Inligting

2B: Samestelling, volgorde en konformasie-analise van proteïene - Biologie

2B: Samestelling, volgorde en konformasie-analise van proteïene - Biologie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Leerdoelwitte

beskryf in algemene terme die prosedures en chemiese stappe in die bepalings van die volgende vir proteïene:

  • molekulêre gewig
  • teenwoordigheid van sekere spesifieke aminosure
  • aminosuur samestelling
  • N en C terminale aminosuur
  • spesifieke aminosuur wat nodig is vir binding en aktiwiteit
  • aminosuur volgorde
  • sekondêre struktuur
  • 3D struktuur

Kleinkiekie: Struktuur van menslike hemoglobien. Die proteïene α en β subeenhede is in rooi en blou, en die ysterbevattende heemgroepe in groen. Uit PDB: 1GZX​. (GNU; Proteopedia Hemoglobien).


Struktuur en konformasie toestande van die bees mitochondriale ATP sintase deur cryo-EM

Adenosientrifosfaat (ATP), die chemiese energie-geldeenheid van biologie, word hoofsaaklik in eukariotiese selle gesintetiseer deur die mitochondriale ATP-sintase. ATP-sinteses werk deur 'n roterende katalitiese meganisme waar protontranslokasie deur die membraan-ingevoegde FO gebied is gekoppel aan ATP-sintese in die katalitiese F1 streek deur rotasie van 'n sentrale rotor subkompleks. Ons rapporteer hier enkeldeeltjie elektron kryomikroskopie (cryo-EM) analise van die bees mitochondriale ATP sintase. Die kombinasie van cryo-EM data met bioinformatiese analise het ons in staat gestel om die vou van die a subeenheid te bepaal, wat 'n protontranslokasiepad deur die F voorstel.O streek wat beide die a- en b-subeenhede behels. 3D-klassifikasie van beelde het sewe afsonderlike toestande van die ensiem aan die lig gebring wat verskillende maniere van buig en draai in die ongeskonde ATP-sintase toon. Rotasie skommelinge van die c8-ring binne die FO streek ondersteun 'n Brownse ratelmeganisme vir proton-translokasie-gedrewe rotasie in ATP-sinteses.


Agtergrond

Vergelykende ontleding van eukariotiese genome bied 'n ongekende geleentheid om te ondersoek wat 'n gegewe spesie uniek maak. Die genetiese meganismes wat spesie-spesifieke verskille genereer, sluit in positief geselekteerde mutasies wat 'n fiksheidsvoordeel verleen, ewekansige fiksasie van selektief neutrale mutasies, en die verkryging van nuwe gene [1, 2]. Divergensie tussen spesies sluit dus variasie in geenvolgorde in, veral dié van regulatoriese gene, kenmerke van nie-koderende volgordes en herhalende DNA, en geennommer en repertorium [3, 4]. Tot op datum het vergelykende genomika in eukariote grootliks gefokus op gene wat proteïene kodeer met eksperimenteel gedefinieerde domeine of motiewe (proteïene met gedefinieerde kenmerke (PDF's)) [5, 6]. Omdat die ontleding van PDF's 'n hoë mate van ooreenkoms tussen verskillende spesies aan die lig gebring het, is dit wyd aanvaar dat die uniekheid van 'n spesifieke spesie gedryf is deur veranderinge in regulatoriese gene of elemente [1-6], in teenstelling met die divergensie van gevestigde kodering. volgordes of die skepping van nuwe gene. Dit het gelei tot 'n wydverspreide perspektief dat slegs 'n paar model-organismes die eksperimentele grondslag kan verskaf om funksies aan byna elke eukariotiese geen toe te ken.

Opmerklik ontbreek uit die vergelykende analise van eukariotiese genome tot op datum, egter, is 'n ontleding van die oorsprong en funksies van gene wat proteïene kodeer wat tans nie gedefinieerde motiewe of domeine (proteïene met obskure kenmerke (POF's)) [7, 8]. Uitdrukkingsprofielstudies in verskillende organismes het voorgestel dat POF'e 'n belangrike rol speel in baie verskillende biologiese prosesse. Nietemin, hul biologiese rolle en oorsprong bly swak verstaan ​​en die toeligting van hul funksies is tans 'n groot doelwit van biologiese navorsing in byna alle organismes wat bestudeer is [7, 8]. In hierdie artikel ondersoek ons ​​die moontlikheid dat gene wat POF's kodeer, wat ongeveer 'n kwart van alle eukariotiese gene uitmaak, 'n rol speel in die bepaling van verskille tussen spesies. In analogie met die verwagting dat PDF's dikwels onder spesies bewaar word [4-6], kan 'n mens verwag dat POF's 'n parallelle patroon van filogenetiese bewaring sal toon. Om hierdie aanname te toets, het ons 'n vergelykende analise van 10 verskillende eukariotiese proteome uitgevoer, insluitend bot- en splitsingsgis, wurm, vrugtevlieg, muskiet, Arabidopsis, rys, muis, rot en mens. Verbasend genoeg, in teenstelling met PDF's, het ons gevind dat POF's 'n baie groter persentasie proteïene insluit wat hoogs uiteenlopend is. Ons resultate beklemtoon die belangrikheid van die afbakening van die oorsprong en funksies van POF's as 'n onderliggende oorsaak van spesiespesifisiteit.


Inleiding

'n Proteïen se volgorde bepaal sy vrye energie-landskap, maar dit het 'n groot uitdaging bewys om volgorde-afhanklike strukturele neigings uit fisiese eerste beginsels te voorspel. Dit het belangrike praktiese gevolge vir terapeutiese ontwerp, aangesien konformasievoorkeure geneesmiddelspesifisiteit kan bepaal. Die tipe-II-kinase-inhibeerder Gleevec is 'n uitstekende voorbeeld, aangesien dit sterk aan ABL-kinase bind, maar nie aan SRC-kinase nie, alhoewel hulle 47% volgorde-identiteit het. 1, 2 Daar is voorgestel dat Gleevec se spesifisiteit deels te wyte is aan verskillende neigings van kinase-proteïene vir 'n konformasie bekend as "DFG-out" wat die proteïen moet aanneem om tipe II-inhibeerders te bind. 3-7 Dit is egter betwis en die volgorde-afhanklike oorsprong van die verskil was moeilik om suiwer deur strukturele analise te bevestig. 8-11

Die evolusionêre oorsprong van proteïene maak 'n ander invalshoek oop. Fisiese interaksies tussen twee residue in 'n proteïen se struktuur lei tot hul mutasie-ko-variasie in 'n meervoudige volgorde-belyning (MSA) van die proteïenfamilie, wat ko-evolusionêre analisetegnieke gemotiveer het wat kontakte in struktuur voorspel deur sterk gekorreleerde posisiepare in te identifiseer die MSA (sien Verw. 12, 13 vir hersiening). "Inverse Ising" metodes het bewys dat dit besonder geskik is vir hierdie doel. Hierdie lei 'n statisties-energetiese "Potts" Hamiltoniaanse model af wie se parameters ooreenstem met direkte paarsgewyse residu-residu-interaksiesterktes, deur MSA-statistieke te pas deur tegnieke wat uit statistiese fisika ontleen is, te gebruik. 14 Die krag van inverse Ising-inferensie is gedemonstreer deur die gebruik daarvan as die sentrale komponent van "direkte koppelingsanalise" (DCA) vir proteïenkontakvoorspelling, wat getoon is om die top 200 intra-proteïenkontakpare in baie proteïene met ∼ te voorspel 80% akkuraatheid soos bevestig deur X-straal kristallografie en KMR studies, sowel as inter-proteïen kontakte, alternatiewe ongekristalliseerde konformasies, ligand-gemedieerde kontakte, en dit is gebruik vir ab-initio struktuur voorspelling. 14-20

Die Potts-model kan gebruik word vir meer as om kontakte te voorspel. Die model verskaf 'n waarskynlikheid (of met 'n logaritme, 'n statistiese energie) van enige gegewe ry, en voorspel die verandering in 'n ry se statistiese energie vir enige stel mutasies. Hierdie statistiese energie is verwant aan die vou vrye energie van die proteïen, en kan ontbind word in posisie- en residu-spesifieke interaksie terme waarvan die verwantskap met die paarsgewyse terme in struktuur-gebaseerde vrye energie funksies net begin ondersoek word. 21, 22 Dit skep die moontlikheid om volgorde-spesifieke eienskappe, insluitend konformasie-neigings, te voorspel.

Ons doel is om konformasie-neigings van individuele kinases af te lei vir die onaktiewe DFG-uit-toestand, waarin 'n "DFG"-motief weg van die kinase se aktiewe plek georiënteer is, anders as in die aktiewe DFG-in-konformasie. 6 Ons voorspel konformasievoorkeur deur berekeninge van die Potts-energie vir 'n ry as 'n funksie van konformasie te "inryg". Reekse wat deur ons ontleding voorspel word om 'n hoë straf vir die DFG-uit-toestand te hê, word nooit in daardie toestand in kristalstrukture waargeneem nie, terwyl die oorblywende rye in beide DFG-in en DFG-uit waargeneem word, en ons vind ook dat rye met 'n hoë voorspelde straf bind swak aan tipe II-inhibeerders in 'n hoë-deurset bindingstoets. Verder dui ons ontleding daarop dat die stabiliteit van die aktiveringslus in die DFG-in-toestand 'n belangrike rol speel in die kontoer van die energielandskap.


Agtergrond

Koöperatiewe proteïenreaksie en dus koöperatiewe netwerkgedrag vereis inligtingoordrag tussen distale plekke in 'n proteïen- of proteïenkompleks. Proteïenstrukture bereik dikwels sulke langafstandkommunikasie deur allosteriese beweging [1-4], maar dit is beslis nie 'n vereiste nie. In wese enige verandering in die dinamiese eienskappe van proteïenreste, byvoorbeeld na ligandbinding, wat doeltreffend deur die struktuur voortplant en op 'n distale plek waarneembaar is, vorm 'n vorm van seintransduksie [5-9]. Baie teoretiese en eksperimentele studies is gewy aan die strukturele dinamika van globulêre proteïene en die implikasies daarvan vir proteïenfunksie. Onlangse eksperimentele studies, aan die een kant, fokus op die rol van proteïendinamika vir katalise [10], seintransduksie [7, 11], samewerkende reaksie [12] en proteïenaggregasie [13]. Aan die ander kant het teoretiese benaderings die verband tussen proteïen strukturele dinamika en seintransduksie ondersoek, slegs beperk deur die kombinatoriese kompleksiteit wat met die konformasieruimte geassosieer word. In reaksie hierop is tegnieke soos geteikende molekulêre dinamika [11], anisotropiese termiese diffusie [5] of Go-agtige steekproefneming [14] ontwikkel om die grade van vryheid te verminder sodat die kartering van 'n pad wat een grondtoestand verbind met sy allosteriese eweknie. Boonop het Ranganathan en medewerkers residue gekarteer wat deelneem aan seintransduksie in verskeie belangrike proteïene deur evolusionêre gekorreleerde mutasies uit veelvuldige volgorde-belynings te onttrek [7]. Saam toon hierdie studies dat (1) veranderinge in proteïendinamika deur die proteïenstruktuur kan voortplant en sodoende langafstandkorrelasies tussen distale aktiewe terreine skep [6, 14], (2) slegs 'n fraksie van residue in 'n proteïenstruktuur neem deel aan seinvoortplanting [ 9, 12], en (3) hierdie intra-proteïen kommunikasie modes word oor die algemeen bewaar binne proteïen families en selfs proteïen voue [4, 7].

Noudat die beginsels wat verband hou met gekorreleerde strukturele dinamika met seintransduksiemeganismes binne proteïene duidelik word, bied ons hier 'n metode aan om hierdie strukturele fluktuasies te identifiseer en te kwantifiseer in terme van inligting wat die berekening van die inligtingoordrag tussen aktiewe terreine moontlik maak. In die besonder gebruik ons ​​inligtingsteorie [15], en meer spesifiek die konsep van wedersydse inligting, as 'n manier om die verhouding tussen strukturele proteïendinamika en seingedrag te beskryf. Hierdie assosiasie volg direk uit die verband tussen die definisies van entropie as 'n maatstaf van strukturele versteuring in statistiese termodinamika, aan die een kant, en as 'n maatstaf van fout op kommunikasiekanale in inligtingsteorie aan die ander kant [16]. Die potensiaal van globulêre proteïene om inligting regdeur hul struktuur oor te dra, en sodoende die gedrag van verafgeleë effektorplekke te korreleer, word inderdaad verskaf deur die verandering in strukturele dinamika wat deur ligandbinding geïnduseer word. Maar meer fundamenteel, inligtingoordrag ontstaan ​​uit wedersydse konformasie afhanklikheid van die verskillende residue wat 'n proteïen- of proteïenkompleks saamstel. Met ander woorde, wanneer die konformasie buigsaamheid van een residu die konformasie buigsaamheid van 'n ander oorblyfsel beïnvloed, sal veranderinge in die strukturele dinamika gekorreleerde veranderinge in entropie produseer en inligting word dus uitgeruil [17]. Wedersydse inligting kwantifiseer die hoeveelheid konformasie-afhanklikheid tussen proteïenreste. As gevolg hiervan kan 'n proteïen beskou word as 'n netwerk van residue wat konformasie-inligting uitruil. Hierdie interpretasie verskaf 'n teoretiese raamwerk om te verstaan ​​hoe die herverspreiding van termodinamiese versteurings binne 'n netwerk van proteïenreste 'n inligtingoordragnetwerk daarstel.

Om ons inligtingteoretiese benadering te illustreer, karteer ons die residu-gebaseerde inligtingoordragnetwerk van die SH2-domein van die Fyn-tyrosienkinase [18], 'n lid van die Src-familie van kinases [19], wat betrokke is by noodsaaklike seinpaaie, vir byvoorbeeld die beheer van selgroei, proliferasie, differensiasie, beweeglikheid en seladhesie [20]. Familielede deel 'n gemeenskaplike multi-domein argitektuur, met die argetipiese Src homologie 3 (SH3) domein by die N-terminaal [21], 'n Src homologie 2 (SH2) domein [22, 23], die tyrosine kinase domein en 'n kort C-terminale stert. In sy onaktiewe vorm word die kinase-domein deur die SH3- en SH2-domeine gesekwestreer (sien Figuur 1A). Die SH3-domein koppel aan die skakelaar wat die SH2 met die kinase-domein verbind. Die SH2-domein hou vas aan 'n C-terminale fosfotirosienvolgorde (sien Figuur 1A). Defosforilering van hierdie C-terminale volgorde lei tot die vrystelling daarvan vanaf die SH2 fosfopeptied-bindingsplek. Dit lei weer tot die vrystelling van die SH2-kinase-skakelaar vanaf die SH3-domein en ontkoppeling van die kinase-domein wat meer as 40 Angstrom is (sien Figuur 1A) weg van die SH2-fosfopeptiedbindingsplek [24].

Die Fyn-tyrosienkinase en sy SH2-domein. Die Fyn tyrosine kinase (A) bestaan ​​uit drie domeine: die N-terminale domein SH3, 'n SH2-domein wat fosfotirosienmotiewe bind, die SH1-domein met tirosienkinase-aktiwiteit en 'n kort C-terminale stert. Wanneer onaktief, word die tirosien by posisie 527 in die C-terminale deel gefosforileer en aan die SH2-domein gebind. In (B) die SH2-domein saam met die gebonde C-terminale fosfotirosienpeptied word gevisualiseer. Die standaardnomenklatuur vir die sekondêre struktuurelemente word bygevoeg, sien ook (D). (C) Naby-aansig van die fosfopeptied en hidrofobiese bindingsplekke, insluitend die sykettings van die residue wat relevant is vir binding. Die standaard nomenklatuur van die sleutelinteraksieresidu word verskaf in [25] (PDB identifiseerder 1AOT [38]). Alle molekulêre grafika geskep met YASARA http://www.yasara.org en PovRay http://www.povray.org.

Die SH2-domein het 'n tipiese lengte van ongeveer 100 aminosure en vertoon 'n eenvoudige vou (getoon in Figuur 1B) waarin 'n sentrale anti-parallelle β-vel deur twee alfa-helikse omring word. Die β-stringe word gewoonlik van βA na βG geannoteer, terwyl die α-helikse na verwys word as αA en αB. Paneel B (en D) van Figuur 1 toon die benoemde struktuur (volgorde) van die Fyn SH2-domein wat in die huidige analise gebruik word (sien Metodes vir struktuurinligting). Die peptiedbindingsplek van die Fyn SH2-domein bestaan ​​uit twee funksionele streke: die fosfotirosienbindende sak (rooi etikette in Figuur 1C), verantwoordelik vir pTyr-herkenning, en die hidrofobiese bindingsak, wat in wisselwerking is met die residue C-terminaal tot die pTyr ( blou etikette in Figuur 1C) [25, 26]. Die eerste bindingsholte is geleë tussen die sentrale anti-parallelle β-vel en die α-heliks αA. Die tweede bindingsak is geleë aan die teenoorgestelde kant van die fosfotirosienbindingsholte, tussen die sentrale β-vel en die α-heliks αB. In Figuur 2C word die name van die residue wat betrokke is by die binding van die C-terminale gefosforileerde volgordes op die struktuur geannoteer volgens die nomenklatuur wat in [25, 26] gedefinieer is. Hierdie name, bv. HisβD4, sal gebruik word wanneer na residue van enige bindingsholte verwys word. Ander oorblyfsels, bv. Ser23, sal aangedui word deur hul aminosuur naam en posisie in die Fyn SH2 PDB strukture wat hier gebruik word (sien Metodes). Vir verdere gedetailleerde bespreking van SH2-funksie en nomenklatuur verwys ons na die literatuur [25, 26].

Verandering in wedersydse inligting per residu en belangrikste groepering. Binding van die peptied met gefosforileerde tyrosien aan die SH2-domein lei tot 'n verandering in wedersydse inligtingresidu-residu-interaksies. (A) Hierdie paneel wys die verandering in wedersydse inligting vir elke paarsgewyse interaksie. Dit is duidelik dat die meeste oorblyfsels onaangeraak bly. 'n Aantal oorblyfsels by spesifieke posisies ervaar die sterkste effek. (B) Die meeste oorblyfsels ervaar byna geen verandering in wedersydse inligting nie. Die insetsel toon die verspreiding in die stert wat begin met 'n verandering in wedersydse inligting groter as 0,5 (geraasvlak) (C) Om die residue te groepeer deur die verandering in wedersydse inligting as ooreenkomsmaatstaf te gebruik (sien Metodes), lei tot 'n groepie hoogs gekoppelde residue, geleë in die bindende sakke en naby die kinase-skakelaargebied van die SH2-domein. Alle molekulêre grafika geskep met YASARA http://www.yasara.org en PovRay http://www.povray.org.

Eksperimentele werk oor die rol van die skakelaar tussen die SH3- en SH2-domein van Fyn het getoon dat die aard van die skakelaar, dit wil sê die residupatroon, beide oriëntasie en koppeling tussen die twee domeine bepaal [27, 28]. As sodanig het dit 'n direkte effek op die aktiveringsgedrag van die proteïenkinase en op die intra-molekulêre kommunikasie. Hierdie waarneming word ondersteun deur eksperimentele en molekulêre dinamika-werk wat deur Kuriyan et al. [9] op die SR-kinase. Hulle het getoon dat die vrystelling van die C-terminale volgorde vanaf die SH2-bindingsplek die bewegings van die SH2- en SH3-domeine ontkoppel deur die buigsaamheid van die koppellus wat hierdie twee domeine verbind, te verhoog. Die koppelskakel tussen die SH2- en SH3-domein dien dus as 'n induseerbare snap-slotmeganisme en vervanging van drie van die agt residue in hierdie skakelaar deur glisiene genereer 'n konstitutief aktiewe kinase. In effek word die fosfopeptiedbindingsplek aan die een kant van die SH2-domein dus gekoppel aan die SH3-SH2-skakelaar aan die teenoorgestelde kant van die SH2-domein. Wat belangrik is, is dat koöperasie bereik word sonder groot allosteriese beweging binne die SH2-domein en daarom spruit uit subtiele verskille in dinamika tussen fosfopeptied-gebonde en ongebonde toestande. Ons analise toon dat wedersydse inligting die koöperasie in die SH2-domein oor lang afstande identifiseer en kwantifiseer, wat ander resultate vir verskillende nie-allosteriese strukture bevestig [29, 30]. Met ander woorde, die binding van die fosfotirosienpeptied veroorsaak 'n inligtinguitruiling vanaf die SH2-bindingssakke na residue wat aan die teenoorgestelde kant van die domein geleë is, wat die skakelgebiede rig. Gevolglik dien die SH2-peptiedbindingsplek as 'n skakelaar wat inligting oor sy bindingstoestand aan beide skakels met die ander domeine versprei, wat die SH2-SH3-dokmodule koördineer.


Abstrak

Die volgorde en heliese inhoud van twee alanienryke peptiede (AQK18 en GpAQK18, Gp:l-propargylglycine) en hul konjugate met poli(etileenglikol) (PEG) is ondersoek deur multidimensionele massaspektrometrie (MS), wat elektrosproeiionisasie (ESI insluit) ) of matriks-ondersteunde laser desorpsie ionisasie (MALDI) gekoppel aan tandem massaspektrometrie (MS 2) fragmentasie en vorm-sensitiewe skeiding via ioon mobiliteit massaspektrometrie (IM-MS). Die samestelling, volgorde en molekulêre gewig verspreiding van die peptiede en biokonjugate is geïdentifiseer deur MS en MS 2 eksperimente, wat ook die aanhegting van PEG aan die C-terminus van die peptiede bevestig het. ESI tesame met IM-MS het die bestaan ​​van ewekansige spoel en α-helikale konformers vir die peptiede in die gasfase aan die lig gebring. Belangriker nog, die proporsie van die heliese konformasie het aansienlik toegeneem na PEG-aanhegting, wat daarop dui dat vervoeging stabiliteit by hierdie konformeerder voeg. Die konformasiesamestellings wat in die gasfase opgespoor is, is grootliks in oplossing gevorm, soos bevestig deur onafhanklike sirkelvormige dichroïsme (CD) eksperimente. Die botsingsdwarssnitte (rotasiegemiddelde vorentoe bewegende areas) van die ewekansige spoel en heliese konformers van die peptiede en hul PEG-konjugate is gesimuleer vir vergelyking met die eksperimentele waardes wat deur IM-MS afgelei is om die identiteit van die waargenome argitekture te bevestig en te verstaan die stabiliserende effek van die polimeerketting. Daar word getoon dat C-terminale PEGilering die positiewe ladingsdigtheid verhoog en intramolekulêre positiewe ladings by die konjugasieplek oplos, waardeur die stabiliteit van α-helikse verbeter word, hul konformasie bewaar word en heliese geneigdheid verhoog word.


2B: Samestelling, volgorde en konformasie-analise van proteïene - Biologie

Biochemie: 2. jaar, wintersemester, verpligte kursus

Natalia . Polovi , Ph.D.
medeprofessor, Fakulteit Chemie, Studentski trg 12-16, Beograd

Jelica R. Milo evi
assistent, Fakulteit Chemie, Studentski trg 12-16, Beograd

Weekliks: vier uur lesings + sewe uur laboratoriumwerk (4+0+7)

Die doel van hierdie kursus is om studente te help om fundamentele kennis te bekom van die struktuur en funksie van proteïene en nukleïensure. Studente moet die verband tussen die struktuur en funksie van proteïene en nukleïensure verstaan. Hierdie kursus bied aan studente 'n grondslag vir kursusse in biochemie en molekulêre biologie in die daaropvolgende jare van hul studies. Studente sal vertroud raak met die basiese tegnieke en metodes wat gebruik word vir isolasie en karakterisering van proteïene en nukleïensure en hulle sal die basiese vaardighede verwerf wat nodig is om in 'n biochemiese laboratorium te werk.

Begrip van die struktuur van proteïene en nukleïensure, die verband tussen die struktuur en aktiwiteit van proteïene en die verwantskap tussen proteïene en nukleïensure op die vlak van voorgraadse studies. Verwerf basiese vaardighede wat nodig is vir werk in 'n biochemiese laboratorium en ontwikkel aanvanklike begrip van eksperimentele werk met proteïene en nukleïensure.

Lesings, eksperimentele oefeninge, teorie-oefeninge, individuele en groepwerk met studente oor die konsolidering van die kursuseenhede.


Laai hierdie artikel af en druk dit uit vir u persoonlike wetenskaplike, navorsings- en opvoedkundige gebruik.

Koop 'n enkele uitgawe van Wetenskap vir slegs $ 15 dollar.

Wetenskap

Vol 343, Uitgawe 6176
14 Maart 2014

Artikel Gereedskap

Meld asseblief aan om 'n waarskuwing vir hierdie artikel by te voeg.

Deur Martin Jinek, Fuguo Jiang, David W. Taylor, Samuel H. Sternberg, Emine Kaya, Enbo Ma, Carolin Anders, Michael Hauer, Kaihong Zhou, Steven Lin, Matias Kaplan, Anthony T. Iavarone, Emmanuelle Charpentier, Eva Nogales, Jennifer A. Doudna

Binding van 'n gids-RNA veroorsaak strukturele veranderinge in 'n stel DNS-splitsende ensieme.


Materiale en Metodes

Kloning van die EGFP-WRN konstrukte

Om EGFP-WRN (aa 1-1432) volle lengte konstruk te genereer, die PCR-versterkte WRN vanaf die mens WRN geen, is gesubkloneer in die Xhoek-KersfeesI-plekke van pEGFP-C3 vektor (Clontech). Die WRN-fragment wat die NLS (aa 1358-1432) bevat, is gegenereer deur PCR met behulp van die EGFP-WRN (1-1432)-koderende plasmied as die templaat, en dan gesubkloneer in die Kpnek-KersfeesI plekke van pEGFPC3 vektor. Die res van die EGFP-WRN-fragmente wat in hierdie studie gebruik is, is in die Xhoek-EkoRI-plekke van pEGFPC3 vektor (met of sonder NLS) vanaf die pGEX-CS vektor. WRN-fragmente wat aminosure 949-1432 en 949-1092 kodeer, is in die Ncoek-BamHI-plekke van die pGEX-CS vektor (Brosh, Jr et al., 2001). WRN-fragmente wat die eksonuklease- en helikase-domeine (aa 54-946) en die C-terminale domein (aa 1072-1432) bevat, is gegenereer deur PCR, met die EGFP-WRN-koderende plasmied as die templaat, en dan gesubkloneer in die Ncoek-BamHI-plekke van pGEX-CS vektor. Om die EGFP-WRN RQC deletion mutant (EGFP-WRNΔ853-1089, I852L) te genereer, het ons twee bekend gestel SacI-plekke (aminosure 852 en 1089) in die pEGFP-WRN-volgorde (aa 1-1432) deur gebruik te maak van 'n oligonukleotiedgerigte in vitro mutagenese sisteem van Stratagene (Snelverandering-plekgerigte mutagenese). Na SacMet vertering, is die verteerde vektor gesuiwer en herligeer. Alle fragmente is in volgorde geplaas.

Transfeksies, lokalisering in lewende selle en immunofluoressensietoetse

Die U-2 OS- en B16F10-selle was van ATCC, en die AG11395-selle was van Coriell. Selle is gegroei in Dulbecco se gemodifiseerde Eagle's medium (Life Technologies) en 10% FBS. Vir in vivo lokaliseringstoetse is die selle in glasbodem-mikroputskottels (MatTek) gekweek en met die ooreenstemmende vektore getransfekteer deur gebruik te maak van die Calphos-soogdiertransfeksiestel (Clontech). Na 15 uur is selle onder 'n laserskandering konfokale mikroskoop (Zeiss 410) in die groen (488 nm) kanaal (63× NA 1.4 lens) bekyk. Die beelde is toe oorgetrek en geanaliseer met Metamorp beeldstelsel 4.1 (Universal Imaging Corporation). Vir die kolokaliseringstoetse is getransfekteerde selle wat op dekstrokies gegroei het (15 uur na transfektasie) gefixeer met 4% paraformaldehied in 1× PBS (vir 15 minute by RT), en gepermeabiliseer met 0.4% Triton X-100 in 1× PBS (vir 10) minute by RT). Na die blokkeerstap (0,1% Tween-20, 2% BSA in 1× PBS, vir 1 uur by RT), is dekstrokies geïnkubeer met bok anti-B23-teenliggaampies (Santa Cruz) (1:200 verdunning in blokkeerbuffer) vir 2 ure by RT. Bok teenliggaampies is dan opgespoor met Texas Red-gekonjugeerde anti-bok teenliggaampies (Jackson Laboratories1:200 in blokkeerbuffer) vir 1 uur by RT. Na was, is die dekstrokies op Vectashield (Vector Laboratories) gemonteer en onder 'n laserskandering konfokale mikroskoop (Zeiss 410) in aparte kanale (groen, 488 nm rooi, 568 nm) bekyk. Die beelde is toe soos voorheen verwerk.

Western klad analise vir proteïen uitdrukking vlakke van die verskillende GFP-WRN fragmente

Ongeveer 15 uur na transfeksie is selle wat op 10 cm-skottels (80-90% konfluent) gegroei het, versamel. Die pille is hersuspendeer in 200μl/korrel van SDS monster buffer, gekook en geanaliseer (~8% van die monster) deur SDS-PAGE gevolg deur western klad met anti-GFP monoklonale teenliggaampie (Clontech).


2B: Samestelling, volgorde en konformasie-analise van proteïene - Biologie

Iris A. Bermejo, a Claudio D. Navo, /> ab Jorge Castro-López, c Ana Guerreiro, d Ester Jiménez-Moreno, a Elena M. Sánchez Fernández, e Fayna García-Martín, /> f Hiroshi Hinou, f Shin-Ichiro Nishimura, /> f José M. García Fernández, /> g Carmen Ortiz Mellet, /> e Alberto Avenoza, a Jes'250's H. Busto, a Gonçalo J. L. Bernardes, /> dh Ramón Hurtado-Guerrero, cij Jesús M. Peregrina /> ​​* a en Francisco Corzana /> ​​* a

a Departamento de Química, Universidad de La Rioja, Centro de Investigación en Síntesis Química, E-26006 Logroño, Spanje
E-pos: [email protected], [email protected]

b CIC BioGUNE, Bizkaia Tegnologie, Parkgebou 800, 48170 Derio, Spanje

c Instituut vir Bioberekening en Fisika van Komplekse Stelsels (BIFI), Universiteit van Zaragoza, Zaragoza, Spanje

d Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, Avenida Professor Egas Moniz, 1649-028 Lisboa, Portugal

e Departamento de Química Orgánica, Facultad de Química, Universidad de Sevilla, E-41012 Sevilla, Spanje

f Nagraadse Skool en Fakulteit Gevorderde Lewenswetenskap, Laboratorium vir Gevorderde Chemiese Biologie, Hokkaido Universiteit, N21 W11, Sapporo 001-0021, Japan

g Instituto de Investigaciones Químicas (IIQ), CSIC–Universidad de Sevilla, E-41092 Sevilla, Spanje

h Departement Chemie, Universiteit van Cambridge, Lensfieldweg, CB2 1EW Cambridge, VK

i Kopenhagen Sentrum vir Glykomika, Departement Sellulêre en Molekulêre Geneeskunde, Skool vir Tandheelkunde, Universiteit van Kopenhagen, Kopenhagen, Denemarke

j Fundación ARAID, Zaragoza, Spanje

Abstrak

Die Tn-antigeen (GalNAc-α-1-O-Thr/Ser) is 'n bekende tumor-geassosieerde koolhidraatdeterminant. Die gebruik van glikopeptiede wat hierdie struktuur inkorporeer, het 'n beduidende en belowende nis van navorsing geword as gevolg van hul potensiële gebruik as teenkanker-entstowwe. Hierin, die konformasievoorkeure van 'n glikopeptied met 'n onnatuurlike Tn-antigeen, gekenmerk deur 'n treonien versier met 'n sp 2 -iminosuiker-tipe α-GalNAc nabootsing, is bestudeer beide in oplossing, deur die kombinasie van KMR spektroskopie en molekulêre dinamika simulasies, en in die vaste toestand gebind aan 'n anti-mucin-1 (MUC1) teenliggaam, deur X-straal kristallografie. Die Tn-surrogaat kan die hoofkonformeerder naboots wat deur die natuurlike antigeen in oplossing gemonster is en toon hoë affiniteit teenoor anti-MUC1-teenliggaampies. Aangemoedig deur hierdie data, is 'n kanker-entstofkandidaat gebaseer op hierdie onnatuurlike glikopeptied en gekonjugeer aan die draerproteïen Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) voorberei en in muise getoets. Betekenisvol, die eksperimente in vivo het bewys dat hierdie entstof hoër vlakke van spesifieke anti-MUC1 IgG-teenliggaampies ontlok as die analoog wat die natuurlike Tn-antigeen dra en dat die ontlokte teenliggaampies menslike borskankerselle met hoë selektiwiteit herken. Altesaam stel ons bewyse saam om te bevestig dat die aanbieding van die antigeen, beide in oplossing en in die gebonde toestand, 'n kritieke rol speel in die doeltreffendheid van die ontwerpte kanker-entstowwe. Boonop bewys die uitkomste van hierdie entstof dat daar ruimte is om verdere aanpassings op koolhidraatvlak te ondersoek wat kan bydra tot die ontwerp van meer doeltreffende kanker-entstowwe.


Kyk die video: Biologie DNA replicatie (September 2022).