Inligting

Vloeisitometriese telling van apoptotiese hechtende selle

Vloeisitometriese telling van apoptotiese hechtende selle


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek het probeer om die tempo van apoptose in epiteelselle te meet deur apoptotiese selle te merk met anneksien V gekonjugeer met phycoerythrin (PE) en sorteer met behulp van vloeisitometrie. Ongelukkig hang die selle aan en word dit in 'n met kollageen bedekte plaat gekweek. Om hulle op te skort vir vloeisitometrie, het ek 'n trypsienbehandeling gebruik. Ongelukkig was my resultate redelik swak. Ek glo dat daar verskeie probleme is. Eerstens sal die tripsienbehandeling waarskynlik die ontwrigting van integrale membraanproteïene veroorsaak, wat moontlik die eksternalisering van fosfatidielserien (PS) (waaraan die anneksien bind) op die buitenste plasmamembraan van selle veroorsaak. Aangesien die selle geïnkubeer is met die bylae V na suspensie met trypsien, kon dit tot 'n aansienlike toename in skynbare apoptose gelei het en werklike verskille tussen die apoptose in WT- en KO -selle gemasker het. Verder is ek ingelig dat epiteelselle, ten einde hul strukturele integriteit te behou, 'n relatief groot verhouding van sitoplasma tot kern het, en 'n prominente sitoskelet wat lei tot verhoogde agtergrondgeraas (groenerig van kleur). Om hierdie probleme op te los, het ek verskeie alternatiewe oorweeg, soos om die fluoresserende merker waarmee bylae V gekonjugeer is, te verander om outofluorescerende interferensie te verminder, met behulp van 'n ander merker van apoptose (in die plek van bylae V), of, as ek sou Hou aan om anneksien V te gebruik, en ek dink dat inkubasie met anneksien V gevolg deur afwas van oortollige annexien, eers daarna met trypsienbehandeling, moontlik een van my verskillende probleme kan oplos (of dan weer, miskien nie). Help my asseblief om 'n geskikte protokol te vind vir vloeisitometriese analise van apoptotiese merkers in aanhangende epiteelselle. Verder, as u weet van enige studies wat sulke metodes gebruik, kan u my gerus daarop rig. Dankie by voorbaat.


Hier is 'n paar hulpbronne,

  1. Sel -oes effekte op Annexin V kleuring.
  2. Protokol vir apoptotiese analise met behulp van Annexin V.
  3. Nogal 'n lang bespreking oor hierdie kwessie.
  4. Nog 'n protokol.

Groete,

Pedro


Hoe om vloeititometrie te gebruik om apoptose, nekrose en outofagie te meet

Moord is 'n algemene tema in die geheimsinnige spanningsgenre. Die speurders wat hierdie moorde oplos, gebruik 'n kombinasie van waarneming en afleiding om die skuldige party te identifiseer. Hierdie metafoor pas by die meting van seldood.

In biologie is daar vier hoofweë vir seldood.

Die studie van die verskillende maniere waarop selle sterf, het bekend geword as Cell Necrobiology, soos geskep deur Darzynkiewicz en medewerkers in hul 1997-oorsigartikel.

Vloeisitometrie is ideaal as 'n instrument om selnekrobiologie te bestudeer, en met die oorvloed reagense is dit selfs moontlik om die verskillende stappe in hierdie prosesse te volg.

Die vier belangrikste maniere waarop 'n sel kan sterf, is:

    — geprogrammeerde seldood — traumatiese seldood — geordende afbraak van sellulêre komponente (outophagositose) — geordende nekrose

Seldood is so belangrik dat dit die middelpunt van verskeie Nobelpryse was, waaronder een wat in 2002 toegeken is aan Sydney Brenner, Robert Horvitz en John Sulston wat die gene wat by apoptose betrokke was, ontdek het, en weer in 2016 toe Yoshinori Ohsumi erkenning gekry het vir sy werk aan die meganismes van outofagie.

Van hierdie meganismes is apoptose waarskynlik die maklikste bestudeer met behulp van vloeititometrie.

Daar is baie toetse wat uitgevoer kan word om apoptose in selle te meet. Dit kan gegroepeer word volgens die toestand van die sel terwyl dit sterf.


Selbiologie

In selbiologie -navorsing moedig die beheer van seltellings in die vroegste stadium reproduceerbare resultate aan. Die gebruik van 'n outomatiese selteller word aanbeveel om te verseker dat gelyke aantal selle in stroomaf-analise gebruik word, en om selkonsentrasie op 'n akkurate en presiese wyse te bepaal.

Oplossings

In selbiologie-navorsing, of jy nou seltelling en lewensvatbaarheid benodig, of om gevorderde fluoressensie-gebaseerde selanalise met hoë reproduceerbaarheid uit te voer, het ons 'n oplossing om jou behoeftes te pas. Ons instrumente is outomatiese fluorescentie beeldsitometers wat ontwerp is vir gebruiksgemak, presisie en akkuraatheid.

Die verkryging van navorsing van hoë gehalte hang af van die reproduceerbaarheid en konsekwentheid van u data. NucleoCounter ® -instrumente verrig 'n wye reeks funksies, van presiese seltelling en lewensvatbaarheidbepalings tot gevorderde selmonsteranalise, met minimale gebruikerinmenging.

Plug-and-play-toetse bevat vyf verskillende apoptose-toetse, 'n selsiklusanalise en 'n GFP-transfeksie-toets. Boonop is daar ook 'n platform vir gebruikersbepaalbare toetse beskikbaar. Ons instrumente is ontwerp vir toegewyde selbiologie navorsing en ontwikkeling laboratoriums.

Onpartydige seltelling en lewensvatbaarheidbepalings

Handmatige seltelling met 'n hemositometer en trypanblou uitsluitingsmetode is tydrowend en hang baie af van die gebruiker se persepsie en pipetvaardighede.

Om seltelling en lewensvatbaarheid te bepaal deur die NucleoCounter ® NC-202™ en NC-3000™ instrumente te gebruik, laai eers die selsuspensie in die Via2-Cassette™ of Via1-Cassette™, onderskeidelik. Selle word outomaties gekleur deur die twee fluorofore in die kasset, akridien oranje en DAPI, wat onderskeidelik totale selle en dooie selle kleur. Die volume van die telkamer is vooraf gekalibreer, wat hoë akkuraatheid en reproduceerbaarheid verseker.

Hoë spoed sel lewensvatbaarheid en tellings

Die multi-kamer NC-Slide A8™ maak hoëspoed lewensvatbaarheid en seltelling bepalings van insek- en soogdierselle moontlik, en meet tot agt monsters in minder as drie minute. Meng die selsuspensie met akridien oranje en DAPI om alle selle en die dooie selle onderskeidelik te vlek. Laai dan die A8-slide ™ -kamers met die monster en plaas die skyfie in die NucleoCounter ® NC-3000 ™.

Ons bied geoptimaliseerde telprotokolle vir saamgevoegde selle, selle wat op mikrodraers en in sferoïede groei. Lees meer oor seltelling en lewensvatbaarheid deur die NC-Slide A8™ vir soogdierselle te gebruik.

Uitstekende datavisuele beelde en analise

Die NucleoView™-sagteware is die gebruikerskoppelvlak vir die NucleoCounter ® NC-200™ en NC-3000™. Dit hanteer data-verkryging en aanbieding, saam met beeldanalise. NucleoView™ bevat 'n verskeidenheid datahanteringskenmerke wat perfek geskik is vir gereguleerde omgewings.

Die sagteware stel jou in staat om die fluoressensiebeeld visueel te inspekteer en gee jou die geleentheid om die telling te verifieer. U kan spesifieke gebeurtenispopulasies in die verspreidingsplotte kies en die geldigheid van die insluiting of uitsluiting daarvan ondersoek en bepaal uit die finale telresultate. Gating kan aangepas word en u kan hierdie aangepaste protokol stoor vir toekomstige metings.

Tel gesamentlike selle

Die NucleoCounter ® NC-202 ™ (en NC-200 ™) bevat 'n wye reeks gespesialiseerde toetse, wat dit die perfekte selteller maak. Bolkulture of hoogs saamgestelde seltipes bied groot uitdagings in die tel van selle, maar met ons gespesialiseerde toetse kan hierdie instrumente selfs die mees saamgestelde selkultuurmonsters tel.

Gestandaardiseerde Apoptose Assays

Vir gevorderde navorsing oor seldood, is dit noodsaaklik om die meganismes van apoptose te bestudeer. Met behulp van die NucleoCounter ® NC-3000 ™, 'n reeks van vyf plug-and-play-toetse, insluitend Annexin V, mitochondriale potensiaal met JC-1, caspase-sein, DNA-fragmentering en die unieke vitaliteitsbepaling van een minuut, sodat u sel volledig kan ondersoek doodsmeganismes.

APOPTOSE ASSAY FISIOLOGIESE VERANDERINGE GEDETEKTEER Toneel
Mitochondriale potensiaalbepaling (JC-1) Ineenstorting van die mitochondriale membraanpotensiaal Vroeg
Annexin V -toets Ineenstorting van plasmamembraan lipied asimmetrie Vroeg-middel
Caspase -toets Kaspase -aktivering dui stroomopwaartse apoptotiese gebeure aan Vroeg-middel
Vitality (VB48 ™) toets Afname in sellulêre vlakke van verlaagde tiole bv. GSH Laat
DNA Fragmentasie Assay Ontbinding en fragmentering van DNA Laat

Dek vroeë tot laat stadiums van apoptose, hierdie toetse help jou om in-diepte studies van apoptose progressie in soogdierselle uit te voer. Jy kan gevorderde data-analise moeiteloos met NucleoView™ uitvoer. Die platform bied skakels tussen beelde, histogramme en verstrooiingsdiagramme, wat jou toegang gee tot gedetailleerde en presiese data-analise wat persentasies apoptotiese, nekrotiese en lewende selle identifiseer.

Monitering van lewensvatbaarheid en doeltreffendheid van GFP -transfeksie

By die transfeksie van selle met gene van belang, is 'n manier om die doeltreffendheid van die transfeksie te bepaal, 'n fluorescerende proteïen, soos groen fluoresserende proteïen (GFP), onder dieselfde promotor uit te druk en die hoeveelheid GFP te bepaal.

Die NucleoCounter ® NC-3000 ™ bied 'n vinnige en maklik om te gebruik toets om die doeltreffendheid en uitdrukking van GFP-transfeksie te toets. Deur selle te kleur met Hoechst 33342 en propidiumjodied (PI), kan u die totale selpopulasie en die dooie selpopulasie definieer saam met die populasie wat GFP uitdruk.

Selkleuring in NucleoView ™ sagteware met behulp van GFP transfeksie doeltreffendheidstoets met die NucleoCounter ® NC-3000 ™

A – -selle word met behulp van Hoechst 33342 (blou) gevind, en die persentasie GFP -uitdrukkingselle (groen) kan maklik bepaal word. Nie-lewensvatbare selle word met propidiumjodied (PI-rooi) gekleur.
B – Alle selle wat met Hoechst 33342 (blou) gekleur is, word geïdentifiseer.
C – GFP-uitdrukkingselle word in groen en nie-lewensvatbare selle in rooi geïdentifiseer deur PI-kleuring.

Maklike koppeling tussen die beeld verkry en die verstrooiingsdiagramme of histogramme laat jou toe om die presiese hekinstellings te bepaal wat gebruik word om die kleurpatroon vir spesifieke selpopulasies te ondersoek. Die NucleoCounter ® NC-3000 ™ bied 'n alles-in-een platform om die doeltreffendheid van GFP-uitdrukking te evalueer.

Nie-lewensvatbare selle wat met PI bevlek is, kan maklik gevind word met die beeld-oorlegfunksie in die NucleoView ™ sagteware (A). GFP-getransfekteerde selle kan onmiddellik geïdentifiseer word (B).

Vinnige sel siklus analise

Om die impak van 'n behandeling op seldeling te ondersoek, is een van die kragtigste instrumente binne selbiologie. Die NucleoCounter ® NC-3000™ bied vinnige en maklike selsiklusanalise in minder as vyf minute.

Nadat 'n lysbuffer bygevoeg is, word alle selkerne gekleur en word die monster gemeet met behulp van die NC-3000 ™. 'n Selsiklusprofiel word in die meegaande plotbestuurder in die NucleoView™-sagteware vertoon. Gebeurtenisse in die sub-G1-fase, G0/G1-fase, S-fase en G2/M-fase word geïdentifiseer.

Met die FlexiCyte™-sagtewarepakket kan die NucleoCounter® NC-3000™ selfs gebruik word om selproliferasie met BrdU- en EdU-inkorporering te bestudeer, opgespoor met fluoresserend gemerkte teenliggaampies wat gevorderde studies van selproliferasie moontlik maak.

Illustrasie: Twee-stap selsiklustoets van onbehandelde en kamptotesien-behandelde (CPT) Jurkat-selle. Die histogramme vertoon intensiteit van die DNA-kleur DAPI en kan gebruik word om selsiklusgebeure in die sub-G1-fase, G0/G1-fase, S-fase en G2/M-fase te definieer. Na CPT-behandeling word die selsiklus in die G2/M-fase gestaak.

Gevorderde selanalise

Die FlexiCyte™-module beskikbaar vir die NucleoCounter ® NC-3000™ stel gebruikers in staat om gedetailleerde gevorderde selanalise van hul eie keuse in soogdier- en insekselle uit te voer. Die kombinasie van LED's, van UV tot verrooi, tesame met 'n versigtig gekose stel emissiefilters, stel u in staat om 'n wye verskeidenheid fluoresserende teenliggaampies en proteïene op te spoor.

Die Protokol -aanpassingswizard -funksie lei die gebruiker deur 'n seleksie van optimale instellings. Na beeldverkryging, in die plotbestuurder, word seldata langs die fluorescerende beeld aangebied as spreidingsplotte, histogramme of albei. Deur beelde met erwe te koppel, is u bewapen met alles wat u nodig het om gedetailleerde data -ontledings uit te voer.

Die FlexiCyte™-sagtewarepakket maak gedetailleerde biomerkerontleding van 'n wye reeks fluoresserende teenliggaampies en proteïene moontlik.


Induksiefase van Apoptose

Alhoewel dit nie moontlik is om intrinsiek gemedieerde apoptose-induksie deur vloeisitometrie te meet nie, is die meting van ekstrinsiek bemiddelde apoptose-induksie relatief eenvoudig aangesien dit die ontleding van die sogenaamde doodsreseptore (DR) CD95, CD261 (DR4), CD262 (DR5) behels, CD120a en CD120b, wat met teenliggaampies opgespoor kan word. Ons Apoptose Oorsig bladsy gaan in meer besonderhede oor die twee hoof apoptose weë.

Dit is belangrik om die balans te verstaan ​​tussen die uitdrukkingspatrone van sterfreseptore en anti-apoptotiese meganismes, seinweë en die opregulering van hierdie reseptore op die gebied van kanker, inflammasie, weefselgenesing, oorplanting en seldood. Vloeisitometrie is ideaal om uitdrukkingsvlakke van hierdie reseptore in selpopulasies uit verskillende monsters te bepaal. Ontvanger vlakke bv. CD95/FAS (Figuur 1) kan in verskillende seltipes bepaal word bloot deur FSC (voor) en SSC (syverspreiding) profiele waar limfosiete, monosiete en granulosiete geïdentifiseer kan word. Alternatiewelik kan spesifieke afstammingstekens gebruik word, soos CD3 vir T -selle, CD19 vir B -selle en CD14 vir monosiete in 'n immunofenotiperingspaneel. Dit stel u in staat om inligting te verkry oor die vlakke van induksie van apoptose in spesifieke selle.


Tabel 1 hieronder lys Bio-Rad&rsquos doodreseptor teenliggaampies wat in vloeisitometrie bekragtig is. Let op dat versigtigheid in ag geneem moet word by die immunofenotipering van apoptotiese selle. Dooie selle kan teenliggaampies nie-spesifiek bind, so 'n lewensvatbaarheidskleurstof is 'n moet om vals positiewe te vermy. Vlekprotokolle moet moontlik ook geoptimaliseer word. Lang inkubasietye kan die apoptosevlakke verander en intrasellulêre kleuring vereis fiksering en permeabilisering van selle.

Tabel 1. Vloeisitometrie-gevalideerde teenliggaampies teen reseptore van die ekstrinsieke apoptose-weg.

Ontvanger Ligand

Positiewe beheer

Verdere inligting

Menslike perifere limfosiete

Oplosbare weergawe van CD95 (sCD95) tree op as 'n lokmiddelreseptor wat apoptose inhibeer

Menslike perifere granulosiete

Kruisreageer met muis CD266

Afkortings: TRAIL, TNF-verwante apoptose-induserende ligand TNF-R, tumor nekrose faktor reseptor TNFRSF12A, tumor nekrose faktor reseptor superfamilie 12A TWEAK, TNF-agtige swak induseerder van apoptose.


Bespreking

In die huidige studie het ons getoon dat 'n taamlik klein fraksie van CD34 + selle van die perifere bloed in apoptose tree tydens die proses van byvoeging, vries en ontdooiing van DMSO. Aan die ander kant was die fraksie van apoptose en nekrose hoog in die totale selpopulasie (Figuur 1 en Tabel 2).

Na ons wete is dit die eerste keer dat apoptose en nekrose gemeet word in menslike cryopreserveerde perifere bloed CD34 + selle, met behulp van die goed gedokumenteerde annexien V-vloei sitometriese metode. Anthony et al 18 het vars outoloë PBPC-konsentrate met annexien V gekleur (sonder die dubbele kleuring met nie-vitale kleurstof), en meld dat 87,6% (reeks 30–96,6) van die CD34 + -selle annexien V-negatief was, wat byna identies is aan ons figuur van 81% (reeks 49–97). Die syfers is egter nie streng vergelykbaar nie, aangesien die selle in ons studie ondersoek is na DMSO byvoeging en vries/ontdooiing. De Boer et al 5 het sitometriese metings van bevrore/ontdooide MACS-geïsoleerde CD34 + -selle uitgevoer en getoon dat beide die verlies aan L-selectine-uitdrukking en die opkoms van apoptose plaasgevind het na vries-ontdooiing. Onlangs, Schuurhuis et al, 7 het hierdie werk uitgebrei deur vroeë apoptose te meet in beide gesuiwerde en nie -gesuiwerde CD34 + -selle uit cryopreserveerde leukaferese -monsters. Deur gebruik te maak van die vroeë apoptotiese merker Syto R 16 in kombinasie met actinomycin D, meld hulle dat in ongesuiwerde bevrore/ontdooide CD34 + PBPC van 15 pasiënte soveel as 37% van die CD34 + selle vroeg apoptoties was en 29% nekroties was. Hul getal apoptotiese CD34 + -selle is duidelik hoër as die syfer in ons ondersoek. Hul metings van apoptose en nekrose in die CD34+-selle is meer in ooreenstemming met ons metings van apoptose en nekrose in die totale selpopulasie. Volgens Schuurhuis et al, Syto R 16 bespeur 'n ietwat hoër fraksie van vroeë apoptotiese selle as anneksien V. Ons glo egter nie dat dit die enigste rede kan wees vir die groot verskil in metings nie. Die byvoeging van DMSO, vries/ontdooiingsproses, verdunning en hantering van die ontdooiing van die monster kan die lewensvatbaarheid na ontdooiing beïnvloed. Meer vloeisitometriese studies van na-vries/ontdooi PBPC apoptose is nodig om die verskil tussen die twee studies te verduidelik.

Die blootstelling van PS aan die buitenste selmembraan dien as 'n herkenningsein vir makrofage om die apoptotiese selle te fagositiseer. Dus sal die anneksien V-positiewe CD34-selle waarskynlik uit die hematopoietiese stelsel geëlimineer word en sal dit dus geen effek hê op die langtermyn-enting na myeloablatiewe chemoterapie nie. Kwantitatiewe metings van anneksien V-negatiewe CD34-selle voor herinfusie van PBPC kan belangrik wees in die kliniese omgewing om pasiënte met 'n risiko van entversaking te identifiseer. Dit kan veral belangrik wees vir voorloperselkonsentrate met 'n lae CD34 + -telling of vir konsentrate wat gemanipuleer is deur suiwering/positiewe seleksie. In die onderhawige studie is nie een van die 11 pasiënte herinfuseer met PBPC -konsentrate wat minder as 1,7 × 106 annexien V negatiewe CD34 + selle/kg bevat nie, en al die pasiënte het 'n normale hematologiese herstel gehad.

Soos in figuur 2 getoon, dui die huidige studie aan dat 'n mens 'n ruwe skatting kan kry van die gekombineerde fraksie apoptotiese + nekrotiese CD34 + selle, net deur na die verstrooiingseienskappe te kyk. Dit is in ooreenstemming met ander studies. 5,12 Die opmerking dat die apoptotiese selle 'n ietwat hoër aktinomisien D -opname gehad het as die lewensvatbare selle en 'n laer opname van aktinomisien D as die nekrotiese selle, is ook in ooreenstemming met ander vloeisitometriese ondersoeke. 16,20

Ons was verbaas om te vind dat soveel as 31% (gemiddeld) van die totale selpopulasie in die PBPC-konsentraat (hoofsaaklik volwasse bloedselle), in vroeë apoptose was na kriopreservering. Die laat apoptotiese/nekrotiese totale selfraksie in ons studie was 33%, wat nie te ver is van ander se bevindings nie. 21 Moontlike ongewenste kliniese implikasies van herinfusering van 'n konsentraat met 49–81% apoptotiese en nekrotiese selle is onbekend. Die algemene kliniese newe-effekte van die herontdooiing van 'n ontdooide PBPC-konsentraat wat deur ontdooi is, is spoel, naarheid, kortaseming, strengheid na infusie en onderdruk. Hierdie simptome word gewoonlik toegeskryf aan DMSO-geïnduseerde histamienvrystelling. 'N Klein kliniese studie het egter getoon dat hierdie simptome ook voorkom by pasiënte wat DMSO voor die herinfusie uit die PBPC-produk laat verwyder het, wat dui op 'n moontlike skadelike effek van die herinfusie van nie-lewensvatbare selle wat nie deur 'n kristal bewaar is nie. 22 Aan die ander kant kan 'n mens spekuleer of kontaminerende tumorselle in die PBPC-konsentraat ook apoptoties en nekroties kan word na die vries/ontdooi proses, wat 'n moontlike voordelige suiweringseffek van die vriesprosedure voorstel.

Ten slotte bevestig hierdie studie die relatiewe robuustheid van menslike CD34 + -selle tydens die vries/ontdooiingsprosedures wat in die daaglikse kliniese praktyk uitgevoer word. Die vloeisitometriese driekleurmetings van perifere bloedvoorloperselkonsentrate bevlek met anti-CD34, anneksien V en actinomycin D is 'n eenvoudige, vinnige en reproduceerbare metode. Hierdie ondersoek kan nuttig wees om die potensiaal van stamvaderselle te bepaal in vivo hematopoietiese engraftment en verder ex vivo manipulasies, soos uitbreiding van voorloperselle en geenterapie.


Bespreking

Dit word al hoe duideliker dat die vorming van ApoBD's tydens apoptose 'n hoogs gereguleerde proses is 4,13,15. Die verspreiding van intrasellulêre inhoud in ApoBD's is egter nie goed gedefinieer nie, moontlik as gevolg van die gebrek aan metodologieë wat hierdie proses vinnig en akkuraat kan bestudeer. Die data wat hier aangebied word, demonstreer die vermoë om die verspreiding van intrasellulêre inhoud, insluitend DNA, RNA en mitochondria, doeltreffend in ApoBD's te monitor en te kwantifiseer deur vloeititometrie. Daar moet op gelet word dat ander intrasellulêre inhoud (bv. Ander organelle of spesifieke molekules) in ApoBD's ook met 'n soortgelyke benadering gemonitor kan word indien geskikte kleuring- of opsporingsmetodes beskikbaar is. Net so kan soortgelyke benaderings vir beide kleef- en nie-kleefselle sowel as primêre selle gebruik word. Verder, deur gebruik te maak van die beskrywe benadering wat gebaseer is op vloeisitometrie, vestig hierdie werk ook die konsep dat ApoBD's nie net een homogene identiteit is nie, waardeur subgroepe van ApoBD's gedefinieer kan word op grond van hul intrasellulêre inhoud. Dit is veral relevant vir stroomafwaartse funksies van ApoBD's, aangesien verskillende subgroepe van ApoBD's verskillende funksies kan vertoon. Byvoorbeeld, nie alle ApoBD's kon die oordrag van outo-antigene, sitokiene of mikroRNA's na ontvangerselle bemiddel nie. Daarbenewens moet bepaal word of fagosiete verskillende subgroepe van ApoBD's anders kan herken en uitvee.

Soos beskryf in ons onlangse studies 4,15,16, word die demontage van apoptotiese sel gereguleer deur drie verskillende morfologiese stappe, naamlik membraanblaas (stap 1), vorming van apoptotiese uitsteeksel (stap 2) en fragmentasie om ApoBD's te genereer (stap 3). Belangrik is dat apoptotiese selle verskillende meganismes kan gebruik om ApoBD's te genereer, afhangende van die aktiwiteit van sekere molekulêre faktore 13,15,17. In die besonder kan die manipulasie van die aktiwiteit van sleutelreguleerders van selontbinding, soos ROCK1 en PANX1, bepaal of apoptotiese selle ApoBD's via apoptopodia (afsonderlike membraanblare om ApoBD's te vorm) of kralewerk -apoptopodia (fragmentasie van die apoptotiese membraanuitsteeksel sal vorm om ApoBD's te vorm) ) 13 . Met behulp van die vloeisitometrie metode wat in hierdie studie beskryf word, het ons bewyse gelewer om die idee te ondersteun dat die inhoud in ApoBD's beïnvloed kan word deur die meganisme van hul vorming. Byvoorbeeld, ApoBD's wat deur kralende apoptopodia gegenereer word, is minder geneig om 'n aansienlike hoeveelheid DNA te bevat in vergelyking met ApoBD's wat via apoptopodia gegenereer word. Die verspreiding van intrasellulêre inhoud in ApoBD's is dus nie bloot 'n stogastiese proses nie en kan dit gereguleer word deur die meganisme van die demontage van apoptotiese selle. Aangesien verskillende seltipes verskillende meganismes kan gebruik om die demontage van selle tydens apoptose 4,13,14,15,16 te ondergaan, het ApoBD's wat deur verskillende seltipes gegenereer word, waarskynlik verskillende effekte op fisiologiese prosesse sowel as die vordering van sekere siektes. Dit is interessant om daarop te let dat vorige studies ook voorgestel het dat die verpakking van intrasellulêre inhoud soos DNA en RNA in ApoBD's gereguleer word, en DNA en RNA word in verskillende ApoBD's geskei tydens apoptose 22 . Die data wat in hierdie studie aangebied word, dui egter daarop dat hoewel die verspreiding van intrasellulêre inhoud in ApoBD's 'n gereguleerde proses is, DNA en RNA nie in aparte ApoBD's verdeel word nie. Die verskil tussen vorige werk 22 en ons huidige studie kan toegeskryf word aan hoe die ApoBD's voor ontleding hanteer is (bv. gefixeerde versus nie gefikseer, sitotentrifugeer versus nie sitotentrifugeer nie), en hoe ApoBD's ontleed is (bv. mikroskopie-analise gebaseer op 'liggaamagtige' strukture se teenoor vloeititometrie -analise gebaseer op A5 -kleuring sowel as relatiewe grootte en kompleksiteit/korrelvorm).

Tot nou toe was die identifikasie van ApoBD's in selkultuurmonsters grootliks gebaseer op eienskappe soos fosfatidielserienblootstelling, sowel as deeltjiegrootte en korreligheid 19 . Om die funksie van ApoBD's in verskeie siekte-omgewings verder te bestudeer en te karakteriseer, is dit nodig om hierdie vesikels akkuraat te kan identifiseer. Hier demonstreer ons dat benewens intrasellulêre inhoud, ApoBD's ook geïdentifiseer en gesubklassifiseer kan word op grond van die sel van oorsprong waaruit hulle ontstaan. Deur analise van oppervlakmerkeruitdrukking op HUVEC, THP-1 monosiete en Jurkat T-selle, is opgemerk dat die uitdrukking van seltipe spesifieke merkers (bv. CD146, CD45 en CD3) verminder word op apoptotiese selle en ApoBD's in vergelyking met lewensvatbare selle. Alhoewel dit onduidelik is waarom hierdie seltipe spesifieke merkers op die oppervlak van apoptotiese selle verminder word, was die uitdrukking van hierdie merkers voldoende om verskillende subgroepe van ApoBD's in gemengde kultuur te identifiseer op grond van hul seloorsprong. Dit is veral moontlik om die oorsprong van ApoBD's uit liggaamsvloeistowwe te identifiseer deur middel van vloeisitometrie as toepaslike oppervlakmerke en hekstrategieë vasgestel word.

Gesamentlik kan die vloeisitometrie-gebaseerde benaderings wat in hierdie studie beskryf word, gebruik word om die vorming van verskillende subsets van ApoBD's te monitor, en hul funksie onder fisiologiese en patologiese toestande beter te verstaan.


MitoStatus TMRE

Paneel 1. Vloeisitometriese analise van TMRE -kleuring in Jurkat -selle. Jurkat -selle is behandel met 0,025% DMSO (vaste lyn histogramme), 5 μM camptothecin (linkerplot, stippellyn histogram) vir 4 uur of 50 μM FCCP (20 minute, regterplot, histogram met 'n stippellyn) en dan met 100 nM gekleur BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE (15 min, Kat. No. 564696).

Paneel 2. Tweekleurvloeisitometriese analise van TMRE-kleuring in Jurkat-selle. Jurkat-selle is vir 4 uur behandel met 0,025% DMSO (Linker Plot) of 5 μM kamptotesien (Regte Plot) en dan gekleur met 100 nM MitoStatus TMRE (15 min). Selle is hersuspendeer in Annexin V Binding Buffer (Kat. No. 556454) en gekleur met APC Annexin V (15 min, Kat. No. 556419). Co-kleuring toon twee hoofpopulasies: gesonde selle wat MitoStatus TMRE-positief en Annexin V-negatief is, en apoptotiese of dooie selle wat MitoStatus TMRE-negatiewe en APC Annexin V-positiewe is. In vergelyking met die DMSO-voertuigbehandelde kontrole, het camptothecinbehandeling die MitoStatus TMRE-negatiewe en APC Annexin V-positiewe populasie verhoog, wat aandui dat meer selle apoptose ondergaan. Die verlies aan mitochondriale membraanpotensiaal is 'n vroeë apoptotiese merker, so 'n klein populasie selle in oorgang is MitoStatus TMRE-negatief en APC Annexin V-negatief. Vloeisitometriese analise is uitgevoer met behulp van 'n BD LSRFortessa ™ selanaliseerderstelsel.

Paneel 3. Immunofluorescerende beelding van TMRE in HeLa -selle. HeLa-selle is behandel met 0,02% DMSO (linkerbeeld) of 1 uM staurosporien (regterbeeld) vir 3 uur. Selle is gekleur (30 min) met 200 nM MitoStatus TMRE en 5 ug/ml Hoechst. Vlekmedia is verwyder en vervang met DPBS. In vergelyking met die voertuig-behandelde kontrole, toon staurosporien-behandelde selle 'n afname in mitochondriale kleuring met TMRE, sowel as piknotiese kerne kenmerkend van apoptotiese selle. Selle is afgebeeld op 'n BD Pathway™ 435-selontleder en saamgevoeg met BD Attovision™-sagteware.

MitoStatus TMRE is op die muis getoets (data word nie getoon nie).

Paneel 1. Vloeisitometriese analise van TMRE-kleuring in Jurkat-selle. Jurkat -selle is behandel met 0,025% DMSO (vaste lyn histogramme), 5 μM camptothecin (linkerplot, stippellyn histogram) vir 4 uur of 50 μM FCCP (20 minute, regterplot, histogram met 'n stippellyn) en dan met 100 nM gekleur BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE (15 min, Kat. No. 564696).

Paneel 2. Tweekleurvloeisitometriese analise van TMRE-kleuring in Jurkat-selle. Jurkat-selle is vir 4 uur behandel met 0,025% DMSO (Linker Plot) of 5 μM kamptotesien (Regte Plot) en dan gekleur met 100 nM MitoStatus TMRE (15 min). Selle is hersuspendeer in Annexin V Binding Buffer (Kat. No. 556454) en gekleur met APC Annexin V (15 min, Kat. No. 556419). Samekleuring toon twee hoofpopulasies: gesonde selle wat MitoStatus TMRE-positief en Annexin V-negatief is, en apoptotiese of dooie selle wat MitoStatus TMRE-negatief en APC Annexin V-positief is. In vergelyking met die DMSO-voertuig-behandelde kontrole, het kamptotesienbehandeling die MitoStatus TMRE-negatiewe en APC Annexin V-positiewe populasie verhoog, wat aandui dat meer selle apoptose ondergaan. Die verlies aan mitochondriale membraanpotensiaal is 'n vroeë apoptotiese merker, so 'n klein populasie selle in oorgang is MitoStatus TMRE-negatief en APC Annexin V-negatief. Vloeisitometriese analise is uitgevoer deur gebruik te maak van 'n BD LSRFortessa™ Sel Ontleder System.

Paneel 3. Immunofluorescerende beelding van TMRE in HeLa -selle. HeLa-selle is behandel met 0,02% DMSO (linkerbeeld) of 1 uM staurosporien (regterbeeld) vir 3 uur. Selle is gevlek (30 minute) met 200 nM MitoStatus TMRE en 5 ug/ml Hoechst. Vlekmedia is verwyder en vervang met DPBS. In vergelyking met die voertuig-behandelde kontrole, toon staurosporien-behandelde selle 'n afname in mitochondriale kleuring met TMRE, sowel as piknotiese kerne kenmerkend van apoptotiese selle. Selle is op 'n BD Pathway ™ 435 -selanaliseerder afgebeeld en saamgevoeg met behulp van BD Attovision ™ sagteware.

MitoStatus TMRE is op die muis getoets (data word nie getoon nie).

Paneel 1. Vloeisitometriese analise van TMRE -kleuring in Jurkat -selle. Jurkat -selle is behandel met 0,025% DMSO (vaste lyn histogramme), 5 μM camptothecin (linkerplot, stippellyn histogram) vir 4 uur of 50 μM FCCP (20 minute, regterplot, histogram met 'n stippellyn) en dan met 100 nM gekleur BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE (15 min., Kat. Nr. 564696).

Paneel 2. Tweekleurvloeisitometriese analise van TMRE-kleuring in Jurkat-selle. Jurkat -selle is vir 4 uur behandel met 0,025% DMSO (linkerplot) of 5 μM camptothecin (regterplot), en daarna gekleur met 100 nM MitoStatus TMRE (15 min). Selle is weer gesuspendeer in Annexin V Binding Buffer (Cat. No. 556454) en bevlek met APC Annexin V (15 min, Cat. No. 556419). Co-kleuring toon twee hoofpopulasies: gesonde selle wat MitoStatus TMRE-positief en Annexin V-negatief is, en apoptotiese of dooie selle wat MitoStatus TMRE-negatiewe en APC Annexin V-positiewe is. In vergelyking met die DMSO-voertuigbehandelde kontrole, het camptothecinbehandeling die MitoStatus TMRE-negatiewe en APC Annexin V-positiewe populasie verhoog, wat aandui dat meer selle apoptose ondergaan. Verlies van mitochondriale membraanpotensiaal is 'n vroeë apoptotiese merker, so 'n klein populasie van selle in oorgang is MitoStatus TMRE-negatief en APC Annexin V-negatief. Vloeisitometriese analise is uitgevoer met behulp van 'n BD LSRFortessa ™ selanaliseerderstelsel.

Paneel 3. Immunofluorescerende beelding van TMRE in HeLa-selle. HeLa-selle is behandel met 0.02% DMSO (linkerbeeld) of 1 uM staurosporien (regterbeeld) vir 3 uur. Selle is gekleur (30 min) met 200 nM MitoStatus TMRE en 5 ug/ml Hoechst. Kleurmedia is verwyder en vervang met DPBS. In vergelyking met die voertuigbehandelde kontrole, toon staurosporien-behandelde selle 'n afname in mitochondriale kleuring met TMRE, sowel as pyknotiese kerne wat kenmerkend is van apoptotiese selle. Selle is op 'n BD Pathway ™ 435 -selanaliseerder afgebeeld en saamgevoeg met behulp van BD Attovision ™ sagteware.

MitoStatus TMRE is op muis getoets (data nie gewys nie).

BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE

Regulerende Status Legende

Enige gebruik van ander produkte as die toegelate gebruik sonder die uitdruklike skriftelike toestemming van Becton, Dickinson en Company is streng verbode.

Aanbevole toetsprosedures

Bring BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE kleurstofpoeier en vars selkweek-graad Dimethyl Sulfoxide (DMSO bv. Sigma D2650) tot kamertemperatuur. Reconstitute TMRE dye powder in DMSO at a stock concentration of 0.2-1 mM. For example, 1 mg of BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE can be dissolved in 1.94 mL of DMSO to yield a 1 mM stock solution (MW = 514.96 g/mol).

Upon arrival, store the dye powder desiccated and protected from light at ≤ -20°C until use. The dye powder is stable for at least 12 months if stored as indicated. After reconstitution with DMSO, store the stock solution at ≤ -20°C in small aliquots. The stock solution is stable for at least 6 months if stored as indicated.

Flow Cytometry Requirements

Before staining with this reagent, please confirm that your flow cytometer is capable of exciting the fluorochrome and discriminating the resulting fluorescence. Flow Cytometers (eg, BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™, BD™ LSR II, or BD Accuri™ C6) equipped with a blue (eg, 488 nm) or yellow-green (eg, 561 nm) laser can be used. TMRE dye fluorescence can be detected with filters commonly used for phycoerythrin (PE) (eg, 575/26 or 582/15 nm).

Fluorescence compensation is best achieved using the cell samples of interest. When designing multicolor fluorescent staining panels, please be aware of high fluorescence spillover into the following fluorochromes' detectors: BD Horizon™ PE-CF594, BV605, BV650, or PerCP-Cy™5.5. We recommend titrating the dye and using the lowest concentration that provides adequate resolution of polarized and depolarized cell populations to reduce fluorescence spillover.

BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE labeling of suspended cells for flow cytometric analysis

1. Count cells to determine cell density. Adjust cell density to 1 × 10^6 cells/mL or less in fresh, pre-warmed cell culture media.

2. Stain cells in fresh, pre-warmed cell culture media or desired stain buffer with 20-200 nM BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE in a polypropylene container by adding the stock solution directly to the cells at the desired concentration.

a. Note: BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE may also be added directly to the culture instead of staining in fresh media. Staining may also be performed in pre-warmed BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (Cat. No. 554656) or pre-warmed PBS. PBS may provide increased resolution for some cell types, but can also result in increased background staining.

b. Note: TMRE is known to stick to polystyrene. Samples should be stained in polypropylene containers.

c. Note: To aid in flow cytometric gating, we recommend using control cells treated with vehicle alone and/or cells treated with a mitochondrial uncoupler, such as FCCP [Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone, eg, Sigma Cat. No. C2920].

3. Incubate samples for 15-30 minutes at 37°C protected from light.

4. Wash cells twice with BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS).

5. Decant the supernatant and gently mix to disrupt the cell pellet.

6. Resuspend the cells in Stain Buffer (FBS).

7. Analyze cells by flow cytometry. Alternatively, counterstain cells with compatible fluorescent dyes or antibodies as desired and then analyze.

BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE labeling of adherent cells for flow cytometric analysis

1. Adherent cells should be stained in situ at ≤ 70% confluence. Stain cells in fresh, pre-warmed cell culture media or desired stain buffer with 20-200 nM BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE by adding the stock solution directly to the cells at the desired concentration.

a. Note: BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE may also be added directly to the culture instead of staining in fresh media. Staining may also be performed in pre-warmed BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) or pre-warmed Dulbecco's PBS (DPBS). DPBS may provide increased resolution for some cell types, but can also result in increased background staining.

b. Note: To aid in flow cytometric gating, we recommend using control cells treated with vehicle alone and/or cells treated with a mitochondrial uncoupler, such as FCCP..

2. Incubate samples for 15-30 minutes at 37°C protected from light.

3. Wash cells twice with BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS).

4. Remove cells from the growth medium. We recommend using BD™ Accutase™ Cell Detachment Solution (Cat. No. 561527).

5. Wash cells twice with BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) or the equivalent.

6. Decant the supernatant and gently mix to disrupt the cell pellet.

7. Resuspend the cells in Stain Buffer (FBS).

8. Analyze cells by flow cytometry. Alternatively, counterstain cells with compatible fluorescent dyes or antibodies as desired and then analyze.

1. This dye is not compatible with cellular fixation.

2. Each user should determine the optimal concentrations of reagents, cells, and conditions for the assay of interest. We recommend titrating the reagent in early experiments to obtain optimal results.

3. Cells may be stained in bulk prior to staining with fluorescent antibodies.

BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE labeling of cells for fluorescent imaging

1. Stain cells in fresh, pre-warmed media with 20-200 nM BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE.

2. Incubate samples for 15-30 minutes at 37°C protected from light.

3. Remove the staining solution and replace with pre-warmed DPBS.

4. Analyze cells by fluorescence imaging. Alternatively, counterstain cells with compatible fluorescent dyes or antibodies as desired and then analyze.


Measuring Apoptosis

One of the most common features of apoptosis that can be measured by flow cytometry is externalization of phosphatidylserine (PS), a phospholipid found in the inner membrane of healthy cells. Annexin V binds to phosphatidyl serine and thus annexin V labeled with fluorophores allow apoptosis to be assessed, usually in combination with a viability dye such as propidium iodide (PI) to distinguish apoptotic from necrotic cells. Healthy cells are negative for both markers, apoptotic cells are positive for annexin V and necrotic cells are positive for both markers. When Jurkat T cells are treated with staurosporine they undergo apoptosis, followed by necrosis. The time course in Figure 33 below shows the increase in annexin V staining after 1 hour as they apoptose, followed by a subsequent increase in necrotic cells by 6 hrs.

Fig. 33. Annexin V staining to measure apoptosis. Jurkat cells were treated with staurosporine at 1 &muM for 0 hr, 1 hr and 6 hr to induce apoptosis. The cells were then stained with annexin V FITC (ANNEX300F) and ReadiDrop&trade propidium iodide (1351101). Apoptotic cells positive for annexin V can be seen in the bottom right quadrant and dead cells positive for both annexin and PI in the top right quadrant. Healthy cells are negative for both stains.

Because phosphatidylserine externalization is a dynamic, reversible process until a cell is committed to apoptosis after mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP), annexin V conjugates are unable to distinguish early apoptotis from late apoptosis. Polarity-sensitive indicator of viability and apoptosis (pSIVA) probes are biosensors that reversibly bind to PS and thus turn on and off as PS flips from the outer membrane to the inner membrane. This allows easy comparison of differences in apoptosis rates in response to different experimental treatments in real time.


Why You Need To Remove Dead Cells

Dead cells should be removed from all flow cytometry experiments that aim to evaluate live cell lineage and functionality.

Below are two simple examples of why you need to remove non-viable cells prior to implementing your flow cytometry gating strategies.

The two plots display mesenchymal stromal cells (MSC) produced in a Good Manufacturing Practices lab. The lab in question is very good at producing these cells from bone marrow and routinely generates 100% CD45-negative cells after their analysis.

In the panel on the left, the sample is stained with a dead cell marker only. Here, you can easily see what appears to be CD45 contamination of their MSC product in the dead cell (dead cell marker-positive) fraction. This would NOT be possible without the dead cell marker. Also, as discussed above, the left panel reveals the higher levels of autofluorescence in the dead cells. Finally, by adding anti-CD45 antibody to the sample (right panel)you see both the autofluorescent population, as well as a separate CD45-positive population that’s taking up the antibody.

Fortunately for scientists and flow cytometrists like you, there are multiple ways to label and identify dead cells so they can be removed from your flow cytometry analysis and cell sorting experiments.


BESPREKING

Although the molecular mechanisms involved in phagocytosis of apoptotic cells are becoming better understood, little is known about the recognition and uptake of necrotically dying cells. Here, we used differentially labeled macrophages and target cells to study the uptake of apoptotic and necrotic cells in a quantitative flow cytometry phagocytosis assay. The L929 fibrosarcoma cellular system provided us with well-characterized models of apoptosis and necrosis mediated by a death domain receptor (Denecker et al., 2001b), distinct from cell death caused by physical damage such as rupture of the cell membrane by douncing, freeze thawing, or exposure to high temperature (Sauter et al., 2000 Cocco and Ucker, 2001 Fadok et al., 2001a).

Previous studies showed that PS is a prerequisite for the uptake of apoptotic cells by macrophages. PS exposed on the apoptotic cell membrane is recognized directly by the macrophage PS receptor (Fadok et al., 2000) or indirectly via binding of PS to a soluble intermediate (milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8), which is secreted by macrophages, followed by recognition of the complex by the αvβ3 integrin on the phagocyte's surface (Hanayama et al., 2002). Our results demonstrate that both apoptotic and necrotic target cells are recognized and phagocytosed by macrophages, whereas viable control cells are not. Uptake of apoptotic and necrotic cells occurred irrespective of the stimulus inducing cell death. Phagocytosis of necrotic cells is a feature common to different macrophage cell lines and also occurs in vivo, as demonstrated in Figure 8. Apoptotic cells are taken up very efficiently as soon as PS exposure becomes evident, at a time when their membrane is still intact. Uptake of necrotic cells takes place when cells loose the integrity of the membrane and become PS positive. Moreover, recombinant annexin V can inhibit phagocytosis of both types of dying cells, suggesting that externalization of PS is a general signal indicating to phagocytes that a dying cell should be cleared, irrespective of the way the cell has died. Indeed, PS exposure is an old “eat me signal” also used for the recognition and uptake of aged erythrocytes (Schlegel and Williamson, 2001). Although the recognition of dying L929sA cells seems to be dependent on PS for both apoptotic and necrotic cells, the efficiency of uptake is higher for the former. Moreover, when given the choice, macrophages prefer to clear early apoptotic cells, as demonstrated by the competition experiment (Figure 6), even though these target cells present a lower mean annexin V staining level. The lower efficiency of uptake of necrotic cells might be due to physical constraints. It is possible that the PS exposed on necrotic and late apoptotic cells is less accessible to the macrophages. Moreover, although apoptotic cells fragment into many small-contained particles that are easy to recognize and engulf, necrotic cells swell and remain as large single entities for a long time. Similar observations were made in Caenorhabditis elegans, where necrotic corpses linger for much longer than apoptotic ones, probably due to their larger volume, although uptake of both types of dying cells requires the same engulfment genes (Chung et al., 2000). Indeed, electron microscopy analysis presented here suggests that the mechanism used by macrophages to engulf necrotic cells is morphologically different from that used for apoptotic cells. Macrophages that engulf necrotic cells protrude into the swollen ghost-like structures of the dying cells, grasping only small volumes of the cellular debris, whereas apoptotic cells are readily engulfed as contained distinct apoptotic bodies (Krysko et al., 2003).

Phagocytosis of apoptotic cells does not induce inflammation and is often referred to as a silent event (Fadok et al., 1998 Cocco and Ucker, 2001 Fadok et al., 2001a). A possible consequence of the greater difficulty apparently encountered by macrophages in clearing necrotic cells is spillage of the cellular contents of the dying cells, leading to more histotoxicity and development of proinflammatory (Haslett, 1992 Haslett et al., 1994 Wiegand et al., 2001 Medan et al., 2002) or autoimmune responses (Rovere et al., 2000 Chan et al., 2001 Magnus et al., 2001). Indeed, apoptotic neutrophils and PS-exposing membranes were reported to elicit an antiinflammatory effect, whereas incubation of macrophages with physically lysed neutrophils, but not with lysed lymphocytes, significantly stimulated the production of macrophage-inflammatory protein 2, IL-8, TNF-á, and IL-10 (Fadok et al., 2001a). However, the latter effect was attributed to the cleavage of PS-receptor on the surface of the macrophages by elastase, a protease released upon the lysis of neutrophils. The cleavage of PS-receptor probably also impairs the phagocytic capacity of the macrophages and may cause them some stress (Vandivier et al., 2002). Our results show that phagocytosis of apoptotic or necrotic cells by Mf4/4 macrophages does not induce the expression of IFNβ, TGFβ, TNF, or IL-6, neither at the mRNA nor at the protein level. On the other hand, exposure of the same macrophages to LPS strongly increased the expression of TNF and IL-6 and moderately increased the levels of IFNβ mRNA. Moreover, phagocytosis of apoptotic or necrotic L929 cells did not affect this LPS-induced response. Several reports are in agreement with these findings. Cocco and Ucker (2001) observed that heat-killed necrotic and late apoptotic thymoma and T-cell hybridoma target cells did not induce J774A.1 and RAW 264.7 macrophages to secrete TNF or IL-6. Furthermore, no signs of inflammation accompanied the necrotic interdigital cell death occurring in Apaf-1–deficient mice and further development proceeded normally (Chautan et al., 1999). Although inflammation often accompanies necrosis, the above-mentioned observations and our results indicate that this is not due to the induction of expression of proinflammatory cytokines in the macrophages clearing the dying cells. Therefore, it is conceivable that the release of cytokines or other factors from the necrotic cells themselves may be crucial for an inflammatory response. Additionally, our results demonstrate that the clearance of primary and probably also secondary necrotic cells is clearly less efficient and more difficult and time consuming than that of apoptotic cells. This process may cause the macrophages to remain at the same site longer, thus heightening the inflammatory state. These results suggest that prevention of necrosis and secondary necrosis, and promotion of apoptosis may allow a more rapid and efficient clearance of the dying cells and decrease the damage to the surrounding tissue both in injury and in antitumor cancer treatment.