Inligting

Hoe kan ek die mRNA-volgorde vir 'n spesifieke prokariotiese geen vind?

Hoe kan ek die mRNA-volgorde vir 'n spesifieke prokariotiese geen vind?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wat ek wil uitvind is die begin van die transkripsie vir 'n spesifieke geen, hoe lank die UTR is voordat die werklike koderingsvolgorde begin.

Ek het na verskeie databasisse soos NCBI Gene, Refseq of 'n gespesialiseerde een soos PRODORIC gekyk. Maar nie een van hulle bevat eintlik die mRNA -volgorde of inligting oor die onvertaalde dele van die mRNA nie. Net die koderingsvolgorde self.

Is hierdie soort inligting eenvoudig nie vir baie bakterieë geannoteer nie? Ek kyk nie na modelorganismes soos E. Coli of B. subtilis nie, maar ek sou verwag het dat inligting beskikbaar sou wees.

Is daar 'n databasis waar ek die werklike transkripsievolgordes vir prokariotiese gene kan vind?


MRNA spesifieke navrae

Voeg dit by u NCBI -navraag:EN mrna[filter]

As dit nie in groot databasisse beskikbaar is nie, is dit moontlik nie bekend nie.

MRNA -data kan egter onduidelik wees, selfs in die belangrikste databasisse, maar dit is moontlik behoort wees daar. Ek sal verbaas wees as dit die geval is, maar aangesien u nie met modelorganismes werk nie, is daar moontlik niks beskikbaar nie.

As u op soek is na 'n transkripsie -geen, het NCBI 'n paar wenke wat u hier kan sien om na hul databasis te soek. #8 kan vir u relevant wees, aangesien dit 'n manier is om uitsluitlik mRNA -rekords te filter.

As daar nie 'n UniGene -groep vir hierdie geen en organisme is nie, soek 'n soektog in die Nucleotide -databasis met die gennaam, produkaam of simbool. Sluit die organisme in by die soektog om die mees relevante resultate te vind en filter vir transkripsiereekse, byvoorbeeld:Sitochroom c EN brulpadda [orgn] EN mrna [filter].

Voorspelling van mRNA

Basies: ExPasy DNA -vertaalhulpmiddel

Gevorderd: regna 2

As ons aanvaar dat gevorderde navrae nie wys wat u nodig het nie, kan u 'n paar nuttige voorspellings maak voordat u dit na die laboratorium neem. Daar is 'n handjievol ander voorspellingsinstrumente wat u kan help as dit die enigste opsie is. Ek kan nie presies weet watter inligting u as insette het nie. As ek aanvaar dat u die DNA -volgorde het, sou ek begin met die voor die hand liggende keuse: die ExPasy DNA -vertaalhulpmiddel.

Ek sou dan sê dat regrna 2 jou dalk in die regte rigting kan stuur ten opsigte van meer subtiele vertaalelemente.


Waarom kan prokariotiese transkripsie en vertaling gelyktydig plaasvind?

Dit is omdat daar geen kern in is nie prokariote wat die transkripsie en vertaling proses. Daarom, wanneer bakteriese gene is getranskribeer dan begin transkripsies vertaal onmiddellik. Prokariotiese transkripsie kom in die sitoplasma langsaan voor vertaling en beide prosesse vind plaas gelyktydig.

Tweedens, kan eukariotiese selle gelyktydig transkripsie en translasie ondergaan? In 'n prokariotiese sel, transkripsie en vertaling gekoppel is, dit wil sê vertaling begin terwyl die mRNA nog steeds gesintetiseer word. In 'n eukariotiese sel, transkripsie kom in die kern voor, en vertaling kom voor in die sitoplasma.

Mense vra ook: waarom kan transkripsie en vertaling gelyktydig in prokariote voorkom, maar nie in eukariote nie?

Prokariotiese transkripsie kom in die sitoplasma langsaan voor vertaling. Prokariotiese transkripsie en vertaling kan gebeur gelyktydig. Hierdie is onmoontlik in eukariote, waar transkripsie kom voor in 'n membraangebonde kern terwyl vertaling kom buite die kern in die sitoplasma voor.

Kan 'n sel alle gene gelyktydig transkribeer?

Is dit waarskynlik dat a sel sou transkribeer alles die gene binne sy kern gelyktydig? Hoekom of hoekom nie? Geen, selle enigste transkribeer gene vir spesifieke proteïene op 'n slag. Nee, seker gene sal spesifiek aangeskakel/afgeskakel word selle, afhangende van ligging en funksie.


'N Nuwe mRNA -wysiging kan geenuitdrukking beïnvloed


Navorsers by CCR het 'n nuwe verandering in menslike boodskapper -RNA (mRNA) geïdentifiseer. NAT10, 'n ensiem wat verantwoordelik was vir die wysiging, is voorheen betrokke by kanker en veroudering. Dit is een van die eerste voorbeelde van 'n unieke chemiese modifikasie aan mRNA ('n sleutelfaktor in die ontsyfering van die genetiese kode) wat 'n toename in proteïenproduksie veroorsaak. Die studie deur Shalini Oberdoerffer, Ph.D., ondersoeker in die laboratorium vir reseptorbiologie en gene -uitdrukking, en kollegas, verskyn op 15 November 2018 in Sel.

Die ontsyfering van die genetiese kode is 'n multi-stap proses wat begin met die transkripsie van inligting vervat in DNA na 'n boodskapper RNA, die resulterende mRNA's word dan vertaal in proteïene wat sleutelkomponente van die sel uitmaak. Dit is bekend dat RNA gemodifiseer kan word na aanleiding van die transkripsieproses as 'n manier om funksie te reguleer. Hierdie studie bied 'n eerste voorbeeld van 'n chemiese verandering aan mRNA wat proteïenproduksie verbeter. Die ondersoekers stel voor dat die verandering die tempo waarmee die genetiese kode binne elke string van mRNA gelees word, verander.

Die navorsers het gefokus op 'n spesifieke chemiese modifikasie aan mRNA, N4-asetielsitidine (ac4C). Hulle het eers die teenwoordigheid van ac4C na duisende menslike mRNA's gekarteer. In die laboratorium het die wetenskaplikes vervolgens vasgestel dat die teenwoordigheid van ac4C binne mRNA's hul vermoë om in proteïen vertaal te word, kragtig verbeter het. Hulle het verder getoon dat ac4C 'n invloed het op die proliferasie van selle, 'n kenmerk van kankerselle.

"Ons hoop om hierdie ontdekking eendag in te span om die wysiging spesifiek op sleutel -mRNA's te rig en sodoende nuwe terapieë te skep," het dr. Oberdoerffer gesê.

Die volgende stappe van die navorsers is om in kaart te bring hoe die wysiging spesifiek funksioneer om geenuitdrukking te verander, asook om vas te stel of wanregulering die hoofoorsaak van sekere siektes is.

Die titel en teks van hierdie artikel is geredigeer om beter te weerspieël dat die NAT10 -ensiem geenuitdrukking beïnvloed deur die mRNA te verander sodat dit lei tot groter proteïenproduksie. Hierdie chemiese modifikasie aan mRNA verander nie DNS nie.


Wat is eukariotiese gene -uitdrukking

Eukariotiese geenuitdrukking is die produksieproses van geenprodukte gebaseer op die inligting in die eukariotiese gene. Dit vind ook plaas deur transkripsie en vertaling. Hier, aangesien eukariotiese DNA binne die kern voorkom, vind die transkripsie ook binne die kern plaas. Drie RNA-polimerases is verantwoordelik vir die transkripsie van verskillende tipes RNA's: RNA-polimerase 1, wat rRNA sintetiseer, RNA-polimerase 2, wat mRNA sintetiseer, en RNA-polimerase 3, wat tRNA sintetiseer. Boonop is elke eukariotiese geen onder die beheer van 'n individuele promotor. Gevolglik produseer transkripsie 'n monokistroniese mRNA.

Figuur 2: Prokariotiese en Eukariotiese geenuitdrukking

Aan die ander kant ondergaan die primêre transkripsie van mRNA post-transkripsie-modifikasies, insluitend die byvoeging van 'n 5'-dop en 'n 3'-poli A-stert. Daarbenewens word die introne wat die proteïenkoderende gebied van die eukariotiese mRNA onderbreek, uitgesplits in 'n proses wat RNA-splywing genoem word. Die uiteindelike mRNA -molekule is die volwasse mRNA wat die kern na die sitoplasma verlaat en gereed is vir translasie. 80S Ribosome is verantwoordelik vir die vertaling van die eukariotiese mRNA.


16.1 Die Sentrale Dogma: DNA Kodeer mRNA en mRNA Kodeer Proteïen

Die vloei van genetiese inligting in selle van DNA na mRNA na proteïen word beskryf deur die Sentrale Dogma van molekulêre biologie (Figuur 16.2). Wanneer 'n sel 'n spesifieke proteïen benodig, word die geen wat vir daardie proteïen kodeer geaktiveer en 'n enkelstring-mRNA-kopie word van die geen gemaak, in 'n proses genaamd transkrif. Die kode wat in die mRNA gekopieer is, word dan gebruik om die volgorde van aminosure in die proteïen te bepaal, in 'n proses genaamd vertaling. Die kopiëring van DNA na RNA is relatief eenvoudig, met een nukleotied wat by die mRNA-string gevoeg word vir elke nukleotied wat in die DNA-string gelees word. Die vertaling na proteïen is 'n bietjie meer kompleks omdat drie mRNA -nukleotiede ooreenstem met een aminosuur in die polipeptiedvolgorde (Figuur 16.2).

Figuur 16.2 Die sentrale dogma van molekulêre biologie. DNA -segmente, genen genoem, word in mRNA -kopieë oorgeskryf. mRNA word dan "gelees" in drie-nukleotiedkodons om die volgorde van aminosure in 'n proteïen te spesifiseer.

Die genetiese kode is universeel en oorbodig

Hoe spesifiseer die volgorde van nukleotiede in 'n mRNA die volgorde van aminosure in 'n proteïen? mRNA word "gelees" in drie nukleotiedesegmente wat genoem word kodons. Aangesien RNA vier nukleotiede (A, C, U en G) het, is daar 64 (4 3) moontlike kombinasies van drie nukleotiede (Figuur 16.3). 61 van hierdie kodone kodeer vir een van die 20 algemene aminosure. Die ander drie word gebel stop kodons of nonsens kodons omdat hulle nie vir 'n aminosuur kodeer nie.

Figuur 16.3 Die genetiese kode laat selle toe om elke nukleotied drieling in mRNA te vertaal in 'n aminosuur of 'n beëindigingssein in 'n proteïen. (krediet: wysiging van werk deur NIH)

Wetenskaplikes het die genetiese kode noukeurig opgelos deur sintetiese mRNA's in vitro te vertaal en die proteïene wat hulle gespesifiseer het, te volg (Figuur 16.4). Sodra al die kodons bekend was, het hulle 'n paar belangrike kenmerke van die kode ontdek.

Die genetiese kode is universeel. Met enkele uitsonderings gebruik feitlik alle spesies dieselfde genetiese kode vir proteïensintese. Bewaring van kodons beteken dat 'n gesuiwerde mRNA wat vir die globienproteïen by perde kodeer, na 'n tulpsel oorgedra kan word, en die tulp sou perdeglobien sintetiseer. Dat daar slegs een genetiese kode is, is 'n kragtige bewys dat die hele lewe op aarde 'n gemeenskaplike oorsprong het

Aangesien daar meer nukleotied-drieling is as wat daar aminosure is, is die genetiese kode oortollig. Met ander woorde, 'n gegewe aminosuur kan deur meer as een nukleotied drieling gekodeer word. Redundansie verminder die negatiewe impak van ewekansige mutasies. Kodons wat dieselfde aminosuur spesifiseer verskil tipies net met een nukleotied, gewoonlik die derde een. Byvoorbeeld, ACU, ACC, ACA en ACG kodeer almal vir die aminosuur treonien. Boonop word aminosure met chemies soortgelyke sykettings gekodeer deur soortgelyke kodons. UGU en UGC kodeer byvoorbeeld vir die aminosuur cysteine, terwyl AGU en AGC vir die aminosuur serine. Sisteïen en serien het albei polêre sykettings wat baie soortgelyk is in grootte en ander eienskappe. Die oortolligheid van die genetiese kode verseker dus dat 'n enkele-nukleotied-substitusiemutasie dieselfde aminosuur of 'n soortgelyke aminosuur kan spesifiseer, wat voorkom dat die proteïen heeltemal nie-funksioneel word.

Terwyl 61 van die 64 kodons die toevoeging van 'n spesifieke aminosuur tot 'n polipeptiedketting spesifiseer, beëindig die oorblywende drie kodons proteïensintese en stel die polipeptied uit die translasiemasjinerie vry. Hierdie drielinge word genoem nonsens kodons, of stop kodons. 'N Ander kodon, AUG, het ook 'n spesiale funksie. Benewens die spesifikasie van die aminosuur metionien, dien dit ook as die begin kodon vertaling te begin. Die leesraam vir vertaling word bepaal deur die AUG -startkodon naby die 5 ′ -einde van die mRNA.

Toeligting van die genetiese kode

Gegewe die verskillende getalle "letters" in die mRNA en proteïen "alfabette", het wetenskaplikes teoretiseer dat kombinasies van nukleotiede ooreenstem met enkele aminosure. Nukleotiedubblette is nie voldoende om elke aminosuur te spesifiseer nie, want daar is slegs 16 moontlike kombinasies met twee nukleotiede (4 2). Daarteenoor is daar 64 moontlike nukleotied drielinge (4 3). Die feit dat aminosure deur nukleotied drielinge gekodeer is, is eksperimenteel bevestig deur Francis Crick en Sydney Brenner. Hulle het een, twee of drie nukleotiede in die geen van 'n virus ingevoeg. Wanneer een of twee nukleotiede ingevoeg is, is die proteïen nie gemaak nie. Toe drie nukleotiede ingevoeg is, was die proteïen gesintetiseer en funksioneel. Dit het getoon dat drie nukleotiede elke aminosuur spesifiseer. Die nukleotied-drieling wat vir aminosure kodeer, word genoem kodons. Die invoeging van een of twee nukleotiede het die drieling r heeltemal verandereading raamen sodoende die boodskap vir elke daaropvolgende aminosuur verander (Figuur 16.4). Alhoewel die invoeging van drie nukleotiede veroorsaak dat 'n ekstra aminosuur tydens translasie ingevoeg word, is die integriteit van die res van die proteïen gehandhaaf.

/>Figuur 16.4 Die verwydering van twee nukleotiede verskuif die leesraamwerk van 'n mRNA en verander die hele proteïenboodskap, wat 'n niefunksionele proteïen skep of proteïensintese heeltemal beëindig.

Uitsonderings op die Sentrale Dogma

Baie gene kodeer vir RNA -molekules wat nie as mRNAs funksioneer nie en dus nie in proteïene vertaal word nie. Sommige RNA's, wat rRNA genoem word, vorm dele van die ribosome. Ander vorm oordrag -RNA's, of tRNA, wat help met vertaling. Nog ander kan reguleer watter gene uitgedruk word.

'N Ander uitsondering op die sentrale dogma is dat inligting in sommige gevalle agteruit vloei, soos gesien kan word in sekere virusse wat retrovirusse genoem word. Hierdie virusse het gene wat uit RNA bestaan ​​en wanneer retrovirusse 'n sel besmet, moet die virus 'n DNA -weergawe van die RNA -gene sintetiseer met behulp van 'n gespesialiseerde virale polimerase genaamd reverse transcriptase. Die menslike immuungebrekvirus (MIV), wat VIGS veroorsaak, is 'n retrovirus en baie van die voorgeskrewe middels wat vir VIGS -pasiënte gebruik word, is gerig op die MIV -transkriptase.


Metodes

Genemonsterneming

Uitgebreide BLAST 39 -soektogte wat oor die diversiteit van eukariotiese en prokariotiese lewe strek, is uitgevoer om vermeende eukariotiese en prokariotiese PPO -homoloë te identifiseer. Bykomende soektogte is ook uitgevoer, behalwe landplante (embryofiete, taxid: 3193). Die soektogte na aminosuurvolgordes is uitgevoer teen die GenBank nie-oortollige proteïenvolgorde-databasis met behulp van die BLASTp-instrument van die NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST-bediener. Die PPO-TYR-domein is ook gebruik om die genome van eensellige eukariote in die Joint Genome Institute (http://genome.jgi-psf.org/) en Phytozome (www.phytozome.net) te deursoek. Om die robuustheid van die geenmonsterneming na te gaan, is addisionele soektogte met behulp van PSI-BLAST 39 (5 ​​iterasies), tBLASTn en HMMER 40 uitgevoer.

Filogenetiese analise

Tyrosinase-domeine van PPO-proteïene en ander TYR-bevattende proteïene was in lyn met ClustalW 41 en geredigeer met Jalview 2.8 42 om gapings te verminder. Inligting oor rye wat gebruik word, word breedvoerig in Aanvullende Tabel S1 beskryf. Die boom in Fig. 1b het die LG -proteïensubstitusiemodel 43 gebruik, maar JTT 44 en Blosum62 45 het in wese dieselfde resultate gelewer. Bootogenoemde maksimum waarskynlikheid dat filogenetiese bome gebou is met Phyml 3.0 46,47. Gammakorreksie is gebruik om heterogeniteit in evolusionêre snelhede te verklaar met vier diskrete klasse webwerwe, 'n geskatte alfa -parameter en 'n geskatte deel van onveranderlike plekke soos geïmplementeer in Phyml. 'n Totaal van 100 bootstrap-herhalings is gebruik om robuustheid te bepaal en boomtopologie is geoptimaliseer deur subboom snoei en hertransplantasie (SPR). Die boom is met TreeDyn 48 gevisualiseer en geredigeer. Die figuur 1d -skema wat ons huidige begrip van die supergroep Plantae -evolusie opsomm en vereenvoudig, is geïnspireer deur diegene wat onlangs 3,49,50 gepubliseer is.

Vergelyking van proteïendomeinargitektuur

Gene wat vir proteïene met tyrosinase -domeine kodeer, is vergelyk deur hul ooreenstemmende proteïendomeinargitekture te ondersoek met behulp van CDART (Conserved Domain Architecture Retrieval Tool: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi) 51 en die CDD (Conserved Domains Database: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml) 13 van die NCBI.

Strukturele modellering

Die strukturele modellering is uitgevoer met behulp van die intensiewe modelleringsmodus van die Protein Homology/analogy Recognition Engine (Phyre) Weergawe 2.0 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ html/page.cgi?id= indeks) 52.

Plasmiede, plantmateriaal en groeitoestande

Vollengte cDNA's wat kodeer Solanum tuberosum PPO (GenBank-toegangsnommer: U22921) of a PPO weergawe wat lokaliseringsein ontbreek, is vanaf cDNA versterk en in plasmied pDONR207 gekloneer deur gebruik te maak van Gateway-tegnologie (Invitrogen, Kalifornië, VSA). Die in siliko die opsporing van die subsellulêre lokalisasie sein is geïdentifiseer met behulp van ChloroP 21 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/). Die volgorde is daarna in plasmiede pGWB405 53, pET28 54 (aangepas vir Gateway-versoenbare kloning) en pB7FWG2 55 gesubkloneer. Konstruksies is bevestig deur beperkingskaarte en DNA -volgorde -analise. Inligting oor die gebruikte primers word breedvoerig beskryf in aanvullende tabel S2. Konstrukte in pGWB405 is gebruik vir verbygaande uitdrukking in Nicotiana benthamiana blare 56. Konstrukte in pET28 is gebruik vir proteïenuitdrukking in Escherichia coli. Konstrukte in pB7FWG2 is gebruik vir stabiel Agrobacterium tumefaciens-bemiddelde transformasie van Arabidopsis thaliana plante (ekotipe Kol-0) 57 . Homosigotiese Arabidopsislyne wat 'n enkele T-DNA-invoeging bevat, is gekies op grond van die segregasie van die fosfinotrisien (PPT) weerstandsmerker. Aanvanklike segregasie -analise is uitgevoer deur plante te saai op steriele Murashige en Skoog (MS) medium plate aangevul met 20 μg/ml PPT (Duchefa, Haarlem, Nederland). 'N Totaal van 25 PPOM. en 29 PPOA homosigotiese lyne is geïsoleer waaruit drie onafhanklike lyne van elke PPO weergawe gekies is vir verdere karakterisering. Arabidopsis-plante is op grond gekweek in 'n klimaatbeheerde groeikamer (22 °C, 65–70% RH en 60 μmol m −2 s −1 fotosinteties aktiewe bestraling) onder 8 uur lig/16 uur donker fotoperiode vir 4 weke. Vir fenielpropanoïde profilering is Arabidopsis-sade aan die oppervlak gesteriliseer en op Petri-plate gesaai met steriele MS-medium wat 1% agar en 30 g/L sukrose bevat. Indien aangedui, is plate aangevul met 5 μM norflurazon. Na stratifikasie vir 3 dae by 4 ° C in die donker, is die plate 20 dae lank in groeikamers by 22 ° C onder deurlopende lig (130 μmol m −2 s − 1 fotosinteties aktiewe bestraling) geïnkubeer.

Uitdrukking van rekombinante PPOA en PPOM. in E coli selle

Na transformasie van bevoegde E coli selle stam Rosetta 2 (DE3) (Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) met gesuiwerde plasmiede pET28-PPOA en pET28-PPOM., die aktiwiteit van PPOA en PPOM. is bevestig deur die groei van die getransformeerde E coli selle vir drie dae by 28 °C op LB-agarplate aangevul met 34 μg/ml chlooramfenikol, 25 μg/ml kanamisien, 0,5 mM IPTG, 40 μg/ml CuSO4 en 600 μg/ml chlorogene suur, soortgelyk aan metodes wat voorheen beskryf is 58 om melanienvorming op te spoor. PPOA en PPOM. kolonies was donker omdat die selle melanienagtige polimere kon produseer.

Konfokale laserskanderingsmikroskopie

Subsellulêre lokalisering van GFP fluoressensie en chlorofil fluoressensie is bepaal met 'n Olympus FV 1000 konfokale laserskanderingsmikroskoop (Olympus, Tokio, Japan) met behulp van 'n argon laser vir opwekking (by 488 nm) en 'n 500–510 nm filter vir opsporing van GFP en 'n 610–700 nm filter vir opsporing van chlorofilfluoressensie.

Meting van rosetblare se oppervlakte

Die oppervlak van rosetblare is gemeet met Photoshop (Adobe, Kalifornië, VSA) en GraphPad Prism 5.0a (GraphPad Software, Kalifornië, VSA) deur digitale beelde (van bo af) van vier weke oue plante te ontleed en te vergelyk met grootte standaard reeks wat wissel van 4 tot 16 cm 2 .

Transkripsie -analise

Blaarmonsters van 4-week-oue plante is geoes en totale RNA is onttrek met behulp van die Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue Kit (Promega, Wisconsin, VSA) volgens die vervaardiger se instruksies. Gesuiwerde RNA's is gekwantifiseer deur spektroskopie met behulp van 'n NanoDrop -apparaat (Thermo Scientific, Massachusetts, VSA) en RNA -integriteit is geëvalueer deur agarosegelelektroforese. Die First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Basel, Switserland) is gebruik om cDNA te genereer volgens die instruksies van die vervaardiger, met behulp van 50 pmol van 'n verankerde poly (dT) primer [d (T18V)] en 2 μg totale RNA. Die relatiewe mRNA-oorvloed is geëvalueer via kwantitatiewe omgekeerde transkripsie PCR (RT-qPCR) in 'n totale reaksievolume van 20 ul met behulp van LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Basel, Switserland) op 'n LightCycler 480 Real-Time PCR-stelsel (Roche, Basel, Switserland) met 0,3 μM van elke spesifieke sintuig en anti-sintuig primers. Drie onafhanklike biologiese herhalings van elke monster en drie tegniese herhalings van elke biologiese herhaal is uitgevoer en die gemiddelde waardes is oorweeg vir verdere berekeninge. Die genormaliseerde uitdrukking van PPO is bereken soos beskryf 59 met behulp van UBC (Arabidopsis ubiquitin-conjugating enzyme gene At5g25760, GenBank accession number: DQ027035) as die endogene verwysingsgeen. Inligting oor die gebruikte primers word breedvoerig beskryf in aanvullende tabel S2.

PPO aktiwiteit

Proteïenekstrakte is verkry van rosetblare wat gehomogeniseer is teen 'n verhouding van 50 mg vars gewig tot 1000 μl 20 mM fosfaatbuffer (pH 6). Die homogenaat is by 16.000 × gesentrifugeer g en 4 ° C vir 5 minute en die supernatant is gebruik vir proteïenbepaling van PPO -aktiwiteit. PPO-aktiwiteitstoetse is uitgevoer in 20 mM fosfaatbuffer (pH 6) wat 10 mM L-DOPA bevat. Die reaksie is gemeet met 'n SpectraMax M3 spektrofotometer (Molecular Devices, Kalifornië, VSA) deur die verandering in absorbansie by 475 nm en 25 °C.

Fenielpropanoïed profilering

Fenielpropanoïede (spesifiek flavonoïede) is gesuiwer en ontleed soos voorheen beskryf 60 met geringe wysigings. Kortliks, gevriesdroogde Arabidopsis-saailinge is gehomogeniseer teen 'n verhouding van 1 mg droë gewig tot 33 μL metanol:asetaat:H2O (9: 1: 10) ekstraksieoplosmiddel wat 0,1 mg/ml naringenien bevat as 'n interne standaard vir kwantifisering. Homogenate is in die donker by 4 °C vir 30 minute met roering (1000 rpm) geïnkubeer en dan teen 14 000 × gesentrifugeer g en 4 ° C vir 5 min. Supernatante is herwin, gefiltreer en ontleed deur hoëprestasie vloeistofchromatografie (HPLC) met behulp van 'n Agilent 1200-reeks HPLC-toerusting (Agilent Technologies, Kalifornië, VSA) met 'n XSelect CSH C18 (3,5 μm, 4,6 × 100 mm) kolom (Waters, Massachusetts , Die VSA). Flavonole en antosianiene is onderskeidelik by 320 en 520 nm bepaal.

Data-analise

ANOVA gevolg deur Newman-Keuls meervoudige vergelyking post-hoc toetse is gebruik om statistiese betekenisvolheid vir veelvuldige groepe te bepaal. Pearson -korrelasiekoëffisiënte (r waardes) is bereken met behulp van die oppervlakte van rosetblare, PPO mRNA -oorvloed en PPO -aktiwiteit. Statistiese ontleding is uitgevoer met behulp van GraphPad Prism 5.0a (GraphPad Software, Kalifornië, VSA).


Metodes

Bakteriese stamme en kultuurtoestande

Escherichia coli MG1655 (ATCC: 700926) oornagkulture is om 1:50 in vars LB -medium geënt en by 37 ° C met skud (150 rpm) verbou. Nadat die eksponensiële groeifase bereik is, is die kultuur vir 10 min by 3000 g gesentrifugeer. Die media is verwyder en die korrel is hersuspendeer in PBS tot 'n konsentrasie van 10 7 selle per μL. Die selle is op ys geberg en totale RNA -ekstraksie is onmiddellik uitgevoer.

RNA ekstraksie

Trizol (Thermo Fisher Scientific, Kat. # 15596018) RNA-ekstraksie is uitgevoer volgens die vervaardiger se protokol. Kortliks, 10 8 selle is by 750 μL Trizol gevoeg, gemeng en dan gekombineer met 150 μL chloroform. Na sentrifugering is die helder waterige laag herwin en met 375 μL isopropanol en 0.67 μL GlycoBlue (Thermo Fisher Scientific, Kat. # AM9515) gepresipiteer. Die korrel is twee keer gewas met 75% etanol en na die laaste sentrifugering is die resulterende pellet in RNase-vrye water geresuspendeer.

EMBR-sek

Poli -adenilering

100 ng totale RNA in 2 μL is gekombineer met 3 μL poly-A-mengsel, bestaande uit 1 μL 5x eerste string buffer [250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, kom met Superscript II omgekeerde transkriptase, Invitrogen Cat. # 18064–014], 1 μL blokkerende onderlaagmengsel (sien Primers), 0,8 μL nukleasevrye water, 0,1 μL 10 mM ATP en 0,1 μL E coli poly-A polimerase (New England Biolabs, Cat. # M0276S). Die mengsel is vir 10 min by 37 °C geïnkubeer. In die kontrolegroep is geen blokkerende primers bygevoeg nie en 1,8 μL nukleasevrye water is bygevoeg. Vir EMBR-seq met óf ongemodifiseerde óf gefosforileerde 3'-end blokkerende primers, is die blokkerende primer mengsel voorberei deur gelyke volumes van 50 μM blokkerende primers spesifiek vir 5S, 16S en 23S rRNA te meng. Vir EMBR-seq met hotspot blokkerende primers, is die blokkerende primer mengsel voorberei deur gelyke volumes 100 μM 3'-end blokkerende primers met 100 μM hotspot blokkerende primers te meng, sodat die finale mengsel 50 μM 3'-end primers was (3 primers gemeng) en 50 μM hotspot primers (6 primers gemeng).

Omgekeerde transkripsie

Die polyadenyleringsproduk is gemeng met 0,5 μL 10 mM dNTPs (New England Biolabs, Cat. # N0447L), 1 μL reverse transkripsie primers (25 ng/μL, sien Primers), en 1.3 μL blokkerende primermengsel, en verhit tot 65 ° C vir 5 minute, 58 ° C vir 1 minuut, en dan op ys geblus. In die kontrolemonsters is die blokkerende primers weer vervang met nukleasevrye water. Vervolgens word 3,2 μL RT -mengsel, bestaande uit 1,2 μL 5x eerste -string buffer, 1 μL 0,1 M DTT, 0,5 μL RNaseOUT (Thermo Fisher Scientific, Cat. #10777019) en 0,5 μL Superscript II reverse transkriptase by die oplossing gevoeg, gevolg deur 1 uur inkubasie by 42 °C. Die temperatuur is daarna vir 10 minute na 70 ° C verhoog om Superscript II te verhit.

Tweede streng sintese

49 μL van die tweede string mengsel, wat 33.5 μL water, 12 μL 5x tweede string buffer [100 mM Tris-HCl (pH 6.9), 23 mM MgCl bevat2, 450 mM KCl, 0,75 mM β-NAD, 50 mM (NH4)2 SO4, Invitrogen, Kat. # 10812–014], 1,2 μL 10 mM dNTP's, 0,4 μL E coli ligase (Invitrogen, Kat. # 18052–019), 1.5 μL DNA-polimerase I (Invitrogen, Kat. # 18010–025), en 0.4 μL RNase H (Invitrogen, Kat. # 18021–071), is by die produk gevoeg vanaf die vorige stap. Die mengsel word vir 2 uur by 16 ° C geïnkubeer. cDNA is gesuiwer met 1x AMPure XP DNA-krale (Beckman Coulter, Kat. # A63881) en geëlueer in 24 μL nukleasevrye water wat daarna tot 6.4 μL gekonsentreer is.

In vitro transkripsie

Die gekonsentreerde oplossing is gemeng met 9,6 μL Ambion in vitro transkripsiemengsel (1,6 μL van elke ribonukleotied, 1,6 μL 10x T7 reaksie buffer, 1,6 μL T7 ensiem mengsel, MEGAscript T7 transkripsie kit, Thermo Fisher Scientific, kat. # AMB13345) en geïnkubeer by 37 °C vir 13 uur. Vervolgens is die aRNA behandel met 6 μL EXO-SAP (ExoSAP-IT ™ PCR Product Cleanup Reagent, Thermo Fisher Scientific, Cat. # 78200.200.UL) vir 37 minute by 37 ° C, gevolg deur fragmentasie met 5,5 μL fragmentasie buffer (200 mM Tris-asetaat (pH 8,1), 500 mM KOAc, 150 mM MgOAc) by 94 ° C vir 3 minute. Die reaksie is dan geblus met 2.75 μL stopbuffer (0.5 M EDTA) op ys. Die gefragmenteerde aRNA is gekies in grootte met 0.8x AMPure RNA krale (RNAClean XP Kit, Beckman Coulter, Kat. # A63987) en geëlueer in 15 μL nuklease-vrye water. Daarna is Illumina-biblioteke voorberei soos voorheen beskryf [20].

EMBR-seq met TEX-vertering

Om die Terminator™ 5'-fosfaatafhanklike eksonuklease (Lucigen, Kat. # TER5120) te toets, is 100 ng van totale RNA in 2 μL gekombineer met 18 μL TEX-mengsel, bestaande uit 14.5 μL nukleasevrye water, 2 μL terminatorbuffer A, 0,5 μL RNAseOUT, en 1 μL TEX. Die oplossing is vir 1 uur by 30 °C geïnkubeer en met 1 μL 100 mM EDTA geblus. Die produk is met 1x AMPure RNA-krale gesuiwer en in 10 μL nukleasevrye water geëlueer en tot 2 μL gekonsentreer. Hierdie TEX-verteerde totale RNA is dan gebruik as begin-RNA in die EMBR-seq protokol hierbo beskryf.

EMBR-volgens bioinformatiese analise

Opeenvolgende volgorde van die EMBR-seq-biblioteke is uitgevoer op 'n Illumina NextSeq 500. Alle volgordebepalingsdata is onder die toetredingsnommer GSE149666 by Gene Expression Omnibus gestort. In die volgordebiblioteke bevat die linkermaat inligting oor die monsterstrepieskode (sien Primers). Die regte maat word na die bakteriese transkriptoom gekarteer. Voor die kartering is slegs leesstukke met geldige monsterstrepieskodes behou. Vervolgens is die leeswerk gekarteer na die verwysingstranskriptoom (E coli K12 substraat. MG1655 cds ASM584v2) met Burrows-Wheeler Aligner (BWA) met standaardparameters.

Ontleding van opsporingsvooroordeel in EMBR-seq

E coli operone is afgelaai vanaf RegulonDB [44]. Operone met ten minste 2 gene is ingesluit vir hierdie analise. Die data van EMBR-seq-biblioteke met 100 ng beginmateriaal is in kaart gebring E coli K12 substraat. MG1655 verwysingsgenoom (ASM584v2). Vir elke lees wat binne 'n operon karteer, is die afstand van die gekarteerde ligging vanaf die 3′-kant van die operon bereken, met inagneming van die leeslengte. Vervolgens is die operone in 50 houers gediskretiseer, en alle operone met meer as 200 unieke leeswerk is oorweeg vir stroomaf-analise. Die aantal lesings in elke bin is dan genormaliseer deur die totale aantal leess in elke operon, en die gemiddelde van die relatiewe lees binne elke bin is bereken. Om bakteriële data van EMBR-seq te vergelyk met soogdierdata van CEL-seq, het ons CEL-seq-data afgelaai wat in Grün et al. (GEO -toetreding: GSM1322290) en soortgelyke analise vir die muise -gene uitgevoer [45].

Bewaring van sekwense van 16S en 23S rRNA

16S rRNA rye van 4000 spesies is verkry uit rrnDB [46], terwyl 23S rRNA rye van 119 spesies gekies is uit NCBI RefSeq [47]. Vervolgens is die laaste 100 basisse van die 3'end van elke volgorde in lyn gebring met behulp van Clustal Omega [48]. Shannon-entropie vir elke belynde basislokasie is daarna so bereken dat die maksimum entropiewaarde 1. Vyf moontlikhede is toegelaat: "A", "T", "C", "G" en "-".

Primers

Omgekeerde transkripsie primers word hieronder getoon met die strepieskodes van die 6-nukleotiedmonster onderstreep [20]:

Die volgende vyf strepieskodes is in hierdie studie gebruik:

In die geval van die 3'-gefosforileerde primers, het alle blokkerende primers 'n 3'-fosforileringsmodifikasie.

16S primer vir hotspot op posisie 107:

16S primer vir hotspot op posisie 682:

16S primer vir hotspot op posisie 1241:

23S-onderlaag vir hotspot by posisie 375:

23S primer vir hotspot by posisie 1421:

23S primer vir hotspot op posisie 1641:

Elke primer is ontwerp om ongeveer 100 bp stroomaf van die hotspot te uitgloei. Die presiese posisie en lengte van elke onderlaag is aangepas om die T te versekerm was bo 65 °C.


Hoe om promotorvolgorde vir 'n spesifieke geen op te spoor

Baie mense het probleme met die identifisering of voorspelling van die promotorvolgorde van 'n geen, of weet nie hoe om die werklike volgorde vir ontleding te kry nie, soos primerontwerp, transkripsiefaktorbinding van webwerf, ens. Hier gee ek maniere hoe ek hierdie dinge kan doen. Moenie vergeet om die nuutste casinospeletjies by DaisySlots te probeer om die stres wat jy ervaar, te help verlig nie.

Hoe om promotorreekse uit genoomdatabasisse te vind en op te haal. Promotorreekse is gewoonlik die volgorde onmiddellik stroomopwaarts van die begin van die transkripsie (TSS) of die eerste ekson. As ons die TSS van 'n geen ken, sal ons met vertroue weet waar die promotor selfs sonder eksperimentele karakterisering is. Vir baie organismes, soos die mens, die muis, is die genoom goed geannoteer en TSS goed gedefinieer. Die herwinning van promotorvolgorde is dus 'n maklike taak. Daar is drie groot genoomblaaiers: NCBI, Ensembl en UCSC. Vir ons doel bied Ensembl die maklikste koppelvlak. Hier is 'n voorbeeld:


Materiaal en metodes

Gasheerlyne en verslaggewer Gene. 'N DNA-fragment met 96 kop-tot-stert-tandemherhalings van die 50-nt-lange volgorde 5'-CAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGAGCACCAGCCAGCTGATCGACCTCGA-3' is voorberei soos beskryf deur Robinett et al. (19) en in die plasmied pTRE-d2EGFP (Clontech) ingevoeg deur die veelvoudige kloneringsplekke daarvan te gebruik. The resulting plasmid, pTRE-GFP-96-mer, was used to transfect CHO cell line CHO-AA8-Tet-off (Clontech), which possesses a stably integrated gene for the tetracycline-controlled Tet-off transactivator. A geneticin G418-resistant clone (CHO-GFP-96-mer) that responded to 10 ng/ml doxycycline in the medium by turning off its fluorescence within 24 h was selected. To obtain cells expressing histone H2B-GFP, this cell line was transfected with plasmid pBOS-H2BGFP (BD Biosciences), and a clone that exhibited an intense GFP signal in the nuclei was isolated.

Cells were cultured in the α modification of Eagle's minimal essential medium (Sigma) supplemented with 10% TET-System-Approved FBS (Clontech). Imaging was performed in phenol red-free OptiMEM (Invitrogen). Cells used in the ATP-depletion studies were first incubated in glucose-free Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) containing 10 mM sodium azide and 60 mM 2-deoxyglucose for 30 min and then imaged in OptiMEM containing the same inhibitors. After this treatment, the mitochondria in the cells could not be stained by rhodamine 123 (Sigma), confirming that the inhibitors were effective (14).

Molecular Beacons. The sequences of the molecular beacons were Cy3 or Alexa-594-5′-CUUCGUCCACAAACACAACUCCUGAAG-3′-Black Hole Quencher 2. The backbone of the molecular beacons was composed of 2′-O-methylribonucleotides.

Live Cell Imaging. Cells were maintained at 37°C on the microscope stage by controlled heating of the objective and the culture dish (Delta T4 open system, Bioptechs, Butler, PA). Molecular beacons were dissolved in water at a concentration of 2.5 ng/μl, and an ≈0.1- to 1-fl solution was microinjected into each cell by using a FemtoJet microinjection apparatus (Brinkmann). An Axiovert 200M inverted fluorescence microscope (Zeiss), equipped with a ×100 oil-immersion objective, a CoolSNAP HQ camera (Photometrics, Pleasanton, CA) cooled to -30°C, and openlab acquisition software (Improvision, Sheffield, U.K.) were used to acquire the images.

Synthetic RNA Transcripts and Their Hybrids with Molecular Beacons. We prepared a series of pGEM plasmids (Promega) containing 1, 2, 4, 8, 16, 32, or 64 tandem repeats of the sequence described above. In addition, we excised the gene encoding GFP-mRNA-96-mer from pTRE-GFP-96-mer and inserted it into plasmid pGEM, because that plasmid contains a bacteriophage T7 promoter. To produce RNA transcripts possessing a different number of repeats, these plasmids were linearized and used as templates for in vitro transcription by T7 RNA polymerase. The transcript containing 96 repeats possessed a GFP-mRNA sequence, whereas the other transcripts only possessed the repeat motifs. Hybrids were formed by incubating 20 ng of transcripts with 20 ng of molecular beacons in 10 μl of 10 mM Tris·HCl (pH 8.0) containing 1 mM MgCl2 at 37°C for 60 min and were then injected into the cells.


Bespreking

RNA structural probing studies with the 5′ UTRs of ribD en ypaA RNAs confirm that the highly conserved RFN element is a natural FMN-binding aptamer. This RNA motif exhibits an exceptionally high affinity for its target ligand (apparent KD of <10 nM). As with the two natural metabolite-binding aptamers reported (2, 4), the FMN-binding domain of ribD exhibits a high level of discrimination against closely related compounds. Furthermore, both the thiamine pyrophosphate- and the FMN-dependent aptamers require the presence of phosphate groups on their respective ligands to bind with the highest affinity, which is a somewhat surprising achievement for a polyanionic receptor molecule. These aspects of molecular recognition are of particular importance in a biological setting, where the promiscuous binding of closely related biosynthetic intermediates would interfere with proper regulation of genetic expression.

The role of the natural FMN aptamer in these two instances most likely is to serve as the recognition domain for FMN-dependent riboswitches that control gene expression of the riboflavin biosynthetic operon and the riboflavin transporter in B. subtilis. Preliminary investigations into the mechanisms used by the associated expression platforms in both cases are consistent with those proposed from comparative sequence analysis data (9). Spesifiek, ribD RNA undergoes an increased frequency of transcription termination after the addition of FMN. This is perhaps the most efficient riboswitch mechanism for controlling the expression of large operons, because termination of transcription in the 5′ UTR prevents the synthesis of long mRNAs when their translation is unnecessary. Indeed, regulation by transcription termination may be common among many bacterial species (26). A search for sequences in the B. subtilis genome that could form terminator–antiterminator elements revealed nearly 200 candidates (27). In contrast, the riboswitch in the ypaA mRNA leader seems to control ribosome access to the SD element. Although the entire sequence of this smaller mRNA would be produced, this genetic control mechanism permits the organism to respond rapidly to declining concentrations of FMN.

Our findings provide additional evidence in support of earlier speculation (3, 8, 28–31) that mRNAs have the ability to play an active role in sensing metabolites for the purpose of genetic control. It seems likely that new riboswitches will be discovered that respond to other metabolites and exhibit more diverse mechanisms of genetic control. The riboswitches examined in this study provide examples of two mechanisms for expression platform function for the down-regulation of gene expression. However, we speculate that there will be instances where gene expression might be increased in response to metabolite binding to mRNAs. For example, certain enzymes that make use of the riboswitch effectors coenzyme B12 (2), thiamine pyrophosphate (4), and FMN might make use of expression platforms that permit gene activation. If the occurrence of these or other riboswitches extends across the phylogenetic landscape, or if they are used to control the expression of more than just biosynthetic and transport genes, then it is likely that a greater diversity of genetic control mechanisms will be discovered.


Kyk die video: DNA, mRNA, eiwit: transcriptie en translatie (Oktober 2022).