Inligting

Waarom nie SDS-PAGE as 'n metode gebruik om virusse op te spoor nie?

Waarom nie SDS-PAGE as 'n metode gebruik om virusse op te spoor nie?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Onlangs het ek navorsing gedoen oor DNS en ek weet die gewildste metode om virusse op te spoor is op DNS gebaseer. Nadat ek van proteïene geleer het, wonder ek hoekom ons nie virusse opspoor wat op virusproteïene gebaseer is nie?

As dit waar word, kan ons baie geld bespaar, in plaas daarvan om 'n PCR-reaksie te doen, kan ons meer as een siekte in 'n enkele reaksie opspoor.

Byvoorbeeld, wanneer ek die volgorde van 'n virus van NCBI Genebank het, kan ek weet hoeveel proteïene die teikenorganisme produseer en ek kan die molekulêre gewig van elke proteïen bereken. Loop dit dan in 'n SDS-PAGE-jel om te sien hoe die bande lyk, kan ek wees dat ek kan weet die teikenorganisme is teenwoordig of nie?

MIV produseer byvoorbeeld 9 proteïene en die molekulêre gewig van elke proteïen verskil. So nadat ek elektroforese gedoen het, het ek 9 bande. Gebaseer op die afstand tussen elke band en gebaseer op die molekulêre gewig, is dit moontlik om te weet MIV is teenwoordig of nie?


Eenvoudig gestel, die antwoord is dat jy kon poog om virale proteïene op te spoor, maar omdat hierdie proteïene baie klein komponente van jou monster sou wees, sal jy 'n immunoblotting-tegniek moet gebruik om 'n spesifieke virale proteïen op te spoor. Alhoewel immunoblotting nogal 'n sensitiewe tegniek is, dink ek dit is regverdig om te sê dat dit tegnies veeleisend kan wees. Daarteenoor is 'n PKR-reaksie uiters sensitief en redelik robuust. PCR is ook tegnies meer reguit omdat DNA oor die algemeen makliker is om mee te werk as proteïene.

Voor die koms van PCR, sou immunoblotting die metode van keuse gewees het.


Molekulêre metodes vir virusopsporing

Molekulêre diagnostiese prosedures is in 'n aantal onlangse boeke en artikels beskryf. Hierdie publikasies het egter nie op virusopsporing gefokus nie, en het ook nie praktiese protokolle vir die nuwer molekulêre metodes verskaf nie.

Geskryf deur die uitvinders of hoofontwikkelaars van hierdie tegnologieë, Molekulêre metodes vir virusopsporing verskaf beide resensies van individuele metodes en instruksies vir die opsporing van virusnukleïensuurvolgordes in kliniese monsters. Elke prosedure sluit gehalteversekeringsprotokolle in wat dikwels deur ander metodologieboeke geïgnoreer word. Molekulêre metodes vir virusopsporing verskaf klinies relevante prosedures vir baie van die nuwer diagnostiese metodologieë.

Molekulêre diagnostiese prosedures is in 'n aantal onlangse boeke en artikels beskryf. Hierdie publikasies het egter nie op virusopsporing gefokus nie, en het ook nie praktiese protokolle vir die nuwer molekulêre metodes verskaf nie.

Geskryf deur die uitvinders of hoofontwikkelaars van hierdie tegnologieë, Molekulêre metodes vir virusopsporing verskaf beide resensies van individuele metodes en instruksies vir die opsporing van virusnukleïensuurvolgordes in kliniese monsters. Elke prosedure sluit gehalteversekeringsprotokolle in wat dikwels deur ander metodologieboeke geïgnoreer word. Molekulêre metodes vir virusopsporing verskaf klinies relevante prosedures vir baie van die nuwer diagnostiese metodologieë.


5.1. Laboratorium kwaliteitsversekering

Om laboratoriumkapasiteit te bou, moet nasionale MIV/VIGS-programme belê in 'n QA-program vir alle laboratoriums wat diagnostiese toetse uitvoer, en moet bestaande beskikbare dienste wat deur die WGO en ander, insluitend die Sentrums vir Siektebeheer en -voorkoming (CDC) verskaf word, gebruik om eksterne te ondersteun kwaliteit assesseringskemas (EQAS).

Om hoogs akkurate toetse te hê, waarborg nie noodwendig betroubare laboratoriumresultate nie. Baie prosesse is betrokke vanaf die tyd dat die monster versamel en na die laboratorium vervoer word, getoets word en totdat die resultate gerapporteer word, waartydens foute kan voorkom. Daarom is deurlopende QA binne die konteks van die laboratoriumkwaliteitstelsel, beide intern en ekstern, noodsaaklik. Klinici en personeel wat laboratoriumdienste verskaf, benodig gereelde kommunikasie oor die uitvoering van toetse om toepaslike prestasie te verbeter en te verseker. Goed gedefinieerde standaardbedryfsprosedures (SOP's), wat nasionaal gedefinieerde en bekragtigde toetsalgoritmes volg, is noodsaaklik vir optimale gebruik van alle laboratorium-gebaseerde toetse.


Die stapelgel is van geen nut vir die ontleding nie en dit kan verwyder word. Bokant van die gel verwys na die bokant van die skei-gel, dit wil sê die punt waarop verskillende polipeptiede begin skei het. 'n Mengsel van proteïenstandaarde bestaan ​​gewoonlik uit vyf tot agt individuele polipeptiede wat 'n prominente "ladder" produseer. Standaarde word van bo af na onder geïdentifiseer. Afhangende van %T sal een of meer van die laagste massastandaarde dalk nie opgelos word nie.

Om 'n standaardkromme vir molekulêre massa voor te berei, skat 'n mens 'n relatiewe mobiliteit vir elke standaard en teken 'n standaardkromme van molekulêre massa versus relatiewe mobiliteit op semi-log papier of log molekulêre massa versus relatiewe mobiliteit op konvensionele grafiekpapier. Relatiewe mobiliteit word bepaal deur die afstand van die bokant van die jel na die middel van die kleurstoffront of arbitrêre verwysingspunt te meet, die afstand van die bokant van die jel na die middel van die band te meet, en die tweede meting deur die eerste te deel. . Dit is die Rf, wat altyd tussen 0 en 1 is.

Let daarop dat die relatiewe mobiliteit van 'n gegewe proteïen afhang van jelkonsentrasie. Enige enkele jel het 'n boonste en onderste limiet vir sy bruikbare reeks vir die skatting van molekulêre massa.


3. Selkultuur (Weefselkultuur)

Daar is drie tipes weefselkultuurorgaankultuur, eksplantasiekultuur en selkultuur.

Orgaankulture word hoofsaaklik gedoen vir hoogs gespesialiseerde parasiete van sekere organe bv. trageale ringkultuur word gedoen vir isolasie van koronavirus.

Uitplant kultuur word selde gedoen.

Selkultuur word meestal gebruik vir die identifisering en kweek van virusse.

  • Selkultuur is die proses waardeur selle onder gekontroleerde toestande gekweek word.
  • Selle word in vitro op glas of 'n behandelde plastiekoppervlak in 'n geskikte groeimedium gekweek.
  • By die eerste groeimedium word gewoonlik gebalanseerde soutoplossing wat 13 aminosure bevat, suiker, proteïene, soute, kalfserum, buffer, antibiotika en fenolrooi geneem en die gasheerweefsel of -sel word geënt.
  • Met inkubasie verdeel die sel en versprei op die glasoppervlak om 'n samevloeiende monolaag te vorm.

Metodes wat hele faagdeeltjies opspoor

Transmissie-elektronmikroskopie (TEM) gebruik 'n straal elektrone om 1000x hoër resolusie te produseer in vergelyking met tradisionele ligmikroskope. Verhoogde resolusie (tot 0,2 nm) is genoeg om selfs virusse te visualiseer. Hierdie tegnologie kan gebruik word om virale deeltjies te kwantifiseer, al moet die monster hoogs gekonsentreerd wees (� 6 deeltjies/ml) om betroubare resultate te lewer (Mann, 2005 Goldsmith en Miller, 2009). Virale kwantifisering deur gebruik te maak van TEM is hoogs akkuraat in die bepaling van die morfotipe en die totale getal, maar dit word as tydrowend, duur en onprakties beskou om baie monsters uit te voer en kan nie vir komplekse monsters gebruik word nie. Daarbenewens is monstervoorbereiding vervelig en die tegniek vereis 'n bekwame operateur bo en behalwe die gesofistikeerde instrument (Ackermann, 2012).

Nog 'n tegniek om heel deeltjies te tel, is vloeisitometrie. Hierin word virale deeltjies met 'n fluoresserende kleurstof gemerk en deur 'n kapillêre gerig. Klein deursnee van die kapillêre dwing deeltjies om in 'n enkele lyn te vloei, wat die opsporing van ligverstrooiing moontlik maak wat deur elke deeltjie veroorsaak word. Die metode is vinnig en streng en word dus wyd aangewend (Picot et al., 2012). 'n Seminale studie het getoon dat die fluoresserende sein nie met die genoomgrootte korreleer nie, maar dat verskillende virusse in 'n gemengde monster gediskrimineer kan word op grond van hul fluoressensie en syverspreiding (Brussaard et al., 2000). Onlangs is getoon dat die fluoresserende sein gebruik kan word om die aantal teikennukleïensuurmolekules met die aantal virale deeltjies te korreleer slegs as monsters sagkens hanteer word, die gebruik van oppervlakaktiewe middels vermy word, negatiewe kontroles is ingesluit om outo-fluoressensie te bepaal. van die medium en die instrument- en toetssensitiwiteit word vooraf beraam, met behulp van 'n paneel bakteriofage van verskillende genoomgroottes (Dlusskaya et al., 2019).

Laastens, 'n lasergebaseerde metode wat deur NanoSight Limited ontwikkel is, laat intydse visualisering toe en om virale deeltjies binne 'n paar minute op te som gebaseer op dinamiese ligverstrooiing deur laserverligte optiese mikroskopie. Nadele is die behoefte aan relatiewe hoë monsterkonsentrasie (10 7 � 9 PFU/ml) en 'n helder vloeistof (Anderson et al., 2011) wat moeilik verkrygbaar is van komplekse monsters soos grond en fekale materiaal.


Blotting

Na die skeiding van die proteïenmengsel word die polipeptiedbande na 'n membraandraer oorgedra. Vir hierdie doel word die membraan aan die jel geheg en hierdie sogenaamde toebroodjie word na 'n elektroforesekamer oorgeplaas. Dit is moontlik dat sommige van die SDS uitgewas word, en die proteïen weer gedeeltelik hernatuur, d.w.s. sy 2D- en 3D-struktuur herwin. Die toegepaste elektriese lading veroorsaak egter dat die proteïene vertikaal uit die jel beweeg na die rigting waarin hulle op die jel beweeg het, op die membraan. Die proteïenbande word daardeur aan die membraan gebind. Die "gevlekte" bande is nou beskikbaar om verder behandel te word (bv. vir die opsporing van spesifieke proteïene met spesifieke teenliggaampies).


Kwantifisering van nukleïensure

Skat DNA-konsentrasie op 'n ethidiumbromied-gekleurde gel

Agarosegelelektroforese word algemeen gebruik om DNA-fragmente te skei na beperking endonuklease-vertering of PCR-amplifikasie. Fragmente word opgespoor deur die jel te kleur met die interkalerende kleurstof, etidiumbromied, gevolg deur visualisering/fotografie onder ultraviolet lig. Ethidiumbromied kleur DNS op 'n konsentrasie-afhanklike wyse sodat hoe meer DNS in 'n band op die jel teenwoordig is, hoe intenser sal dit vlek. Hierdie verwantskap maak dit moontlik om die hoeveelheid DNA teenwoordig in 'n band te skat deur vergelyking met 'n ander band met 'n bekende DNS-hoeveelheid. As die intensiteite van twee bande soortgelyk is, dan bevat hulle soortgelyke hoeveelhede DNA. Ethidiumbromied kleur enkelstring DNA en RNA slegs baie swak. Hierdie vorme van nukleïensuur sal nie betroubare kwantifisering deur gelelektroforese gee nie.


Monster denaturasie

Verskeie monster buffers is gebruik vir SDS-PAGE maar almal gebruik dieselfde beginsels om monsters te denatureer. Ons verkry goeie denaturering deur 'n monster voor te berei tot 'n finale konsentrasie van 2 mg/ml proteïen met 1% SDS, 10% gliserol, 10 mM Tris-Cl, pH 6.8, 1 mM etileendiamien tetraasynsuur (EDTA), 'n reduseermiddel soos bv. as dithiotreitol (DTT) of 2-merkapto-etanol, en 'n knippie broomfenolblou om as 'n opsporingskleurstof te dien (

Ons berei 'n 2x konsentraat van monsterbuffer voor wat bestaan ​​uit 2% SDS, 20% gliserol, 20 mM Tris-Cl, pH 6.8, 2 mM etileendiamien-tetraasynsuur (EDTA), 160 mM ditiotreïtol (DTT) en 0.1 mg/ml bromfenol blou kleurstof. Ek verkies DTT bo 2-merkapto-etanol omdat laasgenoemde 'n baie sterker onaangename reuk het en dit nie ons bloedfraksies baie goed denatureer nie. Deel van die probleem is dat ons waterbaddens nie die kookpunt bereik nie, en kook kan nodig wees met 2-merkapto-etanol. Ons berei al ons onbekendes voor tot dieselfde konsentrasie en meng dan 1 volume voorbereide monster met 1 volume 2x buffer.

So, wat doen die verskillende komponente? EDTA is 'n preserveermiddel wat tweewaardige katione chelaat, wat die aktiwiteit van proteolitiese ensieme wat kalsium- en magnesiumione as kofaktore benodig, verminder. Die tris dien as 'n buffer, wat baie belangrik is aangesien die stapelproses in diskontinue elektroforese 'n spesifieke pH vereis. Gliserol maak die monster digter as die monsterbuffer, dus sal die monster in die bodem van 'n put bly eerder as om uit te dryf. Die kleurstof laat die ondersoeker toe om die vordering van die elektroforese te volg.

SDS, DTT en hitte is verantwoordelik vir die werklike denaturering van die monster. SDS breek die twee- en driedimensionele struktuur van die proteïene op deur negatiewe lading by die aminosure te voeg. Aangesien soortgelyke ladings afstoot, word die proteïene min of meer reguit gemaak, wat hulle onmiddellik funksioneel maak. Sommige kwaternêre struktuur kan oorbly as gevolg van disulfiedbinding (kovalent) en as gevolg van kovalente en niekovalente bindings met ander tipes molekules. Terloops, 'n ander naam vir SDS is laurylsulfaat. Jou sjampoe bevat dalk laurylsulfaat – wek dit nou nie vertroue in die produk nie?

Baie proteïene het beduidende hidrofobiese eienskappe en kan sterk geassosieer word met ander molekules, soos lipiede, deur hidrofobiese interaksie. Verhitting van die monsters tot minstens 60 grade C skud die molekules op, wat SDS in staat stel om in die hidrofobiese streke te bind en die denaturasie te voltooi.

Die aminosuur sisteïen bevat 'n sulfhidriel (-SH) groep wat spontaan 'n disulfiedbinding (-S-S-) vorm met 'n ander sulfhidriel groep onder normale intrasellulêre toestande. Disulfiedbinding is kovalent en word nie deur SDS ontwrig nie. DTT is 'n sterk reduseermiddel. Die spesifieke rol daarvan in monsterdenaturering is om die laaste bietjie tersiêre en kwaternêre struktuur te verwyder deur disulfiedbindings te verminder.

Die meeste monsterbuffers verwyder nie kovalent aangehegte koolhidraat- of fosfaatgroepe nie, en sommige assosiasies met ander tipes makromolekules is moeilik om te ontwrig. Polipeptiede bevat verskillende hoeveelhede basiese en suur aminosure wat lading by die molekules voeg, en individuele aminosure verskil in molekulêre gewig alhoewel hulle SDS met dieselfde affiniteit kan bind. Daarom word lading tot massa verhouding en die relatiewe mobiliteit van baie proteïene beïnvloed deur ander faktore as streng molekulêre gewig. SDS-PAGE is baie effektief om reproduceerbare resultate te verskaf, maar reken nie op presiese waardes vir MW-bepaling nie.


Hoë sensitiwiteit opsporing van koronavirus SARS-CoV-2 met behulp van multipleks PCR en 'n multipleks-PCR-gebaseerde metagenomiese metode

Baie opsporingsmetodes is gebruik of aangemeld vir die diagnose en/of toesig van SARS-CoV-2. Onder hulle is omgekeerde transkripsie polimerase kettingreaksie (RT-PCR) die sensitiefste, wat aanspraak maak op opsporing van ongeveer 5 kopieë van virusse. Daar is egter gerapporteer dat slegs 47-59% van die positiewe gevalle deur RT-PCR geïdentifiseer is, waarskynlik as gevolg van verlies of afbraak van virus-RNA in die monsternemingsproses, of selfs mutasie van die virusgenoom. Daarom is die ontwikkeling van hoogs sensitiewe metodes noodsaaklik om robuuste opsporingsvermoëns te verseker. Met die doel om sensitiwiteit te verbeter en verskeie toepassingsinstellings te akkommodeer, het ons 'n multipleks-PCR-gebaseerde metode ontwikkel wat bestaan ​​uit 172 pare spesifieke primers, en het die doeltreffendheid daarvan getoon om SARS-CoV-2 teen lae kopiegetalle op te spoor. Die toets het skoon kenmerkende teikenpieke van gedefinieerde groottes opgelewer, wat die direkte identifikasie van positiewe deur elektroforese moontlik gemaak het. Daarbenewens kan opsionele volgordebepaling verdere bevestiging sowel as filogenetiese inligting van die geïdentifiseerde virus(se) verskaf vir spesifieke rasdiskriminasie, wat van kardinale belang sal wees vir toesigdoeleindes wat 'n globale gesondheidsvereiste verteenwoordig. Laastens het ons ook parallel 'n multipleks-PKR-gebaseerde metagenomiese metode ontwikkel wat vatbaar is om SARS-CoV-2 op te spoor, met die bykomende voordeel van die potensiaal daarvan om mutasie-diversiteit en nuwe patogene op lae volgorde-diepte te ontbloot.


Kyk die video: Separating Proteins using SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS page (Augustus 2022).