Inligting

C-myc/anti-myc Ab-interaksie met fusieproteïene

C-myc/anti-myc Ab-interaksie met fusieproteïene


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek gaan 'n c-myc-fusieproteïen voorberei met die volgende konfigurasie:

(28-residu seinvolgorde)-(c-myc)-(GGSGGGSG Linker)-(Proteïen van belang (PVI))

POI is 'n transmembraanproteïen en die 28-residu-seinvolgorde is nodig vir membraaninkorporasie in ER.

My bekommernis is die ontwrigting van die c-myc/anti-myc Ab-interaksie as gevolg van die feit dat c-myc aan beide kante saamgesmelt word. Het iemand enige ervaring of verwysing met 'n soortgelyke konstruksie?


Na 'n paar verdere navorsing het ek vraestelle gevind wat suksesvolle ko-immunopresipitasie-eksperimente met POI-myc-His-fusieproteïene rapporteer.

Boonop het ek gedink die seinvolgorde sal deur seinpeptidases gesplit word wat die c-myc-merker op die N-terminus blootgestel sal laat met slegs 'n ekstra oorblyfsel. Ek dink nie dat een ekstra oorblyfsel 'n probleem sal skep nie.

Hier is die instrument wat ek gebruik het om uit te vind waar die seinvolgorde geklief sal word: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

Hier is die verwysings vir POI-myc-His eksperimente:

  • DOI: 10.1016/j.cub.2006.08.085
  • DOI: 10.1073/pnas.97.2.668

LUMIER: 'n Ontdekkingsinstrument vir soogdierproteïeninteraksienetwerke

Proteïen-proteïen-interaksies (PPI's) speel 'n noodsaaklike rol in alle biologiese prosesse. In vivo kom PPI's dinamies voor en hang af van ekstrasellulêre leidrade. Om nuwe proteïen-proteïen-interaksies in soogdierselle te ontdek, het ons 'n hoë-deurset outomatiese tegnologie genaamd LUMIER (LUminescence-based Mammalian Interactome) ontwikkel. In hierdie benadering druk ons ​​saam 'n Luciferase (LUC)-gemerkte samesmeltingsproteïen saam met 'n Vlag-gemerkte proteïen in 'n doeltreffend transfekteerbare sellyn soos HEK-293T-selle. Die interaksie tussen die twee proteïene word bepaal deur ko-immunopresipitasie deur gebruik te maak van 'n anti-Vlag-teenliggaam, en die teenwoordigheid van die LUC-gemerkte interaktor in die kompleks word vervolgens deur sy lusiferase-aktiwiteit opgespoor. LUMIER kan maklik transmembraanproteïenvennote opspoor, interaksies wat sein- of splitsing isovorm-afhanklik is, sowel as dié wat slegs in die teenwoordigheid van posttranslasionele modifikasies mag voorkom. Deur gebruik te maak van verskeie versamelings van Vlaggemerkte proteïene, het ons proteïeninteraksienetwerke vir verskeie TGF-β-familiereseptore, Wnt-roetelede gegenereer, en het ons sistematies die effek van neuraal-spesifieke alternatiewe splitsing op proteïeninteraksienetwerke ontleed. Die resultate het belangrike insigte verskaf oor die fisiologiese en funksionele relevansie van sommige van die nuwe interaksies wat gevind is. LUMIER is hoogs skaalbaar en kan vir beide lae- en hoë-deursetstrategieë gebruik word. LUMIER is dus 'n waardevolle hulpmiddel vir die identifisering en karakterisering van dinamies gereguleerde PPI's in soogdierstelsels. Hier beskryf ons 'n handleiding weergawe van LUMIER in 'n 96-put formaat wat maklik in enige laboratorium geïmplementeer kan word.

Sleutelwoorde: Binêre kompleks LUMIER Soogdierselle Proteïen–proteïeninteraksie Seinpaaie Ternêre komplekse Transmembraanproteïene.


Fusieproteïene

Gebruike van samesmeltingsproteïene

Die tegniek om samesmeltingsproteïene te skep is uitgebrei na ander samesmeltingsvennote, en bykomende gebruike is vir die samesmeltingsvennoot ontwikkel. Drie van die belangrikste gebruike van samesmeltingsproteïene is: as hulpmiddels in die suiwering van gekloonde gene, as verslaggewers van uitdrukkingsvlak, en as histochemiese merkers om visualisering van die ligging van proteïene in 'n sel, weefsel of organisme moontlik te maak.

Vir suiwering word 'n proteïen wat maklik en gerieflik deur affiniteitschromatografie gesuiwer kan word, saamgesmelt met 'n proteïen wat die navorser wil bestudeer. 'n Aantal proteïene en peptiede is vir hierdie doel gebruik, insluitend stafilokokkusproteïen A, glutathione-S-transferase, maltosebindende proteïen, sellulosebindende proteïen, chitienbindende domein, tioredoksien, strepavidien, RNaseI, polihistidien, menslike groeihormoon. , ubikitien en teenliggaampepitope.

Die proteïene wat die meeste as samesmeltingsvennote vir verslaggewerkonstrukte gebruik word, is β-galaktosidase, luciferase en groen fluoresserende proteïen (GFP). β-galaktosidase het die voordeel van talle kommersieel beskikbare substrate, insluitend sommige wat 'n gekleurde produk produseer en sommige wat lei tot die produksie van lig. Luciferase en GFP produseer beide lig, en kan direk gevisualiseer of gekwantifiseer word met behulp van 'n luminometer of 'n fluorometer, onderskeidelik. GFP het 'n voordeel deurdat dit nie 'n substraat benodig nie, terwyl luciferase sy substraat, luciferien, sowel as ATP, O benodig.2, en Mg 2+ . GFP straal groen lig uit wanneer dit deur blou of UV-lig opgewek word, en kan in baie gevalle op lewende, ongeskonde selle en organismes gebruik word.

'n Nuttige uitbreiding van samesmeltingsproteïene as verslaggewers is die twee-hibriede sisteem. In hierdie metode word twee afsonderlike samesmeltings aangewend om te toets vir interaksie tussen twee proteïene, waar binding van die twee proteïene hul samesmeltingsvennote bymekaar bring en lei tot geaktiveerde transkripsie van 'n verslaggewergeen.


Fusie van DARPin tot Aldolase maak visualisering van klein proteïene deur Cryo-EM moontlik

Die oplossing van proteïenstrukture deur enkeldeeltjie-krio-elektronmikroskopie (cryo-EM) het 'n belangrike hulpmiddel in strukturele biologie geword. Terwyl opwindende vordering gemaak word in die rigting van die visualisering van klein makromolekules, is die mediaan proteïengrootte in beide eukariote en bakterieë steeds buite die bereik van cryo-EM. Om hierdie probleem te oorkom, het ons 'n platformstrategie geïmplementeer waarin 'n klein proteïenteiken stewig aan 'n groot, simmetriese basis geheg is via 'n kiesbare adapter. Van ons sewe ontwerpe het die beste konstruksie 'n ontwerpte ankyrien-herhalingsproteïen (DARPin) gebruik wat styf aan tetrameriese konynspieraldolase saamgesmelt is deur 'n heliese skakelaar. Die DARPin het sy vermoë behou om sy teiken te bind: GFP. Ons het die struktuur van hierdie kompleks opgelos tot 3.0 Å resolusie in die algemeen, met 5-8 Å resolusie in die GFP-streek. Aangesien buigsaamheid in die DARPin-posisie die algehele resolusie van die teiken beperk het, beskryf ons strategieë om hierdie element te rigideer.

Sleutelwoorde: CryoEM DARPin Elektron krio-mikroskopie Enkeldeeltjie-analise aldolase kunsmatige proteïen krio-elektron mikroskopie platform proteïen ontwerp.


Ontwikkeling van 'n antigeen-teenliggaam mede-vertoonstelsel vir die opsporing van interaksie van G-proteïen-gekoppelde reseptore en enkelketting veranderlike fragmente

G-proteïengekoppelde reseptore (GPCR's), veral chemokienreseptore, is ideale teikens vir monoklonale teenliggaampies. Met inagneming van die spesiale multi-pass transmembraan struktuur van GPCR, is dit dikwels 'n moeisame werk om teenliggaam inligting oor nie-teikens en epitope op antigene te verkry. Om die proses te versnel, moet 'n vinnige en eenvoudige metode ontwikkel word. Die gesplete-ubiquitien-gebaseerde gis twee baster sisteem (YTH) is gebruik as 'n blou skrif vir 'n nuwe metode. Deur met transmembraanpeptiede te smelt, is scFv-teenliggaampies ontwerp om op die sitomembraan geanker te word, waar die GPCR ook saam vertoon is. Die gekoppelde gesplete-ubiquitien sisteem het die scFv-GPCR interaksie sein in die uitdrukking van verslaggewergene getransformeer. Deur die topologiese struktuur van scFv-fusieproteïen en sleutelelemente, insluitend seinpeptiede, transmembraanpeptiede en buigsame skakelaars te optimaliseer, is 'n stelsel genaamd Antigen-Antibody Co-Display (AACD) gevestig, wat die interaksies tussen teenliggaampies en hul teiken-GPCR's vinnig opgespoor het. , CXCR4 en CXCR5, terwyl dit ook die off-teiken teenliggaampies en teenliggaam-geassosieerde epitope bepaal. Die AACD-stelsel kan vinnig die assosiasie tussen GPCR's en hul kandidaat-teenliggaampies bepaal en die navorsingsperiode vir buite-teiken-opsporing en epitoop-identifikasie verkort. Hierdie stelsel behoort die proses van GPCR-teenliggaampieontwikkeling te verbeter en 'n nuwe strategie vir GPCR-teenliggaampiesifting te verskaf.

Sleutelwoorde: G-proteïen gekoppelde reseptor teenliggaampies epitoop off-teikens gis twee baster.

Verklaring van belangebotsing

Die befondsers het geen rol in die ontwerp van die studie gehad in die versameling, ontledings of interpretasie van data in die skryf van die manuskrip of in die besluit om die resultate te publiseer nie.


Protogenien definieer 'n oorgangstadium tydens embrioniese neurogenese en voorkom vroegtydige neuronale differensiasie.
Fann MJ
Die Tydskrif vir Neurowetenskap: die amptelike tydskrif van die Vereniging vir Neurowetenskap 30.12 (24 Maart 2010): 4428-39.

Regulering van Fasciclin II en sinaptiese terminale ontwikkeling deur die splitsingsfaktor beag.
McCabe BD
Die Tydskrif vir Neurowetenskap: die amptelike tydskrif van die Vereniging vir Neurowetenskap 32.20 (2012 16 Mei): 7058-73.

Sc65 is 'n nuwe endoplasmiese retikulum proteïen wat beenmassa homeostase reguleer.
Morello R
Tydskrif vir been- en mineraalnavorsing: die amptelike tydskrif van die American Society for Bone and Mineral Research 29.3 (2014 Mrt): 666-75.

Neuronale stikstofoksied sintase-afhanklike S-nitrosilering van gefirien reguleer gefiriengroepering by GABAergiese sinapse.
Schwarz G
Die Tydskrif vir Neurowetenskap: die amptelike tydskrif van die Vereniging vir Neurowetenskap 34.23 (2014 4 Junie): 7763-8.

Protogenien definieer 'n oorgangstadium tydens embrioniese neurogenese en voorkom vroegtydige neuronale differensiasie.
Fann MJ
Die Tydskrif vir Neurowetenskap: die amptelike tydskrif van die Vereniging vir Neurowetenskap 30.12 (24 Maart 2010): 4428-39.

Syne-proteïene anker spierkerne by die neuromuskulêre aansluiting.
Han M
Verrigtinge van die Nasionale Akademie van Wetenskappe van die Verenigde State van Amerika 102.12 (22 Maart 2005): 4359-64.

Regulering van Fasciclin II en sinaptiese terminale ontwikkeling deur die splitsingsfaktor beag.
McCabe BD
Die Tydskrif vir Neurowetenskap: die amptelike tydskrif van die Vereniging vir Neurowetenskap 32.20 (2012 16 Mei): 7058-73.


Aansoeke

  • Suiwer of immunopresipiteer myc-gemerkte samesmeltingsproteïene van sellisate
  • Identifiseer myc-gemerkte proteïene
  • Voer hoë-deurset proteïen-proteïen interaksie studies uit

Bykomende produkinligting

Sien asseblief die produk se analisesertifikaat vir inligting oor bergingstoestande, produkkomponente en tegniese spesifikasies. Sien asseblief die Kit-komponentelys om stelkomponente te bepaal. Sertifikate van analise en Kit-komponentlyste is onder die Dokumente-oortjie geleë.

Takara Bio USA, Inc.
Verenigde State/Kanada: +1.800.662.2566 &bul Asië-Stille Oseaan: +1.650.919.7300 &bul Europa: +33.(0)1.3904.6880 &bul Japan: +81.(0)77.565.6999
SLEGS VIR NAVORSINGSGEBRUIK. NIE VIR GEBRUIK IN DIAGNOSTIESE PROSEDURES NIE. &kopieer 2021 Takara Bio Inc. Alle regte voorbehou. Alle handelsmerke is die eiendom van Takara Bio Inc. of sy geaffilieerde(s) in die VSA en/of ander lande of hul onderskeie eienaars. Sekere handelsmerke mag nie in alle jurisdiksies geregistreer word nie. Bykomende inligting oor produkte, intellektuele eiendom en beperkte gebruik is beskikbaar by takarabio.com.

Takara Bio Europe is 'n lid van die Takara Bio Group, 'n toonaangewende lewenswetenskappemaatskappy wat daartoe verbind is om die menslike toestand deur biotegnologie te verbeter. Deur ons Takara-, Clontech- en Cellartis-handelsmerke is ons missie om innoverende gereedskap en dienste van hoë gehalte te ontwikkel om ontdekking te versnel.


Verwysings

Tsjernomordik, L.V. & Kozlov, M.M. Proteïen-lipied wisselwerking in samesmelting en splitsing van biologiese membrane. Annu. Ds Biochem. 72, 175–207 (2003).

Chernomordik, L.V., Zimmerberg, J. & Kozlov, M.M. Membrane van die wêreld verenig! J. Cell Biol. 175, 201–207 (2006).

Helenius, A., Kartenbeck, J., Simons, K. & Fries, E. Op die toetrede van Semliki Forest virus in BHK-21 selle. J. Cell Biol. 84, 404–420 (1980). Een van verskeie referate waarin Helenius, Simons en hul medewerkers gewys het dat die suur pH van 'n endosoom 'n sneller vir virale samesmelting is. Die demonstrasie dat virusse ontwikkel het om die plaaslike protonkonsentrasie te 'aanvoel', was 'n bydrae tot ons kennis van virale toegangsmeganismes en tot ons begrip van die eienskappe van endositiese weë meer algemeen..

White, J. & Helenius, A. pH-afhanklike samesmelting tussen Semliki Forest-virusmembraan en liposome. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 77, 3273–3277 (1980).

Kuzmin, P.I., Zimmerberg, J., Chizmadzhev, Y.A. & Cohen, F.S. 'n Kwantitatiewe model vir membraanfusie gebaseer op lae-energie tussenprodukte. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 98, 7235–7240 (2001).

Zimmerberg, J., Blumenthal, R., Sarkar, D.P., Curran, M. & Morris, S.J. Beperkte beweging van lipied en waterige kleurstowwe deur porieë wat deur griephemagglutinien tydens selsamesmelting gevorm word. J. Cell Biol. 127, 1885–1894 (1994).

Plonsky, I. & Zimmerberg, J. Die aanvanklike samesmeltingsporieë wat deur baculovirus GP64 geïnduseer word, is groot en vorm vinnig. J. Cell Biol. 135, 1831–1839 (1996).

Melikyan, G.B., Markosyan, R.M., Brener, S.A., Rozenberg, Y. & Cohen, F.S. Rol van die sitoplasmiese stert van ekotropiese Moloney-muizenleukemievirus Env-proteïen in fusieporievorming. J. Virol. 74, 447–455 (2000).

Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Reseptorbinding en membraansamesmelting in virustoegang: die griephemagglutinien. Annu. Ds Biochem. 69, 531–569 (2000).

Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. & Harrison, S.C. 'n Ligandbindende sak in die dengue-virus-omhulselglikoproteïen. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 100, 6986–6991 (2003).

Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. & Harrison, S.C. Struktuur van die dengue-virus-omhulselproteïen na membraanfusie. Natuur 427, 313–319 (2004).

Roche, S., Bressanelli, S., Rey, F.A. & Gaudin, Y. Kristalstruktuur van die lae-pH-vorm van die vesikulêre stomatitis-virus glikoproteïen G. Wetenskap 313, 187–191 (2006).

Roche, S., Rey, F.A., Gaudin, Y. & Bressanelli, S. Struktuur van die voorfusievorm van die vesikulêre stomatitis-virus glikoproteïen G. Wetenskap 315, 843–848 (2007).

Yin, H.S., Paterson, R.G., Wen, X., Lamb, R.A. & Jardetzky, T.S. Struktuur van die ongekloofde ektodomein van die paramyxovirus (hPIV3) samesmeltingsproteïen. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 102, 9288–9293 (2005).

Yin, H.S., Wen, X., Paterson, R.G., Lamb, R.A. & Jardetzky, T.S. Struktuur van die parainfluenza-virus 5 F-proteïen in sy metastabiele, prefusie-konformasie. Natuur 439, 38–44 (2006).

Lescar, J. et al. Die samesmeltingsglikoproteïendop van Semliki Forest-virus: 'n ikosaëdriese samestelling wat voorberei is vir fusogeniese aktivering by endosomale pH. Sel 105, 137–148 (2001).

Gibbons, D.L. et al. Konformasieverandering en proteïen-proteïen-interaksies van die samesmeltingsproteïen van Semliki Forest-virus. Natuur 427, 320–325 (2004).

Wilson, I.A., Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Struktuur van die hemagglutinienmembraanglikoproteïen van griepvirus by 3 Å resolusie. Natuur 289, 366–373 (1981). Die baanbrekende aanvanklike strukturele resultaat van die Skehel-Wiley-samewerking oor die griepvirus hemagglutinien. 'N Mylpaal in strukturele biologie en oppervlak-glikoproteïen-biochemie, hierdie artikel het met byna 15 jaar die volgende verslag van 'n duidelike virale samesmelting-proteïenstruktuur voorafgegaan. Dit het gehelp om die hele veld van omhulde virusinskrywing en virale antigenisiteit te vorm.

Wiley, D.C., Wilson, I.A. & Skehel, J.J. Strukturele identifikasie van die teenliggaampies bindende plekke van Hong Kong griep hemagglutinien en hul betrokkenheid by antigeniese variasie. Natuur 289, 373–378 (1981).

Bullough, P.A., Hughson, F.M., Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Struktuur van griephemagglutinien by die pH van membraanfusie. Natuur 371, 37–43 (1994). Hierdie artikel, wat die struktuur van die post-fusie-konformasie van griepvirus HA2 rapporteer, het 'n twaalf jaar lange poging om die produk van die konformasie-oorgang wat deur Skehel ontdek is, te visualiseer. et al. 23 . Die omvang van die HA2 hervou was onverwags, en toe ons dit sien, het ons waardering vir die waarskynlike repertorium van proteïenkonformasie-oorgange verander.

Chen, J. et al. Struktuur van die hemagglutinien voorloper splitsingsplek, 'n determinant van grieppatogenisiteit en die oorsprong van die labiele konformasie. Sel 95, 409–417 (1998).

Weis, W. et al. Struktuur van die griepvirus hemagglutinien gekomplekseer met sy reseptor, siaalsuur. Natuur 333, 426–431 (1988).

Skehel, J.J. et al. Veranderinge in die konformasie van hemagglutinien van griepvirus by die pH-optimum van virus-gemedieerde membraanfusie. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 79, 968–972 (1982). Die ontdekking dat protonbinding (lae pH) 'n diepgaande konformasieverandering in hemagglutinien van griepvirus veroorsaak. Die skrywers was in staat om die noodsaaklike kenmerke (alhoewel nog nie die omvang nie) van die konformasieverandering in hemagglutinien af ​​te lei, deur insiggewende gebruik van selektiewe proteolise en deur deurdagte interpretasie van oplosbaarheidseffekte van nie-ioniese skoonmaakmiddels.

Chen, J., Skehel, J.J. & Wiley, D.C. N- en C-terminale residue kombineer in die samesmelting-pH-influensa-hemagglutinien HA2-subeenheid om 'n N-dop te vorm wat die driestrengige opgerolde spoel beëindig. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 96, 8967–8972 (1999).

Carr, C.M. & Kim, P.S. 'n Veergelaaide meganisme vir die konformasieverandering van griephemagglutinien. Sel 73, 823–832 (1993).

Daniels, R.S. et al. Fusiemutante van die griepvirus hemagglutinienglikoproteïen. Sel 40, 431–439 (1985).

Han, X., Bushweller, J.H., Cafiso, D.S. & Tamm, L.K. Membraanstruktuur en samesmelting-snellerende konformasieverandering van die samesmeltingsdomein van griephemagglutinien. Nat. Struktuur. Biol. 8, 715–720 (2001).

Borrego-Diaz, E., Peeples, M.E., Markosyan, R.M., Melikyan, G.B. & Cohen, F.S. Voltooiing van trimeriese haarnaaldvorming van hemagglutinien van griepvirus bevorder samesmeltingsporieë opening en vergroting. Virologie 316, 234–244 (2003).

Park, H.E., Gruenke, J.A. & White, J.M. Leiband in die groefmeganisme van membraansamesmelting. Nat. Struktuur. Biol. 10, 1048–1053 (2003).

Heinz, F.X. et al. Strukturele veranderinge en funksionele beheer van die bosluisgedraagde enkefalitisvirus glikoproteïen E deur die heterodimeriese assosiasie met proteïen prM. Virologie 198, 109–117 (1994).

Zhang, W. et al. Visualisering van membraanproteïendomeine deur krio-elektronmikroskopie van dengue-virus. Nat. Struktuur. Biol. 10, 907–912 (2003).

Mukhopadhyay, S., Kim, B.S., Chipman, P.R., Rossmann, M.G. & Kuhn, R.J. Struktuur van Wes-Nyl-virus. Wetenskap 302, 248 (2003).

Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C., Kunz, C. & Harrison, S.C. Die omhulselglikoproteïen van bosluisgedraagde enkefalitisvirus teen 2 Å resolusie. Natuur 375, 291–298 (1995).

Allison, S.L. et al. Oligomere herrangskikking van bosluisgedraagde enkefalitisvirus-omhulselproteïene wat deur 'n suur pH geïnduseer word. J. Virol. 69, 695–700 (1995).

Bressanelli, S. et al. Struktuur van 'n flavivirus-omhulselglikoproteïen in sy lae-pH-geïnduseerde membraanfusie-konformasie. EMBO J. 23, 728–738 (2004).

Stiasny, K., Kossl, C., Lepault, J., Rey, F.A. & Heinz, F.X. Karakterisering van 'n strukturele intermediêre van flavivirus membraanfusie. PLoS Pathog. 3, e20 (2007).

Kampmann, T., Mueller, D.S., Mark, A.E., Young, P.R. & Kobe, B. Die rol van histidienreste in lae-pH-gemedieerde virale membraanfusie. Struktuur 14, 1481–1487 (2006).

Roche, S. & Gaudin, Y. Karakterisering van die ewewig tussen die inheemse en fusie-onaktiewe konformasie van hondsdolheid virus glikoproteïen dui daarop dat die samesmelting kompleks is gemaak van verskeie trimere. Virologie 297, 128–135 (2002).

Durrer, P., Gaudin, Y., Ruigrok, R.W., Graf, R. & Brunner, J. Photolabeling identifiseer 'n vermeende samesmeltingsdomein in die omhulselglikoproteïen van hondsdolheid en vesikulêre stomatitisvirusse. J. Biol. Chem. 270, 17575–17581 (1995).

Heldwein, E.E. et al. Kristalstruktuur van glikoproteïen B van herpes simplex-virus 1. Wetenskap 313, 217–220 (2006).

Hannah, B.P., Heldwein, E.E., Bender, F.C., Cohen, G.H. & Eisenberg, R.J. Mutasiebewyse van interne samesmeltingslusse in herpes simplex-virus glikoproteïen B. J. Virol. 81, 4858–4865 (2007).

Chandran, K., Sullivan, N.J., Felbor, U., Whelan, S.P. & Cunningham, J.M. Endosomale proteolise van die Ebola-virus glikoproteïen is nodig vir infeksie. Wetenskap 308, 1643–1645 (2005).

Simmons, G. et al. Inhibeerders van katepsien L voorkom ernstige akute respiratoriese sindroom-koronavirus-inskrywing. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 102, 11876–11881 (2005).

Schornberg, K. et al. Rol van endosomale katepsiene in toetrede bemiddel deur die Ebola-virus glikoproteïen. J. Virol. 80, 4174–4178 (2006).

Godley, L. et al. Bekendstelling van intersubeenheid disulfiedbindings in die membraan-distal gebied van die griep hemagglutinien skakel membraan samesmelting aktiwiteit af. Sel 68, 635–645 (1992).

Stiasny, K., Allison, S.L., Schalich, J. & Heinz, F.X. Membraaninteraksies van die bosluisgedraagde enkefalitisvirusfusieproteïen E by lae pH. J. Virol. 76, 3784–3790 (2002).

Liao, M. & Kielian, M. Domein III van klas II-fusieproteïene funksioneer as 'n dominant-negatiewe inhibeerder van virusmembraanfusie. J. Cell Biol. 171, 111–120 (2005).

Russell, C.J., Jardetzky, T.S. & Lam, R.A. Membraanfusiemasjiene van paramyxovirusse: vaslegging van samesmeltingsmiddels. EMBO J. 20, 4024–4034 (2001).

Blacklow, S.C., Lu, M. & Kim, P.S. 'n Trimeriese subdomein van die ape-immuniteitsgebrekvirus-omhulselglikoproteïen. Biochemie 34, 14955–14962 (1995).

Chan, D.C., Fass, D., Berger, J.M. & Kim, P.S. Kernstruktuur van gp41 vanaf die MIV-omhulselglikoproteïen. Sel 89, 263–273 (1997).

Weissenhorn, W., Dessen, A., Harrison, S.C., Skehel, J.J. & Wiley, D.C. Atoomstruktuur van die ektodomein vanaf MIV-1 gp41. Natuur 387, 426–430 (1997).

Wild, C.T., Shugars, D.C., Greenwell, T.K., McDanal, C.B. & Matthews, T.J. Peptiede wat ooreenstem met 'n voorspellende alfa-helikale domein van menslike immuniteitsgebreksvirus tipe 1 gp41 is kragtige inhibeerders van virusinfeksie. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 91, 9770–9774 (1994).

Furuta, R.A., Wild, C.T., Weng, Y. & Weiss, C.D. Vaslegging van 'n vroeë samesmelting-aktiewe konformasie van MIV-1 gp41. Nat. Struktuur. Biol. 5, 276–279 (1998).

Munoz-Barroso, I., Durell, S., Sakaguchi, K., Appella, E. & Blumenthal, R. Verwydering van die menslike immuniteitsgebrekvirus-1-omhulselglikoproteïenfusieporie wat deur die inhiberende werking van 'n sintetiese peptied van gp41 geopenbaar is. J. Cell Biol. 140, 315–323 (1998).

Kilby, J.M. & Eron, J.J. Nuwe terapieë gebaseer op meganismes van MIV-1-seltoetrede. N. Engl. J. Med. 348, 2228–2238 (2003).

Reeves, J.D. et al. Sensitiwiteit van MIV-1 vir toetrede-inhibeerders korreleer met omhulsel/koreseptor-affiniteit, reseptordigtheid en samesmeltingkinetika. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 99, 16249–16254 (2002).

Reeves, J.D. et al. Enfuvirtide-weerstandsmutasies: impak op menslike immuniteitsgebrekvirus-omhulselfunksie, intree-inhibeerdersensitiwiteit en virusneutralisasie. J. Virol. 79, 4991–4999 (2005).

Frey, G. et al. 'n Fusie-intermediêre toestand van MIV-1 gp41 geteiken deur breedweg neutraliserende teenliggaampies. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 105, 3739–3744 (2008).

Danieli, T., Pelletier, S.L., Henis, Y.I. & White, J.M. Membraansamesmelting bemiddel deur die griepvirus hemagglutinien vereis die gesamentlike werking van ten minste drie hemagglutinien trimere. J. Cell Biol. 133, 559–569 (1996).

Yang, X., Kurteva, S., Ren, X., Lee, S. & Sodroski, J. Subeenheid-stoïgiometrie van menslike immuniteitsgebrekvirus tipe 1-omhulsel-glikoproteïen-trimere tydens virusinskrywing in gasheerselle. J. Virol. 80, 4388–4395 (2006).

Rand, R.P. & Parsegian, V.A. Fisiese kragoorwegings in model- en biologiese membrane. Kan. J. Biochem. Sel Biol. 62, 752–759 (1984).

Son, Z.Y. et al. MIV-1-neutraliserende teenliggaampies onttrek sy epitoop uit 'n geknikte gp41-ektodomeinstreek op die virale membraan. Immuniteit 28, 52–63 (2008).

Kemble, G.W., Danieli, T. & White, J.M. Lipied-geankerde griephemagglutinien bevorder hemifusie, nie volledige samesmelting nie. Sel 76, 383–391 (1994).

Melikyan, G.B., White, J.M. & Cohen, F.S. GPI-geankerde griephemagglutinien veroorsaak hemifusie na beide rooibloedselle en planêre dubbellaagmembrane. J. Cell Biol. 131, 679–691 (1995).

Armstrong, R.T., Kushnir, A.S. & White, J.M. Die transmembraandomein van griephemagglutinien toon 'n streng lengtevereiste om die hemifusie na fusie-oorgang te ondersteun. J. Cell Biol. 151, 425–437 (2000).

Frey, G. et al. Klein molekules wat die binnekern van gp41 bind en MIV-omhulsel-gemedieerde samesmelting inhibeer. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 103, 13938–13943 (2006).

Lin, P.F. et al. 'n Klein molekule MIV-1-remmer wat die MIV-1-omhulsel teiken en CD4-reseptorbinding inhibeer. Proc. Natl. Acad. Wetenskap. VSA 100, 11013–11018 (2003).

Chen, B. et al. Struktuur van 'n unliganded simian immuniteitsgebrekvirus gp120 kern. Natuur 433, 834–841 (2005).


MATERIALE EN METODES

Selkultuur en transfeksies

Alle sellyne is in bevogtigde atmosfeer by 37°C met 5% CO geïnkubeer2. P493-6 en Jurkat T-selle is in RPMI-medium gekweek en HEK293-, HEK293T-, U2OS- en HeLa-selle is in DMEM+Glutamax-medium gekweek, beide aangevul met 10% hitte-geïnaktiveerde fetale kalfserum en 1% penisillien/streptomisien (P/S) ). Vir groei-arrestasie en MYC-onderdrukking, is P493-6 B-selle gesaai teen 5 × 10 5 /ml en behandel met 0.1 μg/ml tetrasiklien vir 72 uur. Om MYC-uitdrukking te veroorsaak, is tetrasiklien verwyder deur die selle twee keer met fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS) te was en vars RPMI-medium wat 10% FCS (+MYC) bevat, by te voeg. Kontroleselle is in tetrasiklien-bevattende medium gehou tot oes (-MYC).

Transfeksies van plasmiede is uitgevoer met behulp van die kalsiumfosfaatmetode (35, 36). Eksperimente is 36 tot 48 uur na transfeksie geoes wanneer slegs proteïen-uitdrukkingsplasmiede gebruik is. Eksperimente met plasmiede wat korthaarnaald-RNA's (pSuper) uitdruk, is 72 uur na transfeksie geoes. Verbygaande transfeksies met Dharmacon siRNAs is uitgevoer met behulp van HiPerfect (Qiagen, Hilden Duitsland) transfeksie reagens volgens die vervaardiger se instruksies by 'n finale konsentrasie van 15-20 nM.

Dharmacon siRNA swembaddens (Thermo Scientific)

Beheer: siGENOME nie-teiken siRNA Pool #2 (D-001206-14)

ASH2L: SMARTpool siGENOME ASH2L siRNA (M-019831-01)

MYC: SMARTpool siGENOME MYC siRNA (M-003282-07)

Dharmacon Stel van 4 enkel siRNAs (Thermo Scientific)

ASH2L: siGENOME ASH2L siRNA (MQ-019831-01)

MYC: siGENOME MYC siRNA (MQ-003282-07)

Die vier individuele siOligos is getoets vir afbreekdoeltreffendheid (data nie getoon nie). Die twee mees doeltreffende siOligos is toe gebruik in addisionele kontrole eksperimente (getoon in Aanvullende Figure S6 en S7).

Plasmiede, siRNA's en rekombinante proteïene

pcDNA3-Vlag-MYC-1-439 (wt), -1-410, -1-350, -1-180, -101-439, -148-439, -178-439, -Δ103-263, -Δ265 -329, -Δ265-367, -Δ319-341 en pCGN-HA-MYC-1-439 (wt), -1-366, -1-293, -1-220, -221-439, -294-439 , -367-439 is vriendelik verskaf deur W. Tansey ( 37). Plasmiede wat ASH2L uitdruk, is voorheen beskryf (38). Mutante is gegenereer deur gebruik te maak van standaard kloningstegnieke. Die volgende pSuper (39) konstrukte is gebruik: pSuper-ASH2L 5'-GGATCTCACTTACCGCCCT pSuper-Control (ASH2Lmut) 5'-CCCTGCAGATCCATGCTT. pcDNA3-Flag-MLL2 653 (Addgene 11017), pcDNA3-Flag-WDR5 (Addgene 15552) en pcDNA3 RbBP5 (Addgene 15550) plasmiede is gebruik vir die uitdrukking van die KMT2 komplekse komponente.

Rekombinante proteïene is geproduseer in Escherichia coli (E coli) BL21(DE)pLysS as GST-fusion of His6-fusieproteïene met behulp van die volgende konstrukte pGEX4T3-ASH2L-wt, -1-121, -1-279, -1-394, -1-444, pGEX2T-MYC-1-262 (N262), -1-156, - 263-439, pGEX3X-MAX, pGEX2T-YY1, pGEX4T3-H3-N, pQE30-ASH2-1-387, pRSET-Syn6-WDR5 ( 40). Getransformeerde bakterieë is gegroei tot 'n OD van 0.7-0.9 en proteïenuitdrukking is geïnduseer met 0.4 mM IPTG óf by 37°C vir 4 uur of by 21°C vir 16 uur. Bakteriese korrels is gelys in buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.5% (v/v) Nonidet P40, 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.2 mM fenielmetielsulfonielfluoried (PMSF), 1% v/v) Aprotinien), gesoniceer en gesentrifugeer by 10.000 xg by 4°C vir 30 min. GST-fusieproteïene is van die sellisaat geskei met glutathione-agarose (Sigma-Aldrich) en geëlueer van die krale met 10 mM glutathione in buffer A.

Maltose-bindende proteïen-MYC samesmelting (MBP-MYC) en MBP (41) is gesuiwer uit E coli BL21(DE)pLysS gegroei in NZC-medium (1% NZ-amien A, 0.5% (w/v) NaCl, 0.2% (w/v) MgCl2, 0,2% glukose) geïnduseer by OD 0,5 met 0,3 mM IPTG by 30°C vir 4 uur. Selle is in buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2 mM PMSF, 1% (v/v) Aprotinin) gelys, gesonikeer en teen 10 000 xg gesentrifugeer 4°C vir 30 min. MBP-proteïene is met amilose-agarose (New England Biolabs) van die sellysaat geskei en uit die krale geëlueer met 10 mM maltose in buffer A. Kernhistone en rekombinante histoon H3 (New England Biolabs) en GST-Histone H3 N'-terminaal -sterte (verskaf deur Y. Shinkai) ( 40) is as substrate gebruik.

GST-aftrektoetse

Vir bindingsreaksies is 3 μg GST of GST-fusieproteïene aan glutathion-agarose-krale gebind en geïnkubeer met [35S]metionien-gemerkte, in vitro getranskribeerde en vertaalde proteïene in bindingsbuffer of met 3 μg rekombinante His6-fusieproteïene (42). Vir in vitro vertaling/transkripsie, die TNT Quick Coupled Transscription/Translation System (Promega) is gebruik met die plasmiede pcDNA3-Flag-MYC en pcDNA3-Flag-ASH2L.

Ko-immunopresipitasie

Vir selinteraksietoetse is heelsel-lisate van 2 × 10 7 selle in F-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.05, 50 mM NaCl, 30 mM Na voorberei)3PO4, 50 mM NaF, 5 μM ZnCl, 100 μM Na3VO4, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 eenhede/ml α2-makroglobulien, 2,5 eenhede/ml pepstatien A, 2,5 eenhede/ml leupeptien, 0,15 mM benzamidin). Ko-immunopresipiteerde proteïene is opgespoor deur western klad analise (43, 44).

Histoonmetieltransferase-toets

Heelsel-lisate van 3 × 10 7 selle is in F-buffer voorberei om MYC of ASH2L en die geassosieerde MTase te immunopresipiteer. MYC- en ASH2L-geassosieerde MTase is gemeet met 5 μg kernhistone of GST-H3 N-terminale sterte as substrate in die teenwoordigheid van 1.5 μl [3 H]-SAM (Perkin-Elmer Life Sciences, NET-155H, 0.55 mCi/ ml, 79,8 Ci/mmol) by 30°C vir 30 min. Gemodifiseerde proteïene is gevisualiseer deur SDS-PAGE en outoradiogafie. Plekspesifisiteit en MYC-geassosieerde metieltransferase-aktiwiteit is gemeet met 1 μg rekombinante histoon H3 in die teenwoordigheid van 100 μM SAM by 30°C vir 1 uur. Histoon H3 metilering is opgespoor deur immunoblotting met verskillende H3K4 en H3K9 metiel-spesifieke teenliggaampies.

Immunofluoressensiekleuring

HeLa-selle is op dekstrokies gesaai, kortstondig getransfekteer met pSuper-ASH2L en gefixeer in PBS wat 3.7% paraformaldehied bevat 72 uur na transfeksie. Selle is gepermeabiliseer in PBS met 0.2% Triton X-100 by kamertemperatuur vir 5 min en gekleur met die ASH2L-spesifieke rot mAb 4C5 en die H3K4me3-spesifieke konyn poliklonale teenliggaam ab8898 (abcam) by 37°C vir 45 min. Anti-rat-Cy3 en anti-konyn-Cy2 sekondêre teenliggaampies is vir 30 min by 37°C gebruik. Dekstrokies is gemonteer met Moviol (Merck) in PBS wat 2,5% N-propylgallaat (Sigma) bevat. Vir die proximity ligation assay (PLA) is die DuolinkII fluoressensie sisteem gebruik saam met die Probemaker Plus kit vir etikettering van die sekondêre anti-rot teenliggaam volgens die vervaardiger se instruksies (Olink Bioscience) (45).

Teenliggaampies

Die volgende teenliggaampies is gebruik vir IP, chromatien-immunopresipitasies (ChIP) en westelike klad: konyn-anti-MYC (N262, sc-764 C19, sc-788, beide Santa Cruz IG13, 022Y, 1236 al drie verskaf deur L.-G Larsson), konyn anti-MAX (C17, sc-197, Santa Cruz), rot anti-MXD1 (5F4), muis anti-nukleolien (MS-3, sc-8031, Santa Cruz) konyn anti-ASH2L (A300– 489A, Bethyl sera 548 en 549 (antigeen ASH2L-1-444)), rot anti-ASH2L (4C5 en 4B5 (antigeen ASH2L-1-279)), muis anti-WDR5 (ab56919, abcam), konyn anti-RbBP5 ( A300-109A, Bethyl), konyn anti-H3 (ab1791, abcam), konyn anti-H3ac (06-599, Millipore), konyn anti-H3K9ac (ab4441, abcam), konyn anti-H3K27ac (ab4729, abcam), r anti-H3K4me3 (ab8580, abcam), konyn anti-H3K4me2 (07-030, Millipore), konyn anti-H3K4me1 (ab8895, abcam), konyn anti-H3K9me3 (ab8898, abcam), konyn H3K4me12 (07K9me) (07K9me) , konyn anti-H3K9me1 (ab9045, abcam), konyn anti-H3K27me3 (ab6002, abcam), konyn anti-CBP (C-20, sc-583, Santa Cruz), konyn anti-p300 (N- 15, sc-584, Santa Cruz), konyn IgG (Kch-504-250, Diagenode), muis anti-aktien (MP Biomedicals), rot anti-HA (3F10, Roche), muis anti-vlag (M2, Sigma- Aldrich), konyn anti-kaspase 5 (2157, is vriendelik verskaf deur A. Krippner-Heidenreich).

ChIP- en Re-ChIP-qPCR

ChIP-qPCR-toetse is uitgevoer met die Diagenode OneDay ChIP-stel volgens die vervaardiger se instruksies. P493-6- en HEK293T-selle is met 1% formaldehied (deur 37% formaldehied by die medium by te voeg) op 'n skudplatform vir 10 min by kamertemperatuur gekruis en vir 5 min geblus deur 125 mM glisien by te voeg. Selle is gelys in 100 μl lysisbuffer (2 × 10 7 P493-6 selle en 1 × 10 7 HEK293T selle) en chromatien is vir 15 minute geskeer deur 'n Bioruptor (Diagenode) te gebruik. Immunopresipitasie is uitgevoer met 100 μg chromatien (insette) en 2 μg teenliggaampies. DNA is gesuiwer en die kwantitatiewe polimerase kettingreaksie (qPCR) is uitgevoer met die volgende primer pare:

Ctrl pp4 (vir): 5'-GCGTGACTCAAATTGTGTGTGCCT-3'

Ctrl pp4 (rev): 5'-ATCAAGCATTCAGCAGCGTTC CA-3'

CCND2 prom1 (vir): 5'-CCCCTTCCTCCTGGAGTGAAATAC-3'

CCND2 prom2 (rev): 5'-CGTGCTCTAACGCATCCTTGAGTC-3'

CCND2 Ex1 (vir): 5'-GGGAGAGCGAGACCAGTTTTTAAG-3'

CCND2 Ex1 (rev): 5'-CCTTTGGCTAAATAGGGGGTTTTC-3'

ODC E-boks (vir): 5'-ATCACTTCCAGGTCCCTTGCAC-3'

ODC E-boks (rev): 5'-TTCCACCTGGCGTTCAGTACCT-3'

NCL In1 (vir): 5'-TGGGCCGGGAAATGGCGGTA-3'

NCL In1 (rev): 5'-TAGGCCACCACGTGCCCGAA-3'

Vir Re-ChIP eksperimente is die eerste IP uitgevoer met 100–200 μg chromatien (invoer). Chromatin was released from beads using release buffer (TE buffer, pH 7.5, 1% SDS, 10 mM DTT) for 30 min at 37°C and diluted in 4 volumes ChIP buffer (Diagenode OneDay ChIP kit, with protease inhibitor cocktail and 10 mM iodoacetamide). Then, 2 μg of antibody were added for the second immunoprecipitation, followed by DNA purification and qPCR. PCR was performed as described below.

The DNA was purified from one tenth of the input chromatin that was used for the ChIPs, diluted two-fold and used for qPCR amplification. The dilution factor was included in the % input calculation of all the qPCR results.

QRT-PCR

Total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen) and DNase digestion (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. 1 μg of RNA was reverse transcribed into cDNA using the QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) and analyzed by qPCR with SensiMix SYBR Green Mix (Bioline) in a Rotor-Gene Q (Qiagen) machine.

The following primer pairs were used for amplification:

β-glucuronidase (GUS) for: 5’-CTCATTTGGAATTTTGCCGATT-3’,

β-glucuronidase (GUS) rev: 5’-CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA-3’

QuantiTect primer assays (Qiagen): MYC (Hs_Myc_1_SG), ASH2L (Hs_ASH2L_1_SG), CCND2 (Hs_CCND2_1_SG), ODC (Hs_ODC1_1_SG), NCL (Hs_NCL_1_SG). Relative mRNA expression was calculated by the comparative ΔΔCt method and normalized to the housekeeping gene GUS using Rotor-Gene Q software.

P493-6 cells were harvested by centrifugation, washed with PBS and fixed by adding 100% methanol at -20°C. After RNase A treatment (20 μg/ml) cells were stained with propidium iodide (PI, 50 μg/ml) for 15 min at room temperature and analyzed using a FACSCanto II (BD Biosciences).

Bioinformatics analysis of publicly available ChIP-Seq data

Public data from ChIP experiments followed by massively parallel DNA sequencing (ChIP-Seq) was used to analyze the occupancy of the factors MYC, WDR5 and POL II and the occurrence of the histone modifications H3K4me3, H3K4me1 and H3K27me3 in normal human epidermal keratinocytes (NHEK). Data from histone modifications, POL II, MYC and controls were obtained from the ENCODE project (GEO accession GSE29611, GSM748557). WDR5 ChIP-Seq was obtained from published findings ( 46) (GEO accession GSE42180). No read alignments were provided in GEO for WDR5 and MYC. For those, the alignments from original sequence reads were performed using Burrows-Wheeler Alignment tool with default parameters ( 47). All alignments were based on the human reference genome Hg19. Peak calling was performed with MACS ( 48) with a bl-value of 10 −5 and the ChIP-Seq control as input.

Definition of regulatory features

Publicly available data for histone modifications were combined to define regulatory regions in NHEK cells: active promoters (both H3K27ac and H3K4me3 peaks overlapping with the core promoter, 200 bps upstream of a gene transcription start site (TSS)), active enhancers (regions distant from core promoters with peaks of both H3K4me1 and H3K27ac), poised promoters (H3K4me3 and H3K27me3 ( 49)), poised enhancers (H3K4me1, lack of H3K27ac ( 50)) and closed chromatin regions (only H3K27me3). Regions not fitting any of these criteria were indicated as ‘other’. bedTools ( 51) was used to find the regions of overlap between these sites that contain histone with specific modifications and the TSS of genes. Gene TSS positions were based on Hg19 RefSeq annotation obtained from USCD Table Browser. Additionally, the overlap of these regions with POL II ChIP-Seq peaks was evaluated. As a last step, the peaks from MYC, WDR5 and regions containing both MYC and WDR5 peaks were related to the above-mentioned regulatory features (see Supplementary Tables S1 and S2 for statistics).

Analysis of transcription factor binding sites

To analyze the presence of binding sites for MYC and ASH2L inside ChIP-Seq peaks, the summit regions of the Chip-Seq peaks (positions with highest reads within a peak as provided by MACS), extended by 125 bps in each direction, were inspected. This procedure ensures that all peaks possess the same size and avoids biasing the binding site statistics. The choice of peaks with a size of 250 bps is in accordance with previously published work ( 52). Note that other choices of peak sizes (500, 100 and 80 bps) resulted in similar qualitative results (data not shown). As background, random genomic regions with the same characteristics of the ChIP-Seq peaks were obtained. The MYC position weight matrix (MA0147.1) from the Jaspar database ( 53) and the ASH2L position weight matrix from ( 54) were used. Biopython ( 55) was employed to perform binding site searches. Functions provided by the Motif class were applied to calculate a bit-score based on the application of a position Weight Matrix in the ChIP-Seq peaks. An empirical statistical test based on dynamic programming was used to define a bit-score threshold with a false discovery rate of 0.0001 ( 56). The number of MYC, WDR5 and both MYC and WDR5 ChIP-Seq peaks with at least one binding site motif were counted and a Fisher's Exact test performed to evaluate whether the proportion of peaks with binding sites is higher than in the background regions (Supplementary Table S3). Using the same analysis, but classifying the MYC or WDR5 peaks that belong to the previously described regulatory features, no relation between the proportion of binding sites and the regulatory features surrounding the peaks was detected (not shown). The analysis was performed with the Regulatory Genomics Toolbox available at https://code.google.com/p/reg-gen/.

Analysis of gene expression

To evaluate if regions of ChIP-Seq peaks and NHEK expression data from RNA-Seq experiments are related, the alignment of RNA-Seq reads from the ENCODE project (GSM958736) was analyzed. The summits of peaks of MYC, WDR5 and both MYC and WDR5 were extended by 1000 bps to capture the expression of neighboring genes. The number of aligned reads inside the ChIP-Seq peaks was counted and normalized by the size of the peaks. In addition, the same analysis was performed considering only ChIP-Seq peaks overlapping with the region 200 bps upstream of a TSS.


C-myc/anti-myc Ab Interaction with Fusion Proteins - Biology

Integrin ligand binding induces a signaling complex formation via the direct association of the docking protein p130 Cas (Cas) with diverse molecules. We report here that the 14-3-3ζ protein interacts with Cas in the yeast two-hybrid assay. We also found that the two proteins associate in mammalian cells and that this interaction takes place in a phosphoserine-dependent manner, because treatment of Cas with a serine phosphatase greatly reduced its ability to bind 14-3-3ζ. Furthermore, the Cas-14-3-3ζ interaction was found to be regulated by integrin-mediated cell adhesion. Thus, when cells are detached from the extracellular matrix, the binding of Cas to 14-3-3ζ is greatly diminished, whereas replating the cells onto fibronectin rapidly induces the association. Consistent with these results, we found that the subcellular localization of Cas and 14-3-3 is also regulated by integrin ligand binding and that the two proteins display a significant co-localization during cell attachment to the extracellular matrix. In conclusion, our results demonstrate that 14-3-3 proteins participate in integrin-activated signaling pathways through their interaction with Cas, which, in turn, may contribute to important biological responses regulated by cell adhesion to the extracellular matrix.


Kyk die video: 1118: BCL2 Overexpression or C-MYC Overexpression (Oktober 2022).