Inligting

3.6.5: Gasvesikels - Biologie

3.6.5: Gasvesikels - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

LEERDOELWITTE

  • Bespreek die rol van 'n gasvesikel met betrekking tot oorlewing.

Gasvesikels is spilvormige strukture wat in sommige planktoniese bakterieë voorkom wat dryfkrag aan hierdie selle verskaf deur hul algehele seldigtheid te verminder. Positiewe dryfvermoë is nodig om die selle in die boonste dele van die waterkolom te hou, sodat hulle kan voortgaan met fotosintese. Dit bestaan ​​uit 'n dop proteïen met 'n hoogs hidrofobiese binneoppervlak, wat dit ondeurdringbaar maak vir water (en waterdamp verhinder om binne te kondenseer), maar deurlaatbaar vir die meeste gasse. Omdat die gasvesikel 'n hol silinder is, is dit geneig om ineen te stort wanneer die omringende druk te groot word.

Natuurlike seleksie het die struktuur van die gasblasie verfyn om sy weerstand teen knik te maksimeer deur 'n eksterne versterkende proteïen, GvpC, in te sluit eerder soos die groen draad in 'n gevlegte slangpyp. Daar is 'n eenvoudige verband tussen die deursnee van die gasvesikel en die druk waarteen dit ineenstort - hoe wyer die gasvesikel, hoe swakker word dit. Breër gasblasies is egter meer doeltreffend. Hulle bied meer dryfkrag per proteïeneenheid as smal gasblasies. Verskillende spesies produseer gasblasies met verskillende diameters, waardeur hulle verskillende dieptes van die waterkolom kan koloniseer (vinnig groeiende, hoogs mededingende spesies met wye gasblasies in die boonste lae; stadiggroeiende, donker aangepaste spesies met sterk smal gasblasies in die dieper lae). Die deursnee van die gasvesikel sal ook help om te bepaal watter spesies in verskillende watermassas oorleef. Diep mere wat in die winter vermeng word, stel die selle bloot aan die hidrostatiese druk wat deur die volle waterkolom gegenereer word. Dit sal selekteer vir spesies met smaller, sterker gasblasies.

Kern punte

  • Hulle bestaan ​​uit 'n dop proteïen met 'n hoogs hidrofobiese binneoppervlak, wat dit ondeurdringbaar maak vir water (en verhinder dat waterdamp binne -in kondenseer), maar deurlaatbaar vir die meeste gasse.
  • Natuurlike seleksie het die struktuur van die gasvesikel verfyn om sy weerstand teen buiging te maksimeer, insluitend 'n eksterne versterkende proteïen, GvpC, net soos die groen draad in 'n gevlegde pyp.
  • Die deursnee van die gasvesikel sal ook help om te bepaal watter spesies in verskillende waterliggame oorleef.

3.6.5: Gasvoertuie - Biologie

Alle artikels wat deur MDPI gepubliseer word, word onmiddellik wêreldwyd beskikbaar gestel onder 'n ooptoeganglisensie. Geen spesiale toestemming word vereis om die hele of 'n gedeelte van die artikel wat deur MDPI gepubliseer is, te hergebruik nie, insluitend syfers en tabelle. Vir artikels wat onder 'n ooptoegang Creative Common CC BY-lisensie gepubliseer is, mag enige deel van die artikel sonder toestemming hergebruik word, mits die oorspronklike artikel duidelik aangehaal word.

Feature Papers verteenwoordig die mees gevorderde navorsing met 'n groot potensiaal vir 'n groot impak in die veld. Speelvraestelle word op individuele uitnodiging of aanbeveling deur die wetenskaplike redakteurs ingedien en ondergaan ewekniebeoordeling voor publikasie.

Die artikel kan óf 'n oorspronklike navorsingsartikel wees, 'n aansienlike nuwe navorsingsstudie wat dikwels verskeie tegnieke of benaderings behels, óf 'n omvattende oorsigstuk met bondige en presiese opdaterings oor die nuutste vordering op die gebied wat stelselmatig die opwindendste vooruitgang in wetenskaplike stelsels ondersoek. literatuur. Hierdie tipe papier bied 'n vooruitsig op toekomstige navorsingsrigtings of moontlike toepassings.

Editor's Choice-artikels is gebaseer op aanbevelings deur die wetenskaplike redakteurs van MDPI-tydskrifte van regoor die wêreld. Redakteurs kies 'n klein aantal artikels wat onlangs in die tydskrif gepubliseer is, wat volgens hulle besonder interessant sal wees vir skrywers, of belangrik is op hierdie gebied. Die doel is om 'n momentopname te verskaf van van die opwindendste werk wat in die verskillende navorsingsareas van die joernaal gepubliseer is.


Gasblasies kom hoofsaaklik voor in waterorganismes, aangesien dit gebruik word om die dryfvermoë van die sel te moduleer en die posisie van die sel in die waterkolom te verander, sodat dit optimaal geleë is vir fotosintese of na plekke met min of meer suurstof kan beweeg. [1] Organismes wat na die lug -vloeistofkoppelvlak kan dryf, ding mee met ander aërobies wat nie in 'n waterkolom kan opkom nie, deur suurstof in die boonste laag op te neem.

Daarbenewens kan gasblasies gebruik word om optimale soutgehalte te handhaaf deur die organisme op spesifieke plekke in 'n gestratifiseerde watermassa te plaas om osmotiese skok te voorkom. [2] Hoë konsentrasies opgeloste stof sal veroorsaak dat water deur osmose uit die sel getrek word, wat sellise veroorsaak. Die vermoë om gasblasies te sintetiseer, is een van vele strategieë waarmee halofiele organismes omgewings met 'n hoë soutinhoud kan verdra.

Gasblasies is waarskynlik een van die vroegste motiliteitsmeganismes onder mikroskopiese organismes, omdat dit die algemeenste vorm van motiliteit is wat in die genoom van prokariote bewaar is, waarvan sommige ongeveer 3 miljard jaar gelede ontwikkel het. [3] [4] Modusse vir aktiewe beweeglikheid, soos flagella -beweging, benodig 'n meganisme wat chemiese energie in meganiese energie kan omskep, en is dus baie meer kompleks en sou later ontwikkel het. Die funksies van die gasblasies word ook grootliks onder spesies bewaar, hoewel die reguleringswyse kan verskil, wat dui op die belangrikheid van gasblasies as 'n vorm van beweeglikheid. In sekere organismes soos enterobacterium Serratia sp. flagella-gebaseerde motiliteit en gasvesikelproduksie word teenoorgesteld gereguleer deur 'n enkele RNA-bindende proteïen, RsmA, wat alternatiewe wyses van omgewingsaanpassing voorstel wat in verskillende taksons sou ontwikkel het deur regulering van die ontwikkeling tussen beweeglikheid en flotasie. [5]

Alhoewel daar bewyse is wat dui op die vroeë evolusie van gasblasies, dien plasmiedoordrag as 'n alternatiewe verklaring vir die wydverspreide en bewaarde aard van die organel. [4] Splitsing van 'n plasmied in Halobacterium halobium het gelei tot die verlies van die vermoë om gasvesikels te biosinteer, wat die moontlikheid van horisontale geenoordrag aandui, wat kan lei tot 'n oordrag van die vermoë om gasvesikels te produseer tussen verskillende bakteriestamme. [6]

D) Aangepas uit Ramsay et al. (2011), met toestemming van die uitgewer.

Gasblasies is oor die algemeen suurlemoenvormige of silindriese, hol proteïenbuise met koniese kappies aan beide kante. Die vesikels wissel die meeste in hul deursnee. Groter blasies kan meer lug hou en minder proteïene gebruik, wat hulle die mees ekonomiese maak in terme van hulpbrongebruik, maar hoe groter 'n vesikel, hoe struktureler swakker is dit en hoe minder druk benodig voordat die vesikel in duie stort. Organismes het ontwikkel om die doeltreffendste te wees met proteïengebruik en gebruik die grootste maksimum vesikeldeursnee wat die druk sal weerstaan ​​waaraan die organisme blootgestel kan word. Om die natuurlike seleksie van gasblasies te beïnvloed, moet die deursnee van die vesikels deur genetika beheer word. Alhoewel gene wat vir gasvesikels kodeer, in baie spesies van haloarchaea gevind word, produseer slegs 'n paar spesies hulle. Die eerste Haloarchaeale gasvesikelgeen, GvpA, is vanaf Halobacterium sp. NRC-1. [7] 14 gene is betrokke by die vorming van gasblasies in haloarchaea. [8]

Die eerste gasvesikelgeen, GvpA, is in Calothrix geïdentifiseer. [9] Daar is ten minste twee proteïene wat 'n sianobakterie se gasvesikel saamstel: GvpA, en GvpC. GvpA vorm ribbes en 'n groot deel van die massa (tot 90%) van die hoofstruktuur. GvpA is sterk hidrofobies en kan een van die mees hidrofobiese proteïene wees wat bekend is. GvpC is hidrofiel en help om die struktuur te stabiliseer deur periodieke insluiting in die GvpA -ribbes. GvpC is in staat om uit die vesikel gewas te word en 'n gevolglike afname in die vesikel se sterkte. Die dikte van die vesikel se wand kan wissel van 1,8 tot 2,8 nm. Die geribde struktuur van die vesikel is duidelik op beide binne en buite oppervlaktes met 'n afstand van 4-5 nm tussen die ribbes. Voertuie kan 100–1400 nm lank en 45–120 nm in deursnee wees.

Binne 'n spesie is gasblaasjesgrootte relatief uniform met 'n standaardafwyking van ± 4%.

D) Aangepas uit Pfeifer (2012) en (E) van Shapiro et al. (2014), met toestemming van die uitgewer.

Dit blyk dat gasblasies hul bestaan ​​begin as klein bikoniese (twee keëls met die plat basisse saamgevoeg) wat tot die spesifieke deursnee vergroot as wat groei en hul lengte uitbrei. Dit is onbekend presies wat die deursnee beheer, maar dit kan 'n molekule wees wat GvpA inmeng of anders kan die vorm van GvpA verander.

Die vorming van gasblasies word gereguleer deur twee Gvp -proteïene: GvpD, wat die uitdrukking van GvpA- en GvpC -proteïene onderdruk, en GvpE, wat uitdrukking veroorsaak. [10] Ekstrasellulêre omgewingsfaktore beïnvloed ook vesikelvorming, hetsy deur Gvp-proteïenproduksie te reguleer of deur die vesikelstruktuur direk te versteur. [8] [11]

Ligte intensiteit Wysig

Daar is gevind dat ligintensiteit gasvesikels produksie en instandhouding verskillend beïnvloed tussen verskillende bakterieë en archaea. Vir Anabaena flos-aquaehoër ligintensiteite lei tot ineenstorting van vesikels as gevolg van 'n toename in turgordruk en 'n groter opeenhoping van fotosintetiese produkte. By sianobakterieë neem vesikelproduksie af by hoë ligintensiteit as gevolg van blootstelling van die bakteriese oppervlak aan UV-straling, wat die bakteriese genoom kan beskadig. [11]

Koolhidrate Redigeer

Ophoping van glukose, maltose of sukrose in Haloferax mediterranei en Haloferax volcanii Daar is bevind dat die uitdrukking van GvpA -proteïene en dus 'n afname in die produksie van gasvesels belemmer word. Dit het egter net by die sel se vroeë eksponensiële groeifase plaasgevind. Vesikelvorming kan ook veroorsaak word deur die ekstracellulêre glukosekonsentrasie te verminder. [12]

Suurstof wysig

Daar is gevind dat 'n gebrek aan suurstof 'n negatiewe invloed op die vorming van gasblasies in halofiele archaea het. Halobacterium salinarum produseer min of geen vesikels onder anaërobiese toestande as gevolg van verminderde sintese van mRNA -transkripsies wat vir Gvp -proteïene kodeer. H. mediterranei en H. volcanii produseer geen vesikels onder anoksiese toestande nie as gevolg van 'n afname in gesintetiseerde transkripsies wat vir GvpA kodeer en afgeknipte transkripsies wat GvpD uitdruk. [12]

PH wysig

Daar is gevind dat verhoogde ekstrasellulêre pH -vlakke die vesikelvorming in Microcytis -spesies verhoog. Onder verhoogde pH, vlakke van gvpA en gvpC transkripsies neem toe, wat meer blootstelling aan ribosome moontlik maak vir uitdrukking en lei tot 'n opregulering van Gvp -proteïene. Dit kan toegeskryf word aan groter transkripsie van hierdie gene, verminderde verval van die gesintetiseerde transkripsies of die hoër stabiliteit van die mRNA. [13]

Ultrasoniese bestraling Redigeer

Daar is gevind dat ultraklankbestraling, by sekere frekwensies, gasblasies in sianobakterieë in duie stort Spirulina platensisom te voorkom dat hulle bloei. [14]

Quorum sensing Wysig

In enterobacterium Serratia sp. stam ATCC39006, word gasvesikel slegs geproduseer as daar voldoende konsentrasie van 'n seinmolekule, N-asielhomoserienlaktoon, is. In hierdie geval tree die kworumwaarnemingmolekule, N-asiel homoserienlaktoon op as 'n morfogeen wat organelontwikkeling inisieer. [5] Dit is voordelig vir die organisme aangesien hulpbronne vir gasvesikelproduksie slegs benut word wanneer daar suurstofbeperking is wat veroorsaak word deur 'n toename in bakteriese bevolking.

Gasvesikelgeen gvpC van Halobacterium sp. word gebruik as afleweringstelsel vir entstofstudies.

Verskeie kenmerke van die proteïen wat deur die gasvesikelgeen gekodeer word gvpC toelaat dat dit as draer en byvoegmiddel vir antigene gebruik word: dit is stabiel, bestand teen biologiese afbraak, verdra relatief hoë temperature (tot 50 ° C) en nie-patogeen vir mense. [15] Verskeie antigene van verskillende menslike patogene is weer in die gvpC-gen om sub-eenheid entstowwe te skep met langdurige immunologiese reaksies. [16]

Verskillende genomiese segmente wat vir verskeie koder Chlamydia trachomatis patogene se proteïene, insluitend MOMP, OmcB en PompD, word verbind met die gvpC geen van Halobakterieë. In vitro assessering van selle toon uitdrukking van die Chlamydia-gene op seloppervlakke deur middel van verbeeldingstegnieke en toon kenmerkende immunologiese reaksies soos TLR-aktiwiteite en pro-inflammatoriese sitokiene produksie. [17] Gasvesikelgeen kan as 'n afleweringsvoertuig ontgin word om 'n potensiële entstof vir Chlamydia te genereer. Beperkings van hierdie metode sluit in die behoefte om die skade van die GvpC-proteïen self te minimaliseer terwyl soveel van die entstofteikengeen in die gvpC gene segment. [17]

'N Soortgelyke eksperiment gebruik dieselfde gasvesikelgeen en Salmonella enterica patogeen se inosien fosfaat effektor proteïen SopB4 en SopB5 afgeskei om 'n moontlike entstofvektor op te wek. Geïmmuniseerde muise skei pro-inflammatoriese sitokiene IFN-γ, IL-2 en IL-9 af. Teenliggaam IgG word ook opgespoor. Na 'n infeksie -uitdaging is daar geen of beduidend minder bakterieë in die geoes organe soos die milt en die lewer gevind nie. Potensiële entstowwe wat gasvesikels as 'n antigeenvertoning gebruik, kan via die slymvliesroete as 'n alternatiewe toedieningsweg gegee word, wat die toeganklikheid daarvan vir meer mense verhoog en 'n wyer reeks immuunresponse binne die liggaam ontlok. [15]

Gasvesikels het verskeie fisiese eienskappe wat hulle sigbaar maak op verskeie mediese beeldingsmodaliteite. [18] Die gasblaas se vermoë om lig te verstrooi, word al dekades lank gebruik om die konsentrasie daarvan te bepaal en hul ineenstortingsdruk te meet. Die optiese kontras van gasvesikels stel hulle ook in staat om as kontrasmiddels in optiese koherensie-tomografie te dien, met toepassings in oftalmologie. [19] Die verskil in akoestiese impedansie tussen die gas in hul kerns en die omliggende vloeistof gee gasvesikels robuuste akoestiese kontras. [20] Boonop genereer die vermoë van sommige gasvesikels om te buig harmoniese ultraklank-egko's wat die kontras tot weefselverhouding verbeter. [21] Laastens kan gasblasies gebruik word as kontrasmiddels vir magnetiese resonansie beelding (MRI), afhanklik van die verskil tussen die magnetiese vatbaarheid van lug en water. [22] Die vermoë om nie-indringend gasblasies te druk met drukgolwe bied 'n meganisme om hul sein uit te vee en hul kontras te verbeter. Deur die beelde voor en na akoestiese ineenstorting af te trek, kan agtergrondseine uitskakel wat die opsporing van gasvesikels verbeter.

Heterologiese uitdrukking van gasblasies in bakteriese [23] en soogdiere [24] selle het dit moontlik gemaak as die eerste familie van akoestiese verslaggeergene. [25] Terwyl fluoresserende verslaggewergene soos groen fluoresserende proteïen (GFP) wydverspreide gebruik in biologie gehad het, in vivo toepassings word beperk deur die penetrasiediepte van lig in weefsel, tipies 'n paar mm. Luminesensie kan dieper binne die weefsel opgespoor word, maar het 'n lae ruimtelike resolusie. Akoestiese verslaggewergene bied 'n sub-millimeter ruimtelike resolusie en 'n penetrasiediepte van etlike sentimeter, wat dit moontlik maak in vivo studie van biologiese prosesse diep in die weefsel.


Meting van gasvesikelafmetings deur elektronmikroskopie

Grant J. Jensen, Afdeling Biologie en Biologiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Grant J. Jensen, Afdeling Biologie en Biologiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Afdeling Biologie en Biologiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Afdeling Biologie en Biologiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Beckman Institute, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Afdeling Biologie en Biologiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Afdeling Biologie en Biologiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Departement Chemie en Biochemie, Brigham Young Universiteit, Provo, Utah, VSA

Grant J. Jensen, Afdeling Biologie en Biologiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, Kalifornië, VSA

Grant J. Jensen, Afdeling Biologie en Biologiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Mikhail G. Shapiro, Afdeling Chemie en Chemiese Ingenieurswese, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125.

Befondsingsinligting: Caltech Sentrum vir Omgewingsmikrobiese Interaksies Erfenis Mediese Navorsingsinstituut Nasionale Instituut van Gesondheid, Toekennings-/toekenningsnommers: R01-EB018975, R35-GM122588 Packard Fellowship for Science and Engineering Pew-beurs in die Biomediese Wetenskappe

Abstrak

Gasblasies (GV's) is silindriese of spilvormige proteïen-nanostrukture gevul met lug en word gebruik vir flotasie deur verskillende sianobakterieë, heterotrofiese bakterieë en Archaea. Onlangs het GV's belangstelling in biotegnologie-toepassings gekry vanweë hul vermoë om te dien as beeldmiddels en aktueerders vir ultraklank, magnetiese resonansie en verskeie optiese tegnieke. Die deursnee van GV's is 'n deurslaggewende parameter wat bydra tot hul meganiese stabiliteit, dryffunksie en evolusie in gasheerselle, sowel as hul eienskappe in beeldtoepassings. Ondanks die belangrikheid daarvan, verskil die gerapporteerde diameters vir dieselfde soorte GV, afhangende van die metode wat gebruik word vir die beoordeling daarvan. Hier gee ons 'n verduideliking vir hierdie teenstrydighede en maak gebruik van elektronmikroskopie (EM) tegnieke om die deursnee van die mees algemeen bestudeerde tipes GV's akkuraat te skat. Ons toon aan dat GV's tydens lugdroging op die EM -rooster plat, wat lei tot 'n

1,5-voudige toename in hul skynbare deursnee. Ons demonstreer dat GV's se deursnee akkuraat bepaal kan word deur direkte metings van cryo-EM monsters of alternatiewelik indirek afgelei kan word uit die breedtes van plat ineengestorte en negatief gekleurde GV's. Ons bevindinge help om die inkonsekwentheid in data wat voorheen gerapporteer is, te verduidelik en bied akkurate metodes om GV's se afmetings te meet.


Resultate

Twee verskillende metodes is toegepas om proteïen-proteïen interaksies te ondersoek. Die eerste benadering was aftrek-eksperimente wat die sellulose-bindende domein as merker gebruik, en die tweede benadering was verdeel-GFP om interaksievennote te identifiseer in vivo.

Trek-eksperimente met behulp van die sellulose bindingsdomein

Vermeende interaksies van die bykomstige proteïene GvpF tot GvpM is ondersoek deur aftrek-eksperimente met behulp van die sellulose-bindingsdomein, CBD, wat gemerkte proteïene toelaat om sellulose te bind by hoë soutkonsentrasies (2𠄳 M KCl) (Ortenberg en Mevarech, 2000 Irihimovitch en Eichler , 2003 Schlesner et al., 2012). SSK is saamgesmelt met die N- of C-terminus van elke bykomende Gvp met behulp van die vektorplasmied pCBD (Aanvullende Figuur 1). Die gevolglike CBDX of XCBD konstrukte (X = enige bykomende GvpF deur GvpM) is gebruik om te transformeer Haloferax volcanii WR340. Om te toets of die CBD-samesmeltingsproteïene inderdaad gesuiwer kan word in 2 M KCl, lysate van die onderskeie CBDX transformante is gemeng met sellulose om die CBD-gemerkte Gvp te bind, en die elueringsfraksies is ondersoek deur SDS-PAGE sowel as Westerse analise met behulp van antisera wat teen die verskillende Gvp-proteïene opgewek is (aanvullende figuur 2). Behalwe vir GvpJ en GvpM, is die bykomstige Gvp in ordentlike hoeveelhede geïsoleer (Tabel 1), en goed sigbaar in die Coomassie-gekleurde gels (Aanvullende Figuur 2). GvpJ en GvpM is in baie laer hoeveelhede verkry, vermoedelik as gevolg van hul hidrofobiese aard en neiging tot aggregasie. Aggregate van GvpJ en GvpM kan teenwoordig wees in die vaste fraksie van die selekstrakte, en die byvoeging van die skoonmaakmiddels DDM (n-dodecyl-β-D-maltoside) of OGP (oktiel-β-D-glukopiranoside) na die lysaat en wasbuffer het die teenwoordigheid van hierdie proteïene in die oplosbare fraksie effens verbeter (Tabel 1). Al die bykomende Gvp -proteïene, insluitend GvpJ en GvpM, was opspoorbaar deur Westerse analise (aanvullende figuur 2). 'N Vlek van groter bande is altyd opspoorbaar met GvpJ, wat dui op die vermoë om te versamel (aanvullende figuur 2). Dus, elkeen van die CBDGvp -proteïene is gekies en kan gesuiwer word. Om te verseker dat die ongemerkte Gvp nie interaksie het met die sellulosematriks of met CBD nie, is transformante vervaardig wat die plasmiede pCBD bevat (sonder gvp) en pX ex (gvpX-pJAS35 wat enige uitdruk gvp sonder cbd samesmelting). Nie een van die Gvp -proteïene wat getoets is, was waarneembaar in die onderskeie elueringsfraksie nie, wat bewys dat nie een van hulle aan sellulose of CBD self gebind het nie (data word nie getoon nie).

Tabel 1. Bedrag van CBDGvp herstel van 'n 400 ml kultuur deur CBD.

Die CBD-gemerkte Gvp-proteïene is as aas gebruik en getoets vir die keuse van 'n vermeende Gvp-interaksievennoot wat in dieselfde sel geproduseer word. Die eerste proteïenpaar wat getoets is, was GvpL/GvpM, waar 'n interaksie met His-gemerkte Gvp-proteïene gedemonstreer is. GvpL of GvpM het CBD saamgesmelt na die N- of C-terminus (CBDL, LCBD of CBDM, M.CBD), en die kombinasies CBDL/M, L.CBD/M, CBDM/L en M.CBD/L is ontleed. Lysate van die CBDL/M en L.CBD/M-transformante is getoets vir die teenwoordigheid van GvpM, en monomere en dimere van hierdie proteïen is deur Westerse analise geïdentifiseer (Aanvullende Figuur 3). Ook was GvpL teenwoordig in die elueringsfraksies van die CBDM/L en MCBD/L transformante wat aandui dat GvpL GvpM gebind het (aanvullende figuur 3). Hierdie resultate bevestig die GvpL/GvpM-interaksie wat reeds gesien is met behulp van die onderskeie His-tagged Gvp-proteïene en 'n Ni-NTA-matriks vir affiniteitschromatografie (Tavlaridou et al., 2014).

Soortgelyke aftrek-eksperimente met CBD is uitgevoer met alle ander bykomende Gvp-proteïene. Die onderskeie Hfx. volcanii transformante het altyd twee konstrukte gedra, een vir die aasproteïen (CBDX), en een vir die prooi GvpY (met X, Y = F, G, H, I, J, K, L of M). Beide leesrame wat aas en prooi kodeer, is onder uitgedruk Pfdx promotorbeheer om 'n soortgelyke hoë uitdrukking te verseker. Nie alle moontlike interaksies is op beide maniere uitgevoer nie (CBDX+Y en CBDY+X), aangesien proteïeninteraksies reeds met een proteïenpaar gevind is. Die resultate van hierdie studies word in Figuur 1 en opgesom in Tabel 2. Die Western blots in Figuur 1 is gerangskik volgens die antiserum wat gebruik word om die prooi proteïen op te spoor. Met behulp van CBDX om GvpM te kies het monomeriese GvpM mee opgelewer CBDH, en monomere sowel as dimere met CBDF, CBDG, CBDJ, CBDK, en CBDL (Figuur 1). Dimers en multimers van GvpM is waargeneem met CBDI (Figuur 1). GvpM is dus in al hierdie gevalle afgetrek. GvpL is gekies deur CBDF, maar die resultate verkry met CBDH of CBDEk was dubbelsinnig (Figuur 1). Wanneer egter CBDL is as lokaas gebruik, GvpM, GvpK, GvpJ of GvpG is weer gekies wat daarop dui dat al hierdie bykomstige Gvp GvpL gebind het. Sedertdien het GvpK ook interaksie gehad met enige van die bykomende Gvp CBDF deur CBDJ en CBDL afgetrek GvpK, en CBDK het GvpM teruggekry. Monomers van GvpJ is gekies deur CBDX, maar daar is 'n besmetting met bykomende GvpJ -multimere gevind CBDF, CBDH, CBDEk, CBDL, of CBDM (Figuur 1). GvpI is slegs gebruik as aas, en CBDEk het enige van die bykomende Gvp-proteïene afgetrek. Dit is interessant om daarop te let dat CBDEk het dikwels die vorming van groter oligomere geïnduseer, veral met GvpM, GvpK of GvpJ as prooi. GvpH is gekies deur CBDF of CBDEk, en CBDH het GvpG, GvpJ, GvpK, GvpL of GvpM afgetrek (Figuur 1 en Tabel 2). GvpG monomere en dimere is gekies deur CBDF, terwyl CBDH, CBDEk en CBDL het die dimeer van GvpG gekies (en bykomende multimere in die geval van CBDI) (Figuur 1). Sedert CBDG het GvpM, GvpK en GvpJ gebind, hierdie resultate het getoon dat GvpG in staat is om met alle bykomende proteïene te kommunikeer. Soortgelyke resultate is verkry met GvpF, aangesien GvpF afgetrek is deur CBDEk, en CBDF het GvpG, GvpH en GvpJ deur GvpM afgetrek (Figuur 1 en Tabel 2). Oor die algemeen het die resultate van hierdie aftrekeksperimente impliseer dat enige bykomende Gvp verskeie interaksievennote het en suggereer dat hierdie proteïene 'n groter kompleks kan vorm.

Figuur 1. Westerse ontledings van die aftrektoetse met behulp van CBDX. Die aas CBDX en die prooi proteïen Y (X, Y = enige GvpF deur GvpM proteïen) is in dieselfde gesintetiseer Hfx. vulkanii sel. Albei is bo -aan die vlekke gemerk. Slegs die elueringsfraksie van die sellulosematriks word getoon. In elke geval is 15 μL van die elueringsfraksie geskei deur SDS-PAGE, die proteïene oorgedra na 'n PVDF membraan en geïnkubeer met die onderskeie antiserum wat onderaan aangedui is (㬟 deur αM). Die vermeende interaksievennote is gevisualiseer met die fluorofoorgemerkte sekondêre teenliggaam IRDye 800 CW (Licor). Die vlekke word omgekeer na swart-wit en gerangskik volgens die onderskeie antiserum wat gebruik is. Pyle merk die verwagte Gvp monomeer en dimeer. Getalle aan die linkerkant is grootte merkers in kDa.

Tabel 2. Opsomming van die aftrekeksperimente met behulp van CBDGvp.

Toebehore Gvp Proteïene gekies deur CBDM.

Om te ondersoek of GvpM alle bykomende Gvp tegelyk kon kies, Hfx. volcanii transformante is vervaardig CBDM en daarby die plasmied pF-L wat uitdruk gvpFGHIJKL onder die sterkes Pfdx promotorbeheer. Die interaksievennote van CBDM is gekies deur aftrekeksperimente uit die lysaat van hierdie transformant, en monsters is getoets deur Westerse ontledings met behulp van die verskillende antisera (Figuur 2). Alle bykomende Gvp is geïdentifiseer, wat impliseer dat CBDM het hulle almal aangetrek. In elke geval is die onderskeie monomeriese Gvp opgespoor. In die geval van GvpG was twee 30� kDa-bande sigbaar bykomend tot die verwagte 10-kDa GvpG-proteïen, en GvpJ en GvpK het ook multimere gevorm (Figuur 2). Die monomeer van die CBDM aas proteïen is ook opgespoor (Figuur 2). Algehele, CBDM kon GvpF deur GvpL aftrek. Dit is moontlik dat elkeen van hierdie Gvp -proteïene onafhanklik gebind word CBDM, maar dit is ook moontlik dat sommige of almal 'n kompleks gevorm het wat aan GvpM gebind is.

Figuur 2. Westerse ontledings van proteïene gekies deur CBDM in CBDM/pF-L ex transformante. In elke geval is 15 μL van die elueringsfraksie geskei deur SDS-PAGE, oorgedra na 'n PVDF-membraan en geïnkubeer met die onderskeie antiserum wat onder gemerk is (㬟 tot αM). Reaksies word gevisualiseer met die fluorofoor-gemerkte sekondêre teenliggaam IRDye 800 CW (Licor). Pyle dui die verwagte Gvp -monomeer aan. Die vlekke is omgekeer na swart-wit. Getalle aan die linkerkant is grootte merkers in kDa.

Proteïen-proteïen-interaksies ondersoek deur Split-GFP

Paarsgewyse interaksies van die bykomstige Gvp-proteïene is bestudeer in Hfx. vulkanii in vivo met behulp van die split-GFP metode. Elkeen gvp leesraam is versterk deur PCR en ingevoeg in die vier vektorplasmiede om die ngfp- of cgfp leesraam na die 5′ of 3′ terminus van elk gvp (Winter et al., 2018). Die N- en C-terminale GFP-fragmente NGFP en CGFP is afkomstig van die soutaangepaste, groen fluoresserende proteïen mGFP2 (Born en Pfeifer, 2019). 'n Fluoresserende GFP word slegs gevorm wanneer die twee samesmeltingsvennote interaksie het en steriese hindernis nie voorkom nie. Die leesraamwerk van elke samesmeltingsproteïen word uitgedruk onder die Pfdx promotorbeheer om soortgelyke groot hoeveelhede van hierdie proteïene te lewer. Die vier N/CGFP -samesmeltings is aangewys NX, of CX vir die N-terminale samesmelting, en XC of XN vir die C-terminale samesmelting met Gvp (met X = onderskeie bykomstige Gvp C = CGFP N = NGFP). Die agt kombinasies van 'n proteïenpaar is getoets Hfx. vulkanii transformante en die fluoressensie is gemeet in arbitrêre ligabsorberende eenhede per mm 2 . Die hoogste relatiewe fluoressensie (rf-waardes) wat vir elke interaksiepaar bereken is, word in aanvullende figuur 4 getoon, en die oorspronklike data wat in LAU/mm 2 verkry is, word in aanvullende figuur 5. 'n Opsomming van hierdie data word in figuur 3 getoon.

Figuur 3. Interaksies van die bykomende Gvp bepaal deur split-GFP. (A) Die hoogste relatiewe fluoressensie (rf-waardes) bepaal vir die proteïen-proteïen interaksies bereken soos beskryf in die metodes afdeling. Alle eksperimente is uitgevoer met twee biologiese en drie tegniese herhalings. (B) Opsomming van die verskillende proteïen-proteïen-interaksies wat deur split-GFP bepaal is. Die Gvp-proteïene wat getoets word, word in die grys blokkie aan die linkerkant getoon, en hul interaksievennote is gerangskik volgens die hoogste rf-waarde wat bepaal is (hieronder gegee). 'N Fluoressensie wat rf > 5 oorskry, is as 'n duidelike interaksie beskou. Rf-waardes < rf 4 word as swak of geen interaksie beskou nie.

Die hoogste relatiewe fluoressensie van alle interaksies is waargeneem met die NG/CL-transformant (rf 77.5) wat 'n sterk interaksie van GvpL met GvpG impliseer (Figuur 3A). Alle ander interaksievennote van GvpL lewer rf-waardes onder 20. Rf-waardes tussen 10 en 20 is waargeneem vir die interaksie FC/NL, NEk/L.C, MC/L.N, H.N/L.C, en J.C/NL, en rf 7.4 is vir K bepaalC/NL (figure 3A, B en aanvullende figuur 5). Hierdie resultate impliseer dat die 32-kDa GvpL in wisselwerking was met alle ander bykomende Gvp. GvpL is die grootste van die bykomende Gvp en kan as platform dien om alle ander te bind. GvpF het ook interaksie gehad met verskeie Gvp -proteïene (GvpL, GvpH, GvpI en GvpG) (Figuur 3B). Die FC/L.N transformant (rf 16.6) het die hoogste relatiewe fluoressensie getoon, terwyl die ander drie bindingsvennote laer rf-waardes (rf 5.0𠄶.3) opgelewer het. In die geval van GvpF moet genoem word dat die hoogste fluoressensie altyd waargeneem is wanneer N- of CGFP met die C-terminus van GvpF versmelt is, wat daarop dui dat 'n samesmelting met die N-terminus die samestelling van mGFP2 belemmer. Die 23-kDa GvpF is kleiner as GvpL, maar beide proteïene vertoon volgordeooreenkomste en 'n soortgelyke 3D-struktuur wanneer gemodelleer deur die kristalstruktuur van die sianobakteriese GvpF as sjabloon te gebruik (Xu et al., 2014 Winter et al., 2018).

Die tweede hoogste fluoressensie (rf 20) van alle kombinasies is waargeneem vir die HC/NI-transformant (Figuur 3), wat impliseer dat GvpH en GvpI mekaar aantrek. Beide proteïene het ook interaksie gehad met GvpF en GvpL (rf 6.3). Twee vennootproteïene is geïdentifiseer vir GvpG (GvpL en GvpF), en GvpL blyk die enigste interaksievennoot van die drie proteïene GvpJ, GvpK en GvpM te wees (Figuur 3B). Oor die algemeen het hierdie resultate wat deur hierdie split-GFP-ontledings verkry is, getoon dat alle bykomende Gvp-proteïene ten minste een ander Gvp-proteïen as interaksievennoot gehad het. Aangesien GvpL almal gebind het, is dit moontlik dat hulle 'n groter kompleks vorm. In vergelyking met die resultate verkry deur affiniteitschromatografie met behulp van CBDGvp, minder interaksies is waargeneem met gesplete-GFP, veral vir die twee hidrofobiese proteïene GvpJ (12 kDa) en GvpM (9.2 kDa), en vir GvpK (12.6 kDa).

Interaksievennoot (s) van GvpA

Om interaksies tussen die belangrikste strukturele gasvesikelproteïen GvpA en hierdie bykomstige Gvp te ontbloot, is elke kombinasie van A/X (X = GvpF deur GvpM) deur split-GFP ondersoek. GvpA is by die N- of C-terminus aan N- of CGFP gesmelt en paarsgewys getoets met die onderskeie N/CGFP-fusievariante van GvpF deur GvpM. Agt verskillende kombinasies is vir elke paar ondersoek, en die hoogste rf-waardes wat in elke geval bereken is, word in Figuur 4A getoon. Die oorspronklike data wat in hierdie eksperimente verkry is, word in aanvullende figuur 6. Die hoogste relatiewe fluorescentie is verkry vir die AC/FN transformant (rf 20), terwyl alle ander transformante rf-waardes < 1 opgelewer het, wat baie swak kontakte tussen GvpA en die ander Gvp-proteïene suggereer (Figuur 4A). Behalwe NA/LC, is die hoogste fluoressensie van 'n proteïenpaar altyd waargeneem wanneer N- of CGFP met die C-terminus van GvpA versmelt is. Hierdie resultate het geïmpliseer dat GvpF die enigste interaksievennoot van GvpA is, en dat die N-terminale streek van GvpA by die interaksie betrokke kan wees.

Figuur 4. Split-GFP interaksie studies met GvpA/GvpX. Slegs die hoogste relatiewe fluorescentie wat vir elke kombinasie bepaal is, word gegee. Twee biologiese en drie tegniese herhalings is in elke geval uitgevoer. (A) Interaksiestudie van GvpA met die agt bykomstige proteïene GvpF deur GvpM. (B) Interaksie van vyf verskillende GvpA-fragmente met GvpF. (C) Volgorde van die vyf GvpA -fragmente in verhouding tot die aa -volgorde van GvpA wat bo getoon word. Getalle bo die ry beeld die aa -posisies in GvpA uit. Die helices 㬑 en 㬒 en die β-velle 㬡 en 㬢 is vetgedruk en onderaan gemerk en ook grys.

To define the interaction site of GvpF in GvpA more precisely, five GvpA fragments harboring different structural features (according to the model obtained by Strunk et al. (2011)) were studied by split-GFP. Fragment A1-22 encompasses the first 22 amino acids of GvpA including α-helix 1 (㬑), fragment A1-34 contains in addition β-sheet 1 (㬑-㬡), and A1-43 the 㬑-㬡-㬢 elements of GvpA (Figure 4C). Fragment A20-47 contains 㬡-㬢, and A44-76 the α-helix 2 up to the C-terminus of GvpA (㬒) (Figure 4C). Each of these GvpA fragments was fused at the N- or C-terminus to N- or CGFP and tested with the respective N/CGFP fusion of GvpF. Transformant FN/A1-22C yielded the highest fluorescence (rf 41), i.e., more than twice as high as obtained for the interaction of GvpF with the entire GvpA (rf 20) (Figure 4B). Smaller protein fragments offer less steric hindrance supporting the interaction (Ghosh et al., 2000 Winter et al., 2018). An increased fluorescence was also found for the transformants harboring F/A1-34 and F/A1-43 (rf 33 – 35), whereas a very low relative fluorescence (rf < 1) was obtained for the transformants harboring F/A20-47 or F/A44-76. These results implied that the C-terminal portion of GvpA is not involved, and that the N-terminal portion contains the interaction site of GvpF.

To further confine the interaction site of GvpF in GvpA, various substitution variants of GvpA were tested by split-GFP. Many of these point mutations in GvpA are known to influence the formation of gas vesicles in 㥊+Amut transformants (Strunk et al., 2011 Knitsch et al., 2017). These transformants carry two vector plasmids, the 㥊 construct (contains except gvpA almal gvp genes of the p-vac region) and construct A (gvpA or mutant gvpA expressed in pMDS20 under the control of the native PA promoter). The different GvpA variants were investigated by split-GFP analysis for their potential to interact with GvpF in Hfx. volcanii. Die FN fusion protein was used as interaction partner in all these cases (Figure 5A). The strongest reductions in relative fluorescence (rf < 6) compared to GvpA wild type (rf 15-18) were observed for the GvpA substitutions G20D, G20A, D24A, D24Y, R28A, R28D, or E40A, but also R15A, K19D, A27E, or G33V resulted in a low relative fluorescence of the F/Amut transformants (Figure 5A and Supplementary Figure 6). Especially the charged aa in 㬡 and 㬢 (D24, R28, E40) and G20 of GvpA had a strong influence on the interaction with GvpF (Figure 5). All these aa are located in the N-terminal half of GvpA, whereas any of the single substitutions in the C-terminal half had no effect on the interaction with GvpF, supporting the results described above. It is likely that these aa of GvpA are involved in the GvpF/GvpA interaction. In respect to the gas vesicle phenotype of the 㥊+Amut transformants, most of these mutations result in a Vac – phenotype, except for D24A (cylindrical) and R28A (mini gas vesicles) (Knitsch et al., 2017 Figure 5B). It is possible that the Vac – phenotype is caused by the lack of an interaction between GvpF and GvpA, rather than (or in addition to) an influence of the mutation on the GvpA/GvpA contact in the gas vesicle wall.

Figuur 5. Split-GFP studies of GvpF and variants of GvpAmut. (A) Rf-values of the GvpF/GvpA (WT) and the various F/Amut transformants. The single substitutions in GvpA are indicated below. F/Amut transformants with relative fluorescence φ are labeled in blue. The fluorescence was determined in LAU/mm 2 , and the relative fluorescence in relation to the fluorescence of Hfx. volcanii wild type calculated. Two biological and three technical replicates were performed in each case. (B). Sequence of GvpA and summary of the rf-values of the various GvpA mutants. The sequence of GvpA is presented on top and the structural features 㬑–㬡–㬢–㬒 shaded in grey. The substitutions in GvpA are summarized underneath each GvpA contains only a single substitution. Rf < 6 is regarded as weak interaction, whereas rf > 11 is similar to GvpA wild type. The Vac phenotype of the respective 㥊+Amut transformants is indicated by color: red, Vac negative green, cylinder shaped yellow, mini gas vesicles without color, wild type gas vesicles.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
Vol. 55, 2004

Abstrak

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . Lees meer

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


REACTIVE OXYGEN SPECIES: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction

Klaus Apel and Heribert Hirt
Vol. 55, 2004

Abstrak

▪ Abstract Several reactive oxygen species (ROS) are continuously produced in plants as byproducts of aerobic metabolism. Depending on the nature of the ROS species, some are highly toxic and rapidly detoxified by various cellular enzymatic and . Lees meer

Figure 1: Generation of different ROS by energy transfer or sequential univalent reduction of ground state triplet oxygen.

Figure 2: The principal features of photosynthetic electron transport under high light stress that lead to the production of ROS in chloroplasts and peroxisomes. Two electron sinks can be used to alle.

Figure 3: The principal modes of enzymatic ROS scavenging by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), the ascorbate-glutathione cycle, and the glutathione peroxidase (GPX) cycle. SOD converts hydro.

Figure 4: Schematic depiction of cellular ROS sensing and signaling mechanisms. ROS sensors such as membrane-localized histidine kinases can sense extracellular and intracellular ROS. Intracellular RO.

Figure 5: Different roles of ROS under conditions of (a) pathogen attack or (b) abiotic stress. Upon pathogen attack, receptor-induced signaling activates plasma membrane or apoplast-localized oxidase.


Types of Vesicles

Different types of vesicles are found within the cell that has a wide variety of functions.

  • Vacuoles: These are tiny lipid enclosed structures that usually contain water, and are mostly seen in plante and certain bakterieë. They are used for regulating osmotic pressure in the cell.
  • Lysosome: Lysosomes are a type of vesicle which is involved in sellulêre digestion. A lysosome contains proteolytic enzymes that can break down food molecules.
  • Peroksisome: Similar to lysosomes, peroxisomes are specialized vesicles that contain hydrogen peroxide. These vesicles are primarily involved in cellular oxidation reactions.
  • Transport vesicles: As the name suggests, these are tiny sacs enclosed by a lipid bilayer that is heavily involved in the transport of materials from and to the cell and between organelles.
  • Secretory vesicles: A type of specialized vesicle that carries substances out of the cell. They usually generate from the Golgi apparatus.
  • Synaptic vesicles: A type of specialized vesicle found in the types of neurons that store and transport neurotransmitter molecules.
  • Extracellular vesicles: Extracellular vesicles are found outside the cell and are used for transport into the cell. These type of vesicles are seen in both eukaryotic and prokaryotic cells.
  • Gas vesicles: These are found in bacteria and provide buoyancy to the cell.


The Gas Vesicle Gene Cluster from Microcystis aeruginosa and DNA Rearrangements That Lead to Loss of Cell Buoyancy

FIG. 1. Die gvp gene cluster region in M. aeruginosa and IS found in the GV-deficient mutants. (A) Strain PCC 7806 (B) strain PCC 9354. From top to bottom, names and sizes of the IS, localizations of the insertions, names of the putative genes, maps of the ORFs and their orientations, and intergenic regions (ig) in base pairs (bp) are shown. Arrows, ORFs black arrows and lines, sequenced regions grey-shaded arrows and lines, nonsequenced regions. Precise locations (with respect to the sequence submitted to DDBJ/EMBL/GenBank under no AJ577136) of the insertion elements are as follows: between nucleotides 115 and 2206 for ISMae1, between nucleotides 4033 and 4034 for ISMae2, between nucleotides 7633 and 7634 for ISMae3, and between nucleotides 8301 and 8302 for ISMae4. FIG. 2. Transcription analysis of the gvp cluster. (A) RNA blot analysis of the gvpA, gvpC, en rnpB transcripts from M. aeruginosa PCC 7806 grown under a day-night cycle (16 h-8 h). The cells were harvested for RNA extraction after 1 h of light when the culture reached OD750 = 0.4. The same blot (15 μg of total RNA per lane) was successively hybridized with different probes: a 180-bp gvpA fragment (obtained by PCR amplification with primers 635 and 636), a 400-bp gvpC fragment (amplified with primers 870 and 871), and (as a control for RNA loading and transfer) a 0.6-kb rnpB fragment (obtained by PCR with the primers mentioned in Materials and Methods). The sizes of the different transcripts are indicated in kilobases (kb). (B) RT-PCR analysis showing cotranscription between the genes of the gvp cluster. Die gvpC-N fragment was amplified with primers 893 and 973, the gvpN-J fragment was amplified with primers 975 and 1108, the gvpJ-X fragment was amplified with primers 974 and 1110, the gvpX-K fragment was amplified with primers 978 and 1109, the gvpK-F fragment was amplified with primers 1111 and 1113, the gvpF-G fragment was amplified with primers 965 and 1018, and the gvpK-G fragment was amplified with primers 965 and 1111. s, analyzed sample (with cDNA as a template) −, negative control (with RNA as a template) +, positive control (with genomic DNA as a template). A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes M.). FIG. 3 . Detection of the IS by PCR analysis of the gvp region of the wild-type (WT) and the GV-deficient mutant (M1, M2, M3, and M4) strains of M. aeruginosa. Primers used for amplification (see Table 1) were as follows: primers 1006 and 1017 for the 5′ gvpAek-5′ gvpC region, primers 1081 and 1082 for gvpV, primers 949 and 972 for gvpN, and primers 983 and 1077 for gvpW. A 1-kb DNA ladder (Invitrogen Life Technologies) was used as a size marker (lanes M.). FIG. 4 . Transcription analysis of gvp genes in the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. aeruginosa. (A) RT-PCR with the gvpA-specific primers 994 and 995 (see Table 1). The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M2 and M3) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. (B) RT-PCR results for the three genes carrying an IS (gvpN, gvpV, en gvpW) and for gvpJ en gvpX. The results for PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M3 and M2) strains and PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains are shown. Die gvpV gene was amplified with primers 1081 and 1082, gvpN was amplified with primers 949 and 972, gvpJ was amplified with primers 974 and 975, gvpX was amplified with primers 1109 and 1110, and gvpW was amplified with primers 983 and 1077. A DNA ladder (100 bp [Amersham Biosciences] or 1 kb [Invitrogen Life Technologies]) was used as a size marker (lanes M.). FIG. 5 . Immunodetection of GvpA on isolated GV and cell extracts from the wild-type and the GV-deficient mutant strains of M. aeruginosa. GV, enriched GV fraction (20 μg) from PCC 7806 wild-type strain. Other lanes show the results for crude extracts (200 μg) from PCC 7806 wild-type (WT) and mutant (M1, M2, and M3) strains and from PCC 9354 wild-type and mutant (M4) strains. FIG. 6 . Electron micrographs of the wild-type strains (A and E) and the GV-deficient mutant strains (B, C, D, and F) of M. aeruginosa. (A) PCC 7806 wild type (B) PCC 7806 M1 (C) PCC 7806 M2 (D) PCC 7806 M3 (E) PCC 9354 wild type (F) PCC 9354 M4. gv-l, GV in longitudinal section gv-c, GV in cross-section. Bars, 500 nm.

Supporting information

S1 Fig. Die sic1 mutant exhibits developmental defects in rosette leaves.

(A) The 3-week-old sic1 mutant grown on artificial soil shows growth retardation compared to Col-0. Scale bar represents 3 cm. (B) The rosette leaf number of Col-0 and sic1. Scale bar represents 2 cm. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Fig. The leaf developmental phenotype of sic1 is partially driven by root.

The images were taken on the 20th day after grafting. Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 wortel sic1/Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted plants sic1, significant ionome changes 1.

S3 Fig. CTL1 is highly conserved among different species.

Protein sequence alignment of CTL1 among different species shows CTL1 is highly conserved and the mutation site of sic1 is located in a conserved domain. And the red boxes show the TMHs. The red triangle indicates the mutation site of sic1. CTL1, choline transporter-like 1 sic1, significant ionome changes 1 TMH, transmembrane helix.

S4 Fig. The expression of CTL1 in sic1 en cher1-4.

(A) The insertion site of cher1-4 and the position of primers used in this experiment. The triangle showed the insertion site of cher1-4 and the arrows shows the positions of primers used in this experiment (B) RT-PCR analysis of CTL1 transcripts in Col-0, sic1, en cher1-4. UBC was used as an internal standard for the RT-PCR. Single PCR reactions were performed on RNA from individual plants of each genotype. (C) The qRT-PCR result of CTL1 in Col-0, sic1 en cher1-4. The data represent the means ± SE n = 3. The raw data can be found in S1 Data. Col-1, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 PCR, polymerase chain reaction qRT-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction RT-PCR, real-time polymerase chain reaction sic1, significant ionome changes 1.

S5 Fig. Genetic and transgenic complementation of developmental phenotype sic1.

(A) The 6-day-old seedlings of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines grown on agar-solidified 1/2 MS medium plate. Scale bar represents 1 cm. (B) Primary root length of Col-0, sic1, cher1-4, and complementation lines. Letters above bars indicate statistically different groups using a one-way ANOVA, followed by an LSD test at the probability of bl & lt 0,05. Data represent means ± SE, n = 10 for each genotype. (C) Root patterning of Col-0 and sic1_CO plants. Scale bars represent 50 μm. The raw data can be found in S1 Data. Col-0, Columbia-0 LSD, least significant difference sic1, significant ionome changes 1.

S6 Fig. The expression pattern of CTL1 in different tissues of A. thaliana.

(A-D) CTL1-GFP showed the expression pattern in root tip (A), root maturation zone (B and C), leaf pavement cells (D). Three independent transgenic lines were observed and showed the same expression pattern. Green channel represents CTL1-GFP signal and red channel represents propidium iodide signal. Scale bars represent 50 μm for (A) and (D). (E) The relative expression of CTL1 in the shoot and root of Col-0 plants. Data represent means ± SE, n = 3. The raw data can be found in S1 Data. CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein.

S7 Fig. CTL1 localizes to PM and endosome membrane vesicles.

(A) An enlarged view of CTL1-GFP in the root tip of Col-0 plant. Green channel shows the GFP signal and red channel shows the PI signal. Scale bar represents 10 μm. (B) Subcellular localization of CTL1-GFP after plasmolysis in Col-0 root. Green channel shows the GFP signal. Scale bar represents 50 μm. (C) CTL1 is co-localized with FM4-64 in root cells. Green channel shows the CTL1-GFP signal red channel shows the FM4-64 signal. The insets showed an enlarged view of epidermal cell. Scale bars represent 5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide PM, plasma membrane.

S8 Fig. The aggregation of NRAMP1 and PDCB proteins locate in different intracellular organelles.

(A) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP is co-localized with FM4-64 signal in sic1. (B and C) The intracellular aggregations of PDCB1-GFP (B) and PDCB2-GFP (C) are not co-localized with FM4-64 in sic1. The transgenic seedlings of sic1 background were stained with FM4-64 for 1 h and then observed in confocal microscope. Green channels represent the GFP signal, and red channels represent the FM4-64 signal. The scale bars represent 7.5 μm in (A) and 5 μm in (B and C). (D) The intracellular aggregation of NRAMP1-GFP in sic1 localized to TGN. The scale bars represent 7.5 μm. Col-0, Columbia-0 CTL1, choline transporter-like 1 GFP, green fluorescent protein FM4-64, N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide NRAMP1, natural resistance-associated macrophage protein 1 PDCB, plasmodesmata callose-binding protein sic1, significant ionome changes 1.

S9 Fig. The expression pattern of HMA4 in the roots of Col-0 and sic1.

The insets showed an enlarged view of sic1 root hair. Scale bars represent 50 μm. Col-0, Columbia-0 HMA4, heavy metal ATPase 4 sic1, significant ionome changes 1.

S10 Fig. The expression of iron uptake related genes in the roots of Col-0 and sic1.

(A-B) The expression levels of IRT1 (A) en AHA2 (B) in the roots of Col-0 and sic1. The data represent the mean ± SE, n = 3. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (bl < 0.01) calculated using Student t toets. The raw data can be found in S1 Data. AHA2, Arabidopsis H + -ATPase 2 Col-0, Columbia-0 IRT1, iron regulated transporter 1 sic1, significant ionome changes 1.

S11 Fig. The recycling of PIN1 was affected in sic1 mutant.

(A) The BFA compartments were observed after CHX and BFA treatment in Col-0 and sic1. (B) The subcellular localization of PIN1 in Col-0 and sic1 after BFA washout. Scale bars represent 20 μm. (C) The statistics analysis of percentage of cells with BFA bodies. The data represent the mean ± SE, ten seedlings of three independent transgenic lines were used in this analysis. The asterisks above the bar represent a statistically significant difference (bl < 0.01) calculated using Student t toets. The raw data can be found in S1 Data. BFA, brefeldin A CHX, cycloheximide Col-0, Columbia-0 PIN1, PIN formed 1 sic1, significant ionome changes 1.

S1 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in artificial soil.

Data represents means ± SE, bl-values were calculated by Student t toets, n = 12. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S2 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, bl-values were calculated by Student t toets, n = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S3 Table. Root ionome of Col-0 and sic1 grown in Hoagland’s solution.

Data represents means ± SE, bl-values were calculated by Student t toets, n = 7. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S4 Table. Leaf ionome of Col-0 and sic1 reciprocal grafting experiment.

Data represents means ± SE. sic1 /Col-0, grafted plants with sic1 shoot and Col-0 root Col-0/sic1, grafted plants with Col-0 shoot and sic1 root. n = 7–19. Col-0, Columbia-0 NG, non-grafted plants SG, self-grafted Col-0 sic1, significant ionome changes 1.

S5 Table. Leaf ionome of genetic complementation.

Data represents means ± S.E., n = 12 for each genotype.

S6 Table. Leaf ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ± SE, sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wild-type pSIC1::SIC1-GFP, n = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S7 Table. Root ionome of sic1 transgenic complementation.

Data represents means ±S.E., sic1 _CO1, sic1 _CO2 and sic1 _CO3, three independent transgenic complementation lines of sic1 with wildtype pSIC1::SIC1-GFP, n = 7 for each genotype. Col-0, Columbia-0 sic1, significant ionome changes 1.

S8 Table. Primers used in this study (from 5ʹ–3ʹ).

S1 data. Data used to generate the figures.


Kyk die video: (September 2022).