Inligting

Rede vir die gebruik van induseerbare promotor vir heteroloë uitdrukking

Rede vir die gebruik van induseerbare promotor vir heteroloë uitdrukking


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dit lyk of protokolle dikwels reguleerbare promotors gebruik wanneer 'n heteroloë geen in 'n gasheer soos gis uitgedruk word, waar hulle iets soos IPTG byvoeg om uitdrukking van (sê) die lac-promotor te veroorsaak.

Is daar 'n rede om dit te doen in teenstelling met die gebruik van 'n konstitutiewe promotor? d.w.s. Is daar rede om te dink dat reguleerbare (induseerbare) promotors hoër uitdrukkingsvlakke het as konstitutiewe promotors?

Met ander woorde, watter nut is daar om 'n eksterne "skakelaar" te hê, dit wil sê die IPTG om uitdrukking op aanvraag aan te skakel eerder as om net die verstek uitdrukkingsvlak 'n hupstoot te gee deur 'n promotor wat nie induksie benodig nie?

Die doel hier is klein biomolekulesintese deur industriële fermentasie van 'n transgeniese gis.

Voorbeeld protokol:

L21 Star™ (DE3) E. coli-selle (Invitrogen) is saam met die plasmiede pACYCDuet-4506 en Ct94-pETDuet getransformeer en getransformeerde selle is geselekteer op karbenisillien (50 μg/ml) chlooramfenikol (34 μg/ml) LB-agarose plate. Enkelkolonies is gebruik om 5 mL LB-medium met 50 μg/ml karbenisilien en 34 μg/ml chlooramfenikol te ent. Die kultuur is oornag by 37° C geïnkubeer. Die volgende dag is 2 mL TB-medium aangevul met dieselfde antibiotika met 0.2 mL van die oornagkultuur geënt. Na 6 uur inkubasie by 37° C., is die kultuur afgekoel tot 28° C. en 1 mM IPTG, 2 mg/ml mevalonaat (berei deur mevalonolaktoon (Sigma) op te los in 0.5N NaOH teen 'n konsentrasie van 1 g/ml en inkubasie van die oplossing vir 30 minute by 37°C.) en 0.2 ml dekaan is by elke buis gevoeg. Die kulture is vir 48 uur by 28° C geïnkubeer. Die kulture is dan twee keer met 2 volumes etielasetaat onttrek, die organiese fase is gekonsentreer tot 500 μL en ontleed deur GC-MS soos hierbo beskryf in Voorbeeld 3. In hierdie toestande sesquiterpeen produksie bo 200 mg/L is gereeld bereik. Beta-santaleen is vervaardig.


Heteroloë promotors druk dikwels gene uit wat giftig is vir die organisme wanneer dit in te groot hoeveelhede uitgedruk word. Wanneer die gene konstitutief uitgedruk word, sal die organisme óf stadig groei óf sterf voordat hulle 'n hoë digtheid bereik wat geskik is vir die produksie van die proteïen.

As sodanig gaan dit nie daaroor om die gene heeltyd uit te druk nie, maar om die maksimum hoeveelheid geenproduk oor die kortste tydperk uit te druk. Dit maak nie sin dat die selle die geenproduk heeltyd uitdruk as hulle nie eers voldoende digthede kan bereik nie. Meer produk sal gemaak word as die selle toegelaat word om tot 'n relatief hoë digtheid te groei, en dan uitdrukking op almal van hulle veroorsaak. Dit sal relatief groot produksievlakke in 'n kort tydperk moontlik maak.


Kyk die video: Transcription (Oktober 2022).