Inligting

Kan qPCR-primer met verskeie wanpassing werk?

Kan qPCR-primer met verskeie wanpassing werk?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek ontwerp primers vir qPCR uit bewaarde streke van 'n paar verskillende vissoorte.Dit is omdat die gene volgorde vir my vissoorte nog nie in die NCBI databasis beskikbaar is nie.

Is dit in orde (kan die primer gloei aan die teikenvolgorde) as die primers verskeie wanpassings aan die binnekant en na die 5'-kant daarvan het? Aan die 3'-kant kan ek slegs onderlaag ontwerp met maksimum 5 behoue ​​basisse.

Dankie.


QPCR is uiters sensitief, so ek sou dit nie doen nie. In plaas daarvan sal ek daardie primers kry wat jy in jou vraag noem en in plaas daarvan 'n volgorde gebruik in plaas daarvan om qpcr daarmee te doen. Dan sou ek nuwe primers spesifiek maak vir die streek waarop jy qpcr wil doen, gebaseer op die volgorde. Die voordeel hiervan is dat jy nou die volgorde sal ken en dus sal jy beter primers vir qpcr hê.


Analitiese sensitiwiteit en doeltreffendheid vergelykings van SARS-CoV-2 RT-qPCR primer-probe stelle

Die onlangse verspreiding van ernstige akute respiratoriese sindroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) illustreer die kritieke behoefte aan akkurate en vinnige diagnostiese toetse om kliniese en openbare gesondheidsintervensies aan te spoor. Tans word verskeie kwantitatiewe omgekeerde transkripsie-PCR (RT-qPCR) toetse deur kliniese, navorsings- en openbare gesondheidslaboratoriums gebruik. Dit is egter tans onduidelik of die resultate van verskillende toetse vergelykbaar is. Ons doel was om onafhanklike evaluasies te maak van primer-probe-stelle wat in vier algemene SARS-CoV-2 diagnostiese toetse gebruik word. Uit ons vergelykings van RT-qPCR analitiese doeltreffendheid en sensitiwiteit, toon ons dat alle primer-probe-stelle gebruik kan word om SARS-CoV-2 op te spoor by 500 virale RNA-kopieë per reaksie. Die uitsondering hiervoor is die RdRp-SARSr (Charité) bevestigende primer-probe-stel wat 'n lae sensitiwiteit het, waarskynlik as gevolg van 'n wanpassing met sirkulerende SARS-CoV-2 in die omgekeerde primer. Ons het nie bewyse gevind vir agtergrondversterking met pre-COVID-19-monsters of onlangse SARS-CoV-2-evolusie wat sensitiwiteit verminder nie. Ons aanbeveling vir SARS-CoV-2 diagnostiese toetse is om 'n toets met 'n hoë sensitiwiteit te kies en wat regionaal gebruik word, om die vergelykbaarheid tussen uitkomste te vergemaklik.


Inleiding

CRISPR/Cas9 het die belangrikste genoom-redigeringstegnologie geword en is wyd gebruik in verskillende soorte organismes vir genoommodifikasie doeleindes 1,2,3,4. In die CRISPR/Cas9-stelsel word Cas9-nuklease na teiken-DNA gerig wat die protospasieerder-aangrensende motief (PAM) bevat deur enkelgids-RNA (sgRNA), dan sny beide stringe teiken-DNS op 'n plek 3 bp stroomop van die PAM-volgorde en genereer dubbel -strandbreuke (DSB's). Hierdie soort DNA-breek is skadelik vir selle en kan tot mutagenese of seldood lei as dit nie herstel word nie. Sodra dit waargeneem is, sal die DSB'e meestal herstel word deur twee verskillende soorte intrinsieke meganismes, homologie-gerigte herstel (HDR) of nie-homologe eindverbinding (NHEJ) 5,6. Eersgenoemde maak staat op 'n homoloë volgorde as die herstelsjabloon en herstel DNS-breuke op 'n hoëtrou-manier. Dit word gewoonlik aangewend om spesifieke DNA-modifikasies in te voer, om aan die behoeftes in funksionele studie van genetiese variasie te voldoen, veral in kliniese gebruik. Laasgenoemde behels direkte afbinding van die gebreekte punte sonder die behoefte aan 'n homoloë sjabloon en herstel DNS-breuke op 'n foutgevoelige wyse. Die NHEJ lei gewoonlik tot onvoorspelbare invoeging of uitwissing van basisse in die genoom, genaamd indel, wat heel waarskynlik die oop leesraam van teikengeen sal ontwrig. Dit maak dit 'n baie effektiewe metode in die vernietiging van geenuitdrukking vir geen funksionele studie en in kliniese om patogeniese gene te verwyder 7,8.

Gewoonlik, vir enige eksperimentele doel, is voorafkeuring van die sgRNA's vir hoë redigeerdoeltreffendheid en spesifisiteit noodsaaklik en sifting van die enkelselklone of nageslag wat verlangde modifikasiegebeurtenisse dra, is dikwels verpligtend. Die huidige tegnieke om die doeltreffendheid van genoombewerking te evalueer, is goed bespreek en vergelyk in 'n resensie 9. Die wyd gebruikte metodes is hoofsaaklik gebaseer op DNA-volgordebepaling of wanpas-spesifieke nuklease 9,10. Sanger-volgordebepalingsmetode behels PCR-amplifikasie en kloningstappe van die teikengebied voordat elke DNA-volgorde afsonderlik gelees word. Hierdie multistap-metode kan gedetailleerde inligting verskaf van elke mutasiegebeurtenis wat deur nuklease veroorsaak word, maar is redelik tydrowend, duur en moeisaam 10 . Om hierdie nadele te oorkom, is berekeningsalgoritme ingestel om redigeringsdoeltreffendheidskwantifisering te realiseer gebaseer op direkte Sanger-volgordebepaling van amplikonmengsel van teiken-DNA-streek. Terwyl sy betroubaarheid geneig is om belemmer te word deur herhalende volgorde rondom die snyplek, en dit hang baie af van die suiwerheid van die PCR -produk en die kwaliteit van die Sanger -volgorde 11. Die volgende generasie DNA-volgordebepaling (NGS)-tegnologie is ook toegepas in die profilering van DNA-mutasie geïnduseer deur sgRNA-gerigte Cas9-nuklease as gevolg van sy massiewe parallelle kapasiteit 12 . Verskeie webgebaseerde aanlynplatforms is ontwikkel om die NGS-data te ontleed, insluitend CRISPR-GA 13 , BATCH-GE 14 , CRISPResso 15,16 , Cas-analyzer 17 en CRISPRMatch 18 et al. Alhoewel dit effektief is, vereis hierdie NGS-gebaseerde metodes steeds multi-stap bewerkings en is dit duur in tyd en geld. Die wanpassing-spesifieke nuklease-gebaseerde metodes gebruik T7 endonuklease 1 (T7E1) of Surveyor nuklease om wanpassings wat gevorm word tussen DNA-stringe wat volgordeverskil bevat, afkomstig van nuklease-sny 19, te splits. Hulle benodig slegs basiese laboratoriumtoerusting maar nie van toepassing op polimorfiese lokusse nie en is geneig om enkelnukleotiedmutasie sowel as groot delesies 20 te mis. Boonop is baie ander alternatiewe ontwikkel met verbetering in sekere aspekte, insluitend qEva-CRISPR 21, vervaardigde nuklease-geïnduseerde translokasies (ENIT) 22, Cas9 nuklease gebaseerde beperkingsfragmentlengte polimorfisme (RFLP) analise 23, Indel Detection by Amplicon Analysis ( IDAA) 24 en die gen-redigeringsfrekwensie digitale PCR (GEF-dPCR) 25. Die meeste metodes is egter multistap en kwantifiseer die redigeerdoeltreffendheid gebaseer op voorafversterkte PCR-produk wat van genomiese DNA kom, maar nie direk op die genomiese DNA self nie 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,22,23,24 . Volgorde- en lengte-afhanklike vooroordeel wat tydens PCR-versterking ingestel word, sal onvermydelik die opsporing akkuraatheid 26,27,28 beïnvloed. Boonop vereis baie metodes spesifieke toestelle, soos kapillêre elektroforese-apparaat 21,24, digitale PCR-stelsel 25 en NGS-platform 12,13,14,15,16,17,18 wat duur is en nie geredelik beskikbaar is in die meeste laboratoriums nie. Wat genotipering van nageslag en enkelselle-kloonsifting betref, behalwe vir Sanger-volgordebepaling en NGS-gebaseerde metodes 29,30, is daar ook verskeie ander strategieë spesifiek ontwikkel vir genotiperingsdoeleindes, insluitend smelting met hoë resolusie (HRM) 31 en oligoribonucleotide interferensie-PCR (ORNi- PCR) 32 et al. In sebravis 33 en plant 34 is PCR-gebaseerde metodes ontwikkel vir mutante sifting, maar beperkte akkuraatheid en sensitiwiteit het die wye toepassings daarvan beperk.

Hier het ons 'n intydse PCR gebaseerde metode ontwikkel, naamlik genoom redigering toets PCR (getPCR) deur die sensitiwiteit van Taq polimerase te kombineer by primer 3' einde met intydse PCR tegniek vir sy krag in DNA kwantifisering. Toepassings in Lenti-X 293 T-selle op 9 sgRNA-teikens dui daarop dat hierdie tegniek die genoomredigeringsdoeltreffendheid akkuraat kan bepaal in alle gevalle van genoomredigering, insluitend NHEJ-geïnduseerde indels, HDR en basisredigering. Intussen het hierdie metode groot krag in enkelsel kloon genotipering vertoon deur sy vermoë om presies te vertel hoeveel allele gemodifiseer is. Hierdie tegniek wat hier beskryf word, bied verreweg die mees robuuste strategie wat nie net in genoom redigering doeltreffendheid kwantifisering gebruik kan word nie, maar ook enkelsel kloon genotipering op 'n hoë deurset manier.


ONTWERP EN IMPLEMENTERING

Om die benutting van die bedienerhulpbronne te maksimeer, is PCRTiler geïmplementeer as 'n multi-draadtoepassing wat soveel primer-pare gelyktydig ontwerp as wat die bediener verwerkers het. Onafhanklike teëlversoeke word in tou gesit totdat die teëlwerk wat tans uitgevoer word, voltooi is. Gebruikers wat 'n e -posadres verskaf, word in kennis gestel wanneer hul versoek voltooi is. Ander sal die skakel wat verskaf word op die indieningbevestigingsbladsy moet gebruik om hul resultaat te sien.

Om billike gebruik van die stelsel te bevorder, is die totale aantal primerpare wat in 'n enkele versoek ontwerp kan word, beperk tot 200, en die maksimum tydsduur van 'n teëlwerk is tot drie uur. Gebruikers wat daardie limiete oorskry, kan steeds PCRTiler gebruik, hetsy deur die selfstandige PCRTiler-toepassing op hul persoonlike rekenaar te installeer, die bedienerweergawe te installeer en die limiet te deaktiveer, of hul groot versoek in kleiner streke te verdeel.

PCRTiler sal grasieus herstel van bediener herbegin. Sodra nuwe teëlversoeke by die bediener ingedien word, word dit saamgepers en dan op die skyf gestoor. In die geval dat die bediener herbegin word, sal PCRTiler die tou-teëlversoeke deursigtig herwin, hul oorspronklike volgorde behou, en die uitvoering van die lopie wat gestaak is, hervat.

Sagteware en hardeware vereistes

PCRTiler vereis die Java Runtime Environment (JRE) v1.6.0 en Tomcat 6 wat op 'n rekenaar met die Linux-bedryfstelsel loop. Dit behoort teoreties ook op enige kombinasie van platforms en bedryfstelsels te loop waarvoor implementerings bestaan ​​vir die JRE, Tomcat 6, Primer3 en BLAST binaries, maar dit is nie getoets nie en word dus nie ondersteun nie. Tydens toetsing het ons bevestig dat dit behoorlik optree wanneer dit met die nuutste weergawes van Firefox, Safari en Internet Explorer bekyk word.

Die prestasie van PCRTiler is hoofsaaklik afhanklik van die beskikbare geheue. In ons ervaring, vir aanvaarbare werkverrigting, benodig jy genoeg geheue vir die BLAST-databasis (800 MB vir Homo sapiens, 5 MB vir die meeste bakterieë), plus 'n maksimum van 1 GB vir PCRTiler. Daarom behoort 2 GB geheue genoeg te wees. Hierdie hoeveelheid geheue word algemeen ingesluit by onlangse werkstasie -rekenaars en skootrekenaars. PCRTiler is 'n multi-threaded toepassing, sodat dit alle beskikbare CPU-kerns sal gebruik, wat die ontwerp van die primer proporsioneel sal versnel met die aantal kerns. Die PCRTiler-bediener loop tans Mandriva Linux 2010 op 'n toegewyde Quad-core Intel-masjien geklok op 2.4 Ghz met 4 GB RAM. Insluitend die BLAST-databasisse van al 1169 genome, benodig PCRTiler <15 GB hardeskyfspasie.

Selfstandige weergawe

Benewens die bedienerweergawe, bied ons 'n selfstandige Java-gebaseerde toepassing, wat 'n grafiese gebruikerskoppelvlak en dieselfde genoombestuurfunksie met een klik bevat as die bedienerweergawe. Dit hanteer ook alle aspekte van die aflaai van genome vanaf GenBank en die skepping van BLAST-databasisse. Aangesien die selfstandige en bedienerweergawes baie van dieselfde kodebasis deel, bied hulle albei dieselfde funksionaliteit. Die selfstandige weergawe gebruik egter die hulpbronne van die kliëntrekenaar. Die gebruik van die selfstandige weergawe is die maklikste opsie vir die meeste gebruikers wat PCRTiler plaaslik wil bestuur. Let daarop dat Tomcat nie 'n selfstandige weergawe benodig nie. Tot op datum is getoon dat dit korrek werk op Linux i386, Windows Vista en Windows XP.

Bewaring van data

PCRTiler-resultate word vir 14 dae op die bediener gehou. Gebruikers het egter die opsie om hul resultaatlêer onmiddellik van die bediener te verwyder deur die toepaslike knoppie op die resultaatbladsy te gebruik. Gebruikers wat graag vir 'n langer tydperk aan 'n PCRTiler-resultaat wil vashou, kan die rou resultaatlêer van die webwerf aflaai, wat met die selfstandige weergawe van PCRTiler bekyk kan word.


Volg 'n paar basiese riglyne om u eie stel ontaard primers te ontwerp:

15-20 basispare.
5) Probeer om aminosure metionien en triptofaan in te sluit, wat deur 'n enkele kodon (drieletternukleotiedkode) gekodeer word, en vermy aminosure leucien, serien en arginien, wat elk deur ses kodonkombinasies gekodeer kan word (Tabel 2).
6) Vir daaropvolgende kloningsprosedures en om die primerlengte (en dus gloeitemperatuur) te verhoog, voeg 'n stert van 5 '(6-9 basispare) by wat 'n beperking-ensiemplek bevat.
7) As daar volledige degenerasie is (geen ooreenkomste tussen enige gegewe spesie nie), oorweeg dit om die basis-inosien (struktureel soortgelyk aan guanien) te gebruik, aangesien dit met enige van die vier basisse kan koppel, alhoewel dit verkieslik aan sitosien sal bind. Alternatiewelik, voeg N vir enige basis in om ekwimolêre konsentrasies van elke basis op daardie posisie in jou onderlaagmengsel te verseker.
8) Vermy degenerasie by die 3'-terminus (dit sal nie 'n goeie plek wees om inosien in te voeg nie).

Afhangende van die doelwit, kan die uitspeel tussen primer spesifisiteit en doeltreffendheid gewysig word deur die degenerasie van die primer te verander. Byvoorbeeld, hoe meer gedegenereer die primers, hoe minder spesifieke uitgloeiing sal egter wees, verminderde degenerasie sal meer potensiaal toelaat om onbekende variante te identifiseer.


1 SequenceTracer verwyder die ontbrekende rye in ROI. Die uitsluitingskriterium van ontbrekende rye is uitgeklaar met redaksionele goedkeuring na Fase 1 aanvaarding en voor waarneming van die data.

2 Die drempel is voor Fase 1 aanvaarding besluit. Dit is egter nie duidelik in die Fase 1-protokol genoem nie en daar is slegs na 'n vorige studie verwys.

Elektroniese aanvullende materiaal is aanlyn beskikbaar by https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5012597.

Gepubliseer deur die Royal Society onder die bepalings van die Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, wat onbeperkte gebruik toelaat, mits die oorspronklike outeur en bron gekrediteer word.

Verwysings

2020 'n Nuwe koronavirus wat verband hou met menslike respiratoriese siektes in China. Natuur 579, 265-269. (doi:10.1038/s41586-020-2008-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 'n Longontsteking-uitbraak wat verband hou met 'n nuwe koronavirus van waarskynlike vlermuisoorsprong. Natuur 579, 270-273. (doi:10.1038/s41586-020-2012-7) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 'n Nuwe koronavirus van pasiënte met longontsteking in China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727-733. (doi:10.1056/NEJMoa2001017) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 'n Familiale groep longontsteking wat verband hou met die 2019 nuwe koronavirus wat persoon-tot-persoon-oordrag aandui: 'n studie van 'n gesinsgroepering. Lancet 395, 514-523. (doi:10.1016/S0140-6736(20)30154-9) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2020 'n Familiale groep infeksie wat verband hou met die 2019 nuwe koronavirus wat moontlike oordrag van persoon tot persoon tydens die inkubasietydperk aandui. J. Infect. Dis. 221, 1757-1761. (doi: 10.1093/infdis/jiaa077) Crossref, PubMed, Google Scholar

2020 Genomiese karakterisering en epidemiologie van 2019 nuwe koronavirus: implikasies vir virusoorsprong en reseptorbinding. Lancet 395, 565-574. (doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 Verbeterde molekulêre diagnose van COVID-19 deur die nuwe, hoogs sensitiewe en spesifieke COVID-19-RdRp/Hel intydse omgekeerde transkripsie-PKR-toets wat in vitro en met kliniese monsters bekragtig is. J. Clin. Mikrobioloë. 58, e00310-20. (doi:10.1128/JCM.00310-20) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 Kliniese kenmerke van pasiënte wat met die nuwe koronavirus in 2019 besmet is in Wuhan, China. Lancet 395, 497-506. (doi:10.1016/S0140-6736(20)30183-5) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 Vergelykende prestasie van SARS-CoV-2-opsporingstoetse met behulp van sewe verskillende primer/probe-stelle en een toetsstel. J. Clin. Mikrobioloë. 58, e00557-20. (doi: 10.1128/JCM.00557-20) Crossref, PubMed, Google Scholar

Niu P, Lu R, Zhao L, Wang H, Huang B, Ye F, Wang W, Tan W

. 2020 Drie nuwe intydse RT-PCR-toetse vir die opsporing van COVID-19-virus. China CDC Weekliks. Google Scholar

2020 Ontwikkeling van 'n laboratoriumveilige en laekoste-opsporingsprotokol vir SARS-CoV-2 van die koronavirussiekte 2019 (COVID-19). Exp. Neurobiol. 29, 107-119. (doi:10.5607/en20009) Crossref, PubMed, Google Scholar

2020 Ontwikkeling van 'n nuwe, genoomaftrekking-afgeleide, SARS-CoV-2-spesifieke COVID-19-nsp2-intydse RT-PCR-toets en die evaluering daarvan met behulp van kliniese monsters. Int. J. Mol. Wetenskaplike. 21, 2574. (doi:10.3390/ijms21072574) Crossref, Google Scholar

2020 Epidemiologiese kenmerke en kliniese verloop van pasiënte wat met SARS-CoV-2 in Singapoer besmet is. JAMA 323, 1488-1494. (doi:10.1001/jama.2020.3204) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Lippi G, Simundic AM, Plebani M.

. 2020 Potensiële preanalitiese en analitiese kwesbaarhede in die laboratoriumdiagnose van koronavirussiekte 2019 (COVID-19). Clin. Chem. Lab. Med. (doi: 10.1515/cclm-2020-0285) Crossref, Google Scholar

. 2005 Volgordevariasie in primer-teikens beïnvloed die akkuraatheid van virale kwantitatiewe PCR. J. Clin. Virol. 34, 104-107. (doi:10.1016/j.jcv.2005.02.010) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2019 Gemis opsporing van griep A(H1)pdm09 deur intydse RT-PCR-toets as gevolg van hemagglutinienvolgordemutasie, Desember 2017 tot Maart 2018, noordelike Viëtnam. Western Pac. Toesig. Reaksie J . 10, 32-38. (doi:10.5365/wpsar.2018.9.3.003) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Klungthong C, Chinnawirotpisan P, Hussem K, Phonpakobsin T, Manasatienkij W, Ajariyakhajorn C, Rungrojcharoenkit K, Gibbons RV, Jarman RG

. 2010 Die impak van wanaanpassings tussen primer en sonde-sjabloon op die sensitiwiteit van pandemiese griep A/H1N1/2009-virusopsporing deur intydse RT-PCR. J. Clin. Virol. 48, 91-95. (doi:10.1016/j.jcv.2010.03.012) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Lee HK, Lee CK, Loh TP, Chiang D, Koay ES, Tang JW

. 2011 Mis diagnose van griep B-virus as gevolg van nukleoproteïenvolgorde mutasies, Singapoer, April 2011. Euro Surveill. 16, 19943. PubMed, Google Scholar

2014 Nuut opkomende mutasies in die matriksgene van die menslike griep A(H1N1)pdm09- en A(H3N2)-virusse verminder die opsporingsensitiwiteit van intydse omgekeerde transkripsie-PKR. J. Clin. Mikrobioloë. 52, 76-82. (doi:10.1128/JCM.02467-13) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kamau E, Agoti CN, Lewa CS, Oketch J, Owor BE, Otieno GP, Bett A, Cane PA, Nokes DJ

. 2017 Onlangse volgordevariasie in sondebindingsplek het opsporing van respiratoriese sinsitiale virusgroep B deur intydse RT-PCR beïnvloed. J. Clin. Virol. 88, 21-25. (doi:10.1016/j.jcv.2016.12.011) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Koo C, Kaur S, Teh ZY, Xu H, Nasir A, Lai YL, Khan E, Ng LC, Hapuarachchi HC

. 2016 Genetiese variasie in sondebindende streke verklaar vals negatiewe resultate van 'n molekulêre toets vir die opsporing van dengue-virus. Vector Borne Zoonotic Dis. 16, 489-495. (doi:10.1089/vbz.2015.1899) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Hughes GJ, Smith JS, Hanlon CA, Rupprecht CE

. 2004 Evaluering van 'n TaqMan PCR -toets om rabiesvirus -RNA op te spoor: invloed van volgordevariasie en toepassing op kwantifisering van virale ladings. J. Clin. Mikrobioloë. 42, 299-306. (doi:10.1128/jcm.42.1.299-306.2004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Christopherson C, Sninsky J, Kwok S

. 1997 Die uitwerking van interne onderbrekingsjabloon-mismatches op RT-PCR: MIV-1 modelstudies. Nukleïensure Res. 25, 654-658. (doi:10.1093/nar/25.3.654) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Acharya A, Vaniawala S, Shah P, Parekh H, Misra RN, Wani M, Mukhopadhyaya PN

. 2014 'n Robuuste MIV-1 virale lading opsporing toets geoptimaliseer vir Indiese sub tipe C spesifieke stamme en hulpbron beperking instelling. Biol. Res. 47, 22. (doi:10.1186/0717-6287-47-22) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Liu C, Chang L, Jia T, Guo F, Zhang L, Ji H, Zhao J, Wang L

. 2017 Intydse PCR-toetse vir hepatitis B-virus-DNS-kwantifisering kan twee verskillende teikens vereis. Virol. J. 14, 94. (doi:10.1186/s12985-017-0759-8) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chow CK, Qin K, Lau LT, Cheung-Hoi Yu A

. 2011 Belangrikheid van 'n enkelnukleotied-primer-wanpassing in hepatitis B-virus intydse PCR-diagnostiese toetse. J. Clin. Mikrobioloë. 49, 4418-4419 outeur antwoord 4420. (doi: 10.1128/JCM.05224-11) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chan JF, Kok KH, Zhu Z, Chu H, To KK, Yuan S, Yuen KY

. 2020 Genomiese karakterisering van die 2019 nuwe mens-patogeniese koronavirus wat geïsoleer is van 'n pasiënt met atipiese longontsteking nadat hy Wuhan besoek het. Opkom. Mikrobes besmet. 9, 221-236. (doi:10.1080/22221751.2020.1719902) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Ogando NS, Ferron F, Decroly E, Canard B, Posthuma CC, Snijder EJ

. 2019 Die eienaardige geval van die nidovirus-eksoribonuklease: sy rol in RNA-sintese en replikasiegetrouheid. Voorkant. Mikrobioloë. 10, 1813. (doi:10.3389/fmicb.2019.01813) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Smith EC, Sexton NR, Denison MR

. 2014 Dink buite die driehoek: replikasiegetrouheid van die grootste RNA-virusse. Annu. Ds Virol. 1, 111-132. (doi:10.1146/annurev-virology-031413-085507) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Filogenetiese ontleding van die eerste vier SARS-CoV-2-gevalle in Chili in 2020. J. Med. Virol. (doi:10.1002/jmv.25797) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Forster P, Forster L, Renfrew C, Forster M

. Filogenetiese netwerkanalise van SARS-CoV-2-genome in 2020. Proc. Natl Acad. Wetenskaplike. VSA 117, 9241-9243. (doi:10.1073/pnas.2004999117) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2020 Genetiese diversiteit en evolusie van SARS-CoV-2. Infekteer. Genet. Evol. 81, 104260. (doi:10.1016/j.meegid.2020.104260) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 Oor die ontstaan ​​en voortgesette evolusie van SARS-CoV-2. Natl Sci. Ds. nwaa036. (doi:10.1093/nsr/nwaa036) Crossref, Google Scholar

Wang C, Liu Z, Chen Z, Huang X, Xu M, He T, Zhang Z

. 2020 Die vestiging van verwysingsvolgorde vir SARS-CoV-2 en variasie-analise. J. Med. Virol. 92, 667-674. (doi: 10.1002/jmv.25762) Crossref, ISI, Google Scholar

2020 Ernstige akute respiratoriese sindroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) intydse RT-PCR N geen 2020 (Wuhan-N 2019-nCoV-verwante toets). protokolle.io. (doi:10.17504/protocols.io.bchwit7e) Google Scholar

Sharfstein JM, Becker SJ, Mello MM

. 2020 Diagnostiese toetsing vir die nuwe koronavirus. JAMA 323, 1437. (doi:10.1001/jama.2020.3864) Crossref, ISI, Google Scholar

Wang X, Yao H, Xu X, Zhang P, Zhang M, Shao J, Xiao Y, Wang H

. 2020 Limiete van opsporing van ses goedgekeurde RT-PCR-stelle vir die nuwe SARS-coronavirus-2 (SARS-CoV-2). Clin. Chem. (doi: 10.1093/clinchem/hvaa099) Crossref, Google Scholar

Li D, Wang D, Dong J, Wang N, Huang H, Xu H, Xia C

. 2020 Vals-negatiewe resultate van intydse omgekeerde-transkriptase-polimerase-kettingreaksie vir ernstige akute respiratoriese sindroom koronavirus 2: rol van diep-leer-gebaseerde CT-diagnose en insigte uit twee gevalle. Koreaans J. Radiol. 21, 505-508. (doi:10.3348/kjr.2020.0146) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chen Z, Li Y, Wu B, Hou Y, Bao J, Deng X

. 2020 'n Pasiënt met COVID-19 wat 'n vals-negatiewe omgekeerde transkriptase polimerase kettingreaksieresultaat aanbied. Koreaans J. Radiol. 21, 623. (doi:10.3348/kjr.2020.0195) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Li Y, Yao L, Li J, Chen L, Song Y, Cai Z, Yang C

. 2020 Stabiliteitskwessies van RT-PCR-toetsing van SARS-CoV-2 vir gehospitaliseerde pasiënte wat klinies met COVID-19 gediagnoseer is. J. Med. Virol. (doi: 10.1002/jmv.25786) ISI, Google Scholar

Dong X, Cao YY, Lu XX, Zhang JJ, Du H, Yan YQ, Akdis CA, Gao YD

. 2020 Elf gesigte van koronavirussiekte 2019. Allergie. (doi:10.1111/all.14289) Crossref, Google Scholar

Ai T, Yang Z, Hou H, Zhan C, Chen C, Lv W, Tao Q, Sun Z, Xia L

. 2020 Korrelasie van bors-CT en RT-PCR-toetsing in koronavirussiekte 2019 (COVID-19) in China: 'n verslag van 1014 gevalle. Radiologie . (doi: 10.1148/radiol.2020200642) Crossref, PubMed, Google Scholar

Patel R, Babady E, Theel ES, Storch GA, Pinsky BA, St George K, Smith TC, Bertuzzi S

. 2020-verslag van die Amerikaanse Vereniging vir Mikrobiologie COVID-19 Internasionale Beraad, 23 Maart 2020: waarde van diagnostiese toetsing vir SARS-CoV-2/COVID-19. mBio 11, e00722-20. (doi:10.1128/mBio.00722-20) Crossref, ISI, Google Scholar

2020 Opsporing van 2019 nuwe koronavirus (2019-nCoV) deur intydse RT-PCR. Euro Surveill. 25, 2000045. (doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045) Crossref, Google Scholar

2020 Ontwikkeling van genetiese diagnostiese metodes vir nuwe koronavirus 2019 (nCoV-2019) in Japan. Jpn. J. Infekteer. Dis. (doi:10.7883/yoken.JJID.2020.061) Crossref, Google Scholar

2020 Molekulêre diagnose van 'n nuwe koronavirus (2019-nCoV) wat 'n uitbraak van longontsteking veroorsaak. Clin. Chem. 66, 549-555. (doi:10.1093/clinchem/hvaa029) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2017 GISAID: globale inisiatief oor die deel van alle griepdata - van visie tot werklikheid. Euro Surveill. 22, 30494. (doi:10.2807/1560-7917.ES.2017.22.13.30494) Crossref, PubMed, Google Scholar

Das J, Do Q-T, Shaines K, Srikant S

. 2013 VSA en hulle: die geografie van akademiese navorsing. J. Dev. Econ. 105, 112-130. (doi:10.1016/j.jdeveco.2013.07.010) Crossref, ISI, Google Scholar

2017 Veranderende neigings en volgehoue ​​vooroordele in drie dekades van bewaringswetenskap. Glob. Ecol. Conserv. 10, 32-42. (doi: 10.1016/j.gecco.2017.01.008) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2020 Hou tred met die jongste navorsing oor koronavirus. Natuur 579, 193. (doi:10.1038/d41586-020-00694-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

Arab-Zozani M, Hassanipour S

. 2020 Kenmerke en beperkings van LitCovid-spilpunt vir vinnige toegang tot literatuur oor COVID-19. Balkan Med. J. (doi:10.4274/balkanmedj.galenos.2020.2020.4.67) Crossref, PubMed, Google Scholar

Katoh K, Misawa K, Kuma K, Miyata T

. 2002 MAFFT: 'n nuwe metode vir vinnige meervoudige volgorde-belyning gebaseer op vinnige Fourier-transformasie. Nukleïensure Res. 30, 3059-3066. (doi:10.1093/nar/gkf436) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Katoh K, Rozewicki J, Yamada KD

. 2019 MAFFT-aanlyndiens: veelvuldige volgordebelyning, interaktiewe volgordekeuse en visualisering. Kort Bioinform. 20, 1160-1166. (doi:10.1093/bib/bbx108) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 AliView: 'n vinnige en liggewig belyningskyker en redigeerder vir groot datastelle. Bioinformatika 30, 3276-3278. (doi:10.1093/bioinformatics/btu531) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Nagy A, Jirinec T, Jirincova H, Cernikova L, Havlickova M

. 2019 In silico-herbeoordeling van 'n diagnostiese RT-qPCR-toets vir universele opsporing van Griep A-virusse. Wetenskaplike. Rep. 9, 1630. (doi:10.1038/s41598-018-37869-w) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Zhao Z, Li H, Wu X, Zhong Y, Zhang K, Zhang YP, Boerwinkle E, Fu YX

. 2004 Matige mutasiekoers in die SARS-koronavirusgenoom en die implikasies daarvan. BMC Evol. Biol. 4, 21. (doi:10.1186/1471-2148-4-21) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 Genomiese diversiteit van SARS-CoV-2 by pasiënte met koronavirussiekte 2019. Clin. Infekteer. Dis. (doi: 10.1093/cid/ciaa203) Crossref, Google Scholar

. 2016 Meganismes van virale mutasie. Sel. Mol. Lewenswetenskap. 73, 4433-4448. (doi:10.1007/s00018-016-2299-6) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Carrasco-Hernandez R, Jacome R, Lopez Vidal Y, Ponce de Leon S

. 2017 Is RNA -virusse kandidaat -agente vir die volgende wêreldwye pandemie? N resensie . ILAR J. 58, 343-358. (doi:10.1093/ilar/ilx026) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Lefever S, Pattyn F, Hellemans J, Vandesompele J

. 2013 Enkelnukleotied polimorfismes en ander wanpassings verminder prestasie van kwantitatiewe PCR-toetse. Clin. Chem. 59, 1470-1480. (doi:10.1373/clinchem.2013.203653) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Stadhouders R, Pas SD, Anber J, Voermans J, Mes TH, Schutten M

. 2010 Die effek van primer-template-wanpassings op die opsporing en kwantifisering van nukleïensure met behulp van die 5'-nuklease-toets. J. Mol. Diagn. 12, 109-117. (doi:10.2353/jmoldx.2010.090035) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Armstrong PM, Prince N, Andreadis TG

. 2012 Ontwikkeling van 'n multi-teiken TaqMan-toets om oostelike perde-enkefalitisvirusvariante in muskiete op te spoor. Vector Borne Zoonotic Dis. 12, 872-876. (doi:10.1089/vbz.2012.1008) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Garson JA, Ferns RB, Grant PR, Ijaz S, Nastouli E, Szypulska R, Tedder RS

. 2012 Geringe groefbinderwysiging van wydgebruikte TaqMan-sonde vir hepatitis E-virus verminder die risiko van vals negatiewe intydse PCR-resultate. J. Virol. Metodes. 186, 157-160. (doi:10.1016/j.jviromet.2012.07.027) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Brault AC, Fang Y, Dannen M, Anishchenko M, Reisen WK

. 2012 'n Natuurlike mutasie binne die sondebindende streek kompromitteer 'n molekulêre-gebaseerde Wes-Nyl-virus waarnemingstoets vir muskietpoele (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 49, 939-941. (doi: 10.1603/me11287) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 Analitiese sensitiwiteit en doeltreffendheid vergelykings van SARS-COV-2 qRT-PCR-toetse. medRxiv . (doi: 10.1101/2020.03.30.20048108) Google Scholar

West CP, Montori VM, Sampathkumar P

. 2020 COVID-19-toetsing: die bedreiging van vals-negatiewe resultate. Mayo Clin. Proc. 20, 30365-30367. (doi:10.1016/j.mayocp.2020.04.004) Google Scholar

Drame M, Teguo MT, Proye E, Hequet F, Hentzien M, Kanagaratnam L, Godaert L

. 2020 Moet RT-PCR as 'n goue standaard beskou word in die diagnose van Covid-19? J. Med. Virol. (doi:10.1002/jmv.25996) Crossref, PubMed, Google Scholar

2020 BioLaboro: 'n bioinformatika-stelsel vir die opsporing van molekulêre toets-handtekeningerosie en die ontwerp van nuwe toetse in reaksie op opkomende en heropkomende patogene. bioRxiv. (doi: 10.1101/2020.04.08.031963) Google Scholar

2020 Vergelyking van SARS-CoV-2-opsporing van nasofaryngeale deppermonsters deur die Roche cobas(R) 6800 SARS-CoV-2-toets en 'n laboratorium-ontwikkelde intydse RT-PCR-toets. J. Med. Virol. (doi:10.1002/jmv.25988) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2020 Interpreteer met omsigtigheid: 'n evaluering van die kommersiële AusDiagnostics versus interne ontwikkelingsbepalings vir die opsporing van SARS-CoV-2-virus. J. Clin. Virol. 127, 104374. (doi:10.1016/j.jcv.2020.104374) Crossref, PubMed, Google Scholar

Nagy A, Jirinec T, Cernikova L, Jirincova H, Havlickova M

. 2015 Grootskaalse nukleotiedvolgordebelyning en volgordeveranderlikheidsevaluering om die evolusionêr hoogs gekonserveerde streke vir universele siftings-PKR-toetsontwerp te identifiseer: 'n voorbeeld van griep A-virus. Metodes Mol. Biol. 1275, 57-72. (doi:10.1007/978-1-4939-2365-6_4) Crossref, PubMed, Google Scholar

Singer JB, Thomson EC, McLauchlan J, Hughes J, Gifford RJ

. 2018 GLUE: 'n buigsame sagtewarestelsel vir virusreeksdata. BMC Bioinf. 19, 532. (doi: 10.1186/s12859-018-2459-9) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar


Instrumentfoute kan 'n verraderlike aanvang hê en kan dus moeilik wees om te diagnoseer. Om duur herstelkoste te voorkom, moet u verseker dat alle operateurs van instrumente volledig opgelei is en aanvanklik onder toesig is. Sommige instrumentfoute veroorsaak katastrofiese mislukkings, wat geen amplifikasie of fluoresserende data tot gevolg het nie, terwyl ander data verdraai of monsters op 'n nie-eenvormige wyse behandel wat kunsmatige verskille tussen identiese biologiese monsters skep. Die gebruik van kontrolemonsters met kontroletoetse is van onskatbare waarde vir die oplos van probleme. Wanneer 'n instrumentfout vermoed word, moet 'n betroubare, geoptimaliseerde toets in alle putte uitgevoer word. Hierdie eenvormigheidstoets sal probleme openbaar wat spesifiek is vir streke van die instrument sowel as afsonderlike toets- en instrumentkwessies.

Nadat u 'n goed beplande PCR uitgevoer het, is daar verskeie diagnostiese instrumente beskikbaar vir die oplos van probleme:

  • Beheer monsters en toetse
  • Eindpuntgel/SYBR Groen I kleurstofreagens
  • Amplifikasie Plotte (kontroleer replikate en versterking plot profiel)
  • Standaardkurwes (gradiënt en R2)/verdunningsreeks
  • Smelt/Dissosiasie Plotte (SYBR Green I kleurstof, Molecular Beacons, Scorpions ® Probes)
  • Rou data/multikomponent-aansigte

Beheer monsters/reaksies

Die gebruik van kontroles word sterk aanbeveel. Dit is byna onmoontlik om 'n mislukte toets op te los sonder inligting van 'n toepaslike reeks kontroles.

Figuur 11.4. A) Onverdunde sjabloon slaag nie daarin om te versterk nie, terwyl verdunnings verbeterde amplifikasie-doeltreffendheid toon. B) Toevoeging van 0,3% BSA tot die qPCR -mengsel ondersteun versterking vanaf die onverdunde sjabloon.

Ondersoek na 'n heeltemal mislukte toets kan moeilik wees, want daar is min inligting waarmee u kan werk om probleme op te los. Aangesien baie toetsmislukkings die gevolg is van een of ander katastrofiese fout, moet die eerste kontrole wees om die eksperimentopstelling te verifieer en dan die PCR te herhaal. As dit misluk, is die probleemoplossingsproses afhanklik van inligting rakende elke komponent van die eksperiment (Figuur 11-5).

Figuur 11.5. Die basiese probleemoplossingsproses vir PCR.

When a qPCR experiment completely fails, the first step is to check assay design, the oligo sequences and the QC data from the oligo manufacturer. Although the assay may have failed, qPCR multicomponent/raw data can be used to provide further information. Figure 11.6A shows the raw data plot for two assays containing either a 6-FAM™ or a HEX™ (VIC ® ) labeled probe. Although both assays show amplification, the HEX signal is approximately half of that of the FAM signal. Since this is an inherently weaker dye, this is a normal observation. The agarose gel analysis (Figure 11.6B) shows both reactions yield a similar concentration of products, supporting the observation that the qPCR Cq values are similar.

Figure 11.6. A) The raw data plots of a duplex assay containing a FAM and a HEXlabeled probe. The FAM probe naturally yields higher fluorescence. B) The agarose gel showing that equal quantities of product were produced in each reaction and confirms the qPCR Cq observation.

Examination of the raw data is a useful check to verify that the probe is labeled correctly and was added to the reaction. Figure 11.7 shows the raw data for the amplification of three targets in a triplex experiment. The probes specific to each target are labeled with FAM, HEX and TAMRA. The HEX and TAMRA probes show a low background and efficient amplification, however the FAM signal is consistently high throughout the experiment and there is no evidence of amplification. This is consistent with too high probe concentration in the reaction or a fault with the probe such that there is no initial quenching of the signal. In such cases the probe concentration and assay design should be verified, ensuring that the probe has a compatible label and quencher and, if required, a new probe tested.

Figure 11.7. A triplex reaction was used to detect three targets using probes labeled with FAM, HEX and TAMRA. The HEX and TAMRA probes yielded amplification from the targets but the FAM probe showed no amplification. Examination of the raw data revealed that the background fluorescence was exceptionally high and no difference was observed throughout the reaction. This is consistent with too high a probe concentration in the reaction or a faulty probe with inadequate quenching.

If the original experiment relied upon probe detection the assay should be repeated using SYBR Green I reagents, including a positive and negative control (but not precious samples). Alternatively the products of a failed reaction can be checked on an ethidium bromide stained agarose gel. Adopting the SYBR Green I approach for repeating the experiment is preferable because it avoids the risk of contamination and provides a repeat experiment to verify the initial failure. If the SYBR Green I experiment provides data, it is possible that the original probe failure was due to either a technical error or probe fault. To differentiate between experimental error or a fault with the probe, repeat the probe experiment if the reaction fails again, replace the probe. This approach can be adopted to investigate reactions that are producing poor data. In the example shown in Figure 11.8, the probe reaction was sub-optimal and when compared to the reaction run using SYBR Green I, it can be seen that the probe signal does not reflect the experiment. In such cases the assay design should be verified and a new probe tested.

Figure 11.8. Identical reactions were run containing either a qPCR probe or SYBR Green I dye (as indicated). The SYBR Green I reaction was approximately eleven cycles more sensitive and yielded much higher end-point fluorescence. This is indicative of a fault in the probe or problem with the probe design (data kindly provided by Prof. Stephen Bustin, UK).

Validating probe labeling

The raw data or multicomponent plot is a useful diagnostic tool to investigate whether the appropriate concentration of probe has been included into the reaction and that the probe is adequately labeled and quenched. Figure 11.9 shows the multicomponent plot for a reaction containing three probes. The first two generate amplification plots and background fluorescence is evident. There is no data from the third probe and an examination of the raw data reveals that the background fluorescence is equivalent to the water blank control which does not contain any probe. Therefore, this data is the result of absence of fluorescence in the reaction. This would be due to an error during set up in which the probe was not included or that the probe was not labeled.

Figure 11.9. Three genes were detected in the same template sample. Two reactions resulted in amplification (1 and 2), however the 3rd was negative. An examination of the multicomponent view reveals that the background fluorescence for the 3rd reaction is equivalent to the water control indicating an absence of signal.

A further check of the probe labeling can be performed using a DNase I digestion. This must be performed with extreme care to ensure that probe and primer stocks are not contaminated with enzyme, which would lead to catastrophic results. An aliquot of a failing probe (Figure 11.10A) equivalent to that included in a reaction, e.g., 300 nM is incubated with and without DNase I. This can be carried out in real time (Figure 11.10B) such that the fluorescent yield is measured with respect to time or alternatively, the initial and end point (after 10 min) reading provide sufficient information. When performing this test it is important to compare the data to a probe that is functioning well and has the same fluorescent label and quencher (Figure 11.10B).

Figure 11.10. A) Two templates were detected using different probes, both FAM labeled. While detection using one probe resulted in a high fluorescent signal, the second was much weaker. B) A control and a test probe (300 nM) were incubated at 37 °C in a real time instrument in DNase I buffer in the presence or absence of DNase I enzyme. The fluorescent release from probe 1 was approximately twice that from probe 2, demonstrating that probe 2 labeling was inadequate.

Amplification Plots

The structure of the amplification plots and the reproducibility of technical replicates provide a wealth of information regarding the quality of the qPCR assay and may also provide the first warning indications that all is not as it should be. The amplification plots in Figure 11.11A are non-typical, very noisy and would be difficult to interpret accurately. A further examination of the dR fluorescence values reveals that the end-point fluorescent yield is only 400 units, indicating that the reaction is inadequate but the amplification plots have been generated by the instrument software and autoscaled. Similarly, the data in Figure 11.11B have a pronounced foxtail (decreasing curve) at the beginning of the profile, before increasing again after a baseline section. The appearance of the foxtail is consistent across two reactions, but one reaction has a much lower end-point (Figure 11.11C) resulting in an amplified, relative foxtail.

Figure 11.11. A) Amplification plots that are noisy due to autoscaling by the instrument software of poor data with low fluorescence. B) Reactions yielding low end point dR have a pronounced initial foxtail. C) The foxtail is seen as a normal effect when in proportion to the high quality assay.

Similarly, the amplification plots in Figure 11.12A are clearly abnormal and could not be used as they are presented. An amplification plot which dips below zero dR (Figure 11.12A) is a classic indication of inappropriate baseline settings having been applied. Examination of the raw data for this reaction (Figure 11.12B) shows that the actual amplification plots have a normal profile, confirming that the analyzed data are the result of an instrument software issue. The appropriate baseline can be deduced from the raw data and applied in the software. In this case cycles 6 to 16 represent the initial linear, baseline phase of the reaction and when applied, result in normal amplification plots (Figure 11.12C).

Figure 11.12. A) Amplification plots were clearly abnormal with a section of the profile dipping below the baseline. B) Examination of the raw data plot reveals that the reaction data are as expected. C) Setting the instrument baseline according to the appropriate cycles restores the normal profile to the data of analyzed amplification plots.

The amplification plot profile can also be interpreted to give information about the quality of the assay and optimization. Figure 11.13 shows the attempted amplification of a 10‑fold serial dilution of template with each concentration run in duplicate qPCR. The reproducibility between replicates is poor, the cycle difference (ΔCq) between the data is not constant and it is not 3.323 cycles, as expected for a 10-fold serial dilution. Examination of the amplification plots, with consideration to this being a standard curve, reveals that the assay is below standard and could not be used for analysis. The reasons would need further investigation but could be the result of poor assay design (see PCR/qPCR/dPCR Assay Design), sub-optimal assay conditions (see Assay Optimization and Validation), or poor pipetting (repeat assay).

Figure 11.13. A cDNA sample was diluted through a 10-fold serial dilution and the specific template detected using duplicate qPCR for each dilution. The replicates are poor, indicating a problem with pipetting or with assay optimization.

Figure 11.14. During a standard qPCR the data suddenly spike upward with a non-typical profile.

Figure 11.15. For declining or hooked fluorescence plots, the possible cause may be due to the complementary strand competing with the primer and/or probe for annealing to template. Ignore as long as Ct is not affected


The equation for using multiple reference genes to calculate the relative gene expression is displayed below.

The first thing I will say is: don’t panic! It is actually not as confusing as it looks. It is actually very similar to the Pfaffl equation, the only difference here being the geometric averaging of all the relative quantities (RQ), i.e. the (EREF) ∆Ct REF part, of the multiple reference genes used on the denominator (bottom) part of the equation.

Die E in the equation refers to the base of exponential amplification. A value of 2, like in the delta-delta Ct method, indicates that after each PCR cycle, the amount of product will double. In other words, a value represents a 100% efficient reaction.


RESULTATE

Efficiencies were calculated above 97% for all TaqMan and SYBR Green analysis [ Table 2 ]. Standard curves for SYBR Green and TaqMan analysis showed in [Figures ​ [Figures1 1 and ​ and2] 2 ] respectively.

Tabel 2

Calculated efficiencies of two methods

Standard curves of SYBR Green method, (a) A1 adenosine receptor, (b) A2A Adenosine receptor, (c) A2B adenosine receptor (d) A3 adenosine receptor, (e) B. actin

Standard curves of TaqMan method, (a) A1 adenosine receptor, (b) A2A Adenosine receptor, (c) A2B adenosine receptor (d) A3 adenosine receptor, (e) B. actin

The average values of normalized adenosine receptors gene expression levels were 1.44, 2.38, 3.79 and 3.55 for A1, A2A, A2B and A3 adenosine receptors for SYBR Green method and value for TaqMan method were 1.38, 2.43, 3.84 and 3.58 [ Table 3 ] respectively.

Tabel 3

Adenosine receptors expression levels in breast cancer

In the case of association between data of gene expression resulting from TaqMan and SYBR Green, Pearson analysis showed a significant and positive correlation between all method-pair gene expression analysis Table 4 .

Tabel 4

Correlation between results of SYBR Green and TaqMan methods


Advantages of Multiplex PCR

1. Internal Controls
Potential problems in a simple PCR include false negatives due to reaction failure or false positives due to contamination. False negatives are often revealed in multiplex assays because each amplicon provides an internal control for the other amplified fragments.

2. Efficiency
The expense of reagents and preparation time is less in multiplex PCR than in systems where several tubes of uniplex PCRs are used. A multiplex reaction is ideal for conserving costly polymerase and templates in short supply.

3. Indication of Template Quality
The quality of the template may be determined more effectively in multiplex than in a simple PCR reaction.

4. Indication of Template Quantity
The exponential amplification and internal standards of multiplex PCR can be used to assess the amount of a particular template in a sample. To quantitate templates accurately by multiplex PCR, the amount of reference template, the number of reaction cycles, and the minimum inhibition of the theoretical doubling of product for each cycle must be accounted.


Kyk die video: Primer design with Oligo 7 for qPCR SYBR green detection (Oktober 2022).