Inligting

Waarom DNA-polimerase gebruik om cDNA te maak?

Waarom DNA-polimerase gebruik om cDNA te maak?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

RT is in staat om 'n komplementêre DNA-string te sintetiseer (soos in MIV-lewensiklus.) Waarom word DNA-pol dan gebruik wanneer cDNA (wat die tweede string daarvan sintetiseer) vanaf mRNA gesintetiseer moet word (Vir bv. om 'n cDNA-biblioteek te konstrueer)?


Omgekeerde transkripsie, soos die naam aandui, gebruik 'n RNA-sjabloon om 'n DNA-transkripsie (d.w.s. komplement) te skep. Sodra die DNS-komplement gemaak is, word DNS-polimerase gebruik omdat dit 'n DNS-sjabloon gebruik om 'n DNS-komplementêre string te produseer.

In jou spesifieke voorbeeld bevat MIV 'n positiefstrengs, RNA-genoom. Die MIV RT kan óf RNA óf DNA sjablone gebruik om DNA komplemente te produseer, en dit is hoe die enkelstring RNA genoom in dubbelstring DNA getranskribeer word, voor integrasie.

Na my wete is die RT-ensieme wat kommersieel verkoop word (vir toepassings soos RT-PCR) tipies 'n mengsel van 'n RT-ensiem en 'n DNA-polimerase, geïsoleer van ander retrovirusse, soos muriene leukemievirus. 'n Belangrike oorweging vir laboratoriumtoepassing is die produksie van cDNA wat werklik die RNA-sjabloon van belang verteenwoordig. Aangesien RT-ensieme tipies 'n 3'->5'-eksonuklease-aktiwiteit het, is hulle nie in staat om die komplementstring te "proeflees" soos dit geproduseer word nie. Daarteenoor is daar baie doeltreffende proeflees-DNA-polimerase, en dit is hoekom 'n DNA-polimerase (met 'n hoë proefleesvermoë) gebruik word na eerste-string-sintese deur RT.


CDNA - (10/10/2008)

Wanneer cDNA gekonstrueer word in die RNA is uracel, is hierdie uracel ook basispaar met die "A" of nie,
Uracel het die vermoë om dubbelbinding met die A-nukleotied te maak of nie.
Hierdie RNAse H sal die enkelstrengs RNA kloof omdat dit sy uracel-identifikasie is

hoekom hierdie DNA-nuklease net die haarspeldlus kloof.

Ek weet nie of dit help nie, want jou plasing het my 'n bietjie verwar.

cDNA is enkelstrengig, net soos RNA. Jy moet 'n DNA-polimerase gebruik om dit dubbelstrengs te maak, so ek verstaan ​​nie wat die paringsprobleem is nie.

Kan jy jou probleem meer spesifiek maak?

Ek verstaan ​​nie mooi wat jou vraag is nie.

Wanneer ek cDNA maak, gebruik ek altyd 'A', 'T', 'C', 'G', dus is daar nie veronderstel om 'U' in cDNA te hê nie.

Ja as RNA dubbelstring vorm en saam paar, 'U' is paar met 'A', word U-A-paar gevorm deur waterstofbinding (ja 2 van hulle).

Soos ek verstaan, kan geen RNase dubbelstring RNA raak nie (perfek pas by geen bouble of lus nie).
Dus, wanneer RNA sekondêre struktuur-haarpen vorm, sal slegs enkelstrengslus deur RNase opgevreet word, maar nie dubbelstringstam nie.

Dit is wat ek onthou, en hoop dit help

wanneer jy cDNA verkry is dit dubbelstrengs, nie enkelstrengs nie (die "c" staan ​​vir komplementêr). jy gebruik mRNA om cDNA te kry. in vivo urasielbindings met adenien (RNA gebruik nie timien nie). as ek my nie misgis nie, gebruik jy 'n cDNA-stel wat 'n RNAse H verskaf, is die idee om dit te gebruik om van enige RNA ontslae te raak nadat jy die cDNA gesintetiseer het, nie om jou sjabloon-RNA te vernietig nie.

Ek bedoel wanneer jou cDNA voorberei is en dit is voorberei vanaf die sjabloon RNA,
cDNA is die in die eerste string en nou is dit geheg met die sjabloon RNA, hierdie sjabloon RNA word afgebreek deur RNAse H as gevolg van sy uracel identiteit.
nou moet jy tweede string van die cDNA skep.
einde van die cDNA maak 'n een of ander haarspeld-lusstruktuur as gevolg van self-priming en jy kan DNA-polimerase gebruik om die tweede DNA te maak,
Nadat jy hierdie tweede string gemaak het, kan jy die stamlus aan die einde van dubbelstringe deur DNAse vernietig, is ek reg

IN DIE RNA sal daar uracel wees en dit kan herken word deur die RNAse H en dus sal dit die RNA sjabloon kloof en ek dink die haarspeld lool word afgebreek deur enkelstreng DNA nuklease

Ek bedoel wanneer jou cDNA voorberei is en dit is voorberei vanaf die sjabloon RNA,
cDNA is die in die eerste string en nou is dit geheg met die sjabloon RNA, hierdie sjabloon RNA word afgebreek deur RNAse H as gevolg van sy uracel identiteit.
nou moet jy tweede string van die cDNA skep.
einde van die cDNA maak 'n een of ander haarspeld-lusstruktuur as gevolg van self-priming en jy kan DNA-polimerase gebruik om die tweede DNA te maak,
Nadat jy hierdie tweede string gemaak het, kan jy die stamlus aan die einde van dubbelstringe deur DNAse vernietig, is ek reg

Ek het myself nie die vorige keer duidelik gemaak nie. Toe ek gesê het cDNA is enkelstrengig, het ek bedoel dat jy eerste string cDNA sintetiseer. As jy wel tweede string cDNA wil maak, moet jy die RNA-sjabloon met RNase verwyder, 'n enkelstring cDNA-molekule maak, en dan die tweede string met 'n DNA-polimerase produseer. Het ek myself nou enigsins duideliker gemaak?


A. cDNA-konstruksie

mRNA is slegs 'n paar persent van 'n eukariotiese sel die meeste is rRNA. Maar daardie klein hoeveelheid mRNA kan van ander sellulêre RNA's geskei word op grond van hul 3&rsquo poly(A) sterte. Gee eenvoudig 'n totale RNA-ekstrak oor 'n oligo-d(T) kolom (hieronder geïllustreer).

Die stringe timidien (T) kan H-bind met die poli(A) sterte van mRNA's, wat hulle aan die kolom bind. Alle RNA's sonder 'n 3&rsquo poly(A) stert sal as afval deur die kolom vloei. 'n Tweede buffer word oor die kolom gevoer om die A-T H-bindings te destabiliseer om toe te laat elutie van 'n mRNA-fraksie. Wanneer vry&rsquo oligo d(T) by die geëlueerde mRNA gevoeg word, vorm dit H-bindings met die poli(A) sterte van die mRNAs, wat dien as 'n primer vir die sintese van cDNA kopieë van die poli(A) mRNAs oorspronklik in die selle. Ten slotte, vier deoksinukleotied DNA-voorlopers en omgekeerde transkripsie (oorspronklik geïsoleer van hoenderretrovirus-geïnfekteerde selle) word bygevoeg om omgekeerde transkripsie te begin. Die sintese van 'n cDNA-string komplementêr tot 'n mRNA word hieronder getoon.

Na verhitting om die cDNA's van die mRNA's te skei, word die cDNA gerepliseer om dubbelstring, of (ds)cDNA, te produseer, soos hieronder geïllustreer.

Sintese van die tweede cDNA-string word ook deur omgekeerde transkriptase gekataliseer! Die ensiem herken DNA sowel as RNA-sjablone, en het dieselfde 5&rsquo-tot-3&rsquo DNA-polimeriserende aktiwiteit as DNA-polimerases. Na 2de cDNA string sintese, S1 nuklease (a enkelstrengige endonuklease oorspronklik geïsoleer van 'n Oos-Asiatiese swam!) word bygevoeg om die lus van die (ds) cDNA-struktuur oop te maak en die res van die enkelstring-DNS te snoei. Wat oorbly is die (ds) cDNA.


Wat is cDNA

Die cDNA (komplementêre DNA) verwys na die enkelstring-DNS wat uit die omgekeerde transkripsie van boodskapper-RNA-template geproduseer word. Omgekeerde transkripsie word deur die ensiem, omgekeerde transkripsie, gekataliseer. cDNA word ook in retrovirusse geproduseer tydens die omskakeling van die RNA-genoom na DNA. cDNA word hoofsaaklik gebruik in die kloning van eukariotiese gene in prokariote. Eukariotiese gene bevat introne tussen die eksons, wat vir proteïene kodeer. Tydens transkripsie word beide introne en eksons in boodskapper-RNA (mRNA) gekodeer. Maar die introne word van mRNA verwyder om 'n volwasse mRNA te produseer deur die eksons saam te splyt. Die totale mRNA van 'n organisme word die transkriptoom genoem. Hierdie mRNA kan gebruik word om cDNA te produseer, wat slegs die proteïenkoderende streke van die genoom bevat.

Figuur 2: Omgekeerde transkripsie en PCR

Die sintese van cDNA vanaf DNA verminder die aantal basispare wat tydens 'n eksperiment hanteer moet word. Hierdie cDNA word dan in vektore gekloneer, wat vreemde DNA na ander prokariotiese of eukariotiese organismes kan dra. Bakterieë, sowel as die eensellige swamme, word met eukariotiese gene getransformeer. Omgekeerde transkripsie tesame met 'n PCR word in figuur 2.


DNA Polimerase Funksie

DNA-polimerase speel verskillende rolle in die meganismes van DNA-sintese, herstel en replikasie. DNA-polimerase word in sewe verskillende families gekategoriseer in eukariote, virusse, giste en bakterieë. Hierdie sewe families is A, B, C, D, X, Y en omgekeerde transkriptase (RT). Toekomstige navorsing kan verdere groepe ontdek.

Elkeen van hierdie families bevat 'n subset van DNA-polimerases wat hul eie reeks funksies het. Byvoorbeeld, DNA-polimerase I is 'n lid van die A-familie DNA-polimerase IV of DinB is 'n lid van die X-familie. Jy hoef nie elke naam te memoriseer nie, maar die basiese funksie per groep sal jou ook help om proteïensintese, geenmutasie en geenmodifikasie beter te verstaan.

Die struktuur van DNA-polimerase word vergelyk met 'n regterhand met 'n palm, vingers en duim. Jy kan jou voorstel dat 'n DNS-string deur 'n DNS-polimerasemolekule beweeg soos die lint deur 'n tikmasjien. Baie eenvoudig gestel, die vingers help om die oopgeritste DNS-string versigtig te posisioneer deur die nukleotiede te herken, die palm is die aktiewe plek waar fosforilering plaasvind (byvoeging van die fosfaatruggraat), en die duim bind die DNS in 'n dubbelheliksvorm soos dit uitgaan. die DNA-polimerase molekule. Maar nie alle DNA-polimerasefamilies het dieselfde strukturele komponente nie. Kom ons kyk bietjie meer in detail na die verskillende families.

Polimerase Familie A

Familie A is 'n groep DNA-replikasie of DNA-herstel-ensieme. In DNA-replikasie pas hulle 'n nukleotiedbasis by die regte maat. Dit is nodig wanneer 'n sel ook al voorberei om te verdeel, en die enkelstrengige chromosoom word gedupliseer sodat beide selle, ma en dogter, 'n volledige stel DNA het.

Pol γ is die enigste DNA-polimerase wat mitochondriale DNA kan repliseer (en slegs familie X DNA-polimerases voer mtDNA-herstel uit).

Pol theta (DNA-polimerase theta) herstel dubbelstring-breuke binne die DNA deur die gebreekte punte weer te verbind. Skade aan die geen wat kodeer vir Pol theta (θ)-produksie beteken dat breuke begin ophoop sonder om herstel te word, maar theta-bemiddelde eindverbinding (TMEJ) verhoog die risiko van mutasie in vergelyking met ander DNA-herstelmeganismes. As gevolg hiervan is foutiewe Pol θ-gene aan baie vorme van kanker gekoppel.

As gevolg van sulke studies oor siektes en DNA, het familie A DNA-polimerases ons gehelp om verskeie vorme van kanker te verstaan ​​en te behandel. Nog 'n voorbeeld van die A-familie is Pol nu wat help om interstrand-kruisverbindings (ICL) af te haak. Wat is 'n interstrand-kruisskakel? Het jy al ooit gehoor van mosterdgas wat in die Tweede Wêreldoorlog gebruik is? As u hierdie gas in groot hoeveelhede inasem, kan dit doodmaak, maar duisende soldate het blootstelling oorleef. Soos die tyd verbygegaan het, het dokters gevind dat hierdie dapper mans meer geneig is om aan kanker van die respiratoriese stelsel te sterf as mense wat nog nooit aan mosterdgas blootgestel is nie. Die gas het die longe binnegedring en direk met die DNS van longselle gereageer, en een nukleotiedstring saamgebind aan teenoorgestelde nukleotiede wat nie hul vennote (skuins- of kruisskakels). Hierdie ekstra bindings het dit moeilik gemaak om DNA voor replikasie uit te rits en, wanneer replikasie wel plaasgevind het, is foute gemaak met die kopiëring van die kode. Hierdie foute het mettertyd vermeerder, wat baie DNA-foute veroorsaak het wat gekopieer is en geenmutasies veroorsaak het. Hierdie mutasies het gelei tot die produksie van foutiewe selle of kanker. In die geval van mosterdgas was dit longkanker.

Pol nu (POLν) word spesifiek vervaardig om hierdie hoogs skadelike interstrand-kruisverbindings te probeer oplos. Dit word nie in groot hoeveelhede gemaak nie en blyk meer 'n rugsteun-ensiem te wees, maar daar kan meer daaraan wees as dit. Alhoewel dit eers in 2003 ontdek is, geniet minder bekende DNS-polimerases soos Pol nu baie aandag. Een van die redes is dat ongeveer 50% van borskankerselle verwyderde areas toon op sitogeniese ligging (posisie) 4p16.2 – dit is chromosoom 4, kort arm (p), streek 16, band 2). In die onderstaande prent is dit die posisie verste na links. Ook belangrik om daarop te let is dat dit presies is waar die geen vir Pol nu-sintese geleë is.

Polimerase Familie B Funksie

DNA polimerase B familie ensieme is belangrik tydens die proses van seldeling. Hulle kontroleer nuut-gerepliseerde en gesintetiseerde DNA. Die familie sluit beide prokariote en eukariote polimerases in.

Pol alfa ('n Griekse letter, dus 'n eukariote polimerase) skop die DNA-replikasieproses aan die gang en kommunikeer areas van skade aan ander B-familie DNA-polimerases soos Pol delta en Pol epsilon. Omdat hierdie foute onmiddellik reggestel word, is dit baie meer geneig om suksesvol te wees en die risiko van wanpasherstel (wat die verkeerde nukleotied by 'n beskadigde DNA-string pas) is laag.

'n Voorbeeld van wanpasherstel is die vervanging van 'n voorheen gebind guanien- en timienpaar om 'n guanien- en sitosienpaar in die DNA te produseer, waar timien verkeerdelik met sitosien vervang word. Bakteriële en eukariote DNA-polimerases is sentraal tot beide skadeherkenning en skadeherstelmeganismes.

Polimerase Familie C Funksie

Terwyl DNA-polimerase C-funksies slegs in bakterieë gevind word, moet ons nooit vergeet dat bakterieë menslike selle tien tot een oorskry op en binne die gemiddelde liggaam nie. Die meeste hiervan is noodsaaklik vir ons gesondheid, help die spysverteringstelsel en produseer chemikalieë wat stelsel- en orgaanfunksie verbeter. Minder dikwels koloniseer patogene bakterieë om simptome van siekte en siekte te produseer. Familie C – dikwels na verwys as PolC – is die belangrikste bakteriese DNA replikasie polimerase groep. Familie C is nie 'n herstelpolimerase nie.

Met dwelmweerstandige bakterieë aan die toeneem, word nuwe antibakteriese middels al hoe meer nodig. Nuwe gebiede van navorsing sluit in die ontwikkeling van antibiotika wat PolC direk teiken. Hierdie potensiële nuwe breëspektrummiddel kan replikasie in alle soorte bakterieë, gesond en patogenies voorkom, maar selfs meer belangrik, hierdie middels – wat nog in die vroegste stadiums van ontwikkeling is – vermy die meganismes wat lei tot bakteriële antibiotika weerstand.

Polimerase Familie D Funksie

Euryarchaeota beskryf 'n groep gram-positiewe en gram-negatiewe bakterieë wat dikwels gesê word dat hulle uiterste omgewings (ekstremofiele) verkies. Hierdie bakterieë leef en vermeerder egter in alle soorte omgewings, van diep seeslib tot ons spysverteringstelsels. Hulle gebruik D-familie DNA-polimerases (PolD) vir DNA-replikasie. Mutasietempo's in hierdie groep is baie hoog in vergelyking met dié van PolB DNA-polimerases. En anders as ander polimerases, het familie D nie 'n handagtige struktuur nie, waarskynlik omdat hierdie selle, evolusionêr gesproke – baie vroeë seltipes is.

Polimerase Familie X Funksie

Die X-familie van DNA-polimerase is beperk tot eukariotiese selle en speel beide replikatiewe en herstelrolle. Sommige werk om mitochondriale DNA te herstel waar hoë oksidatiewe omgewings DNA-skade aanmoedig. Ander herstel een tot (ongeveer) tien opeenvolgende nukleotiede in die DNA van die selkern. Die metode van herstel (basis eksisie herstel) in die mitochondrion en kern is soortgelyk. Base eksisie herstel (BER) is 'n proses wat verskeie tipes ensieme gebruik, insluitend DNA-glikosilase en endonukleases. Dit is X-familie DNA-polimerase (Pol beta en Pol lambda) wat die aktiewe plek vir hierdie herstel vorm en die korrekte nukleotied invoeg. As die geen vir X-familie DNA-polimerases beskadig word, word BER-prosesse negatief beïnvloed en dit word met sekere tipes kanker geassosieer. Sommige nuwe geteikende terapieë wat vir hierdie kankers ontwikkel is, inhibeer foutiewe basis-eksisie-herstelmeganismes.

Polimerase Familie Y Funksie

Die DNA-polimerase Y-familie is 'n replikatiewe en herstel-ensiem wat in eukariotiese en prokariotiese selle voorkom. Al hierdie polimerases is baie foutief ten opsigte van hul rol in die replikasie en onmiddellike herstel of omseiling van foutiewe DNA-volgordes. Tog kan te lae vlakke van hierdie familie van polimerase 'n mens se vatbaarheid vir kwaadaardige gewasse verhoog. Dit is hoekom die Y-familie soms met 'n tweesnydende swaard vergelyk word.

Die Y-familie groep aktiveer wanneer ander DNA-polimerases nie 'n effek kan maak nie. Dit is veronderstel om 'n rugsteunmeganisme te wees, dit kan verklaar waarom mutasies na hierdie tipe herstel meer algemeen voorkom.

Omgekeerde transkripsie-funksie

Virusse, retrovirusse en eukariote selle bevat RNA-afhanklike tru-transkriptase-ensieme. Hierdie ensieme – deel van die DNA-polimerase-groep – is wat virusse gevaarlik maak. Aangesien 'n virus slegs RNA bevat, moet dit 'n mikro-organisme of sel mislei om dit voort te plant. As ons selle net die RNA gekopieer het, kan hulle een of twee ongewone proteïene in 'n ribosoom produseer, maar dit sal nie die virus help om te vermeerder nie. In plaas daarvan moet die virale RNA homself op een of ander manier deel maak van die DNA-sjabloon sodat die sel permanente veranderinge ondergaan. Dit doen dit deur omgekeerde transkriptase-ensieme te gebruik.

Hierdie ensieme produseer dubbelstring-DNS vanaf 'n enkelstring-RNA-sjabloon in 'n proses bekend as omgekeerde transkripsie. Mutasies is algemeen. Die prent hieronder wys hoe die menslike immuniteitsgebrekvirus repliseer in 'n T-limfosiet. Omgekeerde transkripsie begin die groei van die virus deur die sel te mislei om komponente te produseer wat bymekaarkom om meer virusse uit geredigeerde DNA te vorm.

Die meeste omgekeerde transkripsieprosesse is die gevolg van skadelike virale infeksies, waar die enkelstrengige virale RNA gekopieer word om 'n dubbele DNA-string te vorm wat voortgaan om virale proteïene te maak. Dit word gedoen deur omgekeerde transkripsie (omgekeerd omdat die gewone metode is om dubbelstring-DNS te gebruik om 'n enkele string RNA te produseer).

Toetsing tydens die COVID-19 (SARS-CoV-2) in 2020 – soos met alle virale infeksietoetsing – vereis virale RNA-ekstraksie. Laboratoria gebruik 'n proses wat die omgekeerde transkriptase-polimerase kettingreaksie (rt-PCR) genoem word. Rt-PCR is nie so ingewikkeld om te verstaan ​​as wat dit mag klink nie. Hierdie toets produseer komplementêre DNA (cDNA) of DNA wat uit klein hoeveelhede virale RNA gekopieer word. Aangesien hierdie prosedure slegs baie klein hoeveelhede cDNA produseer, moet die resultate versterk word deur dit te repliseer. Sodra dit in voldoende hoeveelhede geproduseer is, kan die virale genoom opgespoor word.


Stap 1. Berei monster voor

RNA dien as die templaat in cDNA-sintese. Totale RNA word gereeld in cDNA-sintese gebruik vir stroomaf toepassings soos RT-(q)PCR, terwyl spesifieke tipes RNA's (bv. boodskapper-RNA (mRNA) en klein RNA's soos miRNA) verryk kan word vir sekere toepassings soos cDNA-biblioteekkonstruksie en miRNA-profilering.

Die handhawing van RNA-integriteit is van kritieke belang en vereis spesiale voorsorgmaatreëls tydens ekstraksie, verwerking, berging en eksperimentele gebruik. Beste praktyke om agteruitgang van RNA te voorkom, sluit in die dra van handskoene, pipettering met aërosolversperringspunte, die gebruik van nuklease-vrye laboratoriumware en reagense, en dekontaminasie van werkareas.

Om RNA te isoleer en te suiwer, is 'n verskeidenheid strategieë beskikbaar, afhangende van die tipe bronmateriaal (bv. bloed, weefsels, selle, plante) en doelwitte van die eksperimente. Die hoofdoelwitte van isolasie-werkvloeie is om RNA-molekules te stabiliseer, om RNases te inhibeer, en om opbrengs te maksimeer met behoorlike bergings- en ekstraksiemetodes. Optimale suiweringsmetodes verwyder endogene verbindings, soos komplekse polisakkariede en humiensuur, uit plantweefsels wat inmeng met ensiemaktiwiteit en algemene inhibeerders van omgekeerde transkriptases, soos soute, metaalione, etanol en fenol. Sodra dit gesuiwer is, moet RNA by –80°C gestoor word met minimale vries-ontdooi-siklusse.

Produk hoogtepunte

Wenke vir probleemoplossing

  1. Minimaliseer die aantal vries-ontdooi-siklusse van RNA-monsters om agteruitgang te voorkom.
  2. Stoor RNA in 'n EDTA-gebufferde oplossing om nie-spesifieke splitsing deur nukleases wat metaalioon-kofaktore het, te minimaliseer.
  3. Gebruik water wat nukleasevry gesertifiseer is of behandel is met DEPC (diëtielpirokarbonaat) om die afwesigheid van RNase te verseker.
  4. Evalueer die integriteit van RNA deur gelelektroforese of mikrofluidika.

RT-PCR & cDNA Sintese

Die sintese van DNA uit 'n RNA -sjabloon, via omgekeerde transkripsie, produseer komplementêre DNA (cDNA). Omgekeerde transkriptases (RT's) gebruik 'n RNA-sjabloon en 'n primer komplementêr tot die 3&prime-punt van die RNA om die sintese van die eerste string cDNA te rig, wat direk as 'n sjabloon vir die Polimerase-kettingreaksie (PCR) gebruik kan word. Hierdie kombinasie van omgekeerde transkripsie en PCR (RT-PCR) laat die opsporing van RNA's met 'n lae oorvloed in 'n monster toe, en die produksie van die ooreenstemmende cDNA, wat die kloning van lae kopie-gene vergemaklik. Alternatiewelik kan die eerste-string cDNA dubbelstrengs gemaak word met behulp van DNA Polymerase I en DNA Ligase. Hierdie reaksieprodukte kan gebruik word vir direkte kloning sonder amplifikasie. In hierdie geval word RNase H-aktiwiteit, van óf die RT óf eksogeen verskaf, vereis.

Baie RT's is beskikbaar by kommersiële verskaffers. Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Reverse Transcriptase and Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV, MMLV) Reverse Transcriptase is RT's wat algemeen in molekulêre biologiese werkstrome gebruik word. ProtoScript & reg II Reverse Transcriptase is 'n rekombinante M-MuLV reverse transkriptase met verminderde RNase H-aktiwiteit en verhoogde termostabiliteit. Dit kan gebruik word om eerste string cDNA by hoër temperature as die wildtipe M-MuLV te sintetiseer. Die ensiem is aktief tot 50 ° C en bied 'n hoër spesifisiteit, 'n hoër opbrengs van cDNA en 'n meer volledige cDNA-produk tot 12 kb lank.

Die gebruik van gemanipuleerde RT's verbeter die doeltreffendheid van vollengte-produkvorming, om te verseker dat die kopiëring van die 5&prime-kant van die mRNA-transkripsie voltooi is, en maak die voortplanting en karakterisering van 'n getroue DNA-kopie van 'n RNA-volgorde moontlik. Die gebruik van die meer termostabiele RT's, waar reaksies by hoër temperature uitgevoer word, kan nuttig wees vir omgekeerde transkripsie van RNA wat sekondêre struktuur bevat.

Vir hulp met die vergelyking van die beskikbare RT's en cDNA -sintese -reagense, sien ons RT/cDNA -sintese -seleksiekaart.

Kies tipe:

Hierdie produk word gedek deur een of meer patente, handelsmerke en/of outeursregte wat besit of beheer word deur New England Biolabs, Inc (NEB).

Terwyl NEB sy produkte vir verskillende toepassings ontwikkel en bekragtig, kan die gebruik van hierdie produk van die koper vereis om bykomende intellektuele eiendomsregte van derde partye vir sekere toepassings te verkry.

Kontak NEB se Global Business Development -span by [email protected] vir meer inligting oor kommersiële regte.

Hierdie produk is slegs bedoel vir navorsingsdoeleindes. Hierdie produk is nie bedoel om gebruik te word vir terapeutiese of diagnostiese doeleindes by mense of diere nie.


Nuwe ontdekking wys menslike selle kan RNA-reekse in DNA skryf – daag die sentrale beginsel in biologie uit

Selle bevat masjinerie wat DNS dupliseer in 'n nuwe stel wat in 'n nuutgevormde sel ingaan. Daardie selfde klas masjiene, genaamd polimerases, bou ook RNA-boodskappe, wat soos notas is wat uit die sentrale DNA-bewaarplek van resepte gekopieer is, sodat dit meer doeltreffend in proteïene gelees kan word. Maar daar is gedink dat polimerases slegs in een rigting werk DNS in DNS of RNS. Dit verhoed dat RNA-boodskappe teruggeskryf word in die meesterresepteboek van genomiese DNA. Nou, Thomas Jefferson Universiteit navorsers verskaf die eerste bewyse dat RNA-segmente teruggeskryf kan word in DNA, wat moontlik die sentrale dogma in biologie uitdaag en wye implikasies kan hê wat baie velde van biologie raak.

“Hierdie werk maak die deur oop vir baie ander studies wat ons sal help om die belangrikheid te verstaan ​​van 'n meganisme om RNA-boodskappe in DNA in ons eie selle om te skakel,” sê Richard Pomerantz, PhD, medeprofessor in biochemie en molekulêre biologie by Thomas Jefferson Universiteit. “Die realiteit dat 'n menslike polimerase dit met hoë doeltreffendheid kan doen, laat baie vrae ontstaan.” Byvoorbeeld, hierdie bevinding dui daarop dat RNA-boodskappe gebruik kan word as sjablone vir die herstel of herskryf van genomiese DNA.

Die werk is op 11 Junie 2021 in die joernaal gepubliseer Wetenskap vooruitgang.

Saam met eerste skrywer Gurushankar Chandramouly en ander medewerkers, Dr Pomerantz’s span begin deur die ondersoek van een baie ongewone polimerase, genoem polimerase theta. Van die 14 DNA-polimerases in soogdierselle, doen slegs drie die grootste deel van die werk om die hele genoom te dupliseer om vir seldeling voor te berei. Die oorblywende 11 is meestal betrokke by die opsporing en herstelwerk wanneer daar’s 'n breek of fout in die DNA-stringe. Polimerase theta herstel DNA, maar is baie foutgevoelig en maak baie foute of mutasies. Die navorsers het dus opgemerk dat sommige van die polimerase theta’ se “slegte” eienskappe was wat dit met 'n ander sellulêre masjien gedeel het, alhoewel een meer algemeen in virusse - die omgekeerde transkriptase. Soos Pol theta, tree MIV-omgekeerde transkriptase op as 'n DNA-polimerase, maar kan ook RNA bind en RNA teruglees in 'n DNA-string.

In 'n reeks elegante eksperimente het die navorsers polimerase theta getoets teen die omgekeerde transkripsie van MIV, wat een van die bes bestudeerde in sy soort is. Hulle het getoon dat polimerase theta in staat was om RNA-boodskappe in DNS om te skakel, wat dit gedoen het sowel as MIV-omgekeerde transkripsie, en dat dit eintlik 'n beter werk gedoen het as wanneer DNS na DNS gedupliseer word. Polimerase theta was meer doeltreffend en het minder foute ingebring wanneer 'n RNA-sjabloon gebruik is om nuwe DNS-boodskappe te skryf, as wanneer DNS in DNS gedupliseer is, wat daarop dui dat hierdie funksie sy primêre doel in die sel kan wees.

Die groep het saam met dr. Xiaojiang S. Chen se laboratorium by USC gewerk en x-straalkristallografie gebruik om die struktuur te definieer en gevind dat hierdie molekule in staat was om van vorm te verander om die meer lywige RNA-molekule te akkommodeer - 'n prestasie wat uniek is onder polimerases .

“Ons navorsing dui daarop dat polimerase theta’ se hooffunksie is om op te tree as 'n omgekeerde transkripsie,” sê dr Pomerantz. “In gesonde selle kan die doel van hierdie molekule wees na RNA-gemedieerde DNA-herstel. In ongesonde selle, soos kankerselle, word polimerase theta hoogs uitgedruk en bevorder kankerselgroei en middelweerstand. Dit sal opwindend wees om verder te verstaan ​​hoe polimerase theta’ se aktiwiteit op RNA bydra tot DNA herstel en kanker-sel proliferasie.”

Verwysing: “Polθ omgekeerde transkribeer RNA en bevorder RNA-sjabloon DNA herstel” deur Gurushankar Chandramouly, Jiemin Zhao, Shane McDevitt, Timur Rusanov, Trung Hoang, Nikita Borisonnik, Taylor Treddinick, Felicia Wednesday Lopezcolorado, Tatibanana A Kent. , Joseph Mallon, Jacklyn Huhn, Zainab Shoda, Ekaterina Kashkina, Alessandra Brambati, Jeremy M. Stark, Xiaojiang S. Chen en Richard T. Pomerantz, 11 Junie 2021, Wetenskap vooruitgang.
DOI: 10.1126/sciadv.abf1771

Hierdie navorsing is ondersteun deur NIH-toekennings 1R01GM130889-01 en 1R01GM137124-01, en R01CA197506 en R01CA240392. Hierdie navorsing is ook gedeeltelik ondersteun deur 'n Tower Cancer Research Foundation-toekenning. Die skrywers rapporteer geen botsing van belange nie.


DNA-polimerase-termostabiliteit

DNA is 'n dinamiese molekule met 'n struktuur wat gestabiliseer word deur 'n groot aantal swak interaksies. Die stabiliteit van die DNS-dubbelheliks hang af van 'n verskeidenheid faktore, insluitend DNS-volgorde, pH, ioniese sterkte, oplosmiddels en temperatuur. In die besonder, soos die temperatuur verhoog word, word die swak interaksies opeenvolgend ontwrig, wat eers lei tot gelokaliseerde denaturasie van die terminale en geselekteerde interne volgordes, en uiteindelik lei tot volledige skeiding van DNA-stringe. Die mate waarin hierdie destabilisering verlang of geduld word, hang af van die toepassing.

Kloningsprosedures, soos eindpolering, word byvoorbeeld gemaksimeer wanneer die termini gestabiliseer word, wat die gebruik van 'n polimerase van 'n mesofiele organisme voorstel. Tweede string cDNA sintese en nick translasie is ander toepassings wat tradisioneel mesofiele ensieme gebruik. Sulke ensieme is maksimaal aktief by temperature van 25&ndash40°C en behou ook aansienlike aktiwiteit by laer temperature. Oor die algemeen kan hulle hitte-geïnaktiveer word en werk in dieselfde buffers wat gebruik word deur beperking endonukleases en ligases, wat die behoefte aan intermediêre DNA suiwering uitskakel.

'n Verskeidenheid ander molekulêre biologie toepassings, soos PCR, vereis hoë temperature om die DNA te denatureer voor primer uitgloeiing of tydens polimerisasie om sekondêre struktuur te verminder, en sodoende polimerase pouse te verminder. Argeale DNA-polimerases, soos Vent® (NEB #M0254) en 9°Nm&trade (NEB #M0260) is afkomstig van hipertermofiele en is uiters bestand teen hitte-inaktivering, selfs by 100°C, en vertoon maksimum polimerase-aktiwiteit by 75&ndash85°C. Bakteriële termofiele het ensieme opgelewer soos Taq DNA-polimerase, wat aktief is by soortgelyke temperature, maar nie heeltemal so stabiel by 95°C is nie, soos sommige van sy argaeale eweknieë.

Vent® is 'n geregistreerde handelsmerk van New England Biolabs, Inc.
9&gradem&trade is 'n handelsmerk van New England Biolabs, inc.


CDNA (komplementêre DNA)

Die term cDNA verwys na komplementêre DNA. Dit is bekend dat cDNA gesintetiseer word, of vervaardig word uit 'n mRNA of boodskapper-RNA-sjabloon. Dit word gesintetiseer in 'n reaksie wat deur die omgekeerde transkriptase en DNA-polimerase-ensieme gekataliseer word. Noodsaaklik om daarop te let is dat cDNA gewoonlik gebruik word om eukariotiese gene in prokariote te kloneer.

Wetenskaplikes gebruik gewoonlik cDNA wanneer hulle s sekere proteïen wil uitdruk in 'n sel wat nie normaalweg so 'n proteïen uitdruk nie. Daar word na hierdie proses verwys as heteroloë uitdrukking. Die uitdrukking van so 'n proteïen sal gedoen word deur die cDNA wat vir daardie proteïen kodeer na die ontvangersel oor te dra. Dit is ook noodsaaklik om daarop te let dat cDNA ook deur retrovirusse soos Simian Immunodeficiency Virus, MIV-1 en MIV-2 geproduseer kan word. Sodra die cDNA uit sulke virusse geskep is, word dit in die genoom van die gasheer geïntegreer, waar dit voortgaan om 'n provirus te skep.

Navorsing toon dat wanneer 'n proteïen gesintetiseer word, 'n geen se DNA in 'n mRNA getranskribeer word, wat dan in 'n proteïen vertaal word. Gene word gewoonlik in eukariotiese en prokariotiese gene verdeel. Die enigste verskil tussen hierdie gene is dat die eukariotiese gene introne bevat in plaas van ektrone wat in die prokariotiese gene vervat is.

Introne is nie koderende volgordes nie, terwyl ektrone DNA-koderingstelsels is. Tydens die transkripsie van die proteïene word alle intron-RNA van die primêre RNA gesny en die oorblywende stuk word teruggesny om 'n mRNA te word. Met ander woorde, die mRNA word gevorm nadat alle introne van die primêre RNA verwyder is. Sodra dit gevorm is, word die mRNA dan in 'n aminosuur vertaal en bestaan ​​dit uit 'n nuutgevormde proteïen. Uit bogenoemde word opgemerk dat prokariotiese gene geen introne bevat nie, dus is hul RNA's nie onderhewig aan sny of splitsing nie.

In sommige gevalle kan dit nodig wees om 'n prokariotiese sel die gene van 'n eukariotiese sel te laat uitdruk. Een van die maniere om dit moontlik te maak, is deur eukariotiese DNA direk in die prokariotiese sel by te voeg, sodat dit 'n proteïen van sy eie kan maak. Soos reeds opgemerk, het die eukariotiese DNA introne, terwyl die prokariotiese DNA nie die masjinerie het om introne te verwyder van die RNA wat getranskribeer is nie. Gevolglik moet alle intronvolgordes uit die eukariotiese DNA verwyder word voordat dit na die prokariotiese sel oorgedra word. Op hierdie manier sal die sel nie met die las geplaas word om introne te verwyder nie. Die intronvrye DNA wat geskep word, is as gevolg van intronvrye mRNA, en daarom word dit na verwys as 'n komplementêre kopie van die mRNA. Dit is om hierdie rede waarna verwys word as 'n komplementêre DNA of cDNA.

Alhoewel daar talle prosesse is om cDNA te sintetiseer, is die beste manier om dit te doen deur volwasse of volledig gesplitste mRNA te gebruik. Dit word gewoonlik gedoen deur die ensiem omgekeerde transkriptase te gebruik. Hierdie ensiem word gebruik omdat dit hoofsaaklik as 'n enkele string van mRNA funksioneer. Dit genereer sy cDNA deur RNA-basispare aan hul DNA-komplemente te koppel.


Omgekeerde Transkriptase PCR (RT-PCR)

RT-PKR, of omgekeerde transkriptase-PKR, is 'n variasie van die standaard-PKR-tegniek wat die amplifikasie van spesifieke mRNA verkry uit baie klein monsters behels. Dit skakel die behoefte uit vir die vervelige mRNA-suiweringsproses wat nodig is vir konvensionele kloningstegnieke. Met RT-PKR word omgekeerde transkriptase en 'n RNA-monster bykomend tot die standaard PCR-reagense gebruik. Die reaksiemengsel word verhit tot 37 ˚C, wat voorsiening maak vir die produksie van komplementêre cDNA-kopie van die RNA-monster deur omgekeerde transkripsie. Hierdie cDNA gloei dan aan een van die primers wat tot eerste string sintese lei. Standaard PCR volg van hier af waarin dsDNA uiteindelik gegenereer word. RT-PKR word gereeld gekombineer met intydse PCR (qPCR), wat wyd gebruik word vir die kwantifisering van transkripsievlakke in selle en weefsels.


Kyk die video: DNA replicatie Geüpdatet (September 2022).