na die oorloopgebeurtenis. [19] [72] [9] Omdat baie van die vroeë besmettes werkers by die Huanan Seekosmark was, [73] [74] is daar voorgestel dat die virus moontlik van die mark afkomstig is. [9] [75] Ander navorsing dui egter daarop dat besoekers moontlik die virus op die mark gebring het, wat toe vinnige uitbreiding van die infeksies vergemaklik het. [19] [76] 'n WGO-verslag van Maart 2021 oor 'n gesamentlike WGO-China-studie het gesê dat menslike oorstroming via 'n intermediêre diergasheer die mees waarskynlike verklaring is, met direkte oorvloei van vlermuise naas waarskynlik. Bekendstelling deur die voedselvoorsieningsketting en die Huanan Seekosmark is as nog 'n moontlike, maar minder waarskynlike verduideliking beskou. [77]

Die mutasietempo wat uit vroeë gevalle van SARS-CoV-2 beraam is, was van 6.54 × 10-4 per terrein per jaar. [77] Sy virale evolusie word vertraag deur die RNA-proefleesvermoë van sy replikasiemasjinerie. [78]

Navorsing oor die natuurlike reservoir van die virus wat die SARS-uitbraak van 2002–2004 veroorsaak het, het gelei tot die ontdekking van baie SARS-agtige vlermuiskoronavirusse, waarvan die meeste in die Rhinolophus geslag van hoefystervlermuise. Filogenetiese analise dui daarop dat monsters geneem uit Rhinolophus sinicus toon 'n ooreenkoms van 80% met SARS‑CoV‑2. [79] [80] [81] Filogenetiese analise dui ook daarop dat 'n virus van Rhinolophus affinis, wat in die Yunnan-provinsie versamel is en as RaTG13 aangewys is, het 'n 96% ooreenkoms met SARS-CoV-2. [17] [82] Die RaTG13-virusvolgorde is die naaste bekende volgorde aan SARS-CoV-2. [77] Ander nouverwante volgordes is ook in monsters van plaaslike vlermuispopulasies geïdentifiseer. [83]

Vlermuise word beskou as die mees waarskynlike natuurlike reservoir van SARS-CoV-2, [84] [85] maar verskille tussen die vlermuis-koronavirus en SARS-CoV-2 dui daarop dat mense deur 'n tussengasheer besmet is [75], hoewel die bron van bekendstelling in mense bly onbekend. [86]

Alhoewel die rol van pangoliene as 'n tussengasheer aanvanklik gestel is ('n studie wat in Julie 2020 gepubliseer is, het voorgestel dat pangoliene 'n tussengasheer van SARS-CoV-2-agtige koronavirusse is [87] [88] ), het daaropvolgende studies nie hul bydrae gestaaf nie. na die oorloop. [77] Bewyse teen hierdie hipotese sluit in die feit dat pangolienvirusmonsters te ver van SARS-CoV-2 is: isolate verkry van pangoliene waarop in Guangdong beslag gelê is, was slegs 92% identies in volgorde aan die SARS-CoV-2-genoom. Daarbenewens, ten spyte van ooreenkomste in 'n paar kritieke aminosure, [89] pangoline virus monsters toon swak binding aan die menslike ACE2 reseptor. [90]

SARS-CoV-2 behoort aan die breë familie virusse bekend as koronavirusse. [26] Dit is 'n positiewe-sin enkelstrengige RNA (+ssRNA) virus, met 'n enkele lineêre RNA segment. Koronavirusse besmet mense, ander soogdiere en voëlspesies, insluitend vee en geselskapsdiere. [91] Menslike koronavirusse is in staat om siektes te veroorsaak wat wissel van die gewone verkoue tot ernstiger siektes soos die Midde-Ooste respiratoriese sindroom (MERS, sterftesyfer

34%). SARS-CoV-2 is die sewende bekende koronavirus wat mense besmet, na 229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV en die oorspronklike SARS-CoV. [92]

Soos die SARS-verwante koronavirus wat by die 2003 SARS-uitbraak geïmpliseer is, is SARS-CoV-2 'n lid van die subgenus Sarbecovirus (beta-CoV-lyn B). [93] [94] Koronavirusse ondergaan ook gereelde rekombinasie. [95] Sy RNA-volgorde is ongeveer 30 000 basisse lank, [96] relatief lank vir 'n koronavirus (wat op sy beurt die grootste genome onder alle RNA-families dra) [97] Sy genoom bestaan ​​feitlik geheel en al uit proteïenkoderende volgordes, 'n eienskap gedeel met ander koronavirusse. [95]

'n Onderskeidende kenmerk van SARS-CoV-2 is die inkorporering daarvan van 'n polibasiese plek wat deur furien geklief is, [89] wat 'n belangrike element blyk te wees wat die virulensie daarvan verhoog. [98] Die furienprotease herken die kanoniese peptiedvolgorde RX[R/K]R↓X waar die splitsingsplek deur 'n afpyltjie aangedui word en X enige aminosuur is. [99] [100] In SARS-CoV-2 word die herkenningsplek gevorm deur die geïnkorporeerde 12 kodon nukleotiedvolgorde CCT CGG CGG GCA wat ooreenstem met die aminosuurvolgorde PRRA. [101] Hierdie volgorde is stroomop van 'n arginien en serien wat die S1/S2-splitsingsplek (PRRAR↓S) van die aarproteïen vorm. [102] Alhoewel sulke terreine 'n algemene kenmerk van ander virusse is, [101] insluitend sommige lede van die Beta-CoV genus en ander genera koronavirusse, [103] SARS-Cov-2 is uniek onder lede van sy subgenus vir so 'n webwerf. [89]

Virale genetiese volgorde data kan kritiese inligting verskaf oor of virusse wat deur tyd en ruimte geskei word, waarskynlik epidemiologies gekoppel sal wees. [104] Met 'n voldoende aantal opeenvolgende genome is dit moontlik om 'n filogenetiese boom van die mutasiegeskiedenis van 'n familie virusse te rekonstrueer. Teen 12 Januarie 2020 is vyf genome van SARS-CoV-2 uit Wuhan geïsoleer en gerapporteer deur die Chinese Sentrum vir Siektebeheer en -voorkoming (CCDC) en ander instellings [96] [105] die aantal genome het tot 42 met 30 toegeneem. Januarie 2020. [106] 'n Filogenetiese ontleding van daardie monsters het getoon dat hulle "hoogs verwant is met hoogstens sewe mutasies relatief tot 'n gemeenskaplike voorouer", wat impliseer dat die eerste menslike infeksie in November of Desember 2019 plaasgevind het. [106] Ondersoek van die topologie van die filogenetiese boom aan die begin van die pandemie het ook hoë ooreenkomste tussen menslike isolate gevind. [107] Vanaf 7 Mei 2020 was [opdatering] 4 690 SARS-CoV-2-genome wat op ses kontinente gemonster is, publiek beskikbaar. [108] [ opheldering nodig ]

Op 11 Februarie 2020 het die Internasionale Komitee vir Taksonomie van Virusse aangekondig dat volgens bestaande reëls wat hiërargiese verwantskappe tussen koronavirusse bereken op grond van vyf geconserveerde volgordes van nukleïensure, die verskille tussen wat destyds 2019-nCoV genoem is en die virus van die 2003 SAID uitbreking was onvoldoende om hulle virale spesies te skei. Daarom het hulle 2019-nCoV geïdentifiseer as 'n virus van Ernstige akute respiratoriese sindroom-verwante koronavirus. [109]

In Julie 2020 het wetenskaplikes gerapporteer dat 'n meer aansteeklike SARS-CoV-2-variant met pikproteïenvariant G614 D614 as die dominante vorm in die pandemie vervang het. [110] [111]

Coronavirus-genome en subgenome kodeer vir ses oop leesrame (ORF's). [112] In Oktober 2020 het navorsers 'n moontlike oorvleuelende geen met die naam ontdek ORF3d, in die SARS-CoV-2-genoom. Dit is onbekend of die proteïen wat deur ORF3d het enige funksie, maar dit ontlok 'n sterk immuunrespons. ORF3d is al voorheen geïdentifiseer, in 'n variant van koronavirus wat pangoliene besmet. [113] [114]

Filogenetiese boom

'n Filogenetiese boom gebaseer op heelgenoomvolgordes van SARS-CoV-2 en verwante koronavirusse is: [115] [116] [117]

Pangolin SARSr-COV-GX, 89% na SARS-COV-2, Manis javanica, Gesmokkel uit Suidoos-Asië [120]

Pangolin SARSr-COV-GD, 91% na SARS-COV-2, Manis javanica, Gesmokkel uit Suidoos-Asië [121]

Variante

Daar is baie duisende variante van SARS-CoV-2, wat in die veel groter klades gegroepeer kan word. [123] Verskeie verskillende klade-nomenklature is voorgestel. Nextstrain verdeel die variante in vyf klades (19A, 19B, 20A, 20B en 20C), terwyl GISAID hulle in sewe verdeel (L, O, V, S, G, GH en GR). [124]

Verskeie noemenswaardige variante van SARS-CoV-2 het laat in 2020 na vore gekom. Die Wêreldgesondheidsorganisasie het tans vier variante van kommer verklaar, wat soos volg is: [125]

  • Alfa: Afkoms B.1.1.7 het in September 2020 in die Verenigde Koninkryk ontstaan, met bewyse van verhoogde oordraagbaarheid en virulensie. Opvallende mutasies sluit in N501Y en P681H.
    • 'n E484K-mutasie in sommige B.1.1.7-virions is opgemerk en word ook deur verskeie openbare gesondheidsagentskappe opgespoor.

    Ander noemenswaardige variante sluit in 6 ander WGO-aangewese variante wat ondersoek word en Groep 5, wat onder nerts in Demark ontstaan ​​het en gelei het tot 'n nerts genadedood-veldtog wat dit feitlik uitgesterf het. [126]

    Struktuur

    Elke SARS-CoV-2 virion is 50–200 nanometer in deursnee. [74] Soos ander koronavirusse, het SARS-CoV-2 vier strukturele proteïene, bekend as die S (piek), E (omhulsel), M (membraan) en N (nukleokapsied) proteïene, die N-proteïen hou die RNA-genoom, en die S-, E- en M-proteïene skep saam die virale koevert. [127] Coronavirus S-proteïene is glikoproteïene wat in twee funksionele dele (S1 en S2) verdeel word. [91] In SARS-CoV-2, die piekproteïen, wat op atoomvlak afgebeeld is met behulp van kriogene elektronmikroskopie, [128] [129] is die proteïen wat verantwoordelik is om die virus toe te laat om aan die membraan van 'n gasheersel [127] spesifiek, sy S1 subeenheid kataliseer aanhegting, die S2 subeenheid samesmelting. [130]

    Genoom

    SARS-CoV-2 het 'n lineêre, positiewe sintuig, enkelstring-RNA-genoom van ongeveer 30 000 basisse lank. [91] Sy genoom het 'n vooroordeel teen sitosien (C) en guanien (G) nukleotiede soos ander koronavirusse. [131] Die genoom het die hoogste samestelling van U (32,2%), gevolg deur A (29,9%), en 'n soortgelyke samestelling van G (19,6%) en C (18,3%). [132] Die nukleotied-vooroordeel spruit uit die mutasie van guaniene en sitosiene na onderskeidelik adenosiene en urasiele. [133] Die mutasie van CG-dinukleotiede word vermoedelik ontstaan ​​om die sinkvinger antivirale proteïenverwante verdedigingsmeganisme van selle te vermy, [134] en om die energie te verlaag om die genoom te ontbind tydens replikasie en translasie (adenosien en uracil basispaar via twee waterstof bindings, sitosien en guanien via drie). [133] Die uitputting van CG-dinukleotiede in sy genoom het daartoe gelei dat die virus 'n merkbare kodongebruik-vooroordeel gehad het. Byvoorbeeld, arginien se ses verskillende kodons het 'n relatiewe sinonieme kodongebruik van AGA (2.67), CGU (1.46), AGG (.81), CGC (.58), CGA (.29) en CGG (.19). [132] 'n Soortgelyke kodongebruik-vooroordeel-neiging word in ander SARS-verwante koronavirusse gesien. [135]

    Replikasie siklus

    Virusinfeksies begin wanneer virale deeltjies aan gasheeroppervlak sellulêre reseptore bind. [136] Proteïenmodelleringseksperimente op die piekproteïen van die virus het gou voorgestel dat SARS-CoV-2 voldoende affiniteit het vir die reseptor angiotensienomskakelende ensiem 2 (ACE2) op menslike selle om dit as 'n meganisme van seltoegang te gebruik. [137] Teen 22 Januarie 2020 het 'n groep in China wat met die volle virusgenoom gewerk het en 'n groep in die Verenigde State wat omgekeerde genetika-metodes onafhanklik en eksperimenteel gebruik het, gedemonstreer dat ACE2 as die reseptor vir SARS-CoV-2 kan optree. [17] [138] [139] [140] Studies het getoon dat SARS-CoV-2 'n hoër affiniteit met menslike ACE2 het as die oorspronklike SARS-virus. [128] [141] SARS‑CoV‑2 kan ook basigin gebruik om te help met selbetreding. [142]

    Aanvanklike piekproteïen-priming deur transmembraanprotease, serien 2 (TMPRSS2) is noodsaaklik vir toegang tot SARS-CoV-2. [23] Die gasheerproteïenneuropalien 1 (NRP1) kan die virus help met gasheerseltoetrede deur ACE2 te gebruik. [143] Nadat 'n SARS-CoV-2-virion aan 'n teikensel geheg het, sny die sel se TMPRSS2 die spykerproteïen van die virus oop, wat 'n samesmeltingpeptied in die S2-subeenheid en die gasheerreseptor ACE2 blootstel. [130] Na samesmelting vorm 'n endosoom rondom die virion wat dit van die res van die gasheersel skei. Die virion ontsnap wanneer die pH van die endosoom daal of wanneer katepsien, 'n gasheer sisteïenprotease, dit kloof. [130] Die virion stel dan RNA in die sel vry en dwing die sel om kopieë van die virus te produseer en te versprei, wat meer selle besmet. [144]

    SARS-CoV-2 produseer ten minste drie virulensiefaktore wat die afskeiding van nuwe virions uit gasheerselle bevorder en immuunrespons inhibeer. [127] Of dit afregulering van ACE2 insluit, soos gesien in soortgelyke koronavirusse, word nog ondersoek (vanaf Mei 2020). [145]

    Gebaseer op die lae variasie onder bekende SARS-CoV-2 genomiese volgordes, het gesondheidsowerhede waarskynlik die virus binne weke na sy opkoms onder die menslike bevolking laat in 2019 opgespoor. [19] [146] Die vroegste geval van infeksie wat tans bekend is, is gedateer tot 1 Desember 2019, alhoewel 'n vroeëre geval op 17 November 2019 kon plaasgevind het. [147] [148] Die aanvang van die pandemie is deur tMRCA-ontleding beraam dat dit voor die einde van Desember 2019 plaasgevind het, maar hierdie statistiese afleiding verskaf nie definitiewe bewyse van tyd van oorsprong. [77] Die virus het daarna na alle provinsies van China en na meer as 150 ander lande regoor die wêreld versprei. [149] Mens-tot-mens-oordrag van die virus is in al hierdie streke bevestig. [150] Op 30 Januarie 2020 is SARS-CoV-2 deur die WGO as 'n Openbare Gesondheidsnood van Internasionale Kommer aangewys, [151] [12] en op 11 Maart 2020 het die WGO dit as 'n pandemie verklaar. [13] [152]

    Retrospektiewe toetse wat binne die Chinese toesigstelsel ingesamel is, het geen duidelike aanduiding getoon van aansienlike onerkende sirkulasie van SARS-CoV-2 in Wuhan gedurende die laaste deel van 2019 nie. [153]

    ’n Meta-analise van November 2020 het die basiese reproduksiegetal (R 0 >) van die virus op tussen 2.39 en 3.44 geskat. [20] Dit beteken elke infeksie van die virus sal na verwagting lei tot 2,39 tot 3,44 nuwe infeksies wanneer geen lede van die gemeenskap immuun is nie en geen voorkomende maatreëls getref word nie. Die reproduksiegetal kan hoër wees in digbevolkte toestande soos dié wat op vaartuie voorkom. [154] Baie vorme van voorkomende pogings kan in spesifieke omstandighede aangewend word om die verspreiding van die virus te verminder. [112]

    Daar was ongeveer 96,000 bevestigde gevalle van infeksie op die vasteland van China. [149] Alhoewel die verhouding van infeksies wat tot bevestigde gevalle of vordering tot diagnoseerbare siekte lei, onduidelik bly, [155] het een wiskundige model geskat dat 75 815 mense op 25 Januarie 2020 in Wuhan alleen besmet is, op 'n tydstip toe die aantal bevestigde gevalle wêreldwyd was slegs 2 015. [156] Voor 24 Februarie 2020 het meer as 95% van alle sterftes as gevolg van COVID-19 wêreldwyd in die Hubei-provinsie plaasgevind, waar Wuhan geleë is. [157] [158] Vanaf 20 Junie 2021 het die persentasie afgeneem tot 0,083%. [149]

    Op 20 Junie 2021 was daar 178 333 628 totale bevestigde gevalle van SARS-CoV-2-infeksie in die voortslepende pandemie. [149] Die totale aantal sterftes wat aan die virus toegeskryf word, is 3 862 271. [149]


    Materiale en metodes

    Diere en sellyne

    Vroulike ICR, hACE2 muise, 6-8 weke, is aangekoop by die Sentrum van Mediese Proefdiere van die Chinese Akademie vir Mediese Wetenskappe (Beijing, China). Hierdie diere is onder spesifieke patogeenvrye toestande in die Dierefasiliteite van die Chinese Akademie vir Mediese Wetenskap onderhou. Dierestudies wat SARS-CoV-2-stam WH-09 betrek, is in 'n dierebioveiligheidsvlak 3 (BASL3)-fasiliteit uitgevoer met behulp van HEPA-gefiltreerde isolators en die prosedures is goedgekeur deur die Institusionele Dieresorg- en Gebruikskomitee (IACUC-protokolnommer: ZH20005) van die Instituut vir Laboratoriumveekunde, Peking Union Medical College (BLL20001). Murienstudies sonder virale infeksie is deur die Dieresorg- en Gebruikskomitee van die Chinese Akademie vir Mediese Wetenskap goedgekeur. Muriene makrofaagsellyn Raw264.7, menslike monosietsellyn THP-1 en aapniersellyn-Vero E6-selle is by die China Centre for Type Culture Collection (Beijing, China) aangekoop en in DMEM- of RPMI-1640-medium gekweek ( Gibco, VSA) met 10% FBS.

    Reagense

    Chlorokien, Z-VAD-FMK, Jasplakinolied, Lipopolysaccharides en Cytochalasin D is by Sigma-Aldrich (MO, VSA) gekoop. Rekombinante muriene IL-4, IFN-γ en rekombinante menslike IL-4, IFN-γ is van PeproTech (NJ, VSA) gekoop. Clodronate Liposomes is aangekoop by FormuMax (CA, VSA). Latrunculin A is by Millipore (MA, VSA) gekoop.

    Isolasie van primêre alveolêre makrofage en alveolêre epiteel tipe II selle

    Primêre alveolêre makrofage is uit muriene brongoalveolêre spoelvloeistof (BALF) geïsoleer. Kortliks, die muise is onmiddellik voor spoeling verdoof en die tragea is gedissekteer. Longe is vyf keer gespoel met 1 ml PBS en die behoue ​​BALF is teen 600× gesentrifugeer g vir 5 min by 4 °C. Die korrel wat geoes is, is hersuspendeer in RPMI 1640 volledige medium en geïnkubeer op 'n kultuurplaat vir 2 uur. Na 2 uur is nie-hechtende selle verwyder deur saggies met PBS te was. Primêre alveolêre epiteel (AT2) selle is geïsoleer van hACE2 muise soos voorheen gerapporteer 45 . Kortliks, muise is deur die regterventrikel met 10 ml koue PBS geperfuseer. Longe is gevul met 2 mL dispase (BD Bioscience, VSA) en lae geleringstemperatuur agarose (Sigma Aldrich, VSA) voordat longweefsels vir 20 min met 2 mL dispase in 37 °C geïnkubeer is. Daarna is longweefsels gevryf en die suspensie is deur 70 μm en 40 μm nylon maas gefiltreer (JETBIOFIL, China). Die sellulêre suspensie is geïnkubeer met gebiotinileerde anti-CD45 (Biolegend, kloon 30-F11, Kat. 103104), anti-CD16/32 (BD Pharmingen™, kloon 2.4G2, Kat. 553143), anti-CD31 (Biolegend, kloon MEC13) .3, Kat. 102504), anti-TER119 (Biolegend, kloon TER119, Kat. 116104) en anti-CD104 (Biolegend, kloon 346–11A, Kat. 12603) teenliggaampies by 4 °C vir 30 min. en dan MyOneads® TM streptavidien T1 magnetiese krale (Thermo Fisher Scientific, Kat. 65601) is by die selsuspensie gevoeg om leukosiete, monosiete/makrofage, NK-selle, neutrofiele, endoteelselle en eritroïedselle uit te sluit. 'n Negatiewe seleksie van fibroblaste is uitgevoer deur aanhegting op nie-bedekte plastiekplate. Selsuiwerheid is gereeld deur vloeisitometrie beoordeel.

    Immunofluoressensie

    Selle is in 4% paraformaldehied gefixeer en met 0.2% Triton X-100 gepermeabiliseer. Gefixeerde selle is in 5% BSA geblokkeer en geïnkubeer met 'n anti-Lamp2 (Abcam, Cat. ab25339, 1:200) teenliggaam anti-SARS nukleokapsied proteïen (Abcam, Cat. Ab273434, 1:200), anti-Rab7 (Abcam, Kat. ab137029, 1:200) teenliggaam of anti-Rab5-teenliggaam (Abcam, Kat. ab18211, 1:200) by 4 °C oornag, selle is gewas en geïnkubeer met sekondêre teenliggaampies vir 1 uur by kamertemperatuur. Laastens is die skyfies teenkleur met DAPI en gemonteer vir konfokale analise. Die intensiteit van immunofluoressensie is ontleed deur Image J 9.0 sagteware.

    Histologiese en immunohistochemiese kleuring

    Die longweefsels van muise is gefixeer in 10% formalien, ingebed in paraffien, en gesny vir H&E-kleuring. Volgens morfologiese veranderinge na SARS-CoV-2-infeksie, is die longweefsels as lig (1), matig (2), ernstig (3) of lewensgevaarlik (4) gegradeer. 'n Kenner in patologie wat vir die eksperiment verblind was, het 'n telling gegee gebaseer op die inflammatoriese selinfiltrasie, parenchimale longontsteking, alveolêre bloeding en brongiolêre/brongiale luminale of alveolêre eksudaat.Immunohistochemiese kleuring is uitgevoer volgens 'n protokol soos voorheen beskryf 46 . Kortliks, die gedeeltes van paraffien-ingebedde weefsels is geïnkubeer met anti-F4/80 (Santa Cruz Biotechnology, Kat. SC-52664, 1:500) teenliggaampie, anti-mucin 1 (1:200, Abcam, Kat. ab45167) , anti-mucin 5a (1:200, Abcam, Cat. ab24071), anti-mucin 5b (1:200, Abcam, Cat. ab77995) of anti-SARS nukleokapsiedproteïen (Abcam, Cat. ab273434, 1:1000) teenliggaampie by 4 °C oornag. Daarna is skyfies opeenvolgend geïnkubeer met twee HRP-gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies vir 1 uur by kamertemperatuur. Die skyfies is geïnkubeer met ANO Reagens PPD520 of PPD570 deur gebruik te maak van die PANO 4-plex IHC Kit (Panovue, China) volgens die vervaardiger se instruksies, gevolg deur teenkleuring met DAPI (Thermo, VSA) en uiteindelik gemonteer vir analise. Die gekleurde longafdelings is geskandeer en gedigitaliseer met behulp van 'n TissueFaxs Plus-stelsel gekoppel aan 'n Zeiss Axio Imager Z2-mikroskoop of Nikon A1-konfokale mikroskoop. Die intensiteit van positiewe kleuring is ontleed deur Image J 9.0 sagteware.

    Intydse PCR

    Totale RNA is uit selle onttrek met behulp van Trizol (Invitrogen) en is getranskribeer na cDNA deur gebruik te maak van 'n hoëkapasiteit cDNA omgekeerde transkripsiestel (Applied Biosystems, CA). Die primer-volgordes word soos volg getoon: GAPDH, 5'-ACAACTTTGGTATCG TGGAAGG-3' (sin) en 5'-GCCATCACGCCACAGT TTC-3' (antisense) Gapdh, 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3' (sin) en 5'-TGTAGACCATGTAGTTGA GGTCA-3' (antisense) SARS-CoV-2 primer1 (ORF1ab): 5'-CCCTGTGGGTTTTAC ACTAA-3' (sin) en 5'-ACGATTGTGCA TCAGCTGA-3' (antisense) SARS-CoV-2 primer2 (Nukleoproteïen): 5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3' (sin) en 5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3' (antisense) ACE2, 5'-CAAGAGCAAACG GTTGAACAC-3' (sin) en 5'-CCAGAGCCTCTCATTGTAGTCT-3' (antisense) Nos2, 5'-GATGTTGAACTATGTCCTATCTCC-3' (sin) en 5'-GAACACCACTTT CACCAAGAC-3' (antisense) Arg1, 5'-CAAGACAGGGCTCCTTTCAG-3' (sin) en 5'-TGGCTTATGGTTACCCTCCC-3' (antisense). Intydse PCR is uitgevoer met behulp van ABI QuantStudio 3 (Applied Biosystems, CA, VSA). Waardes is gemiddeldes ± SD van drie onafhanklike eksperimente wat in duplikaat uitgevoer is. Statistiese vergelykings tussen groepe is uitgevoer met behulp van 'n Student s'n t-toets. Waardes van alle parameters is as statisties beduidend beskou teen 'n waarde van P & lt 0,05.

    RNA in situ hibridisasie (RNA-ISH)

    RNA-ISH is uitgevoer op primêre alveolêre makrofage wat op glasdekstrokies of paraffien-ingebedde 5 μm longweefselafdelings gekweek is met behulp van die RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v2 volgens die vervaardiger se instruksies (Advanced Cell Diagnostics, VSA). Kortliks, selle is gefixeer in 4% paraformaldehied en geïnkubeer met waterstofperoksied by RT vir 10 min en 1:15 verdunde Protease III by RT vir 10 min. Longweefselseksies is met xileen gedeparaffien gemaak en met gegradeerde etanol herhidreer, met waterstofperoksied geïnkubeer, en dan vir 15 min in Target Retrieval buffer gekook, gevolg deur inkubasie met Protease Plus vir 15 min by 40 °C. Skyfies is gehibridiseer met SARS-CoV-2 probes in 'n hibridisasie oond by 40 °C vir 2 uur, en die fluoresserende seine is versterk volgens die vervaardiger se protokol. Die selle wat op glasdekstrokies en gekleurde longgedeeltes gekweek is, is geskandeer en gedigitaliseer met behulp van 'n TissueFaxs Plus-stelsel wat aan 'n Zeiss Axio Imager Z2-mikroskoop gekoppel is. Die intensiteit van fluoressensie en positiewe seltempo is ontleed deur Image J 9.0 sagteware.

    Lysosomale pH meting

    LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 (Thermo Fisher, VSA) is gebruik om die pH van makrofaag-lisosome te kwantifiseer volgens die vervaardiger se riglyne, wat die pH-afhanklike dubbele opwekkingsspektra in lewende selle vertoon. LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 het 'n oorwegend geel fluoressensie in suur omgewings en 'n blou fluoressensie in 'n alkaliese omgewing. In kort, selle is behandel met 5 μM LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 in die voorverwarmde medium vir 5 min by 37 °C. Nadat hulle twee keer met koue PBS gewas is, is die gemerkte selle vir 5 minute by 37 °C geïnkubeer met 10 μM monensien en 10 μM nigerisien in Living Cell Imaging Solution (Thermo Fisher, VSA). Die fluoresserende intensiteit is gemeet by Ex-330/Em-550 en Ex-380/Em-550. Die standaardkurwe van pH-waarde is uitgevoer deur Intrasellulêre pH Kalibrasie Buffer Kit (Thermo Fisher, VSA). Vir die relatiewe suurheid van die lisosoom, is makrofage geïnkubeer met 5 μM LysoSensor TM Green DND-189 (Thermo Fisher, VSA) vir 30 min onder toepaslike groeitoestande. Daarna is die laaioplossing met 'n vars medium vervang en die gekleurde selle is waargeneem en gedigitaliseer met behulp van 'n Nikon A1 konfokale mikroskoop. Die relatiewe intensiteit is ontleed deur Image J 9.0 sagteware.

    Opsporing van endosomale suurheid

    Vir die opsporing van die endosomale suurheid, is pHrodo TM rooi dekstraan (Thermo Fisher, VSA) gebruik, wat 'n pH-sensitiewe fluoresserende emissie het wat in intensiteit toeneem met toenemende suurheid en in wese nie-fluoresserend in die ekstrasellulêre omgewing is. Volgens die vervaardiger se riglyne, is AM's of PAEC's gekweek met 50 μg/ml pHrodo TM rooi dektraan in Live Cell Imaging Solution vir 10 minute by 37 °C. Nadat dit twee keer met 'n voorafverwarmde medium gewas is, is die selle deur vloeisitometrie ontleed en deur 'n Nikon A1 konfokale mikroskoop met 'n toepaslike filter afgebeeld.

    Diere-eksperimente en behandelingsprotokol

    hACE2-muise is met SARS-CoV-2 (1 × 10 5 TCID) besmet50) deur intratrageale toediening en dan behandel word met voertuigbeheer (H2O of kontrole liposoom), CQ (35 mg/kg, i.p.) of CQ gekombineer met Clodronate Liposomes (50 μL deur intratrageale toediening en 100 μL deur binneaarse inspuiting, slegs een keer) een keer per dag vir 5 dae (n = 4 muise/groep). Na 5 dae van behandeling is muise doodgemaak en longweefsels is versamel vir intydse PCR-toets en histologiese en immunohistochemiese kleuring.

    Opsporing van sellewensvatbaarheid

    Om die sellewensvatbaarheid van AM's wat met SARS-CoV-2 besmet is, te bepaal, is die CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega, VSA) volgens die vervaardiger se instruksies gebruik. Kortliks, 1 × 10 5 /put AM's is in 24-put plate geplaas en met 10 5 TCID besmet50 SARS-CoV-2 vir 4 uur. Selle is dan gelys met Dual-Luciferase Reporter Assay System reagens en die luciferase sein is bepaal deur 'n mikroplaat luminometer.

    Kwantifisering en statistiese analise

    Alle eksperimente is ten minste drie keer uitgevoer. Resultate word uitgedruk as gemiddelde ± SD soos aangedui en deur tweestertstudente ontleed t-toets of Eenrigting ANOVA gevolg deur Bonferroni se toets of Kruskal–Wallis toets. Die P-waarde < 0,05 is as statisties beduidend beskou. Die ontleding is uitgevoer met behulp van die Graphpad 8.0-sagteware.


    Inleiding

    Koronavirusse, vernoem na hul kroonagtige puntige oppervlak, is geneties divers en kan verskeie dierspesies besmet, insluitend vlermuise, varke, katte, knaagdiere en mense [1]. Koronavirusse word in 4 genera verdeel: alfa, beta, gamma en delta. Slegs alfa- en beta-koronavirusse is bekend om mense te infekteer, wat lei tot patologie wat wissel van boonste respiratoriese simptome tipies van die gewone verkoue tot lewensgevaarlike laer respiratoriese siekte. Die gewone verkoue-veroorsakende koronavirusse 229E en OC43 is die eerste keer in die middel-1960's ontdek, met 2 bykomende koronavirusse, NL63 en HKU1, wat onderskeidelik in 2004 en 2005 geïdentifiseer is. Almal is alomteenwoordige menslike patogene [2]. Van 2003 tot middel 2019 het 2 beta-koronavirusse van soönotiese oorsprong uitbrake van ernstige respiratoriese siektes veroorsaak: Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus (SARS-CoV) en Midde-Ooste Respiratoriese Sindroom Coronavirus (MERS-CoV). SARS-CoV het in Februarie 2003 in Asië na vore gekom en na 26 lande versprei voordat die uitbraak beperk is [3,4]. Meer as 8 000 mense is besmet met 'n sterftesyfer van ongeveer 10% [5]. MERS-CoV het die eerste keer in 2012 verskyn met vroeë sake wat uit Saoedi-Arabië en Jordanië afkomstig is. Infeksies kom steeds voor en is in 27 lande aangemeld, met die meeste gevalle geïsoleer na die Arabiese Skiereiland [6]. Terwyl mens-tot-mens-oordrag vir MERS-CoV skaars is, is die sterftesyfer groter as 30% [3,7].

    In Desember 2019 is 'n uitbreking van koors en respiratoriese siekte van onbekende oorsaak in Wuhan, China [8] aangemeld, en teen middel Januarie 2020 is die etiologiese middel geïdentifiseer as 'n ander nuut-opkomende beta-koronavirus, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) [9,10]. Terwyl baie wat met SARS-CoV-2 besmet is asimptomaties is of ligte siektes ontwikkel, kan COVID-19 vir ander potensiële langtermyn-nagevolge hê en in kwesbare bevolkings soos bejaardes en diegene met onderliggende mediese toestande, kan dit aansienlike morbiditeit en gevolge veroorsaak in ernstige respiratoriese nood, hospitalisasie en selfs dood [11]. Sedert daardie tyd het SARS-CoV-2 wêreldwyd versprei, wat die Wêreldgesondheidsorganisasie (WGO) gevra het om die nuwe koronavirussiekte, Coronavirus Disease 2019 of COVID-19, in Maart 2020 tot 'n pandemie te verklaar. In net 12 maande het die virus het gelei tot 'n groot wêreldwye gesondheidskrisis met meer as 81 miljoen COVID-19-gevalle in 190 lande, meer as 1 777 000 sterftes en 'n geraamde sterftesyfer van ongeveer 2.6% [12].

    Afgesien van die intraveneus toegediende antivirale middel remdesivir by pasiënte met ernstige COVID-19-siekte, is daar geen terapeutiese middels wat goedgekeur is vir die behandeling van SARS-CoV-2-infeksie of siekte nie [13]. 'n Multisentrum-evaluering van 4 hergebruikte antivirale middels (remdesivir, hidroksichlorokien, lopinavir en interferon β 1a) wat deur die WGO gerapporteer is, het geen effek op algehele sterfte-aanvang van ventilasie en duur van hospitaalverblyf opgemerk nie [14]. 'n Onlangse subgroepontledings het voorgestel dat vroeë glukokortikoïedgebruik by pasiënte met merkbaar verhoogde C-reaktiewe proteïenvlakke (≥20 mg/dL) geassosieer word met 'n beduidende vermindering in mortaliteit of meganiese ventilasie, terwyl glukokortikoïedbehandeling by pasiënte met laer C-reaktiewe proteïenvlakke was geassosieer met slegter uitkomste [15]. Soos die SARS-CoV-2-pandemie voortduur, is daar 'n dringende behoefte om doeltreffende terapeutiese middels te ontwikkel om verdere verspreiding te beperk. Vroeë pogings om doeltreffende terapeutiese middels vir COVID-19 te identifiseer, het hoofsaaklik gefokus op pogings tot herbestemming van geneesmiddels waarin bestaande klinies gevorderde of bemarkde middels gekeur word vir antivirale aktiwiteit teen SARS-CoV-2 in vitro in sellulêre infeksiestelsels. Terwyl sulke skerms intrige treffers opgelewer het, het vrae ontstaan ​​oor die fisiologiese en patologiese relevansie van die infeksie van onsterflike sellyne afkomstig van nie-pulmonêre of gastroïntestinale oorsprong. Spesifieke vrae het ontstaan ​​oor die meganismes van virale aanhegting en toetrede tot menslike selle wat kan verskil in selle van verskillende weefseloorspronge. Daarbenewens kan siftingssellyne beperkte intrasellulêre masjinerie hê, soos kataboliserende ensieme, wat 'n sleutelkomponent van die primêre sel van infeksie by menslike pasiënte is. Dit is dus van kardinale belang om ons begrip van die sleutelmolekulêre en sellulêre interaksies wat betrokke is by SARS-CoV-2-infeksie te verbeter ten einde toepaslike in vitro-instrumente te ontwikkel om huidige en toekomstige geneesmiddelontdekkingspogings te ondersteun.

    Omvang/vorige resensies

    Die doel van hierdie artikel is om sleutelaspekte van SARS-CoV-2-biologie te hersien, insluitend determinante van virus-toetrede tot veelvuldige sellyne en stelsels wat toelaatbaar is vir virusgroei, weefseltropisme en gasheergene wat virale toetrede, voortplanting en invoer van nukleotiedprogeneesmiddels beïnvloed en omskakeling vir SARS-CoV-2, met die doel om dwelmontdekkingspogings te fasiliteer en moontlik te maak.

    Vir 'n meer omvattende oorsig van toegangsmeganismes en proteaseverwerking in koronavirusse, word die leser gerig na ander onlangse artikels [16-19]. Uitgebreide resensies is beskikbaar oor MERS-CoV [20], SARS-CoV [21,22] en SARS-CoV-2[19] inhibeerders. Ons bespreek SARS-CoV-2 hergebruik skerms in die "Toetredemeganismes en proteases" afdeling.

    Toetredemeganismes en proteases

    Tot op hede het aanvanklike sifting om SARS-CoV-2 antivirale middels te identifiseer grootliks gebruik gemaak van die Vero E6 Afrikaanse groenaap niersellyn as die gasheersel vir sitopatiese effek (CPE) inhibisietoetse. Benewens die gebrek aan uitdrukking van angiotensienomskakelende ensiem 2 (ACE2) en TMPRSS2, is intrinsieke nie-spesifieke endositiese virale opnamemeganismes verantwoordelik vir virale toetrede in Vero E6 en 'n verskeidenheid ander seltipes [23-26]. Daar is dus gevind dat 'n wye verskeidenheid molekules wat endosomale-lisosomale rypwording en outofagie-bane moduleer, kragtige antivirale aktiwiteit in Vero E6-selle toon wat moontlik nie na primêre longepiteelselle vertaal nie. Dit laat die moontlikheid ontstaan ​​dat die antivirale inhibisie wat deur baie van hierdie verbindings teen SARS-CoV-2 in Vero E6-skerms vertoon word, 'n in vitro-aktiwiteit kan wees wat spesifiek is vir hoogs endositiese selle en moontlik nie relevant of vertaalbaar is as SARS-CoV-2-terapeutika nie. Soos hieronder verder uitgebrei, is gedemonstreer dat die SARS-CoV-2-virus virale RNA direk oor die plasmamembraan lewer sonder beduidende betrokkenheid van endositiese opname.

    Infeksie van longepiteelselle van soogdiere deur SARS-CoV-2, sowel as deur ander koronavirusse, begin met die binding van die virus deur sy piekproteïen aan 'n spesifieke reseptor op die seloppervlak. Die sellulêre reseptor vir SARS-CoV-2, en vir die verwante virus SARS-CoV, is menslike ACE2 [16,27,28], wat uitgedruk word op epiteelselle van die long en ingewande, en tot 'n mindere mate, in die nier-, hart-, vet- en beide manlike en vroulike voortplantingsweefsels [29-35]. Binding aan die reseptor word gevolg deur aktivering van die piekproteïen deur proteolitiese splitsing deur 'n gasheerprotease naby die aansluiting tussen sy S1- en S2-domeine [17,36]. Invoeging van die nuut vrygemaakte S2-domein N-terminus in die selmembraan lei tot samesmelting van die virale en sellulêre membrane, wat lei tot oordrag van die virale RNA in die gasheersel sitoplasma waar virale replikasie kan plaasvind [17,36].

    Terwyl die stappe wat hierbo uiteengesit word as noodsaaklik beskou word vir infeksie van gasheerselle deur koronavirusse, laat hierdie beskrywing sleutelaspekte van die virale toegangsproses weg, naamlik die aard van die gasheerprotease(s) wat verantwoordelik is vir die aktivering (of priming) van die piekproteïen vir samesmelting en die sellulêre ligging van die samesmeltingsgebeurtenis self. Werk aan veelvuldige koronavirusse oor die afgelope 20 jaar, en grootliks bevestig vir SARS-CoV-2 binne die afgelope paar maande, toon dat koronavirusse gasheerselle binnedring deur 1 van 2 verskillende weë: (i) die seloppervlakweg na aktivering deur serienproteases soos TMPRSS2 of (ii) die endositiese pad binne die endosomale-lisosomale kompartemente insluitend verwerking deur lisosomale katepsiene (Fig 1) [16-18]. 'N Nuwe studie voer aan dat koronavirusse 'n lisosomale eksositose-weg vir vrystelling gebruik [37]. Die bydrae van elke pad in 'n gegewe seltipe hang grootliks af van die uitdrukking van proteases, veral TMPRSS2. Wanneer TMPRSS2 (of ander serienproteases soos TMPRSS4 of menslike lugweg tripsienagtige protease [HAT]) uitgedruk word, word die vroeë toegangsweg verkies, terwyl die virus in die afwesigheid van hierdie protease staatmaak op die laat pad wat endositose en aktivering behels deur cathepsin L (CTSL) [27,38].

    Virale pelspykerproteïen bind aan ACE2, en in sommige gevalle, miskien NRP1, op responsiewe selle. Viruspiekproteïen word óf verwerk deur TMPRSS2 en ander serienproteases wat seloppervlaktoetrede vergemaklik, óf geëndositoseer in endosome waar piek deur CTSL in die lisosoom verwerk word. Virale RNA vrygestel vanaf TMPRSS2-gemedieerde toetrede of endosoomvrystelling word as gedeeltelike en volledige genoomkopieë gerepliseer en in die ER vertaal om nuwe SARS-CoV-2 virions te vorm. Verwerking van piekproteïen deur furien vind plaas voor die vrystelling van nuwe virusse in die ekstrasellulêre omgewing. ACE2, angiotensienomskakelende ensiem 2 CTSL, katepsien L ER, endoplasmiese retikulum NRP1, Neuropilien 1 SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    'N Begrip van watter virale toegangsweg algemeen voorkom in spesifieke seltipes is uiters belangrik, nie net om koronavirusbiologie te verstaan ​​nie, maar ook vir die korrekte interpretasie van selgebaseerde genetiese en kleinmolekuleskerms. Tot op hede het skerms wat daarop gemik is om bemarkde of klinies gevorderde middels te identifiseer vir potensiële hergebruik vir die behandeling van COVID-19 staatgemaak op die gebruik van onsterflike nierepiteel-sellyne soos Vero E6 (Afrika-groen aap) en 293T (embrioniese mens) [39 –42]. Sulke skerms het verskeie treffers opgelewer wat bekend is dat dit endositose of endosomale rypwording blokkeer of benadeel [39,40,42,43]. Dit is nie verbasend nie aangesien Vero E6- en 293T-selle nie die seloppervlakprotease TMPRSS2 uitdruk nie, daarom is koronavirusinfeksie in hierdie selle afhanklik van die laat endositiese/kathepsien-gemedieerde toegangsweg. Dus, middels wat met hierdie pad inmeng, insluitend katepsien-inhibeerders, middels wat endosomale versuring voorkom (waarvan die katepsiene afhanklik is vir aktiwiteit), en inhibeerders van endosomale rypwording (bv. die PIKfyve-remmer apilimod) kan virale toetrede tot hierdie selle blokkeer [ 38,44,45]. Dit is belangrik dat heteroloë uitdrukking van TMPRSS2 in Vero E6- en HeLa-selle die farmakologiese doeltreffendheid van katepsien-inhibeerders ophef deur die seloppervlak virale toegangsweg [38,46] moontlik te maak. Net so maak pre-aktivering van virus met die serienprotease tripsien ook die seloppervlak-toegangsweg moontlik, selfs in selle wat nie TMPRSS2 uitdruk nie [45,47,48]. In ooreenstemming met hierdie waarnemings, is selle wat TMPRSS2 endogeen uitdruk, insluitend selle afkomstig van die long- en derm-epiteel, ook vatbaar vir die toegang tot koronavirus via die seloppervlakpad. In hierdie selle is katepsien-inhibeerders slegs gedeeltelik effektief, TMPRSS2-inhibeerders soos camostat en nafamostat is aansienlik meer effektief, en 'n kombinasie van die 2 tipes protease-inhibeerders is maksimaal effektief in die voorkoming van koronavirusinfeksie [27,38,49-52]. Hierdie data dui daarop dat koronavirusse hierdie selle via albei weë kan binnedring, met 'n voorkeur vir die seloppervlakbaan.

    Ten spyte van hierdie sellulêre data, is dit steeds 'n kwessie van debat of individuele inhibisie van die seloppervlak of endositiese weë terapeutiese voordeel teen COVID-19 sal bied. SARS-CoV-2 infekteer 'n wye verskeidenheid seltipes [46,53,54], hoewel dit redelik lyk om te vermoed dat epiteelselle van die respiratoriese en spysverteringskanale van die eerstes is wat die virus in 'n kliniese omgewing teëkom. In vivo-studies met die verwante koronavirus SARS-CoV ondersteun die idee dat inhibeerders van die seloppervlaktoegangsweg ten minste gedeeltelik beskermend kan wees. Genetiese [55] en farmakologiese [56] blokkade van TMPRSS2 het gedeeltelike beskerming teen SARS-CoV in muismodelle van infeksie verskaf.In laasgenoemde studie het die breë katepsien-inhibeerder SMDC256160 geen voordeel gelewer nie, hetsy alleen of in kombinasie met camostat. Verdere studies sal vereis word, veral in SARS-CoV-2-infeksiemodelle, om die bydrae van elke virale toegangsweg tot COVID-19-patologie verder te definieer. Daar is veral onlangs voorgestel dat SARS-CoV-2-toegangsblokkade inhibisie van beide die seloppervlak en endositiese weë kan vereis [57].

    TMPRSS2 en furien in seloppervlakinskrywing

    Die TMPRSS2-geen kodeer vir 'n tipe II transmembraan-serienprotease (TTSP) wat oorspronklik meer as 2 dekades gelede ontdek is [58] en daarna getoon word dat dit deur androgeen gereguleer word en hoogs uitgedruk word in prostaat-epiteel [59]. TMPRSS2 is gelokaliseer na die plasmamembraan via 'n enkeldeurlaat transmembraanheliks naby sy N-terminus. Die ensiem kan ook outoklowing ondergaan by Arg255 wat 'n 32-kDa afgeskei vorm van die protease lewer [60]. Muise wat die TMPRSS2-gekodeerde protease (TMPRSS2[-/-]) ontbreek, toon geen waarneembare abnormale fenotipe nie, wat daarop dui dat die protease nie 'n noodsaaklike nie-oortollige funksie dien nie [61], 'n waarneming wat latere ondersoek na TMPRSS2 se rol in muismodelle van koronavirus moontlik gemaak het. siekte.

    Ons huidige begrip van die verband tussen TMPRSS2 en SARS-CoV-2-infeksie het vinnige vordering gesien in die eerste paar maande sedert die opkoms van SARS-CoV-2. Baie van hierdie vooruitgang is gebou op meer as 'n dekade van studies wat begin het vanaf die eerste bewyse dat TMPRSS2-uitdrukking korreleer met SARS-CoV-infeksie in longweefsel en lei tot aktivering van die piekproteïen, wat membraanfusie moontlik maak [62]. Studies wat selsamesmeltingstoetse gebruik, het aangedui dat TMPRSS2-uitdrukking op teikenselle, eerder as virusproduserende selle, krities is vir piekproteïenaktivering, wat ruimtelike en tydelike beperkings op TMPRSS2-aksie by die plasmamembraan ondersteun tydens die vroeë stappe van seloppervlak-virale toetrede. Twee plekke van splitsing op SARS-CoV-punt—R667, geleë by die S1/S2-splytingsplek, en R797, geleë by die S2'-splitsingsplek—is voorgestel as relevante plekke van werking van TMPRSS2, sowel as ander serienproteases wat die piekproteïen in selkultuur kan voorberei, soos tripsien en HAT. Mutasie van R797 by S2' ophef TMPRSS2-afhanklike aktivering van die piekproteïen, en hierdie terrein is hoogs behoue ​​oor koronavirusse, wat daarop dui dat dit funksioneel relevant is vir TMPRSS2-afhanklike seloppervlaktoetrede in SARS-CoV-2.

    Die pro-proteïen convertase furien is lank reeds bekend om 'n rol te speel in virale toetrede, en onlangse data ondersteun 'n rol van hierdie ensiem, spesifiek in TMPRSS2-gemedieerde seloppervlak toetrede. Verwerking van die piekproteïen deur furien by die S1/S2-splitsingsplek word vermoedelik plaasvind na virale replikasie in die endoplasmiese retikulum Golgi-tussenkompartement (ERGIC) [63]. Om die komplekse rol van furien in virale samesmelting en toetrede te onderstreep, is die S1/S2-furiensplitsingsplek teenwoordig in SARS-CoV-2 en MERS, maar nie in SARS-CoV nie [64]. Verder gaan die SARS-CoV-2-furien S1/S2-plek vinnig verlore met verbygaan in Vero E6-selle [65], en 'n ligter SARS-CoV-2-stam-isolaat ZJ01 het ook hierdie plek verloor [30]. Furien kan ook die piekproteïen klief by die samesmelting wat die S2'-plek aktiveer tydens biogenese in MERS-CoV en SARS-CoV [30,36,65-67]. In die algemeen ondersteun huidige beskikbare data 'n geloofwaardige model vir SARS-CoV-2-puntverwerking waarin furien-gemedieerde splitsing by die S1/S2-plek die aarproteïen tydens biogenese pre-primeer, wat daaropvolgende aktivering vir membraanfusie deur 'n tweede splitsingsgebeurtenis by S2 fasiliteer ' deur TMPRSS2 na aanleiding van ACE2-reseptorbinding op teikenselle [46,50].

    Daar is redelik onlangs gewys dat die VEGF-A-reseptor Neuropilin 1 (NRP1) 'n gasheerfaktorreseptor is vir furien-gesplitste SARS-CoV-2-puntpeptied [68-71]. Blokkade van NRP1 verminder aansteeklikheid en toegang, en verandering van die furienplek lei tot verlies van NRP1-afhanklikheid. Uitwissing van die furienpeptied in piek lei tot verminderde replikasie in Calu3, verhoogde replikasie en verbeterde fiksheid in Vero E6, en verswakte siekte in 'n hamsterpatogenese-siektemodel [70].

    Meer onlangs is in vivo bewyse vir die relevansie van TMPRSS2 in muismodelle vir SARS-CoV en MERS-CoV infeksie verskaf van TMPRSS2(-/-) muise wat verminderde siekte erns toon [55]. TMPRSS2 shRNA knockdown studies verskaf bewyse vir 'n spesifieke en nie-oortollige rol in SARS-CoV-2 infeksie [72].

    Lysosomale katepsiene en endositose

    Terwyl die bewyse wat hierbo uiteengesit is, die rol van TMPRSS2 en ander serienproteases in die aktivering van die koronavirus-pikproteïen vir plasmamembraanfusie duidelik maak, het in vitro-studies wat verskeie selkultuurstelsels gebruik, 'n alternatiewe endosomale-lisosomale pad vir virale toegang getoon. Vroeë studies het die sensitiwiteit van SARS-CoV-replikasie in selkultuur vir lisosomotropiese middels getoon, gevolg deur bykomende studies wat die rol van katepsiene vir die verwerking en aktivering van die piek vir membraanfusie dissekteer. Die beskikbaarheid van hoogs kragtige en spesifieke klein-molekule katepsien inhibeerders was die sleutel tot die dissekteer van die molekulêre gebeure betrokke by hierdie pad en die toeskryf van die relevante funksionele effek aan CTSL, 1 van 11 katepsiene in mense [73,74]. Bykomende studies het die plek van CTSL-splitsing op SARS-CoV-puntproteïen gelokaliseer na T678, 11 aminosure karboksielterminus tot R667 van die furiensplitsingsplek. Die waarneming dat die CTSL-splitsingsplek 120 aminosure stroomop van die S2'-plek geleë is wat deur TMPRSS2 geklief is, ontbloot 'n gaping in ons begrip van die molekulêre gebeure betrokke by die endosomale toegangsweg. Vorige studies het die moontlikheid voorgestel van 'n ander protease wat by S2' in die lae pH-omgewing van endosome/lysosome kan klief om die membraansamesmeltingspotensiaal van die piek [36] ten volle te aktiveer, of alternatiewelik verskille in lipiedsamestelling tussen plasmamembrane en endosomale/ lisosomale membrane kan laasgenoemde meer vatbaar maak vir virale samesmelting [75]. Ten spyte van hierdie teenstrydigheid in ons huidige begrip van endositiese virale toetrede, is dit duidelik dat koronavirusse in die algemeen, en SARS-CoV-2 in die besonder, in staat is om sterk infeksie te bewerkstellig deur endosomale toetrede in algemeen gebruikte in vitro selkultuurstelsels.

    Sellyn tropisme/uitdrukking

    Met die kompleksiteit van veelvuldige toegangsmeganismes van SARS-CoV-2, is seleksie van optimale sellyn(e) vir samestellingevaluering en sifting noodsaaklik, veral in studies wat soek na breë antivirale werkingsmeganismes buite die inhibisie van die virale nie-strukturele proteïene. Vir hierdie doel is studies aangemeld om die sellulêre tropisme van die virus beter te verstaan. 'n Vesikulêre Stomatitis Virus (VSV) pseudotipe virus wat SARS-CoV-2 piekproteïen of SARS-CoV piekproteïen dra en 'n paneel van goed gekarakteriseerde menslike en dierlike sellyne is gebruik om die breër tropisme van die virus te bepaal [46]. Die spektrum van sellyne wat vatbaar is vir virusinfeksie was soortgelyk vir SARS-CoV en SARS-CoV-2 piekproteïen met inskrywing ondersteun in A549, BEAS-2B, Calu-3, H1299, 293T, Huh7, Caco-2, Vero E6, en MDCK2 seltipes [27]. Bykomende pogings om virale tropisme te verstaan, sluit in die monitering van die aansteeklikheid van virus vir 120 uur met 0.1 veelvoud van infeksie (MOI) van SARS-CoV-2 HKU-001a oor 'n paneel van 9 menslike en 11 nie-menslike sellyne [53]. Soortgelyk aan die resultate wat met 'n pseudotipe virus waargeneem is, is die sterkste infeksie onder die menslike sellyne waargeneem vir Calu-3 (pulmonêre) en Caco-2 (derm) selle met infeksie ook waargeneem in Huh7 (lewer), 293T (nier) , en tot 'n mindere mate, U251 (neuronale) selle. Onder die 11 seltipes wat in die studie toelaatbaar gevind is vir infeksie, is CPE slegs 120 uur na infeksie waargeneem in Vero E6 en FRhK4 (rhesus-nier), met skade wat selronding, loslating, degenerasie en sinsitiumvorming insluit. Selfs tot 7 dae na infeksie is CPE nie in Calu-3-, Caco 2-, LLCMK2-, PK-15- en RK-13-selle met SARS-CoV-2 waargeneem nie.

    By 'n hoër MOI van een het 'n studie van proteomika kinetiese veranderinge op infeksie beide virale replikasie en CPE in Caco-2-selle getoon [76]. Deur proteïenuitdrukkingsvlakke te monitor, het die skrywers van hierdie studie waargeneem dat infeksie lei tot die hervorming van sentrale sellulêre weë, soos translasie, splitsing, koolstofmetabolisme en nukleïensuurmetabolisme. Hierdie toets is gewysig deur die MOI van 1 tot 0.01 te verlaag en die inkubasietyd van 24 tot 48 uur te verhoog om voorsiening te maak vir verskeie siklusse van virale replikasie om te skerm vir antivirale middels in 'n hoë-inhoud beelding toets [77]. Uit 'n skerm van 5 632 verbindings wat meer as 3 400 kliniese kandidate insluit, het die skrywers 6 verbindings uitgelig wat voorheen gerapporteer is as aktief teen SARS-CoV-2, SARS-CoV of MERS in antivirale toetse in Vero E6, Calu-3, of BHK21 (hamster nier fibroblast) selle, met die patroon van inhibisie wat meer ooreenstem met resultate in menslike Calu-3 selle as in niemenslike Vero E6 en BHK21 selle. Byvoorbeeld, camostat en nafamostat, inhibeerders van TMPRSS2, wat 'n rol speel in die seloppervlakweg vir virale sellulêre toetrede, is gemeet as 100 keer sterker teen SARS-CoV-2 in Caco-2-selle as in Vero E6-selle. Verbindings soos remdesivir, lopinavir en meflokien was egter relatief konsekwent oor seltipes.

    Om die verskillende meganismes wat betrokke is by SARS-CoV-2-toetrede en -infeksie verder te omlyn, het Dittmar en kollegas 'n hoë-inhoud beeldtoetsing toegepas om die antivirale aktiwiteit van 'n paneel van ongeveer 3 000 verbindings te vergelyk [39]. Minder as 1% infeksie is in verskeie seltipes waargeneem, insluitend A549, Calu-1, Huh7, HepG2, HaCaT, IMR90, NCI-H292, CFBE41o en U2OS selle, maar sterk infeksie is egter waargeneem in die menslike hepatosietsellyn Huh7.5 , long-afgeleide Calu-3-selle, en Vero CCL81-selle. Onder die 3 seltipes is waargeneem dat verbindings met verskillende werkingsmeganismes veranderlike antivirale aktiwiteit het. Byvoorbeeld, inhibeerders van endosomale toetrede, soos die katepsien inhibeerder Z-FA-FMK en PIKfyve inhibeerder apilimod, was aktief in Huh7.5 en Vero E6 selle maar nie Calu-3 selle nie. Daarenteen was camostat, 'n inhibeerder van die plasmamembraanprotease TMPRSS2, aktief in Calu-3-selle, maar nie Huh7.5- en Vero E6-selle nie, wat die belangrikheid daarvan beklemtoon om die vertaalbaarheid van 'n sellulêre model van infeksie te verstaan.

    Virale tropisme van SARS-CoV-2 vir verskeie seltipes weerspieël waarskynlik differensiële uitdrukking van sleutelgasheerproteïene wat betrokke is by virale aanhegting en toetrede. Tabel 1 som publiek beskikbare uitdrukkingsdata op vir die SARS-CoV-2 sellulêre reseptor ACE2 en vir 5 proteases betrokke by virale samesmelting en toetrede (furien, TMPRSS2, CTSL, elastase en tripsien). Terwyl CTSL in alle ondersoeke lyne uitgedruk word, verskil ACE2- en TMPRSS2-vlakke, wat die gebruik van heteroloë uitdrukking van hierdie gene in vorige studies wat Vero E6 en ander sellyne betrek het, verduidelik.

    Nukleotied/sy-invoer en omskakeling

    Sifting van sellyne vir die evaluering van nukleotied-progeneesmiddels en nukleosiede as inhibeerders van virale RNA-afhanklike RNA-polimerase (RdRp) moet hul vermoë oorweeg om verbindings in te voer en om te skakel na aktiewe nukleosiedtrifosfaat (NTP) metaboliete [78]. Remdesivir [79–81] is 'n fosforamidaatprotiedmiddel [82] wat invoer en omskakeling in gasheerselle vereis om die replikasie noodsaaklike SARS-CoV-2 RdRp te inhibeer.

    Sellulêre opname van gemodifiseerde nukleosiede hang grootliks af van uitdrukking van konsentratiewe membraanvervoerders (cNT's) of ekwilibratiewe / fasiliterende membraanvervoerders (ENT's) [83,84]. Intrasellulêre omskakeling na nukleosiede na nukleotiede word bemiddel deur sellulêre kinase-fosforilering, en gebrekkige uitdrukking kan antivirale sterkte verminder [39,85,86].

    Sommige voorgeneesmiddels vereis uitdrukking en ensiematiese omskakeling deur esterases en lisosomale katepsien A.

    Ons het dus 5 sellyne getoets vir die vermoë om adenosien ribonukleosiede MK-0608 en GS-441524 (moedernukleosied van remdesivir) te fosforileer in vergelyking met remdesivir progeneesmiddel GS-5734 en gedemonstreer dat gasheerselle differensiële vermoë vir geneesmiddelaktivering het (Fig 2). Hepatosiet-sellyne HepG2 en Huh7 het aansienlik beter aktivering van monofosfaat-fosforamidiet-progeneesmiddel GS-5734 getoon as Vero E6-nierselle van Afrika-groenaap, Crandell-Rees katnier (CRFK)-selle, of menslike Calu-3-longselle as gevolg van verhoogde uitdrukking in katepsien A hepatosiete in vergelyking met ekstrahepatiese selle [87].

    Die 24-uur intrasellulêre NTP-konsentrasie van adenosien antivirale middel lei (MK-0608, Gilead Sciences remdesivir prodrug GS-5734, en Gilead Sciences remdesivir ouer nukleosied GS-441524) na inkubasie by 1 μM sel ap met Verparent defekte illustreer tot omskakeling na die aktiewe trifosfaatvorm in vergelyking met ander sellyne wat bestudeer is. NTP, nukleosiedtrifosfaat.

    Primêre selle/modelstelsels

    Sellyne bied 'n vinnige metode om data op 'n hoë-deurset manier te skerm en in te samel, maar daar is beperkings in hul vertaalbaarheid. Primêre selkultuurstelsels kan relevante sellulêre fisiologie meer akkuraat modelleer. Insig in die SARS-CoV-2-verloop van infeksie is verkry deur gebruik te maak van enkelselvolgordebepalingsresultate van die Human Atlas (nie-geïnfekteerde individue) om transkripsionele uitdrukking van virale reseptore te identifiseer. Proteïenkleuring van hierdie reseptore is 'n beter aanduiding van werklike oppervlakuitdrukking, maar sulke data is tans yl. Ontleding van RNA van besmette pasiëntweefselmonsters verskaf 'n momentopname in tyd waarvoor ons dikwels nie weet wat die tydsberekening van die aanvang van infeksie is nie. Primêre in vitro modelstelsels maak voorsiening vir die toetsing van hipoteses in menslike weefsels en stel ons in staat om tydelike inligting oor geen/proteïenuitdrukking in te samel.

    Baie studies het hoë vlakke van ACE2 en TMPRSS2 mede-uitdrukking in long AT2 selle gerapporteer deur gebruik te maak van data van openbare databasisse en longreseksies [29,88,89]. Long lug-vloeistof koppelvlak (ALI) kulture afkomstig van verskeie streke van die long van gesonde individue het die grootste mede-uitdrukking van ACE2 en TMPRSS2 in verbygaande sekretoriese selle van die brongiale takke getoon. Daar is ook getoon dat daar driedubbele uitdrukking van ACE2, TMPRSS2 en FURIN is wanneer daar oor longweefsel gekyk word, met 'n voorkeur vir mede-uitdrukking van ten minste 2 van die reseptore [29]. In 'n onlangse studie is enkelsel (sc) RNA-volgordebepaling (seq) gebruik om virale RNA op 'n per sel basis oor 'n tydsverloop van geïnfekteerde brongiale epiteelselle (ALI-model) te volg en gevind dat die primêre teiken van SARS-CoV- 2 in die boonste lugweg is gesilieerde longselle, die selle wat verantwoordelik is vir die verwydering van slym en vreemde deeltjies uit die long. Soos infeksie vorder, het die virus basale en klubselle mettertyd besmet, wat hulle met behulp van elektronmikroskopie bevestig het. Daarbenewens is 'n opregulering waargeneem van tipe I- en tipe III-interferone (IFN'e), IL-6, en die chemokiene CXCL9, CXCL10 en CXCL11 (belangrik vir werwing van T/NK-selle) in geïnfekteerde selle en breë interferon-gestimuleerde geen (ISG) opregulering in besmette selle sowel as bystanderselle [90]. Terwyl hierdie enkelselvolgorde- en enkelkernvolgordebepalingsdata baie detail verskaf oor die uitdrukking van RNA-transkripsies, bevestig 'n ouer studie die samekleuring van ACE2 en TMPRSS2-proteïen in longafdelings deur immunohistochemie [91].

    Daarteenoor het ander gerapporteer dat neusepiteelselle die hoogste uitdrukking van ACE2 in die respiratoriese kanaal het. Daarbenewens, deur publieke beskikbare databasisse te fynkam, is gevind dat die boonste lugweg die hoogste uitdrukking van ACE2-gekorreleerde gene het, en gene met aangebore immuunfunksie is buite verhouding verteenwoordig [92]. Hulle het spesifiek gerapporteer dat die neusbekerselle die hoogste uitdrukking van hierdie immuungene het.

    Terwyl long-ALI-kulture 'n meer fisiologies relevante primêre model verteenwoordig as gevolg van die blootstelling van die apikale membraan aan lug, is longorganoïede nuttig om SARS-CoV-2 te bestudeer. Soortgelyk aan long ALI-kulture, word longorganoïede afgelei van basale stamselle van die long (volwasse) of geïnduseerde pluripotente stamselle (embrioniese) en word in 'n 3D-ondersteunende matriks gegroei [93]. 'n Voordeel van die gebruik van organoïede kulture is dat die stamselle voortdurend gepropageer kan word en dan terminaal gedifferensieer kan word in meer volwasse seltipes van die epiteel, wat voorsiening maak vir vinniger uitbreiding en differensiasie van primêre selle tot getalle hoog genoeg om hoër deurset sifting te ondersteun in vergelyking met ALI kulture , wat 21 tot 28 dae neem om volwassenheid te bereik. Een groep het berig dat hulle longorganoïede gebruik het om die Food and Drug Administration (FDA)-goedgekeurde Prestwick-medisyne-biblioteek suksesvol te skerm met 'n luciferase-uitdrukking SARS-CoV-2 pseudovirus [94]. Daarbenewens het hulle 3 uit 4 treffers in hPSC-afgeleide kolonorganoïede bevestig.

    Alhoewel die slymvliesoppervlak waarskynlik die toegangsplek vir SARS-CoV-2 is, het ondersoek van ander weefsels aan die lig gebring dat hoë vlakke van ACE2/TMPRSS2 mede-uitdrukking teenwoordig is in die enterosiete van die ileum en kolon, en die ingewande kan hoër uitdrukking hê van hierdie reseptore as die long [30,31]. Die waarneming dat sommige COVID-19-pasiënte gastro-intestinale nood het voor die ontwikkeling van respiratoriese simptome sowel as tydens siekteprogressie, kan 'n fekale-orale roete van oordrag [95,96] voorstel wat dit ondersteun, is onlangs hersien [97,98]. Net so is gastroïntestinale infeksie/nood voorheen waargeneem vir die nou verwante SARS- en MERS-koronavirusse [99,100]. Die transkripsiedata word ondersteun deur endoskopiese monsters van 'n COVID-19-pasiënt (slukderm, maag, duodenum en rektum) wat kleuring van die ACE2-reseptor in die gastro-intestinale epiteelselle vertoon het, maar nie in die slukderm-epiteel nie [101].

    Studies het die waargenome gastroïntestinale fenotipe gekoppel aan die uitdrukking van ACE2+/TMPRSS2+-selle in die ingewande, met die hoogste uitdrukkingsvlakke in die ileum, gevolg deur die kolon. Meer afdoende was infeksie van intestinale organoïede met SARS-CoV-2 suksesvol, en hulle het replikasie van die virus ondersteun met enterosiete as die primêre seltipe wat geteiken is [31]. Interessant genoeg is daar waargeneem dat tipe III IFN, maar nie tipe I IFN nie, opgereguleer is na infeksie van kolonoïede met SARS-CoV-2, wat daarop dui dat hierdie sitokien 'n beskermende rol in hierdie infeksie kan speel [102].

    Die intestinale organoïde model het verdere karakterisering van virale toetrede moontlik gemaak. Met behulp van 'n VSV-SARS-CoV-2-pseudovirus (wat die SARS-CoV-2-puntproteïen uitdruk), is gedemonstreer dat TMPRSS2 en TMPRSS4 beide nodig is vir fusogeniese toetrede tot duodenale enterosiete [103]. Daarbenewens het die skrywers voorkeurinfeksie van die apikale membraan van die enterosiete waargeneem, en beeldvorming het gepolariseerde virale samestelling en vrystelling van die apikale membraan voorgestel. Hierdie data demonstreer hoe data van primêre selle/weefsel verder gedissekteer kan word wanneer dit in 'n fisiologies relevante primêre modelstelsel gerepliseer word.Die gebruik van primêre long- en dermmodelstelsels blyk baie relevant te wees vir die studie vir SARS-CoV-2, aangesien dit reseptoruitdrukking en moontlik die fisiologiese response wat in vivo gesien word meer akkuraat herhaal.

    Daar moet kennis geneem word dat ander ex vivo-stelsels, soos weefseluitplantings, gebruik is om virale respiratoriese infeksies te bestudeer en waarskynlik gebruik kan word om SARS-CoV-2 te bestudeer. Multispesies in vivo-modelle word ook vinnig ontwikkel om gasheerreaksies op hierdie virus beter te verstaan. In vivo en ex vivo modelle wat onder ontwikkeling was of is, is onlangs hersien, insluitend muis-, fret-, hamster- en niemenslike primaatdiermodelle [104,105].

    Aangebore immuunselle

    Immuundisfunksie is omvattend gekenmerk in COVID-19 pasiënte, soos disregulering van T-selle, B-selle en aangebore immuunselle [106,107]. Spesifiek, verhoogde voorkoms en aktivering van aangebore immuunselle is waargeneem by COVID-19 pasiënte met ernstige siektes [108]. Interessant genoeg is daar gerapporteer dat daar beduidende morfologiese en funksionele verskille is in monosiete afkomstig van COVID-19-pasiënte in vergelyking met gesonde menslike skenkers [109]. Nadoodse ontledings van sekondêre limfoïede organe van COVID-19 pasiënte het die uitdrukking van ACE2 reseptor en die teenwoordigheid van SARS-CoV-2 nukleoproteïen in CD169+ makrofage bevestig [110]. Dit is egter onduidelik of SARS-CoV-2 kan besmet en repliseer in aangebore immuunselle.

    Verskillende grade van virale toetrede en replikasie is waargeneem in primêre aangebore immuunselle wat besmet is met SARS-CoV-1, MERS-CoV, HCoV-OC43 en HCoV 229E [111]. Minimale uitdrukking van sleutelreseptore wat benodig word vir SARS-CoV-2-toetrede, insluitend ACE2 en TMPRSS2 in aangebore immuunselle soos monosiete en makrofage, is onlangs in nie-menslike primate [112] en mense [30] aangemeld. Daarbenewens kan monosiete hoë vlakke van CD147 [113] uitdruk, 'n potensiële reseptor vir SARS-CoV-2-inskrywing [114].

    Twee onlangse publikasies het geïdentifiseer dat CD14+ primêre monosiete van gesonde menslike skenkers geredelik vatbaar is vir SARS-CoV-2-infeksie. Pontelli en kollegas het dit gedemonstreer deur primêre menslike monosiete ex vivo met SARS-CoV-2 te besmet en virale antigene en dsRNA-entiteite in geïnfekteerde selle te meet [115]. Hulle het aansienlike vermindering in virale toegang waargeneem wanneer monosiete in die teenwoordigheid van ammoniumchloried besmet is, wat daarop dui dat die endositiese pad waarskynlik belangrik is. Net so het Codo en kollegas infeksie van SARS-CoV-2 in primêre menslike monosiete waargeneem gebaseer op meting van virale transkripsies deur qPCR [116]. Verder het hulle opgemerk dat SARS-CoV-2-infeksie van monosiete lei tot induksie van glikolise en toename in transkripsievlakke van verskeie gene, insluitend die hoof virale ingangsreseptor ACE2.

    Gegewe die minimale uitdrukking van ACE2-reseptor in monosiete, is hierdie waarnemings nogal verrassend. Meer in-diepte virologiese ontledings van produktiewe replikasie in monosiete sal die waarnemings in hierdie 2 voorgenoemde publikasies aansienlik versterk. Verder is bykomende studies nodig om beter te verstaan ​​of (i) monosiete/makrofage aan SARS-CoV-2 blootgestel word via direkte infeksie via ACE2-binding of deur fagositose (ii) ACE2 geïnduseer word in geïnfekteerde monosiete en omstanderselle deur afskeiding van inflammatoriese bemiddelaars en (iii) uitdrukking van addisionele gasheerintreereseptore soos CD147 en Neuropilien-1 kan in monosiete uitgedruk word om infeksie op 'n ACE2-onafhanklike wyse te fasiliteer [69].

    Voortgesette evaluering van die vatbaarheid van aangebore immuunselle vir SARS-CoV-2 sal ons huidige begrip van SARS-CoV-2-gasheerinteraksies sowel as die immunopatogenese wat by COVID-19-pasiënte waargeneem word, aansienlik verbeter.

    Slotopmerkings

    Fenotipiese sifting om nuwe inhibeerders vir aansteeklike siektes te identifiseer is 'n duur en tydrowende poging. Die belangrikste besluite is die keuse van sellyn- of modelstelsels waarin die skerm uitgevoer moet word en die beskikbaarheid van relevante sekondêre skerms om irrelevante trefslae uit te skakel en dié van potensiële belang te prioritiseer. In hierdie verband moet die beoordeling van die antivirale sterkte vir SARS-CoV-2 virale replikasie die volgende sleuteloorwegings in ag neem. Uitdrukking van die ACE2-reseptor en sleutelgasheerproteases sal die aard van treffers wat geïdentifiseer is, beïnvloed [117]. Skerms in Vero E6-selle het middels geïdentifiseer wat die endositiese weg beïnvloed as antivirale aktiwiteit, maar blokkering van beide endositiese en seloppervlak virale toegangsweë kan nodig wees in die konteks van kliniese infeksie. Benewens die begrip van die virale toegangsweg(e) wat SARS-CoV-2 gebruik in die spesifieke seltipes wat vir sifting gebruik word, moet oorweging gegee word aan die mate van nukleotied-progeneesmiddelaktivering en -fosforilering wat in die in vitro-siftingstelsel waargeneem word, soos duidelik onlangs gedemonstreer [39]. Ontluikende modelstelsels insluitend ALI en organoïde kulture is belowende gasheermimetiese stelsels vir die evaluering van kandidate, alhoewel dit hul eie beperkings het. Ten slotte, die potensiële rol van aangebore immuunselle in infeksie is 'n bykomende belangrike oorweging. Die keuse van geskikte in vitro-modelstelsels wat veelvuldige aspekte van SARS-CoV-2-biologie weerspieël, sal noodsaaklik wees om sukses in huidige en toekomstige geneesmiddelontdekkingspogings te optimaliseer.


    Ondersteunende inligting

    S1 Fig. Filogenetiese analise van die SARS-CoV-2 isolate wat in hierdie studie gegenereer is.

    Filogenetiese analise van volgordes afgelei van die 14 SARS-CoV-2 P2-isolate, tesame met die SARS-CoV-2-volgordes van Alm et al. [26] wat virale diversiteit oor die WGO Europese Streek gedurende dieselfde tydraamwerk verteenwoordig. Wuhan/WH04/2020 (EPI_ISL_406801), wat aan klade 19B behoort, is as die buitegroep gekies. Die boom is gekleur op grond van SARS-CoV-2 Nextstrain klades, met sirkels wat die posisies van 14 SARS-CoV-2 isolate aandui wat in hierdie studie gegenereer is. Die skaalbalk dui die aantal nukleotiedvervangings per plek aan. SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S2 Fig. Karakterisering van geselekteerde SARS-CoV-2-isolate in Vero-E6-selle.

    (A) Vero-E6-selle is geïnfekteer met die aangeduide SARS-CoV-2-isolate teen 'n MOI van 0.01 PFU/sel. Supernatante is op die aangeduide tye na infeksie geoes, en SARS-CoV-2-titers is deur plaaktoets bepaal. Data verteenwoordig gemiddeldes en standaardafwykings van 3 onafhanklike eksperimente, met elke eksperiment uitgevoer met behulp van 1 individuele put. Die stippellyn wat die y-as kruis teen 10 2 PFU/mL dui die toets LoD aan. (B) AUC-waardes vir die virusreplikasiedata getoon in (A), genormaliseer na inokulumtiter van die onderskeie isolaat. Data verteenwoordig gemiddeldes en standaardafwykings van die 3 onafhanklike eksperimente. 'n 1-rigting ANOVA is uitgevoer op log2-getransformeerde data om te toets vir beduidende verskille tussen die individuele isolate (bl < 0,0001). Om te toets vir statistiese betekenisvolheid teen BavPat1, 'n ongepaarde t toets is gebruik op log2-getransformeerde data (**bl < 0,005 ***bl & lt 0.0005). Vir onderliggende data, sien S1 data. AUC, area onder die kromme LoD, limiet van opsporing MOI, veelheid van infeksie PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S3 Fig. Karakterisering en validering van primêre menslike BEpC kulture.

    (A) Tydens primêre menslike BEpC (skenker 1) differensiasie in 'n pseudostratifiseerde lugwegepiteel by die ALI, is TEER weekliks gemeet. Data verteenwoordig gemiddelde TEER-waardes en standaardafwykings van 3 onafhanklike putte op elke tydstip. (B) Gedifferensieerde BEpC's van skenker 1 is vasgestel en gekleur vir gesilieerde selle (β-tubulien siaan), stywe aansluitings (ZO-1 magenta) en kerne (DAPI blou). Skaalbalk verteenwoordig 25 μm. (C) Gedifferensieerde BEpC's van skenker 1 is vanaf die apikale kant met 6 000 PFU van elke SARS-CoV-2-isolaat besmet (sien Fig 2B). Op die aangeduide tye na infeksie is basolaterale monsters geoes, en virustiters is deur plaaktoets bepaal. Data verteenwoordig gemiddeldes en standaardafwykings van 2 onafhanklike herhalings. Die stippellyn wat die y-as kruis teen 10 2 PFU/mL dui die toets LoD aan. Vir onderliggende data, sien S1 Data. ALI, lug-vloeistof koppelvlak BEpC, brongiale epiteel sel LoD, limiet van opsporing PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2 TEER, transepiteel elektriese weerstand ZO-1, zona occludens proteïen 1.

    S4 Fig. Karakterisering van geselekteerde SARS-CoV-2-isolate in bykomende primêre menslike BEpC-skenkers.

    (A en C) Gedifferensieerde BEpC's van skenkers 2 (A) en 3 (C) is met 6 000 PFU van die aangeduide SARS-CoV-2-isolaat vanaf die apikale kant geïnfekteer. Op die aangeduide tye na infeksie is apikale spoelings geoes, en virustiters is deur plaaktoets bepaal. Data verteenwoordig gemiddeldes en standaardafwykings van 3 onafhanklike herhalings. Die stippellyne wat die y-asse kruis teen 10 2 PFU/mL dui die toets LoD aan. (B en D) AUC-waardes vir die virusreplikasiedata getoon in (A en C), genormaliseer na inokulumtiter van die onderskeie isolaat. Data verteenwoordig gemiddeldes en standaardafwykings van die 3 onafhanklike eksperimente. 'n 1-rigting ANOVA is uitgevoer op log2-getransformeerde data om te toets vir beduidende verskille tussen die individuele isolate (n.s. vir skenker 2) bl < 0,0001 vir skenker 3). Om te toets vir statistiese betekenisvolheid teen BavPat1 (D), 'n ongepaarde t toets is gebruik op log2-getransformeerde data (*bl & lt 0,05 **bl & lt 0,01). Let wel, aangesien BavPat1 'n onverklaarde verswakte fenotipe in BEpC's van skenker 2 (B) vertoon het, 'n ongepaarde t toets is gebruik op log2-getransformeerde data om te toets vir statistiese beduidendheid teenoor IMV3 (*bl & lt 0,05 **bl & lt 0,01). (E) Boxplot-voorstelling van die AUC-waardes vir die virusreplikasiedata van die 3 onafhanklike skenkers (data van B en D en Fig 2C), genormaliseer na inokulumtiter van die onderskeie isolaat en skenker. Getoon is mediaan en standaardafwyking. Die rooi driehoeke verteenwoordig data verkry vanaf skenker 1. Vir onderliggende data, sien S1 data. AUC, area onder die kromme BEpC, brongiale epiteelsel LoD, limiet van opsporing PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S5 Fig. Indirekte immunofluorescerende kleuring van SARS-CoV-2-geïnfekteerde selle en gesilieerde selle in BEpC's van skenker 2.

    Gedifferensieerde BEpC's van skenker 2 is vanaf die apikale kant met 6 000 PFU van die aangeduide SARS-CoV-2-isolaat besmet. Teen 72 uur na infeksie is selle gefixeer, gepermeabiliseer en gekleur vir die teenwoordigheid van besmette selle (dsRNA magenta) en gesilieerde selle (β-tubulien siaan). Kerne is met DAPI (blou) gekleur. Pyltjies dui mede-lokalisering aan. Skaalstawe verteenwoordig 50 μm vir die 20x-vergrotings en 8 μm vir die 100x-vergrotings. Verteenwoordigende maksimum projeksie beelde van z-stapels van een eksperiment word getoon. BEpC, brongiale epiteelsel PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S6 Fig. Indirekte immunofluorescerende kleuring van SARS-CoV-2-geïnfekteerde selle en bekerselle in BEpC's van skenker 2.

    Gedifferensieerde BEpC's van skenker 2 is vanaf die apikale kant met 6 000 PFU van die aangeduide SARS-CoV-2-isolaat besmet. Teen 72 uur na infeksie is selle gefixeer, gepermeabiliseer en gekleur vir die teenwoordigheid van besmette selle (dsRNA magenta) en bekerselle (MUC5AC siaan). Kerne is met DAPI (blou) gekleur. Pyltjies dui mede-lokalisering aan. Skaalstawe verteenwoordig 50 μm vir die 20x-vergrotings en 8 μm vir die 100x-vergrotings. Verteenwoordigende maksimum projeksie beelde van z-stapels van een eksperiment word getoon. BEpC, brongiale epiteelsel PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S7 Fig. Indirekte immunofluorescerende kleuring van SARS-CoV-2-geïnfekteerde selle, klubselle en basale selle in BEpC's van skenker 2.

    Gedifferensieerde BEpC's van skenker 2 is vanaf die apikale kant met 6 000 PFU van die aangeduide SARS-CoV-2-isolaat besmet. Teen 72 uur na infeksie is selle gefixeer, gepermeabiliseer en gekleur vir die teenwoordigheid van besmette selle (dsRNA magenta), klubselle (uteroglobien siaan) en basale selle (P63 geel). Kerne is met DAPI (blou) gekleur. Pyltjies dui mede-lokalisering aan. Skaalstawe verteenwoordig 50 μm vir die 20x-vergrotings en 8 μm vir die 100x-vergrotings. Verteenwoordigende maksimum projeksie beelde van z-stapels van een eksperiment word getoon. BEpC, brongiale epiteelsel PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S8 Fig. Indirekte immunofluorescerende kleuring van SARS-CoV-2-geïnfekteerde selle en gesilieerde selle in BEpC's van skenker 3.

    Gedifferensieerde BEpC's van skenker 3 is vanaf die apikale kant met 6 000 PFU van die aangeduide SARS-CoV-2-isolaat besmet. Teen 72 uur na infeksie is selle gefixeer, gepermeabiliseer en gekleur vir die teenwoordigheid van besmette selle (dsRNA magenta) en gesilieerde selle (β-tubulien siaan). Kerne is met DAPI (blou) gekleur. Pyltjies dui mede-lokalisering aan. Skaalstawe verteenwoordig 50 μm vir die 20x-vergrotings en 8 μm vir die 100x-vergrotings. Verteenwoordigende maksimum projeksie beelde van z-stapels van een eksperiment word getoon. BEpC, brongiale epiteelsel PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S9 Fig. Indirekte immunofluorescerende kleuring van SARS-CoV-2-geïnfekteerde selle en bekerselle in BEpC's van skenker 3.

    Gedifferensieerde BEpC's van skenker 3 is vanaf die apikale kant met 6 000 PFU van die aangeduide SARS-CoV-2-isolaat besmet. Teen 72 uur na infeksie is selle gefixeer, gepermeabiliseer en gekleur vir die teenwoordigheid van besmette selle (dsRNA magenta) en bekerselle (MUC5AC siaan). Kerne is met DAPI (blou) gekleur. Pyltjies dui mede-lokalisering aan. Skaalstawe verteenwoordig 50 μm vir die 20x-vergrotings en 8 μm vir die 100x-vergrotings. Verteenwoordigende maksimum projeksie beelde van z-stapels van een eksperiment word getoon. BEpC, brongiale epiteelsel PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S10 Fig. Indirekte immunofluorescerende kleuring van SARS-CoV-2-geïnfekteerde selle, klubselle en basale selle in BEpC's van skenker 3.

    Gedifferensieerde BEpC's van skenker 3 is vanaf die apikale kant met 6 000 PFU van die aangeduide SARS-CoV-2-isolaat besmet. Teen 72 uur na infeksie is selle gefixeer, gepermeabiliseer en gekleur vir die teenwoordigheid van besmette selle (dsRNA magenta), klubselle (uteroglobien siaan) en basale selle (P63 geel). Kerne is met DAPI (blou) gekleur. Pyltjies dui mede-lokalisering aan. Skaalstawe verteenwoordig 50 μm vir die 20x-vergrotings en 8 μm vir die 100x-vergrotings. Verteenwoordigende maksimum projeksie beelde van z-stapels van een eksperiment word getoon. BEpC, brongiale epiteelsel PFU, plaakvormende eenheid SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S1 Tabel. Ct-waardes, en sukses/mislukking-uitkomste van virus-isolasiepogings, van 67 pasiëntmonsters wat PCR-positief was vir SARS-CoV-2.

    Ct, siklusdrempel SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S2 Tabel. SARS-CoV-2-volgordevariante geïdentifiseer deur NGS in pasiëntmateriaal en deurgang 2 van virusisolate.

    NGS, volgende generasie opeenvolging SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S3 Tabel. SARS-CoV-2-volgordevariante geïdentifiseer deur NGS in werkende voorraad (passasie 3) van virusisolate.

    NGS, volgende generasie opeenvolging SARS-CoV-2, Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2.

    S1 data. Individuele numeriese waardes onderliggend aan die opsommingsdata wat in die figuurpanele vertoon word.


    Bespreking

    Die vinnige wêreldwye pandemie van SARS-CoV-2 het reeds 'n groot bedreiging vir menslike gesondheid, maatskaplike gesondheidstelsel, wêreldekonomie en selfs die globale bestuur ingehou, en hierdie invloede kan waarskynlik vir 'n langer tyd voortduur. Ons moet die epidemiese logika van SARS-CoV-2 leer en die onbekende virusse wat deur wilde diere in die natuur gedra word vooraf bestudeer om vroeë waarskuwing te maak. Daar kan volgende keer 'n uitbreking wees wat deur ander soorte virusse veroorsaak word, behalwe vir SARS-CoV-2. Studie-ervarings en lesse oor verskillende virusse kan na mekaar verwys word.

    Voldoende begrip van die verskille van strukturele en nie-strukturele proteïene tussen SARS-CoV's en ander koronavirusse kan help met die ontwikkeling van terapeutiese middels vir SARS-CoV-2-infeksie. Die nie-strukturele proteïene van die koronavirusse wat mense kan besmet is relatief soortgelyk aan SARS-CoV-2 in struktuur. Behalwe S-proteïen, het die meeste van die strukturele proteïene, soos E-proteïen en M-proteïen, geen beduidende verskil in proteïenargitektuur tussen SARS-CoV-2 en ander bekende menslike CoV's getoon nie. Die S-proteïen van CoVs is verantwoordelik vir die binding van die gasheersel-oppervlakreseptor tydens gasheerseltoetrede. Verskillende CoV's herken verskillende seloppervlakreseptore. MERS-CoV's herken byvoorbeeld die dipeptidielpeptidase 4-reseptor. Nietemin herken SARS-CoV en SARS-CoV-2 die ACE2-reseptor. Dit kan die rede wees waarom verskillende CoV's verskillende gasheertoegangsmeganismes het. Daarbenewens het die SARS-CoV-2 RBD hoër hACE2-bindingsaffiniteit as SARS-CoV RBD, wat doeltreffende seltoegang ondersteun. Anders as SARS-CoV, word die toetrede van SARS-CoV-2 vooraf geaktiveer deur proproteïen-konvertase-furien, wat die afhanklikheid daarvan van teikenselproteases vir toetrede verminder. Die hoë hACE2-bindingsaffiniteit van die RBD en die furien-preaktivering van die piek laat SARS-CoV-2 toe om doeltreffende seltoetrede te handhaaf terwyl immuuntoesig ontduik word. Hierdie kenmerke kan bydra tot die wye verspreiding van die virus.

    Weens die beperkte kennis oor SARS-CoV-2 tans, is daar geen goedgekeurde terapeutiese middels of entstowwe beskikbaar vir die behandeling van COVID-19 nie. Namate die wêreldwye epidemie vererger, is effektiewe en veilige entstowwe, teenliggaampies en spesifieke anti-SARS-CoV-2-middels dringend nodig. Neutraliserende teenliggaampies word na verwagting doeltreffend vir SARS-CoV-2-infeksie verwag, maar hul koste, produksieskale en dekkingsyfers is steeds vrae. Entstofontwikkeling staar ook probleme in die gesig, soos tydigheid en ondoeltreffendheid as gevolg van onbedagsame entstofontwerp en/of virusmutasie.

    Anders as die entstof wat 'n relatief duidelike meganisme en roete in ontwikkeling het, kan antivirale middels met 'n hoë sterkte en hoë veiligheid tans moeiliker wees om te ontwikkel as gevolg van ons onvolledige begrip van die viruswêreld en die gasheer se reaksie. Dit kan die rede wees waarom daar tot dusver geen bevredigende antivirale middel beskikbaar is nie. Die potensiaal in vivo toksiese effek van 'n antivirale middel wat as effektief beweer word in vitro kan sy farmakologiese applous teleurstellend oorweldig. Nuwe en onkonvensionele idees en roetes van antivirale geneesmiddelontwerp en -ontwikkeling is nodig om die tekortkominge van die huidige reduksionisme-gebaseerde geneesmiddelnavorsing te oorkom.In hierdie aspek kan die holisme-gebaseerde tradisionele Chinese medisyne, veral die Chinese mediese kruieformules oorweeg word wat bewys is doeltreffend in die stryd teen COVID-19 in China (Ang etਊl., 2020 Luo etਊl., 2020 Ren et& #xa0al., 2020 Zhang et al., 2020a Zhong etਊl., 2020), hoewel verdere meganistiese studies en grootskaalse kliniese proewe geregverdig is.

    Onlangs het baie lande in die wêreld hul belegging in die navorsing en ontwikkeling van antivirale middels, teenliggaampies en entstowwe verhoog. Die versnelling van die ontwikkeling van entstowwe is waarskynlik die huidige sleutelpad om hierdie wêreldwye ramp op te los. Deur gesamentlike pogings regoor die wêreld kan mense hopelik in die nabye toekoms effektiewe anti-SARS-CoV-2-tegnologie ontwikkel.


    Resultate

    Proteoomoorvloed en termiese stabiliteit by SARS-CoV-2-infeksie

    Aangesien virale patogene endogene gasheerproteïenmasjinerie moet kaap vir hul replikasie, het ons geredeneer dat TPP 'n kragtige manier sou wees om funksioneel relevante veranderinge tydens infeksie met SARS-CoV-2 (Savitski) te ontbloot. et al, 2014). Om proteoomwye termiese stabiliteitsprofiele in 'n tipiese TPP-werkvloei te genereer, word selhoeveelhede aan tien verskillende temperature onderwerp om te bevorder in situ proteïen ontvou. Selle word dan gelys, onoplosbare proteïene word verwyder, en die oorblywende oplosbare proteïenfraksie by elke temperatuur word versamel en ontleed met massaspektrometrie-gebaseerde kwantitatiewe proteomika (Becher) et al, 2016, 2018). Om verenigbaarheid met 'n BSL3-werkomgewing te verseker, het ons eers ons standaard TPP-protokol (Franken et al, 2015) deur sentrifugeringstappe – wat andersins kan lei tot die opwekking van aërosols wat luggedraagde patogene bevat – te vervang met 'n filtrasiestap aangehelp deur vakuum vir proteïenaggregaatverwydering wat binne 'n HEPA-gefiltreerde laminêre vloeikas uitgevoer kan word (Fig 1A sien Materiale en Metodes) vir besonderhede). Ons het bevestig dat hierdie stap so effektief was as die vorige sentrifugeringprosedure (Bylae Fig S1A en B).

    Figuur 1. Globale assessering van gasheer oorvloed en termostabiliteit veranderinge tydens SARS-CoV-2 infeksie

    1. Caco-2 monolae bestaande uit 1.5e 6 selle per monster is met SARS-CoV-2 geïnfekteer teen 'n MOI van 0.5 (sien Materiale en Metodes). Drie biologies onafhanklike replikate is per tydpunt versamel. Monsters is aan vakuumspruitstuk-gebaseerde 2D-TPP onderwerp. Na verwydering van onoplosbare proteïene, is die oorblywende oplosbare fraksies gemerk met isobariese massa-merkers (TMTpro) om proteïenkwantifisering moontlik te maak. Monsters is gekombineer in 'n 2D-TPP uitleg om proteïen termiese stabiliteit en oorvloed deur die infeksietydverloop te vergelyk (Becher et al, 2018). Die onbesmette (t−1) tydpunt is gebruik as 'n verwysing om vouveranderinge (FC) te bereken. Beduidende proteïenveranderinge (oorvloed en termiese stabiliteit) word voorgestel as sirkeldiagramme vir individuele proteïene, soos voorheen beskryf (Becher) et al, 2018). Binnesirkel stem ooreen met proteïenoorvloed en die buitenste sirkel stem ooreen met termiese stabiliteitsveranderinge (n = 3).
    2. Caco-2-selle is volgens (A) met SARS-CoV-2 besmet. Selle is gewas, gefixeer en gekleur met DAPI (blou) om selkerne te visualiseer en geïnkubeer met anti-N-proteïen teenliggaampies (rooi) om SARS-CoV-2 geïnfekteerde selle te visualiseer. Skaalbalk dui 10 µm aan.
    3. Infeksietempo's is bereken deur gebruik te maak van outomatiese beeldingsagteware (sien Materiale en Metodes) bereken vanaf ses gesigsvelde per tydpunt per biologiese replikaat. Datapunt dui die steekproefgemiddelde aan en die foutbalk die standaardfout van die gemiddelde (SEM) (n = 3).
    4. SARS-CoV-2 bespeurde proteïene geplot as 'n funksie van tyd waar elke datapunt 'n ander replikaat aandui (n = 3).

    Ons het toe die aangepaste TPP-werkvloei toegepas om te bestudeer hoe SARS-CoV-2-infeksie gasheerproteoom se termiese stabiliteit en oorvloed verander. Caco-2-selle, wat toelaatbaar is vir SARS-CoV-2-infeksie (Stanifer et al, 2020 Bojkova et al. 24 en 48 uur na infeksie (Fig 1A). Vier uur na toevoeging van die virus

    5.2% van selle is besmet, met selinfeksiekoerse wat toe 'n hoogtepunt bereik het op ongeveer 18% by 24 uur (Fig 1B en C). Op elke tydstip is monsters geoes en verwerk met behulp van vakuum-gebaseerde aggregaatverwydering soos hierbo beskryf en ontleed deur massaspektrometrie-gebaseerde kwantitatiewe proteomika (Fig 1A).

    Ons het 7 414 proteïene met ten minste twee unieke peptiede opgespoor. Dit het drie virale proteïene ingesluit: die spykerglikoproteïen (S), die nukleoproteïen (N) en Orf9b. Oorvloed veranderinge van hierdie drie proteïene met verloop van tyd het grootliks die mikroskopie-waarnemings vir virale replikasie gerekapituleer (Fig 1D). SARS-CoV-2-proliferasiekinetika en die virale proteïendekking was vergelykbaar met dié wat voorheen in Caco-2-selle gerapporteer is (Bojkova) et al, 2020). Ons het toe oorvloedsveranderinge bereken in verhouding tot die nie-geïnfekteerde kontrole vir 5 564 proteïene (bespeur by die twee laagste temperature in ten minste twee herhalings), en termiese stabiliteitsveranderinge vir 4 076 proteïene (bespeur by die twee laagste temperature in ten minste twee herhalings en algehele bespeur in ten minste tien temperature Dataset EV1 sien Materiale en Metodes vir besonderhede). Hiervan het 350 proteïene beduidende veranderinge in oorvloed getoon (|Z-telling| > 1,96 en q-waarde < 0.05 sien Materiale en Metodes vir besonderhede) en 278 proteïene het veranderinge in termiese stabiliteit in ten minste een tydpunt getoon (Dataset EV1, Bylaag Fig S2). In ooreenstemming met vorige waarnemings, was die meerderheid veranderinge in proteïenoorvloed die gevolg van afregulering (62.9% van algehele oorvloedveranderings 220 proteïene in totaal) (Bouhaddou) et al, 2020), terwyl stabiliteitsveranderinge oorheers is deur proteïendestabilisering (61.9% van algehele termiese stabiliteitsveranderinge: 172 proteïene in totaal) (Fig 2A en Bylaag Fig S2). Ons het byvoorbeeld 'n vroeë toename in die oorvloed gasheertranskripsie en translasieverwante proteïene (insluitend virale geassosieerde prosesse) waargeneem, spesifiek binne die eerste uur van infeksie, terwyl termostabiliteitsveranderinge vir hierdie prosesse meestal volgehou is deur die infeksietydverloop ( Fig 2B en Datastel EV2). Proteïene wat met mitochondriale translasie geassosieer word, het slegs in oorvloed verander binne die eerste 2 uur van infeksie, en proteïene wat verband hou met sitoskeletale hermodellering en proteïenvou het slegs in termiese stabiliteit verander, meestal na die later stadiums van infeksie (Fig 2B en Dataset EV2). Treffers wat verband hou met proteïenvou was meestal die gevolg van termiese destabilisasie en sel-sel adhesie proteïene is meestal termies gestabiliseer (Bylae Fig. S3 en S4, en Dataset EV2). Samevattend onthul ons 'n ryk en dinamiese kaart van gasheerproteïenoorvloed en termiese stabiliteitsveranderinge na SARS-CoV-2-infeksie wat nuwe terapeuties relevante teikens kan verteenwoordig.

    Figuur 2. Wêreldwye proteïenoorvloed en termiese stabiliteit verander na SARS-CoV-2-infeksie

    1. Totale aantal aansienlik op- of af-gereguleerde proteïene (|Z-telling| > 1,96, q-waarde < 0.05) per tydpunt van SARS-CoV-2-geïnfekteerde Caco-2-selle soos beskryf in Fig 1A. Proteïene wat aansienlik verander is in oorvloed (links) en termiese stabiliteit (regs) is ondergegroepeer volgens óf afregulering/destabilisasie (rooi) óf opregulering/stabilisasie (turkoois).
    2. Gene Ontologie (GO) biologiese proses en padverryking van geselekteerde weë. Sien Datastel EV2 vir volledige GO-term biologiese proses en padverrykings.

    SARS-CoV-2-geïnduseerde termiese stabiliteitsveranderinge konvergeer op virale-gasheer PPI's en fosfosietregulering

    Vervolgens het ons gevra of proteïene wat in oorvloed of termiese stabiliteit verander tydens SARS-CoV-2-infeksie ook deelneem aan virale-gasheer PPI's en/of fosfosiete besit wat differensieel gereguleer word op SARS-CoV-2-infeksie (Bouhaddou) et al, 2020 voordruk: Samavarchi-Tehrani et al, 2020 Gordon et al, 2020b). Om dit te doen, het ons hierdie lys proteïene vergelyk met voorheen verkrygde proteoomwye datastelle wat SARS-CoV-2-gasheer PPI's en fosfosietregulering by infeksie beskryf (Bouhaddou) et al, 2020 Gordon et al, 2020b). Ons het 'n oorvleueling van 30 proteïene gevind wat oorvloed of termiese stabiliteit verander het en wat voorheen getoon is om fisies met virale lokaas in affiniteitsuiwering massaspektrometrie (AP-MS) eksperimente (Gordon) te werk. et al, 2020b Bylaag Fig S5A) en 204 proteïene in BioID-eksperimente (voordruk: Samavarchi-Tehrani et al, 2020 ) (Bylae Fig S5B). Boonop het 107 van die proteïene met veranderde oorvloed of termiese stabiliteit ook veranderde fosforileringstoestande tydens SARS-CoV-2-infeksie getoon (Bylae Fig S5C Bouhaddou et al, 2020). Dus, proteïene wat veelvuldige veranderinge in oorvloed vertoon, termiese stabiliteit en/of hul interaksie of fosforileringstoestand bied verdere molekulêre ondersteuning vir hul funksionele rol tydens SARS-CoV-2-infeksie. Dit is belangrik dat die meerderheid proteïene wat in termiese stabiliteit verander het, uniek was aan die TPP-eksperiment. Soos hieronder bespreek, is sommige van hierdie treffers direkte teikens van SARS-CoV-2-inhiberende middels, wat daarop dui dat TPP ortogonale inligting verskaf oor die biologie van SARS-CoV-2-infeksie.

    Om te verstaan ​​hoe termiese stabiliteitsveranderinge verband hou met veranderinge in gasheer sellulêre prosesse, het ons proteïene met veranderde termiese stabiliteit gebruik om 'n netwerk te saai wat dan gepropageer is met behulp van gasheerproteïene wat voorheen getoon is om met SARS-CoV-2-proteïene te reageer of versteurings in fosfosietregulering tydens SARS-CoV-2-infeksie (Bouhaddou et al, 2020 Gordon et al, 2020b Fig 3A). Na netwerkvoortplanting is groepering uitgevoer om die netwerk te verdeel in modules wat proteïene met verwante biologiese funksies bevat. Biologiese roete-analise het uitgesproke konvergensie van gasheerproteoomregulering (termiese stabiliteit of fosfosiet) en fisiese interaksies (virale-gasheer PPI's) binne kernsellulêre prosesse geopenbaar, insluitend proteïene betrokke by selsiklusregulering, mikrotubule-organisasie en mRNA-splytingsregulering (Fig 3A en B). Veral, proteïene betrokke by RNA-splyting (Module M-3) (bv. SNRNP70, SNRPGP15, SRSF10, SNRPG, SRSF1, SRSF7, SRRM1 en LUC7L3) is konsekwent termies gedestabiliseer teen 2 uur na infeksie (Figuur 3C). Versteurings in die RNA-splyningsmasjinerie is in ooreenstemming met onlangse verslae wat veranderinge in die oorvloed aantoon (Bojkova et al, 2020) en fosforileringstoestande (Bouhaddou et al, 2020) van RNA-splytingverwante proteïene tydens SARS-CoV-2-infeksie. Wat belangrik is, is dat die funksionele vereiste vir spliceosoomfunksie in SARS-CoV-2-infeksie voorheen gedemonstreer is deur die spliceosoom-inhibeerder, pladienolied B, wat SARS-CoV-2-replikasie onderdruk het (Bojkova) et al, 2020). Interessant genoeg ontwrig die SARS-CoV-2-proteïen nsp16 mRNA-splytingsgebeurtenisse deur binding van die mRNA-herkenningsdomeine U1/U2 snRNA's, en voorkom dus translasie van antivirale geenprodukte (Boudreault) et al, 2019 Maranon et al, 2020 Banerjee et al, 2020 ).

    Figuur 3. Netwerkanalise van geïntegreerde SARS-CoV-2-datastelle

    1. Netwerk van proteïene wat algemeen verander of geteiken word tydens SARS-CoV-2-infeksie. Proteïene wat aansienlik veranderde veranderinge in termiese stabiliteit vertoon, is as saad gebruik vir die bou van die netwerk. SARS-CoV-2 infeksie gereguleerde fosfosiete en hul voorspelde stroomop kinases sowel as proteïen-proteïen interaksies tussen virale lokaas en gasheer prooi proteïene is gebruik om die netwerk te propageer. Na netwerkverspreiding is groepering uitgevoer om die netwerk in modules te verdeel (sien Materiale en Metodes). GO-termynverrykings vir elke module word regs onder gewys. Proteïen termiese stabiliteit data is van hierdie studie, terwyl fosforilering/kinase regulering (Bouhaddou et al, 2020) en virale-menslike proteïen-proteïen-interaksie (Gordon et al, 2020b ) data is verkry uit vorige werk en gebruik om die TPP-treffers te versprei wat hierdie netwerk saai. Alle TPP termiese stabiliteit treffers per module word vertoon.
    2. Twee statistiese toetse is toe op die gegenereerde netwerk vanaf (A) uitgevoer. Eerstens, om te bepaal of die modules verryk is in TPP-treffers (Fisher-toets), en tweedens, om te bepaal of hulle 'n beduidende hoeveelheid beginsein (KS-toets) ontvang het. Rooi stippellyn verteenwoordig betekenisdrempel (P-adj < 0.05).
    3. Hittekaart wat die tydpunt toon waarop TPP-treffers gevind word binne elke module gedefinieer in (A). Groen teël dui op beduidende veranderinge in termiese stabiliteit.

    Verder het ons uitgesproke veranderinge in die termiese stabiliteit van strukturele komponente van desmosome wat betrokke is by sel-sel adhesie waargeneem desmoplakien (DSP) was termies gedestabiliseer tussen 7 en 24 uur van infeksie terwyl desmoglein-2 (DSG2) en plakofilien-2 (PKP2) ) het termiese stabilisering na latere tydpunte getoon (Fig 3A, en Datastel EV1). Dit kan implikasies hê vir die verspreiding van SARS-CoV-2, aangesien daar getoon is dat ander virusse sel-sel-aansluitingsproteïene teiken om hul verspreiding na naburige selle te vergemaklik (Mateo et al, 2015 ).

    Ons het 'n sterk destabilisering van inosien-5'-monofosfaat dehidrogenase 2 (IMPDH2) opgespoor vanaf 4 uur na infeksie (Fig 4A). IMPDH2 kataliseer die omskakeling van inosien 5'-fosfaat (IMP) na xantosien 5'-fosfaat (XMP), wat 'n tempo beperkende stap van De novo guanien biosintese. Inhibisie van IMPDH2 met die antivirale ribavirien is voorheen getoon om SARS-CoV-2 replikasie te onderdruk (Bojkova et al, 2020), asook die genetiese ablasie daarvan (Gordon et al, 2020a). Hierdie resultate verskaf verdere bewyse dat IMPDH2 funksioneel gemodifiseer word tydens infeksie, moontlik deur 'n direkte interaksie met nsp14, en bied addisionele molekulêre insig in waarom IMPDH2 farmakologiese inhibisie SARS-CoV-2 replikasie effektief onderdruk.

    Figuur 4. Termiese stabiliteitsveranderinge in SARS-CoV-2-geteikende gasheerproteïene

    1. IMPDH2 is konsekwent gedestabiliseer vanaf 4 uur na SARS-CoV-2 infeksie. Daar is voorheen getoon dat IMPDH2 'n proteïen-proteïen-interaksie met nsp14 (groen lyn) (Gordon) vorm et al, 2020b) en wees 'n deurslaggewende faktor in die ondersteuning van SARS-CoV-2-replikasie (Gordon et al, 2020a). Die SARS-CoV-1 nsp14 het 'n dubbele rol in die herstel van basispaar-wanpassing en sintese van die guanienryke 5′-kap van virale RNA (Chen) et al, 2009 Smith & Denison, 2013 Smith et al, 2015). Sirkelvormige termiese stabiliteit en oorvloed plotte is van Caco-2-selle wat met SARS-CoV-2 geïnfekteer is soos beskryf in Fig 1A (sien ook Fig 1A vir plotlegende). Asterisk dui op beduidende regulering (sien Materiale en Metodes).
    2. Termiese destabilisering van UGDH en PAAF1 val tydelik saam en daar is voorheen getoon dat albei met die SARS-CoV-2-proteïene nsp6 (UGDH) en M (UGDH en PAAF1) interaksie het (voordruk: Samavarchi-Tehrani) et al, 2020). PAAF1 reguleer die proteasoom negatief deur die samestelling/demontage daarvan te beheer (Park et al, 2005) en is voorheen gekoppel aan transkripsie van MIV-1 (Lassot) et al, 2007 Nakamura et al, 2012). Beduidende proteïenveranderinge (oorvloed en termiese stabiliteit) word voorgestel as sirkeldiagramme vir individuele proteïene, soos voorheen beskryf (Becher) et al, 2018). Binnesirkel stem ooreen met proteïenoorvloed en die buitenste sirkel stem ooreen met termiese stabiliteitsveranderinge (n = 3). Asterisk dui op beduidende regulering (sien Materiale en Metodes).
    3. SAFB fosfopeptied oorvloed verander tydens SARS-CoV-2 infeksie. Vero-sel fosfopeptied data van (Bouhaddou et al, 2020). Data wat voorheen verkry is van Vero-selle wat met SARS-CoV-2 (Bouhaddou et al, 2020). S604 fosfosiet wat tydelik saamval met SAFB termiese destabilisering (voordruk: Potel et al, 2020). Getoon bo die lyngrafiek is die termostabiliteit en oorvloed profiele van SAFB in SARS-CoV-2 geïnfekteerde Caco-2 selle soos beskryf in Fig 1A (n = 3). Asterisk dui beduidende regulering aan (sien Materiale en Metodes).
    4. Termiese stabiliteitsprofiel vir alle ongemodifiseerde SAFB-peptiede (groen) en die gefosforileerde S604 (pS604) (pers) in HeLa-selle. Data van Potel et al (voordruk: Potel et al, 2020 ).

    Ons het gevind dat die glikosaminoglikaan-biosinteseproteïen UDP-glukose 6-dehidrogenase, UGDH en die proteasomale 26S-inhibeerder, PAAF1, albei gedestabiliseer is tydens SARS-CoV-2-infeksie (Figuur 4B). Dit is belangrik dat beide UGDH en PAAF1 benodig word vir SARS-CoV-2-infeksie (voordruk: Wang et al, 2020), en daar is voorheen gevind dat nsp6 fisies met UGDH en die virale membraanglikoproteïen M met UGDH en PAAF1 in BioID-eksperimente (voordruk: Samavarchi-Tehrani et al, 2020) (Figuur 4B). Hierdie data dui daarop dat termiese destabilisering van UGDH en PAAF1 tydens SARS-CoV-2-infeksie funksioneel relevante veranderinge in hul biofisiese toestand vasvang wat SARS-CoV-2-proliferasie beïnvloed.

    Ons het voorheen berig dat proteïenfosforilering in sommige gevalle ooreenstem met veranderinge in proteïen termiese stabiliteit (voordruk: Potel et al, 2020). Ons het opgemerk dat sommige fosforileringsgebeure ons voorheen waargeneem het (Bouhaddou et al, 2020) tydens SARS-CoV-2-infeksie het tydelik saamgeval met proteïen se termiese stabiliteitsveranderinge, veral tydens vroeër tydpunte. Byvoorbeeld, fosforilering van S604 op die transkripsiefaktor steieraanhegtingsfaktor B1 (SAFB), het tydelik saamgeval met die destabilisering daarvan wat by 1 hpi begin het en betekenis bereik het by 2 hpi (Bouhaddou et al, 2020 Fig 4C). Ons het voorheen gedemonstreer dat fosforilering van S604 geassosieer word met SAFB termiese destabilisering (voordruk: Potel et al, 2020 Fig 4D), wat daarop dui dat SARS-CoV-2-infeksie SAFB termiese destabilisering bevorder deur fosforilering op S604. In ooreenstemming met 'n rol vir S604 in die regulering van SAFB-funksie, het die proteïenoorvloed van SAFB-teikengene FBL, RPS15 en TAF15 gelyktydig met S604-vlakke toegeneem (Bylae Fig S6A). Daar is veral gevind dat die SAFB-teikengeenproduk LARP1 voorheen interaksie het met die SARS-CoV-2 N-proteïen, en die teikengeen neuroguidin (NGDN) met die SARS-CoV-1-proteïen nsp9 (Gordon) et al, 2020a, 2020b). Ter bevestiging van die funksionele relevansie vir SARS-CoV-2, is onlangs gewys dat NGDN benodig word vir SARS-CoV-2-verspreiding (voordruk: Wang et al, 2020). Hierdie bevindinge verwys na 'n potensiële tydelike wisselwerking tussen SARS-CoV-2 en SAFB, waardeur fosforilering van S604 op SAFB wat die uitdrukking van proteïene wat direk deur SARS-CoV-2 geteiken word tydens infeksie induseer.

    Verskeie gasheer chaperones het diepgaande veranderinge in termiese stabiliteit tydens SARS-CoV-2-infeksie gehad.Byvoorbeeld, die kernkomponente van die menslike chaperone-kompleks (TRiC/CCT) is vroeg in infeksie effens termies gestabiliseer, terwyl hulle sterk gedestabiliseer is tydens latere infeksiestadia (Bylae Fig S6B). Hierdie kompleks word benodig vir replikasie van griepvirus, waar getoon is dat dit 'n proteïenkompleks vorm met die virale RNA polimerase subeenheid PB2 (Fislová) et al, 2010). Daarbenewens is verskeie gasheer hitteskok chaperones termies gedestabiliseer (bv. HSP90AB1, HSP90AA1, HSPB1, HSPA8), waarvan sommige ook differensieel gereguleerde fosfosiete bevat tydens SARS-CoV-2 infeksie (Bouhaddou) et al, 2020). Byvoorbeeld, termiese destabilisering van HSPB1 was geassosieer met verhoogde fosforilering van S15, S78 en/of S82 (Bylae Fig S6C). S78 en/of S82 tree veral op as 'n bouvormskakelaar wat 'n belangrike rol speel in die regulering van HSPB1-dimeervorming en chaperone-aktiwiteit bevorder (Choi) et al, 2019). Saamgevat demonstreer hierdie bevindinge dat TPP verdere molekulêre insig bied in weë wat voorheen by SARS-CoV-2-infeksie betrokke was, asook nuwe weë in SARS-CoV-2-infeksie impliseer.

    Die antivirale effekte van hitteskok chaperone en sitochroom P450 inhibeerders

    Ons het ondersoek of termiese stabiliteit of oorvloed veranderinge funksioneel relevante gasheerproteïene kan openbaar wat as potensiële geneesmiddelteikens uitgebuit kan word om SARS-CoV-2 replikasie te blokkeer. Uitsluitlik gebaseer op ons vermoë om verbindings te vind wat die aktiwiteit van gasheerproteïene selektief moduleer wat aansienlik in ons data verander is, het ons handmatig sewe dwelmbare gasheerteikenproteïene op die kortlys geplaas wat ons gevind het dat hulle veranderde oorvloed (CYP1A1: geïnhibeer deur rhapontigenin) of termostabiliteit (CAPN1) toon. : PD-150606, IMPDH1/2: ribavirien en mikofenolsuur, HSP90: tanespimisien, PTRG1: asetielsalisielsuur en diklofenak, CTSV: E64d en CA-074-Me) by SARS-CoV-2-infeksie. Om rekening te hou met die effekte van die verbindings op beide virale toetrede en replikasie, is selle vooraf met verbindings behandel en dit is gedurende die eksperiment teenwoordig gehou. Die vermoë van die getoetsde verbindings om SARS-CoV-2-proliferasie te inhibeer, is beoordeel deur die hoeveelheid dubbelstrengs virale RNA te kwantifiseer na 20-24 uur na infeksie en hul uitwerking op sellewensvatbaarheid is parallel op onbesmette selle getoets. Twee van die getoetste verbindings het SARS-CoV-2-proliferasie onderdruk (Fig 5) (hieronder bespreek). Die ander verbindings het geen effek op SARS-CoV-2 proliferasie getoon in die konsentrasiereeks wat getoets is nie (Bylae Fig S7A–H), dit sluit nie uit dat hulle aktief kan wees in kombinasie met ander middels of in verskillende sellulêre sisteme nie, soos die geval vir ribavirien (Bojkova et al, 2020) en die CAPN1-remmer (Ma et al, 2020 ).

    Figuur 5. 2D-TPP oorvloed en stabiliteit veranderinge ontbloot funksioneel relevante gasheer teikens tydens SARS-CoV-2 infeksie

    1. Hitteskokproteïene, HSP90AA1 en HSP90AB1, is termies gedestabiliseer tydens SARS-CoV-2-infeksie van Caco-2-selle (sirkelvormige plotte, linkerkant (n = 3) sien Fig 1A vir sirkelgrafiese legende). Beduidende proteïenveranderinge (oorvloed en termiese stabiliteit) word voorgestel as sirkeldiagramme vir individuele proteïene, soos voorheen beskryf (Becher) et al, 2018). Binnesirkel stem ooreen met proteïenoorvloed en die buitenste sirkel stem ooreen met termiese stabiliteitsveranderinge (n = 3). Asterisk dui beduidende regulering aan (sien Materiale en Metodes).
    2. Die ooreenstemmende HSP90-remmer, Tanespimycin, het SARS-CoV-2-proliferasie effektief onderdruk (n = 2). Calu-3-selle is vooraf met die verbinding geïnkubeer, gevolg deur die byvoeging van SARS-CoV-2 en daaropvolgende mede-inkubasie in die teenwoordigheid van die verbinding vir 20-24 uur. Virale lading is parallel gekwantifiseer deur gebruik te maak van teenliggaam-gebaseerde opsporing van dubbelstring-RNA (oranje). Verbinding toksisiteit in Calu-3 selle is geassesseer (pers) behandel met die verbinding alleen vir 20-24 uur.
    3. Die arielkoolwaterstofhidroksilase (CYP1A1) het in oorvloed toegeneem tussen 4 en 12 uur na infeksie en is dan verminder tussen 24 en 48 uur na infeksie (sirkulêre plot, links, (n = 3) sien Fig 1A vir sirkelgrafiese legende). Sirkelvormige plotte vertoon soos beskryf in paneel A. Sterretjie dui beduidende regulering aan (sien Materiale en Metodes).
    4. Die CYP1A1-inhibeerder het SARS-CoV-2-proliferasie onderdruk (n = 2). Dosis-reaksie kurwes is uitgevoer soos beskryf in Fig 4A. Sien Bylaag Fig S7 vir bykomende getoetste middels. Data vertoon soos beskryf in (B).

    Die algehele breë en konsekwente termiese destabilisering van chaperones betrokke by ontvoude proteïenvou het 'n globale verskuiwing in hul betrokkenheid by ontvoude kliëntproteïene voorgestel (Fig 2B). Dit kan wees as gevolg van die drastiese toename in chaperone besetting met groot volumes van ontvou virale proteïen substrate, wat kan vertaal na 'n waarneembare verskuiwing in chaperone termiese stabiliteit. Ons het die funksionele relevansie van HSP90AA1 en HSP90AB1 termiese destabilisasie (Fig 5A) geverifieer met behulp van die selektiewe inhibeerder tanespimycin, wat virale replikasie doeltreffend onderdruk teen lae mikromolêre konsentrasies (EIC)50

    2 µM) wat nie giftig was vir die menslike selle nie (Fig 5B). Daarbenewens het ons 'n uitgesproke toename in CYP1A1-oorvloed tussen 4 en 12 uur na infeksie opgespoor, wat dan gevolg is deur 'n sterk afname tussen 24 en 48 uur na infeksie (Fig 5C). Interessant genoeg het behandeling met die selektiewe CYP1A1-remmer, rhapontigenin, SARS-CoV-2-proliferasie binne die mikromolêre reeks (EIC) onderdruk.50

    Saamgevat demonstreer hierdie resultate dat veranderinge in proteïenoorvloed of termiese stabiliteit molekulêre teikens vir virale replikasie-inhibisie kan voorstel. Dit toon die nut van TPP vir die ontdekking van infeksie-relevante gasheerweë, wat die identifisering van potensiële antivirale terapieë kan bespoedig.


    Verwysings

    Cornelia C. Bergmann, et al. (2006) Coronavirus infeksie van die sentrale senuweestelsel: gasheer-virus stand-off. Natuur Resensies Mikrobiologie. 4, 121-132.
    Paul S. Meesters. (2006) Die Molekulêre Biologie van Coronaviruses. Virus Navorsing. 66, 193–292.
    Stanley G. Sawicki, (2007) 'n Kontemporêre siening van koronavirus-transkripsie. J Virol. 81(1): 20–29.
    Isabel Sola, et al. (2011) RNA-RNA en RNA-proteïen interaksies in koronavirus replikasie en transkripsie. RNA Biol. 8(2): 237–248.