Inligting

Makrofage patogeen fiksasie

Makrofage patogeen fiksasie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Te vereenvoudig, makrofage herken patogene patrone en endositiseer enigiets wat daarby pas.

Dit werk ook op bakterieë, wat dikwels baie beweeglik is. Wat as 'n bakterie net lukraak rondruk wanneer 'n makrofaag dit herken - sou dit moontlik wees dat dit "wegswem" (as 'n reaksie op die makrofaag of net lukraak)? Of gebruik makrofage 'n soort fiksasiemeganisme om enigiets wat hulle herken naby te hou totdat dit verswelg word? Of is verswelging op sigself net so vinnig?


As 'n alternatiewe verduideliking verwys ek na hierdie video.

Kruipende Neutrofiel Jaag 'n Bakterium

Benewens 'n hoë affiniteit tussen die teikenbakterie en die makrofaag, sal die waarneming van die bakterie ook amoeboïedbeweging veroorsaak om 'n patogeen af ​​te jaag.


Die verduideliking wat een van my tutors aangebied het, was die volgende:

In selherkenning is dit baie algemeen dat interaksies tussen proteïene gebaseer is op swak interaksies, maar 'n sekere mate van binding kan 'n (konformasie) verandering veroorsaak wat eerder 'n baie sterk interaksie tussen die betrokke proteïene sal vestig.

Met ander woorde, as die kontak spesifiek genoeg is om as 'n erkende patogeen te tel, sal die interaksies onmiddellik na sterk kragte verander en die patogeen sal nie kan wegbeweeg nie.


Makrofage patogeen fiksasie - Biologie

Figuur 1. Selle van die bloed sluit in (1) monosiete, (2) limfosiete, (3) neutrofiele, (4) rooibloedselle en (5) bloedplaatjies. Let op die baie soortgelyke morfologieë van die leukosiete (1, 2, 3). (krediet: wysiging van werk deur Bruce Wetzel, Harry Schaefer, NCI-skaalstaafdata van Matt Russell)

'n Infeksie kan intrasellulêr of ekstrasellulêr wees, afhangende van die patogeen. Alle virusse besmet selle en repliseer binne -in die selle (intrasellulêr), terwyl bakterieë en ander parasiete intrasellulêr of ekstrasellulêr kan repliseer, afhangende van die spesie. Die aangebore immuunstelsel moet dienooreenkomstig reageer: deur die ekstrasellulêre patogeen te identifiseer en/of deur gasheer selle wat reeds besmet is, te identifiseer. Wanneer 'n patogeen die liggaam binnedring, bespeur selle in die bloed en limf die spesifieke patogeen-geassosieerde molekulêre patrone (PAMP's) op die oppervlak van die patogeen. PAMP's is koolhidraat-, polipeptied- en nukleïensuur "handtekeninge" wat deur virusse, bakterieë en parasiete uitgedruk word, maar wat verskil van molekules op gasheerselle. Die immuunstelsel het spesifieke selle, beskryf in Figuur 1 en getoon in Tabel 1, met reseptore wat hierdie PAMPs herken.

A makrofage is 'n groot fagositiese sel wat vreemde deeltjies en patogene verswelg. Makrofage herken PAMP's via komplementêre patroonherkenningsreseptore (PRR's). PRR's is molekules op makrofage en dendritiese selle wat in kontak is met die eksterne omgewing. A monosiet is 'n tipe witbloedsel wat in die bloed en limf sirkuleer en in makrofage differensieer nadat dit in besmette weefsel inbeweeg. Dendritiese selle bind molekulêre handtekeninge van patogene en bevorder patogene verswelging en vernietiging. Tolagtige reseptore (TLR's) is 'n tipe PRR wat molekules herken wat deur patogene gedeel word, maar onderskeibaar is van gasheermolekules. TLRs kom voor by sowel ongewerweldes as gewerweldes, en blyk een van die oudste komponente van die immuunstelsel te wees. TLR's is ook geïdentifiseer in die soogdier senuweestelsel.

Tabel 1. Die eienskappe en ligging van selle betrokke by die aangebore immuunstelsel word beskryf (krediet: wysiging van werk deur NIH).
Sel Tipe Eienskappe Ligging Diagram
Masselle Verwyder bloedvate en veroorsaak inflammasie deur die vrystelling van histamiene en heparien. Werf makrofage en neutrofiele. Betrokke by wondgenesing en verdediging teen patogene, maar kan ook verantwoordelik wees vir allergiese reaksies. Bindweefsels, slymvliese
Makrofage Fagositiese selle wat vreemde patogene en kankerselle verteer. Stimuleer reaksie van ander immuunselle. Migreer van bloedvate na weefsels
Natuurlike moordenaarselle Dood tumorselle en virus-geïnfekteerde selle Sirkuleer in bloed en migreer in weefsels
Dendritiese selle Bied antigene op hul oppervlak aan en veroorsaak daardeur aanpasbare immuniteit Aanwesig in weefsels in epiteelweefsel, insluitend vel, longe en weefsels van die spysverteringskanaal. Migreer na limfknope by aktivering.
Monosiete Onderskei in makrofage en dendritiese selle in reaksie op inflammasie. Geberg in die milt, beweeg deur bloedvate na besmette weefsels.
Neutrofiele Eerste reageerders op die plek van infeksie of trauma, hierdie oorvloedige fagositiese selle verteenwoordig 50-60% van alle leukosiete. Laat gifstowwe vry wat bakterieë en swamme doodmaak of inhibeer en werf ander immuunselle na die plek van infeksie. Migreer van bloedvate na weefsels
Basofiele Verantwoordelik vir verdediging teen parasiete. Stel histamiene vry wat inflammasie veroorsaak en kan verantwoordelik wees vir allergiese reaksies. Sirkuleer in bloed en migreer na weefsels
Eosinofiele Laat gifstowwe vry wat bakterieë en parasiete doodmaak, maar ook weefselskade veroorsaak. Sirkuleer in bloed en migreer na weefsels


HERSIEN artikel

  • 1 Departement van Geneeskunde, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, Verenigde State
  • 2 Departement Genetika, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, Verenigde State
  • 3 Yale Kardiovaskulêre Navorsingsentrum, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, Verenigde State
  • 4 Vaskulêre Biologie en Terapeutika-program, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, Verenigde State
  • 5 Yale-stamselsentrum, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, Verenigde State
  • 6 Departement Selbiologie, Kardiovaskulêre Navorsingsentrum, Universiteit van Virginia, Skool vir Geneeskunde, Charlottesville, VA, Verenigde State

Weefsel-inwonende makrofage is geassosieer met belangrike en diverse biologiese prosesse soos inheemse immuniteit, weefselhomeostase en angiogenese tydens ontwikkeling en postnataal. Dit is dus van kritieke belang om die oorsprong en funksies van weefsel-inwonende makrofage te verstaan, sowel as meganismes onderliggend aan hul regulering. Dit word nou goed aanvaar dat muriene makrofage tydens drie opeenvolgende golwe van hematopoietiese ontwikkeling geproduseer word. Die eerste golf van makrofaagvorming vind plaas tydens primitiewe hematopoiese, wat in die dooiersak voorkom, en gee aanleiding tot primitiewe eritroïed-, megakariosiet- en makrofaag-voorlopers. Hierdie “primitiewe” makrofage stamvaders gee uiteindelik aanleiding tot mikroglia in die volwasse brein. Die tweede golf, wat ook in die dooiersak voorkom, genereer multipotente eritro-miëloïde stamvaders (EMP), wat aanleiding gee tot weefsel-inwonende makrofage. Weefsel-inwonende makrofage afkomstig van EMP woon in diverse nisse van verskillende weefsels behalwe die brein, en demonstreer weefselspesifieke funksies daarin. Die derde golf van makrofage is afkomstig van hematopoietiese stamselle (HSC) wat in die aorta-gonade-mesonephros (AGM)-gebied van die embrio gevorm word en migreer na, en koloniseer, die fetale lewer. Hierdie HSC-afgeleide makrofage is 'n langlewende poel wat regdeur volwassenheid sal hou. In hierdie oorsig bespreek ons ​​die ontwikkelingsoorsprong van weefsel-inwonende makrofage, hul molekulêre regulering in spesifieke weefsels, en hul impak op embrioniese ontwikkeling en postnatale homeostase.


Makrofage as fagosiete

Makrofage is een van drie tipes fagositiese seltipes, benewens granulosiete (neutrofiele, eosinofiele en basofiele) en dendritiese selle (DC's). Sodra 'n mikro-organisme die gasheer binnegaan en begin repliseer, word dit deur een van hierdie fagosiettipes herken en ingeneem vir vernietiging, 'n proses wat fagositose genoem word. Die meeste patogene kom die gasheer binne deur die respiratoriese stelsel, dermslymvlies, velletsels of die urogenitale kanaal. Aangesien makrofage submukosale weefsels bevolk, is hulle gewoonlik die eerste verdedigingselle wat patogene teëkom. Fagositose word geïnisieer wanneer sekere fagosietreseptore-gewoonlik koolhidraat- of lipiedstrukture spesifiek vir patogene-interaksie met die patogeenoppervlak [3].

Na hierdie eerste interaksie omring en internaliseer die fagosietplasmamembraan die patogeen in 'n groot membraan-ingeslote endositiese vesikel wat 'n fagosoom genoem word. Die fagosoom word dan met een of meer lisosome, klein vesikels wat antimikrobiese peptiede en ensieme bevat, saamgesmelt om die fagolisosoom te vorm. Die lisosoominhoud word in die fagolisosoom vrygestel, wat op sy beurt versuring en ensiematiese prosesse ondergaan wat hoogs reaktiewe stikstofoksied- en superoksiedradikale produseer om die patogeen dood te maak [3].

Twee voorbeelde van fagosietreseptore is Dektien-1 en mannosereseptor (CD206). Albei is lede van die C-tipe lektienagtige familie. Dektien-1 word deur makrofage en neutrofiele uitgedruk en bind aan glukosepolimere wat algemeen in swamselwande voorkom. CD206 word uitgedruk deur makrofage en DC's en bind aan 'n verskeidenheid mannosyleerde ligande wat deur swamme, bakterieë en virusse gedeel word [3].


Kupffer-selle, komplement en patogeenherkenning

Die Kupffer-selle, wat binne die lumen van die lewersinusoïede woon, vorm die grootste populasie makrofage in die retikulo-endoteelstelsel. Alhoewel Kupffer-selle merkers in gemeen het met ander weefselresidente makrofage, verrig hulle gespesialiseerde funksies wat gerig is op doeltreffende opruiming van derm-afgeleide bakterieë, mikrobiese puin, bakteriese endotoksiene, immuunkomplekse en dooie selle teenwoordig in die sirkulasie (Bilzer) et al., 2006). Doeltreffende binding van patogene aan die KC-oppervlak is 'n deurslaggewende stap in die eerste-lyn immuunverdediging (Benacerraf et al., 1959). Laastens word 'n sentrale rol vir Kupffer-selle in patogeen-opruiming geïllustreer deur aansienlik verhoogde mortaliteit in Kupffer-sel-uitgeput muise wat met bakterieë uitgedaag word (Hirakata). et al., 1991 ).

Die enigste komplement C3-reseptore wat tot dusver op muis Kupffer-selle geïdentifiseer is, is CRIg en CR3 (Helmy et al., 2006), terwyl menslike Kupffer-selle addisionele uitdrukking van CR1 en CR4 toon (Hinglais et al., 1989). Beide CRIg en CR3 op Kupffer-selle dra by tot binding aan iC3b geopsoniseerde deeltjies in vitro (Helmy et al., 2006 ). In vivo, CR3 neem nie deel aan onmiddellike herkenning van iC3b-bedekte patogene nie, maar dra eerder by tot opruiming indirek deur die werwing van neutrofiele deur interaksie met neutrofiel-uitgedrukte ICAM-1 (Rogers en Unanue, 1993 Conlan en North, 1994 Gregory et al., 2002). CRIg dra by tot die opruiming van patogene in 'n vroeë stadium na infeksie deur patogene op te vang wat deur die lewer sinusvormige lumen vervoer word (Helmy et al., 2006). Hierdie verskil in die biologie word deels weerspieël deur 'n verskil in bindingseienskappe. Die doeltreffende vaslegging van C3b/iC3b-bedekte deeltjies in die sinusvormige lumen is waarskynlik die gevolg van hoë ywerige multivalente interaksies tussen CRIg-molekules gekonsentreer aan die punt van makrofaagmembraanverlengings en multimere van C3b en iC3b op die patogeenoppervlak. Verder, terwyl CR3 slegs iC3b-bedekte deeltjies bind, bind CRIg aan C3b, die eerste C3-splitsingsproduk wat op serum-opsoniseerde patogene gevorm word (Gordon et al., 1988 Croize et al., 1993). Binding aan C3b bykomend tot iC3b verseker onmiddellike patogeenherkenning deur CRIg. Dus, terwyl beide CRIg en CR3 op Kupffer-selle uitgedruk word, toon hulle duidelike bindingseienskappe en ligand-spesifisiteit, wat lei tot verskillende maniere van patogeenherkenning.


Terwyl intrasellulêre koolstofmetabolisme na vore gekom het as 'n aantreklike geneesmiddelteiken, is die koolstofbronne van intrasellulêre repliserende patogene, soos die tuberkulose-basil Mycobacterium tuberculosis, wat langtermyn infeksies in een derde van die wêreld se bevolking veroorsaak, bly meestal onbekend. Ons het 'n stelselgebaseerde benadering gebruik—13 C-vloed spektrale analise (FSA) aangevul met handanalise—om die metaboliese interaksie tussen M. tuberkulose en sy makrofaaggasheersel. 13 C-FSA analise van eksperimentele data het getoon dat M. tuberkulose verkry 'n mengsel van aminosure, C1 en C2 substrate van sy gasheersel. Ons het eksperimenteel bevestig dat die C1 substraat is afkomstig van CO2. 13C-etiketteringseksperimente wat op 'n fosfoenolpiruvaat karboksykinase mutant uitgevoer is, het aan die lig gebring dat intrasellulêre M. tuberkulose het toegang tot glikolitiese C3 substrate. Hierdie bevindinge verskaf beperkings vir die ontwikkeling van nuwe chemoterapeutika.

Hierdie is 'n ooptoegang-artikel wat versprei word onder die bepalings van die Creative Commons Erkenning-Niekommersieel-Geen Afgeleide Werke-lisensie, wat nie-kommersiële gebruik, verspreiding en reproduksie in enige medium toelaat, mits die oorspronklike outeur en bron gekrediteer word.


VERNIETIGING VAN LISTERIA MONOCYTOGENES IN VITRO

George L. Spitalny, Robert J. North, in Metodes vir die bestudering van mononukleêre fagosiete, 1981

II MATERIALE

A Reagense

1 Diere

Muise is die gewildste diere, alhoewel die prosedure gebruik kan word om die bakteriedodende aktiwiteit van makrofage van enige dier te meet, veral aangesien langtermyn-makrofaagkulture nie nodig is nie.

2 Listeria monocytogenes

'n Stam moet gekies word met ten minste matige virulensie vir muise. Die metode vir die verhoging van virulensie deur herhaalde deurgang in muise word beskryf deur North en Spitalny, hierdie volume, asook die metode vir die verkryging van 'n logfase-kultuur van Listeria vir makrofage uitdaging.

B Ontleding van materiaal

Klokkie wat chloroform-geweekte chirurgiese gaas bevat om muise dood te maak

Twee steriele 3-cm 3 spuite toegerus met 22-gauge naalde (Pharmaseal Labs, Glendale, Kalifornië, #7200)

50 ml plastiekbuise (Falcon Plastics, Oxnard, Kalifornië, #2070)

Stomp punt, 5 1/2 duim vlekvrye skêr (Clay Adams, Parsippany, New Jersey

Hemositometer vir die tel van peritoneale selle (Scientific Products, McGraw Park, Illinois. #B3180

C Weefselkultuurmateriaal

'n Aantal 35 × 10 mm weefselkultuur Petri-skottels (Corning Glass Works, Corning, New York, #25000, of Falcon Plastics, Oxnard, Kalifornië, #3001)

'n Aantal sirkelvormige dekstrokies met 'n deursnee van 12 of 13 mm (Clay Adams, Parsippany, New Jersey, #3350), wat skoongemaak en gesteriliseer word deur in 70% etanol te doop en te vlam

Klein tang om dekstrokies stewig vas te hou

RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, New York, #430-1800) wat 5% hitte-geïnaktiveerde (56°C vir 1 uur) fetale bees serum (RPMI-FBS) bevat met of sonder 5 U/ml preserveermiddelvry heparien (Sigma, St. Louis, Missouri, #3125)

Broeikas by 37°C voorsien van bevogtigde lug wat 5% CO bevat2

D Materiaal vir bakteriese uitdaging en telling

Petroff-Hauser kamer vir opsomming Listeria

Sonicator gestel op 50% maksimum uitset om kettings van bakterieë op te breek en om organismes te bevry wat deur makrofage gefagositiseer is (Biosonik, Brownwill Scientific, Rochester, New York

Bakteriese kolonie teller (New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey)

'n Aantal 5 ml plastiekbuise (Falcon Plastics, Oxnard, Kalifornië, #2058) wat 0,9 ml fisiologiese sout bevat vir reeksverdunnings

Bakteriese kultuurplate (Falcon Plastics, Oxnard, Kalifornië, #1056) wat Tryptikase-soja-agar bevat, voorberei soos beskryf deur North en Spitalny, hierdie volume.

Plastiek 15-ml buise wat 1 ml 0,1% WR 1339 skoonmaakmiddel (Ruger Chemical Co., Irvington, New Jersey) in steriele gedistilleerde water bevat

'n 2-liter aspiratorbottel met uitlaat gekoppel aan 'n rubberbuis toegerus met verstelbare klem en hemostaat. Die bottel is gevul met steriele soutoplossing wat 0,5% hitte-geïnaktiveerde fetale beeserum bevat.


Vooruitgang in bakteriese patogeenbiologie

Joby Cole,. David H. Dockrell, in Advances in Microbial Physiology, 2014

Abstrak

Makrofage is kritieke bemiddelaars van aangebore immuunresponse teen bakterieë. Die Gram-positiewe bakterieë Streptococcus pneumoniae en Staphylococcus aureus druk 'n reeks virulensiefaktore uit, wat makrofage se immuunbekwaamheid uitdaag. Ons hersien hoe makrofage op hierdie uitdaging reageer. Makrofage gebruik 'n reeks strategieë om elke patogeen te fagositiseer en dood te maak. Wanneer die makrofage se vermoë om bakterieë skoon te maak oorweldig word, speel makrofage 'n belangrike rol in die orkestrasie van die inflammatoriese reaksie deur patroonherkenning reseptor-gemedieerde response. Makrofage verseker ook dat die inflammatoriese reaksie streng beperk word, om weefselskade te vermy, en speel 'n belangrike rol in die afregulering van die inflammatoriese reaksie sodra aanvanklike bakteriese replikasie beheer is.


Inleiding

Tydens ontwikkeling en dwarsdeur die lewe word selle deur geprogrammeerde seldood uitgeskakel en vinnig deur fagosiete soos makrofage en glia skoongemaak. Daar word vermoed dat mislukkings in apoptotiese selopruiming (efferositose) bydra tot siekteprogressie in veelvuldige chroniese inflammatoriese toestande (bv. chroniese obstruktiewe longsiekte [COPD]) [1] en outo-immuun disfunksie [2], terwyl effektiewe verwydering van apoptotiese selle help om resolusie te bestuur van inflammasie [3]. Aangesien makrofaaginteraksies met apoptotiese selle in veelvuldige menslike patologieë gevind kan word, wou ons verstaan ​​hoe sulke interaksies makrofaaggedrag op sellulêre vlak beïnvloed. Daarom, om die uitwerking van ontwikkelings- en patologiese vlakke van apoptose op makrofage te bestudeer, het ons gebruik Drosophila embrio's, wat die gemak van die manipulering van seldood en apoptotiese selopruiming tydens in vivo beelding in hierdie model benut.

Drosophila embrio's bevat 'n populasie van hoogs beweeglike, makrofaagagtige selle (plasmatosiete, een van die drie hemosiet-seltipes) wat versprei om die hele embrio te bedek tydens ontwikkeling, wat apoptotiese selle verwyder en ekstrasellulêre matriks afskei soos hulle migreer [4]. Benewens hul funksionele ooreenkomste met gewerwelde witbloedselle, deel vliegbloedselle genetiese spesifikasies deur die werking van GATA- en Runx-familielede [5]. Verspreiding van embrioniese makrofage word beheer deur uitdrukking van plaatjie-afgeleide groeifaktor / vaskulêre endoteelgroeifaktor (PDGF / VEGF) verwante ligande (Pvfs) langs hul roetes [6-8], tesame met fisiese beperkings [9]. Sel-sel afstoting [10] en afregulering van Pvfs [8] dra by tot die tydsberekening en stereotipe aard van latere migrasiegebeurtenisse - laterale migrasie van makrofage vanaf die ventrale middellyn na die rande van die ontwikkelende ventrale senuwee koord (VNC).

Drosophila makrofage prioritiseer hul aktiwiteite in die ontwikkelende embrio, met apoptotiese selopruiming wat voorkeur geniet bo hul verspreiding [11]. Verbasend genoeg blyk voorafgaande blootstelling aan apoptotiese selle nodig te wees vir normale reaksies op besering en infeksie [12]. Inflammatoriese reaksies op steriele beserings stem baie ooreen met dié wat by gewerwelde diere waargeneem word met 'n Duox (ook bekend as Cy) afhanklike uitbarsting in waterstofperoksied wat noodsaaklik is vir normale werwing na plekke van skade [13,14] en 'n genetiese vereiste vir spesifieke Src familie kinases binne aangebore immuun selle [15,16].

Tydens embrioniese ontwikkeling, Drosophila makrofage werk saam met die glia van die sentrale senuweestelsel (SNS) om apoptotiese selle te verwyder [17]. Beide fagosiete gebruik 'n verskeidenheid reseptore om apoptotiese selle te herken en te verswelg [18], waarvan een Six-microns-under (Simu), ook bekend as Nimrod C4, is. Simu is 'n lid van die Nimrod-familie van seloppervlakreseptore met homologie met lede van die sellood abnormaliteit geen 1 (CED-1) familie van reseptore, bv. CED-1 (Caenorhabditis elegans) [19], Draper (Drosophila melanogaster) [20], Jedi-1, en veelvuldige epiteelgroeifaktor-agtige domeine 10 (MEGF10, muis) [21]. Simu bind fosfatidielserien (PS) met behulp van sy elastien-mikrofibril-koppelvlak-geleë proteïen (EMILIN) soos en NIM1 en NIM2 domeine by die N-terminus [22], en die afwesigheid daarvan van makrofage en glia lei tot 'n mislukking in die verwydering van ontwikkelingsgeprogrammeerde apoptose [23 ]. In sommige kontekste kan Simu stroomop van Draper [23] werk, hoewel direkte fisiese interaksie nie gedemonstreer is nie.

Hier het ons gebruik simu mutante vliegembrio's om makrofage met patologiese vlakke van apoptotiese seldood uit te daag om aan te spreek hoe dit hul daaropvolgende gedrag beïnvloed het. Ons wys dat apoptotiese seldood bydra tot ontwikkelingsverspreiding van makrofage en dat oormatige hoeveelhede apoptose ook defekte in verspreiding en migrasie veroorsaak. Chroniese vlakke van onopgeklaarde apoptotiese selle en akute induksie van apoptotiese seldood belemmer wondreaksies in vivo, belangrik, sonder 'n vereiste vir fagositose van hierdie sterwende selle. Ten slotte, in ons nuwe paradigma, demonstreer ons 'n nuwe rol vir Simu in die behoud van makrofage op plekke van nekrotiese wonde en onthul dat Simu die opruiming van nie-apoptotiese selle by sulke plekke van besering fasiliteer. Daarom is die rol van Simu nie beperk tot die opruiming van apopotiese selle nie, maar reguleer reaksies op beskadigde self in die algemeen.


Metodes van studie

Makrofage kan geïsoleer en ontleed word uit volbloed (PBMC-isolasie, makrofaag-analise, monosietstimulasie na makrofage) of van weefsel of gewasse (enkelsel-suspensievoorbereiding van weefsel- of tumormonsters). Daarbenewens is mens- en muismonosiet-sellyne kommersieel beskikbaar, insluitend THP-1-selle (akute monosietiese leukemie), U937-selle (histiositiese limfoom), sowel as RAW264.7-selle (muis-leukemiese monosietmakrofaag) en J774A.1-selle (muis). BALB/c monosiet makrofaag) [17].

Daar is verskeie metodes om makrofage te isoleer, insluitend magnetiese kraal-gekonjugeerde teenliggaampies isolasie, digtheid-gradiënt skeiding, laser-vang mikrodisseksie, en fluoressensie-geaktiveerde sel sortering (FACS) [18]. Na isolasie kan makrofaagfunksies en -fenotipes ontleed en gekarakteriseer word deur geenuitdrukking-analise, funksionele studies, assessering van sitokien- en chemokienproduksie, en analise van proteïenuitdrukking en seloppervlakmerkers met behulp van immunofluorescerende kleuring, immunoassays, vloeisitometrie, western blotting, of PCR . Let daarop dat nie elke ontledingsmetode isolasie vereis nie [18].

Makrofage isolasie

Wanneer makrofage van weefsels of gewasse ontleed of verwerk word, word tipies 'n weefsel- of tumorgedeelte of 'n enkelselsuspensie voorberei. Weefsel- of tumorafdelings kan direk vir immunohistochemie (IHC) kleuring en analise gebruik word. Om 'n enkelselsuspensie voor te berei, word die weefsel of gewas gedissekteer en dan ensimaties verteer. Enkelsel-suspensies kan gebruik word vir direkte analise deur metodes soos vloeisitometriese analise van oppervlakmerkers te gebruik.

Wanneer nodig, kan makrofage geïsoleer word uit 'n enkelsel-suspensie deur gebruik te maak van fluoressensie-geaktiveerde selsortering (FACS) of magnetiese kraal-gekonjugeerde teenliggaampies isolasie. Vir isolasie deur FACS, word fluorofoor-gekonjugeerde teenliggaampies spesifiek vir seloppervlakmerkers gebruik om 'n sel subset te vlek, en dan word 'n sel sorteerder gebruik om gekleurde selle te sorteer gebaseer op gedefinieerde sorteerkriteria. In magnetiese kraal-gekonjugeerde teenliggaampies isolasie word teenliggaampies spesifiek vir 'n selspesifieke oppervlakmerker aan magnetiese krale geheg, en die selsuspensie word met hierdie krale geïnkubeer. Sodra die selle wat die geselekteerde oppervlakmerker bevat aan die krale gebind is, word alle ongebonde selle uit die suspensie gewas voordat die seltipe van belang van die krale losgemaak word.

Daarbenewens kan geïsoleerde makrofage verder gekweek en gestimuleer word. Tipies kan M1 makrofage herprogrammeer word na M2 makrofage deur stimulasie en omgekeerd. Kweek van makrofage kan gebruik word vir die stimulering of generering van sellisate of selkultuur-supernatante wat gebruik kan word vir qPCR-toetse, Western blotting, of verskeie immunotoetse (IA), insluitend ELISA's, kraal-gebaseerde IA's soos Invitrogen ProcartaPlex Immunoassays en PCR gebaseerde IA's soos Invitrogen ProQuantum High-Sensitivity Immunoassays vir kwantifisering van verskeie sitokiene. Makrofaagfunksie kan ook ondersoek word deur fagositose-toetse uit te voer [17].

Wanneer makrofage uit volbloed ontleed of verwerk word, is die gewone prosedure om monosiete te isoleer en na makrofage te differensieer. Daarom word PBMC's uit volbloed geïsoleer via digtheid-gradiënt skeiding met behulp van Ficoll Paque. Hierdie metode trek voordeel uit die digtheidsverskille tussen die verskillende seltipes in volbloed. Vervolgens word CD14+ monosiete geïsoleer uit die PBMC-suspensie deur gebruik te maak van óf FACS óf magnetiese kraal-gekonjugeerde teenliggaampies isolasie, bv. met Invitrogen Dynabeads Untouched Human Monocytes Kit (Kat. No. 11350D), Invitrogen Dynabeads CD14), (Cat. No. of Invitrogen Dynabeads FlowComp Human CD14 Kit (Kat. No. 11367D). Nog 'n kostedoeltreffende isolasiemetode is die verbouing van die PBMC-suspensie in weefselkultuurplastiekware, waaraan die monosiete by voorkeur monosietselgetalle heg, neem toe met die gebruik van gelatienbedekte oppervlaktes.

Makrofaag differensiasie in vitro

Daar is 'n verskeidenheid stimulasie/differensiasie tegnieke wat gebruik word om naïewe makrofage of gepolariseerde M1 of M2 makrofage te verkry in vitro. Indien verdere isolasie van monosiete nie nodig is nie, kan geïsoleerde PBMC's direk makrofage produseer deur inkubasie met Gibco RPMI 1640 Medium aangevul met 15% fetale kalfserum (FCS).

Geïsoleerde monosiete kan gedifferensieer word in naïewe makrofage met behulp van spesiale differensiasie media. Gepolariseerde makrofage kan byvoorbeeld uit monosiete geproduseer word deur die groeifaktore GM-CSF en M-CSF te gebruik. Monosiete kan gestimuleer word in RPMI 1640-medium aangevul met 10% FCS en 10ng/ml GM-CSF (Gibco GM-CSF Rekombinante Menslike Proteïen, Kat. No. PHC2013) of 10ng/ml M-CSF (Gibco M-CSF Rekombinante Menslike Proteïen) , Kat.nr. PHC9501) vir 7 dae, wat lei tot die differensiasie van M1- en M2-makrofage, onderskeidelik. Na stimulasie moet die selle aaneengeheg wees met 'n verlengde vorm.

Alternatiewelik kan M1 en M2 gepolariseerde makrofage verkry word deur opeenvolgende stimulasie van monosiete met verskillende sitokiene. Selle wat geoes is met RPMI 1640-medium aangevul met 10% FCS kan daarna vir 24 uur behandel word met 10ng/ml lipopolisakkaried (Invitrogen eBioscience Lipopolysaccharide (LPS) Solution, Kat. No. 00-4976-03) en 50 IFNng/mLng (Gibco IFN-γ Rekombinante Menslike Proteïen, Kat. No. PHC4031) om M1 makrofage te verkry of met 20 ng/mL IL-4 (Gibco IL4 Rekombinante Menslike Proteïen, Kat. No. PHC0041) om M2/M2a makrofage te verkry. Behandeling met immuunkomplekse en IL-1b of LPS lei tot M2b-aktivering, en byvoeging van IL-10, TGF-b of glukokortikoïede lei tot M2c-aktivering [14] [19] [20]. Makrofagetipes kan geïdentifiseer word deur die uitdrukking van sekere merkers op hul oppervlak met behulp van immunohistochemiese kleuring of vloeisitometrie (Tabel 5).

Identifisering en karakterisering van makrofage

Tabel 5 lys merkers wat gebruik kan word vir die identifikasie van makrofage (algemene fenotipe) en vir hul karakterisering (funksionele kenmerke). Die merkerligging (oppervlak of intrasellulêr) het implikasies vir die metodes wat gebruik word om hierdie antigene op te spoor.

Tabel 5. 'n Nie-uitputtende lys van sellulêre merkers. Die gelyste merkers kan gebruik word om menslike en muismakrofage te karakteriseer.

SpesiesMerker tipeMerkerKloonPlek van merker
MensAlgemene fenotipeCD11bICRF44Oppervlakte
CD1461D3Oppervlakte
CD15HI98Oppervlakte
CD16eBioCB16Oppervlakte
CD68eBioY1/82AIntrasellulêr
Funksionele eienskappeEK DOENOogdioIntrasellulêr
CD163eBioGHI/61 of Mac 2-158Oppervlakte
CD20619.2Intrasellulêr
Arginase-1A1exF5Intrasellulêr
CD204 (MSR-1)PSL204Oppervlakte
CD369 (Clec7a, Dectin-1)1500Oppervlakte
GPNMB (Osteoaktivien)HOST5DsOppervlakte
VSIG4JAV4Oppervlakte
MarcoPLK-1Oppervlakte
MerTKHMER5DSOppervlakte
Osteopontin2F10Intrasellulêr
AxlDS7HAXLOppervlakte
VISTAB7H5DS8Oppervlakte
HLA-DRLN3Oppervlakte
MuisAlgemene fenotipeCD11bM1/70Oppervlakte
F4/80BM8Oppervlakte
MerTKDS5MMEROppervlakte
CD68FA-11Intrasellulêr
Funksionele eienskappeAxlMAXL8DSOppervlakte
CD204M204PAOppervlakte
CD369bg1fpjOppervlakte
VISTAMIH64Oppervlakte
CD163TNKUPJOppervlakte
CD206MR6F3Intrasellulêr
GPNMB (Osteoaktivien)CTSREVLOppervlakte
VSIG4 (CRIg)NLA14Oppervlakte
CXCL13DS8CX13Intrasellulêr
EK DOENmIDO-48Intrasellulêr
Nos2 (iNos)CXNFTOppervlakte
Arginase-1A1exF5Intrasellulêr
LYVE-1ALY7Oppervlakte
RELM-aDS8RELMOppervlakte
Ly-6CHK1.4Oppervlakte
Afkortings: CD, groep van differensiasie CXCL13, CXC motief chemokien 13 GPNMB, glikoproteïen nie-metastatiese melanoom proteïen B HLA, menslike leukosiet antigeen IDO, indolamien-2,3-dioksigenase LYVE-1, limfatiese vaartuig endoteliale hyaluronan reseptor 1 NOS, sinnitariseoksied RELMIS -agtige molekule-alfa VSIG4, V-stel en immunoglobuliendomein wat 4 bevat.

Vloeisitometrie—voorbeeld vir die karakterisering van makrofage

Alhoewel die tradisionele M1/M2-model toegepas kan word in vitro gekweekte en gestimuleerde selle om verskillende tipes makrofage-aktivering te beskryf, onthul nuwe insigte in die ingewikkelde netwerk van weefselmakrofage duidelik dat dit nie daarin slaag om die funksionele en fenotipiese diversiteit van hierdie selle voldoende te beskryf nie. in vivo [21] [22]. Daarom beveel ons aan om die simplistiese M1/M2-model te vervang met 'n meer buigsame en omvattende beskrywing van makrofage, gebaseer op die uitdrukking van veelvuldige merkers en funksionele eienskappe. Kanoniese merkers wat gebruik word om die M1- en M2-fenotipes te definieer, speel egter steeds 'n noodsaaklike rol in makrofaagkarakterisering. Hier beskryf ons hierdie tradisionele merkers, insluitend induseerbare stikstofoksied sintase (iNOS, NOS2), arginase-1 (Arg1), mannose reseptor (CD206), RELM-a (FIZZ1), en CD163, vir die karakterisering van makrofage.

INOS en Arginase 1

Twee histories kanoniese merkers van klassieke en alternatiewe aktivering van makrofage (ten minste in muisselle) is onderskeidelik iNOS en Arg1 (Figuur 4). iNOS is 'n ensiem wat die NADPH-afhanklike oksidasie van L-arginien na L-sitrullien en stikstofoksied (NO) kataliseer. Stikstofoksied is 'n belangrike bemiddelaar van sitotoksisiteit en ander fisiologiese funksies (bv. vasorlaksasie). iNOS word nie konstitutief in makrofage uitgedruk nie en die teenwoordigheid daarvan merk betroubaar vorige stimulasie met pro-inflammatoriese sitokiene soos IL-1, TNF-α of IFN-γ.

Die ensiem Arg1 skakel L-arginien om na ureum en L-ornitien. Deur arginien af ​​te breek, ontneem Arg1 iNOS van sy substraat en verlaag stikstofoksiedproduksie. Arg1 word sterk geïnduseer in makrofage deur IL-4 en IL-13, maar nie deur anti-inflammatoriese sitokiene soos IL-10 of TGF-b nie. In teenstelling met iNOS uitdrukking, kan basislyn uitdrukking van Arg1 gevind word in veelvuldige populasies van weefselmakrofage. Byvoorbeeld, die meeste muis groot peritoneale makrofage (F4/80 hi makrofage) is Arg1 positief in die bestendige toestand. Soos getoon in Figuur 4, Arg1 kan selfs opgespoor word in sommige makrofage wat met IFN-γ gestimuleer is. Daarom moet Arg1 nie as 'n heeltemal spesifieke merker van M2-polarisasie beskou word nie, veral wanneer primêre ongekultiveerde selle ontleed word.

Figuur 4. Makrofage gestimuleer met IFN-γ druk hoofsaaklik iNOS uit, met 'n klein subpopulasie wat positief is vir beide iNOS en lae vlakke van Arg1. Makrofage gestimuleer met IL-4 druk Arg1 uit en geen iNOS nie. C57BL/6 muis-beenmurg-afgeleide makrofage is vir 24 uur gepolariseer met óf LPS en IFN-γ (M1) óf IL-4 (M2a), en daarna oppervlak gekleur met Invitrogen F4/80 Monoklonale Antiliggaam (kloon BM8), eFluor 450 (Kat. No. 48-4801-82). Selle is daarna gefikseer en gepermeabiliseer met die Invitrogen eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set (Kat. No. 88-8824-00) gevolg deur intrasellulêre kleuring met Invitrogen iNOS Monoklonale Antiliggaam (kloon CXNFT), APC (Kat. No. 5920. -82) en Invitrogen Arginase 1 Monoklonale Teenliggaam (kloon A1exF5), PE (Kat. No. 12-3697-82). Lewensvatbare F4/80+ selle is vir ontleding gebruik.

Mannose reseptor (CD206)

Die makrofaag mannosereseptor, bekend as CD206 of mannosereseptor C tipe 1 (MRC1), bemiddel fagositiese en endositiese opname van swam-, bakteriële, protosoë- en virale antigene, en speel 'n belangrike rol in die immuunverdediging en die regulering daarvan. Die mannosereseptor was die oorspronklike identifiserende merker van alternatiewelik geaktiveerde makrofage. In teenstelling met Arg1, word CD206 uitgedruk oor 'n breë spektrum van alternatiewelik geaktiveerde makrofage, insluitend tolerogeniese selle wat met IL-10 of glukokortikoïede behandel is. Interessant genoeg is getoon dat TGF-b die uitdrukking van CD206 afreguleer. Ander faktore wat uitdrukking van hierdie reseptor inhibeer sluit in LPS, IFN-γ en TNF-α. Soortgelyk aan Arg1, word CD206 konstitutief uitgedruk deur veelvuldige tipes weefselmakrofage, alhoewel die uitdrukkingspatroon nie heeltemal met dié van Arg1 oorvleuel nie. Die regte paneel in Figuur 5 toon die konstitutiewe uitdrukking van CD206 in klein (F4/80 lo) en groot (F4/80 hi) peritoneale makrofage.

Figuur 5. Aansienlike fraksies van muis klein peritoneale makrofage (F4/80 lo) en groot peritoneale makrofage (F4/80 hi) druk CD206 konstitutief uit. Muis-inwonende peritoneale ekssudaatselle is oppervlakgekleur met Invitrogen F4/80 Monoklonale Antiliggaam (kloon BM8), eFluor 450 (Kat. No. 48-4801-82) gevolg deur fiksasie en permeabilisering met die Invitrogen eBioscience Intrasellulêre Fiksasie & Bufferstel Permeabilisering (Kat. No. 48-4801-82) No. 88-8824-00). Selle is daarna intrasellulêr gekleur met óf Invitrogen Rat IgG2b kappa Isotipe Kontrole (kloon eB149/10H5), APC (Kat. No. 17-4031-82) (linker paneel) of Invitrogen CD206 Monoklonale Teenliggaam (kloon MR6F3), APC (Kat. No. 17-2061-80) (regter paneel). Totale selle is vir ontleding gebruik, die meerderheid dubbel-negatiewe selle is B-selle.

RELM-a (FIZZ1)

RELM-a, ook bekend as resistin-like alfa of FIZZ1, is 'n klein sitokien wat sterk geïnduseer word deur IL-4 en IL-13 en betrokke is by die reaksie teen parasitiese infeksie. Similar to Arg1, RELM-a is not induced by glucocorticoids and IL-10. Despite this, the in vivo expression pattern of these two commonly used markers of M2 activation is very different. For instance, in the absence of stimulation, RELM-a is expressed by a majority of small peritoneal macrophages (F4/80 lo) and few large peritoneal macrophages (F4/80 hi) (Figuur 6).

Figure 6. Most small peritoneal macrophages (F4/80 lo) and very few large peritoneal macrophages (F4/80 hi) spontaneously express RELM-a. C57BL/6 mouse resident peritoneal exudate cells were surface stained with Invitrogen F4/80 Monoclonal Antibody (clone BM8), eFluor 450 (Cat. No. 48-4801-82). The cells were then fixed and permeabilized using the Invitrogen eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set (Cat. No. 88-8824-00), and intracellularly stained with either Invitrogen Rat IgG1 kappa Isotype Control (clone eBRG1), APC (Cat. No. 17-4301-82) (linker paneel) or Invitrogen RELM alpha Monoclonal Antibody (clone DS8RELM), APC (Cat. No. 17-5441-82) (regter paneel). All peritoneal cells were used for analysis the majority of double-negative cells are B cells.

CD163

CD163 is a haptoglobin and hemoglobin receptor. As its main function is to aid the process of iron recycling, the highest expression of CD163 can be observed in splenic red pulp macrophages. CD163 can also detect certain bacterial compounds and is expressed, although to a lower degree, in other subsets of tissue macrophages, including Kupffer cells, intestinal lamina propria macrophages, and a fraction of large peritoneal macrophages (Figuur 7). Unlike human CD163, mouse CD163 is not as readily induced by M2 polarizing cytokines, and it is not a good marker of murine M2 macrophages. Instead, its expression seems indicative of tissue-specific macrophage functions (e.g., hemoglobin recycling).

Figure 7. A significant fraction of the large peritoneal macrophages (F4/80 hi) and virtually no small peritoneal macrophages (F4/80 lo) constitutively express CD163. BALB/c mouse splenocytes were stained with Invitrogen F4/80 Monoclonal Antibody (clone BM8), eFluor 450 (Cat. No. 48-4801-82) and either Invitrogen Rat IgG2a kappa Isotype Control (clone eBR2a), PerCP-eFluor 710 (Cat. No. 46-4321-82) (linker paneel) or Invitrogen CD163 Monoclonal Antibody (clone TNKUPJ), PE (Cat. No. 12-1631-82) (regter paneel). Total cells were used for analysis.