Inligting

'n Vraag wat verband hou met qPCR-analise

'n Vraag wat verband hou met qPCR-analise


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hier is die ding. Ek gebruik 'n metode, genaamd TU-Tagging, om seltipe spesifieke RNA te isoleer. Jy kan meer oor die metode hier vind: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2783170/

Om dit baie kort te verduidelik, is daar 'n ensiem genaamd UPRT (Uracil Phosphoribosyltransferase) wat uitgedruk word in Toxoplasma gondii. Onder normale omstandighede skep UPRT UMP uit gasheerselle se uracil en hierdie UMP word in RNA geïnkorporeer. Hulle het egter gevind dat hierdie ensiem nie uracil en uracil analoog 4-Thiouracil kan onderskei nie (het basies thio op die 4de posisie van die uracil). Dus, wanneer 4-TU ekstern verskaf word, inkorporeer UPRT 4-TU in RNA en jy kry tio-RNA. Dan met basiese biotinilering en streptaividin-isolasie kan jy tio-RNA van jou totale RNA-isolaat kry. (Natuurlik moet UPRT op spesifieke seltipes van jou belang geplaas word)

In elk geval, na die verduideliking (miskien was dit egter onnodig) hier is my vraag.

Nadat ek my sogenaamde spesifieke RNA isoleer, kontroleer ek die suiwerheid deur qPCR deur seltipe spesifieke merkers te gebruik. Ek het nie 'n verwysingsgeen nie. Die enigste ding waarin ek belangstel, is die teenwoordigheid of afwesigheid van merkers (en ook die vouverandering natuurlik). Nou het ek 'n paar data, maar ek weet nie hoe om dit aan te bied nie (Daar is niemand in my laboratorium wat met qPCR ervaar is nie en my ervaring is net so beperk).

Het jy 'n idee hoe ek hierdie probleem kan oorkom? Ek het na 'n paar berekeninge gekyk, maar die meeste van hulle is nodig vir verwysingsgene of ander dinge. Die enigste ding wat ek het, is siklusgetalle en my primers se doeltreffendheid. Dink jy ek kan iets met hierdie insette doen? (Ek weet dat siklusgetalle niks in 'n plot beteken nie, so ek wil nie basies siklusgetalle plaas nie.)

Dankie dat jy dit gelees het. Enige hulp/idee sal baie waardeer word. Ek is so desperaat. Dankie.


OK, kom ons begin van die begin af. Ons weet wat een seltipe anders maak as 'n ander seltipe, is die uitdrukking daarvan - dit wil sê watter gene word eintlik in RNA getranskribeer. Daarom moet daar sekere RNA in een seltipe wees wat nie in 'n ander seltipe moet uitkom nie. As jy RNA van 'n sekere seltipe isoleer, sê 'n neuron en jy wil wys dat jou monster-RNA slegs neuronale RNA bevat, dan moet jy 2 dinge bewys:

  1. Dat jou monster sekere RNA-volgordes bevat waarvan bekend is dat dit in neurone is
  2. Dat jou monster NIE sekere RNA-volgordes bevat wat bekend is dat hulle NIE in neurone is nie

Daar is verskeie laboratoriumprosedures om die teenwoordigheid/afwesigheid van sekere RNA-volgordes in 'n monster te identifiseer, jou gekose tegniek is qPCR. Hier is 'n kort verduideliking van hoe qPCR werk.

Jy sit jou RNA monster saam met 'n volgorde spesifieke primer in die qPCR masjien. Die primer sal aan 'n spesifieke volgorde bind en dan sal daardie string gerepliseer word. Dit sal aanhou herhaal, siklus na siklus. So as jy begin met 1 ry van sê ry A, na siklus 1, sal jy eindig met 2, dan 4, dan 8 en so aan.

In elk geval, as jou doel is om qPCR te gebruik om te bewys dat jou RNA-monster van 'n neuron kom, dan moet jy 'n paar volgordes vind wat bekend is dat dit spesifiek vir neurone is. Soek dan primers vir hierdie rye. Gebruik dan hierdie primers om 'n bietjie RNA uit jou monster te versterk. As jy amplifikasie kry, dan moes jy daardie volgorde in jou RNA-monster gehad het. Om jouself verder te ondersteun, wil jy dalk ook 'n paar rye naslaan waarvan bekend is dat hulle NIE in neurone uitgedruk word nie en met dieselfde beginsel bewys dat hierdie rye NIE in jou monster is nie.

Bogenoemde sal vir jou kwalitatiewe data gee, dit sal jou eenvoudig vertel of 'n sekere volgorde uitkom of nie in jou RNA-monster bestaan ​​nie. Aangesien jy net in die teenwoordigheid of afwesigheid van merkers belangstel, behoort dit voldoende te wees. As jy egter jou data wil kwantifiseer, dit wil sê om uit te vind hoeveel 'n sekere volgorde uitgedruk word, lees dan verder.

Jy kan ook kwantitatiewe data van qPCR kry (qPCR staan ​​immers vir kwantitatiewe PCR). Die aantal kopieë van 'n RNA-volgorde na 'n sekere aantal siklusse is eweredig aan die aanvanklike aantal kopieë van daardie reeks in jou monster. Met ander woorde, as jou aanvanklike RNA-monster baie volgorde A en 'n bietjie volgorde B het, moet jy by enige siklus meer volgorde A sien.

Ons kan voordeel trek uit hierdie verhouding. Daar is twee algemene metodes wat jy kan gebruik om jou resultate te kwantifiseer. Die een word Absolute kwantifisering genoem en die ander Relatiewe kwantifisering.

Die idee agter absolute kwantifisering is dat jy twee qPCR's laat loop. In een doen jy jou RNA-monster. In die tweede loop jy 'n standaardmonster, waarvoor 'n standaardkurwe beskikbaar is. Jy kan dan jou RNA-monsterresultate met die standaard se resultate vergelyk om ’n idee te kry van die aantal kopieë in jou monster.

Die idee agter relatiewe kwantifisering is dat jy die qPCR-resultate vir jou volgorde van belang vergelyk met die qPCR-resultate van 'n verwysingsgeen. Dit sal jou net 'n idee gee van hoeveel keer min of meer jou volgorde van belangstelling as die verwysingsgeen uitgedruk word. Aangesien jy nie 'n verwysingsgeen het nie, kan jy nie hierdie metode gebruik nie, maar jy kan die absolute kwantifiseringsmetode gebruik wat in die paragraaf hierbo verduidelik word!

Hier is baie nuttige skakels oor kwantifisering deur gebruik te maak van qPCR: http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction#Quantification_of_gene_expression

http://relative.gene-quantification.info/

Laat weet my as jy verdere verduidelikings benodig.


Ons het 'n R-pakket ontwikkel om metodes vir kwaliteitassessering, ontleding en toetsing van qPCR-data vir statistiese betekenisvolheid te implementeer. Dubbel Delta CT en standaard kurwe modelle is geïmplementeer om die relatiewe uitdrukking van teikengene van te kwantifiseer CT in standaard qPCR kontrolegroep eksperimente. Daarbenewens word berekening van amplifikasie doeltreffendheid en kurwes van reeksverdunning qPCR eksperimente gebruik om die kwaliteit van die data te assesseer. Laastens is twee-groeptoetsing en lineêre modelle gebruik om te toets vir betekenisvolheid van die verskil in uitdrukkingskontrolegroepe en toestande van belang.

Deur twee datastelle van qPCR-eksperimente te gebruik, het ons verskillende kwaliteitbeoordeling, analise en statistiese toetsing in die pcr-pakket toegepas en die resultate vergelyk met die oorspronklike gepubliseerde artikels. Die finale relatiewe uitdrukkingswaardes van die verskillende modelle, sowel as die tussentydse uitsette, is gekontroleer teen die verwagte resultate in die oorspronklike vraestelle en is akkuraat en betroubaar gevind.


Abstrak

'n Algemene metode vir die berekening van resultate van qPCR-eksperimente is die vergelykende Ct metode, ook genoem die 2 -ΔΔCt metode. Verskeie aannames is egter ingesluit in die 2 -ΔΔCt metode en standaard statistiese ontledings is nie direk van toepassing nie. Hier beskryf ons 'n ander metode, die X0 metode, vir resultaatberekeninge en statistiese analise van qPCR-eksperimente. Die X0 metode verskil van die 2 -ΔΔCt metode deur 'n omskakeling van die eksponensieel verwante Ct waardes in lineêr verwante X in te voer0 waardes, wat die hoeveelheid beginmateriaal in 'n qPCR-eksperiment verteenwoordig. Resultate bereken deur die X0 metode word geïllustreer vir qPCR-eksperimente met tegniese en biologiese herhalings, insluitend prosedures om standaardafwykings te bereken. Inkorporering van primer-doeltreffendheid in berekeninge deur die X0 metode word ook beskryf. Altesaam, die X0 metode vorm 'n baie eenvoudige en akkurate alternatief vir die 2 -ΔΔCt metode vir resultaat berekeninge van qPCR data.


'n Blywende rol gesien vir qPCR

Selfs as dPCR uitbrei, vertrou verskaffers dat qPCR 'n werkeseltegnologie in molekulêre biologie-navorsing sal bly.

Hoekom? Eerstens, qPCR is goed gevestig as 'n geloofwaardige en bekwame tegnologie en word deur navorsers vertrou vir sy spoed, sensitiwiteit, spesifisiteit en gemak van gebruik. Dit is die mees bruikbare vir relatiewe geenuitdrukking eksperimente en as 'n valideringsinstrument wat ander genomiese metodes ondersteun, insluitend DNA-mikroskikkings en volgende generasie volgordebepaling (NGS) toepassings. Ook, omdat qPCR sedert 1993 bestaan, het die meeste navorsers maklike toegang tot die tegnologie en tot 'n groot hoeveelheid literatuur wat beskikbaar is vir verwysing.

Navorsers kan uit hul eie historiese data put wanneer hulle hul eksperimente ontwerp en interpreteer in onder meer geen-uitdrukking-analise, genotipering, patogeen-opsporing, virale kwantifisering, DNA-metileringsanalise en hoë-resolusie-smeltontleding.

Soos die naam aandui, meet intydse PCR PCR-versterking soos dit plaasvind. Die relatiewe aard van qPCR, wat 'n teiken se konsentrasie of relatiewe oorvloed bereken deur dit met 'n bekende konsentrasie of kontrole te vergelyk, maak die metode besonder geskik vir geenuitdrukking-analise. Wanneer qPCR gebruik word, soos algemeen met baie ander biologiese instrumente, is veranderinge in teikenuitdrukkingsresultate die mees betekenisvolle in vergelyking met verskillende eksperimentele toestande, soos siek teenoor gesonde weefsel.

Goed ontwerpte qPCR-toetse kan verskeie tot soveel as miljoene kopieë van 'n teikenvolgorde per reaksie opspoor wat dit 'n aansienlike dinamiese omvang gee. Dit is geskik vir sifting of stroomaf valideringseksperimente met sy vermoë om teikens met baie lae en baie hoë kopiegetal in dieselfde lopie op te spoor.

Wanneer qPCR gebruik word, kan navorsers hul opsporingchemie kies. Hulle kan kies van goedkoop interkalerende kleurstowwe (soos SYBR-groen) tot 'n verskeidenheid teikenspesifieke probes (TaqMan, molekulêre bakens, ens.). Pryse per monster is baie buigsaam aangesien gebruikers maklik reaksievolume, deurset en opsporingsmetode kan verander om aan eksperimentele behoeftes te voldoen.


Herhalings en foutvoortplanting

Een plek waar 'n aantal foute blykbaar insluip, is die behandeling van herhalings binne PCR-eksperimente.

Die mees algemene fout wat ek gesien het, is die gebruik van die verkeerde tipe gemiddelde wanneer die gemiddelde verhouding bereken word. Die belangrikste feit om te onthou is om altyd die rekenkundige gemiddelde op enigiets op 'n lineêre skaal te gebruik en altyd die meetkundige gemiddelde op enigiets op 'n eksponensiële skaal te gebruik.

Meer bondig, as dit CT-waardes (of verskille daarvan) is, gebruik dan 'n rekenkundige gemiddelde. As dit konsentrasiewaardes is (enigiets wat $$Efficiency^ is$$) gebruik dan die meetkundige gemiddelde.

Ek kry ook gereeld verkeerde behandeling van foutstawe teë. Dikwels sal mense die standaardafwyking (of standaardfout) van konsentrasiedata, of verhoudings, neem en dit direk in hul staafgrafieke uitbeeld. Hierdie maatstawwe veronderstel egter normaalverspreide data wat slegs die geval is vir die CT-waardes self, nie die verhoudings of konsentrasies nie. Kortliks, as jou y-as op jou grafiek lineêre skaal is en jou foutstawe is dieselfde aan beide kante, dan is dit verkeerd.

Ten slotte moet ons handel oor foutvoortplanting. Die fout in jou eksperiment is saamgestel uit die foute van $$(Untreated,Ref) + (Untreated,Target) + (Treated,Ref) + (Treated,Target)$$. Hierdie fout sal gewoonlik meer wees as die fout wat geïmpliseer word deur die standaardfout van die ΔΔCT-waardes vir elke replikaat te neem. Vir ongekorreleerde veranderlikes kan ons egter additiewe foute voortplant deur die formule te gebruik:

Dit werk goed vir delta delta CT aangesien die fout net die produk is van veelvuldige toevoegingsfoute. Vir standaardkrommebenaderings het ons egter ook foute van die doeltreffendheidwaardes wat ons vir ons kurwe bereken het en dit kan nie as 'n additiewe faktor uitgedruk word nie.

In plaas daarvan moet ons 'n Taylor-reeks gebruik om die fout te propageer. Dit laat toe dat al ses bronne van variansie (4x CT's + 2x Doeltreffendheid) by die finale foutberekening ingesluit word.


Normalisering

Datanormalisering het ten doel om sommige van die tekortkominge wat hierbo gelys is aan te spreek, en daar is talle verskillende benaderings, met nuwes wat heeltyd voorgestel word. Normalisering na totale monstermassa of -volume is 'n erfenisbenadering wat oorbly van noordelike kladtegnieke wanneer gellaai en monsteroordrag na filtreerpapier bekragtig is deur na rRNA of sogenaamde huishoudelike gene soos GAPDH te ondersoek, waarvan die uitdrukking as stabiel tussen individue aanvaar is. , eksperimentele toestande of fisiologiese toestande. Terwyl dit nog gebruik word vir RT-qPCR metings, is daar verskeie nadele van die meet van mRNA of miRNA vlakke relatief tot monster massa of volume. Byvoorbeeld, in 'n vergelyking van monsters van verskillende oorsprong bv. tumorbiopsies en normale weefsel is dit verkeerd om aan te neem dat dieselfde weefselmassa soortgelyke selgetalle bevat, of dat die relatiewe verspreiding van prolifererende selle gelyk is. Normalisering teen totale RNA sal die uitdrukking van teikengene in die tumorbiopsies onderskat. Hierdie benadering kan meer geskik wees wanneer die monsters met behulp van laservang mikro disseksie onttrek word en 'n presiese aantal en soortgelyke selle geteiken word, selfs dan is hierdie benadering nie ideaal nie. 'n Verwante tegniek, wat weer aan noordelike klad herinner, is om te normaliseer na DNS- of RNA-konsentrasie. Alhoewel die meet van geenkopiegetal relatief tot inset-DNA-konsentrasie 'n volkome geldige benadering is, is die situasie meer ingewikkeld vir transkripsie-kwantifisering. Wanneer RNA-konsentrasie bepaal word, is die oorgrote meerderheid van die RNA-komponent ribosomale RNA (rRNA). Transkripsie van rRNA is onafhanklik van die transkripsie van boodskapper-RNA (mRNA) aangesien dit deur verskillende ensieme getranskribeer word. Verder soos rRNA opmaak

80 % van die RNA-fraksie, normalisering na rRNA sal subtiele veranderinge in die mRNA-komponent masker wat tipies 2-5% uitmaak. Daarbenewens neem hierdie benadering nie variasies in die sjabloon RNA kwaliteit, of veranderinge in rRNA vlakke in ag wat afhanklik is van sellulêre differensiasie/proliferasie status nie. Nietemin, hoewel dit nie ideaal is nie, kan daar situasies wees waar daar geen ander alternatiewe is as om relatief tot totale RNA te meet nie en sommige ontledingspakkette soos GenEx-sagteware van MultiD6 laat die totale RNA-konsentrasie toe om as 'n normaliseringstegniek saam met ander benaderings te evalueer. Een teoretiese oplossing sou wees om mRNA te suiwer en teen totale mRNA te normaliseer. Ongelukkig lei die suiweringsproses onakkuraathede en 'n ekstra prosesseringsstap in wat ongewens is en in baie gevalle is die biopsie te klein om doeltreffende suiwering van re mRNA moontlik te maak. 'n Baie algemene benadering om vir monsterverskille reg te stel, is om die teikenkonsentrasie relatief tot dié van 'n enkele interne verwysingsgeen uit te druk. Om hierdie benadering geldig te maak, moet die uitdrukking van die enkele verwysingsgeen konstant bly tussen alle eksperimentele monsters. Om so 'n gerieflike teiken te vind is addisionele validering nodig, maar selfs vandag is die al te algemene en misleide benadering om hierdie geen lukraak te kies sonder validering GAPDH, b actin en 18S is besondere gunstelinge in die gepubliseerde literatuur, wat gewoonlik sonder validering of regverdiging gebruik word. . Wanneer die verwysingsgeen nie stabiel tussen alle monsters uitgedruk word nie, sal 'n verhouding van die teikengeen van belang tot die verwysingsgeen die uitdrukkingsveranderinge van beide teikens weerspieël. Dit is nie nuttig wanneer die uitdrukkingsgedrag van nie een van die teikens gedefinieer is nie en kan lei tot onakkuraathede en vals resultate7. 'n Wysiging aan hierdie benadering is om die gekose verwysingsgeen8 te bekragtig of 'n beduidende verwysingsgeen met gedefinieerde biologie te kies waar die transkripsierespons goed gekarakteriseer is ('n benadering waarna verwys word as normalisering na 'n Spesifieke Interne Verwysing, of SIR). Op hierdie manier word die biologie van die teikengeen uitgedruk relatief tot die verandering in biologie van die verwysingsgeen. Die probleem met die gebruik van hierdie enkelverwysingsgeenbenaderings is dat hul resolusie (minimum selfvertroue meting) beperk is tot die minimum fout van die tegniek.

'n Alternatiewe benadering, wat die huidige goue standaard is, is om die data relatief tot die gedrag van veelvuldige verwysingsgene uit te druk en meetkundige gemiddeldes te gebruik om te meet en te beheer vir foutgeïnduseerde neigings in die relatiewe verwysingsgeenuitdrukking. Daar is verskeie benaderings soos dié wat deur geNorm of Normfinder10,11 aangebied word wat toelaat dat die hoeveelheid potensiële verwysingsgene in geselekteerde groepe eksperimentele en kontrolemonsters vergelyk kan word. Hierdie gebruik die gekombineerde variasie van verskeie gene om 'n stabiele verwysingsfaktor vir normalisering te produseer. Die vereiste vir veelvuldige verwysing-transkripsiemetings, hoewel dit baie akkuraat is en moontlik 0.5-voudige resolusie12 verskaf, is 'n belasting op tyd, monster en hulpbron. Verder vereis die gebruik van enkelverwysingsgeen, SIR of veelvuldige verwysingsgene toepaslike validering. 'n Onlangse ontwikkeling dui op 'n moontlike oplossing vir hierdie raaisel. Hierdie metode normaliseer die uitdrukking van die teikengeen van belang na 'n paar honderd verskillende transkripsies deur hul ingebedde uitgedrukte ALU-herhalings (EARs) in primaatstelsels of B-Element-uitgedrukte herhalings (in muismodelle) te teiken. Dit vermy die probleme wat verband hou met enige vooroordeel wat veroorsaak word deur die gebruik van 'n handvol gene, laat normalisering toe wat nie meer weefsel- of behandeling-afhanklik is nie en beloof om data deursigtigheid en reproduceerbaarheid te verhoog. 'n Soortgelyke benadering kan gebruik word vir die normalisering van mikroRNA-uitdrukking, waar die gemiddelde uitdrukkingswaarde van alle uitgedrukte miRNA's in 'n gegewe monster gebruik word as 'n normaliseringsfaktor vir mikroRNA-intydse kwantitatiewe PKR-data en getoon word om beter te presteer as die huidige normaliseringstrategieë in terme van beter vermindering van tegniese variasie en meer akkurate waardering van biologiese veranderinge13.


LinRegPCR en Factor-qPCR

LinRegPCR is ontwikkel deur dr Jan Ruijter, 'n hoofondersoeker in die departement Anatomie, Embriologie en Fisiologie (Akademiese Mediese Sentrum, Amsterdam, Nederland). Die statistiese ontleding van sy eie navorsingsdata het gelei tot die ontwikkeling van hierdie wyd gebruikte program genaamd LinRegPCR

LinRegPCR is 'n program vir die ontleding van kwantitatiewe PCR (qPCR) data gebaseer op PCR doeltreffendheid waardes afgelei van amplifikasie kurwes. Die program voer nie-basislyn gekorrigeerde data in, voer 'n basislynkorreksie op elke monster afsonderlik uit, bepaal 'n venster-van-lineariteit en gebruik dan lineêre regressie-analise om die PKR-doeltreffendheid per monster vanaf die helling van die regressielyn te bepaal. Die gemiddelde PCR-doeltreffendheid per amplikon word bereken. Die fluoressensiedrempel word dan gestel om die Cq-waarde te bepaal. Die gemiddelde PCR-doeltreffendheid per amplikon en die Cq-waarde per monster word dan gebruik om 'n beginkonsentrasie per monster, uitgedruk in arbitrêre fluoressensie-eenhede, te bereken.

Klik hier om jou GRATIS LinRegPCR-program af te laai

    Fluorescent-toename kinetika van verskillende fluoresserende verslaggewers wat vir qPCR gebruik word, hang af van monitering van chemie, geteikende volgorde, tipe DNA-invoer en PCR-doeltreffendheid. Microchimica Acta 2014 (DOI 10.1007/s00604-013-1155-8) Evaluering van qPCR-kromme-analisemetodes vir betroubare biomerker-ontdekking: vooroordeel, resolusie, akkuraatheid en implikasies. Metodes 59: 32-46, 2013. Vooroordeel in die Cq waarde waargeneem met hidrolise sonde gebaseer kwantitatiewe PCR kan reggestel word met die geskatte PCR doeltreffendheid waarde. Methods 50: 313-322, 2010 Amplifikasiedoeltreffendheid: koppel basislyn en vooroordeel in die ontleding van kwantitatiewe PCR-data. Nukleïensure Navorsing 37: e45, 2009 Statistiese betekenisvolheid van kwantitatiewe PCR. BMC Bioinformatics 8: 131, 2007 Relatiewe kwantifisering van mRNA: vergelyking van metodes wat tans gebruik word vir intydse PCR-data-analise. BMC Mol Biol 8: 113, 2007 Aanname-vrye analise van kwantitatiewe real-time PCR data. Neurosci Letters 339: 62-66, 2003

Faktor-qPCR

Dr Jan Ruijter het onlangs 'n ander program genaamd Factor-qPCR ontwikkel. Hierdie program verwyder “vermenigvuldigende tussenlopie-variasie” wat plaasvind wanneer 'n kwantitatiewe PCR-eksperiment veelvuldige plate insluit om alle monsters, teikens en replikasies te akkommodeer. Hierdie herhalingslopies toon soortgelyke proporsionele verskille tussen eksperimentele toestande, maar verskillende absolute waardes, al word die metings vermoedelik onder identiese omstandighede uitgevoer. In die meeste gevalle is variasie tussen sessies vermenigvuldigend en kan dit dus verwyder word deur die data in elke sessie met 'n sessie-spesifieke regstellingsfaktor te deel.

Klik hier om jou GRATIS Factor-qPCR-program af te laai

    Verwydering van tussen-lopies variasie in 'n multi-plaat qPCR eksperiment. Biomolekulêre Opsporing en Kwantifikasie In Press, 2015. Faktorkorreksie as 'n instrument om variasie tussen sessies in replikaat-eksperimente uit te skakel: toepassing op molekulêre biologie en retrovirologie. Retrovirology 3:2, 2006. RDML: gestruktureerde taal- en verslagdoeningsriglyne vir intydse kwantitatiewe PCR-data. RDML-Ninja en RDMLdb vir gestandaardiseerde uitruil van qPCR-data.

Verwante produk

Bekendstelling van & # 8220 Mikrofoon ” jou persoonlike qPCR Cycler

Dit is VINNIG, Akkuraat, KOMPAKT en SKALBAAR.

Dit is die EERSTE qPCR-instrument wat die LinRegPCR-beginsels volg vir die ontleding van sy qPCR-data.

En dit is ontwerp en vervaardig deur Bio Molecular System, 'n Australiese maatskappy wat gestig is deur die voorste innoveerders van die voormalige Corbett Research Life Sciences-maatskappy.


Abstrak

Intydse kwantitatiewe polimerase-kettingreaksie (qPCR) is 'n standaardtegniek in die meeste laboratoriums wat vir verskeie toepassings in basiese navorsing gebruik word. Ontleding van qPCR-data is 'n deurslaggewende deel van die hele eksperiment, wat gelei het tot die ontwikkeling van 'n oorvloed metodes. Die vrygestelde gereedskap dek óf spesifieke dele van die werkvloei óf bied volledige ontledingsoplossings.

Hier het ons 27 oop-toegang sagteware pakkette en gereedskap vir die ontleding van qPCR data ondersoek. Die opname sluit 8 Microsoft Windows, 5 webgebaseerde, 9 R-gebaseerde en 5 gereedskap van ander platforms in. Hersiene pakkette en gereedskap ondersteun die ontleding van verskillende qPCR-toepassings, soos RNA-kwantifisering, DNA-metilering, genotipering, identifikasie van kopiegetalvariasies en digitale PCR. Ons rapporteer 'n oorsig van die funksionaliteit, kenmerke en spesifieke vereistes van die individuele sagteware-instrumente, soos data-uitruilformate, beskikbaarheid van 'n grafiese gebruikerskoppelvlak, ingesluit prosedures vir grafiese data-aanbieding, en aangebied statistiese metodes. Daarbenewens bied ons 'n oorsig oor kwantifiseringstrategieë, en rapporteer verskeie toepassings van qPCR.

Ons omvattende opname het getoon dat die meeste instrumente hul eie lêerformaat gebruik en slegs 'n fraksie van die huidige bestaande instrumente ondersteun die gestandaardiseerde data-uitruilformaat RDML. Om 'n meer vaartbelynde en vergelykbare ontleding van qPCR-data moontlik te maak, moet meer verskaffers en gereedskap die gestandaardiseerde formaat aanpas om die uitruil van data tussen instrumentsagteware, analise-instrumente en navorsers aan te moedig.


'n Vraag wat verband hou met qPCR-analise - Biologie

  • Pad gefokus - Profiel die uitdrukking van 'n paneel van geselekteerde gene wat relevant is vir 'n pad of siektetoestand.
  • Eenvoudig en akkuraat - Eenvoudige intydse PCR-metode bied die voordele van qRT-PCR = hoë sensitiwiteit en wyer dinamiese kwantifiseringsreeks.
  • Kwantitatief -As dit behoorlik toegedien word, is dit ten volle kwantitatief en vertoon 'n goeie reproduceerbaarheid.
  • Ontwerp vir hoë deurvoertoepassings en roetinegebruik - Bring uitdrukkingsprofiel na byna enige laboratorium met 'n blokgebaseerde intydse PCR-instrument.
  • Sensitiwiteit - Met die sensitiwiteit tot 1 ng per reaksie-opstelling of 5 g totale RNA per hele skikkingsplaat bied meer as 80 persent huidige oproeptariewe (aangegee deur die vervaardiger).
  • Reproduceerbaarheid - Die hoë reproduceerbaarheid van die stelsel, met replikaatkorrelasiekoëffisiënte r > 0.99, beteken dat eksperimentele monsters betroubaar vergelyk kan word oor skikkingsplate en binne veelvuldige lopies.
  • Spesifisiteit - Die spesifisiteit van die sisteem, oorgedra deur die kombinasie van SYBR Green primers of Probe mengsels en PCR meester mengsels, waarborg 'n enkele produk van die voorspelde grootte van elke reaksie sonder sekondêre produkte soos primer dimers.
  • Veelvuldige verwysingsgene vir latere normalisering via gevalideerde verwysingsgene (sien Genorm of Normfinder)
  • Kontroles vir genomiese DNA-kontaminasie = DNS-oordragbeheer
  • Omgekeerde transkripsiekontroles = RT-kontrole
  • positiewe PCR-kontroles

qPCR skikking aansoek vraestelle

PCR se volgende grens PCR
Die werkesel van moderne molekulêre biologie laai vorentoe deur gebruik te maak van beide konvensionele en digitale metodes om enkelselle en selfs enkele molekules te verken.
Nathan Blow berig.
NATUURMETODS VOL 4(10) 2007: 869

Reproduceerbaarheid van kwantitatiewe RT-PCR-skikking in miRNA uitdrukkingsprofilering en vergelyking met mikroskikkingsanalise.
Chen Y, Gelfond JA, McManus LM, Shireman PK.
Departement Chirurgie, Universiteit van Texas Gesondheidswetenskapsentrum, San Antonio, TX 78229, VSA
BMC Genomics. 2009 Aug 2810: 407.

Pasgemaakte molekulêre fenotipering deur kwantitatiewe geenuitdrukking en patroonherkenningsanalise
Shreeram Akilesh, Daniel J. Shaffer en Derry Roopenian
Genoom Res. 2003 13(7): 1719-1727
Die Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine 04609, VSA

'n Intydse PCR-skikking vir hiërargiese identifikasie van Francisella-isolate
Kerstin Svensson1,2, Malin Granberg1, Linda Karlsson1, Vera Neubauerova3, Mats Forsman1, Anders Johansson1,2
1 Afdeling CBRN Verdediging en Sekuriteit, Sweedse Verdedigingsnavorsingsagentskap, Ume , Swede, 2 Departement Kliniese Mikrobiologie, Aansteeklike Siektes en Bakteriologie, Ume Universiteit, Ume , Swede, 3 Central Military Health Institute, Praag, Tsjeggiese Republiek
PLoS EEN 4(12): e8360

Die nie-homologe eindverbindingsfaktor Artemis onderdruk multi-weefsel tumor vorming en voorkom verlies van heterosigositeit
Y Woo, SM Wright, SA Maas1,7, TL Alley1, LB Caddle1, S Kamdar1, J Affourtit, O Foreman1, EC Akeson, D Shaffer, RT Bronson, HC Morse, D Roopenian en KD Mills
Onkogen. 2007 26(41): 6010-6020

  • ". 'n omvattende oorsig van die RT-PCR-tegnologie, wat so op datum is as wat 'n boek kan wees." Mareike Viebahn in Current Issues in Molecular Biology (2009)
  • ". 'n nuttige boek vir studente." van J. Microbiological Methods
  • "verskaf 'n dubbele fokus deur in die vroeë hoofstukke te poog om beide die teorie en praktiese aspekte van hierdie diverse en oppervlakkig eenvoudige tegnologie te verskaf, en balanseer dit in die latere hoofstukke met werklike toepassings, wat aansteeklike siektes, bioverdediging, molekulêre haplotipering dek. en voedselstandaarde." van Microbiology Today
  • "'n naslaanwerk wat beide in universiteitsbiblioteke en op die rakke van ervare toepassingspesialiste gevind moet word." van Microbiology Today
  • "'n Omvattende gids tot intydse PCR-tegnologie en die toepassings daarvan" uit Food Science and Technology Abstracts (2009) Volume 41 Nommer 6
  • Hierdie volume behoort van die grootste belang te wees vir alle ondersoekers wat belangstel en betrokke is by die gebruik van RT-PCR. die RT-PCR-protokolle wat in hierdie boek behandel word, sal van belang wees vir die meeste, indien nie alle nie, ondersoekers wat betrokke is by navorsing wat hierdie belangrike tegniek gebruik. 'n goed gebalanseerde boek wat die vele potensiële gebruike van intydse PCR dek. waardevol vir almal wat belangstel in RT-PCR." uit Doodys resensies (2009)
  • "verskaf die beginner en die ervare gebruiker leiding oor die tegnologie, sy instrumentasie en sy toepassings" uit SciTech Book News Junie 2009 bl. 64
  • ". geskryf deur internasionale skrywers kundige in spesifieke tegniese beginsels en toepassings . 'n nuttige kompendium van basiese en gevorderde toepassings vir laboratoriumwetenskaplikes. Dit is 'n ideale inleidende handboek en sal dien as 'n praktiese handboek in laboratoriums waar die tegnologie aangewend word." van Christopher J. McIver, Mikrobiologie-afdeling, Prince of Wales-hospitaal, Nieu-Suid-Wallis, Australië skryf in die Australiese J. Med. Wetenskap. 2009. 30(2): 59-60

Maatskappye wat qPCR-skikkings verskaf:

Witskrif: StellARray Gene Expression System - Onthulling van profiele met onbevooroordeelde betekenis
Daniel Shaffer, Aaron Brown, William Olver
Bar Harbor BioTechnology, Inc. en Marjorie Smithhisler, Lonza Walkersville, Inc.

In hierdie referaat bied ons drie toepassingsvoorbeelde aan wat die nut van die StellARray-geenuitdrukkingstelsel demonstreer om geenuitdrukkingvlakveranderinge in diverse biologiese kontekste soos toksikologie, kanker en stamseldifferensiasie te openbaar. Deur Clonetics en Poietics Primêre Menslike Selle te kombineer met die StellARray Gene Expression System, almal van Lonza, word die navorser voorsien van 'n sinergistiese stelsel om growwe en subtiele veranderinge in geenuitdrukking te openbaar wanneer in vitro modelle van menslike weefsel ontleed word. Dit word maklik bewerkstellig in 96- en 384-put geformateerde StellARrayqPCR-skikkings met behulp van 'n standaard qPCR-instrument en 'n generiese SYBR Groen-gebaseerde Reagens Meestermengsel. Die Global Pattern Recognition (GPR) Data Analysis Tool is optimaal geskik om 'n gerangorde lys van aansienlik veranderde gene binne 'n qPCR datastel te genereer. GPR oorkom die teenstrydighede wat verband hou met konvensionele enkelgeen normaliseringsprosedures deur a priori normaliseerder seleksie uit te skakel. Oor die algemeen wys die resultate hoe die StellARray Gene Expression System vals positiewe uitskakel en WARE resultate verskaf wat gerugsteun word deur 'n streng statistiese analise.

Eenvoudige en akkurate ontleding van Real-Time PCR data met behulp van Bar Harbor Biotechnology GPR sagteware
http://www.bhbio.com/products/gpr/

Bar Harbor Biotechnology het een van die mees fundamentele probleme opgelos wat eksperimentering met behulp van Real-Time PCR. Hoe analiseer ek die data en bepaal WERKLIKE veranderinge in geenuitdrukking? Die antwoord op hierdie vraag word gevind in Bar Harbor Biotechnology, Inc. se patent hangende Global Pattern Recognition (GPR) algoritme, wat geenuitdrukking-analise eenvoudig, vinnig en betroubaar maak. Hier is 'n paar redes waarom ons hierdie algoritme ontwikkel het.

SA Biosciences ('n QIAGEN-maatskappy)

  • qPCR skikking webblad
  • PCR Skikking Data Analise Tutoriaal
  • RT2 - profiler PCR-tegnologie - skyfievertoning
  • qPCR skikking handboek
  • e-leersentrum deur SA Biowetenskappe:
    • Seminaar - Hoe werk qPCR-skikkings?
    • Flieks oor die toepassing van qPCR-skikkings
    • Heelgenoom mikroRNA analise vanaf 'n enkele cDNA sintesereaksie
    • Gevalideer met mees opgedateerde mikroRNA-volgordes wat deur Sanger miRBASE Release 14 geannoteer is
    • Maklik-om-te-gebruik protokol bring mikroRNA uitdrukkingsprofiele na enige laboratorium met 'n intydse PCR-instrument
    • Weergawe 2.0 RT heelgenoom MicroRNA PCR-skikkings
    • beskikbaar vir mens, muis en rot.
    • Menslike RT Heelgenoom MicroRNA PCR-skikkings (96-put en 384-put v2.0)
    • MouseRT Heelgenoom MicroRNA PCR-skikkings (96-putte en 384 putte v2.0)
    • RatRT Heelgenoom MicroRNA PCR-skikkings (96-put en 384-put v2.0)

    Maksimeer doeltreffendheid - Kies toetse vir jou teikens van keuse uit geenlyste van funksioneel verwante geenfamilies of biologiese weë. Bestel hulle as enkeltoetse of stel jou eie pasgemaakte paneel op 'n LightCycler 480 Multiwell-plaat op.

    Verseker optimale resultate - Maak staat op funksie-getoetste qPCR-toetse gebaseer op bewese Universal ProbeLibrary-tegnologie, met gedetailleerde bio-informatiese agtergrondinligting en nuwe foutopsporingskenmerke.

    • Menslike verwysingsgenepaneel
    • Menslike Selsiklusreguleringspaneel
    • Menslike Apoptose Paneel
    • Menslike GPCR-paneel
    • Menslike kernreseptorpaneel
    • Menslike ABC Transporter Paneel
    • vind meer besonderhede
    • Goeie versterkingsvorm
    • Cp van hoogste cDNA-konsentrasie = 34
    • PCR efficiency 2.0 +/- 0.2,
    • R value of standard curve between 0.99 and 1.00
    • Linear dynamic range of at least 3 logs
    • Similar signal heights of amplification curves
    • High specificity, no side products (tested on gels)
    • for more details

    Featuring validated and Tm-normalized LNAbased capture probes, the miRCURY LNAarrays offer global microRNA expression profiling with unmatched specificity and sensitivity.

    • Animation about the Exiqon LNA technology
    • Exiqon E-talk - view other animations, presentations and scientific movies
    • Sensitivity - microRNA profiling possible from as low as 30 ng total RNA
    • Specificity - efficient discrimination between closely related microRNA family members
    • Coverage get access to the 428 unique human microRNAs (miRPlus ) on our human, mouse and rat array or the 4168 mature microRNAs from 85 species on our Other species array
    • Reproducibility - high reproducibility with 99% correlation between arrays
    • Dynamic range - greater than 4 orders of magnitude
    • Diversity - the most comprehensive probe set available
    • Open platform - protocols available for Tecan and MAUI hybridization stations, and for manual hybridization.

    microRNA Ready-to-Use PCR Panels
    Ready-to-Use panels contain pre-aliquoted microRNA PCR primer sets in 384-well PCR plates. Just add cDNA and PCR master mix to the wells and run your real-time PCR profiling of up to 730 microRNAs => Read more details

    Universal cDNA Synthesis and SYBR Green master mix kits
    Highly optimized reagents for first strand synthesis and real-time PCR amplification => Read more details

    Our new interactive tutorial will walk you through every step of a microRNA experiment from RNA Isolation to Functional Analysis.

    Custom TaqMan Assay Manufacturing & Plating Service
    If your research application requires special manufacturing modifications - such as a different dye or assay volume, or you would like to have your assays plated in a specific way, our custom services can help.

    TaqMan Gene Expression Assays
    TaqMan Gene Expression Assays provide over 1.3 million predesigned primer/probe sets covering 23 species, the most comprehensive set of quantitative gene expression assays available. Alternatively, custom assays enable you to study the expression of any gene or splice variant in any organism.

    TaqMan MicroRNA Assays
    Innovative TaqMan Assays for microRNA and other small RNAs, as well as longer noncoding RNA transcripts such as pri-miRNAs and long noncoding RNA. We offer products for noncoding RNA discovery, profiling, quantitation, validation, and functional analysis.

    TaqMan Protein Assays
    Revolutionary TaqMan Protein Assays enable fast, easy identification, and relative quantification of protein markers from limited quantities of cultured cells. Choose from predesigned assays for human stem cell pluripotency markers and control proteins, or create your own assay from your biotinylated antibodies.

    Next Generation Real-time PCR Comes of Age

    The WaferGen SmartChip System enables profiling and validation workflows on a single platform, by combining high-throughput, cost-effective target discovery with the sensitivity, precision, and dynamic range of real-time PCR for validation studies.

    Gene Expression Profiling - Discover More
    Gene expression profiling of specific diseases has become increasingly important in drug development. Comparison of gene expression patterns between normal and diseased patients or expression profiles in the presence or absence of drugs leads to discovery of genes or a set of genes that can be used in drug development. This requires monitoring of tens, hundreds or thousands of mRNAs in large numbers.
    The WaferGen SmartChip System offers the capability to achieve this level of throughput with a high degree of accuracy.

    MicroRNA Profiling - Comprehensive human microRNA profile on a single chip
    MicroRNAs (miRNA) are post-transcriptional regulators of cell proliferation, tissue differentiation, embryonic development, and apoptosis. Specific miRNA expression profiles may be characteristic of diseases or disease states and used as biomarkers. The identification of miRNA profiles has become important for streamlining drug development processes. The comparison of miRNA patterns from normal and disease samples or contrasting miRNA profiles of the same sample in the presence or absence of a drug leads to a greater understanding of pathways and mechanisms of action.
    The WaferGen SmartChip System in conjunction with the pre-validated SmartChip human miRNA panel, offers researchers the ability to carry out comprehensive, rapid miRNA profiling on their human samples simply, cost-effectively, and accurately.
    Fluidigm

    These new integrated fluidic circuits (IFCs) are capable of performing 9,216 simultaneous experiments without any pre-spotting and with complete flexibility for the researcher. In a word, they are revolutionary. Flyer

    The 96.96 Dynamic Arrays are at the heart of Fluidigm s BioMark Genetic Analysis System, which delivers new efficiencies in Gene Expression and Genotyping. Fluidigm products enable and accelerate your Single Cell Gene Expression, Copy Number Variation and Absolute Quantitation research in completely new ways.


    Speaker bios

    Stephen A. Bustin, Ph.D.

    Queen Mary, University of London
    London, UK

    Stephen Bustin obtained his Ph.D. in molecular genetics from Trinity College in Dublin and is currently Professor of Molecular Science at Barts and the London School of Medicine and Dentistry, a part of Queen Mary, University of London, and serves as Visiting Professor of Molecular Biology at the University of Middlesex. His research group’s general areas of interest are the small and large bowel, as well as colorectal cancer with particular emphasis on investigating the process of invasion and metastasis. An important aim is to translate molecular techniques into clinical practice by including molecular parameters into clinical tumor staging. He also has a special interest in real-time polymerase chain reactions (PCR) and has written and edited two books and published numerous peer-reviewed publications and book chapters on this subject. He advised the U.K. High Court and the U.S. Department of Justice on PCR technology in the measles, mumps, rubella (MMR) vaccine/Autism class action, and was an expert witness at the MMR trial in Washington, D.C. He coordinated the recent Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE) initiative.

    Gregory L. Shipley, Ph.D.

    University of Texas Health Science Center at Houston
    Houston, TX

    Dr. Gregory Shipley completed both his undergraduate and graduate training at the University of California, Santa Barbara, after which he moved to the University of Florida in Gainesville and then to MIT in Cambridge, Massachusetts, to carry out his postdoctoral training. Following academic appointments at Texas A&M University and the University of Houston, Texas, Dr. Shipley moved to the University of Texas Health Science Center in Houston, Medical School in 1990, where he is currently the director of the Quantitative Genomics Core Laboratory. There he and his team perform quantitative protein assays using the MesoScale technology and multiple assay types utilizing real-time quantitative PCR. Dr. Shipley oversees the running and analysis of all real-time qPCR assays as well as the development of new assays. He publishes his work regularly and is also one of the authors of the MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR), together with Dr. Stephen Bustin.

    Manju R. Sethi

    Thermo Fisher Scientific
    Wilmington, DE

    Manju Sethi joined Thermo Fisher Scientific in 2008, and as senior product manager is responsible for the development and management of its NanoDrop products line. Sethi specializes in the unique technology and workflow solution needs of life science customers and brings over 20 years of biotech and life science product management, as well as marketing and business development experience to the Thermo Fisher Scientific team. Previously, Sethi was a business consultant for various Fortune 100 companies and was also a senior member of the management team for the Qualicon biotech division at DuPont, where she served as the director of strategic planning and director of business development. Sethi holds a B.Tech. (ChemE) from the Indian Institute of Technology and an M.S. (ChemE) from Clarkson University.

    Sean Sanders, Ph.D.

    Wetenskap/AAAS
    Washington DC

    Dr. Sanders did his undergraduate training at the University of Cape Town, South Africa, and his Ph.D. at the University of Cambridge, UK, supported by the Wellcome Trust. Following postdoctoral training at the National Institutes of Health and Georgetown University, Dr. Sanders joined TranXenoGen, a startup biotechnology company in Massachusetts working on avian transgenics. Pursuing his parallel passion for writing and editing, Dr. Sanders joined BioTechniques as an editor, before joining Wetenskap/AAAS in 2006. Currently, Dr. Sanders is the Director and Senior Editor for Custom Publishing for the journal Wetenskap and Program Director for Outreach.


    Kyk die video: The principle of Real Time PCR, Reverse Transcription, quantitative rt-PCR (September 2022).


Kommentaar:

  1. Dubhglas

    Ek vra om verskoning, maar ek het meer inligting nodig.

  2. Romney

    Briljant

  3. Nolen

    Ja presies.

  4. Ara

    Ek dink dit is reeds bespreek

  5. Jaryn

    Dankie vir die inligting.



Skryf 'n boodskap