Inligting

Waarom veroorsaak 4-tiouracil-etikettering om RNA-bindende proteïene te karteer 'n TC-verandering?

Waarom veroorsaak 4-tiouracil-etikettering om RNA-bindende proteïene te karteer 'n TC-verandering?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek lees nou 'n artikel oor die suiwering en identifisering van mRNA's en die RNA -bindende proteïene daarvan met behulp van UV -kruising en immunopresipitasie. Ek het op hierdie sin afgekom wat my verbaas het

Tot 28% van alle uridiene wat in 3 'UTR's voorkom, toon diagnostiese T-C-veranderinge in die volgorde van die profilering van proteïenbesetting. Hierdie getal is redelik hoog, met inagneming van waarnemings dat tipies slegs een van 'n paar uridiene in RNA -bindingsplekke as vervang deur 4SU, na proteïene kruis.

Wat ek nie verstaan ​​nie, is hoekom 4-thiouracil (4SU) etikettering in die sel T-C veranderinge toon. Sou die uracil-adenien-baseparing nie geraak word nie?

Hoe werk die 4SU -etikettering werklik?


Die tegniek wat in daardie referaat gebruik word, word PAR-CLIP (Photoactivatable Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) genoem; sien Ascano et al., 2012 en Spitzer et al., 2014). Hierdie tegniek behels die vervanging van uridien (U) met 4-tiouridien (4SU) of vervanging van guanosine (G) met 6-tioguanosien (6SG). Die rede vir die gebruik van hierdie aangepaste basisse is dat dit die doeltreffendheid van RNA-proteïenverknoping verbeter. Boonop gebruik PAR-CLIP 365nm UV in plaas van die 254nm UV wat in die konvensionele kruisbinding gebruik word. Die kruisbindingsproses veroorsaak egter die verlies van die swaelatoom wat dieUgelees moet word asCtydens omgekeerde transkripsie. Net so,6SGword gelees asA.

Ascano et al., 2012


Waarom veroorsaak 4-tiourasil-etikettering om RNA-bindende proteïene te karteer 'n T-C verandering? - Biologie

Nuwe tegnologieë het sistematiese kartering van RNA-RNA-interaksies moontlik gemaak, wat tienduisende sulke interaksies onthul het.

In endogene sellulêre toestande is miRNA's en lincRNA's geneig om spesifiek een of 'n paar mRNA's te rig, wat aandui dat die hele RNA-interaksie 'n skaalvrye netwerk is.

Honderde snoRNA-gene produseer miRNA-agtige kort RNA's wat met mRNAs in wisselwerking is, en bied dus 'n geenrepertoire van nuwe regulerende RNA's.

Pseudogene en transposons produseer RNA's wat interaksie het met mRNA's, deur basisparing. Die interaksiestreke toon verhoogde bewaringsvlakke tussen spesies.

Nuwe tegnologieë het sistematiese kartering van RNA-DNA-interaksies moontlik gemaak, wat honderde chromatien-interaksie-RNA's onthul het.

Aangesien transkripsie van die menslike genoom redelik deurdringend is, is dit moontlik dat baie nuwe funksies van die niekoderende genoom nog geïdentifiseer moet word. Dikwels word die niekoderende genoom se funksies uitgevoer deur hul RNA-transkripsies, wat op hul strukture en/of uitgebreide interaksies met ander molekules kan staatmaak. Onlangse tegnologie-ontwikkelings verander die velde van RNA-biologie van die bestudering van een RNA op 'n slag tot transkripsiewye kartering van strukture en interaksies. Hier beklemtoon ons die onlangse vordering in transkriptoomwye RNA-interaksie-analise. Hierdie tegnologieë het die verrassende veelsydigheid van RNA geopenbaar om aan diverse molekulêre stelsels deel te neem. Byvoorbeeld, tienduisende RNA-RNA-interaksies is onthul in gekweekte selle sowel as in die muisbrein, insluitend interaksies tussen transkripsies en mRNA's wat deur transposon vervaardig is. Daarbenewens word die meeste transkripsiebeginplekke in die menslike genoom geassosieer met niekoderende RNA wat vanaf ander genomiese lokusse getranskribeer is. Hierdie onlangse ontdekkings het ons begrip van RNA's se rolle in chromatienorganisasie, geenregulering en intrasellulêre sein uitgebrei.


Afkortings

ADAR, adenosien deaminase wat op RNA inwerk

CHIP, chromatien immunopresipitasie

dsRBD, dubbelstrengs RNA-bindende domein

KSRP, KH-tipe splitsingsregulerende proteïen

lncRNA's, lang nie-koderende RNA's

MAPK, mitogeen-geaktiveerde proteïenkinase

PAZ, Piwi/Argonaute/Zwille

RBP's, RNA-bindende proteïene

Rhed, RNA-bindende heemdomein

RIIID, RNase III -domein

RISK, RNA-geïnduseerde stilmaakkompleks

snRNP's, klein kern ribonukleoproteïene

TDP-43, Teer DNA-bindende proteïen 43

Regulering van geenuitdrukking deur klein nie-koderende RNA's is die kern van 'n steeds groter aantal biologiese paaie en kan beslis nie deur bioloë oor die hoof gesien word nie, ongeag hul navorsingsveld. Daar is verskillende tipes klein regulatoriese RNA, wat volgens hul genomiese oorsprong of hul funksie geklassifiseer kan word. Hulle kan ook in verskillende geure kom gebaseer op die koninkryk, maar ter wille van bondigheid, sal ons net hier die verskillende families wat bestaan ​​in diere noem. Ondanks 'n paar verskille in hul biogenese, deel klein RNA's dieselfde werkingswyse. Hulle dien inderdaad as volgorde-spesifieke riglyne vir effektorproteïene, wat tot die Piwi/Argonaute (AGO) -familie behoort [1]. By laai lei hulle hulle na die beoogde teiken -RNA's. In die breë kan 'n mens twee hoofklasse van klein RNA's onderskei: (a) klein inmengende (si) RNA's, en mikro (mi) RNA's, wat gegenereer word deur die splitsing van dubbelstrengs (ds) RNA-voorlopermolekules van verskillende groottes volgens tipe III ribonukleas, ook genoem Dicer proteïene [2] en (b) kiemlyn spesifieke piwi-geassosieerde (pi) RNA's, wat nie afhanklik is van die sny van 'n dsRNA molekule nie (sien 'n oorsig [3]). Alhoewel hulle 'n paar algemene biogenese faktore deel, is siRNA's en miRNA's baie verskillend in terme van hul biologiese rol in die sel. Eersgenoemde kan gesien word as 'n verdedigingstelsel teen vreemde of ongewenste dubbelstrengs nukleïensure, terwyl die latere konstitutief uitgedruk word en belangrike rolle speel as fyninstellers van geenuitdrukking. Die fokus van hierdie oorsig is op miRNA's, en ons sal dus nie langer stilstaan ​​by si- en piRNA's nie.

Die biogenese van miRNA's, soos beskryf in Fig. 1, is 'n komplekse en kompartementele proses wat begin met die transkripsie van 'n lang primêre transkripsie genaamd pri-miRNA, wat al die kenmerke van 'n koderende mRNA bevat. Hierdie transkripsie word meestal deur RNA-polimerase II (RNA pol II) [4] uitgevoer, maar daar is sommige gevalle van virusgekodeerde miRNA's wat deur RNA-polimerase III (RNA pol III) getranskribeer word [5, 6]. By erkenning van 'n stamlus-struktuur binne die pri-miRNA deur die RNase III Drosha [7] en sy kofaktor DGCR8 [8], dit wil sê die mikroverwerkerkompleks,

65-nukleotied lang voorloper (pre) miRNA word geklief en in beheer geneem deur die Exportin 5 faktor [9] om na die sitoplasma getranslokeer te word. Daar ondergaan die pre-miRNA 'n tweede splitsingsgebeurtenis, wat deur die RNase III Dicer [10] bemiddel word, met die hulp van sy kofaktor TRBP [11]. Die gevolglike klein RNA-dupleks word dan saamgevoeg in een AGO proteïen, waar dit afgewikkel word om slegs een van die twee stringe [12] te hou, wat die volwasse, 22-nukleotiedlange miRNA word. Daar is getoon dat hierdie proses die hulp van chaperones soos Hsp90 vereis [13] . By mense is daar vier AGO -proteïene wat miRNA's sonder onderskeid kan akkommodeer (sien 'n oorsig [14]). Die AGO-proteïen gelaai met 'n miRNA, ook na verwys as RNA-geïnduseerde stilmaakkompleks (RISC) [15] , skandeer die populasie van mRNA-molekules binne die sel totdat dit 'n volgorde-passing vind. Die teikenproses is kompleks en is die onderwerp van 'n geweldige hoeveelheid werk deur verskeie groepe, en ons sal dit nie hier in besonderhede dek nie. Kortliks behels die erkenning van die doelwit deur die RISC 'n handjievol (6-8) nukleotiede wat 5 ′ van die miRNA geleë is, en die saad bedink [16]. Omdat die vereiste vir miRNA-mRNA-paring wat 'n doeltreffende regulering deur AGO tot gevolg het so beperk is, is dit geen wonder dat die oorgrote meerderheid van die koderende genoom deur miRNA's gereguleer kan word nie. Daar word inderdaad tans byna 2000 miRNA -gene aangemeld vir die mens alleen [17], en die konserwatiewe ramings is dat minstens 60% van die mRNA's miRNA -teikens is [18]. Die meganisme waarmee die miRISC sy teiken -mRNA reguleer, vereis 'n hersiening op sy eie. Dit is genoeg om te sê dat dit die werwing van 'n adapterproteïen genaamd GW182 of TNRC6 in die mens behels wat op sy beurt met 'n aantal ander proteïene sal interaksie hê wat uiteindelik sal lei tot die inhibisie van translasie-inisiasie en destabilisering van die mRNA deur deadenilering (vir 'n oorsig sien 19]).

Alhoewel ons hier die belangrikste stappe wat by die kanonieke miRNA -biogenese betrokke was, beskryf het, is daar 'n aantal alternatiewe maniere wat in die literatuur gerapporteer is waarmee hierdie klein RNA's ook volwasse kan word. Ons het reeds verwys na die betrokkenheid van RNA pol III by die transkripsie van pri-miRNA, wat tot op hede slegs in enkele virusse gerapporteer is, soos die murid herpesvirus 4 (MuHV4), wat 'n tRNA-pre-miRNA-baster wat deur tRNase volwasse is, sintetiseer. Z [6], of die beesleukemievirus [5]. Die rypwordingstap deur Drosha is nie verpligtend om 'n miRNA te maak nie; daar is 'n aantal Drosha-onafhanklike maniere om dit te sintetiseer. Die bekendste is die mirtrons, wat gegenereer word deur die splitsing van die pre-miRNA uit 'n mRNA [20, 21]. Ander miRNA's word op 'n Dicer-onafhanklike manier gegenereer, hoewel dit baie skaarser is. In hierdie geval word die pre-miRNA direk in AGO2 gelaai, wat die een arm van die haarnaald splits, voordat die gevolglike RNA verkort word deur 'n eksoribonuklease [22].

Hierdie alternatiewe paaie vir miRNA -biogenese beklemtoon die verskillende stappe wat herlei kan word en wat dus onder streng beheer deur die sel is. Gegewe die regulatoriese krag van miRNA's, is dit uiters belangrik om hul uitdrukking in toom te hou en om kwaliteitskontrole by elke stap onderweg te verseker. Ons weet nou dat regulering van die miRNA-biogenese wel plaasvind vanaf die transkripsie van die pri-miRNA tot by die stabiliteit van die finale volwasse miRNA-produk (vir 'n algemene oorsig oor miRNA-biogenese-regulering sien [23]). Hier sal ons die eerste stap van miRNA-rypwording hersien wat deur die mikroverwerkerkompleks in die kern bemiddel word. Ons sal beskryf hoe dit plaasvind voordat ons fokus op die regulering daarvan deur verskillende kofaktore wat help om sellulêre homeostase of stresreaksie te beheer. Ons sal meer spesifiek die proteïenkofaktore en hul werkingswyse uiteensit, maar onlangse bevindinge oor alternatiewe wyses van pri-miRNA verwerking regulering sal ook bespreek word.


INLEIDING

Lokalisering van mRNA's is 'n universele meganisme om die doeltreffendheid van proteïen in eukariote en prokariote doeltreffend te bestuur. Die teiken van mRNA's fasiliteer die ophoping van die plaaslik vertaalde proteïene na spesifieke sellulêre kompartemente en is dus 'n noodsaaklike meganisme om selpolariteit, patroonvorming en lotsbepaling sowel as proteïensortering te bepaal (Herbert en Costa, 2019 Hughes en Simmonds, 2019 Tian et al., 2019b, 2020.

mRNA -lokalisering vind plaas as 'n meertrap -proses. Na transkripsie, cis-werkende elemente (RNA-poskodes) word herken en gebind deur trans-werkende faktore, hoofsaaklik RNA-bindende proteïene (RBP's) om 'n primêre mRNA-nukleoproteïen (mRNP) kompleks te vorm. Na uitvoer na die sitoplasma, ondergaan die mRNP-kompleks uitgebreide opknapping met die werwing van nuwe faktore en losmaak van ander wat vervoer na sitoskeletale vervoer na die bestemmingsplek moontlik maak (Blower, 2013 Weis et al., 2013 Tian en Okita, 2014).

Alhoewel uitgebreide kennis oor mRNA lokalisering verkry is deur studies in Drosophila melanogaster, gis (Saccharomyces cerevisiae), en soogdierselle, het slegs 'n paar voorbeelde van hoër plante na vore gekom. Die beste gedefinieerde model in plante is lokalisering van proteïen-mRNA in die ontwikkeling van rys (Oryza sativa) endospermselle, waar mRNA's wat vir glutelien en prolamien kodeer, herken word deur poskode-RBP's en na twee afsonderlike kortikale endoplasmatiese retikulum (ER) subdomeine, die cisternal-ER, en proteïenliggaam-ER (PB-ER), onderskeidelik (Chou et al. , 2019 Tian et al., 2019b). Translasie van prolamien-mRNA's op die PB-ER lei tot die samestelling van prolamien intrasisternale korrels wat 'n ER-afgeleide proteïenliggaam I (PB-I) vorm, terwyl glutelienvoorlopers na die Golgi uitgevoer word en dan na proteïenopbergingsvakuole (PSV's) vervoer word. vir verwerking en berging (Chou et al., 2019 Tian et al., 2019b). Alhoewel verskeie sitbo-geassosieerde RBP's wat nodig is vir mRNA-lokalisering geïdentifiseer is (Doroshenk et al., 2009, 2012), bly inligting oor hoe hierdie mRNA's na verskillende ER-subdomeine vervoer word, steeds ontwykend.

Opkomende bewyse uit swammodelstelsels onthul die intieme verband tussen mRNA -vervoer en membraanhandel (Schmid et al., 2006 Jansen et al., 2014 Haag et al., 2015 Niessing et al., 2018). Verskeie mRNA's van gis, Candida albicans, en Ustilago maydis word saam met mobiele ER- of pendelendosome vervoer (Schmid et al., 2006 Jansen et al., 2014 Haag et al., 2015 Pohlmann et al., 2015 Niessing et al., 2018). ASH1 sowel as ander mRNA's word mede-vervoer op buisvormige ER wat na die opkomende knop of dogtersel in gis beweeg. Hierdie proses word bemiddel deur die RBP's She2p en She3p, met She2p met membraanbindende eienskappe en She3p dien as 'n adapterproteïen wat die mRNP-cER met Myo4P proteïen koppel (Schmid et al., 2006 Niessing et al., 2018). Die cdc3 mRNA word vervoer na endosome in die swamswam, U. maydis, 'n proses wat lokalisering van die RBP Rrm4 op die endosome vereis en die interaksie van 'n membraan-geassosieerde koppelproteïen Upa1 met Rrm 4 (Pohlmann et al., 2015 Niessing et al., 2018). Spesifieke adapterproteïene blyk nodig te wees om mRNP's op endosome aan te sluit vir aktiewe vervoer oor lang afstande. Daar is meer onlangs getoon dat neuronale RNA-korrels ryp op bewegende lisosome deur annexin11 as 'n ketting te gebruik (Liao et al., 2019). Alhoewel daar voorgestel word dat same-vervoer van mRNA's met membraankompartemente 'n algemene meganisme in hoër eukariote is (Jansen et al., 2014), moet nog bepaal word of die meganisme deur hoër plante gebruik word.

Vorige studies het voorgestel dat endositose en membraanhandel waarskynlik 'n rol speel in die lokalisering van mRNA in plante. Byvoorbeeld, die verlies aan funksie van die klein GTPase Rab5a en sy verwante guaniennukleotied-uitruilfaktor (GEF) het gelei tot defekte in endositose en membraanhandel en die verkeerde doelwit van glutelienproteïene na die prolamien wat PB-I bevat, sowel as die ekstrasellulêre paramurale liggaam (PMB) in rys -endospermselle (Fukuda et al., 2011 Wen et al., 2015). Aangesien bergingproteïen-teikening gereguleer word deur hul mRNA-lokalisering in rys-endospermselle, dui die verkeerde teikening van glutelienproteïene in die mutant op 'n verband tussen endosomale vervoer en glutelien-mRNA-lokalisering in rys. Die ekstrasellulêre verspreiding van glutelien-mRNA's binne VMV's vanaf 'n mutant wat 'n gebrekkige GEF uitdruk (Yang et al., 2018) ondersteun verder die moontlike betrokkenheid van endosomale handel in glutelien-mRNA-vervoer. Direkte bewyse wat die medetransport van glutelin-mRNA's met endosome verbeeld en hoe endosomale handel met glutelin-mRNA-lokalisering uitgebeeld word, moet egter nog vasgestel word. Sulke verkeerde teiken van glutelien-mRNA's in ryslyne wat mutante Rab5a en GEF uitdruk, kan bloot 'n gevolg van pleiotropie wees.

Onlangse studies (Tian et al., 2018, 2019a) het twee RBP's, RBP-P en RBP-L, geïdentifiseer wat onderskeidelik twee en drie RNA-herkenningsmotief (RRM) domeine bevat. Hierdie RBP's bind spesifiek aan die glutelien-poskode-mRNA-volgordes en reguleer glutelien-mRNA-lokalisering. In hierdie studie, met behulp van hierdie twee glutelin -poskode RBP's as toegangspunte, het ons hul interaksievennote geïdentifiseer, n -etielmaleimied -sensitiewe faktor (NSF) en die klein GTPase Rab5a, wat deelneem aan endosomale membraanhandel. Die vier proteïene kan 'n kwaternaire kompleks vorm wat glutelin -mRNA's dra vir aktiewe vervoer van endosome na die kortikale ER -membraan. Die identifisering van hierdie belangrike skakelproteïene wat endosoom-gemedieerde mRNA-vervoer in rys-endospermselle moontlik maak, bied nuwe insigte oor hoe mRNA's na spesifieke plekke in eukariote versprei kan word.


MATERIAAL EN METODES

Selkweek, DNA -konstruksies en transfeksie

Die HeLa-sellyn is verkry deur die American Type Culture Collection (ATCC, CCL-2, Manassas, VA, RRID: CVCL_0030). Sellyne is gekweek in RPMI 1640 (HeLa -selle) (Thermo Fisher Scientific, Monza MB, IT) aangevul met 10% fetale beeserum (Thermo Fisher Scientific), penisillien (100 U/ml), streptomisien (100 μg/ml) en 2 mM glutamien by 37 ° C in 5% CO2. Die plasmiede wat die rye van die HNRNPD-isoforme (p45, p42, p40 en p37) saamgesmelt het aan die FLAG-tag, was 'n geskenk van R.J. Schneider, Departement Mikrobiologie en Stralingsonkologie, NYU School of Medicine. Die plasmied wat SAF-A-FLAG kodeer wt was 'n geskenk van Nick Gilbert, MRC Menslike Genetika Eenheid, Instituut vir Genetika en Molekulêre Geneeskunde, Universiteit van Edinburgh, Crewe Road, Edinburgh, VK. Die plasmied wat die menslike GFP-RNase H1 kodeer, was 'n geskenk van Robert Joseph Crouch, Afdeling Ontwikkelingsbiologie, Eunice Kennedy Shriver Nasionale Instituut vir Kindergesondheid en Menslike Ontwikkeling, Nasionale Instituut van Gesondheid, Bethesda, MD, VSA. Om die HNRNPD-mutante te genereer, het ons in die pFLAG CMV-1-vektor gekloneer, deur EcoRI- en BamHI-plekke, die ooreenstemmende DNA's wat deur PCR geamplifiseer is deur die primers wat in Aanvullende Tabel S1 gelys is. Om die HNRNPD -mutante te genereer vir E coli uitdrukking het ons gekloneer in pET-duet-vektor, deur die EcoRI- en HindIII-terreine, die ooreenstemmende DNA's wat deur PCR versterk is deur die primers wat in die aanvullende tabel S1 gelys is. Om HeLa-sellyne te genereer wat stabiel ER-AsiSI uitdruk (17), is selle met 90% samevloeiing op 6-putjies gesaai en met 1μg pBABE ER-AsiSI getransfekteer ('n geskenk van G. Legube, Sentrum vir Integratiewe Biologie, Université Paul Sabatier, Frankryk) deur middel van Lipofectamine 2000 Reagent (Thermo Fisher Scientific). ER AsiSI-uitdrukkende selle is gekies met behulp van puromycin (Sigma Aldrich S.r.l, Milan IT) teen die voorheen geoptimaliseerde konsentrasie van 5 μg/ml. Vir die stilmaak van eksperimente is HeLa-selle getransfekteer met ON-TARGETplus Human HNRNPD siRNA Dharmacon, 30 nM siCTR (D-001810–10) of siHNRNPD (L-004079) met behulp van Dharmafect 1 volgens die vervaardiger se instruksies. ON-TARGETplus siRNA is geoptimaliseer om hoë vermindering van buite-teiken-effekte te bereik. Die HeLa HNRNPD-uitklopselle is deur die CRISPR-Cas9-stelsel gegenereer. In kort is selle getransfekteer met die pSpCas9 (BB) -2A-Puro (PX459) V2.0 (18) (geskenk van Feng Zhang, Addgene plasmied #62988) wat gids RNA's bevat wat gerig is op die HNRNPD exon twee (5'-TCCTATCACAGGGCGATCAA-3 ′) en gekies met 5μg/ml puromisien. Die gegenereerde selklone is geanaliseer deur middel van Western blot en volgordebepaling om die uitklop van HNRNPD te verifieer.Vir rekonstitusie-eksperimente het ons die PAM-weerstandige HNRNPD-isoforme gegenereer deur die QuikChange II-terreingerigte mutagenese-kit (Agilent) volgens die vervaardiger se instruksies met die primers wat in aanvullende tabel S1 aangedui word.

Die pCBASceI- en pDRGFP -plasmiede was onderskeidelik 'n geskenk van Maria Jasin, Addgene plasmied #26477 (19) en Addgene plasmied #26475 (20).

Teenliggaampies en western blot

Die volgende teenliggaampies is gebruik: HNRNPD (1: 1000, 07-260, Millipore, RRID: AB_2117338), HNRNPD (1: 1000, D6O4F, Cell Signaling, Danvers, MA, RRID: AB_2616009), RPA32 (1: 5000, A300 –244A, Bethyl Laboratories, RRID:AB_185548), RPA32 S4/S8 (1:2000, A300–245A, Bethyl Laboratories), H3 (1:1000, #9715, Selsein, RRID:AB_331563), (CHK1 S345), (CHK1 S345) 1000, #2348, Selsignaal), CHK1 (1: 1000, #2360, Selsignaal), GAPDH (1: 1000, sc-25778, Santa Cruz, Dallas), MRE11 (1: 1000, NB100–142, Novus Biological ), EXOI (1: 1000, A302–640A, Bethyl Laboratories), CtIP (1: 1000, #61142, aktiewe motief) SAF-A (1: 1000, ab10297, Abcam), RAD17 S645 (1: 2000, ab3620, Abcam), FLAG-M2 (1: 1000, F1804, SIGMA Aldrich), HA-tag (1: 500, sc-805, Santa Cruz Biotechnology), Lamin A/C (1: 1000, #4777, Cell Signal), GFP (1:5000, ab6556, Abcam), His-tag (1:1000, 05-531, Millipore). Vir totale proteïne-ekstraksie is selle gelyseer by 4 ° C in 50 mM HEPES pH7,5, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, aangevul met protease- en fosfatase-remmer cocktail (Roche Applied Science). Lysate is duidelik gemaak deur sentrifugering by 10 000 × g vir 20 minute. Lysate wat gelyke hoeveelhede proteïene bevat, beraam deur die Bradford-toets (Bio-Rad), is aan SDS-bladsy onderwerp. Die chemiluminescerende beelde is verkry met behulp van die ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare).

Immunopresipitasie

Vir ko-immunopresipitasie van proteïene, is HeLa-selle gelys in proteïenekstraksiebuffer soos vir western blot. Die proteïenlysaat is gekwantifiseer en 2 mg, vir elke toestand, is vooraf skoongemaak met proteïen G plus agarose (22851, Thermo Fischer Scientific) 45 minute by 4 ° C tydens skommeling. Immunopresipitasie is uitgevoer teen 4°C tydens skommel oornag met óf FLAG-M2 (1 μg Ab tot 1 mg proteïene, F1804, Sigma Aldrich) en sy negatiewe beheer IgG1 (BD Pharmingen™), óf HA-merker (5 μg) Ab tot 2 mg proteïene, 000000011583816001, Sigma Aldrich) en die negatiewe beheer daarvan IgG2 (550339, BD Pharmingen ™).

RPA-ssDNA/dsDNA aftrek

Biotinileerde DNA-aftrekbepaling is uitgevoer soos gerapporteer deur Yang en Zou (21) met 'n paar wysigings (sien Figuur 1). Kortliks, 87 pmol van 70 nt gebiotinileerde ssDNA is uitgegloei met 87 pmol van 21 nt ssDNA, gedeeltelik komplementêr, om die DNA-eindreseksie-tussenmiddel wat as lokaas in die proteomiese sifting gebruik word, of met dieselfde hoeveelheid ander, verskillende lengtes, ssDNA's te genereer om DNS-fragmente óf stomp óf met verskillende ssDNA-lengte te genereer. Reaksies is uitgevoer in gloeibuffer (20mM NaCl, 10mM Tris -HCl pH7.5) vir 3 minute by 90 ° C, gevolg deur inkubasie 15 minute by 37 ° C in 'n waterbad. Gegloeide DNA is vasgemaak aan streptavidien-bedekte magnetiese krale (Thermo Fisher Scientific) in bindingsbuffer (10 mM Tris – HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10% gliserol, 0,01% NP-40) vir 15 minute wieg by kam, gevolg deur inkubasie met of sonder gesuiwerde RPA by RT vir 30 min. Aan die einde van inkubasie is DNA-streptavidien-bedekte magnetiese kraalkomplekse twee keer met die bindingsbuffer gewas om die ongebonde proteïene te verwyder en daarna geïnkubeer met proteïenekstrak van HeLa verryk vir die kernfraksie by RT vir 30 min, gevolg deur twee spoelings voor westelike klad-analise of LC/MS. Die gebruikte DNA -rye word in Aanvullende Tabel S1 gelys.

Proteomiese skerm en HNRNPD-chromatienbindingsvermoë. (A) Skematiese voorstelling van die proteomiese skerm deur gebruik te maak van 'n sintetiese DNA -struktuur bedek met die heterotrimeriese RPA wt -kompleks, insluitend die 70, 32 en 14 kDa isoforme, wat as aas vir die proteomiese skerm gebruik is nadat dit uitgedaag is met HeLa -kernekstrakte. (B) DNA-aftrektoets van die sintetiese DNA-struktuur wat al dan nie bedek is met die rekombinante RPA-kompleks wat in E coli (invoer) gevolg deur Western blot -analise met die aangeduide teenliggaampies. HeLa -kernekstrak is vir 30 minute geïnkubeer met 0,3 mg/ml RNase A op ys, gevolg deur sentrifugering om puin te verwyder. (Rekse word in Aanvullende Tabel S1 gelys). (C) DNA-aftrek van die skematies aangedui biotinileerde DNA-strukture (rye word in aanvullende tabel S1 gelys). Biotien word voorgestel as swart kolletjies. Western klad analise is uitgevoer met die aangeduide teenliggaampies. Die sterretjie dui op 'n nie-spesifieke band (wat verskyn met behulp van die Millipore-teenliggaam). (D) Chromatienverrykte suiwering is uitgevoer na 2 uur behandeling met 1μM CPT gevolg deur Western blot -analise. DNase I-behandeling van die eerste korrelfraksie (P) is uitgevoer, wanneer aangedui, met 80U ensiem vir 30 minute by 30°C wat 'n nuwe supernatant en korrelfraksie (S1 en P1 onderskeidelik) ontstaan ​​het. Al die suiweringsstappe is uitgevoer na inkubasie vir 30 minute met 0,3 mg/ml RNase A op ys, gevolg deur sentrifugering om puin te verwyder. H3 en GAPDH is as merkers vir onderskeidelik die chromatien en oplosbare breuke gebruik. RAD17 S645 is gebruik as 'n DNS -skadebeheer. (E) Skematiese voorstelling van HNRNPD -verwyderingsmutante. (F) HeLa -selle is getransfekteer met die aangeduide DNA, gevolg deur 48 uur inkubasie. Chromatienverrykte suiwering is uitgevoer na 2 uur behandeling met 1μM CPT gevolg deur Western blot -analise. Al die suiweringsstappe is uitgevoer na inkubasie vir 30 minute met 0.3 mg/ml RNase A op ys, gevolg deur sentrifugering om puin te verwyder. H3 en GAPDH is gebruik as merkers vir die chromatien en oplosbare fraksies, onderskeidelik. RPA32 is gebruik as 'n DNS -skadebeheer.

Proteomiese skerm en HNRNPD -chromatienbindingsvermoë. (A) Skematiese voorstelling van die proteomiese skerm deur gebruik te maak van 'n sintetiese DNA-struktuur wat bedek is met die heterotrimeriese RPA wt-kompleks, insluitend die 70, 32 en 14 kDa isovorme, wat as lokaas vir die proteomiese skerm gebruik is nadat dit met HeLa kernekstrakte uitgedaag is. (B) DNA -toets van die sintetiese DNA -struktuur wat al dan nie bedek is met die rekombinante RPA -kompleks wat daarin vervaardig word E coli (invoer) gevolg deur Western blot -analise met die aangeduide teenliggaampies. HeLa -kernekstrak is vir 30 minute geïnkubeer met 0,3 mg/ml RNase A op ys, gevolg deur sentrifugering om puin te verwyder. (Die volgorde word in die aanvullende tabel S1 gelys). (C) DNA-aftrek van die skematies aangedui biotinileerde DNA-strukture (rye word in aanvullende tabel S1 gelys). Biotien word voorgestel as swart kolletjies. Western klad analise is uitgevoer met die aangeduide teenliggaampies. Die sterretjie dui op 'n nie-spesifieke band (wat verskyn met behulp van die Millipore-teenliggaam). (D) Chromatienverrykte suiwering is uitgevoer na 2 uur behandeling met 1μM CPT gevolg deur Western blot -analise. DNase I-behandeling van die eerste korrelfraksie (P) is uitgevoer, wanneer aangedui, met 80U ensiem vir 30 minute by 30°C wat 'n nuwe supernatant en korrelfraksie (S1 en P1 onderskeidelik) ontstaan ​​het. Al die suiweringsstappe is uitgevoer na inkubasie vir 30 minute met 0,3 mg/ml RNase A op ys, gevolg deur sentrifugering om puin te verwyder. H3 en GAPDH is as merkers vir onderskeidelik die chromatien en oplosbare breuke gebruik. RAD17 S645 is gebruik as 'n DNS -skadebeheer. (E) Skematiese voorstelling van HNRNPD -verwyderingsmutante. (F) HeLa -selle is getransfekteer met die aangeduide DNA, gevolg deur 48 uur inkubasie. Chromatienverrykte suiwering is uitgevoer na 2 uur behandeling met 1μM CPT gevolg deur Western blot -analise. Al die suiweringstappe is uitgevoer na 30 minute met inkubasie met 0,3 mg/ml RNase A op ys, gevolg deur sentrifugering om puin te verwyder. H3 en GAPDH is gebruik as merkers vir die chromatien en oplosbare fraksies, onderskeidelik. RPA32 is gebruik as 'n DNS -skadebeheer.

Selfraksionering

Selfraksionering is uitgevoer soos voorheen deur Ishii beskryf et al. met geringe wysigings (22). Kortliks, 3 × 10 6 selle, per toestand, is versamel en hersuspendeer in 200 μl CSK buffer (10 mM PYPE pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.1% Triton X-100, 0.34 M sukrose) aangevul met protease- en fosfatase-inhibeerders en 5 min op ys gehou. Die oplosbare sitoplasmiese fraksie (S) is geskei van kerne (P) deur 4 minute sentrifugering by 1300 × g by 4 ° C. Die P -fraksie is met CSK gewas en dan in 200 ul 'western blot buffer' gesuspendeer, vir 30 minute by 4 ° C by 10 000 × g gesonikiseer en gesentrifugeer. Na aanleiding van SDS-PAGE is monsters geanaliseer deur Western blot met die aangeduide teenliggaampies. Vir DNase I-behandeling is die P-fraksie geïnkubeer met 80U DNase I (Roche Applied Science, Mannheim Duitsland) vir 30 minute by 30°C, gevolg deur 30min sentrifugering by 1300 × g by 4°C om die opgeloste fraksie (S1) en pelletpaal DNase A (P1).

Immunofluorescentie en UVC mikrobestraling

HeLa -selle, gegroei op glasdeksels, is met 4% paraformaldehied vasgemaak en met 0,5% triton permeabiliseer. Monsters is 10 min in 1%BSA by RT geblokkeer en 1 uur geïnkubeer met anti-BrdU (1:200, 347580, BD Biosciences) of anti-γH2Ax S139 (1:600, 05-636, Millipore) 37°C. Na was is monsters 45 minute by 37 ° C met AlexaFluor 594-gekonjugeerde hoender-anti-konyn en 488-gekonjugeerde konyn-anti-muis of 555-gekonjugeerde bok anti-muis IgG (H+L) (Life Technologies) geïnkubeer en ontleed met 'n Zeiss LSM100 konfokale mikroskoop.

UVC-mikrobestraling is uitgevoer soos beskryf deur Suzuki et al. (23), dan is die volgende teenliggaampies gebruik vir proteïenopsporing HNRNPD (1: 200, 07-260, Millipore), γH2Ax S139 (1: 600, 05-636, Millipore).

Vloei sitometrie analise

Na 48 uur na transfeksie met siRNA, is HeLa -selle vir 2 uur behandel of nie met 1 μM camptothecin (CPT) (Sigma Aldrich) en verwerk soos gerapporteer deur Forment et al. ( 24) met enkele wysigings. Kortliks, 1 × 10 6 HeLa -selle, per toestand, is in CSK -buffer + 0,5% Triton + 0,3 mg/ml RNase A -oplossing met protease -remmers geresuspendeer en vir 5 minute op ys geïnkubeer. Aan die einde van die inkubasie is selle twee keer gewas met CSK -buffer gevolg deur sentrifugering vir 3 minute by 1300 × g by 4 ° C. Daarna is selle gefixeer met 4% paraformaldehied vir 15 minute by RT, twee keer in PBS1X gewas en hersuspendeer in 100 μl inkubasiebuffer (PBS 1× + 0.5% Saponin) vir 1 uur met, RPA (1:200, A300) -244A, Bethyl Laboratories) of γH2Ax S139 (1:200, 05-636, Millipore) by 37°C. Na twee wassinge met inkubasiebuffer, is monsters 45 minute by 37 ° C geïnkubeer met Alexa Fluor 594-gekonjugeerde hoender-anti-konyn of 488-gekonjugeerde konyn-muis (Thermo Fisher Scientific). Die persentasie positiewe selle is met behulp van die CellQuest-sagteware (Becton Dickinson) bepaal.

Die ssDNA -vormingsbepaling is uitgevoer soos voorheen gerapporteer (25) met enkele wysigings. Kortliks is HeLa-selle, 24 uur na transfeksie met die aangeduide siRNA's, vir nog 24 uur polsgemerk met 10 μM BrdU en behandel met 1 μM CPT vir 2 uur. Om die hoeveelheid geresekteerde ssDNA te kwantifiseer, het ons onder nie-denaturerende toestande gewerk. Selle is geoes deur tripsinisering. Na was met die PBS1X, is 1 × 10 6 selle vir elke eksperimentele punt in PBS 1× + 4% paraformaldehied gefixeer vir 15 min by RT gevolg deur permeabilisering met PBS 1× wat 0.1% Triton X-100 bevat vir 30 min by RT. Selle is twee keer in PBS 1× gewas en hersuspendeer in 100μl inkubasiebuffer (PBS 1× + 0.5% Saponin) met die anti-BrdU-teenliggaam (1:100, kloon B44, 347580, BD Biosciences) vir 1 uur by RT of net inkubasiebuffer as kontrole. Selle is gewas met inkubasiebuffer en hersuspendeer met 100 μl 488-gekonjugeerde konyn anti-muis (Thermo Fisher Scientific) vir 45 min by RT. Die persentasie BrdU -positiewe selle is bepaal met behulp van die CellQuest -sagteware (Becton Dickinson). Die drempelvlak wat FITC-positiwiteit identifiseer, is gestel na vergelyking met selle wat slegs met die sekondêre teenliggaam geïnkubeer is.

Kernekstrakvoorbereiding

Kernekstrakte is voorberei soos voorheen gerapporteer (26). Die kernfraksie is oornag by 4 ° C gedialiseer in 10 mM Tris – HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10% gliserol, 0,01% NP-40.

SLIM

SMART (enkelmolekule-analise van reseksiespore) is uitgevoer soos voorheen beskryf deur Cruz-Garcia et al. (27). Dieselfde aantal kontrole- en HNRNPD -stilgemaakte selle is op die skyfies opgemerk, dus vermoedelik dieselfde DNA -inhoud wat aan die skyfies geheg is, alhoewel ons dit nie beoordeel het nie. Die SMART -tegniek is egter gebruik om 'n momentopname visuele beoordeling te kry van die effek van HNRNPD -stilte op grootmaat ssDNA -hoeveelheid op CPT.

ER-AsiSI-reseksietoets

Genomiese DNA -ekstraksie en voorbereiding vir die meting van reseksie in soogdierselle is uitgevoer soos voorheen (28) beskryf met enkele wysigings. Kortliks is HeLa-selle, wat stabiel die ER-AsiSI-stelsel uitdruk (geskenk van Gaelle Legube CBI-Centre de Biologie Integrative-Toulouse), vir 4 uur behandel met of sonder 300 nM van 4-OHT (Sigma Aldrich). Selle is daarna getripsiniseer en geresuspendeer in 0,6% lae gelagarose (Sigma Aldrich) teen 'n konsentrasie van 6 x 106 selle/ml. Vyftig mikroliter selle is op 'n stuk Parafilm opgemerk om 'n soliede agarbol te vorm, wat dan in 1 ml ESP -buffer (0,5 M EDTA, 2% N-lauroylsarcosine, 1 mg/ml proteïenase-K, 1 mM CaCl2, pH 8.0) vir 20 uur by 16°C met rotasie gevolg deur behandeling met 1 ml HS-buffer (1.85 M NaCl, 0.15 M KCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 4 mM Tris, 0,5% Triton X-100, pH 7,5) vir 20 uur by 16 ° C met rotasie. Na 6X was van 10 minute elk met yskoue PBS1X (8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 133 mM KCl, 0,8 mM MgCl2, pH 7,4) by 4 ° C, is die agarbal 15 minute lank gesmelt by 70 ° C en daarna 15-voudig verdun met 70 ° C ddH2O. Die DNA is verdun met 'n gelyke volume 2X NEB 3.1 buffer. Twintig mikroliter genomiese DNA is gedurende die nag by 37 ° C verteer of bespot met 20 eenhede BamHI-HF (NEB). Vier mikroliter is gebruik as sjabloon vir die intydse kwantitatiewe PCR-reaksie (qRT-PCR) met die aangeduide primers met behulp van die SYBR Green real-time meestermengsel (Thermo Fisher Scientific). Alle qRT-PCR reaksies is uitgevoer in 'n 7900HT fast-RealTimePCR (Applied Biosystem) van 7900HT. Die ΔCt-waarde is bereken deur die Ct-waarde van die mock-verteerde monster af te trek van die Ct-waarde van die verteerde monster. Die %ssDNA = 1/(2 (ΔCt-1) +0.5) × 100 (28). Die volgorde van primers wat gebruik word, word in die aanvullende tabel S1 gelys.

Chromatien-immunopresipitasie (ChIP)

ChIP is uitgevoer soos gerapporteer deur Lee et al. (29) met 'n paar wysigings. HeLa-selle wat ER-AsiSI uitdruk, is 1 uur bespot of met 300 nM 4-OHT behandel. Selle is vir 10 minute by 37 ° C met 1% formaldehied verknoop, gevolg deur inaktivering met 0,125 M glisien. Selle is twee keer met yskoue PBS 1X vir elke toestand gewas. 1x10 6 selle is weer gesuspendeer in ChIP-lysisbuffer (50 mM Tris – HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, SDS 0.1% en protease-remmers) en geïnkubeer 10 min op ys gevolg deur sonikasie (20 s-aan/10 s-af twaalf keer by 90% van amplitude met behulp van Sonics Vibra-Cell Sonics, Newtown, CT, VSA). Lysaat is vir 30 min by 14 000 rpm by 4°C geklaar en tienvoudig verdun met die verdunningsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, SDS 0.1% en protease-inhibeerders). FLAG M2 teenliggaam (Sigma Aldrich) is gebruik om die HNRNPD p45-FLAG of SAF-A-FLAG gewig oornag by 4 ° C te immunoprecipitateer. Om die immunokompleks te isoleer, is 20 ul proteïen G plus agarose (Thermo Fisher Scientific) by elke monster gevoeg en op skommeling 45 minute by 4 ° C geïnkubeer. Die korrels is opeenvolgend met lae soutbuffer gewas (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH8, 20 mM Tris – HCl pH8, 50 mM NaCl), hoë sout buffer (0.1% SDS, 1% Triton X -100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris – HCl pH 8, 500 mM NaCl), LiCl buffer (0,25 M LiCl, 1% NP40, 1 mM EDTA pH 8, 1% deoksycholaatzuur, 10 mM Tris – HCl pH 8) en TE buffer twee keer (10 mM Tris – HCl ph8 en 1 mM EDTA) gevolg deur kruis-skakel omkering in elueringsbuffer (1% SDS en 0,1 M NaHCO3) met 270 mM NaCl by 65 ° C vir 4 uur. Proteïenvertering is uitgevoer deur 12 mM EDTA pH 8, 54 mM Tris-HCl pH 8 en 30 μg proteïenase K vir 1 uur by 45°C by te voeg. DNA is herwin deur fenol/chloroform -ekstraksie en met die aangeduide primers ontleed met behulp van 'n SYBR Green real -time meermengsel (Thermo Fisher Scientific). Alle qRT-PCR-reaksies is uitgevoer in 'n 7900HT fast-RealTimePCR (Applied Biosystems). Primers volgordes gebruik as qRT-PCR word gelys in aanvullende tabel S1 (28). Data word gerapporteer as gemiddelde ± s.d. van drie onafhanklike eksperimente. IP -doeltreffendheid is bereken as % van die immuunopgemaakte inset -DNA.

Selsiklusprofiel

Vir DNA-inhoudsanalise is selle in –koue 70% etanol by –20 ° C vasgemaak. Minstens 10 000 selle is ontleed deur FACS (Becton Dickinson) na kleuring met 5 mg/ml propidiumjodied en 0.25 mg/ml RNase A behandeling (Sigma-Aldrich). Data is ontleed deur middel van die CellQuest -sagteware (Becton Dickinson).

Kwantitatiewe intydse PCR

Totale RNA is onttrek met behulp van Trizol (Life Technologies) en behandel met TurboDNase (Life Technologies). 1 μg RNA is retro-getranskribeer met behulp van die Superscript VILO cDNA sintese kit (Life Technologies). cDNA-monsters is geamplifiseer deur intydse kwantitatiewe omgekeerde transkriptase-PCR (qRT-PCR) met behulp van SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) met die primers gelys in Aanvullende Tabel S1. Uitdrukkingsvlakke is genormaliseer na dié van die β-aktien geen. HNRNPD, MRE11, CTIP en EXOI uitdrukkingsvlakke in siHNRNPD -selle is bereken volgens die 2 –ΔΔCt -metode relatief tot siCTR -beheerselle.

Kolonievormingstoets

Vir klonogeniese toetse is 300 selle in 24-put plate gesaai en óf onbehandel óf behandel met die aangeduide dosisse CPT of olaparib (Selleckem) en vir 10 dae geïnkubeer. Kolonies is getel na fiksering met metanol en kleuring met kristalviolet.

In vitro DNA-eindreseksie-toets

Kernproteïene van HeLa wt en HNRNPD KO cl10 is gesuiwer soos hierbo beskryf vir die voorbereiding van kernekstrak, gevolg deur dialise oornag by 4°C in 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT en 0,1 mg/ml BSA. 'N DNA -plasmiedvektor is verteer met KpnI (5' -oorhange), HindIII (3' -oorhange) of EcoRV (stomp ente), gevolg deur kolomsuiwering (Qiagen, Germantown, MD, VSA).Die reaksies is uitgevoer in 'n eindvolume van 20 μl met 5 μg kernproteïene, per toestand, en 300 ng lineariseerde DNA -vektor vir die aangeduide tydspunte, gevolg deur inkubasie in 10 mM EDTA, 0,25% SDS en 100 μg/ml proteïenase K vir 10 minute by 37°C. DNA -produkte wat op 0,8% agarose geskei is, is met etidiumbromied bevlek.

DNA – RNA immunopresipitasie (DRIP)

DNA-RNA immunopresipitasie is uitgevoer soos gerapporteer deur Li et al. (15) met 'n paar wysigings. HeLa ER-AsiSI is vir 48 uur met siCTR of siHNRNPD getransfekteer, gevolg deur behandeling met 4-OHT 300 nM vir 4 uur. Vir elke toestand is 5 × 10 6 selle hersuspendeer in TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5 + 0.5 mM EDTA) + 0.5% SDS + 300 μg/ml proteïenase K a 37°C oornag onder roering. Aan die einde van die inkubasie is die DNA: RNA basters onttrek met die fenol/chloroform protokol, die neerslag is met 70% EtOH gewas en in die lug gedroog. Die korrel was resuspendend in 100 ul H2O en oornag verteer met 50 U van elk van die volgende beperkingsensieme (BsaI, BstXI, NdeI, EcoRI, EcoRV) in 1X beperkingsbuffer. DNA: RNA -basters is gesuiwer deur middel van fenol/chloroform. Die korrel is hersuspendeer in 50 μl water en behandel of skyn behandel met 15 U di RNase H (18021071, Thermo Fischer Scientific) in 'n finale volume van 100 μl en oornag by 37°C geïnkubeer. DNA:RNA basters is gesuiwer deur fenol/chloroform en hersuspendeer in 50 μl H2O. 5μg verteelde DNA is geïnkubeer met 10 μg S9.6 teenliggaam (ENH001, Kerafast) in bindingsbuffer (10 mM Tris – HCl ph 7.5, 1 mM EDTA, 10 mM NaPO4, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100) oornag by 4 ° C. Aan die einde van inkubasie het ons 20 μl proteïen G plus agarose (22851, Thermo Fischer Scientific) bygevoeg vir 2 uur by 4°C op skommel, drie keer gewas met bindingsbuffer en elutie van immunokomplekse met vyf keer proteïen G volume met 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, 500 μg/ml proteïnase K vir 45 min by 55°C. DNA: RNA -basters is met die fenol/chloroform -protokol gesuiwer en in 50 μl H gesuspendeer2O. Vier mikroliter is gebruik as sjabloon vir die intydse kwantitatiewe PCR-reaksie (qRT-PCR) met primers wat 'n gebied versterk wat ∼ 600 bp is van die AsiSI-geïnduseerde DSB-terrein (gelys in Aanvullende Tabel S1 DSB-F/R ChIP en DRIP) met behulp van die SYBR Green intydse meestermengsel (Thermo Fisher Scientific).

RPA -kompleks kloning en suiwering

Molekulêre kloning van die wt RPA kompleks is uitgevoer in pET-duet vektor met die primers gelys in die Aanvullende Tabel S1. Suiwering van wt RPA is uitgevoer soos voorheen gerapporteer (30). Kortliks, wt RPA is in BL21 DE3 (Rosetta) getransformeer, gevolg deur induksie met 300 μM IPTG vir 4 uur. Die bakteriese korrel is hersuspendeer in lisis buffer (50 mM NaH2PO4 pH 7, 300 mM NaCl, 15 mM Imidazool en 10% gliserol gevolg deur sonikasie). Die Ni-NTA-hars is gebruik vir affiniteitsuiwering vir 2 uur by 4 ° C. Aan die einde van die inkubasietyd is die hars ses keer gewas met 10 mM Tris – HCl pH 8, 300 mM NaCl en skalaarkonsentrasie van imidasool van 10 mM tot 60 mM. Die RPA -kompleks is geëlueer met 10 mM Tris -HCl pH 8, 300 mM NaCl en 300 mM imidasool. Die dialise is oornag by 4 ° C uitgevoer met 100 mM NaCl, 10 mM Tris – HCl pH 7,5, 10% gliserol en 0,01% NP40.

Homoloë rekombinasie verslaggewer toets

HeLa-selle wat stabiel die verslaggewerplasmied pDR-GFP uitdruk, is met die pDR-GFP-plasmied (20) (geskenk van Maria Jasin, Addgene-plasmied #26475) getransfekteer en met puromycin gekies. HeLa pDRGFP sellyne is mede-getransfekteer met die koderende plasmied vir die endonuklease I-SceI (pCBA SceI, 'n geskenk van Maria Jasin, Addgene plasmied #26477(19) en die siCTR, siHNRNPD of siMRE11 (L-009271, Dharmacon). Na 48 uur inkubasie ontleed ons die GFP -waardes (as 'n uitlees van HR -frekwensie) deur middel van die FACS -analise.

Identifikasie deur LC–MS/MS

Peptiedvolgordebepaling is op 'n Nano-skaal uitgevoer deur LC–ESI/MS–MS (31). LC–MS-stelsel bestaan ​​uit PHOENIX 40 (ThermoQuest Ltd., Hemel Hempstead, VK) gekoppel aan LCQ DECA Ion-Trap massaspektrometer (Finnigan, San Jose, CA, VSA). Twintig mikroliter oplossings wat deur trypsien verteer is, is ingespuit in 'n klep met ses poorte en is vasgevang in 'n C18-opvangkolom (20 mm × 100 μm ID × 360 μm OD, Nano-skeidings, Nieuwkoop, NL) met behulp van 100% HPLC-kwaliteit water + 0.1% v/v mieresuur (oplosmiddel A) teen 'n vloeitempo van 5 μl/min vir 10 min. 'N Voorkolomverdelingsbeperking het die vloeitempo op 100-125 nl/min op 'n C18-analitiese kolom (30 cm × 50 μm ID × 360 μm OD, Nano-skeidings) gestel. Analitiese skeiding is uitgevoer met behulp van 'n lineêre gradiënt tot 60% asetonitril + 0.1% (v/v) mieresuur (oplosmiddel B) vir 60 min. Aan die einde van die skeiding is vang- en analitiese kolomme vir 10 minute in 100% oplosmiddel B gewas en 10 minute lank in 100% oplosmiddel A in ewewig gebring. 'N ESI-naald, saamgestel uit goudbedekte gesmelte silika (5 cm × 25 μm ID × 360 μm OD, Nano-skeidings), is verhit tot 195 ° C en 2 kV is toegedien vir 'n stabiele bespuiting. Xcalibur™ 1.2-sagteware (Thermo) het die LC-pomp en die outomatiese spektrale opname bestuur. MS/MS ioonsoektog is uitgevoer in Swiss-Prot/UniprotKB databasisse met behulp van MASCOT. Ons stel Homo sapiens as taksonomie, peptiedvoorloper -lading by 2+ of 3+, massatoleransie by ± 1,2 Da vir voorloperpeptied en ± 0,6 Da vir fragmentpeptiede, slegs een gemiste splitsingsplek as aanvaarbaar, carbamidomethylation van cystein as vaste modifikasie, en metionienoksidasie as moontlik wysiging. Peptiede met individuele ioon tellings –10*log [P] is as beduidend beskou. Die massaspektrometrie-proteomika-data is aan die ProteomeXchange-konsortium gedeponeer via die PRIDE ( 32) vennootbewaarplek met die datastel-identifiseerder PXD012045 en 10.6019/PXD012045.

Statistiese analise en reproduceerbaarheid

Gepaarde tweesydige studente t toets is gebruik om die middel van twee ooreenstemmende groepe te vergelyk P & lt 0,05 is as statisties beduidend beskou. Verteenwoordigende eksperimente word getoon uit ten minste twee onafhanklike gedetailleerde inligting (aantal onafhanklike eksperimente, P-waardes) word in die individuele figuurlegendes gelys.


RESULTATE

C6orf203 het 'n voorspelde S4-agtige RNA-bindende domein

BLAST-analise het 'n S4-agtige RNA-bindende domein binne die menslike C6orf203-proteïen aan die lig gebring (Figuur 1A). Hierdie domein het sy naam ontvang deur sy aanvanklike identifikasie in die prokariotiese integrale ribosomale proteïen S4 (RPS4) (14). RPS4 bind aan 16S rRNA in die rypwordende 30S subeenheid van die bakteriële ribosoom, en bevorder korrekte rRNA vou tydens ribosomale subeenheid samestelling (21), sowel as binding aan sy eie mRNA om translasie te onderdruk (22). Die RPS4-proteïen bestaan ​​uit twee RNA-bindende domeine (Figuur 1A), wat albei uitgebreide kontakte met rRNA in die 30S-subeenheid vorm (23). Dit is egter die C-terminale domein van RPS4, wat die S4-agtige RNA-bindingsdomein genoem word, wat bewaring aan die C-terminale domein van C6orf203 demonstreer (Figuur 1A). Vergelyking van die voorspelde vou van die S4-agtige RNA-bindende domein van C6orf203 met die voorheen opgelosde S4-agtige RNA-bindende domein van Escherichia coli RPS4 (PDB: 3J9Y) dui op strukturele bewaring tussen die twee domeine (Figuur 1B en C), gekenmerk deur 'n α-heliese bondel wat teen anti-parallelle β-velle (23) verpak is.

C6orf203 bevat 'n S4-agtige RNA-bindende domein (A). Domeinargitektuur van 'n diverse seleksie van proteïene wat S4-agtige RNA-bindende domeine bevat, insluitend Homo sapiens C6orf203 (Q9P0P8), Escherichia coli 30S ribosomale proteïen S4 (RPS4) (P0A7V8), Clostridium sporogenes NJ4 rRNA methyltransferase (A0A2P8MJ46), E coli tyrosiel-tRNA sintetase (P0AGJ9) en Saccharomyces cerevisiae bifunksionele proteïen RIB2 pseudouridinesintetase (Q12362). Proteïene is in lyn gebring met betrekking tot hul S4-agtige domein (blou) met ekstra funksionele domeine wat vir elke proteïen aangedui word. Addisionele funksionele domeine: NS4/S9 – N-terminaal S4/S9 RNA bindingsdomein FtsJ, FtsJ-agtige metieltransferase tRNA sint, tRNA sintetase klas I domein (W en Y), PseudoU sint, RNA pseudouridylaat sintetase. (B) Voorheen opgeloste struktuur van E coli ribosomale proteïen S4 (PDB: 3J9Y). Die C-terminale S4-agtige RNA-bindende domein word vergroot en geel gemerk. (C) Strukturele voorspelling van die S4-agtige RNA-bindende domein van menslike C6orf203. Voorspelling is gegenereer in SWISS-MODEL (38) met behulp van die primêre volgorde residue 143-216 van menslike C6orf203 (Q9P0P8), en gemodelleer in USCF Chimera (39). (D) Meervoudige proteïenvolgordebelyning van die S4-agtige RNA-bindende domein van verskeie familielidproteïene, insluitend H. sapiens C6orf203. Die belyning van die proteïenvolgorde is gemaak met behulp van Clustal Omega (40). Die bewaarde posisies word ingekleur deur die 80% konsensusreël te gebruik. Die aminosuurklasse wat gebruik is om die konsensus te bou, was soos volg: rooi, polêre residu's groen, hidrofobiese residue grys bokse, klein residue. Name van die proteïene is soos toegewys in UniProt: RPS4_E coli: ribosomale proteïen S4, Escherichia coli (P0A7V8) RS4 (chloroplast) _M. palacea: chloroplast ribosomale proteïen S4, Marchantia paleacea (P06358) RPS9_H. sapiens: 40S ribosomale proteïen S9, Homo sapiens (P46781) rRNA -metielase_C. sporogenes: rRNA -metieltransferase, Clostridium sporogenes (A0A2P8MJ46) TyrS_E coli: Tyrosyl-tRNA sintetase, Escherichia coli (P0AGJ9) RIB2_S. cerevisiae: RIB2, Saccharomyces cerevisiae (V12362). (E) RNA elektroforetiese mobiliteitsverskuiwingstoets (EMSA) wat die voorkeur van C6orf203 aandui vir die binding van dubbelstrengs RNA. Rekombinante menslike C6orf203 is geïncubeer met fluoresceïen-gemerkte RNA's (100 nM). RNA-sjabloonvolgordes wat gebruik is, was soos aangedui (nt. posisie in mtDNA). Die proteïenkonsentrasies wat gebruik is, was onderskeidelik 0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.36, 0.64, 1.28, 2.56 μM. (F) Kwantifisering van die verhouding van ongebonde RNA -ligand relatief tot geen byvoeging van C6orf203 -proteïen, soos in figuur 1E. Dissosiasie konstante (Kd) van RNA-ligand met C6orf203 word aangedui vir eksperimente waar dit bepaal kon word.

C6orf203 bevat 'n S4-agtige RNA-bindende domein (A). Domeinargitektuur van 'n diverse seleksie proteïene wat S4-agtige RNA-bindende domeine bevat, insluitend Homo sapiens C6orf203 (Q9P0P8), Escherichia coli 30S ribosomale proteïen S4 (RPS4) (P0A7V8), Clostridium sporogenes NJ4 rRNA metieltransferase (A0A2P8MJ46), E coli tyrosiel-tRNA sintetase (P0AGJ9) en Saccharomyces cerevisiae bifunksionele proteïen RIB2 pseudouridinesintetase (Q12362). Proteïene is in lyn gebring met betrekking tot hul S4-agtige domein (blou) met ekstra funksionele domeine wat vir elke proteïen aangedui word. Bykomende funksionele domeine: NS4/S9-N-terminale S4/S9 RNA-bindingsdomein FtsJ, FtsJ-agtige metieltransferase tRNA-sint, tRNA-sintetase klas I-domein (W en Y), PseudoU-sint, RNA-pseudouridilaat sintetase. (B) Voorheen opgeloste struktuur van E coli ribosomale proteïen S4 (PDB: 3J9Y). Die C-terminale S4-agtige RNA-bindende domein word vergroot en geel gemerk. (C) Strukturele voorspelling van die S4-agtige RNA-bindende domein van menslike C6orf203. Voorspelling is gegenereer in SWISS-MODEL (38) met behulp van die primêre volgorde residue 143-216 van menslike C6orf203 (Q9P0P8), en gemodelleer in USCF Chimera (39). (D) Meervoudige proteïenvolgordebelyning van die S4-agtige RNA-bindende domein van verskeie familielidproteïene, insluitend H. sapiens C6orf203. Die belyning van die proteïenvolgorde is gemaak met behulp van Clustal Omega (40). Die bewaarde posisies word ingekleur deur die 80% konsensusreël te gebruik. Die aminosuurklasse wat gebruik is om die konsensus te bou, was soos volg: rooi, polêre residu's groen, hidrofobiese residue grys bokse, klein residue. Die name van die proteïene is soos toegeken in UniProt: RPS4_E coli: ribosomale proteïen S4, Escherichia coli (P0A7V8) RS4 (chloroplast) _M. palacea: chloroplast ribosomale proteïen S4, Marchantia paleacea (P06358) RPS9_H. sapiens: 40S ribosomale proteïen S9, Homo sapiens (P46781) rRNA methylase_C. sporogenes: rRNA metieltransferase, Clostridium sporogenes (A0A2P8MJ46) TyrS_E coli: Tyrosyl-tRNA sintetase, Escherichia coli (P0AGJ9) RIB2_S. cerevisiae: RIB2, Saccharomyces cerevisiae (Q12362). (E) RNA elektroforetiese mobiliteitsverskuiwingstoets (EMSA) wat die voorkeur van C6orf203 aandui vir die binding van dubbelstrengs RNA. Rekombinante menslike C6orf203 is geïncubeer met fluoresceïen-gemerkte RNA's (100 nM). RNA-sjabloonvolgordes wat gebruik is, was soos aangedui (nt. posisie in mtDNA). Die proteïenkonsentrasies wat gebruik is, was onderskeidelik 0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.36, 0.64, 1.28, 2.56 μM. (F) Kwantifisering van proporsie ongebonde RNA-ligand relatief tot geen byvoeging van C6orf203-proteïen, soos in Figuur 1E. Dissosiasie konstante (Kd) van RNA-ligand met C6orf203 word aangedui vir eksperimente waar dit bepaal kon word.

Die S4-agtige RNA-bindingsdomein bestaan ​​uit 60-65 aminosure, met sleutelreserwes wat RNA-binding koördineer (Figuur 1D). Die S4-agtige domein is gevind in 'n diverse reeks RNA-interaksie proteïene oor verskillende spesies. Die presiese ligging van die S4-agtige domein kan wissel binne proteïenvolgorde en word dikwels gevind in kombinasie met bykomende funksionele proteïendomeine, insluitend dié wat ensiematiese aktiwiteit verleen (Figuur 1A). Belyning van primêre rye proteïene oor filogenie is uitgevoer om die diversiteit van S4-agtige domein wat proteïene bevat, aan te toon: H. sapiens ribosomale proteïen S9, E coli tyrosiel-tRNA sintetase, Marchantia paleacea chloroplast ribosomale proteïen S4, C. sporogenes rRNA metieltransferase, S. cerevisiae bifunksionele proteïen RIB2 pseudouridylate synthase (Figuur 1A en D). Die S4-agtige domein bied RNA-bindingsvermoë aan hierdie proteïene, wat die funksionele domeine na hul verwante RNA's posisioneer (14). Alhoewel die biologiese rol van hierdie ekstra domeine in baie van hierdie proteïene gekenmerk is (Figuur 1A), is ons pogings om voorheen gekenmerkde funksionele domeine in C6orf203 te voorspel, afgesien van die S4-agtige domein, deur middel van BLAST search of iTASSER voorspelling (Iterative Threading ASSEmbly Refinement (24)), was onsuksesvol.

Met bewyse wat daarop dui dat C6orf203 'n funksionele S4-agtige RNA-bindingsdomein bevat, het ons probeer vasstel of rekombinante menslike C6orf203 die vermoë het om RNA te bind in vitro deur elektroforetiese mobiliteitsverskuiwingsbepalings (EMSA) uit te voer. EMSA het nie affiniteit van C6orf203 vir 'n fluoressensie-gemerkte enkelstrengige (ss)RNA-sjabloon ('n gedeelte van ATP6 mRNA, mtDNA nt. 8657-8685) aangedui nie (Figuur 1E en F). In teenstelling hiermee, het C6orf203, óf gedeeltes van 16S mt-rRNA (mtDNA nt. 1919-1985) óf mt-tRNA Pro (mtDNA 15956-16023), 'n gedeelte van 16S mt-rRNA (mtDNA nt. 1919-1985) of mt-tRNA Pro (mtDNA 15956-16023), 'n bindingsaffiniteit getoon F), met Kd waardes van onderskeidelik 0.23 en 0.29μM. Boonop het ons ons C6orf203 EMSA herhaal met fluoresceïen-gemerkte mt-tRNA Pro dsRNA in die teenwoordigheid van óf gemerkte ssRNA óf gestruktureerde dsRNA-molekules in 'n konsentrasie 100-voudig hoër as die gemerkte mt-tRNA Pro (aanvullende figuur S1B). Alhoewel die ongemerkte mt-tRNA Pro dsRNA suksesvol was om met die gemerkte RNA te kompeteer, wat binding van C6orf203 voorkom, is geen sodanige mededinging waargeneem vir die ongemerkte ssRNA-sjabloon nie, wat die idee ondersteun dat C6orf203 gestruktureerde RNA verkieslik bo lineêre sjablone bind. Saam dui hierdie data daarop dat C6orf203 RNA-bindende vermoë besit, met spesifisiteit vir binding van ds en/of hoogs gestruktureerde RNA.

C6orf203 lokaliseer na die mitochondriale matriks

Ons het vervolgens probeer om die subsellulêre lokalisering van C6orf203 te karakteriseer. Volgens die MitoCarta 2.0 -inventaris word voorspel dat C6orf203 by mitochondria by mense kan plaasvind (13). Om die voorspelling te bevestig, het ons immunositochemie (ICC) uitgevoer van menslike 143B osteosarkoom (HOS) selle wat tydelik getransfekteer is met cDNA van C6orf203 gemerk met 'n C-terminale FLAG epitoop tag (C6orf203 :: FLAG). Gevolglike ICC-beelde het sterk kolokalisering van C6orf203::FLAG met MitoTracker Red CMXRos (Figuur 2A) aangedui, wat 'n oorwegend mitochondriale lokalisering van die rekombinante C6orf203::FLAG-proteïen aandui.

C6orf203 lokaliseer na die mitochondriale matriks in menslike selle. (A) Intrasellulêre lokalisering van C6orf203 via immunosito -chemie. C6orf203::VLAG cDNA is oorgangs in HOS -selle getransfekteer. Selkerne is met DAPI (blou) gekleur. Die C6orf203::FLAG-proteïenproduk is deur middel van 'n anti-FLAG-teenliggaam opgespoor en gevisualiseer met behulp van 'n sekondêre teenliggaam wat aan Alexa Fluor 488 (groen) gekonjugeer is. Mitochondria is gevisualiseer met MitoTracker Red CMXRos (rooi). 'n Digitaal saamgevoegde beeld van DAPI, Alexa Fluor 488 en MitoTracker seine onthul kolokalisering van C6orf203::FLAG met die mitochondriale netwerk skaalbalk = 10 μm. (B) Subsellulêre fraksionering van HEK293T-selle wat C6orf203::FLAG-proteïen uitdruk. HEL293T -sellysate is gefraktioneer in sitosoliese en mitochondriale fraksies. Daarbenewens is hoeveelhede van die mitochondriale fraksies behandel met 25 μg/ml Proteinase K met of sonder behandeling met 1% Triton X-100. Breuke (40 μg) is deur western blotting geanaliseer en die lokalisering van C6orf203 :: FLAG is beoordeel in vergelyking met dié van proteïenmerkers van die sitosol (sitosoliese ribosomale proteïen uL1), buitenste mitochondriale membraan (TOM20) en mitochondriale matriks (mitochondriale ribosomale) proteïen uL3m en uS15m). T, totale sellysaat D, puin C, sitosoliese fraksie.

C6orf203 lokaliseer na die mitochondriale matriks in menslike selle. (A) Intrasellulêre lokalisering van C6orf203 via immunosito -chemie. C6orf203::VLAG cDNA is oorgangs in HOS -selle getransfekteer. Selkerne is gevlek met DAPI (blou). Die C6orf203::FLAG-proteïenproduk is deur middel van 'n anti-FLAG-teenliggaam opgespoor en gevisualiseer met behulp van 'n sekondêre teenliggaam wat aan Alexa Fluor 488 (groen) gekonjugeer is. Mitochondria is gevisualiseer met MitoTracker Red CMXRos (rooi). 'n Digitaal saamgevoegde beeld van DAPI, Alexa Fluor 488 en MitoTracker seine onthul kolokalisering van C6orf203::FLAG met die mitochondriale netwerk skaalbalk = 10 μm. (B) Subsellulêre fraksionering van HEK293T -selle wat C6orf203 :: FLAG proteïen uitdruk. HEL293T -sellysate is gefraktioneer in sitosoliese en mitochondriale fraksies. Daarbenewens is hoeveelhede van die mitochondriale fraksies behandel met 25 μg/ml Proteinase K met of sonder behandeling met 1% Triton X-100. Fraksies (40 μg) is deur western blotting ontleed en die lokalisering van C6orf203::FLAG is beoordeel in vergelyking met dié van proteïenmerkers van die sitosol (sitosoliese ribosomale proteïen uL1), buitenste mitochondriale membraan (TOM20) en mitochondriale matriks (mitochondriale ribosomale ribosomale proteïen). proteïen uL3m en uS15m).T, totale sellysaat D, puin C, sitosoliese fraksie.

Ons het volgende 'n HEK293T-sellyn gegenereer, wat moontlik gemaak het vir induseerbare ooruitdrukking van C6orf203::FLAG via die Flp-In TREx-stelsel (Invitrogen). Subsellulêre fraksionering van HEK293T -selle wat C6orf203 ooruitdruk: FLAG ondersteun verder ons ICC -bevindings wat C6orf203 lokaliseer in menslike mitochondria (Figuur 2B). Alhoewel FLAG sein vir die C6orf203::FLAG te swak was om in totale lysaat (T) op te spoor, was C6orf203::FLAG sigbaar in die mitochondriale fraksie, wat 'n verrykte lokalisering van die proteïen na mitochondria aandui (Figuur 2B). Na die behandeling van Proteinase K van geïsoleerde mitochondria bly C6orf203 :: FLAG ongeskonde, soortgelyk aan die gedrag van mitoribosome subeenheid proteïene uL3m en uS15m, terwyl sitosoliese ribosomale proteïen uL1 en buitenste mitochondriale membraan proteïen TOM20 albei afgebreek word deur Proteinase K behandeling (Figuur 2B). Dit dui aan dat die C6orf203 :: FLAG proteïen beskerm word teen proteolise binne mitochondria. Saam bevestig hierdie resultate dat C6orf203 gelokaliseer word na mitochondria in menslike gekweekte selle.

Mitochondriale geenuitdrukking word versteur in die afwesigheid van C6orf203

Aangesien die EMSA-resultate voorgestel het dat C6orf203 RNA-bindingsvermoë kan hê (Figuur 1E), het ons probeer om die rol van C6orf203 in mitochondriale geenuitdrukking te ondersoek. Om dit te ondersoek, is verskeie uitklop HEK293T -sellyne (KO's) vervaardig met behulp van CRISPR/Cas9 -tegnologie (15) en uitklophou is bevestig deur middel van western blotting (Figuur 3A) en PCR -analise (Aanvullende Figuur S2B). KO 1 en KO 4 is gekies vir toekomstige analise.

Mitochondriale geenuitdrukking word versteur in die afwesigheid van C6orf203. (A) Western blotting om uitklop van C6orf203 in HEK293T lyne KO 1 , KO 2 , KO 4 en KO 6 te bevestig . Totale lysaat van WT en KO klone is opgelos via SDS-PAGE, immunoblotting is uitgevoer en membrane is getoets met anti-C6orf203 teenliggaampies en anti-GAPDH as 'n laai kontrole. (B) Groeikurwe van WT HEK293T, en C6orf203 KO -selle in DMEM wat 0,9 g/l galaktose bevat (drie biologiese herhalings is uitgevoer en die gemiddelde gemiddelde selgetalle op elke tydstip word aangedui, foutstawe = 1 SD). (C) Western blotting van OXPHOS subeenhede in C6orf203 KO lyne. Totale lysaat van WT HEK293T en C6orf203 KO 1 en KO 4 is opgelos via SDS-PAGE Western blotting is uitgevoer en membrane is getoets met teenliggaampies teen C6orf203 en beide mtDNA-gekodeer (COX1, COX2) en kern-geënkodeer (NDUFTP8, SD) ) OXPHOS subeenhede. Anti-VDAC1-teenliggaampies is as laaibeheer gebruik. (D) Western blotting is uitgevoer op die kontrole HEK293T (WT), C6orf203 KO 1 selle en KO 1 selle wat C6orf203::FLAG (KO 1 +C6::F) uitdruk wat vir Oxygraph in (E) gebruik is. Teenliggaamkleuring teen C6orf203 is uitgevoer om uitklop van C6orf203 te bevestig, en heruitdrukking van die C6orf203::FLAG proteïen. α-tubulien is gebruik as laai beheer. (E) Verhouding van maksimale en basale mitochondriale respirasie (elk uitgedruk in pmol suurstofvloed/mg proteïen) gemeet deur Oroboros oksigraaf. Maksimum asemhaling is gemeet na permeabilisering van die selle (met Digitonin), remming van kompleks V (met Oligomycin) en behandeling met die protonofoor (CCCP) (n = 3, * P-waarde = 0,0308). (F) BN-PAGE en in-gel aktiwiteite van kompleks I, kompleks II, kompleks IV en komplekse V aktiwiteite in mitochondriale proteïenekstrakte van WT, C6orf203 KO klone en KO 1 selle wat C6orf203::FLAG uitdruk (KO 1 + C6::F) . Coomassie-kleuring van die jel word gewys om gelyke laai aan te dui. Asterisk dui op opgehoopte F1-bevat subkomplekse van komplekse V.

Mitochondriale geenuitdrukking word versteur in die afwesigheid van C6orf203. (A) Western blotting om uitklop van C6orf203 in HEK293T lyne KO 1 , KO 2 , KO 4 en KO 6 te bevestig . Totale lysaat van WT en KO klone is opgelos via SDS-PAGE, immunoblotting is uitgevoer en membrane is getoets met anti-C6orf203 teenliggaampies en anti-GAPDH as 'n laai kontrole. (B) Groeikromme van WT HEK293T, en C6orf203 KO-selle in DMEM wat 0.9 g/l galaktose bevat (drie biologiese herhalings is uitgevoer en gemiddelde gemiddelde selgetalle op elke tydstip word aangedui, foutstawe = 1 SD). (C) Western blotting van OXPHOS subeenhede in C6orf203 KO lyne. Totale lysaat van WT HEK293T en C6orf203 KO 1 en KO 4 is opgelos via SDS-PAGE Western blotting is uitgevoer en membrane is ondersoek met teenliggaampies teen C6orf203 en beide mtDNA-gekodeerde (COX1, COX2) en kern-gekodeerde (NDUFB8, SDHA, ATP5a) ) OXPHOS subeenhede. Anti-VDAC1-teenliggaampies is as laaibeheer gebruik. (D) Western blotting is uitgevoer op die kontrole HEK293T (WT), C6orf203 KO 1 selle en KO 1 selle wat C6orf203 :: FLAG (KO 1 +C6 :: F) uitdruk wat vir Oxygraph in (E) gebruik is. Teenliggaamkleuring teen C6orf203 is uitgevoer om die uitklop van C6orf203 en heruitdrukking van die C6orf203 :: FLAG proteïen te bevestig. α-tubulien is gebruik as laai beheer. (E) Verhouding van maksimum en basale mitochondriale asemhaling (elk uitgedruk in pmol suurstofvloei/mg proteïen) gemeet deur Oroboros -oksigraaf. Maksimum respirasie is gemeet na permeabilisering van die selle (met Digitonin), inhibisie van kompleks V (met Oligomycin) en behandeling met die protonofoor (CCCP) (n = 3, * P-waarde = 0,0308). (F) BN-PAGE en in-gel aktiwiteite van kompleks I, kompleks II, kompleks IV en komplekse V aktiwiteite in mitochondriale proteïenekstrakte van WT, C6orf203 KO klone en KO 1 selle wat C6orf203::FLAG uitdruk (KO 1 + C6::F) . Coomassie -vlek van die gel dui op gelyke lading. Asterisk dui op opgehoopte F1-bevat subkomplekse van komplekse V.

Om die mitochondriale funksie in die C6orf203 -uitkloplyne te bepaal, is klone verbou in media wat galaktose bevat as die enigste koolstofbron, wat selle dwing om byna geheel en al op mitochondria staat te maak vir ATP -produksie. 'N Verminderde vermoë van KO-klone om in galaktosemedia te vermeerder relatief tot die groei van wildtipe (WT) HEK293T-sellynpopulasie is waargeneem (Figuur 3B), wat dui op 'n mitochondriale disfunksie.

Om hierdie waarneming verder te ondersoek, is western klad van OXPHOS subeenhede uitgevoer, wat 'n ligte verlaging in die bestendige toestand vlakke van komponente van kompleks I (NDUFB8) en IV (COX1 en COX2) (Figuur 3C) aandui, wat daarop dui dat die C6orf203 uitklop inmeng. met mitochondriale geenuitdrukking.

Ten einde te bevestig dat die waargenome OXPHOS-tekort te wyte was aan die verlies van die C6orf203-proteïen, het ons die KO 1-kloon aangevul via die Flp-In T-Rex-stelsel om voorsiening te maak vir induseerbare uitdrukking van wilde-tipe C6orf203::FLAG cDNA (Figuur 3D). Vervolgens het ons die suurstofverbruikskoers gemeet in knock -out en aangevulde sellyne. Die verhouding van maksimum respirasie tot basale respirasie is matig verminder in die afwesigheid van C6orf203 (Figuur 3E), wat in lyn was met die matige afname in die bestendige toestand vlakke van komponente van OXPHOS komplekse. Hierdie ligte afname is gered deur die heruitdrukking van C6orf203 :: FLAG proteïen, wat ook bevestig dat FLAG-gemerkte proteïen endogene C6orf203 funksioneel kan vervang.

Daarbenewens is in-gel aktiwiteit van OXPHOS komplekse ontleed vir beide uitklop- en gekomplementeerde lyne (Figuur 3F). Die aktiwiteit van komplekse I, II en IV is onveranderd of matig beïnvloed vir getoetste KO -klone (Figuur 3F). Met kleuring vir in-gel-aktiwiteit van kompleks V het ons egter aktiwiteit waargeneem wat afgelei is van komplekse met 'n verminderde molekulêre massa relatief tot die F1F0 holoënsiem (Figuur 3F). As gevolg van die teenwoordigheid van ATP -hidrolise, word dit waarskynlik gevorm as gevolg van F1-bevattende subkomplekse. Dit dui daarop dat 'n ligte samestellingsfout in kompleks V voorkom in die afwesigheid van C6orf203, wat gered word met die heruitdrukking van C6orf203::VLAG cDNA (Figuur 3F). Saam ondersteun hierdie resultate dat C6orf203 bydra tot doeltreffende OXPHOS -integriteit binne mitochondria, as gevolg van die ligte fenotipe wat op C6orf203 -ablasie voorkom.

In die lig van die lokalisering van C6orf203 na mitochondria, het ons gepoog om te bepaal of die ligte OXPHOS fenotipe in C6orf203 KO direk toegeskryf kan word aan 'n defek in mtDNA uitdrukking. Metaboliese etikettering van mitochondriale vertaalprodukte dui op 'n sterk, algemene vertalingsdefek in onafhanklike KO -klone (ongeveer 50% in vergelyking met kontrole, n = 3), wat herstel is na uitdrukking van C6orf203::VLAG cDNA in KO 1 (Figuur 4A). Aangesien ons vroeëre bevindinge (Figuur 1E en 2) daarop dui dat C6orf203 kan funksioneer as 'n mitochondriale RNA-bindende proteïen, het ons vervolgens ondersoek ingestel of verandering aan die mitochondriale transkriptoom 'n onderliggende faktor was vir die mitochondriale translasie defek wat waargeneem is in C6orf203 KO. Northern blotting van alle mtDNA-gekodeerde mRNA's, rRNA's en tRNA's (Figuur 4B, C en D) het egter geen verandering in bestendige-toestandvlakke, of versteuring in RNA-prosessering, gedui wat die ernstige, algemene mitochondriale translasiedefek wat waargeneem is, sou verklaar. .

Uitklop van C6orf203 lei tot verminderde mitochondriale vertaling sonder om die steady-state vlakke van mitochondriale RNA's te beïnvloed. (A) Mitochondriale vertaling in C6orf203 KO -sellyne. Na remming van sitosoliese translasie, is produkte van mitochondriale translasie gemerk met [35S] -metionien in WT, C6orf203 KO klone en KO 1 selle wat C6orf203 :: FLAG uitdruk (KO 1 +C6 :: F, getalle dui klone 1 en 2 aan) . Mitochondriale proteïene is geskei deur SDS-PAGE en gevisualiseer deur outoradiografie. Coomassie Brilliant Blue (CBB) kleuring word verskaf om gelyke proteïenbelading te bevestig. Immunoblotting is gebruik om C6orf203 -uitdrukking aan te toon. (B) Noordelike klad van mt-mRNA's (B), mt-rRNA's (C) en mt-tRNA's (D) vir WT- en C6orf203 KO -klone. Kerngekodeerde 28S en 18S rRNA is gebruik as 'n laai kontrole vir mt-mRNAs en mt-rRNAs, en sitosoliese tRNA (Tryptofaan) is gebruik as 'n laai kontrole vir mt-tRNA klads.

Uitklop van C6orf203 lei tot verminderde mitochondriale vertaling sonder om die steady-state vlakke van mitochondriale RNA's te beïnvloed. (A) Mitochondriale vertaling in C6orf203 KO-sellyne. Na remming van sitosoliese translasie, is produkte van mitochondriale translasie gemerk met [35S] -metionien in WT, C6orf203 KO klone en KO 1 selle wat C6orf203 :: FLAG uitdruk (KO 1 +C6 :: F, getalle dui klone 1 en 2 aan) . Mitochondriale proteïene is geskei deur SDS-PAGE en gevisualiseer deur outoradiografie. Coomassie Brilliant Blue (CBB) kleuring word verskaf om gelyke proteïenbelading te bevestig. Immunoblotting is gebruik om C6orf203 uitdrukking te toon. (B) Northern blotting van mt-mRNAs (B), mt-rRNAs (C) en mt-tRNA's (D) vir WT- en C6orf203 KO -klone. Kerngekodeerde 28S en 18S rRNA is gebruik as 'n laai kontrole vir mt-mRNAs en mt-rRNAs, en sitosoliese tRNA (Tryptofaan) is gebruik as 'n laai kontrole vir mt-tRNA klads.

C6orf203 is in wisselwerking met die mitochondriale ribosomale groot subeenheid

Aangesien daar geen konstante toestand-verandering van enige van die mitochondriale transkripsies waargeneem is nie, het ons daarna probeer om spesifieke interaksies van C6orf203 te identifiseer, aangesien dit meer insig kan gee in die onderliggende meganisme van die waargenome mitochondriale translasie-defek. Na C6orf203 :: FLAG -induksie in ons ooruitdrukende HEK293T -lyn, is FLAG immunoprecipitasie (IP) sonder verknoping uitgevoer. Om te kontroleer vir nie-spesifieke binding, is mitochondriaal geteikende luciferase met FLAG gemerk in HEK293T uitgedruk en deur dieselfde prosedure immuun neerslag gevind (aanvullende figuur S3B). Western blotting van die eluaat het spesifieke verryking van proteïene van die mt-LSU (ml37 en uL3m) in C6orf203-aftrek geopenbaar, terwyl proteïene subeenhede van die mt-SSU nie verryk is nie (Figuur 5A). Daarbenewens het ons gevind dat die waargenome interaksie met mt-LSU subeenhede RNA-afhanklik was, aangesien RNase A behandeling gelei het tot 'n verlies aan interaksie van C6orf203 met mL37 en uL3m (Aanvullende Figuur S3C).

C6orf203 het interaksie met die mt-LSU. (A) Immunoblotting van C6orf203::FLAG pulldown. Invoer mitochondriale lysate en eluaat van FLAG-IP vanaf HEK293T wat C6orf203::FLAG uitdruk en kontrole HEK293T sonder FLAG proteïen uitdrukking (WT) is opgelos via SDS-PAGE western klad is uitgevoer en daaropvolgende membrane is ondersoek met teenliggaampies teen óf en vir proteïene van FLAG die mt-LSU-proteïene (mL37, uL3m) of mt-SSU-proteïene (bS16m, uS15m). (B) Massaspektrometrie-analise van proteïene wat met C6orf203::FLAG interaksie het. Na FLAG-immunopresipitasie, is eluate geanaliseer deur middel van etiketvrye kwantitatiewe massaspektrometrie (LFQ) (n = 3). Vulkaanplot dui slegs proteïene aan wat in die Mitocarta 2.0 -databasis voorkom. Proteïene met vouverandering >2.5 word gemerk. Inlas: Boxplot wat vergelyking vertoon van die logFC (log vou verandering) van proteïene (soos in hoof B) van die mt-LSU of mt-SSU in vergelyking met globale proteïene. Gegee P-waardes dui die paargewyse betekenis van verskil in logFC tussen globale proteïene, 39S mt-LSU proteïene of 28 mt-SSU proteïene aan soos bepaal deur Welch se ongelyke variansies t-toets. (C) Kwantitatiewe intydse PCR om verryking van mt-RNA's op C6orf203::FLAG-aftrek te bepaal. Anti-FLAG Immunopresipitasie is uitgevoer op mitochondriale lisaat vanaf HEK293 selle en HEK293T selle wat C6orf203::FLAG ooruitdruk. RNA is onttrek uit beide mitochondriale lysate en elueringsfraksies, omgekeerd getranskribeer, en qPCR is uitgevoer met behulp van primer- en probepare tot mitochondriale DNA -gekodeerde transkripsies. Die relatiewe vou verandering van transkripsie oorvloed in die C6orf203::FLAG immuunpresipiteerde eluate teenoor die HEK293 eluate relatief tot transkripsie oorvloed in hul onderskeie insette mitochondriale lysate is bereken en word hier getoon. Grafiek verteenwoordig 'n kombinasie van drie biologiese herhaal eksperimente foutbalke = S.E.M.

C6orf203 is in wisselwerking met die mt-LSU. (A) Immunoblotting van C6orf203::FLAG pulldown. Voer mitochondriale lysate en elueer van FLAG-IP in uit HEK293T wat C6orf203 uitdruk :: VLAG en beheer HEK293T sonder FLAG proteïenexpressie (WT) is opgelos via SDS-PAGE western blotting is uitgevoer en daaropvolgende membrane is ondersoek met teenliggaampies teen FLAG en vir proteïene van beide die mt-LSU proteïene (ml37, uL3m) of mt-SSU proteïene (bS16m, uS15m). (B) Massaspektrometrie -analise van proteïene wat in wisselwerking is met C6orf203 :: FLAG. Na FLAG-immunopresipitasie, is eluate geanaliseer deur middel van etiketvrye kwantitatiewe massaspektrometrie (LFQ) (n = 3). Vulkaanplot dui slegs proteïene aan wat in die Mitocarta 2.0-databasis gevind word. Proteïene met vouverandering >2.5 word gemerk. Inset: Boxplot wat vergelyking van die logFC (logvouverandering) van proteïene (soos in hoof B) van die mt-LSU of mt-SSU vertoon in vergelyking met globale proteïene. Gesê P-waardes dui twee-twee betekenis aan van die verskil in logFC tussen globale proteïene, 39S mt-LSU proteïene of 28 mt-SSU proteïene soos bepaal deur Welch se ongelyke afwykings t-toets. (C) Kwantitatiewe intydse PCR om verryking van mt-RNA's op C6orf203 :: VLAG-aftrek te bepaal. Anti-FLAG Immunopresipitasie is uitgevoer op mitochondriale lisaat vanaf HEK293 selle en HEK293T selle wat C6orf203::FLAG ooruitdruk. RNA is uit beide mitochondriale lisate en elueringsfraksies onttrek, omgekeerd getranskribeer, en qPCR is uitgevoer met behulp van primer en probes pare na mitochondriale DNA gekodeerde transkripsies. Die relatiewe vouverandering van die transkripte -oorvloed in die C6orf203 :: FLAG -immuun neerslag eluate teenoor die HEK293 eluate relatief tot die transkripte oorvloed in hul onderskeie inset mitochondriale lysate is bereken en word hier getoon. Grafiek verteenwoordig kombinasie van drie biologiese replikaat eksperimente foutstawe = S.E.M.

Vervolgens het ons etiketvrye kwantitatiewe massaspektrometrie uitgevoer op die eluaat van die C6orf203 :: FLAG IP relatief tot 'n negatiewe kontrole (HEK293T sonder FLAG proteïenuitdrukking). Dit onthul verryking van 'n groot aantal proteïene van die mt-LSU wat saam met C6orf203 :: FLAG saam immuun neerslaan (Figuur 5B), terwyl slegs 'n enkele subeenheid van die mt-SSU waargeneem is (uS15m) met 'n logFC van & gt2. Toe die verrykingsprofiele van die samestellende proteïene van die mt-LSU en die mt-SSU afsonderlik beskou is, toon alle mt-LSU-subeenhede 'n konsekwente verryking oor die globale proteïenverspreiding, terwyl mt-SSU-proteïene nie verryk is bo die van globale proteïene (figuur 5B, ingevoeg). Ons het ook verryking van verskeie sitosoliese ribosomale proteïene waargeneem. Hierdie interaksie is egter verminder met Proteinase K -behandeling van mitochondria voor IP, soos getoets via western blotting (aanvullende figuur S3A).

Benewens mt-LSU-komponente, is 'n aantal ander proteïene hoogs verryk in C6orf203::FLAG IP, insluitend 'n aantal faktore wat bekend is om betrokke te wees by die samestelling van die mt-LSU (bv. GTPBP10, DHX30, MALSU1, RPUSD4, TRMT10C ) (Figuur 5B). Aangesien baie van hierdie samestelling faktore waarskynlik uitgesluit sal word van die volwasse ribosoom, kan dit aandui dat die waargenome interaksie van C6orf203 plaasvind binne 'n samestelling intermediêre van die mt-LSU.

Vreemd genoeg was een van die hoogs verrykte proteïene wat op C6orf203::FLAG-aftrekking waargeneem is, C12orf65, 'n lid van 'n familie van vier mitochondriale klas I-peptiedvrystellingsfaktore. Die presiese rol van C12orf65 in mitochondriale vertaling is egter tans onbekend, aangesien familielid mtRF1a voldoende is vir die beëindiging van vertaling in al 13 mitochondriale oop leesrame (25). Die interaksie van C12orf65 met C6orf203 vereis verdere ondersoek om funksionele relevansie te bepaal.

Aangesien ons vroeër C6orf203 gekenmerk het as 'n RNA-bindende affiniteit, het ons probeer ondersoek instel of C6orf203 met mitochondriale RNA in wisselwerking was en het ons C6orf203 :: FLAG immunoprecipitasies herhaal en RNA onttrek uit beide invoer en eluate vir die C6orf203 :: FLAG lyn en WT HEK293 beheer. Deur middel van kwantitatiewe RT-PCR gefokus op mt-mRNA's en mt-rRNA's, het ons spesifieke verryking van 16S mt-rRNA op C6orf203 :: FLAG IP waargeneem in vergelyking met kontrole (Figuur 5C). Hierdie waarneming ondersteun verder ons proteomiese bevindinge rakende interaksie van C6orf203 met óf die volle óf 'n byna saamgestelde intermediêre van mt-LSU.

Afwesigheid van C6orf203 lei tot vermindering van mt-mRNA's wat op mitoribosome gelaai word

In die lig van die waargenome interaksie tussen C6orf203 en die mt-LSU, sowel as die verryking van 'n komplement van bekende mt-LSU-samestellingsfaktore (Figuur 5B), het ons vervolgens probeer om die integriteit van die mitoribosome in ons C6orf203 KO-lyne te assesseer. Western blotting het geen afname in bestendige toestandvlakke van 'n aantal samestellende proteïene van óf die mt-SSU óf mt-SSU (Figuur 6A) getoon nie, en sukrosegradiëntfraksionering het aangedui dat algehele integriteit van beide die mt-SSU en mt-LSU was behou in die C6orf203 KO -klone (Figuur 6B). Dit dui daarop dat daar geen globale defek is in die samestelling van enige subeenheid van die mitoribosoom in die afwesigheid van C6orf203 nie (figuur 6B), en daarom is dit onwaarskynlik dat C6orf203 'n rol sal speel in die vroeë stadiums van die samestelling van die mt-LSU.Dit stem ooreen met die waarneming van 'n byna-volle komplement van mt-LSU-proteïene op C6orf203::FLAG-aftrek (Figuur 5B), wat eerder daarop dui dat C6orf203 kan optree op 'n latere stadium samestelling tussenganger van mt-LSU of die volle mt-LSU .

C6orf203-verlies beïnvloed die betrokkenheid van mt-mRNAs met mitoribosome. (A) Western blotting van steady-state vlakke van mitochondriale ribosomale proteïene in WT, C6orf203 KO en KO 1 selle wat C6orf203 :: FLAG (KO 1 +C6 :: F) uitdruk. Totale sellysaat van WT HEK293T, C6orf203 KO klone en KO 1 selle wat C6orf203 uitdruk :: FLAG (KO 1 +C6F) is opgelos via SDS-PAGE Western blotting is uitgevoer en membrane is ondersoek met teenliggaampies teen proteïene van óf die mt-LSU óf mt-SSU, en VDAC1 is as laaibeheer gebruik. (B) Sedimentasie van mitochondriale ribosome op 10-30% isokinetiese sukrose -gradiënte vir WT HEK293T en C6orf203 KO 1. Mitochondria is uit selle geïsoleer en lysate is op gradiënte gelaai. Na sentrifugering is die verkrygde breuke geanaliseer deur western blotting met teenliggaampies teen proteïene van die mt-LSU (uL3m en mL37), die mt-SSU (uS15m) en C6orf203. (C) Mitoribosome profilering -analise. Relatiewe verhouding van mitoribosoom-beskermde fragmente (per miljoen gekarteerde lesings, RPM) vir C6orf203 KO 1 versus WT HEK293T vir elke mt-mRNA ORF bepaal via MitoRiboSeq. Individue CDS'e word volgens hul ORF-lengte vertoon. Lesings met 5'-punte-kartering tussen die eerste nukleotied van die beginkodon en 30 nt 5' van die stopkodon is vir elke biblioteek getel. Oorvleuelende streke vir ORF's op bicistroniese transkripsies (ATP8/ATP6 en ND4l/ND4) is uitgesluit van die analise. Resultate verteenwoordig data van 'n enkele MitoRiboSeq -eksperiment.

C6orf203-verlies beïnvloed die betrokkenheid van mt-mRNA's met mitoribosome. (A) Western blotting van steady-state vlakke van mitochondriale ribosomale proteïene in WT, C6orf203 KO en KO 1 selle wat C6orf203 :: FLAG (KO 1 +C6 :: F) uitdruk. Totale sellysaat van WT HEK293T, C6orf203 KO klone en KO 1 selle wat C6orf203 uitdruk :: FLAG (KO 1 +C6F) is opgelos via SDS-PAGE Western blotting is uitgevoer en membrane is ondersoek met teenliggaampies teen proteïene van óf die mt-LSU óf mt-SSU, en VDAC1 is gebruik as laai beheer. (B) Sedimentasie van mitochondriale ribosome op 10-30% isokinetiese sukrose -gradiënte vir WT HEK293T en C6orf203 KO 1. Mitochondria is uit selle geïsoleer, en lysate is op gradiënte gelaai. Na sentrifugering is verkry fraksies ontleed deur western klad met teenliggaampies teen proteïene van die mt-LSU (uL3m en mL37), die mt-SSU (uS15m) en C6orf203. (C) Mitoribosome profilering -analise. Relatiewe verhouding van mitoribosoom-beskermde fragmente (per miljoen gekarteer lees, RPM) vir C6orf203 KO 1 teenoor WT HEK293T vir elke mt-mRNA ORF bepaal via MitoRiboSeq. Individue CDS'e word volgens hul ORF-lengte vertoon. Lesings met 5'-punte-kartering tussen die eerste nukleotied van die beginkodon en 30 nt 5' van die stopkodon is vir elke biblioteek getel. Oorvleuelende streke vir ORFs op bisistroniese transkripsies (ATP8/ATP6 en ND4l/ND4) is uitgesluit van die analise. Resultate verteenwoordig data van 'n enkele MitoRiboSeq-eksperiment.

Vreemd genoeg, ondanks die waargenome translasie -defek in C6orf203 KO -selle (Figuur 4A), word mitochondriale monosoomvorming nie beïnvloed in die afwesigheid van C6orf203 (Figuur 6B). Om hierdie verskil tussen mitochondriale monosoomvorming en die sterk translasiedefek teenwoordig in C6orf203 KO te ondersoek, het ons mitochondriale ribosoomprofilering (MitoRiboSeq) in een van die C6orf203 KO-lyne (KO 1 ) gebruik. Hierdeur het ons waargeneem dat die besetting van alle mt-mRNA's op mitochondriale monosome aansienlik verminder is relatief tot WT HEK293T (Figuur 6C), hoewel geen spesifieke mt-mRNA's in 'n groter mate as ander geraak is nie (Figuur 6C). Die MitoRiboSeq resultate is in ooreenstemming met die mitochondriale translasie defek waargeneem in C6orf203 KO (Figuur 4A).

Verdere ontleding van MitoRiboSeq het aan die lig gebring dat, hoewel die betrokkenheid van mRNA's met mitoribosome verminder word, daar geen groot steuring in die rekdoeltreffendheid is nie, aangesien daar geen duidelike verskil in mitoribosoomonderbreking tussen KO- en WT -selle waargeneem is nie (Aanvullende Figuur S4A en B), ook nie mitoribosoom-afval oor die lengte van vertaalde transkripsies (wat kan dui op valse verlies aan leesraam) (Aanvullende Figuur S4C). Boonop het ons geen toename in die besetting van die mitoribosome op spesifieke kodons in die C6orf203-uitkloplyne waargeneem nie, wat daarop dui dat daar geen verstoring is van die beskikbaarheid van enige individuele geaminacileerde mt-tRNA (aanvullende figuur S5). Saam met die afwesigheid van C6orf203 word mitochondriale monosome gevorm, maar hul funksie word in gevaar gestel, wat lei tot verminderde mitochondriale translasie.


Verskeie kodering-/nie -koderende promotors bied 'n unieke geleentheid om RNAPII -transkripsiesiklusse te vergelyk oor lncRNA/mRNA -pare

Die profilering van ontluikende transkripsie was veral insiggewend deur te demonstreer dat die meeste nukleosoom-uitgeputte streke transkripsie in beide rigtings inisieer (Wei et al. 2011 Scruggs et al. 2015) (Figuur 3). Cap-analise-gene-uitdrukking (CAGE) ontledings toon aan dat transkripsiesiklusse in beide rigtings begin deur dieselfde 5 ′-cap-modifikasie te bevorder na die eerste getranskribeerde basis (Andersson et al. 2014). Divergente lncRNA's word egter dikwels geteiken vir eksosoom-gemedieerde degradasie (Preker et al. 2008), met sin-string mRNA wat merkbaar meer stabiel is. Dit is selfs die geval vir uiteenlopende lncRNA/mRNA-pare wat soortgelyke vlakke van ontluikende transkripsie toon (Sigova et al. 2013). Dit blyk dus dat die meeste promotors transkripsie verkieslik in die koderingsrigting dryf. Die meganisme (s) waarmee rigtinggewendheid bereik word, word nie goed verstaan ​​nie. Kanoniese transkripsie-splyting, poliadenilering en terminasievolgorde word verryk in sommige divergente lncRNA's (Almada et al. 2013). Interessant genoeg, terwyl hierdie cis DNA-elemente lei tot die vorming van stabiele mRNA in die koderingsrigting, divergente lncRNA-beëindiging veroorsaak eksosoom-gemedieerde lncRNA-afbraak (Ntini et al. 2013). Die verskillende effekte van splitsing en poliadenylering cis-elemente op mRNA's en lncRNA's versoen verskille in die stabiliteit van transkripsiepare vanaf sulke promotors. Daarbenewens word die sterkte van transkripsie in enige rigting selektief op die chromatienvlak gereguleer, aangesien divergente lncRNA-transkripsie deur 'n aantal chromatienhermodelleringsfaktore onderdruk of geaktiveer kan word (Churchman en Weissman 2011 Marquardt et al. 2014 Scruggs et al. 2015). Faktore wat verband hou met RNAPII, soos PAFI, DSIF en Ssu72, is ook betrokke by die beheer van rigting (Tan-Wong et al. 2012 Fischl et al. 2017 Shetty et al. 2017). Interessant genoeg is daar bewyse dat die RNAPII CTD verryk word vir fosforilering van Tyr1 tydens uiteenlopende nie -kodering transkripsie (Descostes et al. 2014 Hsin et al. 2014), wat die unieke eienskappe van lncRNA -transkripsie verder onthul. Alhoewel transkripsie van koderende/nie-koderende pare streng beheer word, is ons begrip van hoe RNAPII, RNAPII-geassosieerde faktore en chromatien-remodellers onderskei tussen kodering en nie-kodering oriëntasies rudimentêr. Boonop bly die doel van nie -kodering van transkripsie van tweerigtingpromotors swak verstaan. As in ag geneem word dat wydverspreide uiteenlopende nie-koderende transkripsie in baie organismes opgespoor word, kan dit blyk dat dit 'n onvermydelike gevolg van eukariotiese promotorstruktuur is. Die identifisering van faktore wat nodig is vir spesifieke aktivering of onderdrukking van uiteenlopende lncRNA -transkripsie, illustreer egter noukeurige regulering van hierdie proses, wat 'n aanduiding is van funksionele betekenis, hoewel die betekenis nog nie volledig verduidelik moet word nie.

Tweerigting-promotors. Alhoewel die meeste promotors transkripsie in enige rigting kan inisieer, word die sintuigoriëntasie oor die algemeen bevoordeel. Verskeie RNAPII-geassosieerde faktore en chromatienveranderinge blyk die rigting te beheer. Byvoorbeeld, dit lyk asof PAF1, DSIF en Ssu72 RNAPII-transkripsie in die sinrigting stimuleer (Tan-Wong et al. 2012 Fischl et al. 2017 Shetty et al. 2017). Chromatienhermodelleerders ding ook mee om divergente transkripsie te reguleer. Veral, CAF-I onderdruk divergente transkripsie deur die inkorporering van nukleosome met H3K56ac te bevoordeel, terwyl die SWI/SNF-kompleks hierdie aktiwiteit teenstaan ​​en daardeur divergente transkripsie bevorder (Marquardt) et al. 2014). Divergente RNAPII-transkripsie kan ook verryk word vir Tyr1P (Y1P) (Descostes) et al. 2014 Hsin et al. 2014). Laastens word baie uiteenlopende lncRNA's verryk vir promotor-proksimale poliadenileringsterreine en gerig op vroeë beëindiging en eksosoom-gemedieerde afbraak in die kern (Preker et al. 2008 Almada et al. 2013 Ntini et al. 2013). Daarteenoor word stabiele volwasse mRNA's na die sitoplasma vervoer vir proteïensintese. H3, histoon H3 lncRNA, lang nie-koderende RNA poly- (A) webwerf (PAS), RNAPII, RNA Polymerase II skakelaar/sukrose nie-fermenteerbaar (SWI/SNF).


Funksionele lncRNA's vertoon mRNA-agtige transkripsie-eienskappe

Daar is voorspelbaar uitsonderings op die dominante patrone wat hierbo uitgelig is. Nascent-transkripsie-ontledings het ook lncRNA's blootgestel wat meer mRNA-agtige transkripsionele eienskappe vertoon (sien figuur 2B). Twee sulke transkripsies wat in menslike HeLa -selle opgespoor word, sluit byvoorbeeld die baie transkripsies in NORAD en TINCR (Schlackow et al. 2017). NORAD lokaliseer na die sitoplasma waar dit geenuitdrukking beheer deur interaksie met en regulering van Pumilio RNA-bindende proteïene (Lee et al. 2016), terwyl TINKR handhaaf somatiese seldifferensiasie deur interaksie met en stabilisering van differensiasie-spesifieke mRNA's (Kretz et al. 2013). Aangesien lncRNA's oor die algemeen sterker weefselspesifieke uitdrukkingspatrone vertoon as proteïenkoderende gene (Derrien et al. 2012 Kornienko et al. 2016), moet ontluikende transkripsie-ontledings uitgebrei word na ander menslike seltipes om meer mRNA-agtige lncRNA's te identifiseer, aangesien hierdie subklas hoogs waarskynlik spesifieke en waarneembare funksies het.


Proteomika-strategieë om SUMO-teikens en aanvaarderterreine te identifiseer: 'n Opname van RNA-bindende proteïene SUMOylering

SUMOylation is 'n proteïen post -vertaalmodifikasie wat deelneem aan die regulering van talle biologiese prosesse binne die selle. Klein ubiquitin-like modifier (SUMO) proteïene is lede van die ubiquitin-like proteïenfamilie en is, net soos ubiquitin, kovalent gekoppel aan 'n lisienresidu op 'n teikenproteïen via 'n multi-ensiematiese kaskade. Om die spesifieke meganisme wat deur SUMOylation veroorsaak word, te beoordeel, is die identifisering van SUMO proteïensubstrate en die presiese acceptorplek waaraan SUMO gebind is, van kritieke belang. Ondanks dat honderde soogdierproteïene beskryf is as doelwitte van SUMOylation, verteenwoordig die identifisering van die presiese acceptorplekke steeds 'n belangrike analitiese uitdaging as gevolg van die relatief lae stoichiometrie in vivo en die hoogs dinamiese aard van hierdie modifikasie. Boonop word die massaspektrometrie-gebaseerde identifikasie van SUMOylated-terreine belemmer deur die groot peptiedresidu van SUMO-proteïene wat op die gemodifiseerde lysienresidu oorgebly het by tryptiese vertering. Die huidige oorsig bied 'n oorsig van die strategieë wat gebruik is om SUMOylation-substrate en acceptor-plekke in menslike selle op groot skaal te verryk, te suiwer en te identifiseer. Die sukses van die voorgestelde strategieë het gehelp om die talle aktiwiteite van hierdie modifikasie te ontrafel, soos dit getoon is deur die voorbeeldige geval van die RNA-bindende proteïenfamilie, wie se SUMOylering hier hersien word.

Dit is 'n voorsmakie van intekeninginhoud, toegang via u instelling.


Bespreking

Drie belangrike gevolgtrekkings uit ons studie bied insig in hoe die alternatiewe splitsing van plante gereguleer word en hoe dit die abiotiese stresreaksies beïnvloed. Eerstens toon ons splitsingsanalise, RNA-bindingstoetse en filogenetiese analise dat HIN1 'n voorheen onbekende en onverwagte tipe plantspesifieke RNA-bindende proteïen en splitsingsreguleerder is. Tweedens bied HIN1-HAI1-interaksie, sowel as HAI1-defosforylering van HIN1, 'n skakel tussen stressein en pre-mRNA-splitsing. Derdens, die verskuiwing na verhoogde splitsingsdoeltreffendheid van IR-geneigde introne tydens akklimatisering tot matige erns lae ψw dui op 'n spesifieke, en ook onverwagte, effek van droogteakklimasie op IR wat nog ondersoek moet word. Die gene is laag ψw en 35S: HIN1 gelei tot verbeterde splitsingsdoeltreffendheid is verryk vir abiotiese stres en seinverwante funksies. Saam met die verbeterde groei instandhouding van 35S: HIN1 tydens lae ψw, het hierdie resultate getoon dat HIN1 en regulering van pre-mRNA-splyting belangrik is vir droogte-akklimatisering.

Die effek van HIN1 op IR en die binding daarvan aan 'n GAA-bevattende motief wat in intron-flankerende streke verryk is, het aangedui dat HIN1 funksioneel soortgelyk kan wees aan splitsingsverbeteraar en inhibeerderproteïene wat die beste in metazoë gekarakteriseer is, maar nie ten volle in enige organisme verstaan ​​word nie. Alhoewel ons nie ander moontlikhede kan uitsluit nie, dui ons data daarop dat HIN1 as 'n splitsingsremmer dien. HIN1-binding aan ESE-agtige elemente kan optel om splitsingsverwante proteïene wat met HIN1 interaksie het, te werf en kan ook RNA-binding van ander splitsingsverwante proteïene blokkeer wat met dieselfde of soortgelyke RNA-motief assosieer (Fig. 6). Daar word vermoed dat verskillende soorte plant-SR-proteïene, insluitend die HIN1-gekolokaliseerde en HIN1-interaksie-proteïene RSZ22 SC35, SRP30 en SRP34, die cis-elemente bind wat splitsing reguleer (18). Daar is getoon dat RSZ22 interaksie het met komponente van die U1 SNRP en dit kan werf na die 5 ′ splitsingsplek (18, 48). Interessant genoeg, bind RSZ22 by voorkeur aan 'n ander RNA -motief as HIN1 (49), moontlik dat hierdie proteïene kolokaliseer en interaksie het wanneer dit gebind is aan aangrensende RNA -terreine of as een of albei nie aan RNA gebind is nie. Die SC35-verwante proteïen SCL30 (en miskien SC35 self) het gebind aan 'n GAA-bevattende RNA-motief verryk in volgordes binne 100 basisse van SC35/SCL30-gereguleerde introne (43). Ook, 'n motief soortgelyk aan die GAA-bevattende motief wat ons geïdentifiseer is, is verryk in die intron-flankerende streke van SR45-geassosieerde transkripsies, insluitend ABA en stresverwante gene (20). SR45 mutant en ooruitdrukking lyne het ABA sensitiwiteit verander. Sulke resultate, saam met die resultate wat hier aangebied word, dui op 'n komplekse interaksie en mededinging tussen proteïene wat bind aan GAA-bevattende ESE-agtige elemente en dui aan dat sodanige interaksie/kompetisie belangrik is vir abiotiese stres en ABA-reaksies (Fig. 6). Sulke interaksies kan verklaar waarom óf verlies van HIN1 funksie óf ektopiese HIN1 uitdrukking kan lei tot verbeterde splyting doeltreffendheid in ongestreste plante. Dit is moontlik dat ektopiese uitdrukking van HIN1 ander splitsingsfaktore sekwestreer of dat hoër vlakke van HIN1-uitdrukking lei tot verskillende posttranslasionele modifikasie (soos fosforilering) wat HIN1-funksie bepaal. Sulke HIN1 -interaksies en regulering deur posttranslasionale wysiging kan ook die meer prominente lokalisering van HIN1 in kernspikkels tydens spanning verklaar en kan die waarneming verklaar dat 35S:HIN1 het byna geen bykomende effek op splicing tydens lae ψ gehad niew spanning. Of spikkel-gelokaliseerde HIN1 aktief is en of die spikkels plekke is waar HIN1 gesekwestreer word, soos wat vermoedelik die geval is vir ander splitsingsfaktore, is onseker.

Moontlike meganismes van HAI1-HIN1 funksioneer in splitsingsregulering. Deposforylering van HIN1 deur HAI1 (en ander Clade A PP2C's) kan HIN1-interaksie met ander splitsingsverwante proteïene beïnvloed. HIN1-binding aan eksonstreke naby intron-exon-aansluitings kan ook die werwing of uitsluiting van ander splitsingsfaktore beïnvloed, insluitend dié wat bind aan soortgelyke RNA-cis-element-rye as HIN1. 'N Alternatiewe, en nie wedersyds uitsluitende, hipotese is dat HIN1 HAI1 (en miskien ander Clade A PP2C's) werf na spesifieke terreine om defosforylering van ander teikenproteïene te vergemaklik, soos RSZ22 en ander splitsingsverwante proteïene wat deur fosfoproteomiese analise van haai1-2 (24). Een of 'n kombinasie van hierdie meganismes lê ten grondslag aan die vermoë van HIN1 om die splitsing van spesifieke IR-geneigde introne te beïnvloed.

Die toenemende voorkoms van HIN1 -kernspikkels in die haai1-2 agtergrond en verminderde IR van HIN1-geaffekteerde gene in haai1-2 dui aan dat HAI1 die HIN1 -funksie beïnvloed. Dit is egter onwaarskynlik dat dit plaasvind via effekte op HIN1 RNA-binding aangesien dit by die N-terminale streek plaasgevind het, terwyl HAI1 met die C-terminale gedeelte van HIN1 interaksie gehad het en gedefosforileer het. In plaas daarvan kan HAI1-regulering van HIN1-fosforilering die interaksie met ander splitsingsverwante proteïene beïnvloed. 'N Ander moontlikheid wat nie wedersyds uitsluit nie, is dat werwing deur HIN1 HAI1 na die geskikte plek bring om splitsingsfaktore soos RSZ22 of ander te defosforyleer (fig. 6). Dit is bekend dat RSZ22 deur fosforylering beïnvloed word, aangesien fosfatase- en kinase -remmers die mobiliteit en verspreiding daarvan in kernspikkels verander (50 ⇓ –52). Meer algemeen is dit bekend dat die splitsingsfaktorfosforylering beïnvloed word deur abiotiese stres (32, 53, 54), en ons data dui aan dat HAI1 - HIN1 -interaksie deel is van 'n voorheen onbekende meganisme wat stres sein verbind met splitsingsfaktore.

Van die HIN1-verwante gene in Arabidopsis, net LIMYB is gekenmerk. Daar is gerapporteer dat LIMYB interaksie het met Ribosomal Protein L10 en die uitdrukking van ribosomale proteïengene afreguleer, wat lei tot 'n algemene afregulering van translasie om te verdedig teen virale replikasie (33). Hulle interpreteer die funksie van LIMYB as die van 'n transkripsiefaktor en vind verryking van LIMYB op ribosomale geenpromotore in chromatien -immunopresipitasie -toetse. Hulle het egter nie getoets of LIMYB DNS direk gebind het of deel was van 'n groter proteïenkompleks wat met ribosomale gene geassosieer word nie, wat miskien proteïene insluit wat betrokke is by kotranskripsionele verwerking van ribosomale RNA's. Ongeag of LIMYB ook 'n RNA -bindende proteïen is, die funksie daarvan verskil van die van HIN1 as benoud het geen groei beïnvloed nie, en LIMYB het slegs swak interaksie met HAI1 gehad. Die 2 eksperimenteel waargenome fosforileringsterreine in die C-terminale domein van HIN1, wat waarskynlik teikens van HAI1-defosforylering is, word nie in LIMYB bewaar nie (SI Bylae, Fig. S4). Daar moet ook op gelet word dat vars gewig en droë gewig van hin1 mutante is met byna 'n kwart verminder, selfs in die onbeklemtoonde beheer. Of hierdie verminderde groei uitsluitlik deur effekte op splitsing veroorsaak is of nie, is onbekend.Alhoewel ons data 'n rol vir HIN1 in splitsingsregulering bepaal, sluit ons nie die moontlikheid uit dat HIN1 addisionele funksies het wat die fisiologiese fenotipes van hin1 mutante of 35S:HIN1 plante.

Ander studies van stresgeïnduceerde veranderinge in splitsingspatrone het, na ons wete, nie die verskuiwing na verhoogde splitsingsdoeltreffendheid van IR-geneigde introne wat ons waargeneem het, waargeneem nie. Trouens, daar is berig dat korttermyn soutspanning of hitte spanning die voorkoms van IR verhoog (9, 55). 'N Belangrike verskil tussen ons studie en ander is dat ons plante blootgestel het aan 'n matige laag ψw meer as 96 uur om tyd toe te laat vir stres-akklimatisering. Gene waar HIN1 en lae ψw gelei tot verbeterde splitsingsdoeltreffendheid is verryk vir stres en seinverwante GO-terme. 'N Aantal hiervan was Vroeë reaksie op uitdroging (ERD) gene insluitend ERD6, 7, 10, 13, en 14 (Datastelle S9 en S15) sowel as ander gene wat bekend is dat hulle transkripsioneel veroorsaak kan word deur stres of betrokke is by stres sein (byvoorbeeld MAP Kinase 3 en baie gene wat verband hou met kalsium sein). Die totale transkripsievlak van hierdie gene was oor die algemeen onveranderd in ons lae ψ op lang termynw behandeling of deur 35S:HIN1. Vir gene soos die ERD's is die implikasie dat hierdie gene in die vroeë akute fase van stresreaksie transkripsie gereguleer is, terwyl splitsingsregulering van hierdie gene later geïnisieer word, of langer aanhou, tydens lae ψw akklimatisering. In die onbeklemtoonde kontrole kan 'n hoë vlak van IR wat lei tot die produksie van onstabiele transkripsies of transkripsies wat nie 'n aktiewe proteïen kodeer nie, 'n manier wees om te verseker dat die produksie van stresverwante proteïene afgeskakel word. Verhoogde splitsingsdoeltreffendheid tydens spanning sou die transkripsionele aktivering versterk of die duur van verhoogde proteïenproduksie uit hierdie gene tydens droogteakklimasie verleng.

Handmatige inspeksie van spanning en 35S:HIN1Uit aangetaste transkripsies is gevind dat byna al die IR -transkripsies voortydige stopkodons het, in ooreenstemming met ander studies oor alternatiewe splitsing van plante (10). As die transkripsie stabiel en getranskribeer is, is dit waarskynlik dat die afgeknotte proteïen wat geproduseer word nie-funksioneel is. In sommige gevalle kan 'n proteïen met veranderde funksie egter geproduseer word. Byvoorbeeld, IR van die laaste intron van NTL6/NAC062 (AT3G49530 Fig.C) produseer 'n transkripsie wat kodeer vir 'n afgeknotte proteïen sonder die membraanbindingsdomein. Hierdie afgeknotte proteïen hoef nie meer deur stres- of ABA-geïnduseerde splitsing van die plasmamembraan vrygestel te word om die kern binne te gaan en geenuitdrukking te reguleer nie (56, 57). Interessant genoeg is intron-retensie wat lei tot 'n soortgelyke C-terminale afkapping van 'n ortoloë NAC-transkripsiefaktor in mielies waargeneem (58), wat daarop dui dat alternatiewe splitsing 'n bewaarde meganisme kan wees om NAC-transkripsiefaktorfunksie te reguleer. Die effek van HIN1 op groei by lae ψw kan 'n kumulatiewe effek van gewysigde funksie of 'n veranderde oorvloed van sein- en stresverwante proteïene, soos NAC062, wat deur gene gekodeer word met HIN1-gereguleerde veranderinge in IR, verteenwoordig. Karakterisering van geval tot geval is nodig om te bepaal watter van die IR-transkripsies wat ons waargeneem het, lei tot 'n verlaagde proteïenvlak en wat lei tot die produksie van funksioneel verskillende isoforme. Soos hierbo genoem, sluit ons nie die moontlikheid uit dat ander aspekte van HIN1 molekulêre funksie ook tot die fisiologiese fenotipes daarvan kan bydra nie.

Ons data toon ook dat HAI1 met verskeie splitsingsfaktore kan interaksie hê. Dit stem ooreen met fosfoproteomiese analise van haai1-2 wat vermoedelike teikens vir HAI1 -defosforylering identifiseer wat verband hou met splitsing en RNA -verwerking (23). Die karakterisering van hierdie addisionele HAI1-gereguleerde proteïene sal 'n belowende benadering wees om verdere verbindings van stressein met pre-mRNA-splitsing aan die lig te bring. Dit kan die regulering van IR -gebeurtenisse insluit en veranderinge van skenker -aannemer -terrein wat deur stres geraak word, maar nie deur HIN1 geraak word nie. Dit sal op sy beurt lei tot beter algehele begrip van hoe en waarom abiotiese stres so 'n uitgesproke effek op alternatiewe splitsing het, 'n vraag wat steeds meer prominent in plantstresbiologie word.


Kyk die video: TOP 5 Suplemenata Za Dodavanje Misicne Mase (Oktober 2022).