Inligting

Hoe kan ek die akkurate/lae aantal selle uit sellysaat neem?

Hoe kan ek die akkurate/lae aantal selle uit sellysaat neem?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek wil graag weet hoe kan ons 'n lae of presiese aantal selle uit 'n sellisaat neem? (sonder die gebruik van enige proteïen kwantifiseringstoets).

Gestel, as ek 'n sellyn het met seldigtheid 5x10^5 selle/ml (en die gemiddelde hoeveelheid proteïenkonsentrasie is 0.1ng/sel)

As ek hierdie selle liseer by die konsentrasie van 5x10^5 sel/ml met buffer (bv. 0.1% rapigest + 10mM DTT). Nadat ek sellisaat bereik het, hoe kan ek presiese selgetalle van hierdie lysaat neem vir verdere monsterverwerking (bv. alkilering, vertering, ens.)?

Byvoorbeeld, as ek 100 selle/5 ul of 1000 selle/50 ul wil hê, hoe kan ek dit dan uit sellysaat neem?

Ek weet ek sal my lysaat moet verdun, maar ek is bietjie deurmekaar hoe om dit te bereik op grond van selkonsentrasie? hoeveel lisebuffer en verdunning sal gepas wees?

Let wel: In my geval kan ek geen proteïen-kwantifiseringstoets gebruik om proteïenkonsentrasie te meet nie.

Ek sal dit baie waardeer as iemand kan help asb.

Sien uit om binnekort te hoor.

Die uwe,


Die soogdierbrein het meer as 10 000 soorte neurone. Daarom vereis die bestudering van geenregulering in die brein effektiewe strategieë om spesifieke seltipes te rig, veral dié met 'n lae hoeveelheid. Selisolasie kan geenuitdrukking verander en is ontwrigtend vir volwasse neurone met uitgebreide prosesse. Hierdie protokol beskryf seltipe-spesifieke uitdrukking van gemerkte ribosoom en die gebruik van ribosoommerking gevolg deur RNA-seq om translatoom van lae getal en yl selle in muisbreine te identifiseer sonder ontwrigtende selisolasie.

Vir volledige besonderhede oor die gebruik en uitvoering van hierdie protokol, verwys na Gao et al. (2020)


Selkultuurmikroskope

Om 'n gesonde en stabiele selkweek te handhaaf, verg daaglikse mikroskopiese ondersoek, wat vinnig en maklik moet wees om omgewingsstres te voorkom en die risiko van besmetting te verminder, asook om u werklading laag te hou. Selkultuurbeeld kan inligting verskaf oor groei, besmetting, seldifferensiasie en status en transfeksiesnelhede. Goeie selkultuurpraktyk en karakterisering is voorvereistes om reproduceerbare resultate te verseker.

Die mikroskoop wat jy vir selkultuur gebruik, moet ideaal binne jou kultuurkap pas, of kompak genoeg wees om op 'n aangrensende bank te plaas. Aangesien gekweekte selle deursigtig kan verskyn onder helderveldbeligting, maak fasekontras die visualisering van sellulêre morfologie en beeldvorming van organelle moontlik. Die gebruik van 'n lig-emitterende diode (LED) bron kan voordelig wees, aangesien LED's onmiddellik aan en af ​​kan skakel, minimale hoeveelhede hitte of ongewenste ultraviolet (UV) lig kan produseer en sodoende die fototoksiese effekte verminder in vergelyking met bronne soos kwikbooglampe .

Die visualisering van die beste strukture in u selle vereis 'n perfek gepaste kontrasterende tegniek, soos differensiële interferensie -kontras (DIC), PlasDIC en verbeterde Hoffman -modulasie -kontras (iHMC). DIC verbeter die kontras van ongekleurde monsters en produseer hoë-resolusie beelde. In PlasDIC word die monster met nie-gepolariseerde lig verlig, wat dit 'n ideale tegniek maak wanneer plastiekkultuurhouers gebruik word. HMC gebruik 'n modulator met drie sones, wat elkeen 'n spesifieke oordrag van lig moontlik maak. Met 'n gekombineerde spleetopening wat skuins monsterbeligting verskaf, word lig óf gebreek óf gaan deur die modulator in ooreenstemming met die monsterstruktuur. Verbeterde HMC verseker skerp kontras en pseudo-3D-beelde van die beste sellulêre strukture.


Hoe kan ek die akkurate/lae aantal selle uit sellysaat neem? - Biologie

Figuur 1: 'n agterkant van die omhulselberekening van die aantal proteïene per sel in 'n kenmerkende bakterie en soogdier. Skatting is gebaseer op generiese parameterwaardes. Vir meer akkurate organisme-spesifieke waardes sien hoofteks.

Gegewe die sentrale plek van geenregulering in alle domeine van biologie, is daar groot belangstelling in die bepaling van die sensus van mRNA in selle van verskeie tipes. Ons is geïnteresseerd in spesifieke gene en in die hele transkriptome as 'n funksie van die omgewingstoestande en die ontwikkelingsfase. Sulke metings bied 'n direkte uitlees van die oombliklike regulatoriese toestand van die sel op 'n gegewe tydstip, en gee ons as sodanig 'n kragtige instrument om te ontleed hoe sellulêre besluitneming geïmplementeer word. Ons begin met die verbeelding om te sien of ons 'n paar belangrike sellulêre feite kan gebruik om die aantal mRNA's te bepaal. Gegewe ons kennis van die kinetika van die prosesse van die sentrale dogma tydens een selsiklus, kan die aantal mRNA-molekules per sel uitgewerk word soos getoon in Figuur 1. Die essensie van die skatting is om die erkenning te ontgin dat oor die loop van die selsiklus, moet die aantal proteïene verdubbel word deur proteïensintese. Hierdie proteïensintese is op sy beurt gebaseer op die verspreiding van mRNA-molekules wat in die sel teenwoordig is. Soos in hierdie agterkant van die koevertberekening getoon, kan ons 'n skatting aflei vir vinnig verdelende selle van 10 3 -10 4 mRNA per bakteriese sel en 10 5 -10 6 mRNA per die 3000 μm 3 kenmerkende grootte van 'n soogdiersel.

Figuur 2: Gebruik volgordebepaling om die aantal mRNA's per sel te vind. (A) mRNA word versigtig uit selle onttrek en gemeng met gesintetiseerde mRNA wat dien vir kalibrasie. Diep volgordebepaling maak dit moontlik om die aantal kopieë van elke mRNA -tipe te tel, en hieruit kan die totale aantal mRNA's afgelei word. (B) mRNA tel vir E. coli gegroei in ryk media en minimale media. (Data met vergunning van Zoya Ignatova)

Moderne tegnieke het nou grootliks dié wat tot die klassieke sensusgetalle gelei het, vervang. Een benadering is gerig op "genoomwye" metings waarin 'n poging aangewend word om die aantal mRNA's oor die hele transkriptoom te vergroot. Hierdie resultate is gebaseer op die metode van RNA-Seq waar individuele mRNA's van die sellisaat gevolgorde word. Aangesien die telling gebaseer is op die frekwensie van sekwenslesings, is dit natuurlik kalibrasie nodig. Vir daardie doel word die monster met mRNA-standaarde verryk waarvan die hoeveelheid bekend is voor volgordebepaling. 'n Voorbeeld van so 'n resultaat word in Figuur 2 getoon, wat oor die verspreiding van mRNA's in E coli gegroei onder beide ryk en minimale media toestande. Die resultaat van hierdie studie is dat die aantal transkripsies per sel (≈8000 mRNA-kopieë/sel) vir selle wat in LB-media gegroei het, ongeveer drievoudig groter is as die aantal transkripsies per sel (≈3000 mRNA-kopieë/sel) vir selle gegroei in minimale media. Gegewe dat die aantal gene meer as 4000 is, impliseer dit dat die gemiddelde kopiegetal in LB in die orde van een per sel is. Vir die meeste gene is dit eintlik nog minder, wat beteken dat daar in die meeste selle nul kopieë is, terwyl daar in sommige een of twee is. Ons vind hierdie treffende feit een voorbeeld van waar vir die meeste mense die prentjie van die inhoud van 'n sel, in hierdie geval 'n bakteriese sel, aangevul word deur die gebruik van getalle as 'n sesde sintuig om selle waar te neem.

Figuur 3: Fluoressensie mikroskopie benadering tot die neem van die mRNA sensus. Deur gebruik te maak van fluoressensie in-situ hibridisasie (FISH), is dit moontlik om fluoressensie intensiteit van spesifieke probes wat hibridiseer met 'n mRNA van belang te gebruik om hierdie mRNA te tel. (A) Skematiese voorstelling van die enkelmolekule probes wat gebruik word om mRNA te benoem. (B) Fluorescentiebeeld van 'n veld van E. coli -selle met die mRNA vir 'n spesifieke geenbeeld. (C) Histogram van die gemiddelde aantal mRNA in E. coli vir 'n aantal gene. (Aangepas uit Taniguchi et al. Science, 329, 533 (2010)).

Een van die belangrikste vrae in die middel van die biologiese gesyferdheid wat in ons boek gevra word, is dié van reproduceerbaarheid, veral wanneer verskillende metodes op dieselfde probleem ingestel word. 'n Baie nuttige alternatief vir die neem van die mRNA-sensus is gebou rondom direkte telling deur na die individuele mRNA-molekules onder 'n mikroskoop te kyk. Spesifiek, 'n geen-vir-geen ontbinding deur gebruik te maak van tegnieke soos enkelmolekule fluoressensie in-situ hibridisering (FISH), vul die RNA-Seq perspektief hierbo aan. FISH bied 'n venster na die mRNA-ruimtelike en sel-tot-sel-verspreiding vir 'n spesifieke spesie mRNA-molekule soos hier in Figuur 3 getoon en soos getoon in Figuur 2 van die vignet oor "Hoeveel sel-tot-sel-veranderlikheid bestaan ​​in proteïen uitdrukking?”. Die idee in hierdie geval is om probes te ontwerp wat bind aan die mRNA van belang deur komplementêre basisparing. Elke so 'n sonde het 'n fluorofoor en dus, wanneer die gefixeerde selle in die mikroskoop ondersoek word, word die intensiteit van die fluoressensie van hierdie probes gebruik as 'n uitlees van die aantal mRNA's. Soos gesien in Figuur 3B, is die aantal mRNA's per sel oor die algemeen tussen 0.1 en 1, met verskeie uitskieters wat beide kleiner en groter mRNA-tellings het. Soos ook in die boek beklemtoon is, lei verskillende toestande tot verskillende getalle en die VISH -resultate wat hier herskep word, stem ooreen met 'n stadige groei.

Figuur 4: mRNA -verspreidings in gis. (A) mRNA -verspreiding in ontluikende gis verbou in ryk media (YPD) en minimale media (SD) soos gemeet met behulp van PCR. (B) mRNA-verspreiding in splitsingsgis gemeet met RNA-Seq. ((A) aangepas uit F. Miura, BMC Genomics, 9, 574 (2008) (B) aangepas uit S. Marguerat, Cell, 151: 671 (2012)).

Wat van die mRNA -sensus in ander seltipes behalwe bakterieë? Weereens, beide volgordebepalingsmetodes en mikroskopie is op hierdie vrae in gis en ander eukariote gebruik. Figuur 4 gee resultate vir die mRNA -sensus in beide ontluikende en splitsingsgis. Die totale aantal mRNA per sel is in die reeks 20,000-60,000 in eksponensieel groeiende ontluikende gis (BNID 104312, 102988, 103023, 106226, 106763). Soos met ons vorige resultate vir bakterieë, vind ons ook hier dat elke geen oor die algemeen net 'n paar mRNA-molekules op enige tydstip in die sel teenwoordig het. Die vignet op "Wat is die proteïen tot mRNA-verhouding in selle?" verskaf 'n venster op die amplifikasiefaktor wat 'n gegewe mRNA bywoon soos dit in die proteïene van die sel verander word in die proses van translasie. Vir 'tipiese' soogdierselle is 'n aangehaalde waarde van 200,000 mRNA per sel (BNID 109916) in ooreenstemming met ons eenvoudige skatting hierbo en toon aan dat die skaal van die aantal mRNA proporsioneel met grootte en groeitempo 'n nuttige eerste raaiskoot lyk.


Figuur 2

Figuur 2. (a) Dosisresponskurwe vir rekombinante Akt, MK2 en PKA aktiwiteitsbepaling. Die opsporingsgrense is onderskeidelik 1, 1.2 en 0.7 ng/ml. (b) Dosisresponskurwes wat die opregulering van Akt -aktiwiteit deur insulien en die opregulering van PKA -aktiwiteit deur forskolin toon (25 μM, 30 min). Geplot waardes dui die gemiddelde ± s.m. vir duplikaatmetings.

Kinase aktiwiteitsbepaling van grootmaat sellysaat

Kinase aktiwiteitsbepaling uit enkelsellysaat


Hoe kan ek die akkurate/lae aantal selle uit sellysaat neem? - Biologie

'n Departement Biomediese Ingenieurswese, Yale University, New Haven, CT 06520, VSA
E-pos: [email protected]
Faks: +1 203-432-6441
Tel: +1 203-432-9905

b Departement Genetika, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, VSA
E-pos: [email protected]
Faks: +1 203-785-4305
Tel: +1 203-737-3426

c Yale-stamselsentrum, Yale-kankersentrum, New Haven, CT, VSA

d Yale Sentrum vir RNA Wetenskap en Geneeskunde, New Haven, CT, VSA

Abstrak

Mikro-RNA's (miRNA's) is klein nie-koderende RNA's wat geenuitdrukking op die post-transkripsionele vlak beheer via 'n komplekse regulatoriese netwerk wat genoomwye miRNA-profiele vereis om te dissekteer. Die patrone van miRNA-uitdrukking op die genoomskaal is ryk aan diagnostiese en prognostiese inligting vir menslike siektes soos kankers. Hierdie ontleding vereis egter multi-stap suiwering van RNA's van groot hoeveelhede selle, wat nie net tydrowend en duur is nie, maar ook uitdagend in situasies waar selgetalle beperk is. In hierdie studie rapporteer ons direkte vaslegging, amplifikasie en biblioteekvoorbereiding van miRNA's van heelsel-lisaat sonder die behoefte aan vooraf-suiwering. As gevolg hiervan maak dit genoomwye miRNA-profilering reproduseerbaar moontlik met 'n lae hoeveelheid selmonsters (~500 hematopoietiese selle). Spesifiek, ons het 'n sistematiese ondersoek van twee sleutelstappe uitgevoer - sellise vir miRNA-vrystelling en 3'-adapterligasie wat nodig is vir direkte miRNA-opvang en amplifikasie. Die verkryde uitdrukkingsprofiel onderskei nie net seltipes nie, maar bespeur ook individuele miRNA-veranderinge in nouverwante isogeniese sellyne. Hierdie benadering, wat wesenlik eenvoudig is in vergelyking met die standaardmetodes as gevolg van die uitskakeling van die behoefte aan RNA-suiwering, is voordelig vir die meting van lae hoeveelheid monsters.


Agtergrond

Borsmelk se voedingseienskappe word al vir honderde jare erken. Borsvoeding word beskou as een van die belangrikste maatreëls om die gesondheid van kinders in baie samelewings te verbeter, en borsmelk word nou beskou as 'n terapeutiese middel wat geskik is om parallel met geneesmiddelterapie [1,2,3] gebruik te word.

Die melk van elke spesie het 'n unieke samestelling wat oor miljoene jare ontwikkel het om aan die behoeftes van babas van die spesie te voldoen. Dit bevat 'n magdom immunologiese, biochemiese en sellulêre komponente wat die potensiaal het om pasgebore immuniteit en vatbaarheid vir infeksie aansienlik te verander [1, 4]. Bykomende kompleksiteit word veroorsaak deur individuele variasies in die samestelling van borsmelk, wat toegeskryf word aan die stadium van laktasie, die mate van borsvolheid, babavoeding, die gesondheid van die borsvoedingsdiade en ander faktore.

Ten spyte van variasie in melksamestelling, is die hoofboustene van melk algemeen vir alle soogdiere. Funksioneel is dit moontlik om te onderskei tussen voedings- en bioaktiewe komponente in moedersmelk. Laasgenoemde is groei- en immunologiese faktore en sellulêre komponente. Tipies word vermoed dat borsmelk epiteelselle en immuunselle bevat. Onlangse deurbrake het getoon dat borsmelk meer heterogeen is as wat voorheen gedink is en dat dit ook stamselle bevat. Borsmelk is ook 'n deurlopende bron van kommensale en voordelige bakterieë, insluitend melksuurbakterieë en bifidobakterieë. 'n Vergelyking van somatiese selgetal en bakteriese lading in dieselfde monsters het geen beduidende korrelasie getoon nie. Die huidige kennis van die sellulêre samestelling van moedermelk word in figuur 1 opgesom.

Selle in menslike borsmelk

Navorsing het 'n noue verband tussen melkvet en selvinhoud getoon wat verander met die graad van borsvolheid [5]. Meganismes wat nog toegelig moet word, sluit in die regulering van borsmelksintese, die migrasie van selle na borsmelk, die skepping van die stamvader/stamsel samestelling en die skepping van die mikrobioom bydrae. Die samestellende variëteit van borsmelk selpopulasies laat vrae ontstaan ​​oor die funksie van nie-immuun- en stam-/stamvader selle, en die korrelasies tussen melkmikrobiota, somatiese selle en makronutriënte. Hierdie resensie beklemtoon die huidige stand van kennis oor die sellulêre samestelling van menslike borsmelk.

Immunologiese selle

Mensmelk-gemedieerde beskerming van die baba is lank reeds bekend en intensief bestudeer. Borsmelk verleen aktiewe en passiewe immuniteit aan die baba omdat dit 'n ryk bron is van immunoglobuliene, laktoferrien, lysozyme, sitokiene en talle ander immunologiese faktore.

In die laat 1960's het studies aan die lig gebring dat kolostrum ryk is aan leukosiete [6, 7], wat as die volopste borsmelkselle beskou is. Visuele identifikasie lei egter tot verkeerde identifikasie en oorskatting van die leukosietkonsentrasie, terwyl nuwe metodes soos veelkleurige vloeisitometrie uitstekende identifikasie en kwantifisering van alle borsmelkselle bied. Nuwe data het aan die lig gebring dat leukosiete slegs 'n klein minderheid (& lt2%) van die selle in die volwasse melk van 'n gesonde moeder uitmaak [8]. Leukosiete verskaf hoofsaaklik aktiewe immuniteit en bevorder die ontwikkeling van immunokompetentie by die baba, maar dit is ook waarskynlik dat hulle die melkklier teen infeksie beskerm.

Die oordrag van immuunfaktore van die moeder na die baba begin in die baarmoeder en gaan postnataal deur borsvoeding voort [9]. Bewyse van dierestudies dui daarop dat borsmelk leukosiete deurgang deur die baba se spysverteringskanaal oorleef en dan van die spysverteringskanaal na die bloed en verafgeleë plekke, insluitend die limfknope, milt en lewer verplaas [10, 11]. Daar is egter talle leemtes in die kennis van die ontwikkeling van die immuunstelsel en spysverteringskanaal by babas. Dit is bekend dat moederlike leukosiete uit borsmelk aktiewe immuniteit aan die baba verskaf deur patogene direk via fagositose te beveg, bioaktiewe komponente te produseer, te help met die ontwikkeling van die pasgebore immuunstelsel, of die mikro-omgewing van die baba-spysverteringskanaal te verander [12]. Daar is baie moontlikhede om deur die spysverteringskanaal van die baba te beweeg en van die spysverteringskanaal na die bloed te beweeg (slymvlies-geassosieerde limfoïede weefsels). Daar is getoon dat borsmelk -leukosiete geaktiveer, beweeglik en interaktief is, en dit kan via die sistemiese sirkulasie na verre weefsels oorgedra word [13]. Daar word gepostuleer dat miRNA's, wat volop in borsmelk voorkom, ook deelneem aan die oorlewing van leukosiete in die spysverteringskanaal van die baba, wat moontlik immuniteitsbeskermende en ontwikkelingsfunksies verleen [14].

Die stadium van laktasie hou verband met groot veranderinge in die samestelling van melkleukosiete [15]. Deur gebruik te maak van veelkleurige vloeisitometrie om leukosietsubgroepe in borsmelk verkry van gesonde vroue te identifiseer en te kwantifiseer, Trend et al. het gevind dat bies ongeveer 146 000 selle/ml bevat en dat die hoeveelheid in oorgangs- (8-12 dae na -geboorte) en volwasse melk (26-30 dae na -geboorte) na onderskeidelik 27.500 en 23.650 selle/ml afneem [15]. Hulle het ook getoon dat borsmelk 'n groter verskeidenheid en kompleksiteit van leukosiet -subgroepe bevat as wat voorheen gedink is. Van die geïdentifiseerde selle was die belangrikste leukosiete wat teenwoordig was, die myeloïede voorlopers (9-20%), neutrofiele (12-27%), onvolwasse granulosiete (8-17%) en nie-sitotoksiese T-selle (6-7%). Die vordering van laktasie hou verband met 'n afname in die belangrikste CD45 + leukosietkonsentrasie, eosinofiele, myeloïede en B -selvoorlopers en CD16 - monosiete. Die relatiewe frekwensies van neutrofiele en onvolwasse granulosiete het aansienlik toegeneem in volwasse melk in vergelyking met biesmelk.

Hassiotou et al. het 'n spesifieke toename in borsmelk leukosiete getoon wanneer die borsvoedende moeder 'n infeksie gehad het [8]. Interessant genoeg, Riskin et al. het ook 'n toename in moedermelk -leukosiete gerapporteer wanneer die baba 'n infeksie het, wat dui op 'n dinamiese interaksie tussen die siek babas en hul moeders [16]. Die dinamiese reaksie van moedermelk -leukosiete op infeksies dui aan dat dit 'n streng gereguleerde proses is wat daarop gemik is om bykomende immunologiese ondersteuning aan die baba te verleen [8, 16]. Verdere studies is nodig om lig te werp op die immunologiese meganismes onderliggend aan hierdie reaksies, sowel as die kliniese betekenis daarvan.

Benewens bloed-afgeleide leukosiete, toon voorlopige studies die teenwoordigheid van hematopoietiese stam-/stamvader selle in bies, wat afkomstig is van die moederlike bloedstroom [17]. Hulle eienskappe, rol en meganisme van oordrag van moederbloed na borsmelk verg verdere studie.

Nie-immuun selle en stam/stamvader menslike borsmelk selle

Terwyl die voedings- en beskermingsfunksie van borsmelk voorheen ondersoek is, is min bekend oor die eienskappe en rolle van die nie-immuunselle wat teenwoordig is. Studies wat in die 1950's uitgevoer is, het aan die lig gebring dat kolostrum epiteelselle bevat [18]. In die afgelope dekade is aangetoon dat borsmelk, benewens hierdie selpopulasies, stam- en stamvorselle bevat [19, 20]. Die teenwoordigheid van stam- en stamselle in die melkklier en borsmelk is vroeër gepostuleer op grond van die vermoë van die melkklier om veranderinge te programmeer en te transformeer na die ten volle sekretoriese toestand tydens swangerskap en in die postpartum periode.

Menslike borsmelk bevat dus heterogene selpopulasies, insluitend laktosiete (melksekretoriese selle), myoepiteelselle (uit die buise en alveoli van die melkklier) en 'n hiërargie van stamvader en stamselle. Die sellulêre samestelling van moedermelk is dinamies en die verhouding van verskillende seltipes kan deur baie faktore verander word, soos die stadium van laktasie, gesondheid en babavoeding. Geselekteerde verslae oor die somatiese selle wat uit die borsmelk van gesonde vroue geïsoleer is, word in tabel 1 opgesom.

Luminale en mioepiteelselle en hul voorlopers verteenwoordig byna 98% van die nie-immuun seltipes in menslike melk onder gesonde toestande. Hulle druk 'n paar membraanantigene uit: CK5, CK14 en CK18, wat kenmerkend is van differensiasie van melkeepiteelselle. Myoepiteelselle bou gladde spiervesels rondom die alveoli. Hul sametrekking lei daartoe dat melk uit die alveoli in die melkkanale uitstoot. Luminale selle druk epiteelseladhesiemolekule (EPCAM) uit, terwyl mioepiteelselle gladdespieraktien (SMA) en sitokeratien 14 (CK14) uitdruk. Laktosiete voer die alveoli van die menslike melkklier uit en is verantwoordelik vir die sintese en afskeiding van melk in die alveolêre lumen. Hierdie alveolêre selle druk sitokeratien 18 (CK18) uit en sintetiseer melkproteïene soos α-laktalbumien en ß-kaseïen [21]. Mammêre voorlopers van beide luminale en myoepitheliale seltipes druk α6 integrien (CD49f) en cytokeratin 5 (CK5) uit. Baie studies toon aan dat epiteelselle wat van vars borsmelk geïsoleer is, kleefselle is wat kolonies van verskillende morfologieë vorm wat deur verskeie in vitro -kultuurgange gehandhaaf kan word [22, 23]. 'N Soortgelyke selmorfologie word ook in ons laboratorium waargeneem (Fig. 2).

Morfologie van die borsmelk-afgeleide selle. a Heterogene selpopulasie insluitend leukosiete. b Mammosfeer geskep deur hBSC's op Matrigel (op dag 8 na isolasie). c Subpopulasie van laktosiete en myoepiteelselle op dag 2 na isolasie, kultuur in vitro op weefselkweekplate

Die teenwoordigheid van nestien, 'n neuroektodermmerker, word ook gerapporteer in 'n subpopulasie van borsmelk-afgeleide selle. Die frekwensie van nestien-positiewe selle is egter laag in die heterogene populasie van moedermelk [24].

Cregan et al. het getoon dat borsmelk selle bevat met stam/voorvader eienskappe [19]. Hosseini et al. het bevind dat stamselle van moedermelk die vermoë het om te differensieer in neurale selafstammings en dat hulle ooreenstem met beide embrioniese en mesenchymale stamselle. Die blootstelling van die selpopulasie van borsmelk aan neurogene medium in vitro het gelei tot differensiasie in al drie neurale lyne: neurone wat ß-tubulien as 'n neuronmerker uitdruk, oligodendrosiete wat die O4-merker uitdruk, en astrosiete wat die GFAP-merker uitdruk [23]. Beide die melkklier en die senuweestelsel het dieselfde embrioniese oorsprong, sodat borsmelkselle 'n goeie bron kan wees vir die differensiasie van neurale afstammelinge. Dit is moontlik dat die selle betrokke kan wees by die ontwikkeling van die enteriese senuweestelsel, wat een van die belangrikste dele van die senuweestelsel is, bestaande uit 'n maasagtige stelsel van neurone wat die funksie van die spysverteringstelsel beheer. Voorgebore babas wat nie bors gevoed word nie, toon 'n aansienlik groter risiko om siektes te ontwikkel, soos kinderdiarree en nekrotiserende enterocolitis.

'N Paar studies dui daarop dat menslike melk mesenchymale stamselle (MSC's) bevat. In 'n studie wat in 2013 uitgevoer is, is selle wat die tipiese MSC-merkers uitdruk, soos CD90, CD105 en CD73, uit borsmelk geïsoleer [22, 25]. Volgens Kakulas et al., bestaan ​​daar tans geen oortuigende bewyse wat die teenwoordigheid van MSC's in borsmelk ondersteun nie [26].

Die bestaan ​​van pluripotente stamselle binne menslike borsmelk (menslike borsmelk stamselle, hBSCs) is vir die eerste keer in 2012 deur Hassiotou et al. [20]. Die skrywers het hBSC se vermoë getoon om selfvernuwende stamselle te produseer, met 'n veelvoudige differensiasiepotensiaal vir al drie kiemlae: ektoderm, mesoderm en endoderm. Hulle het die uitdrukking getoon van tipiese embrioniese stamselfaktore: oktamer-bindende transkripsiefaktor 4 (OKT4), seksbepalende streek Y-boks (SOX2) en homeobox (NANOG). Hulle het ook die vorming van ESC-agtige kolonie morfologie en fenotipe getoon, maar hulle het nie teratomas in vivo in immuungebrekkige muise geproduseer nie [27].

Interessant genoeg is 'n beduidende opregulering van ESC-gene waargeneem tydens sferoïedvorming. Dit was gelyk aan of soms die uitdrukkingsvlakke van hESC's. 'n Tydverloopanalise van OCT4, SOX2 en NANOG mRNA uitdrukking vanaf dag 1 tot 12 van sferoïedvorming het 'n stabiele opregulering van hierdie gene getoon.

Daar is getoon dat hBSC's in vitro kan differensieer in vetselle, chondrosiete, osteoblaste, neuronale selle, hepatosietagtige selle en pankreas-beta-selle. Hulle is ook in staat om te differensieer in laktosiete en mioepiteelselle. Menslike bors stamselle kan verryk word in suspensie kulture as mammosfere. Daar is egter min bekend oor die gedrag van hierdie selle. Dit is moontlik dat hBSC's nie net verantwoordelik is vir die hermodellering van die bors wat nodig is om die ontwikkeling daarvan na 'n volwasse melksekretoriese orgaan te ondersteun nie, maar ook die verspreiding, ontwikkeling of epigenetiese regulering van weefsels by die baba. Studies in muise verskaf die bewyse van migrasie en integrasie van borsmelk stamselle na organe van die neonaat. Daar is getoon dat hierdie selle oorleef en die slymvlies van die spysverteringskanaal van verpleegmuisies in vivo oorsteek, na die bloedstroom oorgaan en verder na verskillende organe, waar hulle integreer en differensieer in funksionele selle [28]. Dit kan 'n voorbeeld van menslike mikrochimerisme wees. Geen selle van fetale oorsprong is in die isolate waargeneem nie [29].

Baie min is bekend oor die melkselle, hul oorsprong, eienskappe en die faktore wat dit beïnvloed. Daar is gevind dat ten minste sommige van hierdie selle afkomstig is van die borsepiteel van die lakterende bors, maar die faktore wat dit tydens swangerskap en laktasie aktiveer, is nog onbekend. Dit is moontlik dat hBSC's afkomstig is van die bloed van die moeder, soos die CD34+ hematopoietiese stamselle wat ook in menslike melk voorkom [17].

Sonder enige twyfel bevat borsmelk 'n hiërargie van selle van vroeë-stadium embrioniese-agtige stamselle tot ten volle gedifferensieerde melk epiteel selle. Toekomstige studies sal die potensiaal en voordele van nie-immuunselle en stam/voorvader menslike borsmelkselle in voeding van babas ondersoek, maar ook in terapie en regeneratiewe medisyne.

Probiotika: die vriendelike bakterieë in moedermelk

Mensemelk is ver van 'n steriele vloeistof. Die bestaan ​​van die menslike melkmikrobioom is slegs 'n dekade gelede ontdek. Daar word beraam dat 'n baba wat 800 ml borsmelk per dag voed, daagliks 10 7 -10 8 bakterieselle kan inneem [30]. Vooruitgang in die assessering van vroeë gasheer-mikrobe-interaksies dui daarop dat vroeë kolonisasie van die baba-derm deur melkbakterieë 'n impak kan hê op siektevoorkoming by kinders en later gesondheid.

Die bakterieë wat die meeste in menslike melk voorkom, is dié wat aan die spesie behoort Staphylococcus, Acinetobacter, Streptokokke, Pseudomonas, Laktokokke, Enterococcus en Lactobacillus [31]. Sommige, soos Staphylococcus, Corynebacterium of Propionibacterium, kan van die vel geïsoleer word en word ook gereeld in moedermelk aangetref. Hulle verhoed waarskynlik kolonisasie van die gasheer deur meer ernstige patogene, soos S. aureus [32]. Ander, insluitend L. gasseri, L. salivarius, L. rhamnosus, L. plantarum en L. fermentum, word deur die Europese Voedselveiligheidsowerheid (EFSA) as probiotiese spesies beskou.

In-diepte ontleding van die bakteriese gemeenskappe in melk met hoë-deurset-volgordebepalingstegnieke het 'n veel groter diversiteit van bakterieë in melk geïdentifiseer as wat voorheen gerapporteer is in kultuur-onafhanklike studies wat staatgemaak het op 'n nouer reeks (kwantitatiewe PCR) of presiese (PCR-DGGE) metodes.

Ongetwyfeld is bakterieë geen besmetting wat tydens monsterekstraksie voorkom nie, soos in die verlede [33,34,35] aangeneem is. Die variasies kan egter toegeskryf word aan genetiese, kulturele, omgewings- of dieetverskille tussen bestudeerde bevolkings en menslike melkmikrobioomveranderinge tydens laktasie [30, 36]. Interessant genoeg is gevind dat moedermelk soortgelyke mikrobiese profiele het, onafhanklik van die dragtigheidsouderdom of manier van aflewering [37]. Probiotiese bakterieë in moedermelk is 'n baie onlangse navorsingsveld.

Geselekteerde verslae van die bakteriese spesies wat uit die borsmelk van gesonde vroue geïsoleer is, word opgesom Tabel 2. 'n Paar studies dui daarop dat geselekteerde bakterieë van die moeder se gastro-intestinale mikrobiota toegang tot die melkklier kan kry deur 'n entero-mammarit. Die meganisme behels dendritiese selle en CD18+-selle, wat nie-patogene bakterieë uit die dermlumen kan opneem en dit na die lakterende melkklier kan dra [38, 39]. Boix-Amoros et al. bevestig die teenwoordigheid van lewende bakterieë wat binne -in die ekstrasellulêre matriks van immuunselle beweeg [30]. In 'n ander studie is bakteriële translokasie van derm na mesenteriese limfknope en melkkliere by dragtige en lakterende muise waargeneem [40]. Daar word voorgestel dat bakteriële translokasie na ekstra -intestinale weefsels 'n voordelige fisiologiese gebeurtenis by 'n gesonde gasheer is, en dit kan geassosieer word met die rypwording van die neonatale immuunstelsel.


Promosies

BD FACSMelody ™ 4-rigting sorteerpakkette

Beperkte tyd pakkette op die BD FACSMelody ™ 4-rigting selsorter om aan u laboratorium se behoeftes te voldoen. Bespaar op waardegedrewe instrumentkonfigurasies, bykomstighede of diens.


Maak gebruik van een-tot-een konsultasies vir eksperimentontwerp, ondersteuning en spesiale paneelpryse.

Hoë-dimensionele biologie pakkette

Optimaliseer u vloei-sitometrie-werkstroom om dieper insigte te verkry met hoë-dimensionele biologie. Maak vir 'n beperkte tyd gebruik van pakkette wat vloeisitometers, reagense en informatika bevat, gekombineer met enkelsellige multiomiese instrumente.

Innoverende oplossings om jou diagnostiek en navorsing aan te dryf

Gerugsteun deur die nuutste tegnologie en meer as 45 jaar se kundigheid in vloeisitometrie

BD FACSMelody ™
4-rigting Selsorteerder

Ontdek 'n toeganklike, bekostigbare en outomatiese oplossing vir 4-rigtingselle

BD FACSymphony ™ S6
Selsorteerder

'n Selsorteerder wat ontwerp is om jou wetenskaplike ontdekkings aan te dryf met 6-rigting sortering en tot 60 parameters

BD Horizon™ Red 718-reagense

Innoverende fluorochroom wat ontwerp is om groter oplossingskrag as Alexa Fluor™ 700 te bied

"BD Horizon ™ Red 718-reagense bied 'n helderder alternatief vir Alexa Fluor ™ 700 en verhoog die resolusie van hoë-dimensionele panele as die tradisionele merkers te swak is."

"BD Horizon ™ Red 718-reagense bied 'n helderder alternatief vir Alexa Fluor ™ 700 en verhoog die resolusie van hoë-dimensionele panele as die tradisionele merkers te swak is."

“BD is positioned with BD ® CS&T and BD ® FC Bead technology to enable instrument standardization simply from day to day, instrument to instrument, and lab to lab. Reference control–based instrument standardization is the next step for flow cytometry.”

“BD is positioned with BD ® CS&T and BD ® FC Bead technology to enable instrument standardization simply from day to day, instrument to instrument, and lab to lab. Reference control–based instrument standardization is the next step for flow cytometry.”

“At last, a fully integrated end-to-end walkaway solution, which is going to make our lives significantly easier. It reduces errors in both the pre-analytical and analytical phases, leading to increased productivity and efficiency, but most importantly provides a comprehensive fully audit-able account of the whole process. Finally, a solution that creates capacity to allow us to meet our key performance indicators.”

“At last, a fully integrated end-to-end walkaway solution, which is going to make our lives significantly easier. It reduces errors in both the pre-analytical and analytical phases, leading to increased productivity and efficiency, but most importantly provides a comprehensive fully audit-able account of the whole process. Finally, a solution that creates capacity to allow us to meet our key performance indicators.”


Inhoud

In a viscous fluid, the koers of sedimentation of a given suspended particle (as long as the particle is more dense than the fluid) is largely a function of the following factors:

  • Gravitational force
  • Difference in density
  • Fluid viscosity
  • Particle size and shape

Larger particles sediment more quickly and at lower centrifugal forces. If a particle is less dense than the fluid (e.g., fats in water), the particle will not sediment, but rather will float, regardless of strength of the g-force experienced by the particle. Centrifugal force separates components not only on the basis of density, but also of particle size and shape. In contrast, a more specialized equilibrium density-gradient centrifugation produces a separation profile dependent on particle-density alone, and therefore is suitable for more fine-grained separations.

High g-force makes sedimentation of small particles much faster than Brownian diffusion, even for very small (nanoscale) particles. When a centrifuge is used, Stokes' law must be modified to account for the variation in g-force with distance from the center of rotation. [6]

  • D is the minimum diameter of the particles expected to sediment (m)
  • η (or μ) is the fluid dynamic viscosity (Pa.s)
  • Rf is the final radius of rotation (m)
  • Rek is the initial radius of rotation (m)
  • ρbl is particle volumetric mass density (kg/m 3 )
  • ρf is the fluid volumetric mass density (kg/m 3 )
  • ω is the angular velocity (radian/s)
  • t is the time required to sediment from Rek to Rf (s)

Differential centrifugation can be used with intact particles (e.g. biological cells, microparticles, nanoparticles), or used to separate the component parts of a given particle. [7] Using the example of a separation of eukaryotic organelles from intact cells, the cell must first be lysed and homogenized (ideally by a gentle technique, such as Dounce homogenization harsher techniques or over homogenization will lead to a lower proportion of intact organelles). Once the crude organelle extract is obtained, it may be subjected to a varying centrifugation speeds to separate the organelles:

Typical differential centrifugation parameters for a biological sample [2] (path length of centrifugation ≈1–5 cm)
Sample input G force Tyd Instrument needed Pellet contents Supernatant contents
Unlysed (eukaryotic) cells 100 x g 5 min Benchtop fixed-angle centrifuge, or swinging bucket centrifuge Intact (eukaryotic) cells, macroscopic debris Varies depending on sample
Gently lysed cells (e.g. dounce homogenizer) 600 x g 10 min Benchtop fixed-angle centrifuge, or swinging bucket centrifuge Nuclei Cytosol, non-nuclei organelles
Supernatant of previous row 15,000 x g 20 min Benchtop fixed-angle centrifuge Mitochondria, chloroplasts, lysosomes, peroxisomes Cytosol, microsomes (known as post mitochondrial supernatant)
Supernatant of previous row 50,000 x g - 100,000 x g 60 min High speed fixed-angle centrifuge, or vacuum ultracentrifuge Plasma membrane, microsomal fraction, large polyribosomes Cytosol, ribosomal subunits, small polyribosomes, enzyme complexes
Supernatant of previous row 50,000 x g - 100,000 x g 120 min Vacuum ultracentrifuge Ribosomal subunits, small poly ribosomes, some soluble enzyme complexes Cytosol

The lysed sample is now ready for centrifugation in an ultracentrifuge. An ultracentrifuge consists of a refrigerated, low-pressure chamber containing a rotor which is driven by an electrical motor capable of high speed rotation. Samples are placed in tubes within or attached to the rotor. Rotational speed may reach up to 100,000 rpm for floor model, 150,000 rpm for bench-top model (Beckman Optima Max-XP or Sorvall MTX150), creating centrifugal speed forces of 800,000g to 1,000,000g. This force causes sedimentation of macromolecules, and can even cause non-uniform distributions of small molecules. [8]

Since different fragments of a cell have different sizes and densities, each fragment will settle into a pellet with different minimum centrifugal forces. Thus, separation of the sample into different layers can be done by first centrifuging the original lysate under weak forces, removing the pellet, then exposing the subsequent supernatants to sequentially greater centrifugal fields. Each time a portion of different density is sedimented to the bottom of the container and extracted, and repeated application produces a rank of layers which includes different parts of the original sample. Additional steps can be taken to further refine each of the obtained pellets.

Sedimentation depends on mass, shape, and partial specific volume of a macromolecule, as well as solvent density, rotor size and rate of rotation. The sedimentation velocity can be monitored during the experiment to calculate molecular weight. Values of sedimentation coefficient (S) can be calculated. Large values of S (faster sedimentation rate) correspond to larger molecular weight. Dense particle sediments more rapidly. Elongated proteins have larger frictional coefficients, and sediment more slowly to ensure accuracy. [9]


Affiniteitschromatografie

Affinity chromatography is a very powerful and selective technique that exploits the binding affinities of sample molecules (typically proteins) for molecules covalently linked to the support beads. In contrast to ion-exchange chromatography, where all molecules of a given charge would bind to the column, affinity chromatography exploits the specific binding of a protein or proteins to a ligand that is immobilized on the beads in the column.

For example, if one wanted to separate all of the proteins in a cell lysate that bind to ATP from proteins that do not bind ATP, one could use a column that has ATP attached to the support beads and pass the sample through the column. All proteins that bind ATP will &ldquostick&rdquo to the column, whereas those that do not bind ATP will pass quickly through it. The bound proteins may then be released from the column by adding a solution of ATP that will displace the bound proteins by competing, for the proteins, with the ATP attached to the column matrix.

Histidine tagging

Histidine tagging (His-tagging) is a special kind of affinity chromatography and is a powerful tool for isolating a recombinant protein from a cell lysate. His-tagging relies on altering the DNA coding region for a protein to add a series of at least six histidine residues to the amino or carboxyl terminal of the encoded protein. This &ldquoHis-Tag&rdquo is useful in purifying the tagged protein because histidine side chains can bind to nickel or cobalt ions. Separation of His-tagged proteins from a cell lysate is relatively easy (Figure (PageIndex<8>)).Passing the crude cell lysate through a column with nickel or cobalt attached to beads allows the His-tagged proteins to &ldquostick,&rdquo while the remaining cell proteins all pass quickly through. The His-tagged proteins are then eluted by addition of imidazole to the column. Imidazole, which resembles the side chain of histidine, competes with the His-tagged proteins and displaces them from the column. Although non-tagged proteins in the lysate may also contain histidine as part of their sequence, they will not bind to the column as strongly as the His-tagged protein and will, thus, be displaced at lower imidazole concentrations than needed to elute the His-tagged protein. Surprisingly, many His-tagged proteins appear to function normally despite the added histidines, but if needed, the histidine tags may be cleaved from the purified protein by treatment with a protease that excises the added histidines, allowing the recovery of the desired protein with its native sequence.


Figure (PageIndex<8>): Affinity chromatographic purification of a protein by histidine tagging.Image by Aleia Kim

High performance liquid chromatography (HPLC) is a powerful tool for separating a variety of molecules based on their differential polarities (Figure (PageIndex<9>)). A more efficient form of column chromatography, it employs columns with tightly packed supports and very tiny beads such that flow of solvents/buffers through the columns requires high pressures. The supports used may be polar (normal phase separation) or non-polar (reverse phase separation). In normal phase separations, non-polar molecules elute first followed by the more polar compounds. This order is switched in reverse phase chromatography. Of the two, reverse phase is much more commonly employed due to more reproducible chromatographic profiles (separations) that it typically produces.


Figure (PageIndex<9>): HPLC: Pumps on left/Column in center/Detector on the right. Wikipedia