Inligting

Hoeveel RNA-bindende proteïene kan gelyktydig aan 'n enkele mRNA bind?

Hoeveel RNA-bindende proteïene kan gelyktydig aan 'n enkele mRNA bind?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hoeveel RNA-bindende proteïene kan tipies gelyktydig aan 'n enkele mRNA bind? Of anders gesê, hoeveel "bindingsplekke" het 'n mRNA? Watter orde van grootte?

Ek is geïnteresseerd in RNA korrels soos stres korrels of P-liggame. Dit bevat onder meer mRNA- en RNA-bindende proteïene. Ek is nie 'n bioloog nie en ek het tot dusver nie op hierdie inligting afgekom in die verwante literatuur nie.


Sien hierdie vraestel. Hulle het RBP-beskermde plekke in die hele menslike transkriptoom bestudeer deur RNA-proteïenverknoping gevolg deur RNAse-vertering en volgorde: PIPseq.

Figuur 1 van die vraestel toon verspreiding van proteïenbeskermde plekke in RNA's. Hulle korreleer dit ook met verskillende streke van mRNA en die uitdrukking daarvan.

Hulle toon die aantal proteïenbeskermde webwerwe (PPS) per transkripsie aan, maar dit is na my mening nie 'n behoorlike maatstaf nie. Die getal moet genormaliseer word met die lengte van die afskrif, sodat u 'n digtheid van beskermde webwerwe kry. Uit figuur 4 (sien hieronder) kan u ongeveer skat dat die gemiddelde PPS -digtheid naby 0,6 is, wat beteken dat 60% van enige RNA na verwagting proteïengebonde is.

Figuur 4

Ander punte wat opgemerk moet word:

  • Hoogs vertaalde mRNA's sal veelvuldige ribosome op hul CDS hê en sal waarskynlik meer beskerm word.
  • Gesekwestreerde RNA's in streskorrels sal ook 'n hoë PPS -digtheid hê
  • Die voetspoor van verskillende RBP's sal anders wees. Die aantal proteïene wat aan 'n mRNA kan bind, sal dus verskil tussen verskillende RBP's.

Verdere leeswerk:


Ontleding van die teikenspesifisiteit van die RNA-bindende proteïen HOE onthul dpp mRNA as 'n nuwe HOE-teiken

David Israeli, Ronit Nir, Talila Volk Disseksie van die teikenspesifisiteit van die RNA-bindende proteïen HOE onthul dpp mRNA as 'n nuwe HOE teiken. Ontwikkeling 1 Junie 2007 134 (11): 2107–2114. doi: https://doi.org/10.1242/dev.001594

Regulering van RNA -metabolisme speel 'n belangrike rol in die beheer van geenuitdrukking tydens ontwikkelingsprosesse. Die Drosophila RNA-bindende proteïen Held out wing (HOW), reguleer 'n verskeidenheid ontwikkelingsprosesse in embrioniese en volwasse groei. Ons het die primêre volgorde en sekondêre strukturele vereistes vir die HOE-reaksie-element (HRE) gekarakteriseer en wys dat hierdie terrein nodig en voldoende is vir HOE-binding. Op grond van hierdie analise het ons die Drosophila TGFβ homoloog, dpp, as 'n nuwe direkte teiken vir HOE negatiewe regulering in die vlerkbeeldskyf. Die binding van die repressor isoform HOE (L) aan die dpp3 ′ onvertaalde gebied (UTR) lei tot 'n vermindering van GFP-dpp3'UTR-verslaggewervlakke in S-2-selle, op 'n HRE-plekafhanklike manier. Boonop is die mede-uitdrukking van HOE (L) in die vleuelbeeldskyf met 'n dpp-GFP samesmeltingskonstruksie het gelei tot 'n verlaging in DPP-GFP-vlakke in 'n dpp-3'UTR-afhanklike wyse. Omgekeerd het 'n vermindering van die endogene vlakke van HOE deur geteikende uitdrukking van HOE-spesifieke dubbelstring-RNA gelei tot 'n ooreenstemmende verhoging in dpp mRNA -vlak in die vleuelbeeldskyf. Deur die RNA -rye wat HOW bind, te kenmerk, demonstreer ons dus 'n nuwe aspek van regulering op mRNA -vlak van Drosophila DPP.


MATERIAAL EN METODES

Statistiek en data -aanbieding

Vir eksperimente met gekweekte selle, is monsters wat uit individuele putte of plate gegenereer is, as biologiese herhalings beskou. Vir sebravis-eksperimente is elke larwevis as 'n biologiese replikaat beskou. In die figuurlegende vir elke eksperiment word die aantal onafhanklike biologiese herhalings en hoe die data in die figuur aangebied word (tipies gemiddeld ± sem ) duidelik aangedui. Betekeniswaardes bereken met ongepaarde studente t toets word duidelik in datasyfers aangedui. Data is geplot/pas en statistieke is gegenereer met behulp van Prism 7 of 8 (GraphPad, La Jolla, CA, VSA).

Reagense

Al die HNE wat in hierdie studie gebruik is, was HNE (alkyne) (vir duidelikheid in die manuskrip/syfers HNE genoem) en is gesintetiseer soos voorheen gerapporteer (37). Tensy anders aangedui, is alle ander chemiese reagense gekoop by MilliporeSigma (Burlington, MA, VSA) teen die hoogste beskikbaarheidsuiwerheid. Tris (2-karboksietiel) fosfien (TCEP) was van Chem-Impex International (Wood Dale, IL, VSA). Puromycin kom van Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, VSA). Actinomycin D was van MilliporeSigma. AlamarBlue was van Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, VSA) en is volgens die vervaardiger se instruksies gebruik. Minimal Essential Medium (MEM), Opti-MEM, Dulbecco's PBS, 100X pyruvat (100 mM), 100X nie-essensiële aminosure (11140-050) en 100X penisillienstreptomisien (15140-122) was van Thermo Fisher Scientific. Protease-inhibeerder-skemerkelkie Volledig EDTA-vry was van Roche (Basel, Switserland). 3XFlag peptied was afkomstig van ApexBio Technology (Houston, TX, VSA). Anti-Flag (M2) hars (A2220) was van MilliporeSigma. Talon (635503) hars was van Clontech Laboratories (Mountain View, CA, VSA). Ni-NTA agarose (30210) was van Qiagen (Hilden, Duitsland). 2020 en LT1 -transfeksie -reagense was afkomstig van Mirus Bio (Madison, WI, VSA). DharmaFECT I en Duo was van Dharmacon (Lafeyette, CO, VSA). Polyethylenimine was afkomstig van Polysciences (Warrington, PA, VSA). Venor GeM PCR-gebaseerde mikoplasma-opsporingstel is van MilliporeSigma. ECL-substraat en ECL-Plus-substraat was van Thermo Fisher Scientific en is gebruik soos aangedui. Akrylamied, ammoniumpersulfaat, tetrametieletielendiamien, Precision Plus proteïenstandaard kom van Bio-Rad (Hercules, CA, VSA). Alle lysate is gekwantifiseer deur gebruik te maak van die Bio-Rad Proteïen Assay (Bio-Rad) relatief tot bees serum albumien (BSA) as 'n standaard (Bio-Rad). PCR is uitgevoer met behulp van Phusion Hot start II (Thermo Fisher Scientific) volgens die vervaardiger se protokol. Alle plasmied -insetsels is gevalideer deur volgordebepaling by Cornell Biotechnology se volgordekernfasiliteit (Ithaca, NY, VSA). Alle steriele selkultuur -plastiekware was van CellTreat Scientific Products (Pepperell, MA, VSA).

Vorming van plasmiede

Die volgorde van alle primers wat gebruik word vir kloning en op die plek gerigte mutagenese, word in die aanvullende tabel S9 gelys. Alle plasmiede wat gegenereer is, is ten volle bekragtig deur Sanger-volgordebepaling by die Cornell Genomics-kernfasiliteit.

pCS2+8 Vlag3HuR is gegenereer deur PCR-amplifikasie van menslike HuR (plasmied verskaf van die Hla-laboratorium), uitbreiding van die resulterende produk en kloning in gelineariseerde pCS2+8-vektor (plasmied 34931 Addgene, Watertown, MA, VSA). Vir rekombinante uitdrukking is dieselfde prosedure gebruik om HuR in 'n pET28a -vektor te kloon.

pLJM60 AUF1 p42 is verkry vanaf Addgene (plasmied 38242) en gekloneer met 'n vlag2 merk in pCS2+8 soos hierbo beskryf. Deur die resulterende plasmied te gebruik, is AUF1 p37 en AUF1 p45 gegenereer deur onderskeidelik AUF1-ekson 7 en byvoeging van AUF1-ekson 2 te verwyder. AUF1 p40 is gegenereer deur toevoeging van AUF1-ekson 2 tot AUF1 p37. Vir rekombinante uitdrukking is hierdie konstrukte in 'n pET28a vektor gekloneer.

Die pSGG-luciferase-verslaggewerplasmied (38) wat die Nrf2 3'-UTR bevat, is verkry van prof. Qun Zhou (University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, VSA). Hierdie plasmied is gemodifiseer vir intron-verslaggewertoetse deur fragmente van die Nrf2-transkripsie te kloneer met of sonder introne (geamplifiseer vanaf onderskeidelik genomiese DNA of cDNA wat van HEK293T-selle voorberei is) stroomop van die lusiferase-koderende volgorde.

Kort haarnaald (sh) -RNA-weerstandbiedende uitdrukkingsplasmiede (vir reddingseksperimente) is geproduseer deur PCR-amplifikasie van die beginplasmied met voorwaartse en omgekeerde mutagenese primers wat die gewenste mutasies (Aanvullende Tabel S9) bevat, gevolg deur DpnI (NEB) behandeling. Hierdie plasmiede kodeer vir dieselfde proteïen, maar bevat wanpassings (in rooi gemerk in die primer-rye Aanvullende tabel S9) in die shRNA-doelwitvolgorde, wat uitdrukking van die ektopiese proteïen in afslaanselle moontlik maak.

Selkultuur

HEK293T [verkry uit American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA] en muis -embryonale endoteelselle (MEEC's gegenereer in die Hla -laboratorium) is gekweek in MEM (51090036 Thermo Fisher Scientific) aangevul met 10% v/v fetale bees serum (FBS MilliporeSigma), penisillien/streptomisien (Thermo Fisher Scientific), natriumpyruvat (Thermo Fisher Scientific) en nie-essensiële aminosure (Thermo Fisher Scientific) by 37 ° C in 'n bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Die medium is elke 2-3 dae verander.

Generasie van shRNA-gebaseerde knockdown-sellyne

HEK293T-verpakkingselle (5,5 X 105 selle) is in plate met 6 putte in 'n antibiotika-vrye medium gesaai en vir 24 uur geïnkubeer. Die selle is getransfekteer met 'n mengsel van 500 ng verpakkingsplasmied (pCMV-R8.74psPAX2), 50 ng koevertplasmied (pCMV-VSV-G) en 500 ng pLKO-vektor wat die haarnaaldreeks bevat (MilliporeSigma Aanvullende Tabel S2) met behulp van TransIT-LT1 (Mirus Bio) volgens die vervaardiger se protokol. shControl -plasmied is verkry van prof. Andrew Grimson (Cornell -universiteit). Agtien uur na transfeksie is die medium vervang met medium wat 20% FBS bevat en vir nog 24 uur geïncubeer. Middelhoudende virusdeeltjies is geoes, gesentrifugeer (800 g, 10 minute), gefiltreer deur 'n 0,45 mikrometer filter en gebruik vir infeksie of gevries by -80 ° C vir latere gebruik.

HEK293T of MEEC selle (5.5 X 10 6 selle) in 6-put plate is behandel met 1 ml virusbevattende medium in 'n totale volume van 6 ml medium wat 8 μg/ml polibreen (MilliporeSigma) bevat. Na 24 uur is die medium verander en die selle is vir 24 uur geïnkubeer. Na hierdie tydperk is die medium verander na medium wat 2 μg/ml puromisien bevat (Santa Cruz Biotechnology). Na seleksie is selle deur Western blotting getoets.

RNA volgorde

Na behandeling van shHuR/shControl selle met HNE (50 μM) of H2O2 (225 μM) vir 18 uur, is selle gelys deur die toevoeging van Trizol (Thermo Fisher Scientific), en RNA is geïsoleer volgens die vervaardiger se protokol. Die kwaliteit van die RNA is geassesseer deur Nanodrop spektrofotometrie (A260/A280 verhouding

2) en fragmentanalise met behulp van 'n Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VSA). RNA -kwaliteitgetalle vir alle monsters was 10,0. Die res van die prosedure, insluitend data -analise, is uitgevoer deur die RNA -volgordekerndiens aan die Cornell Universiteit. Kortliks, rRNA is afgetrek deur hibridisasie van totale RNA monsters (100 ng totale RNA insette) met behulp van die RiboZero Magnetic Gold H/M/R Kit (Illumina, San Diego, CA, VSA). Na opruiming deur neerslag, is rRNA-afgetrokke monsters gekwantifiseer met 'n Qubit 2.0 (RNA HS kit Thermo Fisher Scientific). TruSeq-strepieskodeerde RNA-seq-biblioteke is gegenereer uit die helfte van die rRNA-afgetrokke monsters met die NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, VSA). Elke biblioteek is gekwantifiseer met 'n Qubit 2.0 (dsDNA HS kit Thermo Fisher Scientific), en die grootteverdeling is bepaal met 'n Fragment Analyzer (Agilent Technologies) voordat dit saamgevoeg is. Biblioteke is in volgorde op 'n NextSeq500 -instrument (Illumina) opgestel. Ten minste 60 M enkel-einde 75 bp leeswerk is per biblioteek gegenereer. Lesings is afgesny vir lae kwaliteit en adapterreekse met cutadapt v.1.8 [parameters: -m50 -q20 -a 5'-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACT-CCAGTC-3' -pas-lees-wildcards (39)]. Afgesnyde lesings is met bowtie2 v.2.2 in rRNA -rye gekarteer om dit te verwyder [parameters: standaard karteringopsies, -al en -un om te pas en nie -ooreenstemmende lees (40)]. Lesings is gekarteer na die verwysingsgenoom/transkriptoom (GRCh37/hg19) deur gebruik te maak van tophat v.2.1 [parameters: -biblioteek-tipe = fr-eerstestrand -geen-roman-verbindings -G < ref_genes.gtf > (41)]. Manchetknope v.2.2 (cuffnorm/cuffdiff) is gebruik om fragmente per kilobase transkripsie per miljoen gekaarte leeswaardes (FPKM) en statistiese analise van differensiële geenuitdrukking (42) te genereer. RNA-volgorde-data is by die Gene Expression Omnibus (GEO-toetredingsnommer GSE127444) ingedien.

Groei-inhibisie-toetse

HEK293T-selle (4000 selle/putjie) is in 96-putjies geplant. Na 24 uur is selle behandel met die aangeduide molekules by die aangeduide konsentrasies en vir 48 uur geïnkubeer. AlamarBlue (Thermo Fisher Scientific) is by elke put gevoeg, en die selle is vir 'n verdere 3 uur geïnkubeer, waarna fluoressensie (opwekking 560 nm emissie 590 nm) gemeet is met 'n BioTek Cytation 3 mikroplaatleser (BioTek, Winooski, VT, VSA). Om te toets of gereduseerde alamarBlue deur H geoksideer word2O2 oor die tydskale wat gebruik is, is HEK293T-selle in 'n 96-put plaat geïnkubeer met die vervaardiger se aanbevole konsentrasie van alamarBlue vir 3 uur om die kleurstof te verminder. Die groeimedium wat verminderde alamarBlue bevat, is versamel, saamgevoeg, gesentrifugeer om selle te verwyder en dan geïnkubeer met die konsentrasies van H2O2 gebruik in die lewensvatbaarheidseksperiment (aanvullende figuur S2B), en fluoressensie is mettertyd gemeet soos voorheen beskryf. Ons het waargeneem

3% verlies aan fluoressensie na 4 uur in verminderde alamarBlue behandel met 1250 μM H2O2 die fluoressensie van monsters by alle ander konsentrasies was nie beduidend anders as ekwivalente medium wat verminderde alamarblou bevat nie, maar nie met H behandel nie2O2. Hierdie kontrole-eksperiment het dus bevestig dat ons eksperimentele toestande wat oksidante insluit, versoenbaar is met redoks-sensitiewe alamarBlue-reagense wat gebruik word in ons groei-inhibisie-toetse.

Knockdown van HuR en Nrf2 met klein inmengende RNA

Klein interfererende (si)-RNA's wat die oop leesraamwerk van menslike HuR of Nrf2 teiken, is verkry vanaf Dharmacon (Aanvullende Tabel S6), en nie-teiken kontrole siRNA's (Kontrol siRNA-A of -E) is verkry vanaf Santa Cruz Biotechnology. HEK293T (3.6 X 10 5 selle) in 6-put plate is getransfekteer met siRNA met Dharmafect I (Dharmacon) vir 48 uur volgens die vervaardiger se protokol, en dan getoets. Vir cotransfeksie van siRNA en plasmied (e) vir verslaggewertoetse, is selle vir 48 uur getransfekteer met Dharmafect Duo (Dharmacon) volgens die protokol van die vervaardiger, en daarna getoets.

Western blotting

Selle is hersuspendeer in RIPA buffer (Santa Cruz Biotegnologie) aangevul met protease en fosfatase inhibeerders en gelys deur 3 siklusse van vinnige vries-ontdooiing. Lysate is skoongemaak deur sentrifugering (20 000 g, 10 min, 4 ° C) en die totale proteïenkonsentrasie is bepaal deur die Bradford -toets. Tipies is 20-40 μg totale proteïen per baan gelaai, geskei deur SDS-PAGE, oorgedra na PVDF, geblokkeer en geïnkubeer met die toepaslike teenliggaampies (Aanvullende Tabel S10). Opsporing is uitgevoer op 'n ChemiDoc-MP beeldstelsel (Bio-Rad) met behulp van ECL Western blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific) of SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substraat (Thermo Fisher Scientific). Western klad data is gekwantifiseer met behulp van die Gel Analysis instrument in ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, VSA). Belangrike groepe is geïntegreer en genormaliseer tot die laaikontrole.

Luciferase -verslaggewer toets

Luciferase verslaggewer toetse is uitgevoer soos voorheen beskryf (43). In kort is selle onderling oorgedra met vuurvlieg luciferase plasmied [pGL4.37 E364A vir antioksidant reaksie element: luciferase toetse (Promega, Madison, WI, VSA) pSGG wat die menslike Nrf2 3'-UTR sekwensie bevat (van prof. Qun Zhou, Universiteit van Maryland Skool vir Geneeskunde)] en Renilla luciferase plasmied [pGL4.75, E693A (Promega)] in 'n 40: 1 verhouding vir 48 uur met behulp van TransIT 2020 (Mirus Bio) of Dharmafect Duo (Dharmacon). Vir eksperimente wat ektopiese proteïenuitdrukking insluit, is die 40:1 verslaggewer plasmiedmengsel saamgetransfekteer met ektopiese proteïenuitdrukkingsplasmied in 'n 1:1 verhouding. Selle is vir 15 minute gelys in passiewe lysisbuffer (Promega) met sagte skud, en gehomogeniseerde lisaat is na die putte van 'n ondeursigtige wit 96-putplaat (Corning, Corning, NY, VSA) oorgedra. Vuurvliegie en Renilla luciferase aktiwiteit is gemeet op 'n BioTek Cytation3 mikroplaatleser. Vir toetse wat HNE-behandeling behels, is medium vervang met medium wat die aangeduide konsentrasie HNE bevat op 30 uur na transfeksie, en selle is vir 'n verdere 18 uur geïnkubeer.

Intydse kwantitatiewe PCR

Intydse kwantitatiewe PCR (qPCR) is uitgevoer soos voorheen beskryf (44). Totale RNA is geïsoleer uit selle met behulp van Trizol -reagens (Thermo Fisher Scientific) volgens die vervaardiger se protokol. Een mikrogram totale RNA (suiwerheid/integriteit beoordeel deur agarosegelelektroforese en konsentrasie bepaal deur A.260 nm met behulp van 'n BioTek Cytation3-mikroplaatleser met 'n Take3-bykomstigheid) is met amplifikasiegraad DNase I (Thermo Fisherr Scientific) behandel en omgekeerd getranskribeer met Oligo(dT)20 as 'n onderlaag en Superscript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisherr Scientific) volgens die vervaardiger se protokol. PCR is uitgevoer vir 2 tegniese herhalings per monster met behulp van iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) en primers wat spesifiek is vir die geen van belang (Aanvullende Tabel S11) volgens die vervaardiger se protokol. Amplicons is gekies met 'n lengte van 150-200 bp en geen voorspelde binding buite die teiken is voorspel deur die Basic Local Alignment Search Tool (BLAST National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA). Vir gene met veelvuldige splitsingsvariante is primers wat gekonserveerde volgordes oor alle splitsvariante geamplifiseer het, gekies. Primers is gevalideer met behulp van standaardkrommes wat gegenereer is deur versterking van seriële verdunde cDNA -primers met 'n standaardkromme -helling tussen -0,8 en 1,2 en R2 ≥ 0,97 is as doeltreffend beskou. Enkele PCR -produkte is bevestig deur smeltanalise volgens die PCR -protokol. Data is ingesamel met behulp van 'n LightCycler 480 (Roche). Drempelsiklusse is met behulp van die LightCycler 480-sagteware bepaal. Monsters met 'n drempelsiklus >35 of sonder 'n enkele, korrekte smeltpunt is nie by data-analise ingesluit nie. Normalisering is uitgevoer met behulp van 'n enkele huishoudelike geen soos aangedui in elke datastel en die ΔΔCt metode.

Ontleding van verslaggewer mRNA vlakke

HEK293T selle (1.6 X 10 5 ) in 12-put plate is getransfekteer met luciferase verslaggewers soos voorheen beskryf vir 48 uur.Selle is daarna vir 15 minute met skud in 250 ul passiewe lysisbuffer gelys, en 50 ul lisaat is geneem om luciferase -aktiwiteit te meet, soos hierbo beskryf. Trizol LS is by die oorblywende lysaat gevoeg en RNA is geïsoleer soos hierbo beskryf. Voor RT is totale RNA (1 mg) behandel met amplifikasie-graad DNase I (Thermo Fisher Scientific) om enige oorblywende plasmied te verwyder. RT en intydse qPCR is dan uitgevoer soos hierbo.

RNA immunopresipitasie-PKR

RNA immunopresipitasie (RIP) -PCR is uitgevoer volgens voorheen beskryfde metodes (45). HEK293T-selle (4,5 X 106) in plate met 'n diameter van 10 cm is getransfekteer met die aangeduide konstrukte (gemeng 1: 3 met leë plasmied) of leë plasmied alleen (8 ug totale DNA per plaat) met poliëtileenimien (21 g/plaat) . Medium is 24 uur na transfeksie verander, en die selle is 48 uur lank geïnkubeer. Selle is een keer met PBS (Thermo Fisher Scientific) gewas, geoes deur trypsinisering en deeglik gewas met PBS.

Selkorrels is hersuspendeer in polisoom lisis buffer [10 mM 4-(2-hidroksietiel)-1-piperazineetaansulfonsuur (Chem-Impex International) pH 7.0, 100 mM KCl (Thermo Fisher Scientific), 5 mM MgCl2 (Thermo Fisher Scientific), 0.5% Nonidet-P40, Volledige EDTA-vrye Protease Inhibitor Cocktail (Roche), 0.2% vanadiel ribonucelosied kompleks (New England Biolabs)] en gevries by -80°C vir ten minste 30 min. Die lysaat is ontdooi, twee keer gesentrifugeer (20,000 g10 minute elk), en die proteïenkonsentrasie is bepaal met behulp van Bradford Assay. Drie milligram totale proteïen is verdun tot 0,5 mg/ml in NT2 buffer [50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl (Thermo Fisher Scientific), 1 mM MgCl2 (Thermo Fisher Scientific), 0,05% Nonidet-P40, 0,2% vanadyl ribonuceloside complex] en geïnkubeer met 50 μl Flag M2 agarose (MilliporeSigma) vir 3 uur by 4 ° C met end-over-end rotasie. Die hars is ten minste 4 keer (5 min/was) gewas met NT2 -buffer wat 300 mM NaCl bevat, en 'n gedeelte van die hars is behou vir Western blot -analise. Die hars is gesuspendeer in 100 ul NT2, aangevul met 0.1% SDS en 3 mg/ml proteïenase K (Santa Cruz Biotechnology) en vir 30 minute by 55 ° C geïnkubeer. RNA is geïsoleer met behulp van Trizol-reagens volgens die vervaardiger se protokol en ontleed deur intydse qPCR soos voorheen beskryf.

Analise van mRNA stabiliteit

HEK293T shHuR/shAUF1 en shControl selle (9.6 X 105 selle) in 6-put plate is behandel met 5 μg/ml actinomycin D (MilliporeSigma) en geoes in Trizol soos hierbo beskryf op die aangeduide tydpunte. Die hoeveelheid Nrf2-mRNA wat oorbly, is bepaal deur real-time qPCR soos voorheen beskryf.

Kern-sitosoliese fraksionering vir RNA-isolasie

Hierdie prosedure is aangepas uit 'n gerapporteerde protokol (46). HEK293T-selle (9,6 X 105 selle) in plate met 6 putte is geoes deur tryspinisering en twee keer met koue PBS gewas. Selkorrels is toe hersuspendeer in RSB buffer [10 mM Tris (Chem-Impex International) pH 7.4, 10 mM NaCl (Thermo Fisher Scientific), 3 mM MgCl2 (Thermo Fisher Scientific)], vir 3 minute op ys geïnkubeer en gesentrifugeer (1500 g, 3 min, 4°C). Selle is weer gesuspendeer in RSBG40 -buffer [10 mM Tris pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 10% gliserol (MilliporeSigma), 0.5% Nonidet P-40, 0.5 mM DTT (VWR International, Radnor, PA, VSA), en 100 U/ml RNaseOUT (Thermo Fisher Scientific)] en geliseer met sagte pipet op en af. Die suspensie is gesentrifugeer (4500 g, 3 min, 4 ° C), en die supernatant is gestoor as die sitosoliese fraksie. Die kernfraksie (korrel) is weer gesuspendeer in RSBG40 en 10X wasmiddeloplossing [finale konsentrasies: 3,3% natriumdeoksykolaat (Chem-Impex International), 6,6% Tween 20 (Thermo Fisher Scientific)] is bygevoeg. Die kerne is verskeie kere op en af ​​gepipetteer en die suspensie is vir 5 minute op ys geïnkubeer en daarna gesentrifugeer (4500 g, 3 min, 4 ° C). Die supernatant is saamgevoeg met die vorige supernatant, en die gekombineerde monster is gebruik as die sitosoliese breuk. Die kerne is weereens met RSBG40 gewas, gesentrifugeer (9500 g, 3 min, 4 ° C), en deeglik geresuspendeer in RSBG40. Trizol LS is daarna by elke monster gevoeg en RNA is geïsoleer, behandel met amplifikasie-graad DNase I en onderworpe aan qPCR soos hierbo beskryf.

Sebraviskweek, mikro-inspuiting en beeldvorming

Alle sebravisprosedures is uitgevoer in ooreenstemming met die riglyne van die Amerikaanse National Institutes of Health en is goedgekeur deur die Institusionele Dieresorg- en Gebruikskomitee van die Cornell Universiteit (IACUC). Tg(-3.4gstp1:GFP)it416b vis is verkry van Riken Brain Science Institute, (Wako, Japan National BioResource Project, Zebravis). Transgeniese visse is gekruis met wilde tipe vis om 'n mengsel van heterosigotiese en wilde tipe nageslag vir eksperimente op te wek. Bevrugte eiers op die enkelselstadium is ingespuit met 8 ng morfolino-oligonukleotiede (MO's) gerig op zHuR (elavl1a) of zAUF1 (hnrnpd) of 'n ewekansige kontrole MO (Gene Tools, Philomath, OR, VS -aanvullende tabel S7). Visse is gekeur vir die uitdrukking van groen fluorescentieproteïen (GFP) deur middel van beelding met 'n Leica M205-FA fluorescentiestereoskoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland)

24 uur na bevrugting. Na afbeelding is visse geëuthaniseer, twee keer in PBS gewas met 0.1% Tween-20, en oorgedra na 4% formaldehied vir verdere immunofluoresensie-analise (sien hieronder). GFP-uitdrukking is opgespoor met behulp van rooi fluoresserende teenliggaamkleuring as gevolg van hoë agtergrondsein in die GFP (byvoorbeeld: 488 nm em: 520-550 nm) kanaal in hierdie sebravis ontwikkelingstadium, wat akkurate kwantifisering voorkom.

Immunofluorescentie in die geheel

Heel-berg immunokleuring van sebravislarwes is uitgevoer soos voorheen beskryf (47). Alle inkubasiestappe is met sagte skommeling uitgevoer. Genoteerde vis is twee keer met PBST (PBS + 0.1% Tween-20) gewas en in 4% formaldehied in PBS oornag of tot 7 d vasgemaak. Vis is daarna twee keer vir 30 minute gewas met PDT (PBST, 0,3% Triton X-100, 1% DMSO), 1 uur by kamertemperatuur geblokkeer in blokkeringsbuffer (PBST, 10% FBS, 2% BSA) en geïnkubeer met primêre teenliggaampie (Aanvullende Tabel S10) in blokkeerbuffer vir 2 uur by kamertemperatuur of oornag by 4°C. Vis is twee keer met PDT gewas, vir 1 uur by kamertemperatuur weer toegesluit en geïnkubeer met sekondêre teenliggaam (aanvullende tabel S10) in blokkeringsbuffer vir 1,5 uur by kamertemperatuur. Na inkubasie van sekondêre teenliggaampies is visse twee keer met PDT gewas en dan afgebeeld. Fluoresentasie is gekwantifiseer met behulp van die "Measure"-instrument in ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, VSA).

Uitdrukking en suiwering van Syne6-Hoer

BL21-CodonPlus-selle (Agilent Technologies) is getransformeer met pET28a-plasmied wat His6-TEV-HuR kodeer. 'N Enkele kolonie is in verskeie voorgeregskulture (5 ml) verdeel en oornag gegroei in lysogeniese sous wat chlooramfenikol en kanamisien bevat, onder skud. Kulture is daarna elk verdun tot 1 L lysogenie -sous wat kanamisien bevat en by 37 ° C gegroei met skud tot optiese digtheid (OD)600 nm = 0,5, op watter punt isopropyl-β-D-thiogalactoside (1 mM finale konsentrasie GoldBio, St. Louis, MO, VSA) bygevoeg om uitdrukking te veroorsaak. Die temperatuur word daarna verlaag tot 18 ° C en kulture word oornag met skud gegroei. Verdere stappe is by 4°C uitgevoer. Selle is geoes deur sentrifugering (4000 g, 20 min, 4 ° C), geresuspendeer in lysisbuffer [20 mM Tris pH 7,5, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM imidazol (Thermo Fisher Scientific), 5% gliserol, 5 mM β-merkapto-etanol (βME), en 0,5 mM fenielmetielsulfonielfluoried (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, VSA)] en gelys deur 2 gange deur 'n Emlusiflex-selontwrigter (Avestin Europe, Mannheim, Duitsland). Puin is verwyder deur middel van sentrifugering (20 000 g, 30 min, 4 ° C). Streptomisiensulfaat (1% wt/vol) is druppelsgewys oor 20 min bygevoeg met sagte roer, en gepresipiteerde materiaal is skoongemaak deur sentrifugering (20 000 g, 30 min, 4°C). Die lysaat is dan met nikkelhars (Qiagen) vir 1 uur met sagte roering geïnkubeer. Die hars is geleidelik gewas met wasbuffers (20 mM Tris pH7.5 150 mM KCl 2 mM MgCl2 50, 100, 200 mM imidasool en 5 mM βME). Proteïen is geëlueer met elueringsbuffer [20 mM Tris pH 7,5, 150 mM KCl, 2 mM MgCl2, 300 mM imidasool (Thermo Fisher Scientific), 5 mM βME], gekonsentreer, en gelaai op 'n grootte-uitsluiting chromatografiekolom (ÄKTA suiweringstelsel, Hiload 26/600 Superdex 75 prep graad GE Healthcare, Chicago, IL, VSA) en hardloop in stoorbuffer (20 mM Tris pH 7,5, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5% gliserol, 5 mM TCEP). Die proteïen is versamel, gekonsentreer, verdeel in aliquots, blits gevries in vloeibare stikstof, en gestoor by -80°C in enkelgebruik aliquots om vries/ontdooiing te vermy.

Uitdrukking en suiwering van Syne6-AUF1

BL21-CodonPlus-selle (Agilent Technologies) is getransformeer met pET28a His6-AUF1 (p37) en gekweek soos hierbo beskryf. Die reinigingsprosedure was dieselfde as vir Syne6HuR behalwe vir die buffers: lysis buffer [50 mM NaH2PO4 pH 7,6, 300 mM NaCl, 5 mM imidasool, 5 mM βME en 1 mM fenielmetylsulfoniel fluoried, 0,5% Nonidet P40, 0,15 mg/ml lisosiem, 0,1 mg/ml RNase A (MilliporeSigma)] wasbuffers (50 mM NaH2PO4 pH 7,6 150 mM NaCl 20, 50, 100, mM imidasool en 5 mM βME) elueringsbuffer (50 mM NaH2PO4 pH 7,6, 150 mM NaCl, 250 mM imidasool, 5 mM βME). Die eluaat is aangevul met 0,1 mg/ml RNase A en vir 1 uur by kamertemperatuur om die einde gedraai. Die resulterende mengsel is daarna gedialiseer teen opbergingsbuffer [50 mM 4- (2-hidroksietiel) -1-piperazineetaansulfonzuur pH 7,6, 150 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM TCEP] vir 2 uur by 4°C, toe is dialisebuffer verander en dialise is toegelaat om oornag by 4°C voort te gaan. Die proteïen is dan gekonsentreer en gestoor (met 5% gliserol by stoorbuffer gevoeg) by -80°C in eenmalige porsies om vries/ontdooiing te vermy.

[32 P] -Eind-etikettering van RNA-oligo's

RNA-oligo's (IDT, Coralville, IA, VS-aanvullingstabel S8) is in RNase-vrye water tot 200 μM gesuspendeer. RNA is gemerk met γ-[ 32 P] ATP (PerkinElmer, Waltham, MA, VSA) in 'n reaksie wat (finale konsentrasies) 20 pmol RNA, 20 pmol γ-[ 32 P] ATP, 1X polinukleotied kinase buffer bevat (New England Biolabs ), en 0,4 U/ul polynukleotiedkinase (New England Biolabs) in 'n totale volume van 50 ul. Die reaksie is vir 1 uur by 37°C geïnkubeer, waarna 50 μl RNase-vrye water en 300 μl Trizol LS bygevoeg is, en die mengsel is vir 5 min by kamertemperatuur gelaat. CHCl3 (200 μl) is bygevoeg, die mengsel is vir 15 s geskud, vir 2 min by kamertemperatuur gelaat, en dan kortliks afgedraai om die inhoud te versamel. Die waterige laag is versamel en gemeng met 'n gelyke volume CHCl3, geskud en kort gedraai. Die waterige laag is weer versamel, aangevul met 15 μg GlycoBlue (Ambion) en ammoniumasetaat tot 'n finale konsentrasie van 500 mM, en 3 volumes 100% EtOH is bygevoeg. Die mengsel is in 'n draaikolk gebring en laat oornag by -20 ° C neerslaan, waarna dit gesentrifugeer word (20.000 g, 15 min, 4°C). Die gemerkte RNA-korrel is twee keer gewas met 75% EtOH in RNase-vrye water, kort gedroog en in RNase-vrye water geresuspendeer. Gemerkte RNA is gestoor by -80 ° C in eenmalige hoeveelhede om vries/ontdooiing te voorkom.


RBP's oefen terugvoerregulering uit op verskillende post-transkripsionele vlakke

RBP's kan geenuitdrukking in verskillende stappe van RNA -sintese tot sy verval beheer. Die meganisme waarmee RBP's hul eie vlakke beheer, is dikwels dieselfde waarmee hulle hul teiken -RNA's reguleer. Splytingsfaktore soos SR-proteïene of heterogene kern-RNP's (hnRNP's) bemiddel byvoorbeeld onproduktiewe alternatiewe splitsing (AS) van hul mRNA's by ooruitdrukking. Dit genereer transkripsies wat voortydige beëindigingskodons (PTC's) bevat, wat vinnige RNA -agteruitgang veroorsaak (Wollerton et al., 2004 Lareau et al., 2007 Ni et al., 2007). Ander splitsingsfaktore, soos die Fox-proteïene, gebruik AS om dominante negatiewe isovorme te produseer wat met die vollengte-proteïene kompeteer (Daminov en Black, 2010). Translasiereguleerders, soos SRSF1, inhibeer eerder die translasie van hul eie mRNA's (Sun et al., 2010), terwyl die uitvoerfaktor NXF1 die uitvoer van sy eie transkripsie bind en bevorder wat 'n behoue ​​intron bevat, wat lei tot óf tot vinnige agteruitgang van hierdie RNA of tot sintese van 'n afgeknotte, onaktiewe NXF1 proteïen isoform (Li et al., 2006).

In sommige gevalle oefen RBP's op verskeie vlakke homeotiese terugvoer uit. Die gis ribosomale proteïen L32 kan byvoorbeeld beide splitsing en translasie van sy eie mRNA beheer, wat die produksie daarvan pas by die sintesetempo van ribosoomvoorlopers (Dabeva en Warner, 1993). Die Drosophila proteïen Sex-lethal (Sxl) gebruik selfs beide positiewe en negatiewe terugvoermeganismes wat op die vlak van splitsing en translasie werk. Dit lei tot binêre skakelaaragtige gene-uitdrukking (bemiddel deur positiewe terugvoer), terwyl dit terselfdertyd nadelige oorproduksie van die proteïen voorkom deur negatiewe terugvoer (Moschall et al., 2017).


Hoeveel RNA-bindende proteïene kan gelyktydig bind op 'n enkele mRNA? - Biologie

Proteïendruppels sedimenteer sonder matriksondersteuning. Spin -etikettering op spesifieke posisies van FUS- en EPR -eksperimente het aan die lig gebring dat proteïen verder in druppels gekompakteer word terwyl diffusie -NMR FUS -verhoudings in die verskillende fases gekwantifiseer het.

'N Onlangse & quotNature Chemical Biology & quot-vraestel deur die Allain-groep (IMBB) in samewerking met die Jeschke (DCHAB-PC) en Klotzsch (HEST & Humboldt) laboratoriums toon 'n nuwe metode om FUS gelyktydig in die druppels te kwantifiseer en FUS struktureel te kenmerk, beide in die verspreide en gekondenseerde fases.

Baie RNA-bindende proteïene ondergaan vloeistof-vloeistof fase skeiding, wat onderliggend is aan die vorming van membraanlose organelle, soos stres korrels en P-liggame. Studies oor die molekulêre meganisme van fase-skeiding in vitro word belemmer deur die samesmelting en sedimentasie van druppels in die grootte van organelle wat met glasoppervlakke in wisselwerking is. Hier demonstreer ons dat vloeibare druppels FUS, wat 'n proteïen is wat in sitoplasmiese aggregate van ALS- en FTD-pasiënte voorkom, in vitro gestabiliseer kan word deur 'n agarose-hidrogel wat as sitoskeletnabootsing optree. Dit laat hul spektroskopiese karakterisering toe deur vloeibare fase NMR en elektronparamagnetiese resonansie (EPR) spektroskopie. Proteïenseine vanaf beide verspreide en gekondenseerde fases kan gelyktydig waargeneem word en hul onderskeie verhoudings kan presies gekwantifiseer word. Verder dien die agarose hidrogel as 'n kriobeskermingsmiddel tydens skokbevriesing wat gepulseerde EPR metings by kryogeniese temperature vergemaklik. Verbasend genoeg het dubbelelektron-elektronresonansie (DEER) metings 'n verdigting van FUS in die gekondenseerde fase aan die lig gebring.

Figuur en teks word vriendelik deur die outeurs verskaf.
Beide is sowel as Nuus gepubliseer op die webwerf van ETH se D-BIOL.


Biologie Hoofstuk 17 vasvrae

C) Verskillende organismes het verskillende tipes aminosure.

B) post-transkripsionele splitsing

C) translasie in die afwesigheid van 'n ribosoom

B) Dit verander 'n aminosuur in die gekodeerde proteïen.

C) Dit verander die leesraamwerk van die mRNA.

B) Oordrag RNA neem inligting van DNA direk na 'n ribosoom, waar proteïensintese plaasvind.

C) Boodskapper RNA word van 'n enkele geen getranskribeer en dra inligting van die DNA in die kern oor na die sitoplasma, waar proteïensintese plaasvind.

B) Die translasie van kodons word bemiddel deur tRNA's in eukariote, maar vertaling vereis geen intermediêre molekules soos tRNA's in prokariote nie.

C) Prokariotiese kodons bevat gewoonlik verskillende basisse as dié van eukariote.

B) Die oormaat nukleotiede (ACCA) sal by die ribosoom afgesny word.

C) Die 5'-dop van die mRNA sal kovalent gebind word.

B) Dit is 'n meganisme om die vertaalkoers te verhoog.

C) Dit verhoog die tempo van transkripsie.

B) kodon wat dieselfde aminosuur as die oorspronklike kodon spesifiseer

C) 'n aminosuurvervanging wat die tersiêre struktuur van die proteïen verander

B) Die genetiese kode is universeel (dieselfde vir alle organismes).

C) Die genetiese kode verskil vir verskillende domeine van organismes.

B) Prokariotiese selle het ingewikkelde meganismes om proteïene op die toepaslike sellulêre organelle te rig.

C) Uitgebreide RNA-prosessering is nodig voordat prokariotiese transkripsies vertaal kan word.

B) proteïene gesintetiseer word

B) lees van die volgende kodon van mRNA

B) Gene dikteer die produksie van spesifieke ensieme, en geaffekteerde individue het genetiese defekte wat veroorsaak dat hulle sekere ensieme ontbreek.

C) Ensieme is gemaak van DNA, en geaffekteerde individue het nie DNA -polimerase nie.

B) Dit verskaf 'n bron van energie vir die beëindiging van vertaling.

C) Dit stel die ribosoom van die ER vry om polipeptiede in die sitosol toe te laat.

B) binding van die antikodon aan die kodon en die binding van aminosure aan tRNA's

C) binding van ribosome aan mRNA

B) 'n polipeptied wat 'n aminosuur ontbreek

B) die ribosoom bereik 'n stopkodon

C) baseparing van geaktiveerde metionien-tRNA met AUG van die boodskapper-RNA

B) RNA -polimerase transkribeer deur die poliadenyleringssein, wat proteïene met die transkripsie verbind en dit losmaak van die polimerase.

C) RNA-polimerase transkribeer deur die terminatorvolgorde, wat veroorsaak dat die polimerase van die DNA skei en die transkripsie vrystel.


83 Eukariotiese Post-transkripsionele Geenregulering

Aan die einde van hierdie afdeling kan u die volgende doen:

  • Verstaan ​​RNA-splyting en verduidelik die rol daarvan in die regulering van geenuitdrukking
  • Beskryf die belangrikheid van RNA -stabiliteit in geenregulering

RNA word getranskribeer, maar moet in 'n volwasse vorm verwerk word voordat vertaling kan begin. Hierdie verwerking wat plaasvind nadat 'n RNA-molekule getranskribeer is, maar voordat dit in 'n proteïen vertaal word, word genoem post-transkripsionele wysiging. Soos met die epigenetiese en transkripsionele stadiums van verwerking, kan hierdie post-transkripsionele stap ook gereguleer word om geenuitdrukking in die sel te beheer. As die RNA nie verwerk, geskuif of vertaal word nie, sal geen proteïen gesintetiseer word nie.

RNA Splicing, die eerste fase van post-transkripsionele beheer

In eukariotiese selle bevat die RNA -transkripsie dikwels streke, genaamd introne, wat verwyder word voor translasie. Die streke van RNA wat vir proteïen kodeer, word eksone genoem. ((Figuur)). Nadat 'n RNA -molekuul getranskribeer is, maar voordat dit vertrek uit die kern wat vertaal moet word, word die RNA verwerk en word die introne verwyder deur te splits. Splitsing word gedoen deur spliceosome, ribonukleoproteïenkomplekse wat die twee ente van die intron kan herken, die transkripsie op die twee punte kan sny en die eksone bymekaar kan bring vir ligasie.


Alternatiewe RNA-splyting In die 1970's is gene vir die eerste keer waargeneem wat alternatiewe RNA-splyting vertoon het. Alternatiewe RNA -splitsing is 'n meganisme waarmee verskillende proteïenprodukte uit een geen geproduseer kan word wanneer verskillende kombinasies van eksone gekombineer word om die mRNA te vorm ((Figuur)). Hierdie alternatiewe splitsing kan toevallig wees, maar dit word meer gereeld beheer en dien as 'n meganisme van geenregulering, met die frekwensie van verskillende splitsingsalternatiewe wat deur die sel beheer word as 'n manier om die produksie van verskillende proteïenprodukte in verskillende selle of in verskillende stadiums van ontwikkeling te beheer. Alternatiewe splitsing word nou beskou as 'n algemene meganisme van geenregulering in eukariote volgens een skatting, 70 persent van die gene by mense word uitgedruk as veelvuldige proteïene deur alternatiewe splitsing. Alhoewel daar verskeie maniere is om RNA-transkripsies alternatiewelik te splits, is die oorspronklike 5 ′-3 ′ volgorde van die eksons altyd bewaar. Dit wil sê, 'n transkripsie met eksons 1 2 3 4 5 6 7 kan 1 2 4 5 6 7 of 1 2 3 6 7 gesplits word, maar nooit 1 2 5 4 3 6 7 nie.


Hoe kan alternatiewe splitsing ontwikkel? Introne het 'n begin- en eindherkenningsvolgorde, dit is maklik om te dink dat die splitsingsmeganisme nie die einde van 'n intron kan identifiseer nie, en in plaas daarvan die einde van die volgende intron vind en sodoende twee introne en die tussenliggende exon verwyder. Trouens, daar is meganismes in plek om te verhoed dat sulke intron oorslaan, maar mutasies sal waarskynlik tot hul mislukking lei. Sulke 'foute' sal waarskynlik 'n nie -funksionele proteïen produseer. Die oorsaak van baie genetiese siektes is inderdaad abnormale splitsing eerder as mutasies in 'n koderingsvolgorde. Alternatiewe splitsing kan egter moontlik 'n proteïenvariant skep sonder die verlies van die oorspronklike proteïen, wat moontlikhede oopmaak vir aanpassing van die nuwe variant by nuwe funksies. Geneduplisering speel 'n belangrike rol in die ontwikkeling van nuwe funksies op 'n soortgelyke manier deur gene te verskaf wat kan ontwikkel sonder om die oorspronklike, funksionele proteïen uit te skakel.

Vraag: In die mielieslang Pantherophis guttatusDaar is verskillende kleurvariante, insluitend amelanistiese slange waarvan die velpatrone slegs rooi en geel pigmente vertoon. Die oorsaak van amelanisme in hierdie slange is onlangs geïdentifiseer as die invoeging van 'n transponeerbare element in 'n intron in die OCA2 (oculocutaneous albinism) geen. Hoe kan die invoeging van ekstra genetiese materiaal in 'n intron lei tot 'n nie -funksionele proteïen?

Visualiseer hoe mRNA -splitsing plaasvind deur na die proses in aksie in hierdie video te kyk.

Beheer van RNA -stabiliteit

Voordat die mRNA die kern verlaat, word dit twee beskermende “caps” gegee wat verhoed dat die punte van die string afbreek tydens sy reis. 5′ en 3′ eksonukleases kan onbeskermde RNAs afbreek. Die 5 ′ -kap, wat op die 5 ′ -einde van die mRNA geplaas word, bestaan ​​gewoonlik uit 'n gemetileerde guanosinetrifosfaatmolekule (GTP). Die GTP word geplaas “ agteruit ” op die 5 ′ einde van die mRNA, sodat die 5 ′ koolstowwe van die GTP en die terminale nukleotied deur drie fosfate verbind is. Die poly-A-stert, wat aan die 3 ′-einde vasgemaak is, bestaan ​​gewoonlik uit 'n lang ketting adenienukleotiede. Hierdie veranderinge beskerm die twee ente van die RNA teen eksonuklease -aanval.

Sodra die RNA na die sitoplasma vervoer is, kan die tyd wat die RNA daar bly, beheer word. Elke RNA -molekule het 'n gedefinieerde lewensduur en verval teen 'n spesifieke tempo. Hierdie verval kan beïnvloed hoeveel proteïene in die sel is. As die verval tempo verhoog word, sal die RNA nie so lank in die sitoplasma bestaan ​​nie, wat die tyd wat beskikbaar is vir translasie van die mRNA kan verkort. Omgekeerd, as die tempo van verval verminder word, sal die mRNA-molekule langer in die sitoplasma woon en meer proteïen kan vertaal word. Daar word na hierdie tempo van verval verwys as die RNA -stabiliteit. As die RNA stabiel is, word dit vir langer tydperke in die sitoplasma opgespoor.

Binding van proteïene aan die RNA kan ook sy stabiliteit beïnvloed. Proteïene genaamd RNA-bindende proteïene, of RBP's, kan bind aan die streke van die mRNA net stroomop of stroomaf van die proteïenkoderingstreek. Hierdie streke in die RNA wat nie in proteïen vertaal word nie, word die onvertaalde streke of UTR's genoem. Hulle is nie introne nie (dit is in die kern verwyder). Dit is eerder streke wat mRNA -lokalisering, stabiliteit en proteïenvertaling reguleer. Die gebied net voor die proteïenkoderingstreek word die 5 ′ UTR genoem, terwyl die gebied na die kodegebied die 3 ′ UTR ((Figuur)) genoem word. Die binding van RBP's aan hierdie streke kan die stabiliteit van 'n RNA -molekule verhoog of verminder, afhangende van die spesifieke RBP wat bind.


RNA -stabiliteit en mikro -RNA's

Benewens RBP's wat bind aan en beheer (verhoog of verminder) RNA -stabiliteit, kan ander elemente genaamd mikroRNA's aan die RNA -molekule bind. Hierdie mikro -RNA's, of miRNA's, is kort RNA -molekules wat slegs 21 tot 24 nukleotiede lank is. Die miRNA's word in die kern gemaak as langer pre-miRNA's. Hierdie pre-miRNA's word in volwasse miRNA's gekap deur 'n proteïen genaamd Dicer . Soos transkripsiefaktore en RBP's, herken volwasse miRNA's 'n spesifieke volgorde en bind dit aan die RNA, maar miRNA's assosieer ook met 'n ribonukleoproteïenkompleks wat die RNA-geïnduseerde stilmaakkompleks (RISC) genoem word. Die RNA-komponent van die RISC-baspare met komplementêre rye op 'n mRNA en belemmer die vertaling van die boodskap of lei tot die agteruitgang van die mRNA.

Afdeling Opsomming

Post-transkripsionele beheer kan op enige stadium na transkripsie plaasvind, insluitend RNA-splitsing en RNA-stabiliteit. Sodra RNA getranskribeer is, moet dit verwerk word om 'n volwasse RNA te skep wat gereed is om te vertaal. Dit behels die verwydering van introne wat nie vir proteïen kodeer nie. Spliceosome bind aan die seine wat die ekson/intron-grens merk om die introne te verwyder en die eksons saam te lig. Sodra dit gebeur, is die RNA volwasse en kan dit vertaal word. Alternatiewe splitsing kan meer as een mRNA van 'n gegewe transkripsie produseer. Verskillende splitsingsvariante kan onder verskillende omstandighede vervaardig word.

RNA word in die kern geskep en gesplitst, maar moet na die sitoplasma vervoer word om vertaal te word. RNA word deur die kernporiekompleks na die sitoplasma vervoer. Sodra die RNA in die sitoplasma is, kan die tyd wat dit daar bly voordat dit afgebreek word, RNA -stabiliteit genoem, ook verander word om die algehele hoeveelheid proteïen wat gesintetiseer word, te beheer. Die RNA-stabiliteit kan verhoog word, wat lei tot langer verblyftyd in die sitoplasma, of verlaag word, wat lei tot verkorte tyd en minder proteïensintese. RNA-stabiliteit word beheer deur RNA-bindende proteïene (RPB's) en mikroRNA's (miRNA's). Hierdie RPBs en miRNAs bind aan die 5′ UTR of die 3′ UTR van die RNA om RNA stabiliteit te verhoog of te verlaag. MikroRNA's wat met RISC-komplekse geassosieer word, kan translasie onderdruk of tot mRNA-afbreek lei.


Opsomming

Kennis van die rol van RNA-netwerke wat verband hou met RNA-modifikasies en RNA-RBP-interaksies in inflammatoriese en metaboliese regulering by vetsug is beperk. Die versamelde bewyse het egter lig gewerp op hoe RNA-netwerke metaboliese, ontwikkelings- en inflammatoriese meganismes dinamies beïnvloed in die patogenese van vetsug-geassosieerde versteurings. Funksionele veranderinge van addisionele RBP's, insluitend maar nie beperk nie tot LIN28A, IGF2BP2/IMP2 en HuR, hou verband met die ontwikkeling van metaboliese siektes (213 �). RNA -metilering invloede en noodlot karteer RNA na translasie, agteruitgang of selfs sekwestrasie binne sellulêre kompartemente. Daarom verteenwoordig omkeerbare RNA-modifikasie, veral RNA-metilering, 'n nuwe epigenetiese merker, soortgelyk aan omkeerbare DNA-modifikasies, wat leidrade verskaf vir adaptiewe sellulêre reaksies wat verband hou met metaboliese veranderinge in reaksie op duidelike eksogene of endogene stresstimuli, insluitend oormatige voedingstowwe, gifstowwe en mikrobiese infeksies (216, 217). RNA-aanpassings kan RNA-RBP-netwerke en opkomende biologiese gebeurtenisse beïnvloed, insluitend RNA-uitvoer en vervoer, RNA-splitsing, rypwording en stabiliteit, sowel as funksionele veranderinge in RBP's (218). Die onthulling van hierdie epigenetiese regulerende rolle van die RNA-netwerke is belangrik om die patogenese van chroniese siektes te verduidelik, insluitend, maar nie beperk nie tot, vetsug, kardiovaskulêre, veroudering en outo-immuun siektes, waar die presiese molekulêre meganismes steeds swak gedefinieer is.

Terwyl RNA-aanpassings oor die algemeen beskou word as 'n fyn afstemproses van sellulêre homeostase, kan langdurige eksterne aanwysings, insluitend chroniese HFD-voeding, geleidelik foutiewe RNA-modifikasies ophoop wat die selbestuur dryf na chroniese en laegraadse inflammatoriese toestande wat goed waargeneem word. kenmerke in vetsug. Hierdie konsep word ondersteun deur bewyse dat verskeie inflammatoriese RBP's, insluitend TLR3, TLR7 en PKR, betrokke is by die induksie van vetsug-geassosieerde chroniese inflammasie. Aangesien mRNA-metilering-verandering die post-transkripsionele gene-stilte kan beïnvloed en die doelgerigte gene-uitdrukking kan beheer, byvoorbeeld deur interaksies met mRNA/miRNA/Ago proteïenkompleks te beïnvloed, kan daar spesifieke tipes en modifikasies van RNA's wees wat metaboliese en inflammatoriese programme aktiveer in die patogenese van vetsug.

Huidige tegniese vooruitgang het ons in staat gestel om kwantitatiewe veranderinge in baie soorte RNA-spesies te ondersoek, hetsy kodering of nie-kodering van RNA-vlakke, en metileringstatus (219 �). Die uitdaging is egter om die tipe wysiging, die mate van wysigings en die biologiese betekenis daarvan te voorspel, veral die effek van hierdie veranderinge op die RNA se sekondêre struktuur, lokalisering en interaksies met spesifieke RBP's. Hierdie belangrike insigte sou dan lei tot die ontwikkeling van nuwe terapieë om RNA-RBP-interaksies by vetsug en T2D te verander. Nietemin, om die komponente wat RNA-spesifisiteit, regulatoriese meganismes en funksies van RBP's bestuur te ondersoek, is dit belangrik om metodes te prioritiseer wat direkte endogene proteïen-RNA-interaksies kenmerk. In die afgelope dekade is verskeie RIP-metodes, insluitend kruisbinding en immunopresipitasie (CLIP) en metielering individuele nukleotiedresolusie CLIP (miCLIP), ontwikkel om die in vivo RNA-teikens van RBP's (221�). Die gebruik van RBP's wat bekend is dat hulle betrokke is by inflammatoriese en metaboliese siektes om die ȁKatologiese ” RNA's deur RIP te identifiseer, sal unieke benaderings bied om die molekulêre meganismes van chroniese inflammatoriese siektes beter te verstaan. Sulke pogings kan die weg baan vir nuwe terapeutiese en farmakologiese doelwitte en/of intervensies vir die bekamping van vetsug-geïnduseerde gevolge.


Resultate

Differensieel uitgedrukte RBP's in STAD

Die studie -ontwerp word geïllustreer in Figuur 1. Dit is onthul deur GEPIA -analise dat DEG's in STAD 896 afgereguleerde gene en 3475 opreguleerde gene insluit (Figuur 2A). Onder die 1542 RBP's is 362 differensieel uitgedruk met 331 opgereguleerde en 31 afgereguleerde (Figuur 2B, Tabel S1).

Figuur 1 Raamwerk vir die ontleding van RBP's in STAD.

Figuur 2 Vulkaan plot van verwante DEG's in STAD. (A) Vulkaanplot van alle DEG's in STAD. (B) Vulkaanplot van differensieel uitgedrukte RBP's in STAD.

GO en KEGG Pathway Verrykingsanalise van die differensieel uitgedrukte RBP's

Om die funksies en meganismes van hierdie differensieel uitgedrukte RBP's te ondersoek, het ons die funksionele analise uitgevoer vir afgereguleerde en gereguleerde RBP's via WebGestalt.

Soos getoon in Tabel 1, is betekenisvolle verskille waargeneem in funksionele verryking van afgereguleerde en opgereguleerde RBP's. Wat lokalisering binne die sel betref, is afgereguleerde RBP's verryk in U2-tipe spliceosomale kompleks, spliceosomale snRNP-kompleks, U2-tipe prespliceosome, prespliceosome en U1 snRNP, en upregulated RBP's in U1 snRNP, U4 snRNP, U12-tipe spliceosom /ACA snoRNP kompleks en histoon pre-mRNA 3 ⮞nd verwerkingskompleks. Verskille in lokalisering binne die sel het verskillende molekulêre funksies beteken, wat verder bevestig is deur molekulêre funksionele analise. Molekulêre funksionele analise het getoon dat afgereguleerde RBP's deelgeneem het aan RNA-binding, mRNA-binding en snRNA-binding en RBP's opgereguleer in RNA 7-metielguanosienkapbinding, eksoribonuklease-aktiwiteit, transformerende groeifaktor-beta-reseptor, box H/ACA snoRNA-binding en snRNP-binding (Tabel 1) ). Biologiese proses-analise het getoon dat afgereguleerde RBP's verband hou met positiewe regulering van mRNA-prosessering, mRNA-splitsingsplekseleksie, positiewe regulering van RNA-splyting, positiewe regulering van mRNA-splyting en regulering van chaperone-gemedieerde outofagie, terwyl opgereguleerde RBP's na ribosomale subeenheid uitvoer vanaf die kern, beëindiging van RNA -polimerase II -transkripsie, positiewe regulering van sitoplasmiese mRNA -verwerkingsliggaamsamestelling, regulering van ribonukleaseaktiwiteit en mRNA -splitsing betrokke by geenstilstand (Tabel 1).

Tabel 1 GO -verryking en KEGG -padanalise van verskillende uitgedrukte RBP's

Boonop is afgereguleerde RBP's slegs verryk in die spliceosoomweg, terwyl RBP's aansienlik opgegradeer is in aminoasiel-tRNA-biosintese, ribosoombiogenese in eukariote, RNA-vervoer, mRNA-toesigroete, RNA-agteruitgang en spliceosoom (tabel 1).

Prognose-verwante Hub RBP's

Om die uitwerking van RBP's op die prognose van STAD-pasiënte verder te ontleed, het ons die verband tussen die differensieel uitgedrukte RBP's en OS beoordeel deur die eenveranderlike Cox-regressie-analise en Kaplan–Meier-metode in die TCGA-opleidingskohort, waarvan die resultate voorgestel het dat 25 kandidate hub RBPs was aansienlik geassosieer met OS (Tabel 2). Daarna is die impak van hierdie 25 kandidaat-hub RBP's op OS geëvalueer deur meerveranderlike analise, waarvan die resultate gedemonstreer het dat sewe hub RBP's onafhanklike prognostiese voorspellers vir STAD pasiënte was (Tabel 2).

Tabel 2 Cox-regressie-analise vir die identifisering van Hub RBP's in die opleidingsdatastel

Konstruksie van Prognostiese model

'N Voorspellingsmodel wat gebaseer is op die voormelde sewe hub -RBP's, is toe opgestel. Volgens die formule: RS= (0.040* Exp PTBP1) + (𢄠.052* Exp PPIH) + (0.172 * Exp SMAD5) + (𢄠.208* Exp MSI2) + (𢄠.474 * Exp RBM15) + (0,072 * Exp MRPS17) + (𢄠.248* Exp ADAT3), RS van elke individuele pasiënt is beoordeel. Die voorspellingsvermoë van RS is geëvalueer deur oorlewingsanalise. Volgens die mediaan RS is die 187 pasiënte van TCGA-opleidingskohort in lae-risiko-groep en hoërisiko-groep ingedeel. Resultate van oorlewingsanalise het getoon dat dié van 'n hoërisikogroep in vergelyking met pasiënte van die laerisikogroep aansienlik swakker OS gehad het (p π.001, Figuur 3A). Om die prognostiese vermoë van die sewe geïdentifiseerde hub-RBP's verder te evalueer, het ons daarna 'n tydsafhanklike ROC-analise uitgevoer, waarvan die resultate getoon het dat die gebied onder die ROC-kromme (AUC) van hierdie RBP's RS model was 0.804 (Figuur 3B), wat die matige diagnostiese prestasie van hierdie model aandui. Die oorlewingstatus van pasiënte, RS en uitdrukkingshittekaart van die handtekening bestaande uit sewe hub-RBP's in die lae- en hoërisiko-subgroepe word in figuur 3C en#x2013E vertoon.

Figuur 3 Risiko telling analise van sewe-gene prognostiese model in die TCGA opleiding kohort. (A) Oorlewingskurwe vir lae- en hoërisiko-subgroepe. (B) ROC-krommes vir die voorspelling van OS gebaseer op risikotelling. (C) Oorlewingstatus. (D) Risikotelling. (E) Uitdrukking hittekaart.

Validasie van Prognostiese Model

Om die geldigheid van die sewe RBPs-gebaseerde voorspellingsmodelle verder te verifieer, het ons ontleed dat die TCGA-toetskohort 184 STAD-pasiënte insluit en GEO-kohort (GSE84437) 433 STAD-pasiënte ingesluit het, waarvan die resultate getoon het dat dit vergelyk word met pasiënte met 'n lae-risiko telling, diegene met 'n hoërisiko-telling het aansienlik erger OS gehad (p π.05, figuur 4A p π.05, Figuur S1A). AUC van die TCGA -toetskohort en GEO -kohort was 0,644 (figuur 4B) en 0,581 (Figuur S1B), wat goeie sensitiwiteit en spesifisiteit van die voorspellende model voorgestel het. Die oorlewingstatus van pasiënte, RS en uitdrukkingshittekaart van sewe hub -RBP's in die TCGA -toetskohorte en GEO -kohort word getoon in Figuur 4C 𠄾 en Figuur S1C 𠄾. Daarbenewens is die prognostiese betekenis van verskillende veranderlikes onder pasiënte van TCGA-opleidingskohort, TCGA-toetskohort en GEO-kohort beoordeel deur Cox-regressie-analise, waarvan die resultate getoon het dat vir drie kohorte, RS was onafhanklike prognostiese faktore van OS (p π.01, Figuur 5A p π.05, Figuur 5B p π.01, Figuur S1F). Die prognostiese waardes van die sewe spilpunt RBP's is ook verder ondersoek deur Kaplan-Meier plotter aanlyn hulpmiddel, waarvan die resultate aan die lig gebring het dat al die sewe spilpunt RBP's nie net beduidend geassosieer is met OS nie, maar ook met terugval vrye oorlewing (RFS) (Figuur S2). Samevattend suggereer al die bogenoemde resultate dat die sewe RBPs-gebaseerde prognostiese model betroubaar was in die voorspelling van die uitkomste van STAD-pasiënte.

Figuur 4 Risikotellinganalise van sewe-gene prognostiese model in die TCGA-toetskohort. (A) Oorlewingskurwe vir lae- en hoërisiko-subgroepe. (B) ROC-krommes vir die voorspelling van OS gebaseer op risikotelling. (C) Oorlewingstatus. (D) Risikotelling. (E) Uitdrukking hittekaart.

Figuur 5 Die prognostiese waarde van verskillende kliniese parameters. (A, B) Univariate en multivariate COX -regressie -analise van verskillende kliniese parameters in TCGA -opleiding en TCGA -toetskohort.

Bou 'n voorspellende nomogram

'N Nomogram is opgestel om 'n klinies praktiese model op te stel wat dokters in staat sou stel om die prognose van STAD -pasiënte te evalueer deur gebruik te maak van die sewe hub -RBP's (Figuur 6). Gebaseer op die resultate van meerveranderlike Cox-analise, is die ooreenstemmende punte aan elke individuele veranderlike toegeken volgens die puntskaal in die nomogram. 'N Horisontale lyn is getrek om die punt van elke veranderlike te bepaal. Die totale punt vir elke pasiënt is bereken deur die punte van alle veranderlikes op te tel, op grond waarvan ons die oorlewingsyfer van elke pasiënt op 1 jaar, 2 jaar en 3 jaar beraam het.

Figuur 6 Nomogram vir die voorspelling van 1, 2 en 3 jaar OS van STAD -pasiënte in die TCGA -opleidingskohort.

Biologienetwerk en funksies van die Seven Hub RBP's

Om die funksies van die sewe hub-RBP's in STAD verder te ondersoek, het ons TF-geen-, mikro-RNA- en weefselspesifieke PPI-netwerk van die sewe hub-RBP's geskep. TF-gene-spesifieke netwerk bevat 68 nodusse, 152 rande en 7 sade (PTBP1, PPIH, SMAD5, MSI2, RBM15, MRPS17 en ADAT3) (Figuur 7A), miRNA-gene-spesifieke netwerk 36 nodusse, 64 rande en 4 sade (MRPS17, MSI2, SMAD5 en PTBP1) (Figuur 7B) en weefselspesifieke PPI-netwerk 14 nodusse, 19 rande en 5 sade (PPIH, RBM15, PTBP1, SMAD5 en MSI2) (Figuur 7C).Uiteindelik het funksieverrykingsanalise aan die lig gebring dat hulle verryk is in tRNA-wobble-basismodifikasie, trombopoietien-gemedieerde seinweg, Mulleriaanse buisregressie, polipirimidienbinding en U4/U6 snRNP (Figuur 7D). Al hierdie resultate dui daarop dat die sewe hub -RBP's wyd betrokke was by baie biologiese prosesse.

Figuur 7 Biologienetwerk en funksies van die sewe spilpunt-RBP's. (A) TF-geen netwerk. (B) miRNA-geen netwerk. (C) Weefselspesifieke PPI-netwerk. (D) Funksionele verrykingsnetwerk.

Assessering van Tumor Immuniteit Infiltrasie

Die uitwerking van die sewe RBP's op tumor -immuuninfiltrasie is ook ondersoek, waarvan die resultate die uitdrukking van MRPS17 en PTBP1 was negatief aansienlik gekorreleer met die oorvloed TIL's. Dit is ook aan die lig gebring dat die uitdrukking van MRPS17 was negatief gekorreleer met Th1-sel, Tem-CD8-sel, NKT-sel en NK-seloorvloed (figuur 8A). Die uitdrukking van PTBP1 Dit is ook geopenbaar dat dit negatief gekorreleer is met Th1-sel, Tem-CD4-sel, NKT-sel en eosinofiel-oorvloed (figuur 8B). Al hierdie resultate het daarop gedui MRPS17 en PTBP1 kan die infiltrasie van immuunselle verminder.

Figuur 8 Die verhouding tussen die uitdrukking van die hub -RBP's en die oorvloed van TIL's. (A) Die verband tussen MRPS17-uitdrukking en TILs-oorvloed. (B) Die verband tussen PTBP1 -uitdrukking en TILs -oorvloed.

Die afregulering van PTBP1 Die migrasie- en invalvermoë van STAD -selle verswak

Sedert die rol van PTBP1 in STAD is nog onduidelik, het ons die effek van PTBP1 oor die migrasie- en indringingsvermoë van STAD-selle. PTBP1 mRNA uitdrukking in veelvuldige STAD sellyne is opgespoor deur RT-PCR (Figuur 9A). Vervolgens is siRNAs (si-NC, si-1 en si-2) in AGS- en HGC27-selle getransfekteer. RT-PCR- en Western Blotting-toetse het dit getoon PTBP1 uitdrukking is aansienlik af-gereguleer in STAD-selle (AGS en HGC27) wat met si-1 of si-2 getransfekteer is in vergelyking met dié wat met si-NC getransfekteer is (Figuur 9B). Toe is dit bewys deur transwell-toetse dat beide migrasie en indringing van AGS (pπ.01, Figuur 9C) en HGC27 (pπ.01, Figuur 9D) aansienlik verminder is deur afbreek van PTBP1. Daarom kan ons dit aflei PTBP1 het 'n belangrike rol gespeel in die bevordering van metastase van STAD.

Figuur 9 Die afregulering van PTBP1 het die migrasie- en indringingsvermoë van STAD-selle verswak. (A) PTBP1 -mRNA -uitdrukkingsvlak in STAD -selle. (B) PTBP1 knockdown AGS- en HGC27-selle is gebou en daarna bevestig deur RT-PCR en Western blotting. (C, D) Migrasie- en invalvermoë van AGS- en HGC27 -selle is aansienlik verswak deur afregulering van PTBP1. (**pπ 0.01, ***pπ.001).


Ahringer, J. en Kimble, J. (1991). Beheer van die sperma-oosiet skakelaar Caenorhabditis elegans hermafrodiete deur die fem-3 3 'onvertaalde gebied. Natuur 349 , 346 �. Abstrakte artikel

Ambros, V. (2003). MikroRNA-bane in vlieë en wurms: groei, dood, vet, stres en tydsberekening. Sel 113 , 673�. Abstrakte artikel

Barbee, S.A., Lublin, A.L. en Evans, T.C. (2002). 'N Nuwe funksie vir die Sm -proteïene tydens die lokalisering van kiemkorrels tydens C. elegans embriogenese. Curr. Biol. 12 , 1502 �. Abstrakte artikel

Bartel, D.P. (2004). MikroRNA's: genomika, biogenese, meganisme en funksie. Sel 116 , 281 �. Abstrakte artikel

Brown, V., Jin, P., Ceman, S., Darnell, J.C., O'Donnell, W.T., Tenenbaum, S.A., Jin, X., Feng, Y., Wilkinson, K.D., Keene, J.D., et al. (2001). Mikroskikkingsidentifikasie van FMRP-geassosieerde brein-mRNA's en veranderde mRNA-translasieprofiele in brose X-sindroom. Sel 107 , 477 �. Abstrakte artikel

Ciosk, R., DePalma, M. en Priess, J.R. (2004). ATX-2, die C. elegans ortoloog van ataksien 2, funksioneer in translasieregulering in die kiemlyn. Ontwikkeling 131 , 4831 �. Abstrakte artikel

Clifford, R., Lee, M.H., Nayak, S., Ohmachi, M., Giorgini, F., en Schedl, T. (2000). FOG-2, 'n nuwe F-boks wat proteïene bevat, assosieer met die GLD-1 RNA-bindende proteïen en lei manlike geslagsbepaling in die C. elegans hermafrodiet kiemlyn. Ontwikkeling 127 , 5265 �. Abstrak

Crittenden, S.L., Bernstein, D.S., Bachorik, J.L., Thompson, B.E., Gallegos, M., Petcherski, A.G., Moulder, G., Barstead, R., Wickens, M., en Kimble, J. (2002). 'N Bewaarde RNA-bindende proteïen beheer kiemlyn stamselle Caenorhabditis elegans . Natuur 417 , 660 �. Abstrakte artikel

Curtis, D., Lehmann, R., en Zamore, P.D. (1995). Vertaalregulering in ontwikkeling. Sel 81 , 171�. Abstrakte artikel

de Moor, CT, en Richter, JD (2001). Translasiebeheer in gewerwelde ontwikkeling. In die spesifikasies van die geslagslyn en die patroon van die embrio, beskryf L.D. Etkin, en K.W. Jeon, reds. (San Diego, Akademiese Pers), pp. 567�. Abstrak

Detwiler, M.R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., en Lin, R. (2001). Twee sinkvingerproteïene, OMA-1 en OMA-2, word oortollig benodig vir oösiet rypwording in C. elegans . Dev. Sel 1 , 187 �. Abstrakte artikel

Draper, B.W., Mello, C.C., Bowerman, B., Hardin, J., en Priess, J.R. (1996). MEX-3 is 'n KH-domeinproteïen wat die blastomeer-identiteit vroeg reguleer C. elegans embrio's. Sel 87 , 205 �. Abstrakte artikel

Eckmann, C.R., Crittenden, SL, Suh, N., en Kimble, J. (2004). GLD-3 en beheer van die mitose/meiose besluit in die kiemlyn van Caenorhabditis elegans . Genetika 168 , 147 �. Abstrakte artikel

Eckmann, C.R., Kraemer, B., Wickens, M., en Kimble, J. (2002). GLD-3, 'n bicaudal-C-homoloog wat FBF belemmer om geslagsbepaling van geslagslyn te beheer C. elegans . Dev. Sel 3 , 697�. Abstrakte artikel

Francis, R., Barton, M.K., Kimble, J., en Schedl, T. (1995a). gld-1 , 'n tumoronderdrukkergeen wat nodig is vir die ontwikkeling van die eiersel in Caenorhabditis elegans . Genetika 139 , 579 �. Abstrak

Francis, R., Maine, E., en Schedl, T. (1995b). Ontleding van die veelvuldige rolle van gld-1 in kiemlynontwikkeling: interaksies met die geslagsbepalingskaskade en die glp-1 seinpad. Genetika 139 , 607 �. Abstrak

Fribourg, S., Gatfield, D., Izaurralde, E., en Conti, E. (2003). 'n Nuwe manier van RBD-proteïenherkenning in die Y14-Mago-kompleks. Nat. Struktuur. Biol. 10 , 433 �. Abstrakte artikel

Fujita, M., Hawkinson, D., King, K.V., Hall, D.H., Sakamoto, H., en Buechner, M. (2003). Die rol van die ELAV-homoloog EXC-7 in die ontwikkeling van die Caenorhabditis elegans uitskeidingskanale. Dev. Biol. 256 , 290�. Abstrakte artikel

Gibert, M.A., Starck, J., en Beguet, B. (1984). Rol van die gonade sitoplasmiese kern tydens oogenese van die nematode Caenorhabditis elegans . Biol. Sel 50 , 77󈟁. Abstrak

Gomes, J.E., Encalada, S.E., Swan, K.A., Shelton, C.A., Carter, J.C., en Bowerman, B. (2001). Die moederlike geen spn-4 kodeer vir 'n voorspelde RRM -proteïen wat vroeg benodig word vir mitotiese spiloriëntasie en die ontwikkeling van selle C. elegans embrio's. Ontwikkeling 128 , 4301 �. Abstrak

Goodwin, E.B., Okkema, P.G., Evans, T.C., en Kimble, J. (1993). Translasionele regulering van tra-2 deur sy 3' onvertaalde streek beheer seksuele identiteit in C. elegans . Sel 75 , 329 �. Abstrakte artikel

Grishok, A., Pasquinelli, A.E., Conte, D., Li, N., Parrish, S., Ha, I., Baillie, D.L., Fire, A., Ruvkun, G., en Mello, C.C. (2001). Gene en meganismes wat verband hou met RNA -inmenging reguleer die uitdrukking van die klein tydelike RNA's wat beheer C. elegans ontwikkelingstydsberekening. Sel 106 , 23 󈞎. Abstrakte artikel

Gruidl, M.E., Smith, P.A., Kuznicki, K.A., McCrone, J.S., Kirchner, J., Roussell, D.L., Strome, S., en Bennett, K.L. (1996). Veelvuldige potensiële kiemlynhelikases is komponente van die kiemslyn-spesifieke P-korrels van Caenorhabditis elegans . Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. VSA 93 , 13837�. Abstrakte artikel

Hansen, D., Wilson-Berry, L., Dang, T., en Schedl, T. (2004). Beheer van die besluit oor verspreiding versus meiotiese ontwikkeling in die C. elegans kiemlyn deur regulering van GLD-1 proteïenophoping. Ontwikkeling 131 , 93�. Abstrakte artikel

Huang, N.N., Mootz, D.E., Walhout, A.J., Vidal, M., en Hunter, C.P. (2002). MEX-3 interaksie proteïene koppel selpolariteit aan asimmetriese geenuitdrukking in Caenorhabditis elegans . Ontwikkeling 129 , 747�. Abstrak

Jan, E., Motzny, C.K., Graves, L.E., en Goodwin, E.B. (1999). Die STAR-proteïen, GLD-1, is 'n translasiereguleerder van seksuele identiteit in C. elegans . EMBO J. 18 , 258�. Abstrakte artikel

Jin, S.W., Arno, N., Cohen, A., Shah, A., Xu, Q., Chen, N., en Ellis, R.E. (2001a). In Caenorhabditis elegans , is die RNA-bindende domeine van die sitoplasmiese poliadenilasie-element bindende proteïen FOG-1 nodig om kiemsellot te reguleer. Genetika 159 , 1617 �. Abstrakte artikel

Jin, S.W., Kimble, J., en Ellis, R.E. (2001b). Regulering van selbestemming in Caenorhabditis elegans deur 'n nuwe sitoplasmiese polyadenilation element bindende proteïen. Dev. Biol. 229 , 537 �. Abstrakte artikel

Johnstone, O., en Lasko, P. (2001). Translasionele regulering en RNA -lokalisering in Drosophila oosiete en embrio's. Annu. Ds Genet. 35 , 365 �. Abstrakte artikel

Jones, A.R. en Schedl, T. (1995). Mutasies in gld-1 , 'n vroulike kiemsel-spesifieke tumoronderdrukker geen in Caenorhabditis elegans , beïnvloed 'n bewaarde domein wat ook gevind word in Src-geassosieerde proteïen Sam68. Genes Dev. 9 , 1491 �. Abstrak

Karashima, T., Sugimoto, A., en Yamamoto, M. (2000). Caenorhabditis elegans homoloog van die menslike azoospermiefaktor DAZ word benodig vir oogenese, maar nie vir spermatogenese nie. Ontwikkeling 127 , 1069 �. Abstrak

Kataoka, N., Yong, J., Kim, V.N., Velazquez, F., Perkinson, R.A., Wang, F., en Dreyfuss, G. (2000). Pre-mRNA-splitsing druk mRNA in die kern in met 'n nuwe RNA-bindende proteïen wat in die sitoplasma voortduur. Mol. Sel 6 , 673�. Abstrakte artikel

Kawano, T., Kataoka, N., Dreyfuss, G., en Sakamoto, H. (2004). Ce-Y14 en MAG-1, komponente van die exon-exon-aansluitingskompleks, is nodig vir embrionese en seksuele omskakeling van kiembelyn in Caenorhabditis elegans . Mech. Dev. 121 , 27󈞏. Abstrakte artikel

Kawasaki, I., Shim, Y.H., Kirchner, J., Kaminker, J., Wood, W.B., en Strome, S. (1998). PGL-1, 'n voorspelde RNA-bindende komponent van kiemkorrels, is noodsaaklik vir vrugbaarheid in C. elegans . Sel 94 , 635 �. Abstrakte artikel

Kelly, W.G., Schaner, C.E., Dernburg, A.F., Lee, M.H., Kim, S.K., Villeneuve, A.M., en Reinke, V. (2002). X-chromosoom stil in die kiemlyn van C. elegans . Ontwikkeling 129 , 479�. Abstrak

Ketting, R.F., Fischer, S.E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G.J., en Plasterk, R.H. (2001). Dicer funksioneer in RNA-interferensie en in sintese van klein RNA betrokke by ontwikkelingstydsberekening in C. elegans . Genes Dev. 15 , 2654�. Abstrakte artikel

Kiehl, T.R., Shibata, H., en Pulst, S.M. (2000). Die ortoloog van menslike ataksien-2 is noodsaaklik vir vroeë embrionale patrone C. elegans . J. Mol. Neurosci. 15 , 231 �. Abstrakte artikel

Knight, S.W. en Bass, B.L. (2001). 'N Rol vir die RNase III-ensiem DCR-1 in RNA-interferensie en kiemlynontwikkeling in Caenorhabditis elegans . Wetenskap. 293 , 2269�. Abstrakte artikel

Kraemer, B., Crittenden, S., Gallegos, M., Moulder, G., Barstead, R., Kimble, J., en Wickens, M. (1999). NANOS-3- en FBF-proteïene reageer fisies om die inskakeling van die sperma-oosiet te beheer Caenorhabditis elegans . Curr. Biol. 9 , 1009 �. Abstrakte artikel

Kuersten, S., en Goodwin, E.B. (2003). Die krag van die 3 'UTR: translasionele beheer en ontwikkeling. Nat. Ds Genet. 4 , 626 �. Abstrakte artikel

Kuznicki, K.A., Smith, P.A., Leung-Chiu, W.M., Estevez, A.O., Scott, H.C., en Bennett, K.L. (2000). Kombinerende RNA-interferensie dui aan dat GLH-4 kan kompenseer vir GLH-1; hierdie twee P-korrelkomponente is van kritieke belang vir vrugbaarheid C. elegans . Ontwikkeling 127 , 2907�. Abstrak

Lamont, L.B., Crittenden, S.L., Bernstein, D., Wickens, M., en Kimble, J. (2004). FBF-1 en FBF-2 reguleer die grootte van die mitotiese gebied in die C. elegans kiemlyn. Dev. Sel 7 , 697�. Abstrakte artikel

Lee, M.H. en Schedl, T. (2001). Identifikasie van in vivo mRNA-teikens van GLD-1, 'n maksi-KH-motief wat proteïene bevat wat benodig word C. elegans kiemsel ontwikkeling. Genes Dev. 15 , 2408�. Abstrakte artikel

Lee, M.H., en Schedl, T. (2004). Vertalingsonderdrukking deur GLD-1 beskerm sy mRNA-teikens teen onsin-gemedieerde mRNA-verval C. elegans . Genes Dev. 18 , 1047 �. Abstrakte artikel

Loria, P.M., Duke, A., Rand, J.B., en Hobert, O. (2003). Twee neuronale, kern-gelokaliseerde RNA-bindende proteïene wat betrokke is by sinaptiese oordrag. Curr. Biol. 13 , 1317�. Abstrakte artikel

Luitjens, C., Gallegos, M., Kraemer, B., Kimble, J., en Wickens, M. (2000). CPEB-proteïene beheer twee sleutelstappe in spermatogenese in C. elegans . Genes Dev. 14 , 2596�. Abstrakte artikel

Lundquist, E.A., Herman, R.K., Rogalski, T.M., Mullen, G.P., Moerman, D.G., en Shaw, J.E. (1996). Die mec-8 geen van C. elegans kodeer 'n proteïen met twee RNA-herkenningsmotiewe en reguleer alternatiewe splitsing van unc-52 transkripsies. Ontwikkeling 122 , 1601�. Abstrak

Marin, V.A., en Evans, T.C. (2003). Vertalingsonderdrukking van a C. elegans Kerf mRNA deur die STAR/KH domein proteïen GLD-1. Ontwikkeling 130 , 2623 �. Abstrakte artikel

Mello, C.C., Draper, B.W., Krause, M., Weintraub, H., en Priess, J.R. (1992). Die pastei-1 en mex-1 gene en moederlike beheer van blastomeer identiteit in die vroeë C. elegans embrio's. Sel 70 , 163�. Abstrakte artikel

Mello, C.C., Schubert, C., Draper, B., Zhang, W., Lobel, R., en Priess, J.R. (1996). Die PIE-1 proteïen en kiemlyn spesifikasie in C. elegans embrio's. Natuur 382 , 710�. Abstrakte artikel

Milne, C.A., en Hodgkin, J. (1999). ETR-1, 'n homoloog van 'n proteïen gekoppel aan miotoniese distrofie, is noodsaaklik vir spierontwikkeling in Caenorhabditis elegans . Curr. Biol. 9 , 1243�. Abstrakte artikel

Mootz, D., Ho, D.M., en Hunter, C.P. (2004). Die STAR/Maxi-KH domein proteïen GLD-1 bemiddel 'n ontwikkelingsskakelaar in die translasionele beheer van C. elegans PAL-1. Ontwikkeling 131 , 3263�. Abstrakte artikel

Moss, E.G., Lee, R.C., en Ambros, V. (1997). Die koueskok-domeinproteïen LIN-28 beheer ontwikkelingstydsberekening in C. elegans en word gereguleer deur die lin-4 RNA. Sel 88 , 637�. Abstrak

Moss, E.G., en Tang, L. (2003). Behoud van die heterochroniese reguleerder Lin-28, sy ontwikkelingsuitdrukking en komplimentêre mikroRNA-terreine. Dev. Biol. 258 , 432�. Abstrakte artikel

Nicoll, M., Akerib, C.C., en Meyer, B.J. (1997). X-chromosoom-telmeganismes wat aalwurmseks bepaal. Natuur 388 , 200 �. Abstrakte artikel

Ogura, K., Kishimoto, N., Mitani, S., Gengyo-Ando, ​​K., en Kohara, Y. (2003). Translasionele beheer van moeder glp-1 mRNA deur POS-1 en sy interaksie proteïen SPN-4 in Caenorhabditis elegans . Ontwikkeling 130 , 2495 �. Abstrakte artikel

Puoti, A., en Kimble, J. (1999). Die Caenorhabditis elegans geslagsbepaling geen mog-1 kodeer 'n lid van die DEAH-Box-proteïenfamilie. Mol. Sel Biol. 19 , 2189 �. Abstrak

Puoti, A., en Kimble, J. (2000). Die hermafrodiet sperm/eiersel skakelaar vereis die Caenorhabditis elegans homoloë van PRP2 en PRP22. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. VSA 97 , 3276 �. Abstrakte artikel

Ryder, S.P., Frater, L.A., Abramovitz, D.L., Goodwin, E.B., en Williamson, J.R. (2004). RNA-teikenspesifisiteit van die STAR/GSG-domein post-transkripsionele regulatoriese proteïen GLD-1. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 11 , 20󈞈. Abstrakte artikel

Schisa, J.A., Pitt, J.N. en Priess, J.R. (2001). Ontleding van RNA wat verband hou met P -korrels in kiemselle van C. elegans volwassenes. Ontwikkeling 128 , 1287�. Abstrak

Schubert, C.M., Lin, R., de Vries, C.J., Plasterk, R.H., en Priess, J.R. (2000). MEX-5 en MEX-6 funksioneer om soma/kiemlyn-asimmetrie vroeg te vestig C. elegans embrio's. Mol. Sel 5 , 671 �. Abstrakte artikel

Shimada, M., Kawahara, H. en Doi, H. (2002). Nuwe familie van CCCH-tipe sinkvingerproteïene, MOE-1, -2 en -3, neem deel aan C. elegans rypwording van die eiersel. Genes selle 7 , 933�. Abstrakte artikel

Singh, G., en Lykke-Andersen, J. (2003). Nuwe insigte in die vorming van aktiewe nonsens-gemedieerde vervalskomplekse. Tendense Biochem. Wetenskaplike. 28 , 464 �. Abstrakte artikel

Skipper, M., Milne, CA, en Hodgkin, J. (1999). Genetiese en molekulêre analise van jakkals-1 , 'n tellerelement betrokke by Caenorhabditis elegans primêre geslagsbepaling. Genetika 151 , 617�. Abstrak

Spike, C.A., Davies, A.G., Shaw, J.E., en Herman, R.K. (2002).LUR-8 reguleer alternatiewe splitsing van unc-52 transkripsies in C. elegans hipodermale selle. Ontwikkeling 129 , 4999�. Abstrak

Subramaniam, K., en Seydoux, G. (1999). nrs-1 en nrs-2 , twee gene wat verband hou met Drosophila nanos , reguleer primordiale kiemselontwikkeling en oorlewing in Caenorhabditis elegans . Ontwikkeling 126 , 4861 �. Abstrak

Subramaniam, K., en Seydoux, G. (2003). Dedifferensiasie van primêre spermatosiete in kiemselgewasse in C. elegans ontbreek die pumilio-agtige proteïen PUF-8. Curr. Biol. 13 , 134�. Abstrakte artikel

Tabara, H., Hill, R.J., Mello, C.C., Priess, J.R., en Kohara, Y. (1999a). pos-1 kodeer 'n sitoplasmiese sinkvingerproteïen wat noodsaaklik is vir kiemlynspesifikasie in C. elegans . Ontwikkeling 126 , 1󈝷. Abstrak

Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W.G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A., en Mello, C.C. (1999b). Die rde-1 geen, RNA -inmenging en transposon -stilte in C. elegans . Sel 99 , 123 �. Abstrakte artikel

Tabara, H., Yigit, E., Siomi, H., en Mello, C.C. (2002). Die dsRNA-bindende proteïen RDE-4 het interaksie met RDE-1, DCR-1 en 'n DExH-bokshelikase om RNAi in te stuur C. elegans . Sel 109 , 861�. Abstrakte artikel

Tenenbaum, S.A., Carson, C.C., Lager, P.J., en Keene, J.D. (2000). Identifiseer mRNA -subgroepe in boodskapper -ribonukleoproteïenkomplekse deur cDNA -skikkings te gebruik. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. VSA 97 , 14085�. Abstrakte artikel

Tenenbaum, S.A., Lager, P.J., Carson, C.C., en Keene, J.D. (2002). Ribonomika: identifisering van mRNA-subgroepe in mRNP-komplekse met behulp van teenliggaampies teenoor RNA-bindende proteïene en genomiese skikkings. Metodes 26 , 191 �. Abstrakte artikel

Tenenhaus, C., Subramaniam, K., Dunn, MA, en Seydoux, G. (2001). PIE-1 is 'n bifunksionele proteïen wat moederlike en sigotiese gene-uitdrukking in die embrioniese kiemlyn van Caenorhabditis elegans . Genes Dev. 15 , 1031�. Abstrakte artikel

Tijsterman, M., Okihara, K.L., Thijssen, K., en Plasterk, R.H. (2002). PPW-1, 'n PAZ/PIWI-proteïen wat benodig word vir doeltreffende kiemlyn-RNAi, is gebrekkig in 'n natuurlike isolaat van C. elegans . Curr. Biol. 12 , 1535�. Abstrakte artikel

Wang, L., Eckmann, C.R., Kadyk, L.C., Wickens, M., en Kimble, J. (2002). 'n Regulerende sitoplasmiese poli(A)-polimerase in Caenorhabditis elegans . Natuur 419 , 312�. Abstrakte artikel

Wickens, M., Bernstein, D., Crittenden, S., Luitjens, C., en Kimble, J. (2001). PUF proteïene en 3'UTR regulering in die Caenorhabditis elegans kiemlyn. Cold Spring Harb. Simp. Quant. Biol. 66 , 337 �. Abstrakte artikel

Wickens, M., Goodwin, E.B., Kimble, J., Strickland, S., en Hentze, M.W. (2000). Vertaalbeheer van ontwikkelingsbesluite. In Translasionele beheer van geenuitdrukking, N. Sorenberg, J.W.B. Hershey en M.B. Mathews, red. (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 295 & # 8211370.

Xu, L., Paulsen, J., Yoo, Y., Goodwin, E.B., en Strome, S. (2001). Caenorhabditis elegans MES-3 is 'n teiken van GLD-1 en funksioneer epigeneties in kiemlynontwikkeling. Genetika 159 , 1007�. Abstrak

Yoda, A., Sawa, H., en Okano, H. (2000). MSI-1, 'n neurale RNA-bindende proteïen, is betrokke by manlike paringsgedrag in Caenorhabditis elegans . Genes selle 5 , 885�. Abstrakte artikel

Zhang, B., Gallegos, M., Puoti, A., Durkin, E., Fields, S., Kimble, J., en Wickens, M.P. (1997). 'n Bewaarde RNA-bindende proteïen wat seksuele lotgevalle in die C. elegans hermafrodiet kiemlyn. Natuur 390 , 477�. Abstrakte artikel

* Onder redaksie van Thomas Blumenthal. Laaste hersiening van 8 Februarie 2005. Gepubliseer op 18 April 2006. Hierdie hoofstuk moet aangehaal word as: Lee, M.-H. en Schedl, T. RNA-bindende proteïene (18 April 2006), Wurmboek , red. Die C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.79.1, http://www.wormbook.org.

Kopiereg: & kopie 2006 Min-Ho Lee en Tim Schedl. Dit is 'n oop toegangsartikel wat versprei word onder die voorwaardes van die Creative Commons Erkenningslisensie, wat onbeperk gebruik, verspreiding en reproduksie in enige medium moontlik maak, mits die oorspronklike outeur en bron erken word.

& sekte Aan wie korrespondensie gerig moet word. E-pos: [email protected] of [email protected]

Huidige adres: Departement Biologiese Wetenskappe, Universiteit in Albany, SUNY, Albany, NY 12222 VSA

Alle inhoud van WormBook, behalwe waar anders vermeld, is gelisensieer onder 'n Creative Commons Erkenningslisensie.