Inligting

Waarom kan oligo-U nie gebruik word om mRNA's te isoleer nie, in plaas van oligo dT?

Waarom kan oligo-U nie gebruik word om mRNA's te isoleer nie, in plaas van oligo dT?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

dTTP-oligonukleotiede word gebruik om mRNA's te isoleer omdat mRNA's (in eukariote) 'n poli A-stert het wat aan die komplementêre oligo-dT bind. Hoekom kan ons egter nie eerder oligo-U (uracil) gebruik nie? Ek sou raai dit is omdat ribonukleotiede die bykomende 2' OH het wat reaktief is, dus minder wenslik, maar is daar enige ander rede?


Sintetiese oligonukleotiede werf ILF2/3 na RNA transkripsies om splitsing te moduleer

Ons beskryf 'n nuwe tegnologie vir die werwing van spesifieke proteïene na RNA deur selektiewe herkenning van heteroduplekse gevorm met chemies gemodifiseerde antisense oligonukleotiede (ASO's). Tipies funksioneer ASO's deur te hibridiseer met hul RNA-teikens en die binding van enkelstring-RNA-bindende proteïene te blokkeer. Onverwags het ons gevind dat ASO's met 2'-deoksie-2'-fluoro (2'-F) nukleotiede, maar nie met ander 2' chemiese modifikasies nie, 'n bykomende eienskap het: hulle vorm heteroduplekse met RNA wat spesifiek deur die interleukien herken word versterker-bindende faktor 2 en 3 kompleks (ILF2/3). 2′-F ASO-gerigte werwing van ILF2/3 na RNA kan ingespan word om geenuitdrukking te beheer deur alternatiewe splitsing van teikentranskripsies te moduleer. ILF2/3-werwing na voorloper-mRNA naby 'n ekson lei tot weglating van die ekson van die volwasse mRNA, beide in selkultuur en in muise. Ons bespreek die moontlikheid om chemies gemanipuleerde ASO's te gebruik wat spesifieke proteïene werf om geenuitdrukking vir terapeutiese intervensie te moduleer.


HERSIEN artikel

  • 1 Sentrum vir Leer en Geheue, Die Universiteit van Texas in Austin, Austin, TX, VSA
  • 2 Instituut vir Sellulêre en Molekulêre Biologie, die Universiteit van Texas in Austin, Austin, TX, VSA
  • 3 Departement Fisiologie en Farmakologie, Wake Forest Health Sciences, Medical Centre Boulevard, Winston-Salem, NC, VSA

In die afgelope dekade het bioinformatiese ontledings van hoë-deurset proteomika en transkriptomika data navorsers in staat gestel om insig te kry in die molekulêre netwerke wat blywende veranderinge in sinaptiese doeltreffendheid kan onderlê. Ontwikkeling en gebruik van hierdie tegnieke het die veld van leer en geheue aansienlik bevorder. Dit is nou moontlik om van die studie van aktiwiteitsafhanklike veranderinge van 'n enkele proteïen te beweeg na die modellering van hele netwerkveranderinge wat plaaslike proteïensintese vereis. Hierdie data-revolusie het die ontwikkeling van alternatiewe berekenings- en statistiese tegnieke genoodsaak om die patrone daarin te ontleed en te verstaan. Die fokus van hierdie oorsig is dus om 'n samevatting van die reis en evolusie na grootdata-tegnieke te gee om nog onbeantwoorde vrae aan te spreek oor hoe sinapse gewysig word om neuronale stroombane te versterk. Ons hersien eers die seminale studies wat die deurslaggewende rol getoon het wat deur plaaslike mRNA-vertaling gespeel word as die meganisme onderliggend aan die verbetering van blywende sinaptiese aktiwiteit. In die belang van diegene wat nuut is in die veld, verskaf ons 'n kort oorsig van molekulêre biologie en biochemiese tegnieke wat gebruik word vir monstervoorbereiding om plaaslik vertaalde proteïene te identifiseer deur gebruik te maak van RNA-volgordebepaling en proteomika, sowel as die berekeningsbenaderings wat gebruik word om hierdie data te ontleed. Alhoewel baie mRNA's geïdentifiseer is, is min getoon dat dit plaaslik gesintetiseer is. Vir hierdie doel hersien ons tegnieke wat tans gebruik word om nuwe proteïensintese te visualiseer, 'n taak wat as die moeilikste aspek van die veld bewys is. Laastens verskaf ons voorbeelde van toekomstige toepassings om die fisiologiese relevansie van plaaslik gesintetiseerde proteïene te toets wat deur grootdata-benaderings geïdentifiseer word.


Resultate

Unieke en gedeelde mRNA-teikens vir HuR en AUF1

Ten einde funksionele skakels tussen RBP's HuR en AUF1 te ondersoek, het ons probeer om versamelings van endogene mRNA's te identifiseer waaraan elke proteïen in menslike servikale karsinoom HeLa-selle geassosieer word. Immunopresipitasie (IP) reaksies is uitgevoer om mRNA subsets gebind aan HuR en AUF1 te isoleer deur gebruik te maak van spesifieke teenliggaampies. Die nie-spesifieke assosiasie van mRNA's met IP-reagense is bepaal deur parallelle inkubasies met IgG1. Die identifikasie van mRNA's in elke IP materiaal is bereik deur omgekeerde transkripsie (RT) gevolg deur cDNA skikking hibridisasie (Tenenbaum et al, 2002 López de Silanes et al, 2004). Verteenwoordigende skikkingsvelde illustreer die relatiewe oorvloed en spesifisiteit van seine van HuR IPs, AUF1 IPs, sowel as beheer IgG1 IPs (Figuur 1A). Soos getoon (Figuur 1B), is 201 HuR-spesifieke teikentranskripsies, 194 AUF1-spesifieke teikentranskripsies en 267 transkripsies wat deur HuR en AUF1 gedeel word op hierdie skikking geïdentifiseer. Die assosiasie van transkripsies met óf HuR óf AUF1 is as spesifiek geag wanneer Z verhoudings was ⩾1.00 in vergelykings van seine in HuR IPs teenoor IgG1 IPs, of seine in AUF1 IPs teenoor IgG1 IPs, onderskeidelik. Sien http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE1361 vir volledige skikking resultate. In elke mRNA-subset is ARE's van óf Klas I óf III gevind in ~80% van die transkripsies wat getoets is.

Die geldigheid van die teiken-mRNA-identifikasieskema is eksperimenteel getoets deur die teenwoordigheid van verskeie ewekansig gekose teikentranskripsies in elke kategorie (unieke HuR-teikens, unieke AUF1-teikens en gedeelde HuR- en AUF1-teikens) te monitor deur IP-toets gevolg deur RT-PCR-amplifikasie ( IP+RT–PCR) deur gebruik te maak van volgorde-spesifieke primers. Soos getoon, is HuR-teikens effektief slegs vanaf HuR IP's versterk, AUF1-teikens slegs vanaf AUF1 IP's, terwyl teikens van beide proteïene uit beide IP-groepe versterk is (Figuur 1C). Tipies het IgG1 IP's onopspoorbare of lae-vlak amplifikasie seine in hierdie PCR-reaksies getoon, uitgevoer teen ~25 siklusse kontrole-mRNA's wat GAPDH en SDHA kodeer, wat nie teikens van enige RBP was nie, het gedien om agtergrondbinding van mRNA's aan die IP-materiaal te monitor. Volgens die Z verhouding afsnypunt van ⩾1.00 gekies vir hierdie analise, transkripsieverrykings is vir verskeie monster mRNA's bereken deur kwantitatiewe intydse RT-PKR: verryking was ~6-voudig vir 'n Z verhouding van 1,00 (bv. TP53 mRNA in AUF1 IP's), ~60-voudig vir 'n Z verhouding van 1,90 (bv. CCND1 mRNA in HuR IP's), en ~1000-voudig vir 'n Z verhouding van 4.13 (bv. PTMA mRNA in HuR IPs) (data nie gewys nie). Hierdie analise het aan die lig gebring dat 42% van AUF1-gebonde mRNA's uniek geassosieer is met AUF1 en nie met HuR nie, terwyl 43% van HuR-gebonde mRNA's uniek geassosieer is met HuR en nie met AUF1 nie. Omgekeerd was 58% van AUF1-teiken-mRNA's ook teikens van HuR, 'n vergelykbare aantal HuR-teikens (57%) is ook teikens van AUF1 gevind, wat 'n uitgebreide en voorheen onherkende versameling mRNA's openbaar wat algemene vermeende teikens van beide proteïene was.

RNA-afhanklike assosiasie van HuR en AUF1

Die ontdekking dat 'n groot deel van HuR-teiken-mRNA's ook teikens van AUF1 was (en omgekeerd) het daartoe gelei dat ons die moontlikheid formeel ondersoek het dat beide HuR en AUF1 gelyktydig aan 'n gegewe RNA-molekule kon bind. Om hierdie hipotese te begin aanspreek, het ons IP-reaksies uitgevoer om die gesamentlike teenwoordigheid van beide proteïene in dieselfde RNP-kompleks vas te stel. Soos getoon in Figuur 2A, het IP-reaksies met behulp van 'n anti-AUF1-teenliggaam oorvloedige hoeveelhede HuR (Ctrl., bo) opgelewer, terwyl 'n wedersydse IP-toets met behulp van 'n anti-HuR-teenliggaam in staat was om AUF1 (Ctrl., middel) op te lewer, alhoewel minder doeltreffend, moontlik as gevolg van 'n afname in AUF1-binding wat veroorsaak word deur die HuR-teenliggaam self, of om ander nog ongeïdentifiseerde redes. 'n Kontrole-teenliggaam (IgG1) kon nie een van die proteïene in die IP-materiaal toon nie. In addisionele kontrolegroepe is IP-reaksies aangevul met heparien, 'n polianion wat op groot skaal as 'n mededinger van RNA gebruik word om komplekse gevorm deur swak elektrostatiese interaksie te dissosieer, en dus moontlik op 'n niespesifieke wyse (Pinol-Roma) et al, 1988). Die teenwoordigheid van heparien (+Heparien) kon nie die assosiasie tussen HuR en AUF1 ontwrig nie, wat die idee ondersteun dat die AUF1-HuR teenwoordigheid in algemene RNP-komplekse spesifiek was. Boonop het 'n kort inkubasie met RNase A (+RNase) veroorsaak dat HuR van AUF1 dissosieer, wat aandui dat HuR en AUF1 waarskynlik geassosieer word deur hul gesamentlike binding aan algemene teiken-RNA's of RNP-komplekse, en nie direkte proteïen-proteïenkomplekse gevorm het nie. Bewyse dat hierdie RNP-interaksies waarskynlik ook in ongeskonde selle is verkry deur óf formaldehied óf bestraling met kortgolflengte ultraviolet lig (UVC) te gebruik, elk wat in staat was om RNP-komplekse in lewende selle te kruisbind. Die ontleding van lysate wat voorberei is na blootstelling van selle aan kruisbindingsmiddels (Figuur 2A, onder) het verder 'n assosiasie tussen HuR en AUF1 in ongeskonde selle ondersteun. Addisionele beheer IP-toetse (Figuur 2B) het aan die lig gebring dat hierdie RNP-komplekse ook ander algemene RBP's insluit wat by RNA-verwerking betrokke is, soos hnRNP A1 en hnRNP C1/C2 (Dreyfuss et al, 1993). Saam het hierdie data die siening ondersteun dat HuR en AUF1 nie deur proteïen-proteïen-interaksies assosieer nie, maar terselfdertyd in algemene RNA-bevattende komplekse kan assosieer.

Duidelike oorvloed van HuR en AUF1 in verskillende sellulêre kompartemente

Die assosiasie van HuR en AUF1 is verder ondersoek in verskillende subsellulêre fraksies wat uit HeLa-selle voorberei is. Soos getoon in Figuur 3A, het HuR en AUF1 omvattend geassosieer met algemene RNP-komplekse in die kern (let op Westerse kladseine in HuR en AUF1 IP-materiale, Nuc. bane). Daarenteen, sitoplasmiese HuR (tipies 5-10% van sellulêre HuR) geassosieer met AUF1 tot 'n baie mindere mate (let op Western blotting seine op HuR en AUF1 IP materiaal in die Cyto. bane). Gevolglik het HuR en AUF1 baie minder geneig gelyk om aan dieselfde RNA's in die sitoplasma te bind as in die kern, wat verdere ondersoek na die subsitoplasmiese verspreiding van die twee proteïene aangespoor het. In ooreenstemming met vroeëre verslae, is gevind dat HuR hoofsaaklik saam met lae- en hoëmolekulêre gewig (LMW en HMW, onderskeidelik) polisoomfraksies, voorberei deur sentrifugering van die sitoplasmiese materiaal deur sukrosegradiënte (Figuur 3B) (Antic en Keene, 1997 Gallouzi et al, 2000). Daarteenoor is gevind dat AUF1 grootliks beperk is tot die fraksies sonder alle ribosomale komponente (ongebonde (Unb.), bane 1 en 2), waar sitosoliese RBP's TTP, TIAR en TIA-1, sowel as β-tubulien, is ook opgespoor. Saam ondersteun hierdie data die siening dat kern AUF1 en HuR assosieer deur hul gesamentlike binding aan gemeenskaplike teiken-RNA's en/of RNP's, maar hierdie assosiasie word in die sitoplasma ontwrig, waar AUF1 in die sitosoliese fraksie en HuR met die polisoomgebonde voorkoms gevind word. breuk.

Binding van HuR en AUF1 aan endogene en sintetiese mRNA's wat vir p21 en siklien D1 kodeer

Om bykomende ondersteuning te verkry vir die gesamentlike RNA-bindende model wat uit hierdie bevindinge voortspruit, het ons gefokus op die ontleding van spesifieke mRNA's wat gedeelde teikens van beide HuR en AUF1 was: die siklien D1 mRNA (CCND1 Figuur 1B Lin) et al, 2000) en die p21 mRNA (Joseph et al, 1998). Die endogene assosiasie van HuR en AUF1 met hierdie twee mRNAs is bewys deur IP-toetse wat anti-HuR en anti-AUF1 teenliggaampies gebruik, gevolg deur meting van p21 en siklien D1 mRNAs deur RT-PCR. Soos aangedui, is gevind dat beide siklien D1 en p21 mRNA's teikens van HuR en AUF1 is, is baie min of geen amplifikasie in die IgG1 IP-bane gesien nie, en kontrole GAPDH mRNA is slegs gevind as lae-vlak kontaminerende materiaal teenwoordig in al die IP reaksies (Figuur 4A). PCR-amplifikasie is uitgevoer na RT-reaksies deur oligo-d(T) te gebruik, wat aandui dat HuR en AUF1 gebind het aan polyadenylated cyclin D1 en p21 mRNAs (Figuur 4A, mRNA). Dit is egter belangrik dat die pre-mRNA-vorme (en moontlik ook uitgesnyde introne) van hierdie transkripsies ook spesifiek deur HuR en AUF1 gebind is, soos blyk uit die amplifikasie van intronvolgordes van beide transkripsies in HuR en AUF1 IP's (in hierdie RT-reaksies, ewekansige heksamere is gebruik in plaas van oligo-d(T)) (Figuur 4A, pre-mRNA). In alle gevalle is monsters verteer met DNase voor RT en 'geen RT' kontrolereaksies is ingesluit om te verseker dat geen genomiese volgordes geamplifiseer is nie (Figuur 4A).

Terwyl die voorgenoemde resultate voorgestel het dat HuR en AUF1 elk in staat was om komplekse te vorm met endogeen p21 en siklien D1 mRNA's, was dit belangrik om te bepaal of die twee proteïene in staat was om aan elke teiken op duidelik, nie-oorvleuelende plekke van dieselfde mRNA's, waardeur, ten minste teoreties, die gesamentlike binding van beide proteïene op elke teiken toegelaat word (soos ons voorstel dat dit in die kern voorkom). Sulke in vitro analise is uitgevoer deur die vermoë van gebiotinileerde transkripsies wat verskeie streke van die p21 en siklien D1 mRNA's insluit, te toets om met endogene HuR of AUF1 te assosieer (Figuur 4B). Hier is komplekse vorming gevisualiseer deur 'aftrek' van die RNP-assosiasies met behulp van streptavidien-bedekte krale en opsporing van RBP's op Western blots. Soos getoon, was verskeie 3' onvertaalde streek (3'UTR) gedeeltelike transkripsies, maar nie koderende streek (CR) transkripsies, in staat om beide HuR en AUF1 af te trek. Belangrik is dat daar gevind is dat binding by veelvuldige diskrete plekke plaasvind: vir die p21 mRNA, HuR verkieslik gebind transkripsie 3'A, proksimaal aan die CR, binne 'n AU-ryke strek (geskakeer), terwyl AUF1 'n voorkeur vir die distale gebied vertoon het ( 3′C). Met betrekking tot die siklien D1 3'UTR, HuR-gebonde fragment 3'C, terwyl AUF1 die proksimale fragment 3'A gebind het, maar nie die AU-ryke stuk nie, soos voorheen gerapporteer (Lin) et al, 2000), en het ook die distale fragment 3'D gebind (Figuur 4B). Die bevinding dat AUF1 en HuR aan dieselfde teiken-RNA's op verskillende, nie-oorvleuelende streke kan bind, ondersteun die idee dat die twee proteïene in beginsel teikentranskripsies gelyktydig kan bind.

Blootstelling aan UVC het opponerende effekte op die post-transkripsionele regulering van p21 en siklien D1

Gegewe die vermoë van p21- en siklien D1-mRNA's om met beide HuR en AUF1 te assosieer, twee RBP's wat teenoorgestelde effekte op die stabiliteit van teikentranskripsies uitoefen, het ons probeer toets of die bestendige-toestandvlakke van die twee mRNA's op dieselfde manier gereguleer is in reaksie op 'n gegewe stimulus. UVC-bestraling het HuR–p21 mRNA assosiasies in die sitoplasma verhoog, en het gevolglik p21 mRNA stabiliteit en oorvloed in kolonkankerselle verhoog (Wang et al, 2000a). In HeLa-selle het UVC-bestraling (15 J/m 2 ) ook p21-mRNA-vlakke geïnduseer, en siklien D1-mRNA-vlakke onderdruk (Figuur 5A). Net so het UVC HuR sitoplasmiese oorvloed verhoog, maar die sitoplasmiese assosiasie van HuR met AUF1 het nie proporsioneel toegeneem nie (Figuur 5B). Interessant genoeg is die binding van HuR en AUF1 aan teiken-mRNA's in teenoorgestelde rigtings beïnvloed deur UVC-bestraling, soos bepaal deur IP+RT-(intydse) PCR-toetse: na UVC, het HuR-p21-mRNA-assosiasies toegeneem en HuR-siklien D1-mRNA assosiasies het afgeneem, terwyl AUF1-p21 mRNA-assosiasies verminder is en AUF1-cyclin D1 mRNA-komplekse merkbaar verhoog is (Figuur 5C).

UVC-behandeling het die polisoominhoud van die sel verminder, maar dit het eintlik veroorsaak dat HuR sy teenwoordigheid in die polisoomgebonde materiaal verhoog het (Figuur 5D). Daarenteen het AUF1 feitlik uitsluitlik gelokaliseer in breuke 1 en 2 gebly, waar ander sitosoliese komponente geïdentifiseer is, insluitend die eksosoomproteïen hRrp4p. Northern blotting het bevestig dat p21 mRNA oorvloed toegeneem het in LMW en HMW fraksies na UVC, terwyl siklien D1 mRNA vlakke oor die algemeen laer was (Figuur 5E). Eksperimentele bewyse vir UVC-geaktiveerde veranderinge in die samestelling van HuR–RNA-komplekse is verkry deur IP+RT–(intydse) PKR-analise van saamgevoegde polisoomfraksies 6–10. Na UVC-behandeling is gevind dat HuR–p21 mRNA-komplekse ~4 keer meer volop in die polisomale fraksies was, terwyl HuR–cyclin D1 mRNA-komplekse ~3.5 keer minder volop was (Figuur 5F). Toetsing van die ongebonde fraksies (1 en 2) deur IP+RT–(intydse)PCR met behulp van anti-HuR-teenliggaampies kon nie p21- of siklien D1-produkte versterk nie, waarskynlik as gevolg van die lae oorvloed van HuR in hierdie fraksies (Figuur 5F) . Alhoewel ons nie die moontlikheid kan uitsluit dat AUF1-RNA assosiasies deur die fraksioneringsproses ontwrig is nie, is geen AUF1-gebonde RNA's gevind in die polisoomfraksies (Figuur 5F), waar AUF1 basies onopspoorbaar was (Figuur 5D), of in die ongebonde materiaal (Figuur 5D). breuke 1 en 2, Figuur 5F), waar AUF1 na bewering met die eksosoom assosieer, is sulke interaksie gekoppel aan 'n vinnige verval van AUF1-gebonde mRNA's (Laroia et al, 1999 Chen et al, 2001), en kan ons onvermoë om gebonde mRNA's te versterk verklaar.

SiRNA-gemedieerde vermindering van HuR- of AUF1-vlakke verander p21- en siklien D1-uitdrukking

Ten einde die relatiewe invloed van HuR op die uitdrukking van p21 en siklien D1 te bepaal, is 'n RNA-interferensie (RNAi)-gebaseerde benadering bedink. Teen 3 dae na transfektasie van HeLa-selle met behulp van 'n HuR-gerigte siRNA (HuR siRNA), is HuR-oorvloed verminder tot ~20% van die vlakke in die kontrole siRNA-getransfekteerde groep (C, Figuur 6A). Kulture wat verminderde HuR uitdruk, het merkbaar laer p21 en siklien D1 uitdrukkingsvlakke getoon as beheer siRNA-getransfekteerde selle, soos opgespoor deur beide Westerse en Noordelike klad (Figuur 6A en B). Soos in Figuur 6C getoon, was die verlaagde p21- en siklien D1-mRNA-bestendige-toestandvlakke, ten minste gedeeltelik, te wyte aan die laer stabiliteit van elke mRNA in selle met verminderde HuR-uitdrukking, soos bepaal met behulp van aktinomisien D-gebaseerde mRNA-halfleeftyd metings. Toe die kontrole- en HuR siRNA-behandelingsgroepe vergelyk is, het p21 mRNA halfleeftyd van ~4.6 tot 2.7 uur afgeneem, siklien D1 mRNA onderskeidelik van ~8 tot 3.3 uur (Figuur 6C) daarenteen, die stabiliteit van die langlewende GAPDH mRNA (inset) was >18 h in alle transfeksiegroepe. Hierdie resultate onderstreep die stabiliserende invloed van HuR op teiken-mRNA's, insluitend dié wat vir p21 en siklien D1 kodeer. Interessant genoeg, in lysate verkry van HuR siRNA-getransfekteerde selle, AUF1 prominent geassosieer met die p21 3'A transkripsie en die cyclin D1 3'C transkripsie (Figuur 6D), twee plekke wat verkieslik deur HuR gebind is in kontrole lysate (Figuur 4B) , wat daarop dui dat HuR en AUF1 kan meeding vir binding aan hierdie webwerwe.

Om die effek van AUF1 op die uitdrukking van p21 en siklien D1 te bestudeer, het ons 'n RNAi-benadering gebruik wat gebaseer is op die gebruik van 'n plasmied wat siRNA uitdruk wat 'n gebied wat algemeen is vir al vier AUF1-isovorme (Aanvullende materiaal) geteiken het.Op 3 dae na transfeksie, was AUF1 uitdrukking verminder tot ~25% van die vlakke gesien in kontroleselle (C, Figuur 7A). Selle wat verminderde AUF1-oorvloed vertoon het merkbaar verhoogde vlakke van p21- en siklien D1-proteïene (Figuur 7A) en mRNA's (Figuur 7B) getoon. Weereens, die stabiliteit van die twee transkripsies is ook sterk beïnvloed deur AUF1-oorvloed: wanneer die C-groep met die AUF1 siRNA-groep vergelyk word, het p21 mRNA-halfleeftyd van ~2.0 tot 4.4 uur toegeneem, terwyl siklien D1 mRNA-halfleeftyd van ~/ 4 uur tot >8 uur onderskeidelik (Figuur 7C) verskille in die halfleeftye van C populasies (Figure 6C en 7C) was waarskynlik as gevolg van die verskillende transfeksie reagense wat gebruik is. Die stabiliteit van die langlewende GAPDH mRNA (Figuur 7C, inlas) was ook >18 uur in alle transfeksiegroepe. Hierdie waarnemings ondersteun die algemene siening dat AUF1 teiken-mRNA-verval versnel. Verder, in lysate verkry van AUF1 siRNA-getransfekteerde selle, kan HuR prominent die p21 3'C transkripsie en die cyclin D1 3'A transkripsie bind (Figuur 7D), twee plekke wat verkieslik deur AUF1 in kontrole lysate gebind is (Figuur 4B) , wat verdere ondersteuning verleen aan die idee dat HuR en AUF1 ook kan meeding vir binding aan teikenreekse.

Gebaseer op die resultate wat in hierdie ondersoek verkry is, stel ons 'n model voor waarvolgens HuR en AUF1 gesamentlik sowel as individueel aan algemene teiken-mRNA's kan bind en hul post-transkripsionele lot kan beïnvloed (Figuur 8 en Bespreking).


Genetiese manipulasie van model-organismes en gekweekte selle het vir dekades belangrike insigte verskaf in die meganismes onderliggend aan kardiovaskulêre ontwikkeling en siekte. In die afgelope paar jaar het die ontwikkeling van verskeie nukleasestelsels die reeks model-/selstelsels wat gemanipuleer kan word, verbreed. Hiervan het die CRISPR (gegroepeerde gereeld afgewisselde kort palindromiese herhalings)/Cas9 (CRISPR-geassosieerde proteïen 9)-stelsel die gunsteling geword vir die maklike toepassing daarvan. Hier sal ons hierdie RNA-geleide nukleasestelsel vir geenredigering hersien met betrekking tot die bruikbaarheid daarvan vir kardiovaskulêre studies en met die oog op potensiële terapie. Studies oor sy buite-teikenaktiwiteit, tesame met benaderings om hierdie aktiwiteit te minimaliseer, sal gegee word. Die voordele van geenredigering versus geen-teikening in embrioniese stamselle, insluitend die breedte van spesies en seltipes waarop dit van toepassing is, sal bespreek word. Ons sal ook die gebruik daarvan in iPSC dek vir navorsing en moontlike terapeutiese doeleindes en ons sal die gebruik daarvan in spierdistrofiestudies hersien waar aansienlike vordering gemaak is in die rigting van distrofienkorreksie in muise. Die CRISPR/Ca9s-stelsel word ook gebruik vir hoë-deurset-sifting van gene, geenregulerende streke en lang nie-koderende RNA's. Daarbenewens word die CRISPR-stelsel gebruik vir nie-geenredigeringsdoeleindes soos aktivering en inhibisie van geenuitdrukking, sowel as vir fluoressensie-merking van chromosomale streke en individuele mRNA's om hul sellulêre ligging na te spoor. Laastens sal 'n benadering om die onvermoë van post-mitotiese selle om homoloë rekombinasie-gebaseerde geenredigering te ondersteun te omseil, aangebied word. Ten slotte, toepassings van die CRISPR/Cas-stelsel brei teen 'n asemrowende pas uit en 'n rewolusie van benaderings om 'n beter begrip van menslike siektes te verkry.

Baie van die dryfkrag agter diegene op die gebied van genetiese ingenieurswese oor die afgelope paar dekades was om ons begrip van normale en siekteprosesse te verbeter en sodoende die ontwerp van nuwe diagnostiese en behandelingsprosedures moontlik te maak. Sommige van daardie dryfkrag was ook die droom dat verskeie van sy tegnieke uiteindelik op geenterapie van toepassing kan wees. Die vordering van die veld van transgenese na geen-teikening, na embrioniese stamselle (ESC's), na geïnduseerde pluripotente stamselle (iPSC), en onlangs tot geenredigering het geweldig bygedra om sommige van daardie hoop te vervul, en in sommige gebiede, die droom van geenterapie kan tot stand kom.

Oor die afgelope 25 tot 30 jaar het transgenese deur pronukleêre DNA-inspuiting, en ESC-gebaseerde geen-teikening deur blastosist-inspuiting, 'n prominente rol in die kardiovaskulêre veld gespeel. Ewekansige inkorporering van weefselspesifieke promotorgedrewe transgene het die effekte van ooruitdrukking en van ektopiese uitdrukking van baie normale en mutante gene bepaal. Gene-geteikende mutasies het die funksies van gene, hul funksionele domeine en die meganismes onderliggend aan die disfunksie van hul siekte-allele bepaal. Voorwaardelike en induseerbare geenmodifikasie op weefselspesifieke en tydelike wyse het ons in staat gestel om dodelikhede te omseil wat voortspruit uit geenverlies in organe/weefsels wat nie ondersoek word nie of van geenverlies in 'n ontwikkelingstadium voor die stadium wat ondersoek word, en om die verwarrende effekte te vermy. van geenverlies in ander organe en weefsels wat interaksie het met die orgaan/weefsel van belang. Die ontwikkeling en gebruik van hierdie tegnologieë in die kardiovaskulêre veld is voorheen hersien en sal nie hier uitgebrei word nie. 1–4

Geenredigering deur gebruik te maak van ontwerpernukleases soos sinkvingernukleases (ZFNs), TAL effektor nukleases (TALENs), en Cas9 (CRISPR-geassosieerde proteïen 9) RNA-geleide nuklease (of CRISPR [gegroepeer gereeld afgewissel kort palindromiese herhalings]/Cas9) is 'n rewolusie van genetiese ingenieurswese in vitro en in vivo. CRISPR/Cas9 is nou die ontwerpernuklease van keuse omdat dit nie die vervaardiging van teikenspesifieke proteïene behels nie en slegs die aanpassing van 'n kort area van die enkelgids-RNA (sgRNA) vereis om dit teikenspesifiek te maak. Dit is minstens so doeltreffend soos die ander metodes en is minder sitotoksies. Ons sal dus hoofsaaklik fokus op die toepassings van CRISPR/Cas9 op die kardiovaskulêre veld, behalwe wanneer dit belangrike inligting na die bespreking bring. ZFN- en TALEN-tegnologieë is voorheen hier hersien 4 en elders. 5–8

CRISPR/Cas9, sowel as die ander ontwerpernukleases, funksioneer op 'n soortgelyke wyse. Elkeen het die vermoë om 'n dubbelstreng-DNS-breek (DSB) op 'n presiese genomiese ligging te veroorsaak, wat deur 1 van 2 meganismes herstel kan word. Nie-homologe eindverbinding (NHEJ), wat lei tot klein invoegings of skrappings (indels) as daar geen homoloë sjabloon vir direkte herstel is nie, en homologiegerigte herstel (HDR) as 'n homoloë sjabloon teenwoordig is. 9,10 Hierdie tegnologie word gebruik om genoom-geredigeerde sellyne te genereer vir navorsing, dwelmtoetsing en potensiële terapeutiese doeleindes, en vir genoom-geredigeerde plante en diere vir verbeterde voedselproduksie. Dit word ook in genoom-geredigeerde diere gebruik vir basiese navorsing, siektemodellering, prekliniese dwelmtoetsing en verbeterde oorplantingshulpbronne. In hierdie oorsig sal ons eers 'n inleiding gee tot die CRISPR/Cas9-benadering tot geenredigering, die voordele daarvan bo geen-teikening deur homoloë rekombinasie, en die gebruik daarvan in menslike geïnduseerde pluripotente stamselle (hiPSC) en die mutasielading wat daardie selle verkry. Omdat baie navorsingsaktiwiteit geenterapie vir pasiënte met spierdistrofiepasiënte verwag, sal 'n afdeling gewy word aan die bespreking van daardie studies in groter detail. Ons sal eindig met afdelings oor ontwikkelings in die veld om CRISPR/Cas9-spesifisiteit te verbeter, die toepassings van CRISPR/Cas9 uit te brei en om sommige van die bekommernisse wat met CRISPR/Cas9 verband hou, aan te spreek.

CRISPR/Cas9

Die CRISPR tipe II-stelsel word in bakterieë en archaea aangetref om te funksioneer as 'n RNA-gebaseerde bakteriese aanpasbare immuunstelsel. Die belangstelling in CRISPR is dat 'n enkele proteïen, die Cas9, komplekse met 2 kort RNA-volgordes om as 'n plek-spesifieke endonuklease te dien. Een van die RNA's huisves 'n kort homologiegebied (≈20 bp) wat 'n CRISPR RNA (crRNA) genoem word, wat die kompleks na 'n spesifieke genetiese lokus lei. Die crRNA-basispare met 'n transaktiverende crRNA (tracrRNA) wat haarnaaldlusse bevat. Saam vorm die crRNA en tracrRNA 'n RNA-struktuur wat Cas9 na die splitsingskompleks lok as daar ook 'n protospacer adjacent motif (PAM) volgorde in die teiken DNA naby die komplementêre gebied is. 11–13 PAM's is baie kort reekse wat spesifiek is vir Cas9s van verskillende spesies. Die mees gebruikte Cas9 is van Streptococcus pyogenes (SpCas9) en het NGG vir sy PAM-volgorde. 'n Saadstreek wat uit 'n minimum van 13 basisse bestaan, is geleë aan die 5'-punt van die PAM-volgorde waar die crRNA en teiken-DNS-paring plaasvind. Hierdie streek is baie belangrik vir doeltreffende dubbelstring-klowing, aangesien wanpassings in die saadstreek Cas9-gemedieerde splitsing van die teiken-DNS voorkom. Om spesifisiteit en doeltreffendheid te verhoog, is hierdie dubbel-tracrRNA:crRNA-kompleks gemanipuleer in 'n chimeriese sgRNA wat al die eienskappe van die natuurlike basisparingsinteraksie tussen crRNA en tracrRNA het. 14

Dubbel-strand breek herstel paaie

Die DSB's wat deur die sgRNA-Cas9-kompleks veroorsaak word, kan op 2 maniere herstel word. Met geen homologie-sjabloon vir direkte herstel, vind NHEJ plaas. Dit lei tot kort invoegings of delesies by die splitsingsplek (indels). Dit sal dikwels raamverskuiwingsmutasies genereer wat lei tot vroeë beëindiging van proteïentranslasie, transkripsieafbreking en proteïenverlies. 15,16 Indien, inteendeel, 'n homoloë sjabloon by die herstelplek teenwoordig is, sal HDR voorkom. Die sjabloon wat HDR rig kan 'n enkelstring DNA (ssDNA) oligonukleotied of 'n dsDNA plasmied wees. In 'n sel waarby sjabloon gevoeg is, as die sgRNA–Cas9-kompleks na die teiken gelei word, maar die sjabloon nie 'n heterodupleks op daardie terrein gevorm het nie, sal NHEJ voorkom. Die CRISPR/Cas9-stelsel word in Figuur 1 geïllustreer.

Figuur 1. Cas9 RNA-geleide nuklease sisteem. Skematiese voorstelling van die Streptococcus pyogenes Cas9 nuklease (groen) geteiken op genomiese DNA deur 'n enkelgids-RNA (sgRNA) wat bestaan ​​uit 'n ≈20-nt gidsvolgorde (blou) en 'n steier (rooi). Die gidsvolgorde is direk stroomop van die protospacer aangrensende motief (PAM), NGG (oranje sirkels). Cas9 bemiddel 'n dubbelstring DNA-breek (DSB) ≈3 bp stroomop van die PAM (rooi driehoeke). Die breuk word herstel deur 1 van 2 meganismes: nie-homologe eindverbinding (NHEJ) wat ewekansige invoegings of skrappings by die teikenplek of homologiegerigte herstel (HDR) skep. Twee tipes sjabloon kan vir HDR gebruik word: klein enkelstring-DNS (ssDNA) oligonukleotiedskenker met kort 60-70-bp homologie-arms en 'n lineêre of sirkelvormige dsDNA-plasmied met lang homologie-arms van 1 tot 3 kb.

Benaderings om CRISPR/Cas9-reagense te lewer

Die afleweringsmetodes vir Cas9 en sgRNAs kan uiteenlopend wees. Hulle kan ingebring word as mRNA's of as DNA's wat deur 'n plasmied of virale vektore uitgedruk word. Cas9 kan ook as 'n rekombinante proteïen in embrio's ingespuit word. Een studie het embrio's of gekotransfekteerde ESC direk saamgespuit met 3 sirkelvormige plasmied-DNA's wat sgRNA-, Cas9- en merkergene uitdruk, 'n benadering wat die in vitro-transkripsiestap vir die generering van die RNA's omseil het. 17 Nog 'n benadering is om CRISPR/Cas9-reagense in sigote te elektroporeer. 18,19 Hierdie afleweringsmetode sal die behoefte aan sigootmikro-inspuiting uitskakel, en dus slegs konstruksie van die CRISPR/Cas9-reagense en embrio-oordrag van die geëlektroporeerde sigote vereis. Die mees algemene afleweringstelsels vir postnatale organismes en menslike selle is nie-integrerende adeno-geassosieerde virus (AAV) en integrase-tekort lentivirus vektore. AAV het verminderde immunogenisiteit alhoewel ≈50% van die menslike bevolking neutraliserende teenliggaampies teen AAV-kapsied het. 20 AAV het ook die voordeel dat dit 'n reeks serotipes het wat weefseltropisme, soos spiere, bevat. 21–23 Die uitdaging met AAV's is egter hul lae verpakkingskapasiteit (≈ 4.5 kb), wat die konstruksie van aparte AAV-vektore vereis om Cas9, sgRNA(s) en 'n homoloë sjabloon te akkommodeer as HDR die verlangde herstelroete is. Ran et al 24,25 het 'n nuwe strategie ontwikkel wat ontwerp is om hierdie nadele te oorkom deur die veel kleiner Staphylococcus aureus Cas9 (3.2 kb), wat splitsingsaktiwiteit in soogdierselle het met soortgelyke doeltreffendheid as SpCas9 (4.2 kb), en soortgelyke vlakke van buite-teiken-effekte. 24,25 Vandaar, S aureus Cas9 en sgRNAs kan in 1 AAV vektor gelaai word. Ander in vivo roetes van aflewering van CRISPR/Cas9 reagense sluit in retro-orbitale, intraperitoneale en binneaarse inspuitings vir sistemiese aflewering en direkte inspuiting in die teikenweefsel. Die in vivo afleweringstelsels sal in meer besonderhede in die afdeling oor geenredigering vir spierdistrofie bespreek word.

'n Beduidende deel van die opgewondenheid oor ontwerpernuklease-benaderings is die vooruitsig om baie van die behoefte aan geen-teikening in muis-ESC uit te skakel wat die heilige graal van plekspesifieke genetiese ingenieurswese vir >25 jaar is. Oor die afgelope 3 jaar is 'n groot aantal muisstamme gegenereer deur Cas9 saam met óf een óf veelvuldige sgRNA's direk in muisembrio's in te spuit om 'n DSB naby die plek van komplementariteit met die sgRNA te genereer. Die CRISPR/Cas9-benadering wat NHEJ-herstel gebruik, is suksesvol gebruik, teen 80% tot 90% van die muise wat gebore is, om verlies aan funksiemutasies te genereer. 26,27 Hierdie merkwaardige hoë vlak van doeltreffendheid maak voorsiening vir die vermenigvuldiging van geen uitklophoue in 'n enkele eksperiment. 27

Die NHEJ-weg is ook gebruik vir 'n groot genomiese fragment delesie waarin 'n hele geen (Dip2a) van ≈65 kb is met 21% doeltreffendheid verwyder deur 2 sgRNA's in te voer, een aan elke kant van die verlangde verwydering (Figuur 2A). 17 Dieselfde groep het HDR gebruik om 5 kb verslaggewergene in te voeg deur 'n enkele sgRNA in te spuit met 'n plasmied wat die verslaggewergene bevat, geflankeer deur homoloë arms van ≈700 bp, wat lyk soos konvensionele geen-teikenvektore (Figuur 2B). 'n Ander groep het 'n 1-mb-streek geskrap deur 4 sgRNA's (2 aan elke kant van die delesie om DSB-doeltreffendheid te verhoog) plus 'n ssDNA-oligonukleotied wat oor die homoloë streke aan beide kante van die delesie strek, geskrap (Figuur 2C). 28 Vir die bekendstelling van enkelnukleotied polimorfismes (SNP's) of klein Merkers, word skenker-DNA gewoonlik bekendgestel as ssDNA wat die SNP of Merker dra omring deur 2 kort 60- tot 70-bp homoloë arms vir herstelsjablone (Figuur 2D). Invoegings van groter Merkers sal groter homologie-arms vereis wat as dsDNA in plasmiede ingebring word soos in Figuur 2B getoon. Die invoegingsdoeltreffendheid van plasmied-gemedieerde HDR met dsDNA is baie laer as met ssDNA. 15,29,30 As gevolg hiervan sal dit nuttig wees om die grootte van gesintetiseerde ssDNA met hoë getrouheid te vergroot vanaf sy huidige limiet van ≈200 tot 300 bp. Dit kan gedoen word deur RNA te genereer vanaf 'n DNA-sjabloon met in vitro transkripsie, gevolg deur omgekeerde transkriptase polimerase kettingreaksie. 30 Hierdie benadering het 'n 434-bp ssDNA met homologie-arms van 55 bp gegenereer wat 'n 83% algehele invoegingsdoeltreffendheid met >50% in beide allele opgelewer het. Aangesien in vitro transkripsie reaksies ssDNA tot 4- tot 5-kb lank kan produseer, toon hierdie metode potensiaal om die toepaslikheid van die meer doeltreffende ssDNA-gebaseerde HDR uit te brei.

Figuur 2. Groot delesies, merker invoegings en enkel-nukleotied polimorfisme (SNP) invoegings. A, Veelvuldige eksons kan geskrap word deur nie-homologe eindverbinding (NHEJ) deur enkelgids-RNA's (sgRNA's) te ontwerp wat die streek flankeer wat geskrap moet word. In die teenwoordigheid van Cas9 sal dubbelstreng-DNS-breuke (DSB's) plaasvind wat lei tot klein indels op die plek van eindverbinding. Die dubbelbalk by die sgRNA:geen-hibridisasieplek verteenwoordig die DSB wat deur Cas9 veroorsaak word. Cas9 kan as of mRNA of rekombinante proteïen bekendgestel word. B, Merkergeen-invoeging kan bereik word deur homologie-gerigte herstel (HDR) waarin die homoloë streke in 'n plasmied ingebring word soos gedoen sou word deur geen-teikening. C, 'n Chromosomale streek-uitwissing is gedoen met behulp van HDR waarin 2 sgRNA's ontwerp is aan elke kant van die streek wat geskrap moet word. Die homologie sjabloon was 'n enkelstreng DNA (ssDNA) oligo met homologie aan elke kant van die streek wat geskrap moes word. D, SNP invoeging met behulp van HDR met ssDNA oligo as homologie sjabloon.

Vermindering van teikeneffekte van CRISPR/Cas9

Die buite-teiken-effekte van CRISPR/Cas9-geenredigering spruit uit die vermoë van Cas9 om 'n heterodupleks tussen die sgRNA en 'n PAM-aangrensende teiken-DNS te kloof waar die aantal, posisie en tipe wanpassings DSB op-teiken en buite-teiken beïnvloed aktiwiteite. 31–33 Die mate van buite-teikenaktiwiteit is kommerwekkend, veral vir toekomstige terapeutiese toepassings, en is hanteerbaar in modelorganismes waar hulle uitgeskei kan word as hulle op die nieteikenchromosoom is. Benaderings om potensiële buite-teiken-effekte te verminder, begin met streng seleksie van sgRNA's. Empiriese ontleding stel die volgende kriteria voor vir die keuse van sgRNA's met die minste potensiaal vir buite-teiken-aktiwiteit daar moet (1) geen PAM-volgorde by die buite-teiken-plek wees nie, (2) ten minste 3 wanpassings, (3) ten minste 2 wanpassings binne die PAM proksimale gebied, en (4) 'n spasiëring van <4 bp tussen die wanpassings. 31 Daar is verskeie webwerwe soos CRISPR-MIT (http://crispr.mit.edu/), E-CRISPR (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/), en CRISPOR-TEFOR ( http://crispor.tefor.net/) wat die ondersoeker help om die beste sgRNA's vir die projek te kies. Een baie nuttige webwerf verskaf inligting oor die sgRNA-spesifisiteite van die verskillende webwerwe: http://www.clontech.com/US/Products/Genome_Editing/CRISPR_Cas9/Resources/Online_tools_for_guide_RNA_design. Daar is ook verskeie maatskappye waar sgRNA's gekoop kan word, soos http://www.sigmaaldrich.com/, http://www.clontech.com/, http://www.genscript.com/, https:// www.idtdna.com/, en http://www.thermofisher.com. Dit is egter nie noodwendig die geval dat hierdie rekenaarprogramme alle potensiële buite-teikenterreine sal identifiseer nie. Byvoorbeeld, in 'n ontleding van CRISPR/Cas9-aktiwiteit in 2 menslike sellyne, 'n benadering genaamd GUIDE-Seq (Genome-wye onbevooroordeelde identifikasie van DSB's wat deur volgordebepaling geaktiveer word), wat 'n gemodifiseerde oligonukleotied gebruik wat CRISPR/Cas9-gegenereerde DSB's sal merk. , het baie terreine met DSB's geïdentifiseer wat nie onder die voorspelde buite-teikenterreine was nie. 34 Gevolglik, vir geenredigering wat vir terapeutiese gebruik bedoel is, sal in-diepte volgordebepaling nodig wees om buite-teikenaktiwiteit te identifiseer in die geval van hiPSC en die aktiwiteit daarvan te skat in die geval van direkte aflewering. Sistematiese ondersoeke van buite-teikenaktiwiteit in hiPSC sal in 'n latere afdeling bespreek word.

Nog 'n benadering om buite-teiken-effekte te verminder, is om 'n gewysigde Cas9 te gebruik wat een string van die teiken-DNS knip. Gepaarde sgRNA's wat op dieselfde plek knip, maar op teenoorgestelde DNA-stringe lei tot 'n DSB. Geen breek vind plaas sonder dat die spesifisiteit van elke sgRNA in die spel kom nie (Figuur 3).Met hierdie stelsel is getoon dat DSB'e voorkom met 50- tot 1500-voudige verlaagde buite-teikenaktiwiteit, afhangende van die sellyn wat gebruik word. Die nickase is egter nie so doeltreffend soos die wilde-tipe Cas9 nie, so verdere modifikasie is nodig. 35 Slaymaker et al 36 het verbeterde spesifisiteit Cas9-variante ontwerp wat nie-teiken-effekte verminder het nie. Struktuurgeleide ontwerp is gebruik om te bepaal dat positiewe lading neutralisasie in die groef van die nie-komplementêre string buite-teiken aktiwiteit kan verminder. 'n Ander groep het gevind dat die gebruik van 'n korter, 17 bp, gidsvolgorde nie-teikenaktiwiteit kan verminder. 34 'n Verhoogde aantal beskikbare PAM's sal meer sgRNA-opsies bied wat 'n beter kans bied om diegene met minder potensiaal vir buite-teikenaktiwiteit te identifiseer. Byvoorbeeld, die beskikbaarheid van spesie-spesifieke Cas9s, elk met sy eie unieke PAM-volgorde, sal alternatiewe PAMs verskaf. 24 SpCas9-modifikasies het ook Cas9-molekules met verskillende PAM-spesifisiteite gegenereer. 37 Saam sal hierdie fokus op die verbetering van CRISPR/Cas9-spesifisiteit waarskynlik nuwe instrumente oplewer om buite-teikenaktiwiteite te verminder.

Figuur 3. Gemodifiseerde Cas9 met nickase-aktiwiteit om buite-teikenaktiwiteit te verminder. Twee Cas9's, elk met nickase-aktiwiteit (geel Cas9-enkelbalk vir elke Cas9 dui op nickase- eerder as dubbelstring DNA-breek [DSB]-aktiwiteit) is naby geleë op teenoorgestelde stringe met enkelgids-RNA's (sgRNA's) sodat hulle saam 'n enkele DSB. 'n Enkelstrengs DNA (ssDNA) oligo homologie sjabloon word gebruik vir homologie-gerigte herstel (HDR).

Voordele van genoomredigering bo geneteikening

Die aantrekkingskrag van CRISPR/Cas9-gebaseerde geenredigering is die gemak van voorbereiding, doeltreffendheid en wydverspreide toepassing daarvan. Die moeite en tyd wat nodig is om 'n geen-geredigeerde muis te genereer is baie minder as met geen-teikening deur ESC. Die CRISPR/Cas9-reagense word, gewoonlik deur inspuiting, direk in sigote afgelewer, waardeur die uitgebreide kweek, seleksie en sifting van geëlektroporeerde ESC uitgeskakel word. Met betrekking tot die wydverspreide toepassing daarvan, het geen-teikening in ESC slegs prakties bewys in muise, met beperkte sukses in ander spesies of in gekweekte somatiese selle. Die onvermoë om gene in somatiese selle of in diere te redigeer wat meer geskik sou wees vir die modellering van menslike kardiovaskulêre siektes, was 'n groot nadeel van geen-teikening in ESC. Inteendeel, CRISPR/Cas9-gebaseerde geenredigering blyk van toepassing te wees op 'n wye reeks dierspesies en 'n wye reeks gekweekte selle.

In Vitro Voordele van CRISPR/Cas9

Geen-redigering word nou toegepas op 'n verskeidenheid seltipes wat nie toeganklik was deur geen-teikening nie, insluitend menslike sellyne. 26,32,38 Die meeste van die geenredigeringswerk in die kardiovaskulêre area word met hESC en hiPSC gedoen. Die gebruik van CRISPR/Cas9 in hierdie selle en hul gedifferensieerde afgeleides sal in 'n latere afdeling aangespreek word. 'n Sleutelbeperking wat met menslike selle werk, is hul voorkeur om die NHEJ-pad te gebruik om DSB's te herstel eerder as deur homologie. 39,40 In geenredigering is herstel deur NHEJ nuttig vir funksieverliesgebeurtenisse, maar in die meeste kliniese behandelingsinstellings is 'n herstel van endogene geenfunksie nodig, wat HDR sal vereis. In 'n poging om hierdie probleem te omseil, het Chu et al 41 gevind dat inhibisie van KU70 en DNA-ligase 'n 5-voudige toename in HDR veroorsaak, en uitdrukking van adenovirus 4-proteïene wat ubiquitinate en DNA-ligase afbreek, verhoog HDR 8-voudig. Yu et al 42 het 'n skerm vir klein molekules uitgevoer wat die balans na homologie-gebaseerde herstel kan verskuif. Hulle het 'n molekule geïdentifiseer wat CRISPR-gemedieerde HR-doeltreffendheid 3-voudig kan verbeter vir groot fragment-invoegings en 9-voudig vir die bekendstelling van puntmutasies deur HDR.

In Vivo Voordele van CRISPR/Cas9

Die voordele van geenredigering in vivo is merkwaardig. Eerstens omseil geenredigering die teiken, seleksie, sifting en uitbreiding van ESC en vereis gewoonlik een muisgenerasie minder om te identifiseer, sodat die tyd van generering van 'n geen-geredigeerde muis die helfte van die tyd is as met geen-teikening. Tweedens, die mutasies wat in ESC kan ophoop tydens selkultuur is nie teenwoordig in geen-geredigeerde muise nie alhoewel buite-teiken mutasies ook met geen redigering voorkom. Derdens, met geenredigering, kan SNP's maklik in die genoom ingebring word. Met ESC is dit moeilik om SNP's in 'n muisgeen in te voer sonder enige oorblywende volgordes, soos loxP-plekke. Om dit te doen, vereis dit tandem geen-teikening en is selde aangemeld in geen-geteikende muise. 43,44 Die vermoë om CRISPR/Cas9 te gebruik om SNP's skoon in te voer, sal 'n groot vooruitgang wees vir nie net die modellering van siekte-SNP's nie, maar ook studies van transkripsionele regulatoriese elemente. 45 Vierdens was geenredigering suksesvol in verskeie dierspesies, groot en klein. Alhoewel afleiding van ESC vir verskeie ander spesies behalwe muis gerapporteer is, soos rot, 46,47 hamster, 48 konyne, 49,50 varke, 51 skape, 51 en beeste, is 52 geen redigering slegs in rot ESC, 47 aangemeld. en kiemlynoordrag is nog nooit aangemeld nie. Alhoewel HDR in somatiese selle gevolg deur somatiese selkernoordrag 'n alternatiewe benadering tot ESC is en suksesvol gebruik is om transgeniese skape 53 en uitklopvarke te maak, is 54,55 dit nie algemeen gebruik nie omdat HDR in somatiese selle ondoeltreffend is as gevolg van beperkte selgroei en lae homoloë rekombinasiefrekwensie.

Suksesvolle geenredigering is in 'n wye reeks spesies gedemonstreer, van sebravisse en muise tot nie-menslike primate. 27,56-58 Met betrekking tot hartontwikkeling en siekte by sebravis, het studies links-regs-asimmetrie, 59,60 caveolien in hartherlewing, 61 hartstam-migrasie, 62 en Wnt/β-Catenin-sein in hartontwikkeling betrek. 63 Vergelykings van geenredigering en morfolino-afsakkings in sebravisse dui daarop dat geenredigering minder nie-spesifieke fenotipes tot gevolg het as wat morfolino-afslag veroorsaak. 64,65 Geen-geredigeerde lamprei, karp, 66,67 en hoenders 68 is ook aangemeld. In rotte was voorbeelde van geenredigering om 'n serebrale iskemie/herperfusiebesering-reddingsmodel te produseer, 69 'n Duchenne-spierdistrofie (DMD)-model, 70 en 'n ossifikasie van Achilles-tendonmodel. 71 Elektroporasie van pronukleêre stadium rotembrio's 72 en transfeksie van rotspermatogoniale stamselle gevolg deur testesoorplanting 73 is ook gebruik om geen-geredigeerde nageslag in rotte te genereer. Dit is opmerklik dat laasgenoemde benadering mosaïek omseil in die stigtergenerasie van geen-geredigeerde nageslag. Voorbeelde by konyne sluit in 'n miostatien-uitklop om meer spiere vir voedselproduksie te produseer 74 en 'n ApoE-uitklopmodel van dieet-geïnduseerde aterosklerose. 75 Geen redigering word ook in beeste en skape gebruik. 76 Byvoorbeeld, 'n bees-β-laktoglobulien-uitklop-stam is gemaak om melkallergieë by mense te voorkom, 77 en 'n bees-miostatien-uitklop-stam met hipertrofiese spiere is gemaak vir verbeterde vleisproduksie. 78 Die gebruik van geenredigering by plaasdiere vir verbeterde voedselproduksie is hersien. 79 Omdat die kardiovaskulêre en lipiedmetabolismestelsel van varke soortgelyk is aan mense, maak geenredigering moontlikhede oop waaroor gedroom is, maar wat nog nooit tot stand gekom het deur gebruik te maak van vark-ESC of somatiese selkernoordrag nie. Byvoorbeeld, 'n vark von Willebrand-faktor-uitklop is ontwerp om meer bloedverwydering van slag te vergemaklik om vleisverwerking te verbeter. 80 Geen-redigerende varkstamme word ook gemaak om immuunverdraagsaamheid vir xeno-oorplanting van varkweefsels soos hartkleppe te verbeter. 81,82 Verder is somatiese selkernoordrag van geen-geredigeerde somatiese selle 'n benadering wat goed werk in varke. 83,84 Gene-geredigeerde skape en bokke is ook gemaak, 76,83,85 eersgenoemde is meer gepas as muis vir lugwegontwikkeling en funksie. 86 Ten slotte, met betrekking tot ontwikkeling, genetika en die brein, sal die aap die geskikste wees vir modellering. 58,87 Samevattend, geenredigeringstegnologie brei duidelik genetiese ingenieurswese uit vir navorsings- of siektemodelleringsdoeleindes na baie spesies wat baie meer geskik is vir menslike siektes, soos primate in die algemeen, skape vir pulmonale studies, of konyn en vark vir kardiovaskulêre studies.

Gene redigering in hiPSC

'n Groot vooruitgang in stamseltegnologie was die ontwikkeling van hiPSC, wat deur Hockemeyer en Jaenisch hersien is. 40 Hierdie is ontwikkel uit volwasse menslike dermale fibroblaste deur retrovirale transduksie van 4 transkripsiefaktorgene (Klf4, Sox2, 4 Okt, en c-Myc [KSOM]), om sodoende die etiese bekommernisse met die gebruik van menslike ESC te omseil. 88,89 Met die oog op potensiële terapeutiese gebruik van hiPSC, is retrovirale transduksie sedertdien vervang met KSOM-proteïen of sintetiese gemodifiseerde mRNA-transfeksie of nie-integrerende virale of episomale vektortransduksie. 90–93 hiPSC is sedertdien gevestig uit nie net menslike dermale fibroblaste nie, maar ook urine. 94 Die pluripotente aard van hiPSC is oorspronklik deur Takahashi et al 88 gedemonstreer deur karakterisering van verskeie gedifferensieerde seltipes, insluitend kardiomiosiete. Daar is getoon dat opeenvolgende behandeling van hESC met aktivien A en BMP4 (beenmorfogenetiese proteïen-4) differensiasie na kardiomiosiete verbeter, 95 en dit het sedertdien die basis geword vir verskeie benaderings tot die generering van hiPSC kardiomiosiete (hiPSC-CM). Al die voordele wat met isogeniese hiPSC-CM-selle sou kom, sowel as hul nadele, soos fenotipiese veranderlikheid, ongeorganiseerde sarkomeerstruktuur en klein grootte is hersien. 96–100 'n Onlangse studie waarin selkultuurtoestande selle met volwasse grootte en meer georganiseerde sarkomeerstruktuur geproduseer het, het bevind dat die selle steeds fetale kontraktiele eienskappe het. 101 Met die veronderstelling dat toestande vir die opwekking van hiPSC-CM wat voldoende is vir menslike terapie gevind kan word en as aanvaar word dat die selle funksioneel in die hart kan integreer, kan geenredigering dan die weg lei tot korrektiewe terapieë.

Geen redigering is die eerste keer toegepas op hiPSC met behulp van ZFNs, 102–104 'n ontwerper nuklease benadering wat nou vervang is deur CRISPR/Cas9 as gevolg van die gemak van gebruik en die gebrek aan sitotoksiese effekte. CRISPR/Cas9 eerste geredigeer hiPSC met 'n doeltreffendheid van 2% tot 4%, 32 en 'n vergelyking van TALEN met CRISPR/Cas9 geen redigering in hiPSC het 'n 2- tot 3 keer hoër doeltreffendheid van redigering met CRISPR/Cas9 gedemonstreer. 105 In die kardiovaskulêre veld is geenredigering in hiPSC hoofsaaklik gebruik vir studies oor spierdistrofie, wat hieronder in detail bespreek sal word. Geenredigering met behulp van ZFN in hiPSC-selle is gebruik om lang-QT-sindroom te modelleer vir daaropvolgende geneesmiddelstudies. 106 Met betrekking tot kardiovaskulêre studies wat CRISPR/Cas9 gebruik, het 1 groep getoets of daar 'n funksionele verband is tussen 'n miokardiale infarksie-geassosieerde introniese SNP in die fosfatase- en aktienreguleerder PHACTR1-geen, en die binding van miosietversterkerfaktor-2 aan daardie terrein. Die miosiet versterker faktor-2 bindingsplek is verwyder in hESC met behulp van CRISPR/Cas9-NHEJ. Met differensiasie na endoteel selle, is PHACTR1 uitdrukking met 35% verminder, waardeur die regulerende rol van die miosiet versterker faktor-2 bindingsplek op PHACTR1 uitdrukking in menslike endoteel selle vasgestel is. 107 'n Studie waarin die veilige hawe AAV-integrasie-plek 1 lokus in hiPSC geteiken is, het verskeie enkelnukleotiedvariante (SNV's) in die geen-geredigeerde sellyne gevind. Nie een van hulle was egter in die 3665 potensiële buite-teikenstreke nie, en geen individuele SNV is gevind in >1 van die selle wat geanaliseer is nie, wat daarop dui dat die SNVs agtergrondmutasie-akkumulasie verteenwoordig het, waarskynlik van selkultuur. 108 In 'n studie wat ontwerp is om buite-teikenaktiwiteit te meet, is 10 CRISPR/Cas9-geredigeerde hiPSC- en hESC-klone heel-genoom-volgorde. Nie een van die indels wat geïdentifiseer is, was binne óf 100 bp van enige van die voorspelde buite-teiken plekke óf 100 bp van enige genomiese PAM-volgorde aangrensend aan 10 bp van die protospacer-volgorde nie. 109 Ten slotte, geen redigering van die X-gekoppelde Tafazzin (TAZ) geen wat met die Barth-sindroom en ander kardiovaskulêre afwykings geassosieer word, het 'n lae vlak van buite-teikenaktiwiteit deur heelgenoomvolgordebepaling geopenbaar indien >2-bp wanpassing sgRNA's gebruik is, wat daarop dui dat volgorde-analise van individuele klone klone met geen aktiwiteit doeltreffend kan identifiseer nie in voorspelde buite-teiken-webwerwe. Daar is egter gewaarsku dat sommige menslike SNV's onderhewig kan wees aan buite-teikenaktiwiteite sodat dit ook nagegaan moet word. 110

In ander gebiede het 'n aanvanklike studie wat die gebruik van CRISPR/Cas9 op vel-afgeleide hiPSC vir sistiese fibrose geenterapie verwag het, 'n voetspoorvrye benadering gebruik om die mees algemene ΔF508 mutasie reg te stel wat die gebrekkige verwerking van sistiese fibrose transmembraanreguleerder veroorsaak. Eerstens het hulle die geteiken CFRT geen om 'n vektor bekend te stel wat seleksiekassette ingesluit het wat met herkenningsplekke vir die piggyBac transposase saam met homologie-arms met die gekorrigeerde CFRT volgorde. Nadat hulle vir suksesvolle integrasie geselekteer het, het hulle die seleksiekasset naatloos uitgesny deur die piggyBac-transposase uit te druk, wat geen ander oorblyfsels as die verlangde regstelling van ΔF508 gelaat het nie. 111 Die selle het sistiese fibrose transmembraanreguleerderaktiwiteit getoon na differensiasie na longselle. 'n Groot bekommernis was die aantal klein nukleotiedpolimorfismes wat in die geredigeerde hiPSC gevind is, waarvan baie moontlik plaasgevind het tydens die uitgebreide selkultuur wat nodig is om die hiPSC te wysig, te kies en uit te brei. Hierdie seleksiebenadering, met behulp van die piggyBac-transposase, verteenwoordig 'n naatlose manier om gekweekte selle wat geredigeer word te selekteer, en sodoende die aantal gange en opgehoopte mutasies wat normaalweg deur 'n siftingsproses sou plaasvind, te verminder.

Mutasiefrekwensie in hESC en hiPSC

Gedifferensieerde hiPSC wat vir terapeutiese gebruik is, moet 'n lae mutasielading hê. Verskeie studies het die frekwensie van SNV-mutasies in hESC en hiPSC ondersoek. Een het 'n sistematiese ontleding van verskeie iPSC-klone uitgevoer deur heelgenoomvolgordebepaling en honderde SNV's gevind, met 'n gemiddeld van 11 in koderende streke. In 2 van 3 eksperimente was alle SNV'e uniek aan elke kloon, terwyl alle klone in die derde eksperiment ≈157 SNV'e gehad het wat algemeen was. Daarom het die meeste van hierdie mutasies vooraf in 'n klein aantal skenkerselle bestaan ​​voor herprogrammering. 112 Nog 'n studie het die genetiese en epigenetiese profiele van somatiese selkernoordrag-hESC- en hiPSC-lyne vanaf dieselfde bron van voorhuidfibroblaste vergelyk en soortgelyke profiele gevind, wat soortgelyke herprogrammering voorstel. Die de novo mutasies gevind in die sellyne van beide benaderings was egter gemiddeld ≈8 in getal, maar was nie algemeen nie. 113 'n Derde studie het 22 hiPSC-lyne vanaf dieselfde bron gegenereer deur 5 verskillende herprogrammeringsmetodes te gebruik. Heeleksoomvolgordebepaling het 'n gemiddeld van 6 proteïenkoderende mutasies per eksoom gevind, waarvan ongeveer die helfte teen lae frekwensie in die fibroblastbronselle teenwoordig was en die ander helfte tydens of na herprogrammering plaasgevind het. 114 Laastens, 'n heel-eksoom volgordebepalingstudie op voorhuid fibroblast-afgeleide hiPSC het 'n gemiddeld van 12 SNV'e per lyn gevind, waarvan 74% tydens herprogrammering plaasgevind het en die meeste van die res as gevolg van 6 postherprogrammeringspassasies van die selle. 115 Met betrekking tot chromosomale en subchromosomale integriteit alhoewel hESC en hiPSC redelik stabiel is in vergelyking met somatiese selle, is daar ook getoon dat langdurige deurgang van hiPSC onstabiliteit ophoop. 116–119 Saam dui hierdie studies daarop dat gegewe die huidige stand van tegnologie, die herprogrammering van hiPSC en die selkultuur wat benodig sou word vir CRISPR/Cas9-redigering gevolg deur herdifferensiasie van die geredigeerde selle 'n beduidende, maar meetbare mutasielading tot gevolg sou hê. . Deeglike sifting van geredigeerde hiPSC-lyne kan lyne identifiseer waarvan die mutasieprofiel as onbelangrik vir die beoogde terapie beskou sal word.

Gene redigering vir spierdistrofie

Verbeterde behandelings vir spierdistrofie het die hartsiektelas van ouer spierdistrofiepasiënte verhoog, hoofsaaklik van ventrikulêre tagikardie en hartversaking. 120 Dit is dus gepas om geenredigeringstudies oor spierdistrofie te hersien. Ook, geen redigering studies vir spierdistrofie is so gevorderd as wat hulle is vir enige ander siekte area. Voordat ontwerper-nuklease-tegnologie in gebruik geneem is, was daar verskeie virale en nie-virale-gemedieerde benaderings wat gebruik is om die erns van spierdistrofie simptome te verminder. Dit het minidistrofien-transgene ingesluit wat AAV's gebruik, plasmiedaflewering, en nonsens-kodonherstel of ekson-oorslaan deur gebruik te maak van oligonukleotiede. 121 122 Kliniese proewe met ekson-oorslaan deur gebruik te maak van gemodifiseerde oligonukleotiede is geïnisieer, en geen beduidende nadelige immuunrespons op die veelvuldige distrofienprodukte wat deur geneties gemodifiseerde distrofiene gegenereer word, is gevind nie. 123,124 In die finale analise het hierdie kliniese proewe egter tot dusver teleurstellend geblyk. 125 126

DMD het redelik unieke eienskappe wat vatbaar is vir geen redigering gebaseer op NHEJ herstel na ontwerper nuklease-gemedieerde DSB's. NHEJ-herstel is baie meer doeltreffend as HDR-gebaseerde herstel en sal dus daartoe lei dat meer spierselle geredigeer word. Daar word beraam dat ekson-oorslaan 'n mate van distrofienfunksie vir 83% van DMD-mutasies kan herstel omdat baie van sy eksons 'n veelvoud van 3 basisse bevat, en die erns van simptome van pasiënte waarin mutasies die oorslaan van sommige van hierdie eksons veroorsaak kan aansienlik verminder word. 127 Laastens is daar getoon dat so min as 5% van normale distrofienproteïenuitdrukking waarneembare verligting in die spierdistrofie (mdx) muismodel. 128 129

Hierdie kenmerke het gelei tot verskeie studies wat ontwerper-nuklease-benaderings toegepas het om distrofienmutasies te wysig op maniere wat genoeg funksie sou herstel dat indien toegepas op spierdistrofiepasiënte 'n mate van simptomatiese verligting sou bied. In 1 studie is DMD pasiënt primêre fibroblaste en onsterflike mioblaste met 'n uitwissing van eksons 48 tot 50 geen geredigeer met behulp van TALEN om indels in ekson 51 te plaas in afwagting dat sommige van die indels die leesraam sal herstel. Wanneer herprogrammeer of gedifferensieer in miotubes, is distrofien uitdrukking verbeter. 130 Nog 'n studie het ZFN gebruik op onsterflike mioblaste van 'n DMD-pasiënt met eksons 48 tot 50 wat uitgevee is om 'n splitsingsaanvaarderplek in ekson 51 te sny, en sodoende 'n splitsing van 47 tot 52 veroorsaak wat die leesraam herstel.Die bewerkte selle wat in immuungebrekkige muise ingespuit is, het miobuise geproduseer met beduidende herstel van distrofienfunksie, 131 alhoewel daar sitotoksisiteit was wat algemeen is vir die gebruik van ZFN. 132 In studies wat CRISPR/Cas9 gebruik het, het menslike onsterflike mioblaste van 'n DMD-pasiënt met eksons 48 tot 50 geskrap die oorblywende flankerende eksons 45 tot 55 verwyder met behulp van NHEJ-herstel met sgRNA's wat die flankerende eksons gerig het. Selle is geïdentifiseer wat die leesraam herstel het, en daar was geen betekenisvolle sitotoksisiteit nie. 133 Ten slotte, hiPSC van 'n pasiënt met DMD het die distrofien-geen gekorrigeer deur knockin van die ontbrekende ekson, raamverskuiwing of ekson-oorslaan met TALEN en CRISPR, wat albei ewe goed gewerk het. In daardie studie is geen verhoogde off-teiken mutasietempo bespeur bo die agtergrondtempo van die gekweekte selle nie. 134 Hierdie studies demonstreer 'n verskeidenheid benaderings wat HDR- en NHEJ-herstel gebruik om mutante distrofiengene te wysig om 'n mate van funksie terug te bring.

In die mdx muismodel met 'n afkappingsmutasie in ekson 23, CRISPR/Cas9-HDR is gebruik om die mutasie reg te stel deur inspuiting in sigote vanaf die model met 'n benadering soortgelyk aan dié wat in Figuur 2A getoon word. Distrofien-uitdrukking is in die mosaïek-nageslag opgespoor, wat bewys dat CRISPR/Cas9 gebruik kan word om 'n mate van menslike distrofienfunksie in muise te herstel. 135 In verskeie mdx muisstudies, CRISPR/Cas9-NHEJ-herstel is gebruik om ekson 23-oorslaan te veroorsaak of om samesmelting van eksons te veroorsaak wat 'n uitwissing flankeer om die leesraam te herstel. Xu et al 136 het eksons 21 tot 23 verwyder deur sgRNAs vir introne 20 en 23 te gebruik deur óf elektroporasie van die flexor digitorum longus spier óf AAV inspuiting in die gastrocnemius spier van postnatale muise met die CRISPR/Cas9 komponente. Tien dae later, afgekap mdx geïdentifiseer is. Osmotiese skok-geïnduseerde onbeheerde kalsiumvonke is verminder, en daar was geen betekenisvolle sitotoksisiteit nie. Geen buite-teikenontledings is gedoen nie. Iyombe-Engembe et al 137 gebruik die mdx muis met 'n menslike DMD-transgeen wat 'n delesie van eksons 51 tot 53 bevat om te bepaal of CRISPR/Cas9 gebruik kan word om 'n baster-ekson 50 tot 54 te skep wat leesraam kan herstel. Wanneer SpCas9 en sgRNAs in die tibialis anterior spier geëlektroporeer is, is waarneembare vlakke van die hibriede ekson 50/54 gevind. Vier-en-sestig persent van gekloonde amplikone van die geteikende streek het die baster-ekson bevat. In 'n ander studie het Tabebordbar et al 138 een AAV9 verpak, wat skelet- en hartspiertropisme het, met die kort S aureus Cas9, en 'n ander met intron 22 en 24 sgRNA's. Dit is saamgespuit in die tibialis anterior spier van mdx muise. Vier weke later is gevind dat die ekson 23 eksisietempo 39% was, eksentriese kontraksiebesering was minder, verhoogde distrofienproteïen is opgespoor en daar was 'n 50% toename in kraggenerering. Drie weke na intraperitoneale inspuiting is 3% tot 18% van wildtipe vlakke van ekson 23 uitdrukking in hart- en skeletspier opgespoor, afhangende van die spiertipe, en soortgelyke resultate is 6 weke na binneaarse inspuiting verkry. 'n Klein aantal treffers wat nie teiken is nie, is opgespoor. Nelson et al 25 ook direk ingespuit in die tibialis anterior spier van mdx muise met 'n dubbele AAV8-stelsel (het ook skelet- en hartspiertropisme) met die kleiner S aureus Cas9 en sgRNAs om ekson 23 te verwyder. Op 8 weke, 2% van mdx allele het ekson 23 verwyder, distrofienproteïen was 8% van wildtipe, en 67% van miofibers het waarneembare distrofienproteïen gehad. Spesifieke ruk- en tetaniese kragte is verbeter, eksentrieke kontraksiebesering is verswak, en spierhipertrofie en inflammasie is ook verminder. Geen van die voorspelde buite-teikenterreine is geraak nie. Net so het Long et al 139 'n dubbele AAV9-stelsel gelaai met SpCas9 en sgRNAs vir die verwydering van ekson 23. Dit is óf binnespiers ingespuit in die tibialis anterior by P12, RO by P18, óf intraperitoneaal by P1. Alle afleweringsroetes het gelei tot teikenweefsels met waarneembare verwydering van ekson 23 na 3 tot 8 weke, en in alle gevalle het distrofien proteïenvlakke, sowel as % miofibers met distrofienkleuring, met verloop van tyd toegeneem. Funksionele toetse het ook met verloop van tyd verbetering getoon. Met die RO en intraperitoneale inspuitings is spierplekke ver van die inspuitplek op soortgelyke wyse aangetas, maar die bloed-breinversperring is nie oorgesteek nie. Gelukkig is die kiemlyn van die behandelde muise nie aangetas nie.

Hierdie studies (opgesom in die tabel) is bemoedigend vir toekomstige kliniese toepassing. Almal toon dat NHEJ gebruik kan word om 'n beduidende vlak van distrofienfunksie te herwin. Bekendstelling van AAV-vektore beide plaaslik (binnespiers) en sistemies (intraperitoneaal, binneaars en RO) was almal suksesvol in die redigering van die teikenspiere met doeltreffendheid wat klinies betekenisvol kan wees, 25,138,139 en daar was geen waarneembare redigering in die brein of kiemlyn nie. 139 Buite-teiken-terreinontledings het gevind dat min tot geen vlakke van die voorspelde buite-teikenterreine geraak word nie, alhoewel daar geen beheerde ontledings was met behulp van diep volgordebepaling nie. Ook bemoedigend was die bewyse dat die geenredigering distrofienfunksie verbeter het met verloop van tyd, moontlik omdat die omset van kardiomiosiete en skeletmiofibers kan afneem wanneer distrofienfunksie verbeter. Met een uitsondering, 138 was daar min bewyse dat geen-geredigeerde skeletspier-satellietselle die oorsaak is van verhoogde funksie oor tyd. 'n Groot voordeel van NHEJ-herstel, in teenstelling met HDR, is dat dit in post-mitotiese selle kan voorkom, wat lei tot 'n groter aantal teikenselle. Dit sou egter daarop dui dat oor baie langer tydperke as wat in hierdie studies ondersoek is, die verbetering in funksie kan verswak. Ten slotte, alhoewel 'n voordeel van AAV bo adenovirus is dat dit aanvanklik slegs 'n ligte immuunrespons by sommige mense kon ontlok, sou daaropvolgende behandelings nie moontlik wees sonder immuunonderdrukking nie. Vir besprekings van immuunreaksies op AAV, sien die volgende resensies. 20 140

Tafel. Herstel van dystrofienfunksie met generedigering

AAV dui op adeno-geassosieerde virus hDMD, menslike Duchenne spierdistrofie HDR, homologie-gerigte herstel hiPSC, menslike geïnduseerde pluripotente stamsel IM, intramuskulêre IP, intraperitoneale NHEJ, nie-homologe eindverbinding RO, retro-orbitale TALEN, transkripsie-aktivator-agtige effektor-nuklease ZFN, sink-vinger nuklease.

Vooruitsigte vir CRISPR in post-mitotiese selle

'n Groot nadeel van geenredigering is die gebrek aan HDR-masjinerie in post-mitotiese selle. 10 Dit is van besondere belang vir terapeutiese redigeringsbenaderings in skelet- en hartspiere, sowel as in neurone. CRISPR/Cas9 is van toepassing op spierdistrofie omdat ekson-oorslaan, wat NHEJ vereis na DSB's wat eksons flankeer waarvan die verwydering die leesraam sal handhaaf, beperkte maar beduidende distrofienfunksie kan herstel. Daar sal ander genetiese afwykings wees waarvoor dit ook die geval is, maar dit sal beperk wees. Herstel, of funksionele verbetering, van die meeste genetiese afwykings sal nie bereik kan word deur ekson-oorslaan nie. Die enigste benadering om die probleem te omseil, was om stam- of stamselle te isoleer, uit te brei en te redigeer wat direk in die weefsel ingebring of in volwasse selle gedifferensieer kan word en dan in die weefsel ingeënt kan word. Skeletspier het satellietselle wat geïsoleer kan word en gekweekte hartspier het ook 'n klein aantal kardiale stamvaderselle wat tot op hede beperkte potensiaal het vir herlewingstudies 141 en hiPSC's kan geredigeer en dan herprogrammeer word vir inplanting. Tot op datum is daar egter geen benaderings vir die gebruik van CRISPR/Cas9-gebaseerde HDR in vivo op weefsels waarin byna alle selle post-mitoties is nie.

'n Nuwe benadering met behulp van CRISPR/Cas9 wat nuttig kan wees, behels NHEJ-bemiddelde geteikende integrasie. Dit maak staat op DSB-herstel waarin 'n ekstra stel stomp punte gemaak word op 'n oligonukleotied of groter dsDNA-string, gegenereer deur dieselfde sgRNA wat die invoegplek in die teikengeen herken, sodat die ekstra fragment deur NHEJ-herstel ingevoeg word. Dit is vir die eerste keer getoon dat dit effektief is vir geen-knockin in sebravis 142 en is onlangs gebruik vir knockins in post-mitotiese selle in kultuur, sowel as in vivo in 'n rotmodel van retinitis pigmentosa waarin 'n ekson geskrap is. 143 Laasgenoemde studie verwys na die benadering as homologie-onafhanklike geteikende integrasie (Figuur 4). Homologie-onafhanklike geteikende integrasie bied uitbreiding van CRISPR/Cas9 in post-mitotiese selle in volwasse diere, en met verbetering in doeltreffendheid het dit potensiaal om terapeutiese benaderings verder uit te brei as ekson-oorslaan. Enige geneherstel wat deur invoeging deur NHEJ bewerkstellig kan word, sou moontlik wees.

Figuur 4. Geen redigering in post-mitotiese selle. 'n Stelsel wat homologie-onafhanklike, geteikende integrasie gebruik, is ontwikkel vir die maak van 'n paar spesifieke geen-geredigeerde modifikasies in post-mitotiese selle deur gebruik te maak van nie-homologous end joining (NHEJ) herstel. A, NHEJ-gemedieerde geenverandering in post-mitotiese selle gebruik 'n enkelgids-RNA (sgRNA) wat Cas9-dubbelstring-DNS-breuk (DSB)-aktiwiteit bring na beide 'n spesifieke plek in die genoom en na streke in 'n vektor wat 'n GFP flankeer (groen fluoresserende proteïen) merkergeen. Na DSB's in die genoom en vektor, word die fragment wat die uitgesnyde vektorfragment bevat by die plek van die DSB in die genoom ingevoeg deur NHEJ. B, sgRNA's wat beide 'n mutante ekson in die genoom en 'n korrektiewe ekson in 'n vektor flankeer, sal beide eksons uitsny. NHEJ kan genomiese herstel tot gevolg hê waarin die gekorrigeerde ekson in die geen ingevoeg word.

Al die eksperimente in hierdie studie het 'n invoeging by 'n enkele plek in die teikengeen behels (Figuur 4A). As hierdie benadering verder uitgebrei kan word sodat 'n mutante ekson geskrap kan word deur die bekendstelling van 2 sgRNA's wat die ekson flankeer en vervang kan word deur 'n sgRNA-gemedieerde stomp-einde fragment wat die wilde-tipe ekson bevat (Figuur 4B), dan is die meeste SNP-gebaseerde genetiese afwykings sal ook vatbaar wees vir CRISPR/Cas9 herstel in post-mitotiese selle.

Voorwaardelike en induseerbare CRISPR/Cas9-stelsels

Die bekendstelling van voorwaardelike en induseerbare geen-teiken in muise was 'n groot deurbraak vir die veldmuis genetiese ingenieurswese. Voorwaardelike en induseerbare stelsels word nou ontwikkel vir die CRISPR/Cas9-stelsel. Op die kardiovaskulêre gebied het Olson se groep 'n myh6/Cas9 transgeniese muis met uitdrukking slegs in die hart. Intraperitoneale inspuiting van 'n AAV9-uitdrukkende sgRNA wat die myh6 geen gedemonstreer spesifieke kardioredigering van die geen wat lei tot hartversaking in 3 weke. Die stelsel kan ook gewysig word met 'n induseerbare promotor wat die Cas9-uitdrukking aandryf, wat tydelike beheer oor die induksie 144 moontlik maak (kommentaar deur 145). Hierdie benadering is ook ontwikkel vir neurone, immuunselle en endoteelselle. 146 'n Variasie op hierdie benadering is gebruik om sistemiese Cas9-uitdrukking in sigote te verkry deur gebruik te maak van 'n sigootuitdrukkende Cas9-transgeniese muis sodat Cas9 reeds in die sigoot uitgedruk sal word wanneer sgRNA's ingespuit word, en sodoende die behoefte om Cas9-boodskap of proteïen in te spuit met die sgRNA(s). Nageslag sonder die transgeen sou die geredigeerde gene hê, maar geen Cas9-uitdrukking nie, wat enige langtermyn-toksisiteitseffekte van die Cas9-nuklease uitskakel. 147

Induseerbare CRISPR/Cas9-benaderings word ook ontwikkel deur gebruik te maak van gesplete Cas9-stelsels waarin die 2 Cas9-komponente slegs bymekaar kom tydens behandeling met die induserende middel. Rapamisiengedrewe 148 en tamoksifengedrewe 149 heterodimerisasie van die 2 Cas9 komponente is aangemeld. Gesplete Cas9-stelsels wat geïnduseer kan word deur hierdie en ander reagense soos ligte en chemiese reagense is hersien. 150 Hierdie benadering elimineer die behoefte aan genetiese kombinasie van 'n induseerbare-gereed teiken alleel met 'n bykomende induksie alleel soos 'n induseerbare Cre rekombinase.

Hoë-deurset-skerms wat CRISPR/Cas9 gebruik

Hoë deursetskerms is uitgevoer deur biblioteke van sgRNA's te produseer vir teëlwerk met kort tussenposes in die streke van belang. Voorbeelde word gegee vir genetiese uitklopskerms, skerms vir niekoderende RNA's en skerms om regulatoriese streke van gene te identifiseer.

Hoë-deurset genetiese uitklopskerms

Hoë-deurset genetiese uitklopskerms met behulp van NHEJ herstel van CRISPR/Cas9-gemedieerde DSB's het sgRNA lentivirale biblioteke gebruik wat veelvuldige sgRNA's (3-10 vir elke geen) bevat vir die vroeë koderende streke van honderde tot duisende gene. Die Cas9-geen kan deur die selle uitgedruk word deur vorige transfeksie of deur die lentivirale vektore. Een van die voordele van die lentivirale vektor is dat dit stabiele sgRNA-uitdrukking bied oor uitgebreide selkultuur, en sodoende die redigeringsdoeltreffendheid verbeter (Figuur 5A). In 'n vroeë bewys van beginselstudie is verskeie skerms uitgevoer, wat almal daartoe gelei het dat die verwagte gene geïdentifiseer is. 'n Skerm van >70 000 sgRNAs vir >7000 gene vir 6-tioguanienweerstand het die 4 komponente van die wanpasherstelweg geïdentifiseer: MSH2, MSH6, MLH1, en PMS2. Die studie het biallele inaktivering van diploïede gene gedemonstreer wat dit meer robuust maak as RNAi-afbreek, dit het spesifieke volgordemotiewe geïdentifiseer wat met sgRNA-doeltreffendheid geassosieer word, en dit het min inmenging van buite-teikenaktiwiteit gevind. 151 Ander vroeë studies het skerms behels om gene te identifiseer waarvan die verlies weerstand bied teen vemurafenib, 'n inhibeerder van onkogene BRAF, 152 gene wat noodsaaklik is vir die dronkenskap van selle deur miltsiekte en witseerkeel toksiene, 153 gene wat weerstand verleen teen Clostridium septicum α-toksien, 154 gene betrokke by groei en metastase, 155 en gene betrokke by B-sel differensiasie. 156

Figuur 5. Hoë deurset skerms. A, Hoë-deurset geen uitklop-skerms waarin 'n lentivirale enkelgids RNA (sgRNA) biblioteek vir veelvuldige plekke in die vroeë koderende gebied van duisende gene lei tot selklone waarin elke enkele geen uitgeslaan word deur nie-homologe end-verbinding herstel waarin indels voorkom. Verskeie klone sal elke geen verteenwoordig. 'n Skerm vir 'n spesifieke fenotipiese uitkoms, soos middelweerstandigheid of veranderde groei, sal gene wat by daardie prosesse betrokke is, identifiseer. B, Hoë-deurset-skerm vir lang nie-koderende RNA's (lncRNA's). 'n Lentivirale biblioteek van gepaarde sgRNA's, waarvan elke paar 'n individuele lncRNA flankeer, word saam met Cas9 in selle oorgedra. Verskeie sgRNA-pare (kleurgepas) is ontwerp vir elke lncRNA. Fenotiperende klone met soortgelyke eienskappe sal lncRNA's identifiseer wat met daardie fenotipe geassosieer word. C, Hoë-deurset regulatoriese streek skerm. 'n Lentivirale biblioteek wat bestaan ​​uit sgRNA's vir teëlwerk met ≈10-bp intervalle in die regulatoriese gebied van veelvuldige gene kan gebruik word om regulatoriese streke vir elke geen te identifiseer. 'n Soortgelyke benadering is gebruik om 'n biblioteek van selle te maak waarin 'n gids-RNA (gRNA of CRISPR-RNA) in 'n gemodifiseerde Rosa-lokus ingevoeg word waarin die haarnaald-RNA (of tracrRNA) langs die gRNA-invoegplek is en daardeur 'n sgRNA genereer vir elke sel. ssDNA dui op enkelstring-DNS.

Hoë-deurvoer-skerm vir lang nie-koderende RNA's

Die gebruik van CRISPR/Cas9 is effektief vir hoë-deursetskerms vir koderingstreke omdat die indels wat deur NHEJ gegenereer word, gewoonlik tot geenontwrigting sal lei. Lang niekoderende RNA's (lncRNA's) het baie funksies wat modulasie van uitdrukking van stroomaf kodende RNA's deur RNA-polimerase II-werwing kan insluit, tot die blokkering van splitsingsplekke deur hibridisasie met teenoorgestelde-string-lncRNA, tot die generering van klein RNA's soos miRNA's. Vir lncRNA sal die invoeging van indels in die nie-koderende DNA deur NHEJ herstel dikwels nie lncRNA funksie ontwrig nie. 'n Prosedure wat die niekoderende DNA uitvee, is bedink wat sgRNA's koppel wat streke herken wat die niekoderende DNA flankeer (Figuur 5B). 'n Lentivirale gepaarde-sgRNA-biblioteek vir ≈700 lncRNA's is in die lewerkankersellyn Huh7.5 oorgedra, wat 'n konstitutief uitdrukkende Cas9-geen gehad het. Daar is gevind dat twee U6-promotors wat die 2 gRNA's afsonderlik aandryf, die lncRNA teen 'n hoër frekwensie uitvee as 'n enkele U6-promotor wat 2 gRNA's aandryf wat opeenvolgend gekoppel is. Een-en-vyftig lncRNA's is geïdentifiseer met wins of verlies aan groei. Nege wat nie oorvleuel met koderende streke van gene, soos introne nie, het 'n valideringstoets geslaag. Daar is vasgestel dat 20 gepaarde-sgRNA-pare vir elke lncRNA nodig was om die vals-negatiewe tempo van die skerm te minimaliseer. 157

Hoë-deurset Regulerende Streek skerm

NHEJ-herstel van CRISPR/Cas9-gemedieerde DSB's is gebruik in 'n hoë-deursetskerm om regulatoriese streke van gene te identifiseer. Een studie het 40-kb-streke rondom 4 gene ondersoek wat in mESC uitgedruk word. Vier mESC-lyne is gemaak met GFP (groen fluoresserende proteïen) wat in die Nanog, Rpp25, Tdgf1, en Zfp42 gene. Byna 4000 sgRNA's vir teëlwerk met ≈10-bp intervalle is gegenereer met behulp van CRISPR/Cas9-gebaseerde HDR deur individuele crRNA's in 'n gewysigde in te voeg Rosa lokus by 'n terrein wat voorheen 'n dummy tracrRNA-haarnaald in die Rosa lokus, wat lei tot uitdrukking van 'n enkele sgRNA vir elke mESC. Uitdrukking van elke individuele sgRNA vanaf die Rosa lokus het NHEJ herstel by slegs 1 regulatoriese terrein per mESC veroorsaak. Die uitlees was GFP-uitdrukkingveranderlikheid. 158 Hierdie ontwerp word in Figuur 5C getoon. Die voordeel van die maak van die sgRNA biblioteke in die Rosa lokus eerder as in lentivirus was dat slegs 1 redigering gebeurtenis per sel plaasgevind het, wat nie gewaarborg kan word met 'n lentivirus biblioteek nie, selfs teen 'n lae veelheid van infeksie. Die studie het geenuitdrukkingbydrae van naburige geenpromotors getoon, en dit het regulatoriese elemente met atipiese versterker, epigenetiese en chromatienkenmerke geïdentifiseer.

Alhoewel dit nog nie duidelik is of die doeltreffendheid van splitsing verskil tussen repliserende en post-mitotiese selle nie, is dit getoon dat chromatientoeganklikheid van regulatoriese streke van verskeie gene nie 'n voorspeller van CRISPR/Cas9-gemedieerde geenaktivering is nie. 159 Daarbenewens is daar aangetoon dat splitsing by 'n hoogs gemetileerde promotor kan plaasvind. 31 'n Hoë-deurset-analise van Cas9-toeganklikheid tot verskillende toestande van chromatien het aan die lig gebring dat toeganklikheid indirek eweredig was aan nukleosoomdigtheid, maar dat chromosoomhermodellering toegang herstel het. 160 Alhoewel 'n ander studie ook getoon het dat chromosoomhermodellering toeganklikheid verbeter, het dit ook getoon dat nukleosoomteenwoordigheid nie noodwendig Cas9-toeganklikheid blokkeer nie. Spasiëring van die PAM-plek relatief tot die nukleosoom-diade beïnvloed toeganklikheid sterk. 161

Nie-geenredigeringstoepassings van die CRISPR-stelsel

Die doeltreffendheid en spesifisiteit van sgRNA-binding aan sy genomiese ligging het dit nuttig gemaak vir nie-redigeeraktiwiteite op daardie plek. Dit het gelei tot benaderings vir modulasie van geenregulering deur 'n ensiematies dooie Cas9 (dCas9) te versmelt met regulatoriese effektordomeine wat deur die sgRNA na die teikengeenregulerende gebied gerig word. Dit is ook gebruik om chromosomale areas te merk om kernorganisasie te openbaar, sowel as om spesifieke mRNA's te merk om hulle deur die sel op te spoor. Voorbeelde van hierdie benaderings sal gegee word, en hul voordele bo ander benaderings sal bespreek word.

CRISPR-bemiddelde modulasie van geenuitdrukking

Die CRISPR/Cas9-stelsel kan gebruik word vir interferensie (CRISPRi) of aktivering (CRISPRa) van geenregulerende elemente. dCas9 word gebruik om direk in te meng deur steriese hindering met 'n regulatoriese element 162,163 of om indirek in te meng deur samesmelting na 'n regulerende effektordomein (dCas9-effektor) wat in wisselwerking met die endogene regulatoriese element inwerk. 159,164–166

'n Effektiewe CRISPRi-stelsel is ontwikkel waarin dCas9 met die negatiewe transkripsionele effektor KRAB (Krüppel-geassosieerde boks van die Kox1 geen). Daar is getoon dat 162 dCas9-KRAB uitdrukking effektief in HEK293 (menslike embrioniese nier) selle van 'n SV40-gedrewe GFP-verslaggewergeen verminder, sowel as die endogene CD71 en CXCR4 gene (Figuur 6A). Daarbenewens is dit getoon dat die dCas9-KRAB-stelsel uitdrukking van die GFP-verslaggewer verander het toe die AP1- en SP1-verbeterelemente van die SV40-promotor spesifiek geteiken is, wat die bruikbaarheid van die stelsel vir hoë-deurset-verbeterelementsifting voorstel.Buite-teikenaktiwiteit is minimaal gevind. 164 Hierdie benadering is toegepas op 'n hoë-deurset-skerm vir regulatoriese elemente van 49 gene wat Ricin-gevoeligheid moduleer. 167 K562-selle is geïnfekteer met 'n lentivirus-biblioteek van geteëlde sgRNA's wat 10-kb-streke dek wat die transkripsionele beginplekke van hierdie gene dek. Die 50- tot 100-bp-streek stroomaf van die transkripsionele beginterreine is geïdentifiseer as die mees effektiewe streek om vir transkripsie-interferensie te teiken. Reëls vir die konfigurasie van wanpassings in die sgRNA's wat nodig is om buite-teikenaktiwiteit te minimaliseer, is ook vasgestel.

Figuur 6. CRISPR-gemedieerde modulasie van geenuitdrukking. A, CRISPR interferensiestelsel met dCas9 (dooie, nuklease-tekorte Cas9 gekleur in rooi) saamgesmelt met die negatiewe transkripsie-effektor KRAB (Krüppel-geassosieerde boks van die Kox1 geen, rooi gekleur). 'n Lentivirale biblioteek van enkelgids-RNA's vir teëlwerk by geenregulerende streke kan versterkerelemente identifiseer en hul ligging langs die transkripsionele beginplek (TSS) wat geenuitdrukking beïnvloed. B, CRISPR-aktiveringstelsel met dCas9 saamgesmelt aan 'n vasgemaakte string van 'n teenliggaam-epitoop. Kotransduksie van 'n epitoop-spesifieke teenliggaam wat aan veelvuldige Herpes-virus transkripsionele aktiveringsgene saamgesmelt is VP16 sal aan die string epitope bind wat veelvuldige VP16s na die transkripsiemasjinerie bring, en daardeur die geen aktiveer. VP64 is 'n kompleks van 4 VP16 molekules. Figuur afgelei van Figuur 5A van Tanenbaum et al. 169

Met betrekking tot kardiovaskulêre studies, is CRISPRi toegepas op hiPSC afkomstig van 'n pasiënt met die mutant Calmodulin2 (D130G) alleel om kwaadaardige kalmodulinopatiese lang-QT-sindroom te bestudeer. sgRNA's spesifiek vir die mutant, maar nie vir die normale alleel nie, is saam met dCas9-KRAB oorgedra. Soos beplan is die mutante alleel stilgemaak terwyl aktiwiteit van die normale alleel behoue ​​gebly het, wat gelei het tot 'n funksionele redding van aksiepotensiaal duur en C a2+ /CaM-afhanklike inaktivering van die L-tipe Ca 2+ kanaal in gedifferensieerde hiPSC-CM. 168

Vir CRISPRa is 'n dCas9-SunTag (SUperNova-ontploffing)-stelsel (dCas9 saamgesmelt met veelvuldige kopieë van die Herpes-virus transkripsionele aktiveringsdomein VP16 169) gebruik om vas te stel dat die -400- tot -50-bp-streek stroomop van die transkripsionele beginterreine was die optimale streek vir die teiken van transkripsionele aktivering (Figuur 6B). Hierdie CRISPRi- en CRISPRa-platforms is toe gebruik om grootskaalse skerms van 15 977 gene (10 sgRNA's/transkripsiebeginplekke) uit te voer om te bepaal watter selgroei geïnhibeer en geaktiveer is. Daar is gevind dat individuele sgRNA's groei in elke skerm grondig beïnvloed, en die gene wat geïdentifiseer is, stem ooreen met die groei-effekte wat waargeneem is, wat die uitvoerbaarheid van grootskaalse CRISPRI/a-sifting aandui. Slegs 0.3% van negatiewe kontrole, nie-teiken sgRNA's is gevind om DNA te teiken, wat 'n lae vlak van buite-teiken aktiwiteit aandui, wat onbeduidend sou wees met herhaalde skerms.

'n Vergelykende ontleding van ander tweedegenerasie-aktiveerders behalwe die SunTag-stelsel, soos die VPR (VP64-p65-Rta drieledige aktiveerder) en SAM (sinergistiese aktiveringsbemiddelaar) stelsels, het getoon dat hulle almal soortgelyke toenames in aktiveringspotensiaal het relatief tot die VP16-stelsel en om op soortgelyke wyse met dieselfde sgRNA te werk. 170 Die VPR-stelsel gebruik 'n Cas9/VP64/p65/RTA-fusieproteïen vir transkripsie-aktivering 170 en die SAM-stelsel gebruik 'n Cas9/VP64-fusiestelsel plus 'n gemodifiseerde sgRNA wat 'n bakteriofaag-jas-proteïen MS2-bindende haarnaaldlus werf wat 'n samesmelting werf MS2/p65/Hsf1 transkripsionele aktiveringstelsel. 171 Van belang was die feit dat die gebruik van veelvuldige sgRNA's wat 'n enkele geen teiken, gelei het tot verhoogde aktiveringsvlakke, wat daarop dui dat maksimale aktivering nie deur enige van hierdie tweedegenerasie-aktiveerders bereikbaar was nie.

Omkeerbare/Induceerbare Beheer van CRISPRi-gemedieerde geenregulering

Vir sommige eksperimente sal dit nodig wees om die probleem te omseil dat 'n geen uitklophou wat CRISPR gebruik, onomkeerbaar is. Dit sal ook nuttig wees vir verifikasiedoeleindes en vir die verskaffing van tydelike beheer van geenregulering in differensiasiestudies. So 'n stelsel is ontwikkel deur gebruik te maak van 'n anhidrotetrasiklien (aTc)-induseerbare dCas9-KRAB-fusieproteïen waardeur die transkripsie-inhiberende effekte van dCas9-KRAB deur 'n aTc-behandeling geïnisieer is. 162 Soortgelyke CRISPRi-benaderings is ontwikkel met behulp van doksisiklien-induksie. In een studie is hierdie benadering gebruik vir verifikasie van gene wat in 'n selgroeiskerm geïdentifiseer is. 167 In 'n ander studie is doksisiklien-induseerbare dCas9-KRAB-uitdrukkings K562-selle besmet met 'n lentivirale biblioteek van 98 000 sgRNA's wat teël oor >1 Mb se volgorde rondom GATA1 en MYC gene en is getoets vir verminderde groei om versterkerelemente te identifiseer. Die elemente wat geïdentifiseer is, stem ooreen met voorheen bekende elemente van K562 en ander seltipes. 172

In 'n kardiomyosiet-differensiasiestelsel met behulp van hiPSC en hiPSC-CM, het Mandegar et al 173 spesifieke inhibisie van geenuitdrukking en instelbare omkering van daardie inhibisie gedemonstreer met behulp van doxycycline-induseerbare dCas9-KRAB (CRISPRi). Die doksisiklien-induseerbare dCas9-KRAB is in die AAV-integrasieplek 1 veilige hawe lokus van hiPSC getransduseer waar dit transkripsie stil gebly het, maar induseerbaar, in beide hiPSC en hul hiPSC-CM afgeleides. Lentivirus-transduksie van sgRNA's wat die stamselonderhoudsgene teiken Nanog en 4 okt met CRISPR, of hul regulatoriese streke met CRISPRi, het tot hiPSC-differensiasie gelei. 'n Vergelyking van afbreekdoeltreffendheid tussen die CRISPR- en CRISPRI-benaderings het aangedui dat CRISPRi 99% doeltreffend was om teikengeenuitdrukking te verminder, terwyl CRISPR slegs 60% tot 70% so effektief was, grootliks as gevolg van klein indels wat leesraamwerk behou het toe Cas9 nuklease-aktiwiteit het gelei tot NHEJ. Daarbenewens het die CRISPRi-afslag vinniger plaasgevind, en hiPSC-differensiasie was vinniger en vollediger as met CRISPR. Laastens is getoon dat die induseerbare CRISPRi-afslag in beide hiPSC en hiPSC-CM verstelbaar is deur die keuse van verskillende sgRNA's vir die regulatoriese gebied van 'n teikenverslaggewergeen, en dit is omkeerbaar getoon deur die verwydering van doksisiklien.

Voordele van CRISPR bo shRNA en RNAi

CRISPR kan enige element in die genoom teiken, insluitend introne, eksons, promotors, versterkers en intergeniese streke, terwyl RNAi en shRNA slegs transkripsies kan teiken, en sodoende hul bruikbaarheid beperk. Ook, hul doeltreffendheid in die vermindering van transkripsievlakke is dikwels nie volledig nie. Daarbenewens, anders as RNAi wat RISC (RNA-geïnduseerde stilmaakkompleks) kompleks gebruik, is dit nie bekend dat CRISPR enige soortgelyke masjinerie gebruik nie. Off-teiken aktiwiteit van RNAi is ook problematies. CRISPR-uitklopskerms het getoon dat die doeltreffendheid van verlies van beide allele hoog genoeg is om uitklopskerms doeltreffend te maak, terwyl RNAi teikengeenvlakke slegs gedeeltelik onderdruk. 151 152 Nog 'n studie het getoon dat CRISPRi 90% tot 99% afslaan behaal het, en vergelyking met 24 ewekansig gekose shRNA- en RNAi-afsettings het gevind dat CRISPRi meer effektief is as die meeste shRNA, en 3 tot 5x meer effektief as die meeste RNAi. 167

Fluoresensie-etikettering van chromosomale lokusse en mRNA

Om 'n spesifieke chromosomale ligging te visualiseer, moet veelvuldige kopieë van die fluoresserende molekule op daardie plek saamgestel word. Twee algemene benaderings wat dCas9 gebruik, is gebruik om dit te bereik. In een studie is 'n enkele sgRNA met 'n dCas9 saamgesmelt aan 'n peptiedketting met 24 kopieë van 'n epitoop ('n ander Sun Tag-stelsel) in selle getransduseer. Daarbenewens is 'n enkelketting veranderlike fragment teenliggaam (samesmelting van die epitoop-bindende streke van die ligte en swaar kettings van 'n teenliggaam) wat aan GFP gefuseer is ook in die selle ingebring. In hierdie stelsel kan 1 sgRNA tot 24 GFP-molekules ophoop by 1 chromosomale plek-lokusse (soortgelyk aan Figuur 6B behalwe met 'n GFP:teenliggaamsamesmelting in plaas van 'n VP64:teenliggaamsamesmelting). Hierdie benadering is getoon om suksesvol te wees in die visualisering van telomere. 169 In 'n ander studie is 'n dCas9-EGFP (enhanced green fluorescent protein) fusieproteïen in selle ingebring saam met geteëlde sgRNA's langs 'n spesifieke chromosomale plek is gebruik om veelvuldige EGFP-molekules by daardie plek saam te stel. Dit is gebruik om telomeerdinamika en die lokalisering van 'n genomiese lokus tydens die selsiklus te bestudeer. 174

Om 'n individuele mRNA fluoresserend op te spoor, is 2 oligonukleotiede ontwerp om met 'n dCas9-GFP-fusieproteïen te kombineer op so 'n manier dat slegs 'n spesifieke mRNA en nie die koderende DNA herken word nie. Die sgRNA is ontwerp om met mRNA te hibridiseer, maar het geen aangrensende PAM-volgorde in die enkoderende DNA-volgorde nie, sodat Cas9 nie sal bind nie. 'n Tweede oligonukleotied (PAMmer) is saamgestel uit DNA met 'n PAM-volgorde en RNase H-weerstandige 2'-O-metiel RNA basisse wat sal hibridiseer met die mRNA aangrensend aan waar die sgRNA hibridiseer (Figuur 7). Hierdie heterotrimeriese fluoressensiekompleks volg die mRNA na sy sellulêre kompartemente. 175

Figuur 7. mRNA-merking met CRISPR/dooie Cas9 (dCas9). 'n dCas9 (rooi) saamgesmelt met GFP (groen fluoresserende proteïen groen) word in selle ingebring met enkelgids-RNA (sgRNA) en 'n PAMmer-oligonukleotied wat uit gemengde DNA en 2'O-metiel-RNA-basisse saamgestel is sodat dit RNase H-bestand is. Die PAMmer het 'n protospacer adjacent motif (PAM) volgorde langs rye wat basispaar met die teiken mRNA. Die PAM-volgorde is nie ooreen met sy teenoorgestelde basisse (M) in die mRNA, sodat die dCas9:GFP-fusieproteïen slegs die mRNA sal bind en nie sy enkoderende geen nie. PAMmer-hibridisasie na die mRNA saam met sy PAM-volgorde bring die dCas9:GFP-kompleks na die mRNA sodat daardie GFP-geassosieerde mRNA nou binne die sel opgespoor kan word.

RNA-geleide RNA-teiken met CRISPR-effektor C2c2

Onlangs is 'n nuwe CRISPR-stelsel (CRISPR/C2c2) in bakterieë geïdentifiseer as 'n aanpasbare immuunstelsel wat teen faag-RNA beskerm. 176 C2c2 behoort aan die klas 2 tipe VI CRISPR-stelsel en funksioneer as 'n RNA-geleide RNA-endonuklease. Die C2c2-proteïen kan enige ssRNA afbreek wanneer dit gekombineer word met 'n crRNA wat komplementêr is tot 'n teiken ssRNA (Figuur 8). Dit is gewys dat Leptotrichia buccalis (Lbu) C2c2 proteïen beskik oor 2 onafhanklike RNase funksies wat verantwoordelik is vir die verwerking (splitsing) van die kort palindromiese crRNA herhalings in individuele crRNAs wat teiken ssRNA kan bind en vir die splitsing van die individuele crRNA-gebonde teiken ssRNA. Daar is ook getoon dat Lbu C2c2 die herhalende crRNA doeltreffend kan verwerk en teiken-ssRNA teen baie hoë tempo's kan klief. Deur 'n teël-crRNA-biblioteek vir 'n aansteeklike faag te gebruik, het Abudayyeh et al 177 voorkeure vir C2c2-aktiwiteit geïdentifiseer, soos dat die teikenplek nie deur guanien geflankeer moet word nie, en daar moet 'n nabygeleë uracil wees vir splitsing. Alhoewel DNA-redigering permanente veranderinge in die genoom inbring, toon die CRISPR-gebaseerde RNA-teikenbenadering belofte vir die bereiking van tydelike RNA-manipulasie met groter spesifisiteit en doeltreffendheid as RNA-inmenging. Hierdie stelsel kan ook ontwikkel word as 'n ander benadering om detektormolekules aan te dryf vir spesifieke transkripsies wat intydse transkripsiebeelding in lewende selle moontlik maak.

Figuur 8. RNA-geleide RNA-teikening met CRISPR effektor C2c2. C2c2 het hoër eukariote en prokariote nukleotied-bindende domeine wat ribonuklease en nie deoksiribonuklease aktiwiteit het nie. Met 'n C2c2-spesifieke sgRNA wat basispare met 'n spesifieke mRNA, het hierdie stelsel potensiaal vir afbreek en manipulasie van spesifieke mRNA's. Die spesifisiteit vir spesifieke mRNA-modifikasie vereis verdere ondersoek.

Gebiede vir verbetering

Die dringendste behoefte aan verbetering in geenredigering is om CRISPR/Cas9-spesifisiteit te verhoog met minder buite-teikenaktiwiteit. Dit kan gemodifiseerde SpCas9s met alternatiewe PAMs behels, Cas9s van verskillende spesies met spesie-spesifieke PAMs, en gesplete Cas9 nickases met 2 sgRNAs sodat 'n dubbele nick plaasvind slegs as die spesifisiteit van die 2 sgRNAs op dieselfde teikenplek voorkom. 24,35,37 Elke nuwe CRISPR/Cas9-instrument sal sistematies ontleed moet word vir sy buite-teikenaktiwiteit om die toepaslikheid daarvan vir navorsing en potensiële terapeutiese doeleindes te bepaal. Geenredigering in menslike selle wat ontwerp is vir moontlike terapeutiese gebruik, sal ondersoek moet word vir buite-teikenaktiwiteit in elke stadium van selkultuur, van herprogrammering tot redigering en sifting vir geredigeerde selle, tot herdifferensiasie. 111–119 Met hierdie inligting kan verbeterde selkultuurtegnieke gevind word wat ongewenste mutasielading sal verminder. Verhoogde doeltreffendheid in HDR sal vereis word om minder afhanklikheid van NHEJ-herstel te maak, want laasgenoemde sal slegs van toepassing wees op sommige herstelvereistes. Dit kan gedoen word met verbeterde CRISPR/Cas9s soos hierbo genoem en ook met die ontwikkeling van beter reagense wat HDR induseer en NHEJ inhibeer. 42 CRISPR/Cas9-reagensafleweringstelsels, veral met die oog op terapie, sal ook verbeter moet word. Alhoewel AAV en integrase-tekorte lentivirus nie in die genoom integreer nie, bly die probleem van hul immunogenisiteit. Integrase-tekort lentivirus vereis immuunonderdrukking, 178 en AAV ontlok 'n reaksie by ongeveer die helfte van mense. 20 Binne die afgelope dekade is 3 ontwerpernukleasestelsels, ZFN, TALEN en CRISPR/Cas9, ontwikkel, laasgenoemde het veelvuldige voordele bo die ander. Nuwe stelsels vir geenredigering, soos 'n onlangs gerapporteerde DNS-geleide redigeerstelsel, 179 word aktief nagestreef 180 en kan verbeterde doeltreffendheid en spesifisiteit bied bo die huidige nukleasestelsels.

Afsluiting

Gene redigering met CRISPR/Cas9 is 'n rewolusie van molekulêre genetika. In 'n selkultuur begin dit RNA-inhiberende benaderings soos morpholino, RNAi en shRNA vervang omdat dit meer spesifiek is en minder newe-effekte het. Anders as geen-teikening deur homoloë rekombinasie, is dit van toepassing op die meeste seltipes wat getoets word. In vivo is dit van toepassing op 'n wye verskeidenheid plant- en dierspesies. Omdat dit SNP's sonder oorblywende volgorde kan bekendstel, het dit die tipes modifikasies wat gemaak kan word grootliks uitgebrei om nie net siekte-SNP's in te sluit nie, maar ook SNP's in geenregulerende elemente en ander niekoderende streke. Omdat nuklease-tekorte dCas9 sy volgorde spesifisiteit behou, kan dit ook gebruik word om genomiese terreine fisies te blokkeer om hul regulatoriese funksie te assesseer. Dit kan ook gebruik word vir hoë-deurset sifting van gene betrokke by spesifieke geen funksies en vir geen regulerende streke. dCas9 saamgesmelt met fluoressensiemerkers kan ook gebruik word om chromosomale ligging tydens die selsiklus te merk. ’n Nuwe dCas9-benadering is ook ontwikkel om spesifieke mRNA fluoresserend te merk om die sellulêre nasporing daarvan te volg. Post-mitotiese selle ondersteun slegs NHEJ en nie HDR-gebaseerde herstel nie, wat die tipe geenredigering moontlik in volwasse weefsels beperk. 'n Benadering wat net NHEJ-herstel gebruik, is egter ontwerp om eksonvervangings en merkergeen-invoegings in post-mitotiese selle te maak wat belangrike implikasies vir toekomstige terapieë in volwasse weefsels het. Voortgesette ondersoeke na CRISPR-stelsels het 'n CRISPR-ensiem (C2c2) geïdentifiseer wat RNA-endonuklease-aktiwiteit het, wat potensiaal het vir die afbreek van spesifieke mRNA's. Laastens, die merkwaardige doeltreffendheid waarmee CRISPR-stelsels in staat is om hul teikens te vind en te verander, veral in vivo, gepaardgaande met die merkwaardig lae, hoewel steeds kommerwekkende, buite-teiken-aktiwiteit, open werklike potensiaal vir deurbrake in geenterapie. Verbeterings in benaderings om buite-teikenaktiwiteit tot hanteerbare vlakke te verminder, sal daardie potensiaal in werklikheid verander.


Genetika Hoofstuk 21

-Vektore is draer-DNA-molekules
- Laat DNA-beperkingsfragmente toe om gasheerselle binne te gaan vir kopiëring (kloning)
-'n Vektor gekombineer met 'n DNA-beperkingsfragment vorm 'n rekombinante DNA-molekule
- Baie vektore is beskikbaar vir gebruik, afgelei van verskeie bronne
-as dit 'n stuk DNA is wat jy eksogeen in 'n ander genoom inbring, word daardie ander genoom 'n vektor b/c genoem, dit dra daardie DNA

-bevat verskeie beperkingsplekke wat die invoeging van die DNA-fragmente wat gekloneer moet word, moontlik maak
-moet in staat wees om in gasheerselle te repliseer om onafhanklike replikasie van die vektor-DNS en 'n DNA-fragment wat dit dra moontlik te maak

-As 'n DNS-fragment enige plek in die veelvuldige kloningsplek ingevoeg word, word die lacZ-geen ontwrig en sal dit nie funksionele kopieë van Beta-Galactadose produseer nie. Getransformeerde bakterieë in hierdie eksperiment word uitgeplaat op agarplate wat 'n antibiotika bevat. Nie-getransformeerde bakterieë kan nie goed op hierdie plate groei nie b/c hulle het nie die amp^(r)-geen nie en dus maak die antibiotika hierdie selle dood. Hierdie agarplate bevat 'n stof genaamd X-gal (in struktuur soortgelyk aan laktose). Dit is 'n substraat vir beta-galaktosidase, en wanneer dit deur beta-galaktosidase geklief word, word dit blou.
--Gevolglik het bakteriële selle wat nie-rekombinante plasmiede dra 'n funksionele lacZ-geen en produseer beta-galaktosidase, wat x-gal in die medium klief en blou word. Rekombinante bakterieë met plasmiede wat 'n ingevoegde DNA-fragment bevat, sal egter wit kolonies vorm wanneer hulle op x-gal medium groei b/c die plasmiede in hierdie selle produseer nie funksionele beta-galactodoisdase nie

Dit word gebruik om getransformeerde bakteriële selle te identifiseer wat rekombinante of nie-rekombinante plasmiede bevat

-Gs kunsmatige chromosome (YAC's) word as vektore gebruik om groot DNA-fragmente, tot 2Mb groot, te kloon.
-lineêre menslike genoomgrootte fragmente

-komplementêr tot die nukleotiedvolgorde van die mRNA en bevat slegs uitgedrukte gene

-Gebruik van hitte-stabiele DNA Polimerase =
--Taq-polimerase- 'n ensiem wat in warmwaterbronne leef
-- Moet dubbelstrengs heliks denatureer
--Sleutelstreek waarom PCR kan werk
- In staat om hitte te weerstaan ​​om DNA te denatureer

-HGP gebruik as integrale deel van projek

-amplifiseer slegs een van geen of monster van gene
-Kry miljoene kopieë van voorafbepaalde streke wat jy wil versterk
- slegs versterkende gene waarvoor jy primers skep
- nie die hele genoom versterk nie

-In die ____________ word die teiken-DNS in enkelstringe gedenatureer, elke string word dan uitgegloei tot 'n kort, komplementêre onderlaag. DNA-polimerase en nukleotiede brei die primers in die rigting uit, deur die enkelstring-DNS as 'n templaat te gebruik. Die resultaat is 'n nuut gesintetiseerde dubbelstring-DNS-molekule met die primers daarin geïnkorporeer. Herhaalde siklusse van PCR kan die oorspronklike DNA-volgorde met meer as 'n miljoenvoudig versterk.

-wil hê dat primers aan die buitekant moet wees, sodat dit alle gene daarbinne sal bind

-die aantal nuwe DNA-stringe word in elke siklus verdubbel, en die nuwe stringe, saam met die ou stringe, dien as sjablone in die volgende siklus


Die politiek van vigs in Suid-Afrika: verder as die kontroversies

In sy vinnige reaksie "Vir sommige mense is dit almal April Fool's Day
die hele jaar deur" (3
April 2003) met betrekking tot die Padian
studie, het Peter Flegg geskryf "Ek het uitdruklik gesê dat "daar 'n laagtepunt was
transmissietempo" in haar studie ...". Daar moet daarop gewys word dat in
die voornemende studie van 175 MIV-onenstrydige paartjies, wat elke ses maande getoets word,
nie een van die 175 nie-geïnfekteerde mans of vroue het MIV-positief geword nie. Dit wil sê die
Voornemende Padian-studie het nie 'n lae transmissietempo bewys nie, maar 'n nul
transmissietempo, dit wil sê, geen transmissie nie.

So ver as Peter Flegg wat verward is oor die denke van
"dissidente", verwag hy dat alle wetenskaplikes eenders moet dink? Wetenskap
ontwikkel deur 'n diversiteit van sienings en deur bestaande paradigmas te bevraagteken. Terwyl ons
stem saam met die vernaamste standpunte wat deur ander "dissidente" gehuldig word, dit wil sê daar
is geen bewys dat MIV VIGS veroorsaak nie, daar is ook verskille. Ons stem ook saam
sommige standpunte wat deur die "MIV"-kundiges gehuldig word, insluitend die volgende:

  • Ons stem saam 'n positiewe teenliggaamtoets in individue van die VIGS-risikogroepe
    dui op 'n geneigdheid tot die ontwikkeling van sommige siektes. Maar,
    nêrens in die wetenskaplike literatuur is daar bewyse dat 'n positiewe toets
    bewys MIV-infeksie. Met ander woorde, die teenliggaamtoets is soortgelyk aan die
    eritrosiet sedimentasietempo (ESR), 'n laboratoriumtoets van aansienlike
    kliniese nut wat die aanvang of teenwoordigheid van siekte voorspel en wie se
    vlak word gebruik om die natuurlike geskiedenis of behandeling van siektes te monitor.
    Nietemin is dit sonder spesifisiteit.
  • Openbare Gesondheidsbeleid – soos die "MIV"-kundiges, glo ons veilig
    seks is nodig vir die voorkoming van vigs. Trouens, ons gaan 'n stap verder.
    Die MIV-kenners beveel aan dat veilige seks slegs met 'n positiewe beoefen moet word
    vennoot. Ons sê veilige seks moet met alle maats beoefen word, ongeag
    van teenliggaampies status.

Soos die "MIV" kenners is ons almal vir skoon naalde en weer ons
gaan een stap verder. Aangesien dit na ons mening die inhoud van die spuit is, dit
is, die ontspanningsdwelm ingespuit wat een van die primêre oorsake is, die
beste manier om VIGS te voorkom, is om alle inspuitings te vermy.

Peter Flegg het ook geskryf ons beweer dat MIV "deur anaal versprei
omgang". Trouens, in een van ons vinnige antwoorde het ons geskryf "Dit is
ook ons ​​siening dat 'n positiewe teenliggaamtoets ("MIV") verkry word deur die
dieselfde beteken, dit wil sê passiewe anale omgang.”(24 ste
Maart 2003 ) In nog 'n vinnige reaksie het ons
geskryf "al die tans beskikbare data bewys dit is slegs passiewe anaal
omgang wat die risikofaktor is vir die verkryging van 'n positiewe teenliggaam
toets." (1 st
April 2003 .) Dit beteken dat óf MIV
is die enigste eenrigtingverspreide STD in die geskiedenis van medisyne of wat ook al
veroorsaak dat die positiewe teenliggaamtoets nie 'n aansteeklike middel kan wees nie.

Dit is waar dat ons in sommige van ons artikels ons argument het
die bestaan ​​van MIV aangeneem het om aan te toon hoe so 'n aanname daartoe lei
onhoudbare aansprake vir die MIV-teorie van VIGS.

Peter Flegg het geskryf dat ons "bevestig dat MIV dit nie doen nie
bestaan". Peter Flegg het moontlik ons ​​gepubliseerde materiaal hierin geïnterpreteer
manier, maar dit is belangrik om te sê dat ons nog nooit gesê het dat MIV nie bestaan ​​nie.
Eerder van die begin af toe Montagnier en Gallo hul gepubliseer het
studies in 1983/1984, het ons konsekwent aangevoer dat nóg hul data nóg
enigiemand anders bewys dat MIV bestaan. (Hierdie probleem kan opgelos word deur
eksperimente uit te voer. Dit is presies waarvoor ons gepleit het en wat aanvaar is
deur beide kante by die Presidensiële VIGS-paneelvergaderings wat in Julie 2000 gehou is,
Johannesburg, Suid-Afrika http://aidsmyth.addr.com/panelreport.htm).
Sommige van die redes kan gevind word in wat volg.

Na die verskyning van VIGS in 1981 was baie etiologiese faktore
voorgestelde. In Mei 1983 het Montagnier die ontdekking van 'n retrovirus nou aangekondig
bekend as MIV, van limfatiese weefsel van 'n gay man met limfadenopatie. Een jaar
later het Gallo data gerapporteer wat "suggereer dat HTLV-III [MIV] die
primêre oorsaak van VIGS.” Teen 1986 het die wetenskaplike gemeenskap die Gallo aanvaar
bewering dat dieselfde data "duidelike bewyse" was dat MIV die
veroorsakende middel van die kliniese sindroom. Selfs vandag die vyf Wetenskap
referate wat deur hierdie Franse en Amerikaanse groepe gepubliseer word, word steeds algemeen beskou
as bewys bo alle redelike twyfel dat MIV bestaan ​​en die oorsaak van VIGS is.

Nie alle wetenskaplikes het egter hierdie bevindings aanvaar nie. In 1987 Peter Duesberg
het 'n genooide referaat in gepubliseer Kankernavorsing oor retrovirusse en kanker
waarin hy ook die rol van MIV in vigs bevraagteken het. Terselfdertyd een van ons
(EPE) het ook die teorie uitgedaag, insluitend die data wat beweer word om die te bewys
bestaan ​​van MIV. Papadopulos-Eleopulos het ook 'n alternatief voorgestel,
nie-aansteeklike etiologie en behandelings gebaseer op hierdie hipotese. Sedertdien ons
groep het referate gepubliseer wat elke faset van die MIV-teorie aanspreek, insluitend a
gedetailleerde ondersoek van MIV-isolasie en die MIV-genoom. Hier beperk ons
onsself grootliks om die data wat deur Montagnier en Gallo gepubliseer is, aan te spreek
hul 1983/84 Wetenskap papiere. Genomiese data word slegs kortliks bespreek
omdat die bestaan ​​van MIV en die MIV-teorie van VIGS universeel was
aanvaar voordat sulke data beskikbaar was. Vir 'n omvattende bespreking oor
genomiese data word die leser verwys na verwysing 19.


RETROVIRUSSE EN HULLE IDENTIFIKASIE

'n Virus beskik oor twee kenmerkende eienskappe. Die eerste is anatomies,
dit wil sê, synde 'n mikroskopiese deeltjie van individuele morfologie, die tweede, die
vermoë om identiese nageslag te genereer deur sintetiese prosesse verpligtend
wat binne lewende selle voorkom. Dit is laasgenoemde eienskap wat a definieer
deeltjie met die voorkoms van 'n virus, dit wil sê 'n virusagtige deeltjie, as
aansteeklik en dus 'n virus. Die drie subfamilies (0ncovirinae, Lentivirinae
en Spumavirinae) van Retroviridae (Retrovirusse) is
"omhulde virusse met 'n deursnee van 100-120 nm wat by sellulêr bot
membrane. Selvrygestelde virions bevat gekondenseerde binneliggame (kerne) en is
besaai met uitsteeksels (spikes, knoppe)". Die retrovirale deeltjies bevat
RNA en die ensiem omgekeerde transkriptase (RT), 'n RNA-afhanklike DNA-polimerase
wat die sintese van DNA kataliseer in teenstelling met die sentrale dogma van biologie,
dit wil sê in 'n rigting "omgekeerde" van DNA na RNA. Volgens
retroviroloë, word sulke DNA dan geïntegreer in bestaande sellulêre DNA as 'n
"provirus". Retrovirale deeltjies deel die eienskap om te konsentreer
(bandvorming) teen 'n digtheid van 1,16 gm/ml wanneer dit teen hoë spoed in sukrose gesentrifuger word
digtheidsgradiënte, 'n feit wat lank gebruik word in hul suiwering.

Alle retroviroloë stem saam dat om die bestaan ​​van 'n nuwe retrovirus te bewys
mens moet dit isoleer. Die term "virusisolasie" is egter besete
semantiese probleme en onduidelikhede. Die woordeboekbetekenis van
"isolasie" is afgelei van die Latyn isolasie (gemaak in 'n
eiland) en verwys na die handeling om 'n voorwerp te skei van alle ander materie wat
is nie daardie voorwerp nie. "Suiwering" beteken om iets vry van te verkry
onsuiwerhede. In hierdie konteks is isolasie dieselfde as suiwering. Omdat die virus
deeltjies is klein is dit nie moontlik om 'n enkele, geïsoleerde deeltjie te verkry nie.
Die volgende beste ding is om 'n massa deeltjies apart van alles te verkry
anders. Tot die vroeë 1980's, vir die isolasie van dierlike retrovirusse sowel as
die "eerste" menslike retrovirus HL23V, deur isolasie retroviroloë
reiniging beteken het. Aan die ander kant, deesdae beide basiese en gespesialiseerde tekste
selde definieer "isolasie" en wanneer hulle doen sulke pogings is
nie verlig nie. Byvoorbeeld, Levy definieer isolasie as 'n "steekproef van 'n
virus van 'n gedefinieerde bron", en White as die vermoë om "a
totaal onvoorsiene virus, of selfs 'n heeltemal nuwe agent ontdek."
Omvat as "virus isolasie" is gelys metodes van kweek
monsters in weefsel- en kuikenembrio-selle, sowel as lewende diere, volg
deur dokumentasie daarin van sitopatiese en patologiese effekte, hemoabsorpsie,
immunofluoressensie, antigeen/teenliggaamreaksies en "karakterisering van die
virale genoom". MIV-kenners, insluitend Luc Montagnier en Robin Weiss definieer
"virus isolasie" as "propageer hulle [virusse] in selle in
kultuur" en sien www.theperthgroup.com/aids/vftweiss.html.
As "virusisolasie" egter is om 'n monster van 'n virus te neem
van 'n gedefinieerde bron", of "propageer hulle in selle in
kultuur", dan moet 'n mens eers vooraf bewys hê dat 'n virus in bestaan
"'n gedefinieerde bron" of "in selle in kultuur". Mens kan nie weet nie
dat 'n virus bestaan ​​of sy bestanddele definieer sonder suiwering (isolasie)
van die vermeende virale deeltjies.

Daar is verskeie redes waarom dit verpligtend is:

Om te bewys dat die retrovirusagtige deeltjies aansteeklik is, dit wil sê, hulle is
'n virus

Die bevinding van deeltjies met die voorkoms van retrovirusse, is nie 'n bewys nie
dat sulke deeltjies retrovirusse is en nog minder bewys dat 'n deeltjie a
spesifieke retrovirus. Deeltjies wat die morfologiese kenmerke van
retrovirusse is alomteenwoordig. In die 1970's was sulke deeltjies gereeld
waargeneem in menslike leukemieweefsels, kulture van embrioniese weefsels en "in
die meerderheid, indien nie almal nie, menslike plasentas". Tipe C retrovirale deeltjies is
teenwoordig in "visse, slange, wurms, fisant, kwartels, patrys, kalkoen,
boommuis en agouti" asook by "lintwurms, insekte". en
soogdiere". Gallo was deeglik bewus van hierdie probleem so ver terug as 1976 toe hy
geskryf: "Vrystelling van virusagtige deeltjies morfologies en biochemies
lyk soos tipe C-virus, maar het blykbaar nie die vermoë om te repliseer nie
is gereeld van leukemiese weefsel waargeneem." Met ander woorde, dit is nie
moontlik om te beweer dat 'n deeltjie 'n retrovirus is bloot deur die voorkoms. Om te bewys
dat retrovirusagtige deeltjies wat in 'n kultuur waargeneem word, 'n virus is wat 'n mens moet
isoleer die deeltjies, karakteriseer hul proteïene en RNA en stel die in
deeltjies in 'n sekondêre kultuur. Indien enige deeltjies vrygestel word in die
sekondêre kultuur hulle moet ook geïsoleer en bewys word dat hul proteïene en
RNA is dieselfde as dié van die primêre kultuur. In sulke eksperimente moet mens
nie die gebruik van wettige kontroles ignoreer nie en dit in ag neem
'n belangrike verskil tussen retrovirale en ander aansteeklike middels.

Wanneer 'n mens 'n aansteeklike middel vind, byvoorbeeld 'n virus of 'n bakterie,
óf in vitro of in vivo, kan mens verseker wees dat die agent het
van buite in die kultuur of dier ingebring is. Retrovirusse is die
uitsondering. Dit is omdat normale menslike en dierlike genome inligting bevat
wat, onder die toepaslike toestande, lei tot die sintese van retrovirale
RNA en proteïene, of selfs aan die samestelling van retrovirale deeltjies, dit wil sê om
die uitdrukking van endogene retrovirusse. En alhoewel so laat as 1994 albei
Gallo en Fauci het geleer "daar is geen bekende menslike endogene nie
retrovirusse", is dit bekend dat ten minste 1% van die menslike DNA retroviraal is
DNA en dat endogene retrovirusse "in ons almal" teenwoordig is.
Verder kan nuwe endogene retrovirale genome ontstaan ​​uit herrangskikkings van
bestaande retrovirale genome, sellulêre DNA of albei, veroorsaak deur baie faktore,
insluitend patogene prosesse. Die uitdrukking van endogene retrovirale genome
kan spontaan ontstaan ​​en kan aansienlik versnel word en die opbrengs
verhoog deur toestande wat sellulêre aktivering veroorsaak. Volgens die
vooraanstaande retroviroloog George Todaro, "die versuim om endogene te isoleer
virusse van sekere spesies kan die beperkings van in vitro weerspieël
kokultiveringstegnieke". Endogeen geproduseerde retrovirusse is
morfologies en biochemies ononderskeibaar van eksogene retrovirusse.
As gevolg hiervan, die bevinding van identiese retrovirus in serie
"besmette" kulture/kokulture is nie 'n bewys dat die selle wel is nie
besmet met eksogene retrovirus. Een metode wat kan help om op te los, maar sal
nie bewys of selle virus van buite verkry nie (eksogeen verkry
retrovirus, aansteeklike retrovirus) en het nie 'n retrovirus saamgestel uit
inligting wat reeds in normale selle (endogene retrovirus) bestaan, is om
beheerkulture/kokulture parallel met toetskulture/kokulture uit te voer.
Die enigste verskil tussen toets- en kontrolekulture moet die inleiding wees
van weefsel wat veronderstel is om in die toetskulture besmet te wees. In elke ander opsig
beheerkulture moet identies hanteer word. Byvoorbeeld:

  1. omdat opsporing van RT en retrovirale genetiese volgordes, en vrystelling van
    retrovirale deeltjies hang af van die metaboliese toestand van die selle, die
    fisiologiese toestand van die selle wat in die kontrolekulture gebruik word, moet as
    na as moontlik aan die toetskultuur
  2. omdat die blote daad van saam-kweek kan lei tot vrystelling van endogene
    retrovirale deeltjies, as toetsselle saamgekweek word, moet die kontroles ook
  3. ekstrakte selfs uit normale, ongestimuleerde selle wanneer dit by die kulture gevoeg word
    kan endogene retrovirale uitdrukking verhoog. As gevolg hiervan, wanneer gasheer
    selle word gekweek met supernatant of materiaal wat teen 1,16 gm/ml bande
    van kulture wat vermoedelik besmet is, moet die kontroles gekweek word
    soortgelyke materiaal van nie-geïnfekteerde kulture
  4. aangesien die voorkoms van endogene retrovirus versnel kan word en die
    opbrengs 'n miljoen keer toegeneem deur die kulture te stimuleer met mitogene,
    mutagene, chemiese karsinogene en bestraling, indien toetskulture blootgestel word
    om sulke agente in diens te neem, so moet die kontroles
  5. om vooroordeel van waarnemers te vermy en in die beste belang van die wetenskap, blind
    ondersoek van toets- en kontrolekulture/kokulture moet uitgevoer word.

Om hul biologiese effekte te bepaal

Sonder toevlug tot suiwer deeltjies is dit onmoontlik om te bepaal of
effekte is te wyte aan virusdeeltjies of kontaminante insluitend "chemiese
stimulante", 'n waarskuwing wat so ver terug as 1911 deur die Peyton Rous beklemtoon is, die
vader van retrovirologie.

In 1911 het Rous maligniteit by hoenders veroorsaak deur inspuitings van selvry
filtrate verkry van 'n spiergewas. Soortgelyke eksperimente is herhaal deur
baie navorsers en die tumor-induserende filtrate het bekend geword as filtreerbaar
agente, filtreerbare virusse, Rous-agente, Rous-virus en uiteindelik retrovirusse.
Rous het egter self twyfel uitgespreek dat die middels wat die gewasse veroorsaak het
aansteeklik van aard was. Inderdaad het hy gewaarsku, "Die eerste neiging sal wees om
beskou die selfbestendige middel wat aktief is in hierdie sarkoom van die hoender as 'n
klein parasitiese organisme. Analogie met verskeie aansteeklike siektes van die mens en
die laer diere, wat deur ultramikroskopiese organismes veroorsaak word, gee ondersteuning hiervoor
siening van die bevindinge, en tans werk word gerig op die eksperimentele
verifikasie. Maar 'n agentskap van 'n ander soort is nie buite die kwessie nie. dit is
denkbaar dat 'n chemiese stimulant, ontwikkel deur die neoplastiese selle, kan
veroorsaak die gewas in 'n ander gasheer en bring gevolglik 'n verdere
produksie van dieselfde stimulant". 44

Om die virale proteïene te karakteriseer

Die enigste manier om te bewys dat 'n proteïen 'n bestanddeel van 'n voorwerp is, is om
verkry dit van daardie voorwerp, of wanneer die voorwerp baie klein is soos die geval is
virusse, van materiaal wat uit gesuiwerde virusdeeltjies bestaan. As die materiaal
onsuiwerhede bevat wat proteïene is of proteïene bevat, is dit nie moontlik nie
om vas te stel wat viraal is en watter nie. Tog eers na die virale
proteïene word gekenmerk as dit moontlik is om dit as antigene in teenliggaampies te gebruik
toetse.

Om die virale genoom te karakteriseer

Soos virale proteïene die enigste manier om te bewys dat 'n stuk RNA virale is
is om dit te verkry van materiaal wat niks anders as virusdeeltjies bevat nie.
As die materiaal onsuiwerhede bevat, moet die onsuiwerhede nie RNA insluit nie. Toe
en eers dan kan die RNA en sy komplementêre DNA (cDNA) as probes en
primers vir genomiese hibridisasie en PCR studies.

Om op te tree as 'n goue standaard vir die teenliggaamtoetse

Die reaksie van 'n virus of virale proteïen met 'n teenliggaam teenwoordig in 'n
pasiënt se serum nie bewys dat die teenliggaam geïnduseer word deur of gerig word nie
teen die virus of 'n virale proteïen. Dit wil sê, dit bewys nie die reaksie is nie
spesifiek. Dit is omdat daar beduidende struikelblokke is wat die
interpretasie van teenliggaam/antigeen reaktiwiteit insluitend nie-spesifiek
stimulasie, kruisreaktiwiteit of albei. Kruisreaktiwiteit is die gevolg van teenliggaampies
molekules, selfs monoklonale teenliggaampies, wat nie net interaksie met die induserende
antigeen, maar ook met ander antigene. Inderdaad, daar is gevalle waar
"kruisreaktiewe teenliggaampies kan hoër affiniteit met ander antigene hê
as die induserende antigeen. Selfs antigene wat vir die grootste deel van hul struktuur verskil
kan een determinant deel, en 'n monoklonale teenliggaam wat hierdie terrein herken, sou
gee dan 'n 100% kruisreaksie. 'n Voorbeeld is die reaksie van outo-teenliggaampies in
lupus met beide DNA en kardiolipien. Dit moet beklemtoon word dat die deel van a
"determinant" beteken nie dat die antigene identies bevat nie
chemiese strukture, maar eerder dat hulle 'n chemiese ooreenkoms het wat kan
nie goed verstaan ​​word nie, byvoorbeeld 'n verspreiding van oppervlakladings".
Aangesien poliklonale teenliggaampies samestellings van monoklonale teenliggaampies is, is hierdie feite
dien eweredig, indien nie meer nie, toe op poliklonale teenliggaampies. Hierdie feite was
omvattend ontgin in kliniese medisyne vir die diagnose van siektes soos
sifilis en aansteeklike mononukleose. In hierdie siektes, T. pallidum en
Epstein-Barr-virus veroorsaak die voorkoms van teenliggaampies wat met oshart reageer
proteïene en rooibloedselle van skape en perde. Dit beteken egter nie so nie
pasiënte is "besmet" met os-hart, of perd rooibloedselle en
die siektes word deur hierdie middels geïnduseer. Die enigste manier om te bepaal die
spesifisiteit van 'n teenliggaam/antigeen reaksie is om 'n onafhanklike metode te gebruik, a
goue standaard om die teenwoordigheid of afwesigheid van die antigeen te bewys. Die enigste moontlike
goue standaard vir 'n toets om te bewys dat 'n virusinfeksie die betrokke virus is.
Dit wil sê, virus isolasie/suiwering.

METODES VIR DIE ISOLASIE/SUIVERING VAN RETROVIRUS-agtige deeltjies

Tot en met die 1950's is retrovirusse egter deur filtrasie geïsoleer/gesuiwer
hierdie metode was minder as bevredigend. Met die ontwikkeling van die elektron
mikroskoop, blykbaar, vir sommige retroviroloë, die opsporing van
retrovirusagtige deeltjies is voldoende geag om die bestaan ​​van 'n
retrovirus. Ander wetenskaplikes, insluitend die bekende retroviroloog,
JW Beard, het erken dat selle, insluitend onbesmette selle, onder verskeie
toestande, was verantwoordelik vir die generering van 'n heterogene verskeidenheid van
deeltjies sommige met die voorkoms van retrovirusse. Baard beklemtoon:
"identifikasie, karakterisering en analise is onderhewig aan bekende
dissiplines wat deur intensiewe ondersoeke gevestig is, en die moontlikhede het
geensins uitgeput nie. Vreemd genoeg is dit die meeste op hierdie gebied
gereelde tekortkominge word gesien. Dit hou by tye verband met ontduiking van
dissiplines of die toepassing daarvan op ongeskikte materiale. Soos voorsien is,
baie van die belangstelling in die meer vervelige aspekte van deeltjie-isolasie en
analise is afgelei deur die eenvoudiger en ongetwyfeld insiggewende prosesse
van elektronmikroskopie. Alhoewel baie vinnig met die instrument geleer kan word, Dit
is nietemin duidelik dat die resultate wat daarmee verkry word, nooit kan vervang nie, en
al te dikwels kan verduister, die behoefte aan die kritiese fundamentele ontledings wat
is afhanklik van toegang tot homogene materiale
" (ons s'n kursief).

Teen die 1970's was daar algemene ooreenkoms dat "Virions of RTV
[retrovirusse] het 'n kenmerkende dryfdigtheid, en sentrifugering tot
ewewig in digtheidsgradiënte is die voorkeurtegniek vir suiwering van
RTV". Die metode van bande in digtheidsgradiënte is ook nie ideaal nie.
Ander stowwe as retrovirusse kan teen dieselfde digtheid bande. Dit is hoekom by
'n vergadering gehou by die Pasteur Instituut in 1972, Francoise Barre-Sinoussi en
Jean-Claude Chermann het beklemtoon dat om suiwering van retrovirus-agtige te eis
deeltjies wat sukrosedigtheidsgradiënte gebruik, is absoluut nodig om te bewys,
met behulp van die elektronmikroskoop, dat die 1,16 gm/ml-band niks anders bevat nie
maar deeltjies met "geen duidelike verskille in fisiese voorkoms nie".

DIE VERSKYNSELS HET GEVAAR OM DIE BESTAAN VAN MIV te bewys

In Mei 1983 Luc Montagnier, Francoise Barre-Sinoussi, Jean-Claude Chermann
en kollegas het 'n referaat in Wetenskap getiteld, "Isolasie van
'n T-limfotropiese retrovirus van 'n pasiënt met 'n risiko vir Verworwe Immuniteit
Tekortsindroom (VIGS)". Dit is die referaat wat sedert die resolusie
van die polemiek tussen Montagnier en Gallo aangaande bewerings van
wanbesteding deur laasgenoemde van die Franse virus wat deur die Pasteur na die VSA gestuur is
Instituut, word aanvaar as die studie wat die bestaan ​​van MIV bewys het.
Daar is getoon dat mitogeen limfklierselkulture van 'n gay gestimuleer het
man (BRU) met limfadenopatie kon die sintetiese RNA transkribeer
primer-template An.dT15. Uit hierdie data Montagnier en sy kollegas
tot die gevolgtrekking gekom dat BRU se limfklierselle met 'n retrovirus besmet is. Die
bevinding van dieselfde aktiwiteit in die supernatant van 'n kokultuur wat bestaan ​​uit die
dieselfde selle met gestimuleerde limfosiete van 'n gesonde individu is oorweeg
bewys vir virusoordrag sowel as isolasie. In 'n ander eksperiment
supernatante van die kokulture is by twee, drie dae oud, gestimuleerde gevoeg
naelstring limfosiete kulture. “Elektronmikroskopie van die besmette
naelstring limfosiete het kenmerkende onvolwasse deeltjies getoon met digte
halfmaan (C-tipe) wat by die plasmamembraan bot". Supernatant van die
kultuur is in sukrose digtheidsgradiënt gebind en die 1.16 gm/ml band is getoon
om An.dT te transkribeer15. Die proteïene in die 1.16 gm/ml band asook
die proteïene van 'n sellulêre ekstrak is volgens hul molekulêre geskei
gewig met behulp van "denaturerende buffer en geëlektroforeer op 12,5 persent
poliakrielamied-SDS-plaatgel". Wanneer die stroke met 'n mens geïnkubeer is
sera baie proteïene uit die sellulêre ekstrakte is gevind om met serum te reageer
van BRU, nog 'n gay man sowel as 'n "gesonde skenker". In die stroke
wat die proteïene van die 1.16 gm/ml band bevat drie proteïene insluitend 'n p25
('p' vir proteïen, 25 vir sy molekulêre gewig in duisende) is gevind
reageer. Hulle het ook berig dat die p25 nie met teenliggaampies teen HTLV-I gereageer het nie.
Daar word beweer dat die materiaalband by 1,16 gm/ml "gesuiwer, gemerk,
virus" hoewel geen elektronmikroskopiese data aangebied is nie. Die outeurs
tot die gevolgtrekking gekom: "'n Retrovirus wat aan die familie van onlangs ontdek
menslike T-sel leukemie virusse (HTLV), maar duidelik onderskei van elke vorige
isoleer, is geïsoleer van 'n Kaukasiese pasiënt met tekens en simptome wat
gaan dikwels die verworwe immuungebreksindroom (VIGS) vooraf. Hierdie virus is 'n
tipiese tipe-C RNA tumorvirus, knoppe van die selmembraan, verkies magnesium
vir omgekeerde transkriptase-aktiwiteit, en het 'n interne antigeen (p25) soortgelyk aan
HTLV p24".

Robert Gallo en sy medewerkers het nie die Montagnier-groepdata as beskou nie
bewys van "ware isolasie". So laat as 1997, in 'n boek uitgegee deur een
van die bekendste MIV-kenners, Jaap Goudsmit, lees een: “Die BRU-limf
node is vroeg in Januarie 1983 vir die eerste keer gekweek en op 15 Januarie het dit 'n
ensiem absoluut uniek aan die lentivirusgroep. [Die ensiem is nie eens nie
spesifiek vir retrovirusse baie minder aan Lentivirusse (sien onder)]. Die BRU
virus het stadig en met moeite gegroei, maar sy identiteit en aktiwiteit was
berig in die uitgawe van 20 Mei 1983 van Wetenskap. Die Pasteur Groep was
wyd geprys, maar baie bekommerd. In die wêreld van virologie, vind 'n nuwe virus
is nie genoeg nie: Jy moet die organisme voortplant en isoleer vir ontleding deur ander
viroloë. Die Franse het nog nie hul nuwe lentivirus geïsoleer nie.”

Waarom het dan: (a) Gallo, wat die Montagnier-manuskrip geresenseer het, aanbeveel
sy publikasie? (b) al die MIV-kundiges, insluitend Gallo en Goudsmit (op bl
24 van sy boek een lees: "BRU was die eerste stam wat geïsoleer is")
aanvaar dat die eerste isolasie van MIV en dus van die bestaan ​​daarvan bewys is in
Mei 1983 Wetenskap papier?

’n Jaar later, in Mei 1984, het Gallo, Popovic en hul kollegas vier gepubliseer
papiere in Wetenskap waarin hulle aanspraak gemaak het op "isolasie" van 'n ander
retrovirus van vigspasiënte. Maar, bykomend tot die gebruik van 'n leukemie
sellyn, die enigste verskil tussen die Montagnier- en Gallo-groepe se data
kwantitatief was. In die eerste referaat getiteld "Opsporing, isolasie en
Deurlopende produksie van sitopatiese retrovirusse (HTLV-III) van pasiënte met
VIGS en pre-VIGS", (HTLV-III=MIV), eksperimente is beskryf waarin
"gekonsentreerde kultuurvloeistowwe geoes vanaf korttermyn [mitogenies
gestimuleerde] kulture van T-selle" van pasiënte met vigs of pre-vigs was
gekweek met 'n mitogenies gestimuleerde leukemiese sellyn HT en hoogs
geselekteerde klone verkry deur HT te kweek met bestraalde selle van 'n gesonde
skenker. Die data wat as bewys van isolasie van MIV aangebied is, was: (a) RT-aktiwiteit in
selvrye supernatante en die 1.16 gm/ml band (b) reaksie in die kulture
met "Konyn antiserum teen HTLV-III" en "Pasiënt serum (E.T.)"
(c) EM wat die teenwoordigheid van retrovirale-agtige deeltjies in die kulture toon.

'N Ondersoek gedoen deur die National Institutes of Health Office of
Wetenskaplike Integriteit het bevind dat die HT-sellyn nie met gekweek is nie
gekonsentreerde vloeistowwe (supernatant) afkomstig van individuele vigspasiënte, maar
met gekonsentreerde vloeistowwe wat aanvanklik uit individuele kulture van drie saamgevoeg is
pasiënte en uiteindelik uit die individuele kulture van tien pasiënte. In
getuienis gelewer aan hierdie ondersoek die rede wat gegee is, was omdat nie een van die
supernatante "het individueel hoë konsentrasies van omgekeerde geproduseer
transkripsie". Met ander woorde, Gallo en sy kollegas het nie die
vlakke van RT van individuele kulture as bewys dat individuele monsters
'n retrovirus bevat. Die Gallo-ondersoek het die samevoeging van monsters gevind
om "van twyfelagtige wetenskaplike strengheid" te wees. Een wetenskaplike het die
prosedure as "regtig mal". Die belangrikste is hoe kon Gallo die gebruik
reaksie met konyn antiserum om MIV-isolasie (suiwering) te bewys wanneer, om
kry konyn antiserum konyne moet eers ingespuit word met suiwer MIV? dit is
onverklaarbaar hoe Gallo en sy kollegas reeds "Rabbit
serum na HTLV-III" voordat hulle die bestaan ​​van 'n nuwe virus bewys het.
As die antiserum egter vervaardig is "van hase wat besmet is
herhaaldelik met ontwrigte HTLV-III", dit wil sê die materiaalband by 1.16
gm/ml, sou 'n mens verwag om teenliggaampies teen al die proteïene wat daaruit bestaan ​​te verkry
hierdie materiaal selfs al was die proteïene sellulêr en nie viraal nie.

In die tweede referaat getiteld "Gereelde opsporing en isolasie van
Sitopatiese retrovirusse (HTLV-III) van pasiënte met vigs en met die risiko van
VIGS", het Gallo en sy kollegas beweer dat hulle HTLV-III "geïsoleer" het
(MIV) van 26/72 (36%) van VIGS-pasiënte. In hierdie vraestel is isolasie gedefinieer as
"meer as een van die volgende": "herhaalde opsporing van 'n Mg 2+ -afhanklike
omgekeerde transkriptase aktiwiteit in supernatant vloeistowwe virus waargeneem deur elektron
mikroskopie (EM) [retrovirusagtige deeltjies in die kultuur] intrasellulêr
uitdrukking van virusverwante antigene opgespoor met teenliggaampies vanaf seropositiewe
skenkers of met konyn antiserum teen HTLV-III of oordrag van deeltjies".
Oordrag van deeltjies is gedefinieer as "opgespoor deur RT-toetse of deur
elektronmikroskopiese waarneming, tot vars menslike [naelstring] bloed, been
murg, of perifere bloed T limfosiete", gekweek met supernatante van
die "besmette" kulture. (Dit kan gesien word dat die Gallo-groepmetode
"isolasie" van 'n retrovirus toegelaat sonder bewyse vir een van die twee
deeltjies of RT).

In die derde vraestel, proteïene van die 1,16 gm/ml band wat hulle beweer was
"gesuiwerde" MIV, sowel as die proteïene van die "besmette"
selle, is "gelys en gefraksioneer deur elektroforese op 'n 12%
poliakrielamiedplaatgel in die teenwoordigheid van SDS. Die proteïenbande was
elektroforeties oorgedra na 'n nitrosellulose-vel" en gereageer met
verskillende sera. Met ander woorde, Gallo het 'n tegniek gebruik wat bekend staan ​​as Western
klad (WB) teenliggaampie toets. Baie proteïene van die sellulêre uittreksel is gevind
reageer met sera van beide pasiënte en gesonde individue. Hulle het ook gerapporteer
dat twee proteïene van die 1,16 gm/ml-band, p24 en p41, met pasiënt gereageer het
sera. Om hierdie en geen ander rede is daar beweer dat "hierdie molekules is
die hoofkomponente van die virusvoorbereiding. p24 en p41 kan dus wees
beskou as die virale strukturele proteïene". Wat morfologie betref
bekommerd, het die Gallo-groep berig dat die MIV-deeltjie "in
hoë getalle van besmette selle deur bot uit die plasmamembraan. 'n moontlike
Die unieke kenmerk van hierdie virus is die silindriese kern wat in baie waargeneem word
volwasse virions. HTLV-III is 'n ware lid van die HTLV-familie". (HTLV's is
tipe C retrovirale deeltjies en nie Lentivirusse soos MIV beweer word
wees).

In die vierde vraestel, in plaas daarvan om die proteïene te skei wat by 1.16 geband het
gm/ml en inkubeer dit dan met pasiëntsera, die mengsel van alle proteïene
gebruik is, dit wil sê, hulle het 'n toets uitgevoer wat bekend staan ​​as ensiemgekoppelde immunosorbent
toets (ELISA). “Om die molekulêre aard van die antigene te verstaan
erken deur ELISA", het hulle ook WB uitgevoer, met van die sera. Hulle
berig dat: "Serummonsters van 88 persent van pasiënte met vigs en
van 79 persent van homoseksuele mans met tekens en simptome wat gereeld
vigs voorafgaan, maar van minder as 1 persent van heteroseksuele vakke, het
teenliggaampies wat teen antigene van HTLV-III reageer. Die belangrikste immuunreaktiwiteit
blyk gerig te wees teen p41, die veronderstelde koevertantigeen van die virus ... Die
data wat hier en in die meegaande verslae aangebied word, dui daarop dat HTLV-III die
primêre oorsaak van vigs". Twee jaar later het Gallo geskryf dat "Die resultate
aangebied in ons vier referate verskaf duidelike bewyse dat die etiologie van
VIGS en LNR was die nuwe limfotropiese retrovirus, HTLV-III
" 67
(ons s'n kursief).

Soos genoem, afgesien van die kwantitatiewe verskil, is die Gallo-groep
eksperimente verskil nie van dié wat Montagnier en syne uitgevoer het nie
kollegas. Dit volg dan dat indien Montagnier se groepdata nie bewys nie
"ware isolasie" het ook nie Gallo s'n of enigiemand anders s'n nie, want om
datum almal het (vir die oorgrote meerderheid slegs 'n gedeelte daarvan) dieselfde herhaal
eksperimente as hierdie twee groepe. Dit is van deurslaggewende belang dat nie een nie
groep het die gebruik van geldige kontroles aangemeld (sien hierbo) en het ook nie bewys dat hulle dit het nie
verkry gesuiwerde retrovirus-agtige deeltjies. Die vraag is dan, doen die data
verkry deur die Montagnier en Gallo groep, dit is RT, deeltjies in kultuur en
antigeen/teenliggaam reaksies bewys die isolasie van 'n unieke, of selfs 'n
retrovirus, enige retrovirus?

Sonder twyfel, as 'n mens deur isolasie 'n bewys van reiniging verwag, dan is die
opsporing van 'n ensiem, of retrovirusagtige deeltjies in 'n kultuur, of proteïene
óf in die selle óf die 1,16 gm/ml-band wat reageer met teenwoordige teenliggaampies
in menslike of dier sera, voldoen nie. Om anders te argumenteer moet mens die definieer
opsporing van hart- of lewerensieme in die bloed van pasiënte wat aan bors ly
pyn of geelsug as bewys vir isolasie van die menslike hart of lewer. Net so,
as 'n teenliggaam/antigeen reaksie bewys is vir isolasie van 'n virus, dan teenliggaam
reaktiwiteit op die proteïen βHCG is bewys vir isolasie van die mens
plasenta. Die bewering dat die opsporing van 'n retrovirusagtige deeltjie in 'n
kultuur bewys dat isolasie nie anders is as om te beweer dat die opsporing van a
visagtige wese in die see is dieselfde as om 'n definitiewe vis in jou te hê
braaipan. Die opsporing van RT, retrovirus-agtige deeltjies en teenliggaampies/antigeen
reaktiwiteit kan slegs as bewys beskou word vir die opsporing van 'n retrovirus, en
dan as, en slegs as, daar vooraf kennis is dat die drie verskynsels is
spesifiek vir retrovirusse.

Om te beweer dat die opsporing van hierdie verskynsel die bestaan ​​van 'n nuwe bewys
retrovirus moet 'n mens bewys hê dat ten minste een van die drie verskynsels is
verskil van dié wat in alle ander bekende retrovirusse waargeneem word.

Omgekeerde transkripsie

Tans beskou sommige van die voorste MIV-navorsers RT as die
"sine qua non" van retrovirusse en beskou die opsporing van
omgekeerde transkripsie in limfosietkulture van vigspasiënte nie net as
bewys van die teenwoordigheid van sulke virusse maar van MIV self, insluitend MIV-isolasie
en kwantifisering. Maar volgens sommige van die bekendstes
retroviroloë insluitend die ontdekker daarvan, sowel as die Nobelpryswenner en
voormalige Direkteur van die Amerikaanse Nasionale Instituut van Gesondheid Harold Varmus, omgekeerd
transkriptases is teenwoordig in alle selle sowel as bakterieë en virusse.
“Omgekeerde transkripsie (RT) is eers as ’n noodsaaklike katalisator ontdek
in die biologiese siklus van retrovirusse. Maar in die afgelope jaar, bewyse
het opgehoop wat toon dat RT'e betrokke is by 'n verbasend groot aantal
RNA-gemedieerde transkripsiegebeurtenisse wat beide virale en nievirale genetiese insluit
entiteite". Selfs as RT slegs 'n eienskap van virusse was, is dit nie spesifiek vir
retrovirusse. Volgens Varmus, "Omgekeerde transkripsie is 'n toegeken
sentrale rol in die replikasie van ander virusse [hepatitis B en blomkool
mosaïekvirusse] en in die transponering en generering van ander soorte
eukariotiese DNA". "Die hepatitis B-virusse (HBV's) is klein DNA-virusse
wat aanhoudende lewerinfeksies in 'n verskeidenheid dieregashere en
repliseer hul DNA-genome via omgekeerde transkripsie van 'n RNA-tussenproduk.
Alle lede van hierdie gesin bevat 'n oop leesraam (ORF), "P"
(vir pol), wat homoloog is aan retroviraal pol gene" [pol=polimerase].
"Hepatitis B-virus (HBV) lyk soos retrovirusse, insluitend MIV, in verskeie
respekteer. In die besonder, beide virusse bevat omgekeerde transkriptase, en
repliseer deur 'n RNA-tussenproduk". As gevolg hiervan was dit
voorgestel dat hepatitis B-infeksie daarmee behandel moet word
antiretrovirale middels as MIV-infeksie.

Tans bestaan ​​bewyse wat toon dat alhoewel die belangrikste teikenorgaan
vir hepatitis B-virus is die lewer, ander selle as hepatosiete "insluitend
limfosiete en monosiete van perifere bloed, kan met HBV besmet raak".
Limfosietstimulasie in die algemeen en PHA ('n middel wat in die meerderheid van
kulture met weefsels van vigspasiënte), word geassosieer met die produksie van
hepatitis B-virus van perifere bloed limfosiete by pasiënte wat besmet is met
HBV insluitend "virale replikasie in chroniese hepatitis B infeksie van
kinderjare". Hepatitis B-virusinfeksie is wydverspreid in die VIGS-risiko
groepe.

In die vroeë 1970's het Gallo bewys dat kulture van leukemiese selle transkribeer
die An.dT15 sjabloon-primer net soos materiaalbanding teen 1,16 gm/ml
afkomstig van "PHA gestimuleerde (maar nie ongestimuleerde normale menslike bloed nie
limfosiete". Lees die Gallo 1984 Wetenskap papier die indruk
word verkry dat die leukemiese HT-sellyn en dus sy klone, insluitend H9
wat Gallo gebruik het, was 'n nuwe sellyn wat in Gallo se laboratorium ontwikkel is. Maar
dit is nou bekend dat die HT-sellyn die HUT78-sellyn is wat ontstaan ​​het
van 'n pasiënt met volwasse T-sel leukemie, 'n siekte wat Gallo beweer is
veroorsaak deur die retrovirus, HTLV-I. 'n Jaar vroeër het Gallo beweer dat hy bewys het
dat die HUT78-selle met HTLV-I geïnfekteer is. As dit die geval is, die Gallo
groep sou RT in hul kulture opgespoor het selfs al is die ensiem spesifiek vir
retrovirusse en die kulture was nie met MIV besmet nie. Ander navorsers
gerapporteerde RT-aktiwiteit in normale nie-geïnfekteerde spermatozoa.

Dit moet ook daarop gewys word dat die teenwoordigheid van MIV omgekeerde transkripsie
is opgespoor deur beide Montagnier en Gallo, (en alle MIV-kundiges sedertdien)
indirek, dit wil sê deur die transkripsie van die templaat-primer An.dT15.
Ten minste in 1984, indien nie 1983 nie, het Montagnier en sy kollegas egter geweet dat
in die 1970's was daar bewyse dat "Tussen 'n aantal sjabloon primers, (rA)n.(dT)12-18
is die meeste gebruik aangesien RT hoë aktiwiteit hiermee toon
sjabloon primer. Die probleem is egter dat die sellulêre DNA-polimerases (pol b
en pol g ) gebruik ook effektief dieselfde
template primer". Trouens, in 1975, 'n internasionale konferensie oor
eukariotiese DNA-polimerases het DNA-polimerase γ as die sellulêre ensiem gedefinieer
wat "kopieë An.dT 15
met hoë doeltreffendheid, maar kopieer nie DNS goed nie.” Een jaar vroeër Gallo
geskryf: "Onder toepaslike reaksietoestande kan DNA-polimerase β
doeltreffend transkribeer poli (A) geprimeer deur oligo (dT)". Dit is dus moontlik
om transkripsie van An.dT op te spoor15 selfs wanneer geen RT, hetsy virale of
sellulêre, teenwoordig is, veral onder die toestande wat gebruik word om die te bewys
bestaan ​​van MIV.(Beide Montagnier en Gallo aanvaar dat die verskynsels opgespoor is
in kulture wat na bewering MIV-isolasie bewys, kan nie opgespoor word tensy die
selle word chemies gestimuleer). Deesdae is die nie-spesifisiteit van RT
selfs in die populêre pers uitgesaai aan lesers wat die aankoop van oorweeg
aandele in biotegnologiemaatskappye.

Ten slotte, selfs al aanvaar mens Montagnier en Gallo se groepe’
definisie van isolasie, gegewe dat RT'e en omgekeerde transkripsie is
nie-spesifiek vir retrovirusse, hul opsporing selfs in 'n onbeperkte aantal van
opeenvolgende kulture/ko-kulture kan nie as bewys vir isolasie beskou word nie en
voortplanting van 'n retrovirus.

Montagnier en sy kollegas het MIV aanvanklik as 'n tipe C-deeltjie aangemeld,
dan as 'n tipe D deeltjie en dan as 'n Lentivirus. In 1984 het Gallo en syne
kollegas het MIV as 'n tipe C-deeltjie aangemeld. In 1985 het Gallo egter geskryf:
“’n Moontlike unieke kenmerk van die virions is die silindriese kern wat waargeneem word
in baie vermoedelik volwasse virions. Virions met hierdie tipe kern was
gereeld aangemeld vir sekere tipe D retrovirusse, en in sommige gevalle, vir
tipe C retrovirusse". Jay Levy het MIV as 'n tipe D-deeltjie aangemeld. Ander by
die Universiteit van Kalifornië het geskryf dat "Vigs-virus geïsoleerde vertoning
morfologiese kenmerke van tipe C, tipe D en lentivirusse". Volgens
aan Anthony Fauci en ander" "T-selle en makrofage hanteer die virus
baie anders. In die T-sel bot virus uit die eksterne plasmamembraan
van die sel. In die monosiet/makrofaagkulture bot dit tot membraangebonde
vesikels binne die selle". Laasgenoemde is 'n beskrywing van 'n tipe A,
retrovirale deeltjie. So het die voorste MIV-kenners MIV as 'n lid beskryf
van twee subfamilies en drie genera van Retroviridae. Hierdie taksonomiese
verskille impliseer dat as MIV 'n nuut ontdekte soogdier was, dit kon gewees het
óf mens, 'n gorilla of 'n orangoetang. Deur konsensus tans MIV is
beskou as 'n Lentivirus. Hierdie ooreenkoms is bereik toe dit gerealiseer is
dat in "MIV" positiewe individue VIGS nie kort daarna verskyn het nie
"infeksie", hoewel die benaming Lentivirus is 'n
morfologiese beskrywing.

"MIV besmette kulture" bevat bykomend tot die deeltjies met
die morfologie wat aan MIV toegeskryf word baie ander "virale deeltjies". Vir
voorbeeld: Hockley en sy kollegas van die Elektronmikroskopie en Fotografie
Afdeling en Afdeling Virologie by die Nasionale Instituut vir Biologiese
Standaarde en beheer in die Verenigde Koninkryk beskryf 'n oorvloed van deeltjies
wat hulle breedweg in drie groepe verdeel, volwasse, ringagtige en klein saam
spykers. Die volwasse deeltjies "was ongeveer sferies in vorm en 100
tot 150nm in deursnee. Die buitenste lipiedmembraan was gereeld gebreek of afwesig
in plekke, en daar was geen bewyse van oppervlak spykers. 'n Paar volwasse deeltjies
is gevind wat groter as die gemiddelde was en blykbaar 'n dubbele bevat
nukleoïed. in die voorbereiding van MIV was daar altyd baie vesikels met
korrel inhoud waarin dit nie moontlik was om 'n duidelike nukleoïed te herken nie".
Ook, "Die ringagtige deeltjies het 'n meer konsekwent sferiese vorm gehad en
was groter (140nm in deursnee)" en die klein deeltjies "was
buitengewoon sferies maar soms effens hoekig in vorm en 65 tot 90nm in
diameter" en het spykeragtige uitsteeksels op hul oppervlak gehad. Hans Gelderblom
wat die meeste van die EM-studies in MIV/VIGS-navorsing gedoen het, het gemeld dat alhoewel Lentivirusse
en dus word MIV beskou as 'n keëlvormige kern, hy en sy kollegas
sentrosimmetriese en buisvormige kerne ook gevind. Die byskrif by een foto
lees: "Virions kan gesien word met óf verlengde, 'stokagtige' buisvormig
kerns 30-35nm in deursnee of wat meer as een kern bevat. Buisvormig en gereeld
keëlvormige kerne kan saam bestaan ​​binne een virion". Die teks sê:
“Selde, buisvormige kernstrukture wat herinner aan knuppels met ’n deursnee van
30-35nm en 'n lengte van 150-250nm word waargeneem". Lekatsas en ander
viroloë van Pretoria en Johannesburg het berig: “Ons het die
kenmerkende silindriese struktuur in die kern as 'n identifisering
kenmerkend vir die virus om dit te onderskei van sellulêre puin en ook
opgemerk dat dit aansienlik kan verskil in sy afmetings en morfologies
kenmerke. Ons het twee basiese virusdeeltjiegroottes gevind, 90nm en 120nm, albei
in groot getalle teenwoordig. Die groter deeltjie dra geen oppervlakprojeksies terwyl
die kleiner deeltjie is selde 'naak' en dra gewoonlik projeksies". Die
Amerikaanse CDC het berig: MIV-deeltjies is "gewoonlik rond en het 'n deursnee van
ongeveer 85-95nm. Virus met staafvormige nukleoïede en deeltjies met 'n traandruppel
vorm word soms algemeen gesien in HTLV-III/LAV-geïnfekteerde limfosiete
ringvormige deeltjies sonder digte nukleoïede word ook gesien". Die vraag
ontstaan ​​dan as die deeltjies met die "unieke" morfologie in ag geneem word
om MIV te wees, verteenwoordig 'n eksogene retrovirus wat afkomstig is van weefsels van VIGS
pasiënte of diegene in gevaar, wat is dan die oorsprong en rol van die baie nie-MIV
deeltjies en watter, indien enige, van die "MIV" of nie-MIV deeltjies band by
1,16 g/ml? Dit wil sê, wat het die digtheid kenmerkend van retrovirusse?
Retrovirus-agtige deeltjies is gevind in nie-MIV-besmette naelstringbloed
limfosiete selkulture en in selle wat gebruik word vir MIV "isolasie" soos
as en H9 (HUT-78), CEM, C8166 en EBV getransformeerde B-selle. Retrovirus-agtig
deeltjies wat antigeen verwant aan MIV is gevind in speekselkulture
klierekstrakte van pasiënte met Sjorgen se sindroom. In die enigste EM-studie,
óf in vivo of in vitro waarin geskikte kontroles gebruik is
en waarin uitgebreide blinde ondersoek van kontroles en toetsmateriaal was
uitgevoer is, is deeltjies wat nie van "MIV" onderskei kan word nie in 18/20 gevind
(90%) van vigs sowel as in 13/15 (87%) van nie-vigsverwante limfkliere
vergrotings. Dit het daartoe gelei dat die skrywers tot die gevolgtrekking gekom het: "Die teenwoordigheid van sulkes
deeltjies dui nie op sigself infeksie met MIV aan nie."

Dit is van deurslaggewende belang om daarop te let dat:

  1. Soos Hans Gelderblom en sy kollegas in 1998 uitgewys het, het niemand tot op datum nie
    het die teenwoordigheid van "aansteeklike plasma MIV" aangemeld.
  2. In geen "MIV-geïnfekteerde" kulture is daar deeltjies wat vertoon nie
    beide belangrikste morfologiese kenmerke van retrovirusse, dit wil sê,
    "'n deursnee van 100-120nm" EN oppervlaktes wat "gesaai is
    met projeksies (spikes, knoppe)". Die elektronmikroskopist stem saam dat
    die "MIV"-deeltjies is sonder knoppe en dus van die
    "MIV"-proteïen gp120 (sien hieronder) word gesê dat dit die samestellende proteïen is
    van die knoppe.

Hans Gelderblom en sy kollegas het dit onmiddellik daarna beraam
word vrygestel uit die selmembraan "MIV-deeltjies" besit 'n
gemiddeld 0,5 knoppe per deeltjie wat vinnig verlore gaan, maar ook uitgewys
dat "dit moontlik was dat strukture wat lyk soos knoppe, waargeneem kan word
selfs wanneer daar geen gp120 [knoppe] teenwoordig was nie, d.w.s. vals positiewes." Tog
alle MIV-kenners stem saam dat die aansteeklikheid van die MIV-deeltjies bepaal word deur
die gp120 (knoppies). Dus, volgens Montagnier et al, "Die gp120
is verantwoordelik vir die binding van die CD4-reseptor" terwyl vir Matthews en
Bolognesi, "Eerste bind gp120 aan die CD4-reseptor op 'n onbesmette sel
dan raak gp41 geanker in die aangrensende membraan langs die twee membrane
begin saamsmelt, en die virus mors sy inhoud in die sel.” Callebaut et
al
verklaar, "Die menslike immuniteitsgebrekvirus (MIV) besmet limfosiete,
monosiete en makrofage deur te bind aan sy hoofreseptor, die CD4
molekule, deur die virale omhulsel glikoproteïen gp120. Die V3-lus van gp120 is
kritiek vir MIV-infeksie." Ander stem volkome saam.

Die algemene ooreenkoms dat gp120 (knoppies) absoluut noodsaaklik is vir MIV
deeltjies om aansteeklik te wees en die feit dat hierdie proteïen (knoppies) nie teenwoordig is nie
in die sel vrye deeltjies lei tot een onvermydelike gevolgtrekking, dit is, die
"MIV"-deeltjies is nie aansteeklik nie, dit is nie virale deeltjies nie.
Verder het

  1. Om naelstring limfosiete en die HUT-78 selle Montagnier en te besmet
    Gallo het selvrye vloeistowwe (supernatante) gebruik. Montagnier gekweekte naelstring
    koord limfosiete met supernatant van die kokulture van limfosiete van
    BRU gekweek met limfosiete van 'n gesonde individu. Gallo gekweek die
    HUT-78 sellyn met supernatante van die kulture van tien
    "besmette" individue. Selfs al het die supernatante bevat
    deeltjies, aangesien dit selvry is, sal die deeltjies sonder knoppe wees (gp120),
    dit wil sê, hulle sou nie aansteeklik gewees het nie. Dit beteken dat selfs al
    Montagnier en Gallo het bewyse gehad dat hul naelstring en HUT-78 gekloon het
    kulture het deeltjies bevat met al die morfologiese kenmerke van
    retrovirusse, dat in sukrose digtheid gradiënte die deeltjies geband by die
    1,16 gm/ml band en die band het niks anders as deeltjies bevat nie, die
    deeltjies kon nie van hul pasiënte afkomstig wees nie. Verder, sedert
    die enigste monsters wat die Pasteur-instituut aan die Gallo-laboratorium gegee het
    selvry was, moet 'n mens die grondslag waarvan Gallo beskuldig is, bevraagteken
    wanbesteding van die Franse virus.
  2. Dit word algemeen aanvaar dat hemofilie met MIV besmet word deur
    besmette faktor VIII. Niemand het egter tot op hede die teenwoordigheid aangemeld nie
    van "MIV"-deeltjies in plasma. Selfs al was sulke deeltjies teenwoordig
    die deeltjies sal sonder gp120 wees. Aangesien gp120 "deurslaggewend is vir
    MIV se vermoë om nuwe selle te besmet" is dit nie moontlik vir hemofilie nie
    om deur middel van faktor VIII-toediening met MIV besmet te word. Daar is 'n ander
    fundamentele rede waarom dit onmoontlik is vir hemofilie om besmet te word
    met "MIV" van "besmette" faktor VIII. Volgens
    'n publikasie van die CDC, 112 "Om data te bekom oor
    die oorlewing van MIV, laboratoriumstudies het die gebruik van vereis
    kunsmatig hoë konsentrasies van laboratorium gekweekte virus. die bedrag van
    virus wat bestudeer is, word nie in menslike monsters of enige ander plek in gevind nie
    natuur. dit versprei nie of handhaaf aansteeklikheid buite sy gasheer nie.
    Alhoewel hierdie onnatuurlike konsentrasies van MIV onder lewendig gehou kan word
    presies beheerde en beperkte laboratoriumtoestande, het CDC-studies
    getoon dat droog van selfs hierdie hoë konsentrasies van MIV verminder die
    aantal aansteeklike virusse met 90 tot 99 persent binne 'n paar uur. Sedert
    die MIV-konsentrasies wat in laboratoriumstudies gebruik word, is baie hoër as dié
    eintlik gevind in bloed of ander liggaamsmonsters, droog van MIV-besmette
    menslike bloed of ander liggaamsvloeistowwe verminder die teoretiese risiko van
    omgewingsoordrag na dit wat waargeneem is - in wese
    nul". Gegewe dat faktor VIII as 'n gevriesdroogde poeier geresepteer word
    wat baie weke of maande spandeer om gebruik te wag, is dit onbegryplik dat
    die CDC en ander beskou steeds pasiënte met hemofilie in gevaar
    MIV-infeksie via besmette faktor VIII konsentrate en enigmatiese dat
    'n ander verduideliking vir "MIV" en vigs by hemofilie het nie
    gesoek is. 4

Die enigste gevolgtrekking wat 'n mens uit die elektronmikroskopie data kan maak, is dat
die gerapporteerde deeltjies is nie-MIV of selfs retrovirale spesifiek wat beteken dat
die opsporing van sulke deeltjies, hetsy in 'n onbeperkte aantal opeenvolgende
kulture/kokulture, is nie bewys vir isolasie nie, maak nie saak hoe isolasie is nie
gedefinieer.

  1. Selfs al is omgekeerde transkriptase-aktiwiteit en retrovirusagtige deeltjies
    spesifiek vir retrovirusse, is hulle nie spesifiek vir 'n unieke retrovirus nie. Die
    enigste bewys beide groepe aangebied vir die bestaan ​​van 'n unieke
    retrovirus, MIV, is die antigeen/teenliggaamreaksie, soos deur beide erken
    Montagnier en Gallo.
  2. Dit word aanvaar dat die bevinding van 'n retrovirus in kultuur, veral
    onder die voorwaardes wat deur Montagnier en Gallo gebruik word, is nie 'n bewys dat die
    retrovirus teenwoordig is in vivo. Die enigste bewyse wat beide Gallo en
    Montagnier se groepe aangebied vir die bestaan ​​van MIV in vivo was
    die antigeen/teenliggaam reaksie.
  3. Selfs vandag nog die enigste bewyse wat gegee word as bewys dat MIV die oorsaak van VIGS is
    is 'n "korrelasie" tussen die teenliggaamtoets en die voorkoms van
    VIGS.
  1. die Montagnier en Gallo interpretasie van die antigeen/teenliggaam reaksie
    is deurslaggewend vir die MIV-hipotese van VIGS en in werklikheid vir die bestaan ​​van a
    unieke retrovirus, MIV
  2. as die interpretasies nie korrek is nie, sou mens geen ander keuse hê as om dit te doen nie
    bevraagteken nie net die MIV-hipotese van VIGS nie, maar ook die bestaan ​​van MIV.

Dit is reeds genoem dat die blote interaksie tussen 'n antigeen
soos 'n proteïen of 'n virus en 'n teenliggaam bewys nie meer as 'n
chemiese verwantskap. In alle ander aspekte kan die reaksie totaal wees
nie-spesifiek. Om die spesifisiteit van die reaksie te bewys moet 'n mens 'n
alternatiewe, onafhanklike metode om die bestaan ​​van die antigeen te bewys, dat
is, moet 'n mens gebruik wat algemeen bekend staan ​​as 'n goue standaard. Die enigste moontlike
goue standaard vir die MIV-teenliggaampietoetse (die antigeen/teenliggaamreaksie) is MIV
self, dit wil sê MIV-isolasie. Maak nie saak hoe 'n mens isolasie definieer nie, natuurlik
die definisie kan nie die teenliggaam/antigeen-reaksie insluit nie (die teenliggaamtoets,
nie die WB of die ELISA nie), want deur dit te doen, het mens nie net nie
'n onafhanklike ontleding, word die toets sy eie goue standaard en is dus
betekenisloos gemaak. Lees die 1984 Gallo Wetenskap papiere dit verskyn
dat Gallo altyd isolasie gedefinieer het as "meer as een van die volgende:
omgekeerde transkriptase-aktiwiteit hetsy in die supernatant of die 1.16 gm/ml-band
retrovirusagtige deeltjies in die kultuur of reaksie tussen proteïene (óf in
die gekweekte selle of die 1,16 gm/ml band) met teenliggaampies teenwoordig in die
pasiënt sera of "antiserum teen HTLV-III". Maar in 'n onderhoud
Gallo aan Huw Christie, die redakteur van die Britse tydskrif, gegee Kontinuum,
by die 1998 Geneefse VIGS-konferensie het Gallo gesê: "Soms het ons Western gehad
Blot positief, maar ons kon nie die virus isoleer nie. So ons het bekommerd geraak en gevoel ons
het soms vals positiewes gekry, so ons het die Western Blot bygevoeg. Dis al
Ek kan jou vertel. Dit was 'n eksperimentele hulpmiddel toe ons dit bygevoeg het en vir ons dit
het goed gewerk, want ons kon die virus isoleer wanneer ons dit gedoen het.” In ander
woorde:

  1. In 1984 het Gallo dit geweet om die spesifisiteit van die teenliggaamtoets een te bewys
    moet 'n goue standaard gebruik.
  2. Die goue standaard moes MIV-isolasie wees.
  3. Alhoewel dit nie bekend is hoe hy en sy kollegas aanvanklik gedefinieer het nie
    isolasie, het die definisie nie die teenliggaam/antigeenreaksie (die
    Western Blot). Dit beteken dat Gallo en sy kollegas bewus was dat 'n
    teenliggaam/antigeen reaksie kan nie as bewys vir isolasie gebruik word nie. Tog, deur die
    tyd hul Wetenskap referate gepubliseer is, en om te versoen
    die lae korrelasie tussen wat hulle aanvanklik isolasie genoem het en die
    teenliggaam/antigeen reaksie, arbitrêr, en teen alle wetenskaplike
    redenasie, het hulle "die Western Blot" by hul definisie van
    isolasie. (Dit is interessant dat selfs met hul nuwe definisie die
    korrelasie tussen "isolasie" en teenliggaamtoetse was steeds minder
    as perfek. Hulle het MIV van 26/72 (36%) van pasiënte “geïsoleer”.
    met VIGS, terwyl 88% van pasiënte met VIGS seropositief was deur 'n
    teenliggaamtoets Gallo as hoogs spesifiek beskou).

In 'n onderhoud wat Montagnier aan die Franse joernalis Djamel Tahi in
1997, het hy gesê: "analise van die proteïene van die virus vereis massa
produksie en suiwering. Dit is nodig om dit te doen." Inderdaad, die enigste
manier om te bewys dat 'n proteïen 'n virale bestanddeel is, is om dit uit materiaal te verkry
wat niks anders as virale deeltjies bevat nie. In plaas daarvan Montagnier se en
Gallo se groepe het die proteïene geïnkubeer wat teen 1,16 gm/ml met sera van
VIGS pasiënte. Die proteïene wat gevind is om meer gereeld met die sera te reageer
Daar word gesê dat dit MIV-proteïene is (hoewel nie een van die groepe enige bewyse gepubliseer het vir
die bestaan ​​van retrovirusagtige deeltjies, suiwer of onsuiwer, teen die 1,16 gm/ml
band) en die teenliggaampies om MIV-teenliggaampies te wees. Selfs al is die
antigeen/teenliggaam reaksie is 100% spesifiek, dit wil sê, teenliggaampies reageer slegs met
induserende antigene en met geen ander, van so 'n reaksie is dit onmoontlik om
bepaal die oorsprong selfs van een reaktant veel minder die oorsprong van beide die
antigeen en die teenliggaam. Kom ons kyk na verskillende scenario's:

  1. Beide Gallo en Montagnier het bewyse gehad dat die 1,16 gm/ml band bevat
    niks anders as retrovirusdeeltjies nie en dat hul teenliggaampies gereageer het
    spesifiek met hul proteïene. Volgens Montagnier, in die kulture
    wat selle bevat wat afkomstig is van pasiënte met volwasse T4-sel leukemie,
    net soos Gallo se HUT-78-sellyn, "dit is 'n regte sop" van
    retrovirusse. Inderdaad, selfs as die kulture nie MIV huisves nie, sal hulle
    hawe HTLV-I en, gegewe die toestand wat deur Gallo gebruik word en die feit dat die
    selle leukemies was, kan hulle ook endogene retrovirusse bevat.
    Volgens een bekende MIV-kenner, Myron Essex, is 35% van vigspasiënte
    teenliggaampies teen HTLV-I besit. (In dieselfde uitgawe van Wetenskap waarin
    Montagnier het sy isolasie van "MIV" gepubliseer, Gallo het drie gepubliseer
    vraestelle wat isolasie van HTLV-I van vigspasiënte beweer wat dit voorstel
    retrovirus was die oorsaak van vigs). Volgens 'n ander ewe ook
    bekende MIV-kenner, Reinhard Kurth, van die Paul-Ehrich Instituut in Duitsland,
    70% van "MIV-positiewe pasiënte" het teenliggaampies wat daarmee reageer
    die retrovirus HTDV/HERV-K, 'n endogene retrovirus, of, soos Kurth dit gestel het, 'n
    retrovirus teenwoordig "in ons almal". Sewe en dertig persent van MIV
    Daar is ook gevind dat positiewe individue teenliggaampies teen tipe D het
    retrovirusse terwyl daar beweer word dat MIV a Lentivirus. Alhoewel
    Montagnier se kulture het dalk nie HTLV-I bevat nie, die resultaat kan steeds
    was "'n regte sop" van endogene retrovirusse veral as
    'n mens kyk na hul kultuurtoestande en die selle wat gebruik word, naelstring
    limfosiete, wat getoon is om selfs retrovirusagtige deeltjies vry te stel
    wanneer nie met MIV besmet is nie. Aangesien ons nie die proteïene van elkeen kan verkry nie
    deeltjie en karakteriseer hulle, die naasbeste ding is om die massa van te neem
    deeltjies, ontwrig hul proteïene en plaas dit in 'n elektroforetiese
    strook volgens hul molekulêre gewigte. Alhoewel ons weet dat die
    proteïene in die strook is retroviraal, ons het geen manier om te bepaal watter
    proteïen behoort aan watter retrovirus as meer as een retrovirus teenwoordig is
    by die 1,16 gm/ml band. Wanneer die proteïene met sera geïnkubeer word, kan ons
    vind dat sommige van die proteïene reageer. Uit so 'n reaksie sal ons kan sê
    dat die teenliggaampies en natuurlik die proteïene viraal is, maar ons kan nie
    bepaal watter proteïen aan watter virus behoort en deur watter virus die
    teenliggaampies geïnduseer is. Ons sal beslis verkeerd wees as ons so 'n oorweeg
    reaksie bewys dat die 1.16 gm/ml band: (a) slegs een retrovirus bevat
    (b) die retrovirus 'n nuwe eksogene retrovirus is, MIV (c) die proteïene is
    die MIV-proteïene (d) die teenliggaampies is MIV-teenliggaampies (e) hierdie data is
    bewys dat die pasiënt met MIV besmet is, selfs al is die teenliggaampigeen
    reaksies is spesifiek.
  2. Beide Montagnier en Gallo het bewyse gehad dat die oorgrote meerderheid van die 1.16
    gm/ml band was saamgestel uit retrovirus deeltjies maar dat die band ook
    nie-retrovirale materiaal bevat het. Hierdie materiaal kon van sellulêr gewees het
    oorsprong (sellulêre bestanddele ook band by 1,16 gm/ml) en kan van wees
    bakteriële, swam en virale oorsprong (bestanddele van die baie aansteeklike
    ander middels as retrovirusse, waarvan bekend is dat hulle teenwoordig is in die kulture en die
    pasiënte). Dit is 'n feit dat in die VSA, Europa en Australië individue
    met vigs sowel as diegene in gevaar het teenliggaampies teen baie aansteeklike middels
    insluitend virusse soos EBV, CMV en hepatitis B-virus. Bewyse ook
    bestaan ​​wat toon dat individue met vigs en diegene in gevaar het
    sirkulatoriese immuunkomplekse, rumatoïede faktor, anti-kern,
    anti-sellulêre, anti-plaatjie, anti-rooi selle, anti-aktien, anti-tubulien, en
    anti-miosien teenliggaampies. Montagnier het self gedemonstreer dat individue
    met vigs en diegene in gevaar het hoë vlakke van teenliggaampies teen die alomteenwoordige
    sellulêre proteïenaktien waarvan die molekulêre gewig 41 000 is, asook aan
    'n ander alomteenwoordige proteïen, miosien, wat twee sub-eenhede molekulêr het
    gewigte, 18 000 en 25 000. Anti-limfosiete teenliggaampies is gevind in
    87% van pasiënte wat 'n positiewe "MIV" teenliggaampie toets en hul
    vlakke korreleer met kliniese status. Daar word ook erken dat Afrikane
    met vigs en diegene in gevaar is met baie ander middels as MIV besmet.

Ons weet dat dit nie moontlik is om 'n proteïen van die 1,16 gm/ml massa te neem nie
en weet uit watter komponent dit afkomstig is. Kom ons volg dan dieselfde stappe
soos Gallo en Montagnier. Neem die massa van materiaalband by die 1.16 gm/ml,
ontwrig die proteïene en plaas die proteïene elektroforeties in 'n strook
volgens hul molekulêre gewigte. Deur hierdie tegniek te gebruik, kan ons nie
noem uit watter komponent van die 1,16 gm/ml bandmassa 'n proteïen op die strook
aflei. Vervolgens inkubeer ons die proteïene in die strook met pasiënt sera en
ontdek dat sommige van die proteïene reageer met teenliggaampies wat in die sera voorkom.
Selfs as die teenliggaam/antigeen-interaksie 100% spesifiek is, is so 'n reaksie
laat ons toe om die oorsprong van die proteïene te definieer. Tog van so 'n reaksie en
sonder enige bewys dat die teenliggaampies spesifiek gereageer het, Montagnier en Gallo
het die oorsprong van beide die proteïene en die teenliggaampies as "MIV" gedefinieer.

Soos genoem, het Montagnier drie proteïene in die 1,16 gm/ml band gevind wat
gereageer met teenliggaampies teenwoordig in sy pasiënte se sera. Dit was p25, p80 en
p45. Montagnier het tot die gevolgtrekking gekom dat sy pasiënte met 'n retrovirus besmet is
wat "'n groot p25-proteïen bevat, soortgelyk in grootte aan dié van HTLV-I",
maar het geen kommentaar gelewer oor die p80-proteïen nie. Oor p45 het hy geskryf:
"Die 45K [p45] proteïen kan wees as gevolg van kontaminasie van die virus deur sellulêre
aktien".

In 1997 het Montagnier gesê dat die proteïen wat hy in 1983 opgespoor het 'n molekulêre
gewig van 43 000 en was aktien. (Die molekulêre gewig van aktien is nie 45 000 nie
ook nie 43 000 nie maar 41 000. Sedert Montagnier en Gallo egter die
molekulêre gewigte van die proteïene deur hul migrasie in 'n elektroforetiese
strook, en omdat die migrasie deur ander faktore beïnvloed kan word, vir
byvoorbeeld, deur die proteïen se lading, is dit moontlik dat hierdie geringe verskille
in die molekulêre gewig bloot die resultaat van eksperimentele variasie is).

Toe Gallo en sy kollegas die sellulêre proteïene as antigene in die
WB het hulle berig: “Die mees prominente reaksies was die antigene van die
volgende molekulêre gewigte: 65 000, 60 000, 55 000, 41 000 en 24 000. Antigene
met molekulêre gewigte van ongeveer 88 000, 80 000, 39 000, 32 000, 28 000
en 21 000 het minder prominente reaksies gegee ... 'n Groot proteïen met 'n molekulêre
gewig van ongeveer 130 000 en 'n proteïen van 48 000 was ook
opgespoor". In 'n ander eksperiment het die "antigene van virus gesuiwer
van die kultuurvloeistowwe", dit wil sê die 1.16 gm/ml-band, is geïnkubeer met
verskillende sera. Hulle het 'n "Uitgebreide" reaksie van die vigs gevind
pasiënte sera met p24 en p41 en tot die gevolgtrekking gekom: "hierdie molekules is die
hoofkomponent van die virus-voorbereiding. P24 en p41 kan dus wees
beskou virale strukturele proteïene ... Verder, 'n antigeen met 'n molekulêre
gewig van ongeveer 110 000 is in die virusvoorbereiding opgespoor, maar was
onder die limiet van opsporing in die selle. Ook, p39 was teenwoordig in die virus
voorbereiding ... Soms is 'n bykomende stel antigene herken deur 'n
serum, maar hul verband met die antigene wat hierbo beskryf is, is onduidelik".

Tussen 1983-87 die opsporing van teenliggaampies in pasiënt sera wat gereageer het
met p24 of p41 (Montagnier beskou reaksie met p24 en Gallo met p41 MIV
spesifiek) is as bewys beskou dat die pasiënt met MIV besmet is. In die
dieselfde tydperk het dit duidelik geword dat 'n aansienlike aantal individue
met geen risiko van vigs het teenliggaampies gehad wat met hierdie proteïene gereageer het. Sedert 1987
meeste van die proteïene wat Gallo gevind het om óf in die selekstrakte óf te reageer
die 1,16 gm/ml band word nou as MIV-proteïene beskou en laboratoriums benodig die
teenwoordigheid van teenliggaampies wat met meer as een proteïen voor die pasiënt reageer
word beskou as besmet met MIV. Die aantal en identiteit van teenliggaampies/proteïen
(Western blot) bande wat benodig word, verskil van kontinent tot kontinent, van land tot land
land en selfs tussen en binne laboratoriums in dieselfde land. So is dit
moontlik vir dieselfde pasiënt om MIV-seropositief te wees in New York, byvoorbeeld,
maar nie in Afrika of Australië nie.

Verder bestaan ​​daar vir baie jare bewyse wat toon dat p24 dit nie is nie
"MIV"-spesifieke 123,124, p41 is die sellulêre proteïenaktien, 58,125,126
p32 is klas II histoversoenbaarheid DR proteïen 126,127 en p120 / p160
is oligomere van p41. 128

Selfs al bestaan ​​daar bewyse dat die "MIV"-proteïene wel aan a
unieke eksogene retrovirus, kan dit nie aanvaar word dat teenliggaampies wat reageer nie
met hulle is diagnostiese van "MIV" infeksie. Om die spesifisiteit te bewys
van die teenliggaampietoetse is dit verpligtend om:

  1. toets 'n groot aantal vakke met en sonder VIGS. Die vakke
    sonder VIGS moet nie uitsluitlik gesonde individue wees nie (aangesien hulle dit nie doen nie
    hoë vlakke van teenliggaampies het, sou mens min indien enige reaksies verwag) maar
    sluit die siekes in, soos pasiënte met aansteeklike siektes (behalwe
    dié wat na bewering voortspruit uit MIV-infeksie), diegene wat ontvang
    chemoterapie en diegene met outo-immuunafwykings
  2. gelyktydig (verkieslik op dieselfde bloedmonster) toetse vir MIV uitvoer
    isolasie
  3. vergelyk die teenliggaamtoetsresultate met die resultate van MIV-isolasie, dat
    is, gebruik MIV as 'n goue standaard vir die teenliggaamtoets.

Tot op hede het niemand sulke studies gepubliseer deur enige definisie van
"MIV" isolasie.

Die onafwendbare gevolgtrekking is dat die teenliggaam/antigeenreaksie nie MIV is nie
spesifiek en kan dus nie gebruik word om MIV-isolasie te bewys nie, ongeag hoe isolasie
gedefinieer word.

MEER ONLANGSE ONTWIKKELINGS

Teen 1997 het sommige van die bekendste MIV-kundiges aanvaar dat:

  1. "Gesuiwerde" MIV bevat sellulêre proteïene, "sommige is
    oorverteenwoordig in vergelyking met die relatiewe hoeveelheid in die selmembraan,
    terwyl ander blykbaar afwesig is", en dat hierdie proteïene
    "dien as beskermende immunogene in inentingseksperimente".
  2. MIV "gebruik vir biochemiese en serologiese ontledings of as immunogene
    word gereeld voorberei deur sentrifugering deur sukrosegradiënte",
    maar in geen van die studies het die suiwerheid van die viruspreparaat
    geverifieer is". Met ander woorde, tot 1997 het niemand gepubliseer nie
    elektronmikrofoto's van die 1,16 gm/ml-band om te bewys dat die "gesuiwerde
    virus" het niks anders as virusdeeltjies bevat nie.

In daardie jaar, in Virologie, is twee studies gepubliseer, een deur 'n VSA
span, hoofskrywer Julian Bess, en die ander deur 'n Frans-Duitse groep,
hoofskrywer Pablo Gluschankof, met die eerste elektronmikrofoto's van
"gesuiwerde MIV". Terwyl hy in die Gluschankof et al bestudeer die EM's
was van die 1,16 gm/ml band, in die Bess et al band waaruit hulle was
saamgevoegde bands. Die skrywers van beide studies het beweer dat hul
"gesuiwerde" materiaal bevat 'n paar deeltjies met die voorkoms van
retrovirusse en was in werklikheid MIV-deeltjies. Maar hulle het erken dat hul
materiaal het oorwegend deeltjies bevat wat nie retrovirusse was nie, maar
"ontluikende membraandeeltjies wat dikwels mikrovesikels genoem word" of
"bespot virus". Inderdaad die byskrif aan die Gluschankof et al
elektronmikrograaf lees: "Gesuiwerde vesikels van besmette H9-selle (a)
en geaktiveerde PBMC (b) supernatante", nie gesuiwerde MIV. In verder
eksperimente die supernatant van nie-geïnfekteerde kulture is ook ingebind
sukrose gradiënte. Beide groepe het beweer dat die geband materiaal van hierdie
kulture het slegs mikrovesikels, "mock virus" deeltjies bevat, maar nee
MIV. Beide die "MIV" deeltjies en die skyn-virus deeltjies besit
membrane. In die VSA-studie is die "MIV-1-deeltjies" gedifferensieer
van die mikrovesikels "deur die elektrondigte kerne", terwyl in die
ander studie die "MIV" deeltjies is "geïdentifiseer deur die
relatief homogene deursnee van ongeveer 110 nm, die digte keëlvormige kern, en
die "laterale liggame". Maar in die pyl deeltjies wat gesê word
om MIV te wees, is dit moeilik indien nie onmoontlik om enige wat keëlvormig het, op te spoor
kerne of bilaterale, "laterale liggame". In werklikheid geen deeltjie in enige studie nie
het die beginsel morfologiese kenmerk van retrovirus, 'n deursnee van
100-120 nM en oppervlakspykers, knoppe. In die Frans-Duitse studie is die gemiddelde
"MIV" deeltjie deursnee is 136 nM en geen deeltjie het 'n deursnee minder gehad nie
as 120 nM. In die VSA-studie is die ooreenstemmende afmetings 236 nM en 160 nM.
Met ander woorde, die Amerikaanse "MIV" is twee keer die deursnee van die
Europese "MIV" en alle ander "MIV" deeltjies. Die VSA
skrywers het nie hierdie teenstrydigheid opgemerk of verduidelik nie en "was baie meer
gefokus daarop om die mengsel van deeltjies in die voorbereidings te wys in teenstelling met
hul werklike deursnee". Die deursnee van die mikrovesikels "wissel in
grootte van ongeveer 50 tot 500 nm". Beide die "MIV" en die
"bespotlike" virusdeeltjies het RNA bevat. Die RNA van laasgenoemde het
mRNA bevat wat bekend is dat dit ryk is aan adenien en wat volgens
Gallo is spesifiek vir retrovirale RNA. Volgens Gluschankof et al,
“Die vesikels bevat groot hoeveelhede proteïen en nukleïensure wat is
ongestruktureerd en dus deursigtig deur elektronmikroskopie", dit is hoekom
baie, maar nie almal nie, verskyn "leeg" deur elektronmikroskopie, terwyl die
nukleïensure in die "MIV"-deeltjies is gestruktureer en hiervoor
rede waarom hulle blykbaar 'n "elektrondigte kern" het. Maar,
volgens 'n vooraanstaande retroviroloog, John Bader, kan die kerndigtheid wees
verander deur eksterne toestande, dit wil sê die kultuurtoestande. Dit is goed
bekend dat 'n strukturele virusdeeltjie of virusagtige deeltjie kan word
"ongestruktureerd" in die teenwoordigheid van reduseermiddels. Die moontlikheid
kan dan nie uitgesluit word nie, dat die oënskynlike morfologiese verskille tussen die
twee tipes deeltjies kan wees as gevolg van niks meer as die verskil in die
redoks van die mikro-omgewing waarin hulle saamgestel, vrygestel of albei. Dit
is betekenisvol dat aktienpolimerisasie (of aktien/miosieninteraksie)
"bemiddel MIV-ontluiking" en vrystelling. Bewyse bestaan ​​ook dat:

  1. Soos getoon deur Bess et al, vertoon onbesmette selle knoppies wat nr
    verskil van dié in besmette selle.
  2. Daar is 'n assosiasie tussen die herverspreiding van gepolimeriseerde aktien,
    miosien en ander sellulêre proteïene (glikoproteïene) en baie sellulêre
    prosesse insluitend ontluiking wat nie verband hou met vrystelling van retrovirus nie.
  3. Polimerisasie van aktien, aktien-miosien interaksie en kruisbinding van
    polimere word in die algemeen gereguleer deur die redokstoestand, wat oksidasie lei tot
    interaksie.
  4. Beide vigspasiënte en kulture afkomstig van vigspasiënte word onderwerp
    aan oksideermiddels. Trouens, vir die opsporing van "MIV"-proteïene
    en deeltjies moet die selkulture gestimuleer word (met oksidasie behandel
    agente).
  5. In die teenwoordigheid van antioksidante kan geen "MIV"-verskynsels wees nie
    waargeneem.

Die minimum absoluut noodsaaklike maar nie voldoende voorwaarde om dit te eis nie
wat "MIV-1-deeltjies" genoem word, is 'n retrovirus en nie sellulêr nie
mikrovesikels is om te wys dat die sukrose digtheid fraksies verkry uit die
"besmette" selle bevat proteïene wat nie in dieselfde teenwoordig is nie
fraksies verkry uit nie-geïnfekteerde selle. Bess et al het
gewys dit is nie die geval nie. Die enigste verskil wat 'n mens in hul kan sien
SDS-polyacrylamide gel elektroforese stroke van "gesuiwerde virus" en
"spotvirus" is kwantitatief, nie kwalitatief nie. Hierdie kwantitatiewe
verskil kan wees as gevolg van baie redes insluitend die feit dat daar was
beduidende verskille in die geskiedenis en die wyse van voorbereiding van die
nie-geïnfekteerde en "besmette" H9-selkulture, benewens die
"infeksie".

'n Soortgelyke bevinding is 'n paar jaar tevore deur dieselfde skrywers gerapporteer.
Alhoewel in beide studies die proteïene met molekulêre gewig "naby 42
kDa" (42 000) word gemerk as "Actin" en "in die 30- tot
40-kDa reeks" as "HLA DR", al die proteïene met molekulêre gewig
hoër as ongeveer 42 000 en laer as ongeveer 30 000 is oor
ongemerk in die vorige koerant. In die 1997 studie, drie proteïene van molekulêre
gewig laer as 30 000 word gemerk as p24 CA , p17 MA , en
p6/p7 NC en word gesê dat dit "groot bande van virale
proteïene". Maar ook volgens die skrywers was "hierdie etikette
bygevoeg toe een van die beoordelaars daarvoor gevra het. Hy het gevoel dit sal help om te oriënteer
lesers as hulle na die figuur kyk - die resensent is korrek. Ons het nie
bepaal die identiteite van die bande in hierdie spesifieke gel".

In hul vroeëre studie het die navorsers van die VSA verder aangebied
bewyse dat die "virale proteïene" niks meer as sellulêr was nie
proteïene. In hul pogings om 'n MIV-entstof te maak, het hulle makake geïmmuniseer met,
onder andere antigene, "bespot virus", dit wil sê, sukrose digtheid geband
materiaal van die supernatante van nie-geïnfekteerde H9-selkulture. Na die
aanvanklike immunisering die ape is boosters op 4, 8 en 12 weke gegee. Die
diere is dan uitgedaag met "SIV" wat óf in H9-selle gepropageer is
of makaak selle. Wanneer die WB'e verkry word na immunisering maar voor "SIV"
uitdaging vergelyk is met die WB's na-uitdaging, is gevind dat die uitdaging
met "SIV" gepropageer in makaak selle het 'n paar bykomende bande.
Die WB's verkry na die uitdaging met SIV het egter in H9-selle gepropageer
was identies met die WB'e wat na immunisering maar voor uitdaging verkry is. In
ander woorde, die proteïen-immunogene in die "virus" was identies met
die immunogene in die "skynvirus". Aangesien beide die "bespotting
virus" en "gesuiwerde" virus bevat dieselfde proteïene, dan almal
die deeltjies gesien in die geband materiaal insluitend wat die skrywers van die
1997 Virologie papiere wat "MIV"-deeltjies genoem word, moet sellulêr wees
vesikels. Aangesien daar geen bewys is dat die gebande, "gesuiwerde virus",
materiaal bevat retrovirus proteïene en dus retrovirus deeltjies dan daar
kan geen bewys wees dat enige van die gebande RNA retrovirale RNA is nie. Wanneer sulke RNA (of
sy cDNA) word gebruik as probes en primers vir hibridisasie en PCR studies, nr
maak nie saak watter resultate verkry word nie, dit kan nie as bewys vir infeksie beskou word nie
met 'n retrovirus, enige retrovirus.

In die onderhoud wat Montagnier aan Djamel Tahi gegee het, is hy gevra hoekom hulle
het nie 'n elektronmikrograaf van die 1,16 gm/ml-band gepubliseer om te bewys dat die
band verteenwoordig "gesuiwerde" virus, soos hulle beweer het. Hy het dit geantwoord
die rede hiervoor was dat selfs na "Romeinse inspanning" in hul
"gesuiwerde" virus kon hulle geen deeltjies met die sien nie
"morfologie tipies van retrovirusse. Hulle was baie anders. Relatief
anders". Toe Montagnier gevra is of Gallo MIV geïsoleer het, het hy geantwoord:
"Ek glo nie so nie". As daar geen retrovirusagtige deeltjies in was nie
Montagnier se "gesuiwerde" virus, dan klaarblyklik Montagnier en syne
kollegas kon nie daarop aanspraak maak dat hulle 'n spesifieke eksogene retrovirus geïsoleer het nie,
MIV.

Om te beweer dat die rek van RNA (cDNA) die genoom van 'n unieke retrovirale middel is
deeltjie, MIV, die mees basiese vereiste is bewys vir die bestaan ​​van 'n unieke
molekulêre entiteit "MIV RNA" ("MIV DNA") dit is, 'n unieke
fragment van RNA (DNA) identies in beide samestelling en lengte in alle geïnfekteerdes
individue. Die bewering dat 'n stuk RNA (cDNA) 'n unieke molekulêre entiteit is
wat die genoom van 'n unieke retrovirus uitmaak, kan as en slegs aanvaar word
as daar aangetoon word dat die RNA aan deeltjies behoort met die morfologiese,
fisiese en replikatiewe kenmerk van retrovirale deeltjies. Bewys hiervan
kan slegs verkry word deur die deeltjies te isoleer, dit wil sê deur hulle te verkry
apart van alles anders (suiwer hulle). In 1984 beide Gallo's en
Montagnier se groepe het gerapporteer dat hulle gepoliadenileerde (adenienryke) RNA (poli(A)-RNA) gevind het
in die 1,16 gm/ml-bandmateriaal verkry van "besmette" kulture. Die
Daar word beweer dat RNA MIV-RNA is, dit wil sê die MIV-genoom, en die komplementêre daarvan
DNA, die MIV-provirus. Maar,

    1. soos genoem, alhoewel Montagnier beweer het dat sy 1.16 gm/ml band bevat
      suiwer "MIV"-deeltjies, volgens hom nie sy band of dit nie
      van Gallo's het enige deeltjies bevat met "morfologie tipies van
      retrovirusse"
    2. poli(A)-RNA is nie spesifiek vir retrovirusse nie. Dit kan in almal gevind word
      selle en selfs by die 1,16 gm/ml-band verkry vanaf
      "nie-besmette" selle
    3. daar is geen bewys vir die bestaan ​​van 'n unieke molekulêre entiteit nie,
      "MIV-RNA" of "MIV-DNA", terwyl die genome van die meeste
      veranderlike RNA-virusse verskil nie met meer as 1% nie. Die verskil tussen
      die mens- en sjimpansee-genoom is nie meer as 2% terwyl daar op is nie
      tot 40% variasie tussen "MIV"-genome
    4. in hibridisasie studies met behulp van die "MIV RNA" of cDNA, Gallo
      en sedertdien kon baie ander navorsers nie die bewys bewys nie
      bestaan ​​van die MIV-genoom in vars limfosiete van VIGS-pasiënte. In
      1994 Gallo het gesê: "Ons het nog nooit MIV-DNS in die tumorselle van
      KS...In werklikheid het ons nog nooit MIV-DNS in T-selle gevind nie."
      1. Al die bewerings van die bestaan ​​van MIV by mense is gebaseer op polimerase
        kettingreaksie (PCR) studies met behulp van klein fragmente van die "MIV"
        genoom as primers. Maar selfs navorsers wat glo dat daar is
        bewys dat die MIV-inleiders en probes wat in hierdie studies gebruik word, MIV aanvaar
        dat die spesifisiteit van hierdie toets, met die gebruik van die teenliggaam as 'n goue standaard,
        wissel tussen nul en 100 persent. Selfs met die PCR het niemand
        berig die bestaan ​​van die volle "MIV" genoom in die vars
        limfosiete van selfs 'n enkele VIGS-pasiënt.

      Verder, ten spyte van die genoegsame bewyse van die teendeel, vir die meeste
      retroviroloë die bevinding van 'n nuwe nukleïensuur in 'n sel kan wees as gevolg van
      niks anders as 'n aansteeklike middel nie. 'n Halfeeu het verloop sedert die Nobel
      Laureaat Barbara McClintock het die verskynsel van transposisie ontdek wat kan
      lei tot die verskyning van nuwe genotipes en fenotipes. Volgens McClintock,
      die genoom kan herstruktureer word nie net deur transposisie nie, maar ook op ander maniere
      ook. In haar Nobellesing van 1983 het sy gesê, "vinnige herorganisasie van
      genome kan sommige spesievorming onderstreep. Ons huidige kennis sou
      stel voor dat hierdie herorganisasies ontstaan ​​uit een of ander "skok" wat
      het die genoom gedwing om homself te herstruktureer om 'n bedreiging vir sy te oorkom
      oorlewing. Groot genomiese herstrukturering het beslis die vorming van gepaard gegaan
      nuwe spesie". Die "genomiese skok" wat lei tot die ontstaan ​​van
      nuwe spesies kan "óf geproduseer word deur ongelukke wat binne die sel plaasvind
      self, of van buite af opgelê soos virusinfeksies, spesiekruisings,
      gifstowwe van verskillende soorte, of selfs veranderde omgewings soos dié wat deur
      weefselkultuur
      . Ons is bewus van sommige van die ongelukke wat DNS en ook
      van hul herstelmeganismes, maar baie ander kan moeilik wees om te herken.
      Homeostatiese aanpassings aan verskeie ongelukke sal nodig wees indien hierdie
      ongelukke kom gereeld voor. Baie sulke ongelukke en hul aanpassings sou nie wees nie
      bespeur tensy een of ander gebeurtenis of waarneming die aandag daarop gerig het
      hulle. Ongetwyfeld sal ons uit hierdie revolusionêre tydperk met
      gewysigde aansigte van komponente van selle en hoe hulle werk, maar net egter om
      wag op die verskyning van die volgende revolusionêre fase wat weer sal bring
      verbysterende veranderinge in konsepte".

      Soos ons elders genoem het 9,19 is slegs 'n eksogene retrovirus
      een moontlike verklaring vir die bevinding van nuwe nukleïensure in VIGS
      pasiënte. Ander verduidelikings is:

      1. Die genoom van 'n endogene retrovirus, dit wil sê 'n stuk RNA met 'n
        ooreenstemmende provirale DNA teenwoordig in die sellulêre DNA van onbesmette diere
        en wat vertikaal van geslag tot geslag oorgedra word (van ouers
        nageslag via die kiemsellyn) en wat onder sekere omstandighede kan
        uitgedruk en in retrovirale deeltjies geïnkorporeer word.
      2. Die genoom van 'n retrovirus De novo saamgestel deur genetiese
        rekombinasie en verwydering van: (a) endogene retrovirale volgordes of (b)
        retrovirale en sellulêre volgordes of (c) nie-retrovirale sellulêre gene.
      3. 'n RNS verkry deur transposisie, dit wil sê deur sekere repliserende DNA
        volgordes (transposons) wat elders in die genoom ingevoeg word, of deur
        retroposisie, dit wil sê deur bepaalde RNA (retrotransposons) eerste te wees
        getranskribeer in DNA en dan op soortgelyke wyse in die genoom ingevoeg.
        Retroposisie kan "sellulêre meganismes gebruik vir passiewe retroposisie,
        sowel as retro-elemente wat omgekeerde transkriptase bevat." Die
        retro-elemente kan retrovirus-agtige elemente of nie-virale elemente wees. Nie net
        kan retroposisioneer "die eukariositiese genoom in baie vorm en hervorm
        verskillende maniere", maar die nie-virale retro-elemente kan soortgelyk wees aan die
        retrovirale elemente.

      'n Basiese beginsel van molekulêre biologie is dat die primêre volgorde van RNA
      weerspieël getrou die primêre volgorde van die DNS waaruit dit is
      getranskribeer. Maar in die 1980's RNA redigering, "breedweg gedefinieer as 'n
      proses wat die nukleotiedvolgorde van 'n RNA-molekule verander van dié van
      die DNA-sjabloon wat dit kodeer", is ontdek. In die proses a
      nie-funksionele transkripsie kan weer aangepas word, wat 'n vertaalbare mRNA produseer, of
      verander 'n reeds funksionerende mRNA sodat dit 'n proteïen van veranderde genereer
      aminosuur volgordes. Soms is redigering so omvangryk dat die meerderheid van
      volgordes in 'n mRNA word nie genomies gekodeer nie, maar word post-transkripsie gegenereer
      die vervaardiging van die "paradoksale situasie van 'n transkripsie wat nie voldoende is nie
      komplementariteit om met sy eie geen te hibridiseer!". Volgens Nancy Maizels
      en Alan Weiner van die Departement Molekulêre Biofisika en Biochemie by
      Yale Universiteit, "het die sentrale dogma moeilike tye oorleef. Die ontdekking
      van omgekeerde transkripsie gewysig, maar het nie die sentrale dogma van hoe geskend nie
      gene maak proteïene introne gekwalifiseer die gevolgtrekking dat gene noodwendig is
      kolineêr met die proteïene wat hulle kodeer vir somatiese herrangskikking van limfosiet-DNS
      stabiliteit van eukariotiese genome in twyfel getrek. en katalitiese RNA uitgedaag
      die voorrang van proteïene en nuwe lewe in die antieke RNA geblaas
      wêreld". Die ontdekking van RNA-redigering "kan egter naby aan
      dit 'n dodelike slag toe te dien".

      Dus die bevinding van nuwe RNA's in menslike selle, veral dié van VIGS
      pasiënte en diegene in gevaar, kan nie meer as onomstootlike bewys beskou word nie
      dat die RNA eksogeen ingebring is deur 'n vermeende MIV of enige ander
      aansteeklike middels. Dat dit die geval mag wees, is onlangs deur Luc aanvaar
      Montagnier. In 'n skriftelike getuienis gedateer 2 Februarie 2000, aan die VSA
      Huis van Verteenwoordigers Komitee oor Regeringshervorming, Subkomitee oor
      Nasionale Veiligheid, Veterane Sake en Internasionale Betrekkinge, ter ondersteuning van
      die werk van sy kollega, Howard B Urnovitz, (Montagnier is op die wetenskaplike
      adviesraad van 'n publiek verhandelde biomediese maatskappy wie se direkteur is
      Urnovitz), het Montagnier geskryf: "Ek het Dr Urnovitz se gepubliseerde hersiening
      navorsing en die getuienis voorberei vir voorlegging aan hierdie Komitee en
      beveel sterk aan dat toekomstige navorsing oor Golfoorlog-sindroom die
      studie van die opgespoorde genetiese materiaal".

      Urnovitz en sy kollegas het bewyse van die bestaan ​​gelewer, in Persies
      Golfoorlog-veterane, van "nuwe", "nievirale" RNA's,
      "moontlik veroorsaak deur blootstelling aan omgewingsgenotoksiene". Hulle
      tot die gevolgtrekking gekom: "Die patrone van die voorkoms van RPA's [poliribonukleotiede] in
      die sera van GWV's [Golfoorlogveterane] en gesonde beheermaatreëls is voldoende
      onderskei om moontlike toekomstige diagnostiese toepassings voor te stel ... Ons studies van
      pasiënte met aktiewe veelvuldige myeloom stel voor dat pasiënte met individuele
      chroniese multifaktoriale siektes kan unieke RPA's in hul sera hê. Gevalideer
      toetse vir sulke vermeende surrogaatmerkers kan help met die diagnose van sulke
      siektes of in die evaluering van reaksies op terapeutiese modaliteite".

      In dieselfde jaar wat Montagnier MIV-isolasie beweer het, 1983, in 'n koerant
      getiteld "Uitdrukking van nuwe transposon-bevattende mRNA's in menslike T
      selle" het navorsers van die VSA en Kanada berig "Using an HERV-H
      LTR-sonde, 6 en 4.5 kb transkripsies is opgespoor deur Northern klad analise
      wat in normale perifere T-selle geïnduseer is na behandeling met
      phytohaemagglutin" (HERV º menslike endogeen
      retrovirus). Fitohemagglutien is en word steeds gebruik nie net deur
      Montagnier, maar deur feitlik elke retroviroloog wat bewyse vir MIV beweer
      isolasie.

      Aangesien Montagnier met Urnovitz saamstem dat nuwe, nievirale RNA's in die
      Golfoorlog-veterane, hoekom moet die bestaan ​​van nuwe RNA's dan:

      1. In vigs pasiënte en diegene in gevaar wees die genoom van 'n retrovirus MIV en
        nie die gevolg van die baie gifstowwe insluitend genotoksiene waaraan hulle is nie
        blootgestel?
      2. In kulture wat weefsels van VIGS bevat, word pasiënte as MIV geïnterpreteer
        RNAs eerder as die resultaat van die baie gifstowwe insluitend genotoksiene waaraan
        word beide die pasiënte en die kulture blootgestel? Veral wanneer albei
        Montagnier en Gallo aanvaar dat MIV nie opgespoor kan word in kulture wat
        word nie met sulke gifstowwe (oksidantmiddels) insluitend PHA behandel nie?

      Wanneer hard gedruk word sal al die MIV-kundiges uiteindelik die aanvaar
      nie-spesifisiteit van retrovirale-agtige deeltjies, omgekeerde transkripsie en
      teenliggaam/antigeen reaksies. Dat dit die geval is, word geïllustreer
      deur die feit dat hulle aan die begin van die VIGS-era die eerstes was om te rapporteer
      isolasie van MIV van individue wat geen risiko vir VIGS het nie. 166-168 In 1985
      Weiss en sy kollegas het die isolasie van 'n retrovirus van
      mitogenies gestimuleerde T-selkulture van twee pasiënte met gemeenskaplike veranderlike
      hipogmaglobulienemie. Hierdie retrovirus "was duidelik verwant aan HTLV-III/LAV"
      (MIV)-bewyse het positiewe westelike klad met VIGS-sera en hibridisasie ingesluit
      met MIV-sondes. 168 In 1984 het Montagnier en sy kollegas verslag gedoen
      dat "geaktiveerde limfosiete van 'n gesonde bloedskenker spontaan was
      'n virus soortgelyk aan LAV1 in kultuur vry te stel." 169 Met die
      metode wat tans gebruik word vir "MIV"-isolasie (reaksie van p24 met
      proteïene in kultuur) Schupbach en sy medewerkers wat volbloedkulture gebruik
      positiewe resultate gerapporteer in 49/60 (82%) van "vermoedelik onbesmette maar
      serologies onbepaalde" individue en in 5/5 (100%) "seronegatief
      bloedskenkers". 170

      In 1983 Luc Montagnier en sy kollegas en in 1984 Robert Gallo en sy
      kollegas het beweer dat hulle die bestaan ​​van MIV bewys het deur retrovirale te suiwer
      deeltjies, dit wil sê deur 'n massa deeltjies te verkry wat van alles geïsoleer is
      anders en wys dat die deeltjies aansteeklik is. N kritiese ontleding van hul
      bewyse toon dat nie een van die groepe bewyse van isolasie van 'n roman gelewer het nie
      retrovirus van vigspasiënte. Die verskynsels wat hulle as MIV geïnterpreteer het, is almal
      nie-spesifiek en was bekend so lank voor die vigs-era. Trouens, gegee
      die oorsprong van die selle en die kultuurtoestande wat mens verwag om te vind
      al hierdie verskynsels al is die kulture nie met 'n retrovirus besmet nie. In
      1997 Montagnier self beklemtoon dat die bestaan ​​van 'n unieke te bewys
      retrovirus suiwering is absoluut noodsaaklik en erken dat hy nie
      sulke bewyse gelewer, en volgens sy mening het Gallo ook nie. Erkenning hiervan
      feite kan die eerste stap in die oplossing van die probleem van VIGS bewys.

      1. Duesberg PH. (1987). Retrovirusse as karsinogene en
      patogene: Verwagtinge en werklikheid. Kankernavorsing 47:1199-1220.

      2. Papadopulos-Eleopulos E. (1988). Herwaardering van VIGS:
      Is die oksidasie wat deur die risikofaktore veroorsaak word die primêre oorsaak? Medies
      Hipoteses
      25:151-162.

      3. Papadopulos-Eleopopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM,
      Hedland-Thomas B, Veroorsaker D, Bladsy B. (1995). 'n Kritiese ontleding van die
      MIV-T4-sel-VIGS hipotese. Genetika 95:5-24.

      4. Papadopulos-Eleopopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM,
      Veroorsaak D. (1995). Faktor VIII, MIV en vigs by hemofilie: 'n ontleding van
      hul verhouding. Genetika 95:25-50.

      5. Papadopulos-Eleopopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM,
      Bialy H. (1995). VIGS in Afrika: Onderskeidende feite en fiksie. Wêreld
      Tydskrif vir Mikrobiologie en Biotegnologie
      11:135-143.

      6. Papadopulos-Eleopopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM,
      Veroorsaak D. (1997). Hoekom geen hele virus nie? Kontinuum 4:27-30.

      7. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM.
      (1992). Oksidatiewe stres, MIV en VIGS. Navorsing in Immunologie 143:145-8.

      8. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM.
      (1992). Kaposi se sarkoom en MIV. Mediese hipoteses 39:22-9.

      9. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM.
      (1993). Is 'n positiewe Westerse klad bewys van MIV-infeksie? Bio/Tegnologie
      11:696-707.

      10. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM.
      (1993). Het Gallo die rol van MIV in vigs bewys? Noodgeneeskunde
      [Australië]
      5:114-123.

      11. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF. (1994).
      Dekonstruksie van VIGS in Afrika. The Independent Monthly 50-51.

      12. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF. (1995).
      Rekonstruksie van VIGS in Afrika - Antwoord aan Kaldor en Ashton. Die Onafhanklike
      Maandeliks
      Februarie:23-24.

      13. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Veroorsaker DS,
      Papadimitriou JM. (1996). MIV-oordrag deur skenkersemen. Lancet
      347:190-1.

      14. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM.
      (1996). Virus Uitdaging. Kontinuum 4:24-27.

      15. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM,
      Veroorsaak D. (1997). MIV-teenliggaampies: Verdere vrae en 'n pleidooi vir
      opheldering. Huidige Mediese Navorsing en Opinie 13:627-634.

      16. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM,
      Veroorsaak D, Bladsy B. (1998). MIV-teenliggaampietoetse en virale lading – meer onbeantwoord
      vrae en 'n verdere pleidooi vir verduideliking. Huidige Mediese Navorsing en
      Opinie
      14:185-186.

      17. Papadopulos-Eleopulos E. (1998). 'n Kritiese analise
      van die bewyse vir die bestaan ​​van MIV en die MIV-teenliggaampietoetse: Lesing die
      XIIde Internasionale VIGS-konferensie, Genève. http://www.virusmyth.net/aids/perthgroup/geneva/index.htm

      18. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM,
      Causer D, Alphonso H, Miller T. (1999). 'n Kritiese ontleding van die farmakologie
      van AZT en die gebruik daarvan in vigs. Huidige Mediese Navorsing en Opinie
      15:1s-45s.

      19. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM,
      Veroorsaak D. (1996). Die isolasie van MIV: Is dit werklik bereik? Kontinuum
      4:1s-24s. www.virusmyth.net/aids/data/epreplypd.htm

      20. Gelderblom HR, Özel M, Hausmann EHS, Winkel T, Pauli
      G, Koch MA. (1988). Fyn struktuur van menslike immuniteitsgebrekvirus (MIV),
      Immunolokalisering van strukturele proteïene en virus-selverhoudings. Mikron
      Mikroskopika
      19:41-60.

      21. Sinoussi F, Mendiola L, Chermann JC. (1973).
      Suiwering en gedeeltelike differensiasie van die deeltjies van muriene sarkoom
      virus (M. MSV) volgens hul sedimentasietempo's in sukrosedigtheid
      gradiënte. Spektra 4:237-243.

      22. Toplin I. (1973). Tumorvirussuiwering met Zonal
      Rotors. Spektra 225-235.

      23. Levy JA, Fraenkel-Conrat H, Owens RA. (1994).
      Virologie. 3de uitg. Londen: Prentice-Hall, 1994.

      24. White DO, Fenner FJ. (1994). Mediese Virologie. 4de uitg.
      San Diego: Akademiese Pers.

      25. Timbury MC. (1994). Notas oor Mediese Virologie.
      Edinburgh: Churchill Livingstone.

      26. Dimmock NJ, Primose SB. (1996). Inleiding van Modern
      Virologie. 4de uitg. Oxford: Blackwell Science.

      27. Fields BN, Knipe DM, Howley PM, eds. Grondbeginsels van
      Virologie. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1996.

      28. Turner VF, Weiss R. Perth Groepdebat met professor
      Robin Weiss oor die bestaan ​​van MIV, 1999. www.theperthgroup.com/aids/vftweiss.html

      29. Tahi D. (1998). Het Luc Montagnier MIV ontdek? Teks
      van video-onderhoud met professor Luc Montagnier by die Pasteur-instituut Julie
      18de 1997. Kontinuum 5:30-34. www.virusmyth.net/aids/data/dtinterviewlm.htm

      30. Gallo RC, Wong-Staal F, Reitz M, Gallagher RE, Miller
      N, Gillespie DH. Sommige bewyse vir aansteeklike tipe C-virus by mense. (1976). bl.
      385-405 In: Animal Virology Balimore D, Huang AS, Fox CF, eds Academic
      Press Inc., New York.

      31. Panem S. (1979). C Tik Virusuitdrukking in die
      Plasenta. Huidige onderwerpe in patologie 66:175-189.

      32. Grafe A. (1991). 'n Geskiedenis van eksperimentele virologie.
      Heidelberg: Springer-Verlag.

      33. Frank H. Retroviridae. (1987). bl. 253-256 In:
      Dierevirus en struktuur Nermut MV, Steven AC, eds Elsevier, Oxford.

      34. Gallo RC, Fauci AS. Die menslike retrovirusse. (1994). bl.
      808-814 In: Harrison se beginsels van interne geneeskunde Isselbacher KJ,
      Braunwald E, Wilson JD, Martin JB, Fauci AS, Kasper DL, eds 13 ed McGraw-Hill
      Inc., New York.

      35. Lower R, Lower J, Kurth R. (1996). Die virusse in alles
      van ons: Eienskappe en biologiese betekenis van menslike endogene
      retrovirus volgordes. Verrigtinge van die Nasionale Akademie van Wetenskappe van die
      Verenigde State van Amerika
      93:5177-5184.

      36. Yang J, Bogerd HP, Peng S, Wiegand H, Truant R, Cullen
      BR. (1999). 'n Antieke familie van menslike endogene retrovirusse kodeer vir 'n
      funksionele homoloog van die MIV-1 rev-proteïen. Verrigtinge van die Nasionale
      Akademie vir Wetenskappe van die Verenigde State van Amerika
      96:13404-8. www.pnas.org/cgi/content/full/96/23/13404

      37. Weiss RA, Friis RR, Katz E, Vogt PK. (1971). Induksie
      van voëlgewasvirusse in normale selle deur fisiese en chemiese karsinogene. Virologie
      46:920-938.

      38. Temin HM. (1974). Oor die oorsprong van RNA-tumorvirusse. Harvey
      Lesings
      69:173-197.

      39.Weiss R, Teich N, Varmus H, Coffin J, eds. RNA Tumor
      Virusse. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

      40. Aaronson SA, Todaro GJ, Scholnick EM. (1971).
      Induksie van muriene C-tipe virusse vanaf klonale lyne van virusvrye BALB/3T3
      selle. Wetenskap 174:157-159.

      41. Hirsch MS, Phillips SM, Solnik C. (1972). Aktivering
      van leukemievirusse deur graft-versus-gasheer en gemengde limfosietreaksies in
      Vitro. Verrigtinge van die Nasionale Akademie van Wetenskappe van die Verenigde State
      van Amerika
      69:1069-1072.

      42. Toyoshima K, Vogt PK. (1969). Verbetering en
      Inhibisie van voëlsarkoomvirusse deur polikatione en polianione. Virologie
      38:414-426.

      43. Todaro GJ, Benveniste RE, Sherr CJ. Interspesie
      Oordrag van RNA Tumor Virus Gene: Implikasies vir die soeke na
      "Menslike" tipe C-virusse. (1976). bl. 369-384 In: Diere Virologie
      Baltimore D, Huang AS, Fox CS, eds Academic Press Inc., New York.

      44. Rous P. (1911). A Sarcoma of the Fowl oordraagbaar deur
      'n middel wat van die Tumorselle geskei kan word. J Exp Med 13:397-411.

      45. Dansette PM, Bonierbale E, Minoletti C, Beaune PH,
      Pessayre D, Mansuy D. (1998). Geneesmiddel-geïnduseerde immunositotoksisiteit. Europese
      Tydskrif vir dwelmmetabolisme en farmakokinetika
      23:443-451.

      46. ​​Roitt IM. (1997). Roitt se essensiële immunologie.
      Negende uitg. Londen: Blackwell Science, 1997.

      47. Crawford DH, Azim T. Die gebruik van die Epstein-Barr-virus
      vir die produksie van menslike monoklonale teenliggaampies wat sellyne afskei. (1986). bl.
      1-6 In: Menslike monoklonale teenliggaampies: Huidige tegnieke en toekoms
      perspektiewe Brown J, ed IRL Press Ltd, Oxford.

      48. Guilbert B, Fellous M, Avrameas S. (1986). HLA-DR-spesifiek
      monoklonale teenliggaampies kruisreageer met verskeie self en nie-self nie-MHC
      molekules. Immunogenetika 24:118-121.

      49. Pontes de Carvalho LC. (1986). Die getrouheid van
      die immunoglobulienmolekule: kan monoklonale teenliggaampies ooit monospesifiek wees? Immunologie
      Vandag
      7:33.

      50. Ternynck T, Avrameas S. (1986). Murien natuurlik
      monoklonale teenliggaampies: 'n studie van hul polispesifisiteite en hul affiniteite. Immunologies
      Resensies
      94:99-112.

      51. Owen M, Steward M. Antigeenherkenning. (1996). bl.
      7.1-7.12 In: Immunologie Roitt I, Brostoff J, Male D, eds 4th ed Mosby,
      Londen.

      52. Gonzalez-Quintial R, Baccala R, Alzari PM, et al.
      (1990). Poli(Glu 60 Ala 30 Tyr 10 ) (GAT)-geïnduseerde IgG
      monoklonale teenliggaampies kruisreageer met verskeie self en nie-self antigene
      deur die komplementariteitsbepalende streke. Vergelyking met IgM monoklonaal
      polireaktiewe natuurlike teenliggaampies. Europese Tydskrif vir Immunologie
      20:2383-7.

      53. Parravicini CL, Klatzmann D, Jaffray P, Costanzi G,
      Gluckman JC. (1988). Monoklonale teenliggaampies teen die menslike immuniteitsgebrekvirus
      p18-proteïen kruisreageer met normale menslike weefsels. VIGS 2:171-177.

      54. Fauci AS, Laan HC. Menslike Immuniteitsgebrekvirus (MIV)
      Siekte: VIGS en verwante afwykings. (1994). bl. 1566-1618 In: Harrison's
      Beginsels van Interne Geneeskunde Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson JD, Martin
      JB, Fauci AS, Kasper DL, eds 13de uitgawe McGraw-Hill Inc., New York.

      55. Berzofsky JA, Berkower IJ, Epstein SL.
      Antigeen-teenliggaaminteraksies en monoklonale teenliggaampies. (1993). bl. 421-465 In:
      Fundamentele Immunologie Paul WE, ed 3rd ed Raven, New York.

      56. Baard JW. (1957). Fisiese metodes vir die ontleding van
      selle. Annale van die New York Academy of Sciences 69:530-544.

      57. Bader JP. Reproduksie van RNA Tumorvirusse. (1975).
      bl. 253-331 In: Omvattende Virologie Fraenkel-Conrat H, Wagne RR, eds
      Plenum Press, New York.

      58. Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. (1983).
      Isolasie van 'n T-limfotropiese retrovirus van 'n pasiënt met 'n risiko vir verworwe
      immuungebreksindroom (VIGS). Wetenskap 220:868-71.

      59. Popovic M, Sarngadharan MG, Lees E, Gallo RC. (1984).
      Opsporing, isolasie en deurlopende produksie van sitopatiese retrovirusse (HTLV-III)
      van pasiënte met vigs en pre-vigs. Wetenskap 224:497-500.

      60. Goudsmit G. (1997). Virale seks - die aard van vigs. Nuut
      York: Oxford University Press, 1997.

      61. Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al. (1984).
      Gereelde opsporing en isolasie van sitopatiese retrovirusse (HTLV-III) van
      Pasiënte met VIGS en in gevaar vir VIGS. Wetenskap 224:500-503.

      62. Sarngadharan M, G., Popovic M, Bruch L. (1984).
      Teenliggaampies wat reageer op menslike T-limfotrofiese retrovirusse (HTLV-III) in die
      Serum van pasiënte met vigs. Wetenskap 224:506-508.

      63. Schupbach J, Popovic M, Gilden RV, Gonda MA,
      Sarngadharan MG, Gallo RC. (1984). Serologiese analise van 'n subgroep van die mens
      T-limfotrofiese retrovirusse (HTLV-III) wat met VIGS geassosieer word. Wetenskap
      224:503-505.

      64. Maddox J. (1992). Meer oor Gallo en Popovic. Natuur
      357:107-109.

      65. Culliton BJ. (1990). Binne die Gallo-sonde. Wetenskap
      248:1494-1498.

      66. Francis DP. Die soeke na die oorsaak. (1983). bl.
      137-150 In: Die vigs-epidemie Cahill KM, ed 1st ed Hutchinson Publishing
      Groep, Melbourne.

      67. Gallo RC, Sarin PS, Kramarsky B, Salahuddin Z, Markham
      P, Popovic M. (1986). Eerste isolasie van HTLV-III. Natuur 321:119.

      68. Wofsy CB, Hauer LB, Michaelis BA, et al. (1986).
      Isolasie van VIGS-geassosieerde retrovirus van genitale afskeidings van vroue met
      teenliggaampies teen die virus. Lancet i:527-529.

      69. Vogt MW, Craven DE, Crawford DF, et al. (1986).
      Isolasie van HTLV-III/LAV van servikale afskeidings van vroue met 'n risiko vir VIGS. Lancet
      i:525-527.

      70. Henin Y, Mandelbrot L, Henrion R, Pradinaud R, Coulaud
      JP, Montagnier L. (1993). Virusuitskeiding in die servicovaginale afskeidings van
      swanger en nie-swanger MIV-geïnfekteerde vroue. Journal of Acquired Immune
      Gebreksindroom
      6:72-75.

      71. Lee MH, Sano K, Morales FE, Imagawa DT. (1987).
      Sensitiewe omgekeerde transkriptase-toets om mens op te spoor en te kwantifiseer
      immuniteitsgebrekvirus. Tydskrif vir Kliniese Mikrobiologie 25:1717-21.

      72. Temin HM, Baltimore D. (1972). RNA-gerigte DNA
      Sintese en RNA Tumor Virusse. Vooruitgang in virologienavorsing
      17:129-186.

      73. Varmus H. (1987). Omgekeerde transkripsie. Wetenskaplik
      Amerikaans
      257:48-54.

      74. Varmus HY. (1989). Omgekeerde transkripsie in bakterieë. Sel
      56:721-724.

      75. Lazcano A, Valverde V, Hernandez G, Gariglio P, Fox
      GE, Oro J. (1992). Oor die vroeë opkoms van omgekeerde transkripsie: teoreties
      basis en eksperimentele bewyse. Tydskrif vir Molekulêre Evolusie
      35:524-536.

      76. Varmus H. (1988). Retrovirusse. Wetenskap
      240:1427-1435.

      77. Chang LJ, Pryciak P, Ganem D, Varmus HE. (1989).
      Biosintese van die omgekeerde transkriptase van hepatitis B-virusse behels de
      novo
      translasie-inisiasie nie ribsomale raamverskuiwing nie. Natuur
      337:364-368.

      78. Mitsuya H, Broder S. (1989). Antiretrovirale
      chemoterapie teen menslike immuniteitsgebrekvirus (MIV) infeksie: perspektief
      vir terapie van hepatitis B-virus infeksie. Kankeropsporing en -voorkoming
      14:299-308.

      79. Lai CL, Chien RN, Leung NW, et al. (1998). Een jaar
      proef van lamivudien vir chroniese hepatitis B. Asië Hepatitis Lamivudien Studie
      Groep. New England Journal of Medicine 339:61-8.

      80. Neurath AR, Strick N, Sproul PSO. (1992). Soek vir
      hepatitis B virus sel reseptore openbaar bindingsplekke vir interleukien 6 op die
      virus koevert proteïen. Journal of Experimental Medicine 175:461-469.

      81. Vegnente A, Guida S, Lobo-Yeo A, et al. (1991). T
      limfosietaktivering word geassosieer met virale replikasie in chroniese hepatitis
      B-virus infeksie van die kinderjare. Kliniese en Eksperimentele Immunologie
      84:190-194.

      82. Sarria L, Gallego L, de las Heras B, Basaras M,
      Cisterna RSO. (1993). Produksie van hepatitis B-virus uit perifere bloed
      limfosiete gestimuleer met fitohemagglutinien. Enfermedades infecciosas y
      microbiologia clinica
      11:187-189.

      83. Gallo RC, Sarin PS, Wu AM. Oor die aard van die
      Nukleïensure en RNA-afhanklike DNA-polimerase van RNA-tumorvirusse en menslike
      Selle. (1973). bl. 13-34 In: Moontlike episodes in eukariote Silvestri LG,
      ed Noord-Holland Uitgewersmaatskappy, Amsterdam.

      84. Wong-Staal F, Hahn B, Manzuri V, et al. (1983). A
      opname van menslike leukemie vir volgordes van 'n menslike retrovirus. Natuur
      302:626-628.

      85. Whitkin SS, Higgins PJ, Bendich A. (1978). Inhibering
      van omgekeerde transkriptase en menslike sperm DNA-polimerase deur anti-sperm
      teenliggaampies. Kliniese en Eksperimentele Immunologie 33:244-251.

      86. Ono K, Ohashi A, Yamamoto A, et al. (1979).
      Diskriminasie van omgekeerde transkriptase van sellulêre DNA-polimerase deur kinetiese
      ontleding. Sellulêre en molekulêre biologie 25:323-8.

      87. Weissbach A, Baltimore D, Bollum F. (1975).
      Nomenklatuur van eukariotiese DNA-polimerases. Wetenskap 190:401-402.

      88. Gallo RC, Gallagher RE, Miller NR, et al. (1975).
      Verwantskappe tussen komponente in primaat RNA tumorvirusse en in die
      sitoplasma van menslike leukemie-selle: implikasies vir leukemogenese. Koud
      Spring Harbor Simposium oor Kwantitatiewe Biologie
      39:933-961.

      89. Klatzmann D, Montagnier L. (1986). Benaderings tot VIGS
      terapie. Natuur 319:10-11.

      90. Zagury D, Bernard J, Leonard R, et al. (1986).
      Langtermynkulture van HTLV-III-geïnfekteerde T-selle: 'n Model van sitopatologie van
      T-sel-uitputting in vigs. Wetenskap 231:850-853.

      91. Pachacz M. Nie nodig om gefaseerd te word nie. Aandele, 2001:
      28-32.

      92. Gallo RC, Shaw GM, Markham PD. Die etiologie van vigs.
      (1985). bl. In: VIGS Etiologie, Diagnose, Behandeling en Voorkoming DeVita
      VT, Hellman S, Rosenberg SA, eds 1ste uitgawe J.B. Lippincott Company, Philadelphia.

      93. Munn RJ, Preston MA, Yamamoto JK, Gardner MB. (1985).
      Ultrastrukturele vergelyking van die retrovirusse wat met mens en aap geassosieer word
      verworwe immuniteitsgebrek sindrome. Laboratoriumondersoek 53:194-199.

      94. Orenstein JM, Meltzer MS, Phipps T, Gendelman HE.
      (1988). Sitoplasmiese samestelling en akkumulasie van menslike immuniteitsgebrekvirus
      tipes 1 en 2 in rekombinante menslike kolonie-stimulerende faktor-1-behandelde mens
      monosiete: 'n ultrastrukturele studie. Journal of Virology 62:2578-2586.

      95. Hockley DJ, Wood RD, Jacobs JP. (1988). Elektron
      Mikroskopie van menslike immuniteitsgebreksvirus. Tydskrif vir Algemene Virologie
      69:2455-2469.

      96. Lecatsas G, Taylor MB. (1986). Pleomorfisme in HTLV-III,
      die VIGS-virus. Suid-Afrikaanse Mediese Tydskrif 69:793-794.

      97. Palmer E, Sporborg C, Harrison A, Martin ML, Feorino
      P. (1985). Morfologie en immuno-elektronmikroskopie van VIGS-virus. Argiewe
      van Virologie
      85:189-196.

      98. Dourmashkin RR, O'Toole CM, Bucher D, Oxford JS. Die
      teenwoordigheid van ontluikende virusagtige deeltjies in menslike limfoïede selle wat vir MIV gebruik word
      verbouing. VIIde Internasionale Konferensie oor VIGS 1991, Florence: 122.

      99. Garry RF, Fermin CD, Hart DJ, Alexander SS, Donehower
      LA, Luo-Zhang H. (1990). Opsporing van 'n menslike intrasisternale A-tipe retrovirale middel
      deeltjie wat antigeen verwant is aan MIV. Wetenskap 250:1127-9.

      100. O’Hara CJ, Groopmen JE, Federman M. (1988). Die
      Ultrastrukturele en Immunohistochemiese Demonstrasie van Virale Deeltjies in
      Limfknope van menslike immuniteitsgebreksvirus-verwante limfadenopatie-sindroom.
      Menslike Patologie 19:545-549.

      101. Gelderblom HR. (1998). MIV-volgorde databasis: Goed
      struktuur van MIV en SIV. http://hiv-web.lanl.gov/HTML/reviews/Gelderblom.html

      102. Layne SP, Merges MJ, Dembo M, et al. (1992). Faktore
      onderliggende spontane inaktivering en vatbaarheid vir neutralisering van
      menslike immuniteitsgebreksvirus. Virologie 189:695-714.

      103. Gougeon ML, Laurent-Crawford AG, Hovanessian AG,
      Montagnier L. (1993). Direkte en indirekte meganismes wat apoptose bemiddel tydens
      MIV-infeksie: bydrae tot in vivo CD4 T-sel uitputting. Immunologie
      5:187-194.

      104. Matthews TJ, Bolognesi DP. (1988). VIGS-entstowwe. Wetenskaplik
      Medisyne
      259:98-105.

      105. Callebaut C, Krust B, Jacotot E, Hovanessian AG.
      (1993). T-selaktiveringsantigeen, CD26, as 'n kofaktor vir toetrede van MIV in CD4+
      selle. Wetenskap 262:2045-2050.

      106. Weber JN, Weiss RA. (1988). MIV-infeksie: die
      sellulêre prentjie. Wetenskaplike Amerikaner 259:80-87.

      107. Moore JP, Nara PL. (1991). Die rol van die V3-lus
      en gp120 in MIV-infeksie. VIGS 5:S21-S33.

      108. Mortimer PP. (1989). Die VIGS-virus en die VIGS
      toets. Internasionale medisyne 56:2334-2339.

      109. Redfield RR, Burke DS. (1988). MIV-infeksie: Die
      kliniese beeld. Wetenskaplike Amerikaner 259:70-78.

      110. Rosenberg ZF, Fauci AS. (1990). Immunopatogeen
      meganismes van MIV-infeksie: sitokieninduksie van MIV-uitdrukking. Immunologie
      Vandag
      11:176-180.

      111. Haseltine WA, Wong-Staal F. (1988). Die molekulêre
      biologie van die VIGS-virus. Wetenskaplike Geneeskunde 259:34-42.

      113. Christie H. Onderhoud met Dr Robert Gallo 1 Julie
      Palexpo Konferensiesentrum Genève. [Betacam]. New York, 1998.

      114. Tristem M. (2000). Identifikasie en
      karakterisering van nuwe menslike endogene retrovirusfamilies deur filogenetiese
      sifting van die menslike genoom kartering projek databasis. Journal of Virology
      74:3715-30. http://jvi.asm.org/cgi/content/full/74/8/3715

      115. O'Connell C, O'Brien S, Nash WG, Cohen M. (1984).
      ERV3, 'n vollengte menslike endogene provirus: chromosomale lokalisering en
      evolusionêre verhoudings. Virologie 138:225-35. www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/ Omim/getmim%3ffield=medline_uid&search=6495650

      116. Larsson E, Kato N, Cohen M. (1989). Mens endogeen
      provirusse. Huidige onderwerpe in mikrobiologie en immunologie 148:115-132.

      117. Essex M, McLane MF, Lee TH, et al. (1983). Teenliggaampies
      aan selmembraanantigene wat verband hou met menslike T-sel leukemievirus in
      pasiënte met vigs. Wetenskap 220:859-62.

      118. Morozov VA, Ilyinskii PO, Uckert WA, Wunderlich W,
      Ilyin KV. (1989). Teenliggaampies teen strukturele en niestrukturele gag-gekodeerde proteïene
      van tipe D retrovirusse by mense met limfadenopatie en vigs. Internasionaal
      Tydskrif vir Weefselreaksie
      11:1-5.

      119. Matsiota P, Chamaret S, Montagnier L. (1987).
      Opsporing van natuurlike outo-teenliggaampies in die serum van anti-MIV
      Positief-Individue. Annales de l'Institut Pasteur Immunologie
      138:223-233.

      120. Calabrese LH. (1988). Outo-immuun manifestasies van
      menslike immuniteitsgebrekvirus (MIV) infeksie. Klinies en Laboratorium
      Medisyne
      8:269-279.

      121. Bonara P, Maggioni L, Colombo G. Anti-limfosiet
      teenliggaampies en vordering van siekte by MIV-geïnfekteerde pasiënte. VII
      Internasionale VIGS-konferensie 1991, Florence: 149.

      122. Burke DS. (1989). Laboratoriumdiagnose van die mens
      immuniteitsgebrekvirus infeksie. Kliniese en Laboratoriumgeneeskunde
      9:369-392.

      123. Belshe RB, Clements ML, Keefer MC, et al. (1994).
      Interpretasie van MIV-serodiagnostiese toetsresultate in die 1990's: sosiale risiko's van MIV
      entstofstudies in onbesmette vrywilligers. Annale van Interne Geneeskunde
      121:584-589.

      124. Mortimer P, Codd A, Connolly J, et al. (1992).
      Op pad na foutvrye MIV-diagnose: notas oor laboratoriumpraktyke. Openbare gesondheid
      Laboratoriumdiens Mikrobiologie Digest
      9:61-64.

      125. Chamaret S, Squinazi F, Courtois Y, Montagnier L.
      Teenwoordigheid van teenliggaampies teen MIV in gebruikte spuite wat op openbare plekke weggelaat word,
      strande of ingesamel deur uitruilprogramme. XIde Internasionale Konferensie oor
      VIGS 1996, Vancouver.

      126. Arthur LO, Bess JW, Jr., Urban RG, et al. (1995).
      Makake wat met HLA-DR geïmmuniseer is, word beskerm teen uitdaging met ape
      immuniteitsgebrekvirus. Journal of Virology 69:3117-24.

      127. Henderson LE, Sowder R, Copeland TD. (1987). Direk
      Identifikasie van Klas II Histoversoenbaarheid DR Proteïene in voorbereidings van
      Menslike T-sel limfotropiese virus tipe III. Journal of Virology 61:629-632.

      128. Pinter A, Honnen WJ, Tilley SA, et al. (1989).
      Oligomere struktuur van gp41, die transmembraanproteïen van die mens
      immuniteitsgebrekvirus tipe 1. Journal of Virology 63:2674-9.

      129. Bess JW, Gorelick RJ, Bosche WJ, Henderson LE, Arthur
      LU. (1997). Mikrovesikels is 'n bron van kontaminerende sellulêre proteïene wat gevind word
      in gesuiwerde MIV-1-preparate. Virologie 230:134-144.

      130. Gluschankof P, Mondor I, Gelderblom HR, Sattentau QJ.
      (1997). Selmembraanvesikels is 'n groot kontaminant van gradiëntverrykte
      menslike immuniteitsgebreksvirus tipe 1-preparate. Virologie 230:125-133.

      131. Smith RG, Donehower L, Gallo RC, Gillespie DH.
      (1976). Vinnige suiwering van 70S RNA uit media van selle wat RNA tumor produseer
      virusse. Journal of Virology 17:287-290.

      132. Gillespie D, Marshall S, Gallo RC. (1972). RNA van RNA
      tumorvirusse bevat poly A. Natuur: Nuwe biologie 236:227-231.

      133. Sasaki H, Nakamura M, Ohno T, Matsuda Y, Yuda Y,
      Nonomura Y. (1995). Miosien-aktien interaksie speel 'n belangrike rol in die mens
      immuniteitsgebrekvirus tipe 1 vrystelling van teikenselle. Verrigtinge van die
      Nasionale Akademie of Wetenskappe van die Verenigde State van Amerika
      92:2026-2030.

      134. Choudhury S, El-Farrash MA, Kuroda MJ, Harada S.
      (1996). Retensie van MIV-1 binne besmette MOLT-4 selle in samewerking met
      adhesie-geïnduseerde sitoskelet herorganisasie. VIGS 10:363-368.

      135. Orentas RJ, Hildreth JEK. (1993). Vereniging van gasheer
      seloppervlakadhesiereseptore en ander membraanproteïene met MIV en SIV. VIGS
      Navorsing en menslike retrovirusse
      9:1157-1165.

      136. Pearce-Pratt R, Malamud D, Phillips DM. (1994). Rol
      van sitoskelet in sel-tot-sel-oordrag van menslike immuniteitsgebrekvirus. Tydskrif
      van Virologie
      68:2898-2905.

      137. Small JV, Langanger G. (1981). Organisasie van aktien
      in die voorpunt van gekweekte selle: invloed van osmiumtetroksied en
      dehidrasie op die ultrastruktuur van actin meshworks. Die Tydskrif van Sel
      Biologie
      91:695-705.

      138. Jackobson K, O'Dell D, Holifield B, Murphy TL,
      Augustus JT. (1984). Herverdeling van 'n groot seloppervlak glikoproteïen tydens
      sel beweging. Die Tydskrif vir Selbiologie 99:1613-1623.

      139. Carpen O, Pallai P, Staunton DE, Springer TA. (1992).
      Assosiasie van intersellulêre adhesiemolekule-1 (ICAM-1) met aktienbevattende
      sitoskelet en α-aktinien. Die Tydskrif vir Selbiologie
      118:1223-1234.

      140. Herman IM, Crisona NJ, Pollard TD. (1981). Verhouding
      tussen selaktiwiteit en die verspreiding van sitoplasmiese aktien en miosien. Die
      Tydskrif vir selbiologie
      90:84-91.

      141. Wang YL. (1985). Uitruil van aktien subeenhede by die
      voorpunt van lewende fibroblaste: 'n moontlike rol van trapmeul. Die
      Tydskrif vir selbiologie
      101:597-602.

      142. Papadopulos-Eleopulos E. (1982). 'n Mitotiese teorie. Tydskrif
      van Teoretiese Biologie
      96:741-758.

      143. Papadopulos-Eleopulos E, Knuckey N, Dufty A, Fox RA.
      (1989). Belangrikheid van die redokstoestand in vasokonstriksie wat deur adrenalien geïnduseer word
      en serotonien. Kardiovaskulêre Navorsing 23:662-665.

      144. Papadopulos-Eleopulos E, Knuckey N, Dufty A, Fox RA.
      (1985). Bewyse dat die redokstoestand 'n rol het in spiersametrekking en
      ontspanning. Fisiologiese Chemie en Fisika en Mediese KMR
      17:407-412.

      145. Rivabene R, Varano B, Gessini S, et al. Gekombineer
      behandeling met 3-aminobensamied en N-asetielsisteïen inhibeer MIV-replikasie in
      U937-geïnfekteerde selle. XIth International AIDS Conference 1996, Vancouver: DocID:
      Di. A.2032.

      146. Steinhauer DA, Holland JJ. (1987). Vinnige evolusie van
      RNA virusse. Jaarlikse oorsig van mikrobiologie 41:409-33.

      147. Kozal MJ, Shah N, Shen N, et al. (1996). Uitgebreide
      polimorfismes waargeneem in MIV-1 klade B protease geen met behulp van hoë-digtheid
      oligonukleotied skikkings. Natuurgeneeskunde 2:753-759.

      148. Ottman M, Innocenti P, Thenadey M, Micoud M,
      Pelloquin F, Seigneurin JM. (1991). Die polimerase kettingreaksie vir die
      opsporing van MIV-1 genomiese RNA in plasma van besmette individu. Tydskrif van
      Virologiese metodes
      31:273-284.

      149. Lauritsen JL. NIDA-vergadering vra vir navorsing oor
      die poppers-Kaposi se sarkoom verband. (1995). bl. 325-330 In: VIGS:
      Virus- of Dwelmgeïnduseerde Duesberg PH, ed Kluwer Academic Publishers, Londen.

      150. Lauritsen J. (1994). NIDA-vergadering vra vir navorsing
      in die Poppers-Kaposi's Sarcoma Connection. Die inboorling van New York . www.virusmyth.net/aids/data/jlpoppers.htm

      151. Owens DK, Holodniy M, Garber AM, et al. (1996).
      Polimerase kettingreaksie vir die diagnose van MIV-infeksie by volwassenes. A
      meta-analise met aanbevelings vir kliniese praktyk en studie-ontwerp. Annale
      van Interne Geneeskunde
      124:803-15.

      152. McClintock B. (1984). Die betekenis van reaksies
      van die genoom uit te daag. Wetenskap 226:792-801.

      153. Weiner AM, Deininger PL, Efstratiadis A. (1986).
      Nievirale retroposons: gene, pseudogene en transponeerbare elemente gegenereer deur
      die omgekeerde vloei van genetiese inligting. Jaarlikse hersiening van biochemie
      55:631-661.

      154. Leib-Mosch C, Brack-Werner R, Werner T, et al.
      (1990). Endogene retrovirale elemente in menslike DNA. Kankernavorsing
      50:5636s-5642s.

      155. Covello PS, Grey MW. (1989). RNA redigering in plant
      mitochondria. Natuur 341:662-666.

      156. Eisen H. (1988). RNA-redigering: Wie is eerste aan? Sel
      53:331-332.

      157. Lamond AI. (1988). RNA redigering en die geheimsinnige
      geheime gene van tripansomatiese mitochondria. Tendense in Biochemiese
      Wetenskappe
      13:283-284.

      158. Maizels N, Weiner N. (1988). Op soek na 'n sjabloon.
      Natuur 334:469-470.

      159. Montagnier L. (2000). Geskrewe getuienis aan die VSA
      Huis van Verteenwoordigers. www.house.gov/reform/ns/hearings/subfolder/urnovitztest.htm

      160. Urnovitz HB, Tuite JJ, Higashida JM, Murphy WH.
      (1999). RNA's in die sera van veterane van die Persiese Golfoorlog het segmente wat homoloë is
      na chromosoom 22q11.2. Kliniese Diagnostiese Laboratorium Immunologie 6:330-5.
      http://cdli.asm.org/cgi/content/full/6/3/330

      161. Kelleher CA, Wilkinson DA, Freeman JD, Mager DL,
      Gelfand EW. (1996). Uitdrukking van nuwe transposon-bevattende mRNA's in menslike T
      selle. Tydskrif vir Algemene Virologie 77:1101-10.

      162. Papadopulos-Eleopulos E, Hedland-Thomas B, Veroorsakende DA,
      Dufty AP. (1989). 'n Alternatiewe verduideliking vir die radiosensibilisering van VIGS
      pasiënte. Internasionale Tydskrif vir Bestralingsonkologie en Biologiese Fisika
      17:695-697.

      163. Urnovitz HB. (2000). Verklaring vir die Durban VIGS
      konferensie. . www.chronicillnet.org/AIDS/durban.htm

      164. Ameisen J, Capron A. (1991). Sel disfunksie en
      uitputting in vigs: die geprogrammeerde seldood hipotese. Immunologie vandag
      12:102-105.

      165. Urnovitz HB, Murphy WH. (1996). Mens endogeen
      retrovirusse: aard, voorkoms en kliniese implikasies in menslike siekte. Klinies
      Mikrobiologiese Resensies
      9:72-99.

      166. Boussin, F., Rey, F., Dormont, D. et al. 1988. Isolasie van MIV in a
      seronegatiewe demente pasiënt sonder simptome van immuungebrek. Kanker
      Opsporing en Voorkoming.
      12:257-265.

      167. Bayliss, G.J., Jesson, W.J., Evans, B.A. et al. 1989. Isolasie van MIV-1
      uit klein volumes gehepariniseerde volbloed. VIGS 3:45-49.

      168. Webster, A.D.B., Dalgleish, A.G., Beattie, R. et al. 1986. Isolasie van
      retrovirusse van twee pasiënte met "Common Variable"
      Hipogmaglobulienemie. Lancet i:581-582.

      169. Montagnier, Chermann, Barre-Sinossi et al. 'n Nuwe menslike limfotroop
      retrovirus karakterisering en moontlike rol in limfadenopatie en vigs, in
      Menslike T-selleukemie/limfoomvirus, geredigeer deur Robert C. Gallo, Cold Spring
      Hawelaboratorium, 1984, bladsye 363-379.

      170. Schupbach, J., Jendis, J.B., Bron, C. et al. 1992. Vals-positiewe MIV-1
      viruskulture met behulp van volbloed. VIGS 6:1545-1546.

      Verwysings oor inleidende opmerkings

      1. Padian NS, Shiboski SC, Glas SO, Vittinghoff E. Heteroseksuele oordrag
      van menslike immuniteitsgebrekvirus (MIV) in Noord-Kalifornië: resultate van a
      tien jaar studie. American Journal of Epidemiology 1997146:350-357.

      2. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Alfonso H, Page BAP,
      Veroorsaak D, et al. Moeder na kind Oordrag van MIV en die voorkoming daarvan met
      ATZ en Nevirapien
      . Perth: The Perth Group, 2001. http://aidsmyth.addr.com/report/news/newperthpaper.htm

      3. Papadopulos-Eleopulos E. Herwaardering van VIGS: Word die oksidasie veroorsaak deur
      die risikofaktore die primêre oorsaak? Mediese hipoteses 198825:151-162.

      4. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM. Kaposi se sarkoom
      en MIV. Mediese hipoteses 199239:22-9.

      5. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM. Oksidatiewe stres,
      MIV en VIGS. Navorsing in Immunologie 1992143:145-8.

      6. Papadopulos-Eleopopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Hedland-Thomas B,
      Veroorsaak D, Bladsy B. 'n Kritiese analise van die MIV-T4-sel-VIGS hipotese. Genetika
      199595:5-24.

      7. Papadopulos-Eleopopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Bialy H. VIGS in
      Afrika: Onderskeidende feit en fiksie. World Journal of Microbiology en
      Biotegnologie
      199511:135-143.

      8. Papadopulos-Eleopopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D. Factor
      VIII, MIV en vigs by hemofilie: 'n ontleding van hul verhouding. Genetika
      199595:25-50.

      9. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D. Die
      Isolasie van MIV: Is dit werklik bereik? Kontinuum 19964:1s-24s.

      10. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM. Virus Uitdaging. Kontinuum
      19964:24-27.

      11. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Causer DS, Papadimitriou JM. MIV
      oordrag deur skenkersem. Lancet 1996347:190-1.

      12. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D. HIV
      teenliggaampies: Verdere vrae en 'n pleidooi vir verduideliking. Huidige Medies
      Navorsing en opinie
      199713:627-634.

      13. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D, Bladsy B.
      MIV-teenliggaampietoetse en virale lading - nog onbeantwoorde vrae en 'n verdere pleidooi
      ter verduideliking. Huidige Mediese Navorsing en Opinie 199814:185-186.

      14. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D, Alphonso
      H, Miller T. 'n Kritiese analise van die farmakologie van AZT en die gebruik daarvan in VIGS.
      Huidige Mediese Navorsing en Opinie 199915 (Bylae 1):1s-45s.

      15. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF. Ontleding van moeder-tot-kind
      oordrag van MIV en die HIVNET 012 (Nevirapien)-proef vanaf Uganda, 2001 www.theperthgroup.com/aids

      16. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Alfonso H, Page BA,
      Veroorsaak D, et al. Wêreldwye stemme oor MIV/VIGS. Heteroseksuele oordrag van MIV in
      Afrika is nie hoër as enige ander plek nie. British Medical Journal
      2002324:1035 /cgi/content/full/324/7344/1034#resp3

      17. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Alfonso H, Page BAP,
      Veroorsaak D, et al. Hoë koerse van MIV-seropositiwiteit in Afrika-alternatief
      verduideliking. in die pers Internasionale Tydskrif vir STD en VIGS 2003.


      Opsomming

      Die lengte en samestelling van poli(A)-sterte reguleer mRNA-lot. Hierdie studie identifiseer PPR-domein proteïen KPAF3 in die mitochondrion van Trypanosoma brucei, en wys dit om mRNA-redigering te fasiliteer deur die 3'-modifikasietoestand van spesifieke RNA's te beheer.

      • 3′–5′ snoei deur die mitochondriale prosesoom (MPsome) is die belangrikste verwerkingsweg vir primêre mitochondriale transkripsies.
      • Reeksspesifieke KPAF3-binding onderskei pre-mRNA's van rRNA's.
      • KPAF3 beskerm mRNA teen degradasie deur die MPsome.
      • KPAF3 stimuleer mRNA-adenilering deur KPAP1 en inhibeer uridilering deur RET1.
      • Differensiële KPAF3-binding aan vooraf geredigeerde mRNA's verseker dat slegs geadenileerde mRNA's oorgaan na U-invoeging/skrap-redigering.

      Resultate

      Kloning kakapo

      In 'n skerm vir mutasies wat prosesse beïnvloed wat integrien-adhesie vereis, het ons voorheen 19 allele geïsoleer van 'n embrioniese dodelike lokus wat ons genoem het kopupu (Walsh en Brown, 1998). Hierdie aantal allele is baie groter as die getal wat in ander gene op dieselfde chromosoomarm gevind word (2–9 allele/geen), wat aantoon dat kakapo is hoogs veranderlik, en daarom is dit waarskynlik 'n groot geen. Aanvullingstoetsing het aan die lig gebring dat ons kopupu mutante is allelies met die voorheen genoemde kakapo allele wat in 'n soortgelyke skerm geïsoleer is (Prout et al., 1997), daarom verwys ons nou na hierdie geen as kakapo. Die kakapo (kak) lokus is oorspronklik gekarteer na Df(2R)CX1 (Prout et al., 1997 Walsh en Brown, 1998), en deur gebruik te maak van oorvleuelende tekortkominge het ons die sitologiese interval wat bevat verder vernou kak na 50B3-50D2, aangesien dit steeds binne ingesluit is Df(2R)MK1. Ons het toe dodelike P-element-invoegingsallele getoets wat na hierdie sitologiese interval gekarteer is (sien Materiale en Metodes), en gevind dat twee-l(2)k03010 en l(2)k03405-daardie kaart na 50C9-10 is allelies aan kak, en so het ons hulle herdoop kak P1 en kak p2 . Die dodelikheid van beide P-elementlyne kan omgekeer word deur die P-element uit te spring, soos aangeteken deur verlies van die w + merker (data nie gewys nie), wat aantoon dat die kak mutasies word geassosieer met die invoeging van die w + P-element. Ons het die genomiese DNA wat die plek van invoeging flankeer deur plasmied-redding herwin en gevind dat beide P-elemente op presies dieselfde plek ingevoeg word.

      Met behulp van die DNA wat die P-element flankeer, is vyf verskillende cDNA-klone herwin (Fig. 1,a). Twee van die cDNA's strek tot vermoedelike 5'-punte, aangesien elkeen veelvuldige stopkodons bevat voor 'n ATG wat 'n lang oop leesraam inisieer. Die twee cDNA's kodeer alternatiewe NH2-terminale volgordes van 143 aminosure (vorm A) en 32 aminosure (vorm B) voordat gedeelde rye bereik word. Hierdie twee cDNA's verteenwoordig alternatiewe begin van transkripsie (data nie getoon nie), en die P-elemente word ingevoeg in die intron wat die alternatiewe begin van die gedeelde eksons skei, en sal dus waarskynlik beide mRNA's beïnvloed deur voortydige beëindiging van die transkripsies te veroorsaak. Al vyf cDNA's het dieselfde 3'-einde, maar toe ons die volgorde van hierdie klone voltooi het, het ons opgemerk dat daar 'n splitsingsskenkerplek net voor die einde van die oop leesraam is, en dat daar geen duidelike poliadenilasieplek naby die poly A stert (nie getoon nie). Hierdie resultaat het voorgestel dat hierdie klone kopieë kan wees van onvolledig gesplitste mRNA's wat begin by 'n loop van As in 'n intron, soos voorheen gevind in hierdie oligo dT geprimeerde biblioteek (Brown et al., 1989), en is bevestig deur die vind van 'n lopie van Soos aan die einde van hierdie klone in die genomiese DNA (nie getoon nie). Ons het dus die biblioteke met die meeste 3′-gedeelte van die oop leesraam weer gekeur, en een nuwe kloon herwin (Fig. 1,a, Top) wat, wanneer dit in volgorde gerangskik is, gevind is dat dit regdeur sy lengte oop was. Op hierdie stadium, toe ons cDNA's en genomiese volgorde herwin het wat saam 'n proteïen van 2 557 aminosure gekodeer het, het ons volgordes met D. Strumpf en T. Volk uitgeruil en ontdek dat ons dieselfde geen kloon, en dat hul cDNA-volgorde oorvleuel met ons s'n en het ons cDNA-volgorde 3′ uitgebrei (sien Strumpf en Volk, 1998). Saam oorvleuel die cDNA-volgordes om mRNA's van 17,420 nt te gee wat vir 'n 5,497-aminosuurproteïen (vorm A) en 17,217 nt kodeer wat vir 'n 5,385-aminosuurproteïen kodeer (vorm B Fig. 1) a).

      Die Kakapo-proteïen is homoloog aan pletien en distonien by die NH2 Terminus, en na Dystrofin by die COOH-terminus

      Databasissoektogte met behulp van die voorspelde proteïenvolgorde van Kakapo het treffende ooreenkomste met drie afsonderlike klasse proteïen aan die lig gebring. Die NH2-terminale streek (residu 135-1200) stem die meeste ooreen met die plakienklas van sitoskeletale kruisbinderproteïene, insluitend pektien, ACF7 en BPAG1/distonien (Ruhrberg en Watt, 1997). Hierdie wyduitgedrukte proteïene is geïmpliseer in die kruisbinding van aktien aan intermediêre filamente in hemidesmosome, in die stabilisering van neuronale strukture (Wiche et al., 1991 Bernier et al., 1996 Yang et al., 1996), en wanneer dit defektief is, veroorsaak dit epidermale blase. , ataksie en neurodegenerasie (Guo et al., 1995 McLean et al., 1996 Andra et al., 1997 Dowling et al., 1997). Die area van die sterkste ooreenkoms is met 'n aktien-bindende domein wat oorspronklik in α-aktinien gedefinieer is, maar daarna gevind word in distrofiene en spektriene sowel as die plakienfamilie (Dubreuil, 1991). Oor hierdie 240-aminosuurstreek deel Kakapo ~65% aminosuur-identiteit met pektien en BPAG1 (Fig. 1,b). Die hoë vlak van bewaring dui daarop dat hierdie domein in Kak wel aan aktien bind. Ons het ook in die databasis 'n verwante volgorde van geïdentifiseer C. elegans (CeKak binne kosmied ZK1151) wat baie ooreenstem met Kak in sy aktien-bindende domein, en filogenetiese analise van hierdie verwante aktien-bindende domeine plaas Kak ondubbelsinnig onder die plakiene of plektienfamilie eerder as die spektrien- of distrofiengroepe (Fig. 1,c). Die noue ooreenkoms met plakiene duur voort vir die volgende 1 000 aminosure van Kak wat ~26% identiteit met plakiene deel in vergelyking met 22% identiteit met spektriene of distrofiene. Hierdie ooreenkoms buite die aktien-bindende domein is met 'n streek in die plakins met geen bekende ensiematiese funksie nie, maar sluit 'n voorspelde bolvormige kopgebied in en baie van die daaropvolgende staafdomein wat gevorm word uit 'n opgerolde spoel van alfa-helikse (Tang et al., 1996) ). Alle proteïene wat tot dusver in die plakin-familie beskryf is, het 'n karboksie-terminale domein wat intermediêre filamente bind, gekodeer deur 'n enkele groot finale ekson (Ruhrberg en Watt, 1997). Dit blyk nie die geval te wees vir die Kak-proteïen nie, wat, na residu 1200, geen verdere volgorde-ooreenkoms met plakiene het nie, en eerder soortgelyk aan distrofien word (Fig. 1) a).

      Die sentrale streek van Kakapo (aminosure 1 200–4 950) bestaan ​​uit 22 herhalings van ~109 aminosure. Hierdie herhalings is die nouste verwant aan dié wat in die sentrale staafgedeelte van die distrofienfamilie gevind word (Koenig et al., 1988), en is deel van die groter familie van spektrienherhalings (sien Strumpf en Volk, 1998 vir verdere ontleding). Distrofien bind ook aktien, en is gepostuleer om die herhalingsgedeelte te gebruik as 'n buigsame spasieerder tussen die kortikale aktien-sitoskelet en membraangebonde distroglikaanproteïene in spiere (Koenig en Kunkel, 1990).

      Die karboksieterminus van distrofien bevat 'n groep wydbewaarde domeine wat kalsium bind en interaksies met 'n verskeidenheid membraangebonde en regulerende proteïene bemiddel. Kak bevat 'n verwante maar duidelike COOH-terminus wat 'n lae vlak van ooreenkoms met die WW-domein en Ca++-bindende EF-hande in distrofien behou (sien Strumpf en Volk, 1998), maar het nie die behoue ​​sisteïene of finale helikse wat kenmerk die distrofienproteïeninteraksiemotiewe (Brown en Lucy, 1997). In plaas daarvan het Kak 'n streek van ooreenkoms met Gas2, 'n aktien-geassosieerde proteïen wat spesifiek uitgedruk word in groei-gestopte gekweekte selle (Brancolini et al., 1992). Die streek van ooreenkoms met Gas2 is nie enige spesifieke funksie toegeken nie, maar dit word behou in Gas2 delesies of protease splitsingsprodukte wat dramatiese apoptose-agtige herrangskikkings van die aktien-sitoskelet in selkultuur gee (Brancolini et al., 1995). Die samevoeging van segmente van die kakapo geen wat homoloog is aan verskillende tipes proteïen, het die kommer laat ontstaan ​​dat ons 'n cDNA herwin het van 'n afwykende transkripsie wat by eksons van aangrensende gene aangesluit het. Benewens die cDNA wat ons geïsoleer het wat by die plektien- en distrofiendomeine aansluit, het ons kollegas egter 'n tweede cDNA geïsoleer wat ook hierdie twee streke verbind (Strumpf en Volk, 1998), wat hulle op 'n ander posisie verbind en verdere alternatiewe splitsing van hierdie geen demonstreer . Ons het ook twee bykomende cDNA's herwin wat die Gas2-domein met die distrofienstreek verbind (data nie gewys nie). Ons is dus vol vertroue dat hierdie diverse domeine in 'n enkele proteïen in Drosophila, en soos pektien, distonien en distrofien word verskeie isovorme geproduseer (Brown en Lucy, 1997 Ruhrberg en Watt, 1997).

      In die embrio word Kakapo sterk uitgedruk in die epidermis op plekke van PS Integrin-bemiddelde adhesie

      Mutasies in kakapo is geïsoleer omdat hulle dieselfde fenotipe het as mutasies in die PS-integrine: wanneer klone van selle wat hierdie geenprodukte ontbreek, in die ontwikkelende vlerk geproduseer word, versuim daardie selle om aan die opponerende vlerklaag te heg tydens papie-ontwikkeling, wat 'n blaas in die volwassene veroorsaak. vlerk. As 'n eerste stap om te bepaal of kakapo het ook 'n rol in PS integrien-gemedieerde adhesie in die embrio, ons wou vasstel of hulle saam in die embrio uitgedruk word. Ons het dus antisera opgewek teen 'n samesmeltingsproteïen wat die aminoterminus van Kakapo vorm A bevat (sien Materiale en Metodes). Met behulp van affiniteit-gesuiwerde anti-Kakapo antisera, het ons embrio's gekleur en gevind dat Kakapo sterk uitgedruk word in spesifieke epidermale selle (Fig. 2). Dit is gespesialiseerde epidermale selle wat aan die spiere heg, wat die spiere aan die eksoskelet verbind (kutikula, bv. Prokop et al., 1998a). Spieraanhegting vereis die funksie van die PS-integrine, wat sterk uitgedruk word aan die punte van die spiere en in die epidermale spieraanhegtingselle (sien Brown, 1993). Kakapo word dus sterk uitgedruk in dieselfde embrioniese selle wat hoë vlakke van die PS-integrine uitdruk.

      Om die spesifisiteit van ons teenliggaam te demonstreer, het ons dit getoets kak mutante embrio's. Embrio's homosigoties vir die kak p2 alleel toon geen kleuring met ons affiniteit-gesuiwerde anti-Kakapo antisera nie, wat toon dat hierdie teenliggaampies spesifiek is vir die geenproduk wat deur die P-element invoeging ontwrig is (Fig. 3, Top). Ons het bevestig dat teenliggaampies mutante embrio's kan binnedring en merk deur dubbele kleuring met mAb19 (Volk en VijayRaghavan, 1994), wat steeds die mutante embrio's gemerk het (Fig. 3, onderkant). Ons het volgende ons teenliggaam gebruik om te bepaal of die Kakapo-proteïen wat in embrio's gevind word die grootte is wat voorspel is vanaf die cDNA-volgorde (>600 kD). Western klad-analise van embrio-proteïen toon dat die anti-Kak-teenliggaam hoofsaaklik 'n enkele hoë-molekulêre gewig band in wild-tipe lysate herken wat baie stadiger migreer as die 250-kD merker (Fig. 3,b). Klein hoeveelhede korter proteïene kan gesien word wat afbreekprodukte of minder volop alternatiewe vorms kan wees. In lysate van embrio's heterosigoties vir kak V168 , 'n sterk x-straal alleel, het ons die wildtipe proteïen en 'n afgeknotte vorm opgespoor (Fig. 3 b), wat wys dat die bespeurde proteïen gemodifiseer word deur a kakapo mutasie. Die antiserum is dus spesifiek vir Kakapo-geenprodukte wanneer dit vir beide immunofluoressensie en Western blotting gebruik word.

      Verdere ontleding van Kakapo-uitdrukking toon dat die proteïen teen hoë vlakke in al die epidermale spieraanhegtingselle teenwoordig is (Fig. 2 en 4,a): beide dié wat direk aan die spiere heg en dié wat indirek via die tendonmatriks heg (Prokop et al., 1998)a). Ons het die eerste keer sterk Kakapo-uitdrukking in hierdie selle opgespoor teen middel-laat stadium 16, wat ~4 uur is nadat die spiere eers aan die epidermis begin heg het. Tydens die laaste twee stadiums van embriogenese—16 en 17—word aanhegting van die epidermale selle aan die spiere of die tendonmatriks uitgebrei deur uitbreiding van die hemiadherens-aansluitings, opeenhoping van tendonmatriks en verhoogde uitdrukking van β1-tubulien (Buttgereit et al., 1991 Prokop et al., 1998a). Ons bespeur geen uitdrukking van Kakapo in die spiere nie (Fig. 2,c, 4 a, en 5), al word vergelykbare hemiadherens-aansluitings, gekenmerk deur membraan-proksimale elektron-digte plate waarin sitoskeletale elemente insit, daar gevorm en die adhesie is ook integrien-afhanklik (Prokop et al., 1998)a). Hierdie verskil kan daarop dui dat Kakapo 'n funksie het wat onversoenbaar is met spiersametrekking, soos die vorming van stabiele ankerstrukture. Kakapo word ook sterk uitgedruk in twee interne strukture: die farinks en die proventriculus (Fig. 2,c en 4, d-h). In die farinks word Kakapo sterk uitgedruk in die endodermale sellae wat aan die faringeale spiere heg, soos gesien deur Kakapo in Fig. 4 te vergelyk,d na 'n Nomarski-beeld van hierdie weefsels wat op 'n soortgelyke stadium vir die spiere gekleur is (Fig. 4,e). Soos met die epidermale selle wat aan die somatiese spiere heg (sien hieronder), word Kakapo gevind beide by die basale oppervlak wat die mesoderm kontak en by die apikale oppervlak, terwyl die PS integrine net by die basale oppervlak gelokaliseer is (Leptin et al. , 1989). In die proventriculus word Kakapo uitgedruk in 'n ring van selle by die anterior marge van die buitenste laag van hierdie drie-lae struktuur (Fig. 4, f en g). Uitdrukking van die PS-integrine word hoofsaaklik gevind by die raakvlak tussen die buitenste endodermale laag van die proventriculus en die omliggende viscerale mesoderm (Fig. 4,h). Daarom word die integrine in hierdie weefsel in meer selle as Kakapo uitgedruk. Dit is nie duidelik hoekom sterk uitdrukking van Kakapo op hierdie terrein nodig mag wees nie, maar een fenotipe van integrienmutasies is dat die binneste lae van die proventriculus uitgetrek word (Martin-Bermudo et al., 1997), wat daarop dui dat 'n mate van weerstand teen meganiese stres is normaalweg nodig om die integriteit van die proventriculus-struktuur te handhaaf. Ons kan ook beskeie Kakapo-uitdrukking opspoor in die scolopale van die chordotonale organe van die perifere senuweestelsel (Fig. 4) c). 'n Funksie vir die PS-integrine in hierdie selle is tot dusver nie waargeneem nie, maar, soos spieraanhegtingselle, is dit 'n plek van gestabiliseerde β1 mikrotubuli-gebaseerde rigiditeit (Prokop et al., 1998b).

      Kakapo is geleë op beide die apikale en basale oppervlaktes van die epidermale spieraanhegtingselle

      In die epidermale spieraanhegtingselle is die PS-integrine gelokaliseer na die basale oppervlak (Leptin et al., 1989), wat groot hemiadherens-aansluitings bevat (Prokop et al., 1998)a). Mikrotubuli strek vanaf hierdie basale aansluitings na die apikale hemiaadherens aansluitings, wat met die eksoskelet (kutikula) verbind. Die mikrotubuli speel blykbaar 'n soortgelyke strukturele rol as dié van keratienfilamente in die epidermale selle van gewerwelde diere, aangesien intermediêre filamente nog geïdentifiseer moet word in Drosophila. Toe ons die subsellulêre lokalisering van Kakapo in meer besonderhede ondersoek het, het ons gevind dat dit teenwoordig is by beide apikale en basale oppervlaktes van die spieraanhegtingselle (Fig. 5). Kakapo kan gesien word dat dit geposisioneer is by die termini van die mikrotubuli bundels wat strek vanaf die apikale na die basale oppervlak (Fig. 5,a), sowel as effens langs hul lengte. Hierdie subsellulêre patroon verskil van ander proteïene wat die α-aktinientipe aktienbindende domein deel, soos βH.-spektrien (Thomas en Kiehart, 1994), wat aantoon dat hierdie domein nie op sigself die intrasellulêre lokalisering van proteïene wat dit bevat rig nie. Die apikale domein van Kakapo-uitdrukking oorvleuel met die apikale lokalisering van die proteïen 4.1 superfamilie-proteïen Coracle (Fig. 5) b). Ons het in hierdie stadium verminderde kleuring van Coracle op die laterale oppervlak gevind in vergelyking met vroeëre stadiums wat voorheen beskryf is (Fehon et al., 1994). Die 4.1-superfamilie van proteïene word gebruik om transmembraanproteïene aan die kortikale sitoskelet te koppel, so die kolokalisering dui aan dat Kakapo by die selkorteks gevind word.

      Ons het gesukkel om beide die PS-integrine en Kakapo te kleur omdat die twee teenliggaampies verskillende fiksasietoestande vereis. Ten spyte hiervan is dit egter duidelik dat Kakapo-uitdrukking aangrensend is aan PS-integrien-uitdrukking (Fig. 4,b, Fig. 5,c, metanol-gefixeerde embrio's en Fig. 5,d, formaldehied gefixeerd), wat bestaan ​​uit uitdrukking op die basale oppervlak van die epidermis en aan die termini van die hegspiere. Daar is geen betekenisvolle uitdrukking van Kakapo in die spiere nie, maar die basale uitdrukking van Kakapo in die epidermale spieraanhegtingselle word onmiddellik langs, terwyl dit nie oorvleuel nie, die epidermale integrien-lokalisering opgespoor (Fig. 4) b). Kakapo is dus nie net teenwoordig by die basale oppervlak waar die PS-integrine geleë is nie, maar ook by die apikale oppervlak, waar nog geen adhesiereseptore beskryf is nie.

      Die lokalisering van Kakapo aan beide kante van die mikrotubuli-bundels dui daarop dat Kakapo 'n rol kan speel in die koppeling van die mikrotubuli aan die kortikale aktiennetwerk by die membraan, en kan ook direk of indirek met transmembraanreseptore soos die integrine skakel. Om die funksie daarvan in die epidermale spieraanhegtingselle te toets, het ons ondersoek kakapo mutante embrio's. In stadium 16 embrio's kon ons geen penetrerende defekte in spieraanhegting vind in embrio's wat homosigoties was vir die meeste kak allele (data nie getoon nie), hoewel sommige sterker allele ernstige ontwrigtings in embrioniese morfogenese veroorsaak (sien hieronder). In stadium 17-embrio's wat egter mutant is vir die swakker allele, vind ons dat die spiere van die epidermis losmaak, maar hulle bly van end tot end geheg (Fig. 6, a en b). In die lewende embrio kan mens sien dat alhoewel spiersametrekking plaasvind, dit nie meer gekoppel is aan beweging van die eksoskelet nie (data nie getoon nie). Die oorsaak van hierdie defek is baie duideliker in die EM-analise wat in die meegaande referaat aangebied word (Prokop et al., 1998)b), wat wys dat die mikrotubuli-bundels nie meer aan die basale membraan geheg is nie, en die epidermale sel skeur gevolglik in die helfte. Hierdie fenotipe herinner sterk aan die BPAG- en pektienfenotipes (Guo et al., 1995 McLean et al., 1996), en is onderskei van die PS-integrien se mutante fenotipe waar elke spier losmaak van beide van die epidermis en van die ander spiere (sien Brown, 1993). Kakapo word dus benodig vir epidermale aanhegting aan spiere, maar nie vir spier-spieraanhegting nie, in ooreenstemming met sy uitdrukkingspatroon.

      'n Algemene funksie vir Kakapo in die handhawing van die integriteit van die epiteelselblad

      Ons het getoon dat Kakapo 'n belangrike rol speel in die bemiddeling van sterk aanhegting in spesifieke selle binne die embrio wat sterk meganiese stabiliteit vereis, maar dit kan ook meer algemene funksies hê wat ander seloppervlakreseptore bykomend tot die integrine behels. Hierdie moontlikheid stem ooreen met die reproduceerbare lae vlak van Kakapo-uitdrukking wat ons in baie selle waargeneem het (soos die epidermale selle wat in Fig. 5 getoon word) wat nie aan spiere geheg is nie. Ons het dus embrio's wat mutant vir Kakapo ondersoek om te sien of ons meer algemene defekte kan identifiseer wat 'n gevolg kan wees van hierdie verlies aan lae-vlak Kakapo uitdrukking. Embrio's mutant vir kakapo vertoon 'n wye reeks fenotipes, van byna normale ontwikkeling tot ernstige morfologiese abnormaliteite. Hierdie reeks fenotipes word ook gevind in embrio's wat gebrekkig is vir die lokus Df(2R)MK1/ Df(2R)MK1 of Df(2R)CX1/Df(2R)CX1 (data nie getoon nie), wat aantoon dat selfs die volledige afwesigheid van die kakapo geen lei tot 'n konsekwente sigotiese fenotipe nie. Die veranderlikheid van die fenotipe kan wees as gevolg van 'n gedeeltelike oortolligheid van funksie tussen Kakapo en 'n ander proteïen, of veranderlike bydrae van moederlike proteïen. Ons bevoordeel eersgenoemde moontlikheid, aangesien die generering van kiemlynklone van een van die kakapo allele het nie die fenotipe verbeter nie (Walsh en Brown, 1998), en ons kon nie Kakapo-proteïen voor gastrulasie opspoor nie (data nie getoon nie).

      In ooreenstemming met die variasie wat gevind word in embrio's wat gebrekkig is vir kakapo, vind ons dat ons kakapo allele vertoon ook diverse fenotipes. Die meeste van die allele wat in ons skerm geïsoleer is, is embrionies dodelik as homosigote, hoewel die twee allele wat voorheen ondersoek is, normaalweg ontwikkel deur stadium 16 (Walsh en Brown, 1998). Soos hierbo getoon, aan die einde van embriogenese (stadium 17), het die mutante embrio's 'n fenotipe waar die epidermis van die spiere losmaak (Fig. 6,b). Deur die fenotipe van die verskillende allele te ondersoek, het ons gevind dat sommige baie sterker fenotipes het, wat 'n meer algemene funksie aandui. Ons het die epidermaal afgeskeide kutikula ondersoek, wat die patroon van die onderliggende epidermis weerspieël, van embrio's wat homosigoties is vir al ons verskillende x-straal-geïnduseerde kakapo allele en die invoegallele kak P1 en kak p2 . In die meerderheid van die allele (17) het die homosigotiese mutante embrio's 'n normale epidermale patroon, hoewel ~30% van hierdie embrio's beskeie kutikulêre defekte getoon het (nie getoon nie). Dit moet genoem word dat die skerm vir vlerkblaarmutasies moontlik vir 'n spesifieke tipe swak alleel geselekteer het indien ernstiger allele drastiese vlerkdefekte veroorsaak. Een x-straal alleel, kak V168 , en die P-allele kak P1 en kak p2 , het 'n sterker fenotipe: in ~15% van die mutante embrio's, misluk kiemband-terugtrekking en kopinvolusie (Fig. 6, c en d). Ongeveer 40% van die embrio's wat vir hierdie allele mutante het, het 'n normale voorkoms van kutikula, wat aantoon dat hierdie fenotipe ook nie ten volle penetrant is nie.

      Epidermale ontwikkeling is in meer besonderhede ondersoek in die embrio's homosigoties vir sterk kakapo allele wat twee merkers vir epidermale vorm gebruik (Fig. 6, e-h). Hierdie ondersoek het gebreke in die integriteit van die epidermale sellaag aan die lig gebring, naamlik breuke in die ventrale epidermis in die middelste abdominale segmente van die volledig kiemband-verlengde embrio's (Fig. 6,e). Hierdie breuke blyk te ontstaan ​​op die plek van maksimum vervorming tydens kiemband-terugtrekking. In ooreenstemming met hierdie waarneming word kiemband-terugtrekking in sommige embrio's gestop (Fig. 6, d en e). Ander embrio's ondergaan suksesvol kiemband-terugtrekking, maar behou 'n gat in die epidermis by hierdie posisie van maksimum spanning (sien Fig. 6, g en h), wat verantwoordelik kan wees vir die ontwrigtings wat in die kutikulêre dentikelgordels waargeneem word. Die homofiele adhesiemolekule Fasiclin III is nie teenwoordig op die oppervlak van die selle wat aan die gat grens nie (Fig. 6) h). Sulke breuke in die epidermis word nie waargeneem in embrio's wat mutant vir die PS integrine nie, wat daarop dui dat hierdie Kakapo funksie ander sel adhesie molekules behels. Ons het ook morfogenetiese defekte in die interne weefsels waargeneem (data nie getoon nie), maar omdat dit voorkom in embrio's met ernstige epidermale defekte, is dit nog nie seker of dit 'n funksie vir Kakapo in hierdie weefsels aandui, en of die interne defekte 'n gevolg is nie. van die epidermale ontwrigting. Die fenotipes in die embrioniese epidermis dui aan dat die lae-vlak algemene uitdrukking van Kakapo betekenisvol is, en dat Kakapo 'n algemene rol kan speel in die bemiddeling van adhesie, moontlik deur die bemiddeling van interaksies tussen transmembraanproteïene en die sitoskelet.


      Abstrak

      Onderdrukker-tRNA's dra antikodonmutasies wat hulle in staat stel om voortydige stopkodons in metaboliese merkergeen-mRNA's te dekodeer, wat as in vivo-verslaggewers van funksionele tRNA-biogenese gebruik kan word. Hier hersien ons sleutelkomponente van 'n onderdrukker tRNA-stelsel spesifiek vir Schizosaccharomyces pombe en die aanpassings daarvan vir gebruik om spesifieke stappe in tRNA-biogenese te bestudeer. Eukariotiese tRNA-biogenese begin met transkripsie-inisiasie deur RNA-polimerase (pol) III. Die ontluikende pre-tRNA's moet vou, 5' en 3' verwerking ondergaan om die leier en sleepwa te verwyder, kernuitvoer, en splitsing indien van toepassing, terwyl verskeie komplekse chemiese modifikasies deur die proses plaasvind. Ons hersien bewyse dat voorloper-tRNA-verwerking begin met transkripsiebeëindiging by die oligo(T)-terminatorelement, wat 'n 3′ oligo(U)-kanaal op die ontluikende RNA vorm, 'n volgorde-spesifieke bindingsplek vir die RNA-chaperone, La-proteïen. Die verwerkingsroete verdeel na gelang van 'n swak verstaanbare eienskap van pol III-terminasie wat die 3'-oligo(U)-lengte en dus die affiniteit vir La bepaal. Ons hersien dus die pol III-beëindigingsproses en die betrokke faktore, insluitend vooruitgang deur gebruik te maak van geen-spesifieke ewekansige mutagenese deur dNTP analoë wat sleutelresidu identifiseer wat belangrik is vir transkripsieterminasie in sekere pol III subeenhede. Die resensie eindig met 'n 'tegniese benaderings'-afdeling wat 'n delelyste van onderdrukker-tRNA-allele, stamme en plasmiede insluit, en grafiese voorbeelde van die uiteenlopende gebruike daarvan.


      Kyk die video: DR NESTOROVIĆ OTKRIO SVE O KARCINOMU:OVO VOĆE UNIŠTAVA ĆELIJE TUMORA MOZGA,JAJNIKA, PLUĆA I CREVA (Augustus 2022).