Inligting

Lees aantekeninge vanaf 'n plasmiedkaart

Lees aantekeninge vanaf 'n plasmiedkaart


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kan iemand verduidelik hoekom binne plasmied kartering sagteware die aantekeninge onder mekaar gelaag is, ek is verward oor hoekom daar in wese twee lae binne die kaart is, byvoorbeeld in die prent hieronder.

Die onderste rooi laag word geannoteer as "DsRed2" en die boonste geel is "LacZ-DsRed2-fusie uitgedruk in E. coli". Beteken dit dat die rooi laag in die oorspronklike LacZ-geen ingevoeg word of 'n soort mutagenese...? Enige verduideliking sal werklik nuttig wees.

Tweede Plasmid -ontwerp

Derde Plasmied


Hou in gedagte dat die plasmiedkaart deur iemand gemaak is en waarskynlik nie perfek is nie. Hulle word ook gemaak deur programme waarmee jy alles oral kan annoteer, selfs oorvleuelende goed.

In silico neem ek aan dat die DsRed -gedeelte en die Lacz -dele teenwoordig was, miskien gekopieer vanaf 'n ander plasmiedkaart, insluitend annotasie. Daarna het iemand besluit dat dit 'n goeie idee is om die volledige ORF (in geel) aan te teken.

Wat ek dink dit in werklikheid beteken (net raai op die kaart, wat net 'n growwe skematiese prentjie is): daar is nog 'n deel van Lacz in die plasmied (in pienk, tweede baan) wat saamgesmelt (in raam) is met die DsRed -geen (rooi). Saam gee dit die fusiegeen wat in geel gemerk is. Let ook op die deel (terminator?) In pienk wat in die derde baan is.


Identifikasie en DNA-annotasie van 'n plasmied wat uit geïsoleer is Chromobacterium violaceum

Chromobacterium violaceum is 'n ß-proteobakterie wat wêreldwyd wyd voorkom met belangrike biotegnologiese eienskappe en wat verband hou met dodelike sepsis by immuun depressiewe individue. In hierdie werk rapporteer ons die ontdekking, volledige volgorde en annotasie van 'n plasmied wat in C. violaceum wat tot nou toe ongemerk was. Ons het DNA-enkelmolekule-analise gebruik om te bevestig dat die episoom wat gevind is 'n sirkelvormige molekule was en toe voortgegaan met NGS-volgordebepaling. Na DNA-aantekening het ons gevind dat hierdie ekstra-chromosomale DNA waarskynlik 'n gebrekkige bakteriofaag van ongeveer 44 kilobase is, waarvan 39 ORF's meestal hipotetiese proteïene bevat. Ons het ook DNA -rye gevind wat die korrekte replikasie en verdeling van plasmiede verseker, asook 'n toksienverslawingstelsel. Hierdie verslag werp lig op die biologie van hierdie belangrike spesie, en help ons om die meganismes te verstaan ​​waarmee C. violaceum verduur verskeie moeilike omstandighede. Hierdie ontdekking kan ook 'n eerste stap wees in die ontwikkeling van 'n DNS-manipulasie-instrument in hierdie bakterie.


Teken Pasgemaakte Plasmiedkaart Met groot dank aan Dr. Malay Basu vir die verskaffing van die oorspronklike Savvy-bronkode, wat vir hierdie webwerf aangepas is.

Vir 'n baie gesofistikeerde aanlyn plasmied tekenprogram gebruik PlasMapper (Verwysing: X. Dong et al.2004. Nucleic Acids Res. 32 (Web Server uitgawe):W660-4). Hierdie program sal na beperkingswebwerwe soek, en benewens die toelaat dat die gebruiker gene kan skets, kan u ook die posisies van promotors, terminators, repliseringsoorsprong aandui, met 'n groot mate van beheer oor prenteienskappe en kwaliteit.


Hoe kan ek die vertoning van vertalings in kaart- en volgorde -aansigte aanpas?

As ORF'e nie sigbaar is nie, druk die "Wys vertalings"-knoppie in die synutsbalk.

In kaartaansig word ORF'e van die boonste string in oranje uitgelig, en ORF'e van die onderste string word in groen uitgelig.

Verander vertaalopsies

Om die Vertaalopsies dialoog oop te maak, klik Bekyk → Vertaalopsies. .

Om die kriteria vir die vertoon van ORF's aan te pas, spesifiseer die minimum ORF -lengte en die beginkodon -opsies, en klik dan OK.


Molekulêre kloning

Annoteer outomaties plasmiedkaarte en uitdrukkingsvektore. Simuleer 'n verskeidenheid molekulêre kloningsoperasies, insluitend beperkingskloning, Gibson Assembly, Gateway -kloning en TOPO -kloning.

Annoteer outomaties plasmiedkaarte en uitdrukkingsvektore

Geneious Prime is gekoppel aan PlasMapper wat jou toelaat om outomaties plasmiede uit te lig met algemene promotors, terminators, kloningswerwe, beperkingswerwe, verslaggewergene, affiniteitsmerkers, kiesbare merkergene, replikasie-oorspronge en oop leesrame.

Kodon-optimaliseringsinstrument

Soek skaars kodons of produseer 'n volledig geoptimaliseerde volgorde gebaseer op 'n teikenorganisme en verwyder ongewenste beperkingsplekke terselfdertyd.

Simuleer molekulêre kloningsoperasies in een stap

  • Lig verskeie fragmente saam met bypassende oorhangsels
  • Voeg 'n fragment DNA in 'n vektor met bypassende oorhangsels
  • Simuleer beperkingskloning
  • Simuleer konvensionele PCR
  • Simuleer InFusion-kloning en Gibson-samestelling
  • Simuleer TOPO -kloning
  • Simuleer Gateway en TOPO kloning

Stoor en kry toegang tot belangrike beperkingsensiem- en DNA -fragmentdata

Sleep en gooi u belangrike data, pas u lyste met beperkingsensieme aan en vertoon al die ensieme op u lineêre of sirkelvormige DNA-fragment-alles intyds. Kommersiële ensieme, waaronder GoldenGate en BioBrick, word reeds in Geneious Prime gestoor.

Volg en stoor outomaties belangrike dokumentasie

Volg kloningbewerkings sodat veranderinge outomaties van ouers na alle afstammelinge gepropageer kan word.

Outomatiese aantekening in Geneious Prime

Tutoriale

Gibson Assembly – Leer hoe om Gibson Assembly in Geneious Prime te simuleer.

Beperkingskloning – Hierdie tutoriaal wys jou hoe om die beperkingskloninginstrumente in Geneious Prime te gebruik om 'n plasmied met 'n funksionele GFP-fusieproteïen te skep.

Golden Gate Cloning – Leer hoe u Golden Gate -kloning kan naboots, insluitend hoe u oligonukleotied -primers outomaties kan ontwerp om die oorhange vir die samestelling van onderdele te genereer.

Oordrag van aantekeninge – Leer hoe om vinnig 'n reeks te annoteer deur aantekeninge van verwante reekse oor te dra.

Primer Design – Leer hoe om oligonukleotied primers, primer-pare en primer-paar/sonde kombinasies in te voer, te ontwerp en te toets

Aansoeknotas

Homologie-gebaseerde kloningmetodes & # 8211 Ontwerp eksperimente met behulp van eksonuklease-gebaseerde rekombinasie (3' of 5' eksonuklease) of met behulp van homoloë rekombinasie.

Meer Geneious Prime -funksies

Primer Design & # 8211 Ontwerp primers en optimaliseer kodons.

CRISPR – Vind CRISPR -webwerwe, ontwerp gids -RNA's en ontleed u redigeringsresultate

Uitlijning - Voer tweevoudige en meervoudige belyning van DNA of proteïen uit met behulp van betroubare algoritmes, insluitend MAFFT en ClustalW.

BLAST / NCBI - Koppel aan NCBI en PubMed, dien rye direk in by GenBank, BLAST -rye en soek u eie databasis.

Voer data in en voer algemene lêertipes in en omskep, sowel as hul aantekeninge en notas met 'n eenvoudige sleep -en -neerslag


Bespreking

Alhoewel dit nie uniek is in sy vermoë om primêre DNS-volgordes te analiseer nie, fokus PlasmaDNA op dit waarvoor hierdie ontledings meestal nodig is: die beplanning van 'n praktiese molekulêre biologie laboratorium kloningseksperiment en die generering van die gevolglike reekse.

Deur hierdie simulasie visueel en eenvoudig te maak, kan u 'n klooneksperiment volledig begin, van begin tot einde, voordat u met die werklike manipulasies begin. Dit kan tyd en geld bespaar vir die kloning van projekte, aangesien dit die kans verminder om halfpad weer te begin as gevolg van 'n onopgemerkte, ongewenste beperkingsplek of onbehoorlike berekening van die fase vir samesmeltingsproteïene. Die program kan ook in akademiese omgewings gebruik word om studente te leer oor die konsepte van kloning en 'n visuele voorstelling te gee van wat in die verskillende stappe gebeur.

Laastens maak PlasmaDNA dit maklik en foutloos om die nuwe rye wat tydens kloningsprosesse gegenereer word, te bekom. Dit sal verseker dat hierdie nuwe generasie plasmiede en konstrukte gebruik kan word vir verdere kloningseksperimente met volledige kaarte en beperkingsanalise, wat weereens die proses vergemaklik en vermorsing voorkom. Die program self berus op 'n eenvoudige, intuïtiewe, volledig knoppie-gebaseerde koppelvlak. 'N Handleiding is ingesluit in die aflaaibare pakket wat op die webwerf gevind word.


Vervoeging (Met Diagram) | Mikrobiologie

Die onderstaande artikel bevat aantekeninge oor vervoeging.

Nota # 1. Rol van oppervlakte -proteïene in vervoeging:

Konjugasie verskil van transformasie in die feit dat in die voormalige fisiese kontak tussen twee verskillende stamme deur 'n vervoegingsbuis tot stand kom. Die genetiese materiaal van die skenkersel (manlik) word na die ontvanger (vroulike) sel oorgedra. Daar is spesiale aanhangsels op die oppervlak van die bakteriese sel, genaamd sex pilus of F pilus wat die vervoegingsbuis vorm.

Die vrugbaarheidsfaktor (F) stel die sel in staat om as skenker op te tree. Die F -faktor van skenkersel bevat die inligting oor seks pili waarvan die getal wissel van 1 tot 3. Die selle wat 'n outonome F bevat, word F + selle genoem. Dit herhaal onafhanklik. Daar is slegs 1-3 kopieë van F-faktor per sel.

Onder sekere spesifieke omstandighede is die aantal pili per sel tot vyf. Die aantal pili stem ooreen met die aantal kopieë van F-faktor. Dit verklaar dat elke F-faktor 'n enkele pilus sintetiseer of dit outonome repliserende toestande is (as plasmied) of in geïntegreerde toestande (as episoom).

Boonop beskik die ontvangerselle oor reseptorplekke op seloppervlakke wat nodig is vir vervoeging. Sekere bakteriofage bv. f2, MS2, en Qβ tree op as skenker. Die skenker E. coli -selle besit geslagspili sowel as tipe I pilus op hul seloppervlakke. Fag M12 word byvoorbeeld lukraak geadsorbeer slegs op sekspili, maar nie op die seloppervlaktes van die ontvangerbakteriese sel nie.

Nota # 2. Die F -faktor:

Die teenwoordigheid van F-faktor in 'n bakteriële sel bepaal sy outonome replikasie, geslagpili-vorming en huweliksoordragfunksie. Dit bepaal dus die seksualiteit en vervoeging.

Daar is gevind dat twee paringstipes in E. coli K12 afhang van die teenwoordigheid en afwesigheid van die F -faktor. Die F -faktor bly in twee fases as plasmied en as episoom. Die F -plasmied herhaal onafhanklik. Soms word dit egter geïntegreer met die normale chromosoom van die bakterie. Daarom word dit episoom genoem.

Die F-faktore het die volgende belangrike kenmerke getoon:

(a) Wanneer F + stam van 'n bakterie geïnkubeer word op 'n voedingsmedium gemeng met akridien oranje, word dit omgeskakel na F – stam. Acridine oranje is slegs effektief met die groeiende bakterieë, aangesien dit die outonoom repliserende F -faktor belemmer.

(b) 'n Kruising tussen twee F – stamme lewer nie rekombinante op nie. Dit is altyd steriel aangesien die F –-stam nie vervoeging met die ander F –-stam kan ondergaan nie.

(c) Die kruisings tussen F + en F + stam lewer F + selle maar 'n baie lae vlak. Sommige F + -selle word omgeskakel in F – genotipe.

(d) Oordrag van F -faktor van F + na F – in F + x F – -kruisings vind plaas by 'n frekwensie van ongeveer 100%, maar die produksie van rekombinante vind plaas met die snelheid van een per 10 tot 10 selle .

(e) Onder F + -stamme is daar sekere F + -stamme wat ongeveer 1000 keer meer rekombinasie met F –-stamme toon. Die sub-stamme word hoëfrekwensie-rekombinasie (Hfr) stamme genoem. Die Hfr-stamme word geproduseer wanneer F-faktor met die bakteriese chromosome integreer.

Nota # 3. Genetiese kaart van F Plasmid:

'n Genetiese kaart van F-plasmied word in Fig. 8.9 getoon. Die F -plasmied van E. coli is ongeveer 100 kb met gene wat kodeer vir outonome replikasie, geslagspili -vorming en eggenoot -oordragfunksie. Die F-plasmied bevat die oordrag (tra) streek en nie-oordrag verwante merkers.

Die nie-oordragverwante merkers is die invoegingsreekse (IS3, δ, ү en IS2), stabiele DNA-afbraak (srn B), inhibisie van replikasie deur T7, en II fage (pif), en 'n gebied vir replikasie (herhaling), onverenigbaarheid (inc) en oorsprong van vegetatiewe replikasie (oriV). Sommige gene van R-plasmied met hul funksies word in Tabel 8.1 gegee.

Willetts en Wilkins (1984) het die fisiese en genetiese kaart van die oordragstreek van F -plasmied (fig. 8.10) gegee, wat ongeveer 32 kb lank is en bestaan ​​uit ongeveer 25 bekende oordraggene.

Twaalf gene is betrokke by F pilus vorming (bv. tra A,-L,-E,-K,-B,-V,-W/C,-U,-F,-H,-G). Gene wat by regulering betrokke is, is finP en traJ. Stabilisering van parings word gedoen deur gene traN en traG, konjugatiewe DNA -metabolisme deur traM, traY, traD, tral en traZ en oppervlak uitsluiting deur traS en traT.

Fig. 8.10 : Fisiese en genetiese kaart van die oordrag (tra) gebied van F-plasmied.

Die traM- en traJ-promotorstreke is in volgorde geplaas en traY-Z-operon beskik oor sy eie promotor. Transkripsie vanaf die promotors vir traM en skinkbord-Z operon is afhanklik van die produk of traJ wat op sy beurt negatief gereguleer word deur die FinOP onderdrukker. Die tral- en traZ-gene word deurlopend getranskribeer vanaf 'n tweede promotor teen ongeveer 18% of die vlak van die tral-geïnduseerde traY-Z operonpromotor.

Nota # 4. Die proses van egtelike oordrag:

In die Enterobacteriaceae word spesifieke strukturele aanhangsels, d.w.s. sekspili, op seloppervlaktes van skenkerselle aangetref. Die skenkerselle bevat F-faktor. Sel-tot-sel-kontak tussen F + en F – word gevestig. Die stappe van F-plasmiedoordrag van F + na F –-sel word in Fig. 8.11 A-E getoon.

'n Poel van vooraf gevormde subeenhede word in volwasse sekspili geïnkorporeer. Die aantal seks pili wissel van 1 tot 3 per sel. Die punt van pilius is betrokke by die stabiele paringspaarvorming (beheer deur traN- en troF -gene) wanneer dit in wisselwerking is met die ompA -geenproduk op die buitenste oppervlak van die ontvangersel.

Na die aanvanklike kontak tussen die punt van pilus en ontvangersel (A) trek die pilus saam en bring die F + en F – selle in die nabyheid (B). Hierdie muur -tot -muur -kontak vorm 'n vervoegingsbrug wat die samesmelting van die selkoeverte insluit (Fig. 8.11B en 8.12). By oriT-plek van plasmied word 'n kerf gemaak deur traYZ-endonuklease wat in 5′-terminus enkelstring oplewer wat die ontvangerselle binnedring.

Die 5 ′-terminus van DNA bind met 'n proefproteïen en beweeg geleidelik deur hierdie membraanbrug (waarskynlik 'n porie wat die traD DNA-genproduk insluit (fig. 8.12), maar nie deur die pilus self soos oorspronklik geglo is nie. gevind dat die paringsmengsel van E. coli paringsaggregate van 2- 20 selle elk vorm eerder as net parende pare.

Na die vorming van paringsaggregate begin die oordrag van F + DNA vanuit die oriF -gebied in teenstelling met oriV as 'n plasmied ingeslote endonuklease (tralgeenproduk) die F -plasmied by oriT. Die ongeskonde string dien as sjabloon en die 5 ′ eindstreng word na die ontvangersel oorgedra deur 'n rollende sirkelmeganisme (C-D).

Fig. 8.12: 'n Model vir konjugatiewe oordrag by F-plasmied.

Op die ingedrukte oriT -plek aktiveer die traM die konjugale DNA -sintese deur voldoende ssDNA bloot te stel om die binding van helicase ('n trale geenproduk) of DNA helicase I (Fig.8.12) te vergemaklik. Die helikase beweeg ek op die ander draad wat ondergaan word om die plasmied dupleks af te draai. Helikase I migreer met DNA-polimerase III wat die vervangingsstring van die skenker-DNS sintetiseer.

As die helikase I tydens konjugasie aan die membraankompleks bind, kan die gepaardgaande ATP -sintese die dryfkrag bied om die oorgedraaide string in die ontvangersel te verplaas. Nadat u die ontvangersel binnegegaan het, word die 5 ′ eindstreng aan die membraan geheg en ondergaan replikasie.

Oordrag van DNA word geassosieer met sintese van 'n vervangende string in die skenkersel en van 'n komplementêre string in die ontvangersel. Beide die prosesse vereis de novo -primersintese en die aktiwiteit van DNA -polimerase III -holoenziem.

Daar word aanvaar dat 'n enkeldraad -bindende proteïen die DNA bedek en die konjugale DNA -sintese help. Dit hang af van die aard van die porie. Hierdie proteïen word ook van die skenker na die ontvangerselle oorgedra. Na die sintese van komplementêre string word die F-plasmied gesirkuleer (Fig. 8.11 E).

Nota # 5. Hindernisse vir vervoeging:

Daar is gevind dat die selle wat F -faktor bevat, soms 'n swak ontvanger is as konjugatiewe kruise voorkom. Dit is as gevolg van die teenwoordigheid van oppervlakuitsluiting. 'N Soortgelyke verskynsel (onversoenbaarheid) vind plaas wanneer 'n F’-element oorgedra word na 'n ontvangersel wat reeds F-plasmied bevat het.

Die F ’ -element maak dat F -plasmied nie vrugbaar kan word nie. Daar is uitgevind dat vir die uitsluiting van die oppervlak twee gene (traS en traT) nodig is met traT proteïen, wat 'n buitenste membraan-proteïen is. Daar word gehoop dat tralproteïen die stabiliseringsplekke van die paar kan blokkeer of die strukturele proteïene wat nodig is vir die stabilisering van die paar, kan belemmer.

Tabel 8.1 : Sommige gene en plekke van F-plasmiede en hul funksie.

Boonop word in die meeste van die vervoegende plasmiede bv. R 100-oordrag van DNA is merkbaar verminder in vergelyking met F. Dit is omdat die vrugbaarheidsinhibisiestelsel (FinOP) die regulatoriese stelsel van tragene beheer. Die finO- en finP-geenprodukte is in wisselwerking en vorm 'n FinOP-inhibeerder van trageen-uitdrukking.

Nota # 6. Die Hoë Frekwensie Rekombinasie (Hfr) stamme:

Wanneer die chromosoom van F + sel met F plasmied integreer, word dit hoëfrekwensie rekombinasie (Hfr) sel genoem. Die Hfr -selle kom uit F + -kulture (Figuur 8.13A). Selfs na integrasie van F in chromosoom, behou die chromosoom 'n enkele, sirkelvormige DNA-molekule. Die F tree op as 'n deel van die chromosoom.

Die F vergroot die grootte van chromosoom. F is egter in staat om die hele chromosoom van Hfr -selle na die F – -kultuur oor te dra. Die invoegingsfrekwensie vind plaas by ongeveer 10 5-10 7 per generasie, dit wil sê in 'n bakteriese populasie van 10 7 F + selle is daar 'n moontlikheid van 1-100 selle om 'n geïntegreerde F-plasmied met chromosoom te hê.

Hier volg 'n paar van die verskille tussen F + -selle en Hfr -selle:

(a) Die F -faktor van Hfr -selle word selde oorgedra tydens rekombinasie. In 'n Hfr x F is die frekwensie van rekombinasie hoog en dié van oordrag van F-faktor laag. In teenstelling met F + X F – kruising, is die frekwensie van rekombinasie baie laag en die oordrag van F -faktor is hoog.

(b) Dit neem ongeveer 2 minute vir oordrag van F, terwyl 100 minute vir hele bakteriese chromosoomoordrag. Hierdie verskil is hoofsaaklik te wyte aan die relatiewe grootte van F en die geïntegreerde chromosoom.

(c) In 'n kruising tussen F – en Hfr selle, bly F – selle altyd F – as gevolg van die skeiding van selle voor die finale oordrag van die uiteindelike F segment.

(d) In 'n paring tussen 'n Hfr leu + kultuur en 'n F – leu – kultuur ontstaan ​​F – leu + selle. Die genotipe van die skenker word nie verander nie omdat die gelyktydige replikasie in die skenker die oorgeplaasde DNA -string vervang.

(a) Meganisme van integrasie:

Die meganisme van integrasie word getoon in Fig. 8.13B. Integrasie is 'n wederkerige DNA-uitruiling. Uit basisvolgorde -studie is dit duidelik dat 'n geïntegreerde F -reeks geflankeer word deur twee kopieë van een van die invoegingsreekse (IS -elemente) wat in F -plasmied voorkom. Integrasie behels dus homoloë rekombinasie tussen twee sirkelvormige DNA -molekules, wat lei tot een sirkelvormige molekule wat beide die DNA's bevat.

Beide die IS -elemente (IS2 en IS3) teenwoordig op F -plasmied en IS -element op bakteriese chromosoom (E. coli bevat ook 5 elk van IS2- en IS3 -rye) wat as die homoloë streke vir invoeging gestel is. Die integrasie van F -plasmied hang af van recA, maar selde onafhanklik van recA. Die F -integrasie vind ook plaas, afhangende van die transponering van IS -elemente.

So ontstaan ​​Hfr -selle as gevolg van homoloë rekombinasie tussen die twee identiese IS -elemente waarvan die een in chromosoom en die ander in F -plasmied voorkom. Tweedens ontstaan ​​die Hfr-selle ook deur 'n ko-integreer te vorm wat deur 'n IS-element in F-plasmied bemiddel word, en deur 'n teikenvolgorde in die chromosoom te dupliseer.

Daar is rigtinggewendheid teenoor egte DNA -oordrag. Die oordragrigting van oriT is sodanig dat die tra -gene in die laaste oorgedra word. Die oriëntasie van chromosomale IS-element is sodanig dat die gasheergeen B as 'n proksimale merker is, terwyl geen A in die laaste oorgedra word.

Na integrasie repliseer die F-DNS saam met die gasheerchromosoom. As die gasheer-dnaA-geen nie-funksioneel is, kan die replikasie van die hele chromosoom vanaf 'n geïntegreerde F-DNA begin.

(b) Die volgorde van chromosoomoordrag en vervoegingskaarte:

Wollman (1956) het, deur onderbreekte paringseksperimente, die volgorde van chromosoomoordrag van 'n Hfr-skenker na 'n F –-ontvangersel bepaal. Die tyd wanneer 'n spesifieke geen 'n ontvanger binnedring, hou verband met die gedeelte van die gene op die chromosoom. 'N Kaart kan verkry word vanaf die tyd van die invoer van elke geen.

Die onderbroke paringseksperiment behels:

(i) Meng van 'n Hfr -stam met F – -stam,

(ii) die vervoeging met sekere tussenposes onderbreek deur die selle uitmekaar te breek in 'n hoëspoedmenger,

(iii) Plaat die selle op verskeie tipes selektiewe media om die rekombinante selle te selekteer wat die gene van Hfr-stam ontvang het voor onderbreking van paring.

'n Vereenvoudigde koppelingskaart van sirkelvormige E. coli-chromosoom wat uit onderbroke paringseksperiment saamgestel is, word in Fig. 8.14 getoon.

Dit neem ongeveer 100 minute om die hele E. coli -chromosoom oor te dra. Daarom word die gene gekarteer ten opsigte van die posisie van die geïntegreerde F -plasmied deur die tyd te bepaal wat die gene neem om na die ontvangersel oorgedra te word.

Die onderbroke paringseksperiment onthul ook die frekwensie van rekombinasie van elke merker wat geïdentifiseer is deur opspoorbare mutasie op 'n spesifieke lokus (Fig. 8.14). Die genetiese merkers is leu, lac en gal. Die skenker Hfr-sel is wildtipe, terwyl die ontvanger leu, lac –, gal – is, d.w.s. die ontvanger is mutant in lac en gal maar wildtipe in leu.

Daarom benodig die mutant laktose of galaktose as koolstofbron. Die Hfr is strepto- en shymycin-sensitief (Str s) en die ontvanger is strepto- en shymycin-resistent (Str r). Nadat die skenker- en ontvangerselle teen nultyd gemeng is, word die hoeveelhede mengsel met verskillende intervalle verwyder en paringspare word deur vermenging ontwrig.

Die mengsel word op minimale media uitgeplaat wat bevat:

(i) Glukose om te selekteer vir Leu + rekombinant,

(ii) Laktose plus leucine om vir Lac + rekombinante te selekteer, en

(iii) Galaktose + leucien om vir Gal + rekombinante te selekteer.

Kolonies wat op hierdie media groei, is die rekombinante, dit wil sê die ontvanger waarin die wilde tipe skenkergeen oorgedra is en die mutante geen vervang het.

Die gekonjugeerde oordrag van Hfr-chromosoom is dus tydafhanklik. Elke geen betree die F – -sel op 'n spesifieke tydstip. Deur verskillende tydsintervalle te meet, kan 'n grafiek geteken word (Fig. 8.14) en 'n koppelingskaart saamgestel word (Fig. 8.15).

(c) Hoë resolusie kartering:

'N Mens kry 'n lae resolusie -kartering deur 'n onderbroke paringseksperiment. Boonop is hierdie metode nie nuttig vir die kartering van hoë resolusies binne 'n afstand van 2 minute nie. Daarom word studie van stabiele rekombinante eerder as die geenoordrag vereis.

Byvoorbeeld, as abc + en thr + die twee gene is wat oorgedra word, kan die frekwensie van kolonie bereken word met thr + en thr – onder diegene met abc + gene as abc + meer gereeld is as thr +.

Die rekombinasie -afstand tussen abc + en thr + kan verkry word uit die verhouding van thr – (abc + thr –) onder totale abc + ie [(abc + thr +) + (abc + thr –)] soos hieronder:

Rekombinasieafstand = (abc + thr – )/(abc + thr + ) + (abc + thr – )

Nota # 7. Vorming van F – Prime (F’):

Integrasie van F -faktor is 'n omkeerbare proses. Die Hfr-sel kan weer na die F +-toestand terugkeer. Wanneer die omkeerbare proses plaasvind, word die F-faktor vrygestel van die chromosoom en hervat sy outonoom repliserende vermoë. Die skeiding van F -faktor van die geïntegreerde chromosoom vind afwykend by 'n lae frekwensie plaas en lewer 'n plasmied wat F -faktor bevat, en 'n klein gedeelte van chromosoom word F ’ -selle genoem.

Die F ’ is van twee tipes. Tipe I F ’ het 'n sekere volgorde verloor, maar dra 'n gasheer -DNA aan die een of ander kant van die geïntegreerde F. Tipe II F ’ bevat alle F ’ plus gasheer -DNA van beide kante van die punt waar F was geïntegreer. In beide die toestand F bevat 'n klein segment van chromosoom.

As sulke primêre F ’ -selle met F – -ontvangers gekruis word, word die F -faktor doeltreffend saam oorgedra in F – en dit omskakel in die sekondêre F ’ -selle.

Die sekondêre F -selle is gedeeltelik diploïed en word dus merodiploïed of merosigoot genoem omdat die ontvangerselle, benewens sy eie chromosoom, ook 'n segment DNA bevat uit die skenkersel, dws F -sel (Fig. 8.16). Hierdie proses van oordrag van bakteriële DNA van skenkersel na ontvangersel as deel van geslagsfaktor word deur Jacob en Wollman (1961) seksduksie genoem.

Die F’-konjugasie is baie belangrik in die studie van mikrobiese genetika om uit te vind of die alleel wat deur 'n F’-plasmied in merosigote gedra word, dominant of resessief is tot die chromosomale geen. Studie van F ’ -plasmied is ook nuttig by die kartering van die chromosoom, aangesien die twee buurgenen deur 'n F -faktor opgetel word.


Metodes

Etiese verklaring

Hierdie studie is uitgevoer in ooreenstemming met die aanbevelings in die Gids vir die versorging en gebruik van proefdiere [102]. Die Universiteit van Michigan se Institusionele Dieresorg- en Gebruikskomitee het hierdie navorsing goedgekeur (PRO00007474).

Materiaal, media en bakteriese stamme

Alle chemikalieë is by Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) gekoop, tensy anders aangedui. E. coli K12-stam MG1655, Kp-stam NTUH-K2044 [103], en isogeniese mutante is gekweek in Luria-Bertani (LB, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) sous by 37°C met skud, of op LB-agar by 27 ° C (Thermo Fisher Scientific). Die isogene ΔterC mutant is gegenereer soos voorheen beskryf [10]. In kort, die λ-rooi mutagenese stelsel is gebruik om die terC geen [104]. Elektrokompetente NTUH-K2044-selle wat vir die pKD46-plasmied kodeer, is getransformeer met 'n kanamisien-weerstandskasset wat versterk is van die pKD4-plasmied wat homoloë oorhangings bevat na die terC lokus. Getransformeerde selle is oornag by 30°C in SOC media herwin, dan geselekteer in die teenwoordigheid van 40 μg/mL kanamisien. Die isogeniese ΔterC mutant is bevestig deur volgordebepaling van die hele genoom met behulp van die Illumina NexteraXT-kit op die Illumina MiSeq met 'n 2x250 bp V2-stel. Illumina -leesstukke is beskikbaar op die Sequence Read Archive (SRA) in BioProject PRJNA464397. Om die pTerC- en pTerZ-F-komplementasieplasmiede te bou, is PCR-produkte afgelei van WT NTUH-K2044 wat die terC of terZABCDEF oop leesrame is in pCR 2.1 ingevoeg deur gebruik te maak van TOPO TA-kloning (Life Technologies, Carlsbad, CA) en rigtinggewend in pACYC184 geligeer na vertering met Xbal en HindIII. Die ligeringsmengsel is omskep in NEB 10-beta Competent E. coli (New England Biolabs, Ipswich, MA) deur hitte skok. E. coli transformante is gekies by 37 ° C op LB agar wat 30 μg/ml chlooramfenikol bevat, herkweek en bevestig deur kolonie PCR. Enkeltransformante is dan in bondelkultuur gekweek vir plasmiedekstraksie deur gebruik te maak van die Plasmied Midi Kit (Qiagen, Germantown, MD). Bekwame selle MG1655 en NTUH-K2044 is voorberei soos voorheen beskryf [105], met elektroporeer met die komplementasieplasmiede of ooreenstemmende leë vektor, en gekies by 37 ° C op LB agar wat 30 (MG1655) of 80 ug/ml (NTUH-K2044) bevat chlooramfenikol. Na seleksie is transformante hergekweek en bevestig deur kolonie PCR en deur groei in teenwoordigheid van TeO3 -2. Alle primer -rye kan in S5 -tabel gevind word. Vir alle daaropvolgende eksperimente is gekomplementeerde en kontrole stamme in die teenwoordigheid van die toepaslike antibiotika gekweek.

Ter+ genoom identifikasie

Vir plasmiedanalise, ter-koderende verwysingsstamme en plasmiede van die Nasionale Sentrum vir Biotegnologie-inligting (NCBI) nukleotiedversamelingsdatabasis is geïdentifiseer met behulp van BLAST [106], waarin die hele ter lokus (S3-tabel) is as die navraag gebruik, en Klebsiella pneumoniae (taxid: 573) as onderwerp (onttrekdatum 27/03/2019). Die ter operon is nie op enige Kp -chromosome geïdentifiseer nie. Vir die identifisering van Klebsiella sp. kodering van die ter operon, individuele PATRIC Global Family-aantekeninge wat ooreenstem met die NTUH-K2044 terZABCDEF geenprodukte is deursoek teen die genome databasis van die Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC) [41]. Die gevolglike lys genome en ooreenstemmende metadata (onttrekkingsdatum 11/16/2020) is daarna beperk tot Klebsiella sp. en verder verfyn deur genome te identifiseer wat elke NTUH-K2044 het terZABCDEF geen produk annotasie en is van goeie gehalte soos deur PATRIC opgemerk. Metadata is gevisualiseer in R (v.3.6.3) met behulp van die "ggplot2", "ggmap," "maps," en "mapdata" pakkette en Prism 8 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Plasmied volgordebepaling en analise

Om te karakteriseer ter-enkoderende Kp-stamme, die multi-lokus volgorde tipe (MLST) is toegeken deur gebruik te maak van die Bacterial Isolate Genome Sequence Database (BIGSdb) [107,108]. Om die ter-koderende plasmiede van ons vorige studie [10], genomiese DNA is uit suiwer Kp-kulture onttrek met behulp van die DNeasy PowerSoil Pro Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland). Langlees genomiese volgordebepaling is uitgevoer met behulp van GridION X5 (Oxford, Engeland) volgordebepalingsinstrument. Elke Nanopore-volgordebiblioteek is voorberei met behulp van 1 μg DNA met die 1D-ligeringskit (SQK-LSK108, Oxford Nanopore Technologies) en opgestel met behulp van R9.4.1-vloeiselle (FLO-MIN106). MinKNOW sagteware is gebruik om sekwensiedata te versamel. Nanopore-lesings is genoem met Albacore v2.2.3 en saamgestel met Canu v1.7 [109]. Samestellings is vir tien rondtes gekorrigeer met Illumina-lesings deur Pilon v1.22 [110] te gebruik in samewerking met die bowtie2 v2.3.3.1 aligner [111]. Geassembleerde plasmiedvolgordes is met 'n sirkulêre sirkel gemaak en geannoteer met behulp van Dfast [112] prokariotiese aantekeningpyplyn. Paarsgewyse belynings is uitgevoer met behulp van BLAST [106]. Om die teenwoordigheid van hvKp- en antibiotiese weerstandsgene te bepaal, is verwysingsreekse (S3 -tabel) onttrek en BLAST [106] is gebruik om hierdie verwysingsreekse in lyn te bring met ter koderende plasmied volgordes. Om die gene wat rondom die ter lokus, geenvlak meervoudige volgorde belyning (MSA) van die gene binne 10 kbp stroomop van die vermeende biosintetiese lokus en stroomaf van die ter operon in al die plasmiede. Hierdie lokusse is gevisualiseer deur geannoteerde gene te kodeer deur hul 4-karakter geenname en ongeannoteerde hipotetiese proteïene te gebruik deur hul geenkluster identifiseerder te gebruik soos bepaal deur CD-HIT sagteware [113] vir die MSA. 'N Bykomende MSA is uitgevoer met behulp van MAFFT [114] in die L-INS-i-modus en die MSA visualiseer met behulp van MSAviewer [115] om bewaarde gene rondom die ter lokus. Om proteïenstruktuur en funksie van gene binne en aangrensend aan die ter lokus, ter koderende plasmiede is geannoteer met behulp van die PATRIC RAST gereedskapstel [116,117]. Unieke aantekenfrekwensies is bereken, en daarna is unieke voorspelde aminosuurvolgorde voorspellend geannoteer met behulp van I-TASSER [38-40]. S1 Tabel dui verwysingsaminosuurvolgorde aan wat gebruik word vir proteïenstruktuur en funksievoorspelling. Slegs die voorspelde biologiese proses, die voorspelde molekulêre funksie en die voorspelde Pubchem Ligand -bindingswerf met die hoogste telling word gerapporteer. Finally, complete plasmid MSA was performed and visualized using Mauve (MegAlign Pro, DNASTAR Inc., Madison, WI). Illumina and Nanopore reads are available on the SRA in BioProject PRJNA464397.

Murine models of infection

Six- to 12-week-old C57BL/6J male and female mice from barriers RB07 and RB16 (Jackson Laboratory, Jackson, ME) were used for all murine models of infection. Gender was evenly distributed in all groups. For bacteremia studies, WT NTUH-K2044 and NTUH-K2044ΔterC were cultured overnight in LB, then bacteria were pelleted, resuspended, mixed 1:1, diluted in sterile PBS to the appropriate dose, and mice were inoculated intraperitoneally with approximately 5×10 5 CFU in 100 μL of PBS. After 24 hours, mice were euthanized by CO2 asphyxiation and blood, spleen, liver, and brain were collected. Solid organs were weighed and homogenized in sterile PBS, and whole blood and solid organ homogenates were plated on selective media. For oral inoculation studies, mice from both barriers were given regular drinking water, water containing 0.5 g/L ampicillin 3 days prior to inoculation and throughout the experiment, or water containing a SCFA cocktail (67.5 mM sodium acetate, 40 mM sodium butyrate, 25.9 sodium propionate) 7 days prior to inoculation and throughout the experiment. The SCFA dose and duration was chosen based on previous studies [64,118]. Antibiotic or SCFA-containing water was changed every 3 days. Kp strains were cultured overnight in LB in the presence of antibiotics when appropriate, then bacteria were pelleted, resuspended, mixed 1:1, diluted in sterile PBS to the appropriate dose, and mice were orally inoculated via oral gavage with approximately 5×10 6 CFU in 100 μL of PBS. Single strain infections were performed as above without mixing the two strains. For four days post-inoculation, a fresh fecal pellet was collected from each mouse, weighed, and homogenized in sterile PBS, and homogenates were dilution plated on both LB agar containing 10 μg/ml ampicillin or 40 μg/ml kanamycin to determine Kp load. When complemented or empty vector control strains were used, plasmid maintenance was monitored by plating both on LB agar containing 10 μg/ml ampicillin or 40 μg/ml kanamycin to determine total Kp load, and on LB agar containing 10 μg/ml ampicillin and 80 μg/ml chloramphenicol or 40 μg/ml kanamycin and 80 μg/ml chloramphenicol to determine plasmid maintaining Kp load. In all models, mice were monitored daily for signs of distress (hunched posture, ruffled fur, decreased mobility, and dehydration) and euthanized at predetermined timepoints, or if signs of significant distress were displayed. No blinding was performed between experimental groups.

16S rRNA sequencing and analysis

Fecal DNA was isolated using the MagAttract PowerMicrobiome DNA/RNA Kit (Qiagen) and an epMotion 5075 liquid handling system. The V4 region of the 16S rRNA gene was amplified and sequenced as previously described [119]. Standard PCRs used 1, 2 or 7 μL of undiluted DNA and touchdown PCR used 7 μL of undiluted DNA. 16S rRNA gene sequence data was processed and analyzed using the software package mothur (v.1.40.2) [120,121]. Sequences were binned into OTUs based on 97% sequence similarity using the OptiClust method [122] following sequence processing and alignment to the SILVA reference alignment (release 128) [123]. θYC distances [47] were calculated between communities, and AMOVA [124] was used to determine statistically significant differences between experimental groups [47]. Principal coordinates analysis was used to visualize the θYC distances between samples. Taxonomic composition of the bacterial communities was assessed by classifying sequences within mothur using a modified version of the Ribosomal Database Project training set (version 16) [125,126], and diversity metrics, including inverse Simpson, were calculated. Finally, linear discriminant analysis effect size was used to determine if specific families and OTUs were differentially abundant in different groups [51]. Putative genus and species assignments were performed by comparing the representative 16S rRNA sequences from OTUs to the NCBI 16S ribosomal RNA sequence database. These assignments were confirmed using the Ribosomal Database Project (RDP) database, with the exception of OTUs assigned to Muribaculum intestinale based on NCBI, but to Porphyromonadaceae by RDP [125]. All other assignments were in agreement. 16S rRNA gene sequencing reads are available on the SRA in BioProject PRJNA464397.

PICRUSt2 metagenome prediction

16S rRNA gene sequence data processed using the software package mothur (v.1.40.2) [120,121] was used for metagenome prediction analysis using the PICRUSt2 pipeline [59]. 16S rRNA gene sequences were aligned using HMMER (v.3.3, hmmer.org), placed in the default 16S rRNA gene reference tree, which is comprised of 20,000 16S rRNA gene sequences in the Integrated Microbial Genomes database [127], using EPA-NG [128], and then the complete tree was constructed with GAPPA [129]. Following tree construction, unknown lineages were inferred, and KEGG pathway copy number was predicted using castor [130]. Finally, metabolic pathway abundances were inferred from MetaCyc using MinPath [131]. For analysis, metabolic pathway abundances were rounded to the nearest whole number and normalized across each sample to determine the relative abundance of each gene family and inferred metabolic pathway. Principle coordinate analysis was performed in R (v.3.6.3) using the “ggplot2” and “ggfortify” packages to visualize differences in inferred metabolic pathway relative abundances between experimental groups. AMOVA P values [124] were calculated using the “vegan” package and used to determine statistically significant differences between experimental groups [47].

SCFA growth and killing assays

SCFA containing LB was prepared by adding acetic acid, butyric acid, and/or propionic acid to LB at the appropriate concentration. The pH of SCFA-containing LB was adjusted to 7.5 or 5.75 with HCl or NaOH until the appropriate pH was achieved. Control LB lacking SCFAs was also pH adjusted to 7.5 or 5.75. Finally, pH adjusted media was sterile filtered using a 0.22 μM filter. For growth assays, Kp strains were cultured overnight at 37° C with aeration in LB in the presence of antibiotics when appropriate. Overnight cultures were diluted to an OD600 of 0.02 in pH adjusted LB, then mixed 1:1 with pH adjusted LB with or without 2X SCFAs, to achieve a final 1X dilution of SCFAs and OD600 of 0.01. For competitive growth assays, overnight cultures were mixed 1:1 before dilution. Cultures were incubated at 37° C with aeration and OD600 readings were taken every 15 min using an Eon microplate reader with Gen5 software (Version 2.0, BioTek, Winooski, VT) for 24 hours. Area under the curve was quantified using Prism 8 (GraphPad Software, La Jolla, CA). For killing assays, 1 mL of overnight culture was pelleted, resuspended in pH adjusted LB with or without SCFAs, and cultured at 37° C with aeration. Cultures were sampled immediately, then every 2 hours and dilution plated on LB agar to quantify bacterial viability.

SCFA quantification

SCFAs were quantified as previously described [86]. Briefly, archived fecal pellets were suspended 1:2, 1:5, or 1:10 (weight:volume) in sterile PBS and homogenized. Homogenized samples were then centrifuged at 10,000 × g for 5 minutes to pellet the solid fraction and the supernatant was retained. The supernatant was then vacuum through a 0.22 μm filter prior to HPLC analysis. SCFA composition was measured using a Shimadzu HPLC (Shimadzu Scientific Instruments) equipped with an RID-10A refractive index detector. 30 μL injections were run on an Aminex HPX-87H column (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) at 50° C with 0.01 H2SO4 mobile phase and a flow rate of 0.6 mL/minute. SCFA concentration was determined by interpolation from a 9-point standard curve containing acetate, butyrate, and propionate at concentrations between 0.1 mM to 40 mM, then normalized to dilution factor and tissue weight. Total SCFA concentration is a sum of acetate, butyrate, and propionate concentrations.

Statistiese analise

Vir in vitro studies, two-tailed Student’s t-tests or ANOVA followed by indicated post-hoc test was used to determine significant differences between groups. Almal in vitro experimental replicates represent biological replicates. All animal experiments were repeated at least twice with independent bacterial cultures. Competitive indices ((CFU mutant output/CFU WT output)/(CFU mutant input/CFU WT input)) [132] were log transformed and a one-sample t-test was used to determine significant differences from a hypothetical value of 0 and paired ratio t-test, or two-tailed Student’s t-test as indicated in figure legends was used to determine significant differences between groups. A P value of less than 0.05 was considered statistically significant for all experiments, and analysis was performed using Prism 8 (GraphPad Software, La Jolla, CA) unless otherwise indicated.


OGdraw 1.3.1 – Generate high-quality Graphical Maps of circular DNA Sequences

:: BESKRYWING

OGDraw (OrganelleGenomeDraw) is a tool that enables the user to quickly generate high-quality graphical maps of circular DNA sequences. Though especially designed and optimized for the display of small organelle genomes like the chloroplast or mitochondrial genome, it is applicable to all circular DNA sequences. The input data can be provided as GenBank files or GenBank accession numbers.

:: Skermkiekies

:: VEREISTES

:: MEER INLIGTING


Aardrykskunde

Grid reference

1. Always remember to read from the bottom left corner.

2. If the question ask for the four-figure grid reference or grid square of a particular building, e.g. the Hindu temple shown in Fig 1. Read the number for the easting first (from the X axis) and then the northings (from the Y axis). E.g example in Fig.1 is located in 2672

3. If the question ask for the six-figure grid reference or grid square of a particular building, e.g. the Hindu temple shown in Fig 2. Start by finding the grid square with the feature, then divide the grid square into 10 equal parts along both the northings and eastings. Place a ruler onto the bottom left corner of the feature, e.g. the Hindu temple is located at 266727. Read the number for the easting first (from the X axis) and then the northings (from the Y axis).

    To measure the direction of one point to another, draw a straight line connecting them.
  • Read the question carefully– if the question ask you the direction of B from A, then draw a + sign at A and read the direction from A.
  • Draw a straight line connecting the 2 points.
  • Draw a + sign at where you are taking the bearing from.
  • Place the protractor at the + sign with 0° facing north and then read the bearings from the point starting from 0° (north) clockwise as shown in Fig.4.

a) valley – associated with rivers, tend to be V-shaped and narrow in the upper course, broader in the lower course
b) plateau – elevated land with flat top and steep sides
c) escarpment – continuous line of steep slope at the edge of a ridge or plateau. Guide to describing reliefGive the average height ( or the range of height) of the relief of the area and state the height of the highest point.

Describe the relief of the area:
(a) state whether it is mountainous or hilly or whether it is part of a plateau. Point out and describe any relief feature that stands out in the area and state its location on the map.
(b) Describe the slopes in the area. States whether they are concave. Convex, uniform, steep or gently sloping.
Example of how you can describe relief:
The height of the area ranges from below 10 metres near to the coast to 548 metres in grid square 8483.
The main relief feature is T Mountain which is in the western part of the area. As the mountain extends to the south-east, it becomes narrower and its height decreases. This part of the mountain has two peaks of heights about 240 metres in grid square 8582 and about 110 metres in grid square 8682. This part of the mountain also has two spurs from grid square 8583 to 8683 extending from south-west to north-east.
The contours of T Mountain are very close together in the area west of easting 85. This indicates that the slopes are steep. The spacing of the contours on the eastern side of the mountain is wider. The slopes here are therefore less steep.

Steps taken to measure gradient
Identify the two points which the measurement is taken from and the height above sea level for the two points. You can either refer to the spot heights, the bench marks or the contour lines.
Calculate the height difference (vertical distance) of the two points.
Convert the height to the same unit of measurement as for horizontal distance if necessary e.g. 3.048 feet = 1metre
Measure the distance of the 2 points on the map. Convert to actual distance by referring to the line scale or using the map scale ie. 1: 50,000 means 1 cm on the map represents 500m in actual distance.
Gradient is expressed in ratio form – vertical distance: horizontal distance ie. 1: 30 - which means for every 1 metre increase in vertical distance, there is an increase of 30 metres in horizontal distance.



Kyk die video: carte de restriction 2 (Oktober 2022).