Inligting

4.3: Laboratoriumprosedures - Bakteriese smeer, Eenvoudige en Gram-kleuring - Biologie

4.3: Laboratoriumprosedures - Bakteriese smeer, Eenvoudige en Gram-kleuring - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Leeruitkomste

  • Berei mikro-organismes voor vir mikroskopiese waarneming.
  • Let op die verskil in grootte tussen bakterieë en ander eensellige mikroörganismes.
  • Voer 'n eenvoudige vlek en 'n Gram -vlek uit.
  • Neem gekleurde mikroörganismes waar en identifiseer hul grootte, vorm en kleureienskappe.

Deel I: Voorbereiding van 'n bakteriese smeer

Hierdie semester gaan jy twee kleurprosedures uitvoer: 'n Eenvoudige vlek en 'n Gram vlek. Albei hierdie kleurprosedures begin met die voorbereiding van 'n bakteriële smeer.

Materiaal

  • Maak die mikroskoopskyfies skoon
  • Vlekbakke en koerantpapier
  • Waterbottel (vir spoel)
  • Bakteriese kulture: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa,

Hoe om 'n bakteriese smeer te maak

1. Merk 'n skoon glasskyfie met 'n rooi wasmerker. Let daarop dat dit belangrik is om die kant van die glasskyfie te herken waarop jy jou bakteriese monster sit.

2. Voeg 'n by klein druppel soutoplossing na die skyfie (u plaas gewoonlik twee bakterieë op een skyfie van die mikroskoop- volg die spesifieke instruksies van u instrukteur). Dit kan gedoen word deur 'n druppel soutoplossing op jou inentingslus te plaas en dit dan na die skyfie oor te dra. As jy die soutdropper direk op die skyfie gebruik, moenie 'n volle druppel los nie.

3. Met 'n entlus of naald, tel 'n klein hoeveelheid bakterieë op. Meng dit goed met die soutoplossing en versprei die mengsel oor 'n groter area van die skyfie.

  • Wees versigtig dat die twee smere nie in mekaar vasloop nie.

4. Droog die bakteriese monster in die lug op die skyfie (skyfieverwarmers kan ook gebruik word).

5. As skyfies heeltemal lugdroog is, herstel die bakterie-monster deur dit twee keer stadig oor die vlam te laat beweeg (u onderwyser sal dit demonstreer).

  • Hittebinding maak selle dood en plak hulle aan die skyfie.
  • Selle sal van die skyfies afgespoel word as hulle nie behoorlik verhit is nie.
  • Wees versigtig om nie die skyfies in hierdie prosedure te oorverhit nie

Nadat hitte-fiksering voltooi is, is jy gereed om jou skyfie eenvoudig of gram te vlek.

Prent 1: Hittefiksering oor 'n bunsenbrander

Kyk na Video 1: oor hittebinding met behulp van 'n bacticinerator

Kyk Video 1: oor hittebepaling met behulp van 'n baktisinerer van dr. G. Kaiser op URL: https://youtu.be/Rh0GrcTzjnU

Deel II: Eenvoudige vlek

Kulture

Bacillus megaterium

Micrococcus luteus

Saccharomyces cerevisiae - 'n gis

Materiaal

Druppelbottel wat kleuroplossing van metileenblou bevat

Brightfield ligmikroskoop

Olie onderdompeling

lens papier

bybels papier

Lab Prosedures

A. Hersien Laboratoriumprosedures vir die gebruik van 'n Brightfield Light-mikroskoop

B. Voorbereiding van 'n bakteriese smeer vir kleuring

Voorbereidings van bakterieë vir kleuring kan gemaak word uit groei op 'n agarplaat of van 'n souskultuur.

1. Om 'n skyfie voor te berei van selle wat op 'n agarmedium gekweek is, plaas eers a KLEIN druppel, 'n lusvol werk goed, van water op 'n skoon, vetvrye skyfie. Volgende, met 'n steriele lus oordrag a KLEIN BEDRAG van die groei tot die druppel water en vryf die lus om totdat die materiaal so eweredig moontlik versprei is om 'n net sigbaar troebel suspensie te vorm. Versprei die druppel oor a klein gedeelte van die skyfie om 'n dun film met lig sigbare troebelheid te maak.

2. Berei drie afsonderlike smere, een elk van Bacillus megaterium. Micrococcus luteus, en Saccharomyces cerevisiae.

3. Volgende, hitte regmaak die skyfie deur dit vir 5 minute op die skyfieverwarmer te plaas. Sit die monsterkant na bo en merk met jou voorletters aan die een kant van die skyfie. Hierdie proses word genoem hitte bevestiging die monster na die skyfie. Die doel daarvan is om die monster aan die skyfie te bind sodat dit nie tydens kleuring afwas nie. Om die selle met hittefiksasie dood te maak, verhoog ook hul deurlaatbaarheid vir die kleurstowwe wat in kleuring gebruik word.

Moenie u monster onderfiks maak nie (die uitstryk sal uitspoel) en ook nie te warm word nie (die selle breek of verdraai). Die skyfie moet warm wees om aan te raak, nie warm nie. As u dink dat u die skyfie te veel verhit het, moet u nie die skyfie aan u hand raak om uit te vind nie. Die kans is goed dat jou vermoedens korrek is, en jy sal jou hand met die warm glas verbrand. Verhit eerder die skyfie volgende keer vir 'n korter tydperk en toets dan.

4. Na afkoeling is die monster gereed vir die eenvoudige vlek.


C. Metileenblou – 'n Eenvoudige vlek

Lewende bakterieë is amper kleurloos, en bied nie voldoende kontras met die water waarin hulle gesuspendeer is om duidelik sigbaar te wees nie. Die doel van kleuring is om die kontras tussen die organismes en die agtergrond te verhoog sodat hulle makliker in die ligmikroskoop gesien kan word. In 'n eenvoudige vlek word 'n bakteriese smeer bevlek met 'n oplossing van 'n enkele kleurstof wat alle selle in dieselfde kleur vlek sonder om die seltipes of strukture te onderskei. Die enkele kleurstof wat hier gebruik word, is metileenblou, 'n basiese vlek. Basiese vlekke, met 'n positiewe lading, bind sterk aan negatief gelaaide selkomponente soos bakteriële nukleïensure en selwande.

1. Vlek deur die smeer heeltemal met metileenblou te bedek. Dit behoort te wees
gedoen oor 'n wasbak met 'n skuifhouer.

*Vermy vlekke op jou klere, boeke en vingers. Dit is baie moeilik om te verwyder.

2. Laat die vlek 1-2 minute werk.

3. Kantel die skyfie om die vlek te laat dreineer. Spoel nou die oorblywende kleurstof af met 'n sag stroom water uit 'n kraan of wasbottel.

4. Dep die skyfie droog met suurpapier. Verwyder oortollige water van die skyfie deur die een hoek van die skyfie aan die vloeipapier te raak, plaas dan die skyfie tussen skoon velle papier in die kladblok en klad droog. Maak seker jy vryf nie af nie die smeer.

5. Ondersoek onder die mikroskoop deur gebruik te maak van eers die 10X en dan die 100X olie-onderdompel objektief.

6. Teken jou waarnemings op die verslagblaaie aan.

D. Toetsplaat-isolaat

1. Kontroleer u "toetsplate" van Lab1: Oefening I, deel D (alomteenwoordigheid van mikroörganismes) vir geïsoleerde enkele kolonies as kandidate vir u toetsplaatisolaat.

2. Probeer 'n eenvoudige vlek van u kandidaat -toetsplaat isoleer soos beskryf in deel B van oefening II. Teken jou waarnemings aan.

3. Wys 'n instrukteur jou geïsoleerde enkele toetsplaat -isolaat en die skyfie van die eenvoudige vlek van die monster wat jy gekies het. Dit is om te verseker dat jy met 'n bakteriese kultuur sal werk in plaas van 'n swam-isolaat.

4. As jy geen enkele kolonie bakteriële isolate op jou "toetsplate" gekry het nie, gebruik een van 'n ander student in die laboratorium, maar maak seker jy kies 'n ander isolaat as wat daardie student gekies het, of gebruik een van die instrukteur se plate.

5. Nadat u 'n kandidaat vir u toetsplaat geïsoleer het, moet u seker maak dat dit 'n suiwer kultuur is. Gebruik 'n nuwe Nutrient-agarplaat om weer vir enkelkolonies te streep met behulp van die tegniek van Oefening I, deel C (die "T" -reeks). Maak seker dat jy probeer raak net een kolonie, die een wat jy belangstel om as jou onbekende te gebruik. Stoor jou oorspronklike bord. Inkubeer tot die volgende laboratoriumperiode.

E. Demonstrasieskyfie

U het pas skyfies voorberei Bacillus ('n staafvorm) en Mikrokokkus ('n kokkie). Ons het 'n skyfie opgestel om 'n derde groot sellulêre vorm wat in bakterieë gesien word, te demonstreer. Spirillum volutans is 'n spiraalvormige mikro-organisme wat in vars water voorkom. Bekyk die demonstrasieskyfie en teken jou waarnemings op die Resultate-bladsy aan.

Gramkleurprosedure

  • Vir alle stappe in die gram-kleurprosedure, voeg genoeg van die oplossing by om die areas van die skyfie wat bakterieë op het, te bedek. Jy hoef nie die hele skyfie te oorstroom nie.
  • Alle kleuring moet oor 'n kleurskinkbord gedoen word. Maak seker dat jy koerantpapier onder die skinkbord sit in geval van mors.
  • Handskoene moet gedra word terwyl gekleur word en verwyder word voordat met die mikroskoop gewerk word.
STAPPE VERDUIDELIKING
1. Voeg 'n paar druppels by kristalviolet (primêre vlek) na die smeer en laat dit vir 60 sekondes sit.
2. Spoel die skyfie af met water.Alle selle is pers na hierdie stap. Om hier te stop sou 'n eenvoudige vlek.
3. Voeg 'n paar druppels by Gram se jodium (beitsmiddel) na die smeer en laat dit vir 60 sekondes sit.Gram se jodium vorm 'n kompleks met kristalviolet
4. Spoel die skyfie met water.Alle selle is pers na hierdie stap.
5. Ontkleur met 95% etanol: laat die alkohol oor die oppervlak van die skyfie loop totdat daar nie meer kristalviolet kleur uit die smeer kom nie (tyd wissel—nie meer as 5-10 sekondes nie).Gram-positiewe selle behou kristalviolet en bly pers. Gram-negatiewe selle verloor kristalviolet en is nou kleurloos
6. Spoel af met water.Waterspoel stop die ontkleuringsproses
7. Voeg 'n paar druppels by safranien (teenvlek) en laat dit vir 60 sekondes sit.Safranin is 'n pienk/rooi kleurstof
8. Spoel af met water. Dep droog op suurpapier. Wees versigtig om nie die bakterieë af te vee nie.Gram positiewe selle bly oor pers; gram negatiewe selle is nou pienk/rooi
9. Kyk na jou skyfie onder die mikroskoop.Bepaal vir elke organisme morfologie, rangskikking en Gram-reaksie

Gramkleuring: Beginsel, Prosedure, Interpretasie, Voorbeelde en Animasie

Gramkleuring is die algemene, belangrike en mees gebruikte differensiële kleurtegnieke in mikrobiologie, wat in 1884 deur die Deense bakterioloog Hans Christian Gram ingestel is. Hierdie toets onderskei die bakterieë in Gram Positiewe en Gram Negatiewe Bakterieë, wat help met die klassifikasie en differensiasie van mikroörganismes.

Beginsel van Gramkleuring

Wanneer die bakterieë met primêre vlek Kristalviolet gekleur word en deur die beitsmiddel vasgemaak word, is sommige van die bakterieë in staat om die primêre vlek te behou en sommige word deur alkohol ontkleur. Die selwande van gram-positiewe bakterieë het 'n dik laag proteïen-suiker komplekse wat peptidoglycan genoem word, en die lipiedinhoud is laag. Deur die sel te verkleur, word hierdie dik selwand ontwater en krimp, wat die porieë in die selwand toemaak en verhoed dat die vlek die sel verlaat. Die etanol kan dus nie die Crystal Violet-Jodium-kompleks verwyder wat aan die dik laag peptidoglycan van gram-positiewe bakterieë gebind is en blou of pers van kleur lyk nie.

In die geval van gramnegatiewe bakterieë neem die selwand ook die CV-jodiumkompleks op, maar as gevolg van die dun laag peptidoglycan en dik buitenste laag wat gevorm word uit lipiede, word CV-jodiumkompleks afgespoel. As hulle aan alkohol blootgestel word, los die verkleurmiddel die lipiede in die selwande op, waardeur die kristalviolet-jodiumkompleks uit die selle kan loog. Wanneer hulle dan weer met safranien gekleur word, neem hulle die vlek en lyk rooi van kleur.

  • Crystal Violet, die primêre vlek
  • Jodium, die betowerende
  • 'n Ontkleurmiddel gemaak van asetoon en alkohol (95%)
  • Safranin, die teenvlek

Prosedure van Gram-kleuring

  1. Neem 'n skoon, vetvrye skyfie.
  2. Berei die suspensiesmeer op die skoon skyfie voor met 'n lusvol monster.
  3. Lugdroog en hitte fix
  4. Crystal Violet is gegiet en vir ongeveer 30 sekondes tot 1 minute gehou en spoel met water.
  5. Oorstroom die gram se jodium vir 1 minuut en was met water.
  6. Was dan met 95% alkohol of asetoon vir ongeveer 10-20 sekondes en spoel uit met water.
  7. Voeg safranien by vir ongeveer 1 minuut en was met water.
  8. Lugdroog, dep droog en kyk onder mikroskoop.

Gram Positief: Blou/pers kleur
Gram Negatief: Rooi kleur

Gram -positiewe bakterieë: Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactobacillus, Listeria, Mycoplasma, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces , ens.
Gram negatiewe bakterieë: Escherichia coli (E coli), Salmonella, Shigella, en ander Enterobacteriaceae, Pseudomonas,Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, asynsuur bakterieë, Legionella ens


Beginsel van Gram-vlek

Die verskille in die selwand-samestelling van Gram-positiewe en Gram-negatiewe bakterieë is verantwoordelik vir die Gram-kleuringverskille. Gram-positiewe selwand bevat 'n dik laag van peptidoglikaan met talle teichoïensuur-kruisbindings wat die ontkleuring weerstaan.

In waterige oplossings dissosieer kristalviolet in CV+ en Cl – ione wat deur die wand en membraan van beide Gram-positiewe en Gram-negatiewe selle penetreer. Die CV+ is in wisselwerking met negatief gelaaide komponente van bakteriële selle, wat die selle pers kleur.

Wanneer dit bygevoeg word, tree jodium (I- of I3-) in wisselwerking met CV+ om groot kristalviolet-jodium (CV-I) komplekse binne die sitoplasma en buitenste lae van die sel te vorm.

  • Die buitenste membraan van die Gram-negatiewe sel gaan verlore uit die sel, wat die peptidoglykanlaag blootstel. Gram-negatiewe selle het dun lae peptidoglycan, een tot drie lae diep met 'n effens ander struktuur as die peptidoglycan van gram-positiewe selle. Met etanolbehandeling raak gram-negatiewe selwande lek en laat die groot CV-I-komplekse uit die sel spoel.
  • Die hoogs gekruiste en meerlagigpeptidoglikaan van die gram-positiewe sel word gedehidreer deur die byvoeging van etanol. Die meerlaagse aard van die peptidoglikaan saam met die dehidrasie van die etanolbehandeling vang die groot CV-I komplekse binne die sel vas.

Na die verkleuring word die gram-positiewe sel bly pers van kleurterwyl die gram-negatiewe sel die pers kleur verloor en slegs geopenbaar word as die teenvlek, die positief gelaaide kleurstof safranien, word bygevoeg.


Gram Positiewe Selwand:

Gram-positiewe bakterieë het 'n dik maasagtige selwand wat bestaan ​​uit peptidoglikaan (50-90% van selwand), wat pers vlek. Peptidoglycan is hoofsaaklik 'n polisakkaried wat bestaan ​​uit twee subeenhede genaamd N-asetielglukosamien en N-asetiel muramienzuur. Soos aangrensende lae peptidoglikaan gevorm word, word hulle deur kort kettings peptiede deur middel van 'n transpeptidase-ensiem gekruis, wat die vorm en rigiditeit van die selwand tot gevolg het. Die dik peptidoglykaan laag van Gram-positiewe organismes laat hierdie organismes toe om die kristalviolet-jodiumkompleks te behou en die selle pers te vlek.

Lipoteichoïensuur (LTA) is 'n ander hoofbestanddeel van die selwand van Gram-positiewe bakterieë wat in die peptidoglikaanlaag ingebed is. Dit bestaan ​​uit teichoïensure wat lang kettings van ribitolfosfaat is wat via 'n gliseried aan die lipied -tweelaag geanker is. Dit dien as reguleerder van outolitiese wandensieme (muramidases: Bakteriële ensieme in die selwand wat die ontbinding van die sel veroorsaak as gevolg van besering of dood.)

Mediese relevansie van Gram Positiewe Selwand:

LTA het ook antigeniese eienskappe wat spesifieke immuunresponse stimuleer wanneer dit ná seldood uit die selwand vrygestel word. Seldood is per e-pos as gevolg van lise wat veroorsaak word deur lisosimale aktiwiteite, kationiese peptiede van leukosiete, of beta-laktam antibiotika.


Prosedure

Voorbereiding van 'n smeer

  1. Gebruik 'n gesteriliseerde entlus om die lus vol vloeibare suspensie wat bakterieë bevat, oor te dra na 'n skyfie (skoon vetvrye mikroskopiese skyfie) of plaas 'n geïsoleerde kolonie van 'n kweekplaat na 'n skyfie met 'n waterdruppel.
  2. Versprei die bakterieë op die lus in die druppel water op die skyfie en versprei die druppel oor 'n gebied van die grootte van 'n sent. Dit moet 'n dun, egalige smeer wees.
  3. Laat die smeer goed droog word.
  4. Verhit die smeer versigtig deur die onderkant van die skyfie twee of drie keer deur die brandervlam te beweeg. Dit maak die sel in die skyfie reg. Moenie die skyfie oorverhit nie, want dit sal die bakteriese selle verwring.

Verkleuring

  1. Bedek die vlek met metileenblou en laat die kleurstof ongeveer 'n minuut in die vlek bly (kleurtyd is hier nie van kritieke belang nie, tussen 30 sekondes tot 2 minute moet u 'n aanvaarbare vlek gee, hoe langer die kleurstof daarin bly, donkerder sal die vlek wees).
  2. Was die oortollige metileenblou van die skyfie liggies met 'n wasbottel met gedistilleerde water deur 'n sagte waterstroom oor die oppervlak van die skyf te lei.
  3. Was ook enige vlek af wat op die onderkant van die skyfie gekom het.
  4. Versadig die smeer weer maar hierdie keer met Jodium. Jodium sal die vlek stel
  5. Was van enige oortollige jodium met liglopende kraanwater. Spoel deeglik af. (Jy kry dalk nie melding van stap 4 en 5 in sommige handboeke nie)
  6. Vee die agterkant van die skyfie af en vee die gekleurde oppervlak af met suurpapier of met 'n papierhanddoek.
  7. Plaas die gekleurde smeer op die mikroskoop stadium smeer kant na bo en fokus die smeer met behulp van die 10X objektief.
  8. Kies 'n area van die smeer waarin die selle goed versprei is in 'n monolaag. Sentreer die area wat bestudeer moet word, smeer dompelolie direk op die smeer aan en fokus die smeer onder olie met die 100X-doelwit.


Kyk die video: zuurvaste kleuring (Oktober 2022).