Inligting

Bestaan ​​daar 'n sagteware om teenliggaampies outomaties te ontwerp wat op 'n gegewe proteïen of antigeen gerig is?

Bestaan ​​daar 'n sagteware om teenliggaampies outomaties te ontwerp wat op 'n gegewe proteïen of antigeen gerig is?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek is op soek na sagteware om teenliggaampies outomaties te ontwerp wat op 'n gegewe proteïen of antigeen gerig is.


Baie makliker gesê as gedaan!

As ek genoeg geld en tyd gehad het om u doel te bereik, sou ek die Protein Data Bank fynkam vir al die PDB -lêers van belang. Jy het sekerlik 'n proteïen wat jou interesseer. Kan dit oorweeg om die volgende te doen:

  1. Ontdek in watter familie u proteïen behoort, gegewe die aantal en die teenwoordigheid van motiewe: spoele, heliks, beta -blaaie, ens.

  2. Doen 'n literatuuroorsig van enige proteïen wat reeds bestudeer is wat aan hierdie familie behoort. As 'n proteïen in hierdie familie 'n reaksie kataliseer, wat is die buigsame en ingehoue ​​streke daarvan?

  3. Gebruik 'n program soos Autodock om jou proteïen te koppel aan 'n proteïen waarmee sy proteïenfamilie kan interaksie hê.

  4. Bereken die interaksie -energie met behulp van Gromacs, NAMD of Gaussian. U kan 'n nul -tyd berekening van aanvanklike toestande doen of 'n molekulêre dinamika benadering volg terwyl die proteïene lukraak na hul stabielste konfigurasies beweeg, of selfs 'n molekulêre meganika benadering. Watter stelsels is die gunstigste?

  5. Jy het so ver gekom. Nou wat? Maar dan skep nie een van hierdie stappe jou kandidate nie. Dit gee u net 'n idee van die fisika wat betrokke is by reeds struktureel geïdentifiseerde verbindings. Ja, u kan puntmutasies in VMD en Pymol maak. Maar as jy 'n nuwe motief by 'n bestaande proteïenstruktuur wil voeg, sal dit nie werk nie, want meer as 20 aminosure in 'n peptied vou nie behoorlik nie.

Om van die biologiese statistieke te doen, is die navorsingsamewerking van strukturele bioinformatika hier: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

U kan hul vouers met wget ontleed of krul in bash scripting op http://files.rcsb.org/

Maar as jy aanvaar dat jy 'n kandidaat-proteïen uitvind wat nog nie bestaan ​​nie. Hoe gaan jy dit in die laboratorium kry? Dit blyk dat dit beter sal wees om mikrobiese studies te doen. Miskien kan jy skerm vir 'n wedstryd met mikro-skikking plate.


Struktuur en ontwikkeling van enkel domein teenliggaampies as modules vir terapie en diagnostiek

Sedert hulle meer as 25 jaar gelede ontdek is, speel die enkele veranderlike domein van teenliggaampies wat slegs in swaar ketting 'n rol speel in 'n toenemende aantal teenliggaampies. Strukturele en biofisiese studies het aan die lig gebring dat die klein enkele veranderlike domein wat in kameeldiere voorkom, veelsydigheid toon in die herkenning van teikens. Sulke insig het gedien as die grondslag om VHH-domeine te ontwikkel en te ontwerp met verbeterde eienskappe wat in staat is om 'n reeks terapeuties relevante proteïenantigene of lae-molekulêre gewig haptene te teiken. Verder laat die modulêre aard van VHH-domeine dit toe om in konstrukte ingebring te word wat eenvoudig nie moontlik is met konvensionele teenliggaampies nie. Hier hersien ons die strukturele en biofisiese eienskappe van VHH-domeine, beklemtoon ons onlangse terapie en diagnostiek op VHH, en gee ons insig in VHH-ingenieurswese wat die weg kan baan na die volgende generasie enkel-domein teenliggaampassies.

Impakverklaring

Die ontwikkeling van nuwe teenliggaampies, buiten konvensionele teenliggaampies, open nuwe moontlikhede in mediese terapieë, diagnostiek en algemene lewenswetenskaptoepassings wat affiniteitsreagense vereis. Die kameelagtige VHH-domein, wat slegs bestaan ​​uit teenliggaampies met 'n swaar ketting, het na vore getree as 'n praktiese module vir nuwe affiniteitsreagente. Toepassings sluit in doelgerigte kankerterapieë, nuwe antimikrobiese middels, konformasie-spesifieke reagense en op maat gemaakte molekulêre skakelaars. Die wydte van unieke gebruike vir die VHH sal aanhou groei, wat nuwe geleenthede bied om siektes te behandel en te verstaan.


1. Inleiding

SARS-CoV-2 gebruik sy trimeriese piekproteïen vir binding aan gasheer-angiotensien-omskakelende ensiem 2 (ACE2) en vir samesmelting met selmembraan om seltoegang te verkry [1,2,3,4]. Dit is 'n meerstap-proses wat drie afsonderlike S-proteïensplitsingsgebeurtenisse behels om die SARS-2-S voor te berei vir interaksie met ACE2 [2,3], en daaropvolgende membraansmelting en selingang. Hierdie prosesse behels verskillende domeine van die S-proteïen wat interaksie het met gasheersel en ander intrasellulêre en ekstrasellulêre komponente. Doeltreffendheid in elke stap kan bydra tot virulensie en aansteeklikheid. Die ontwrigting van enige van hierdie stappe kan tot mediese genesing lei.

Die domeinstruktuur is baie soortgelyk tussen SARS-S (UniProtKB: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"P59594","term_id":"30173397","term_text":" P59594 ">> P59594) en SARS-2-S (UniprotKB: <" type ":" entrez-proteïen "," attrs ": <" text ":" P0DTC2 "," term_id ":" 1835922048 "," term_text " : "P0DTC2" >> P0DTC2). Beide word gesplits om S1- en S2 -subeenhede op spesifieke splitsingsplekke te genereer (Figuur 1 A). S1 dien die funksie van reseptorbinding en bevat 'n seinpeptied (SP) by die N-terminus, 'n N-terminale domein (NTD) en reseptorbindende domein (RBD). S2 (Figuur 1 A) funksioneer in membraanfusie om seltoetrede te vergemaklik, en dit bevat 'n samesmeltingpeptied (FP) domein, interne fusiepeptied (IFP), twee heptad-herhaal domeine (HR1 en HR2), transmembraan domein, en 'n C -terminale domein [2,3,5,6,7,8]. Daar is egter ook beduidende verskille tussen SARS-S en SARS-2-S. Die kontak-aminosuurplekke tussen SARS-S en menslike ACE2 (hACE2) [5,7,9,10] verskil byvoorbeeld van die tussen SARS-2-S en hACE2 [11,12,13,14]. Dit kan verklaar waarom sommige teenliggaampies wat effektief is teen SARS-S nie effektief teen SARS-2-S [4] is nie, veral dié wat ontwikkel is om die ACE2-bindingsplek van SARS-S te teiken [15]. In hierdie artikel word talle eksperimente oor SARS-S oorweeg om vergelykings te vergemaklik en die verskille tussen die twee uit te lig.

Domeinstruktuur van SARS-S en SARS-2-S. (A) Belangrike domeine in SARS-S en SARS-2-S. SP, seinpeptied NTD, N-terminale domein RBD, reseptor-bindende domein FP, fusie peptied IFP, interne fusie peptied HR, heptad herhalings TM, transmembraan domein CT, sitoplasmiese stert. Die boonste en onderste getalle in elke domein het onderskeidelik betrekking op SARS-S en SARS-2-S. Die rooi pyle dui splitsingsplekke aan, en hul getalle het betrekking op SARS-2-S (B) Belyning van SP tussen SARS-S (bo) en SARS-2-S (onder) (C,D) Belyning van twee inter-domein segmente (E) HR1 in SARS-S en SARS-2-S, tesame met die boaansig van 'n heliks wat hidrofobiese posisies a en d aan dieselfde kant toon (F) Plot van hidrofobisiteit gegenereer uit DAMBE [16].


Resultate

Drie stelsels is gekies om die doeltreffendheid van OptCDR te toets: 'n peptied uit die kapsied van hepatitis C (PDB: 1N64) (Menez et al., 2003), fluoressensie (PDB: 1FLR) ( Whitlow et al., 1995) en VEGF (PDB: 1CZ8) (Chen et al., 1999). Verskeie berekeningsmetrieke word gebruik om vergelykings te tref, insluitend interaksie-energie wat gedefinieer word as die geminimaliseerde energie van die antigeen-CDRs-kompleks minus die energie van die CDRs en die energie van die antigeen individueel. Dit word benader binne CHARMM (MacKerell et al., 1998) met behulp van die Van der Waals, elektrostatika, bindings, hoeke, dihedrale hoeke, onbehoorlike dihedrale hoeke en veralgemeende Gebore met molekulêre volume-integrasie implisiete solvasie-energie funksies. Kontakte word gedefinieer as die aantal CDR -atome binne 3 Å van die antigeen en polêre kontakte word bepaal met behulp van PyMOL (DeLano, 2008). Alle berekeninge is uitgevoer op 3,0 GHz Intel Xeon -verwerkers met 4 GB RAM. Elke volledige antilichaambiblioteekontwerp is op sy eie verwerker gegenereer en almal is binne 12 dae bereken, met 'n gemiddelde van ongeveer 9 dae.

Hepatitis C kapsid peptied

Hepatitis C is 'n virus wat ongeveer 3,2 miljoen mense in die VSA besmet (http://www.cdc.gov/hepatitis/C/cFAQ.htm#statistics). Die CDR's van teenliggaam 19D9D6 (PDB: 1N64) (Menez et al., 2003) wat 'n peptied (residue 13–40) van die kapsied van die hepatitis C -virus bind met 'n Kd van 1.3 ± 0.1 nM word in Fig. 3A getoon. Hierdie stelsel is gekies as 'n algemene toets van OptCDR om belowende ontwerpalternatiewe te genereer. Ons ondersoek eers die omvang van verbeterings wat bereik kan word in die berekeningstoeganklike statistieke van bindingskwaliteit deur slegs die oorspronklike teenliggaamstruktuur te muteer sonder om die CDR -kanoniese strukture te verander. Die resultate wat met behulp van IPRO verkry is, toon verbeterings in al drie bindingsmetodes (Tabel II). Interessant genoeg is die geïdentifiseerde mutasies beperk tot die CDR's met die minste antigeenkontakte. Hierdie neiging om mutasies in die omtrek van die teenliggaam -bindingsak te voorspel, stem ooreen met 'n vorige berekeningstudie wat eksperimenteel gevalideer is (Lippow et al., 2007). In hierdie geval, aangesien 19D9D6 reeds 'n hoë-affiniteit teenliggaam is, dui die resultate daarop dat die dominante interaksies in die middel van die bindingsak reeds effektief is en binding kan slegs verder verbeter word deur die herverpakking van die rande van die teenliggaam-antigeen-koppelvlak.

Rekenkundige en eksperimentele bindingsdata vir die teenliggaampies

Teenliggaam. Antigeen . Interaksie-energie (kcal/mol) . Kontakte. Polêre kontakte. Eksperimenteel Kd .
19D9D6 Hepatitis C kapsied peptied −62.6 74 8 1,3 nM
IPRO affiniteit rypwording van 19D9D6 Hepatitis C kapsied peptied −78.1 tot −80.1 81–87 14–15 NA
OptCDR-ontwerpe Hepatitis C kapsied peptied −88.2 tot −104.8 88–115 18–23 NA
OptCDR-ontwerp met antigeen-herrangskikking Hepatitis C kapsid peptied −123,6 tot −175,8 88–112 23–31 NA
4-4-20 Fluoresceïen −49.5 22 4 0,7 nM
Boder et al. beste ontwerp Fluoresien −78.7 23 4 48 fM
Fukuda et al. konsensus ontwerp Fluoresceïen −67.8 22 5 N1 nM (wt 32 nM)
Fukuda et al. beste ontwerp Fluoresceïen −70.4 24 3 0,88 nM (met 32 ​​nM)
Jermutus et al. konsensus ontwerp Fluoresceïen −74.9 24 3 ~37 nm
IPRO affiniteit rypwording van 4-4-20 Fluoresceïen −77.8 17 1 NA
OptCDR ontwerpe Fluoresceïen −55,2 tot −57,3 71–79 8–9 NA
PDB 1CZ8 VEGF-epitoop 1 −110.8 86 21 0,11 nM
IPRO affiniteitsveroudering van 1CZ8 VEGF-epitoop 1 −111.0 tot −116.0 89–99 21–22 NA
OptCDR ontwerp VEGF-epitoop 1 −82.0 tot −109.0 73–110 11–25 NA
OptCDR ontwerp VEGF-epitoop 2 −88,6 tot −98,4 57–85 15 tot 20 NA
OptCDR nanoliggame VEGF-epitoop 1 −82,2 tot −92,6 79–86 20–22 NA
Teenliggaam. Antigeen. Interaksie -energie (kcal/mol). Kontakte. Polêre kontakte. Eksperimenteel Kd .
19D9D6 Hepatitis C kapsid peptied −62.6 74 8 1,3 nM
IPRO affiniteit rypwording van 19D9D6 Hepatitis C kapsied peptied −78.1 tot −80.1 81–87 14–15 NA
OptCDR ontwerpe Hepatitis C kapsid peptied −88.2 tot −104.8 88–115 18–23 NA
OptCDR-ontwerp met antigeen-herrangskikking Hepatitis C kapsid peptied −123,6 tot −175,8 88–112 23–31 NA
4-4-20 Fluoresceïen −49.5 22 4 0,7 nM
Boder et al. beste ontwerp Fluoresien −78.7 23 4 48 fm
Fukuda et al. konsensus ontwerp Fluoresien −67.8 22 5 N1 nM (wt 32 nM)
Fukuda et al. beste ontwerp Fluoresien −70.4 24 3 0,88 nM (met 32 ​​nM)
Jermutus et al. konsensus ontwerp Fluoresien −74.9 24 3 ~37 nm
IPRO affiniteitsveroudering van 4-4-20 Fluoresceïen −77.8 17 1 NA
OptCDR-ontwerpe Fluoresceïen −55.2 tot −57.3 71–79 8–9 NA
PDB 1CZ8 VEGF-epitoop 1 −110.8 86 21 0,11 nM
IPRO affiniteit rypwording van 1CZ8 VEGF-epitoop 1 −111.0 tot −116.0 89–99 21–22 NA
OptCDR ontwerp VEGF-epitoop 1 −82.0 tot −109.0 73–110 11–25 NA
OptCDR ontwerp VEGF-epitoop 2 −88.6 tot −98.4 57–85 15 tot 20 NA
OptCDR nanobodies VEGF-epitoop 1 −82,2 tot −92,6 79–86 20–22 NA

Die verskillende berekeningsbindingsmaatstawwe word in die teks gedefinieer aan die begin van die Resultate-afdeling en alle eksperimentele Kd waardes is uit die toepaslike publikasies geneem. VEGF-epitoop 1 is die epitoop wat deur bevacizumab gebind word terwyl epitope 2 aan die teenoorgestelde kant van VEGF is. Die nanobody -ontwerpe het slegs drie CDR's, alle ander teenliggaampies het ses.

Berekenings- en eksperimentele bindingsdata vir die teenliggaampies

Teenliggaam. Antigeen. Interaksie -energie (kcal/mol). Kontakte. Polêre kontakte. Eksperimenteel Kd .
19D9D6 Hepatitis C kapsied peptied −62.6 74 8 1.3 nM
IPRO affiniteitsveroudering van 19D9D6 Hepatitis C kapsid peptied −78.1 tot −80.1 81–87 14–15 NA
OptCDR ontwerpe Hepatitis C kapsid peptied −88,2 tot −104,8 88–115 18–23 NA
OptCDR ontwerp met antigeen herrangskikking Hepatitis C kapsied peptied −123,6 tot −175,8 88–112 23–31 NA
4-4-20 Fluoresien −49.5 22 4 0,7 nM
Boder et al. beste ontwerp Fluoresceïen −78.7 23 4 48 fm
Fukuda et al. konsensus ontwerp Fluoresien −67.8 22 5 ~1 nM (gew. 32 nM)
Fukuda et al. beste ontwerp Fluoresceïen −70.4 24 3 0,88 nM (met 32 ​​nM)
Jermutus et al. konsensus ontwerp Fluoresceïen −74.9 24 3 ~37 nm
IPRO affiniteitsveroudering van 4-4-20 Fluoresien −77.8 17 1 NA
OptCDR-ontwerpe Fluoresceïen −55,2 tot −57,3 71–79 8–9 NA
PDB 1CZ8 VEGF-epitoop 1 −110.8 86 21 0,11 nM
IPRO affiniteit rypwording van 1CZ8 VEGF-epitoop 1 −111.0 tot −116.0 89–99 21–22 NA
OptCDR ontwerp VEGF-epitoop 1 −82,0 tot −109,0 73–110 11–25 NA
OptCDR ontwerp VEGF-epitoop 2 −88,6 tot −98,4 57–85 15 tot 20 NA
OptCDR nanobodies VEGF-epitoop 1 −82.2 tot −92.6 79–86 20–22 NA
Teenliggaam. Antigeen. Interaksie -energie (kcal/mol). Kontakte. Polêre kontakte. Eksperimenteel Kd .
19D9D6 Hepatitis C kapsid peptied −62.6 74 8 1,3 nM
IPRO affiniteitsveroudering van 19D9D6 Hepatitis C kapsied peptied −78.1 tot −80.1 81–87 14–15 NA
OptCDR-ontwerpe Hepatitis C kapsid peptied −88,2 tot −104,8 88–115 18–23 NA
OptCDR-ontwerp met antigeen-herrangskikking Hepatitis C kapsid peptied −123,6 tot −175,8 88–112 23–31 NA
4-4-20 Fluoresceïen −49.5 22 4 0,7 nM
Boder et al. beste ontwerp Fluoresien −78.7 23 4 48 fm
Fukuda et al. konsensus ontwerp Fluoresceïen −67.8 22 5 ~1 nM (gew. 32 nM)
Fukuda et al. beste ontwerp Fluoresceïen −70.4 24 3 0,88 nM (met 32 ​​nM)
Jermutus et al. konsensus ontwerp Fluoresien −74.9 24 3 ~37 nm
IPRO affiniteit rypwording van 4-4-20 Fluoresceïen −77.8 17 1 NA
OptCDR ontwerpe Fluoresceïen −55,2 tot −57,3 71–79 8–9 NA
PDB 1CZ8 VEGF-epitoop 1 −110.8 86 21 0,11 nM
IPRO affiniteit rypwording van 1CZ8 VEGF-epitoop 1 −111.0 tot −116.0 89–99 21–22 NA
OptCDR ontwerp VEGF-epitoop 1 −82,0 tot −109,0 73–110 11–25 NA
OptCDR ontwerp VEGF-epitoop 2 −88,6 tot −98,4 57–85 15 tot 20 NA
OptCDR nanobodies VEGF-epitoop 1 −82,2 tot −92,6 79–86 20–22 NA

Die verskillende berekeningsbindingsmaatstawwe word in die teks gedefinieer aan die begin van die Resultate-afdeling en alle eksperimentele Kd waardes is uit die toepaslike publikasies geneem. VEGF-epitoop 1 is die epitoop wat deur bevacizumab gebind word terwyl epitope 2 aan die teenoorgestelde kant van VEGF is. Die nanobody-ontwerpe het slegs drie CDR's, alle ander teenliggaampies het ses.

CDR-hepatitis C kapsied peptied komplekse. Die kapsiedpeptiede word as rooi sfere getoon, die CDR's word as oranje linte getoon, en CDR-reste binne 4 Å van die peptied word eksplisiet getoon. Alle beelde is vanuit dieselfde perspektief. (A) Die natuurlike teenliggaam -peptiedkompleks (PDB: 1N64). (B) 'n OptCDR-ontwerp met geen peptied-konformasieverandering nie. (C) 'N OptCDR -ontwerp met peptiedkonformasieverandering.

CDR -hepatitis C kapsidpeptiedkomplekse. Die kapsiedpeptiede word as rooi sfere getoon, die CDR's word as oranje linte getoon, en CDR-reste binne 4 Å van die peptied word eksplisiet getoon. Alle beelde is vanuit dieselfde perspektief. (A) Die natuurlike teenliggaam-peptiedkompleks (PDB: 1N64). (B) 'N OptCDR -ontwerp sonder verandering in peptiedkonformasie. (C) 'N OptCDR -ontwerp met peptiedkonformasieverandering.

Ons het vervolgens OptCDR gebruik om drie stelle teenliggaampies CDR's te ontwerp om die peptied te bind in plaas daarvan om net daarop staat te maak om puntmutasies by 19D9D6 by te voeg. Ons het eers 'n konserwatiewe houding aangeneem deur harmoniese beperkings op te lê wat verseker het dat die antigeenvorming nie aansienlik verander het tydens binding nie. Die drie gegenereerde ontwerpe vertoon baie uiteenlopende antigeen-liggings/oriëntasies, seleksies van kanonieke strukture en aminosuurvolgorde, maar almal deel die groef wat tipies waargeneem word vir peptiedbindende teenliggaampies. Aansienlike verbeterings in alle berekeningbindingmetrieke word waargeneem (tabel II) in die geval van die gebruik van slegs mutasies. Tabel III beeld die voorspelde laagste-energie-aminosuurvolgorde uit vir die CDR's van die struktuur wat in Fig. 3B getoon word. Deur die voorspelde mutasies te kombineer, kan 'n biblioteek met CDR's gegenereer word (maksimum biblioteekgrootte = 1.1 × 10 14). Deur mutasies te prioritiseer op grond van hul bindingtellings, kan biblioteke van enige kleiner grootte van die oorspronklike verwyder word.

'N Biblioteek van CDR's met teenliggaampies van hepatitis C -kapsied

Die CDR-volgordes en voorspelde mutasies daaraan om 'n biblioteek van tot 1.1 × 10 14 teenliggaampies te vorm wat almal die peptied van die kapsied van hepatitis C kan bind.

'N Biblioteek van CDR's met teenliggaampies van hepatitis C -kapsied

Die CDR -rye en mutasies wat hulle voorspel het, vorm 'n biblioteek van tot 1,1 × 10 14 teenliggaampies wat almal die peptied kan bind van die kapsied van hepatitis C.

Uiteindelik het ons die harmoniese beperkings op die antigeen verwyder, waardeur die konformasie daarvan radikaal kan verander in reaksie op die interaksie -energie -minimaliseringsstap, en OptCDR gebruik om drie ekstra stelle teenliggaampies te genereer om die peptied te bind.Soos gesien in Tabel II, het die toelaat van konformasieveranderinge aan die peptied in reaksie op energie-minimalisering gelei tot bykomende verbeterings in interaksie-energie en polêre kontakte, hoewel geen effek op die aantal kontakte nie. Daar moet kennis geneem word dat die konformasieveranderinge nie gedwing of vooraf gespesifiseer is nie, maar tot stand gekom het as 'n reaksie op interaksies met die CDR's tydens die IPRO-stap (d.i. stap 3) van OptCDR. In hierdie geval was die konformasieveranderinge almal tussen 4.2 en 5.2 Å RMSD vanaf die aanvanklike peptiedkonformasie. Hierdie resultate demonstreer hoe antigeen -konformasionele veranderinge by teenliggaambinding 'n belangrike bydraer kan wees om interaksie teenliggaam -antigeen in te lig. OptCDR maak voorsiening vir 'n deur die gebruiker gespesifiseerde teenwoordigheid, afwesigheid en modulasie van die sterkte van enige opgelegde harmoniese beperkings.

Fluoresceïen

Ons het vervolgens ons aandag gevestig op die hapteenfluoresceïen vir 'n vergelyking met eksperimentele resultate. Anti-fluoresceïne teenliggaampies is gebruik as die toetsstelsel deur verskeie eksperimenteel gerigte evolusiepogings (Boder et al., 2000 Jermutus et al., 2001 Fukuda et al., 2006) met verskillende vertoontegnologieë om die binding van 'n scFv wat afkomstig is van die anti-fluoreseïen-teenliggaam 4-4-20 te verbeter. Dit is 'n besonder interessante stelsel omdat 4-4-20 se affiniteit vir fluoressensie naby die affiniteitsplafon van die tersiêre immuunrespons (0.7 ± 0.3 nM) is ( Boder et al., 2000). Boder et al. (2000) gebruik gisoppervlakvertoning om 'n scFv te identifiseer met 14 mutasies wat 'n 6500-voudige verbetering in Kd, terwyl Fukuda et al. (2006) en Jermutus et al. (2001) het onderskeidelik mRNA en ribosoomvertoning gebruik om mutante te identifiseer met 'n 30-voudige verbetering in Kd.

Eerstens het ons IPRO gebruik om hierdie eksperimenteel geïdentifiseerde mutante te evalueer: die beste mutante wat deur Boder geïdentifiseer is et al. (2000) en Fukuda et al. (2006) en die konsensusmutante wat deur Fukuda geïdentifiseer is et al. (2006) en Jermutus et al. (2001). Aangesien sommige van die mutasies in raamwerkstreke was, is die hele veranderlike domeine gebruik om die mutante te skep, nie net die CDR's nie. SwissParam (http://swissparam.ch/) is gebruik om die topologie- en parameterlêers te skep wat nodig is in CHARMM vir fluoresceïne. Sodra die mutante teenliggaampies gemodelleer is, het ons hul CDR's onttrek, sodat die berekende interaksie-energieë direk vergelyk kan word met OptCDR-resultate. Tabel II toon die berekenings- en eksperimentele verbeterings oor die wilde-tipe scFv van die vier mutante. Let daarop dat die rangorde van die mutante in terme van verbetering oor wildtipe gebruik Kd en interaksie -energie, soos gekwantifiseer in OptCDR, pas by. Verder die H3 CDR in die Jermutus et al. (2001) toon die mutant die hoogste RMSD van die wildtipe struktuur, wat ooreenstem met die eksperimentele waarneming van verhoogde buigsaamheid van hierdie CDR as gevolg van die verwydering van 'n soutbrug.

Vervolgens is IPRO gebruik om die CDR's van teenliggaam 4-4-20 vir rekenaarmatige affiniteit te verouder, wat lei tot talle mutasies (40 totaal) in alle CDR's behalwe H2. Die berekeningsbindingsresultate word in tabel II uiteengesit. Alhoewel die verbetering in interaksie-energie oor die wilde-tipe teenliggaam nie heeltemal so groot is soos dié van die beste eksperimentele mutant nie, oortref dit wel die berekende energie vir alle ander mutante. Ons het ook OptCDR gebruik om twee stelle CDR's te ontwerp om fluoressensie te bind. Hul berekeninge van bindingsmetodes word gegee in Tabel II, strukture in Figuur 4 en aminosuurvolgorde in Tabel IV. Interessant genoeg bereik die interaksie-energie van die OptCDR-ontwerpe nie dieselfde vlakke as die van die weergawes van 4-4-20 met berekendheid en eksperimenteel affiniteit nie, maar oortref dit wel die wilde tipe teenliggaam. Beide ontwerpe deel 'n aantal kenmerke wat gunstig lyk vir binding. In die eerste plek is fluoresceïen in beide gevalle geleë in 'n diep holte tussen die L3- en H2 CDR's aan die een kant en die H3 CDR aan die ander kant. Beide ontwerpe het lang H3 CDR's wat meestal bo -oor die fluoresceïenmolekules gevou is om dit vas te hou, en dit is hierdie posisie van die H3 CDR's wat lei tot die noemenswaardige toename in kontakte tussen die eksperimentele en OptCDR -ontwerpe (tabel II). Vir beide ontwerpe het die rande van die holte poolreste met elke fluoresceïensuurstof wat by ten minste een polêre kontak betrokke is. Laastens bestaan ​​die kante van albei holtes uit alifatiese en aromatiese reste wat die kern hidrofobiese gedeelte van fluoresceïen stabiliseer. Ons veronderstel dat die H3 CDR's van die ongebonde ontwerpe voldoende buigsaam is om fluoresceïen toegang tot die bindvak te gee.

Twee biblioteke van fluoressensiebindende teenliggaampies CDR's

Die aminosuurvolgorde van die twee OptCDR het fluoresceïen-bindende teenliggaampies ontwerp en die voorspelde mutasies na die CDR's om biblioteke van teenliggaampies te vorm.

Twee biblioteke met fluoresceïen-bindende teenliggaampies CDR's

Die aminosuurvolgorde van die twee OptCDR het fluoresceïen-bindende teenliggaampies ontwerp en die voorspelde mutasies na die CDR's om biblioteke van teenliggaampies te vorm.

CDR -fluoresceïen komplekse. Fluoresceïen word getoon as siaansfere met suurstof en waterstof onderskeidelik in rooi en wit. Die CDR's word as oranje linte getoon en alle CDR -reste binne 4Å van fluoresceïne word eksplisiet getoon. Al die komplekse word vanuit dieselfde perspektief getoon relatief tot die teenliggaambindingsak. (A) Die struktuur van teenliggaam 4-4-20. (B en C) Die twee OptCDR fluoresceïne-bindende ontwerpe.

CDR -fluoresceïen komplekse. Fluoresceïen word getoon as siaan bolle met oksigene en waterstof, onderskeidelik in rooi en wit. Die CDR's word as oranje linte getoon en alle CDR-reste binne 4Å van fluoresceïen word eksplisiet getoon. Al die komplekse word vanuit dieselfde perspektief getoon relatief tot die teenliggaambindingsak. (A) Die struktuur van teenliggaam 4-4-20. (B en C) Die twee OptCDR fluoresceïne-bindende ontwerpe.

Vaskulêre endoteel groeifaktor

Uiteindelik word OptCDR-ontwerpe vir die binding van VEGF gekontrasteer teen 'n affiniteitsverouderde antesedent van die teenliggaammedisyne bevacizumab (Chen et al., 2001) om OptCDR se epitope -doelvermoëns te ondersoek. VEGF is getoon (Willett et al., 2004) ter bevordering van die verspreiding en groei van gewasse. 'n Aantal anti-VEGF-teenliggaampies gebaseerde middels, insluitend bevacizumab (Chen et al., 2001), met lae nanomolêre affiniteit is beskikbaar. Die opgeloste struktuur (PDB: 1CZ8) van 'n affiniteitsverouderde bevacizumab-antesedent toon VEGF in 'n sak wat hoofsaaklik gevorm word deur die swaarketting-CDR's (Chen et al., 1999). In alle OptCDR resultate is 'n harmoniese beperking gebruik om te verhoed dat die struktuur van VEGF aansienlik verander tydens berekeninge.

Op IPRO gebaseerde verouderingsveroudering van 1CZ8 het slegs minimale verbeterings in die interaksie-energie gelei, sowel as die aantal kontakte en polêre kontakte, wat 'n bewys is van die deeglikheid van die eksperimentele affiniteitsveroudering wat 1CZ8 reeds ondergaan het. Toe ons OptCDR gebruik om nuwe CDR's te voorspel om dieselfde epitoop van VEGF te bind wat deur 1CZ8 geteiken word, het die beste ontwerp, getoon in Fig. 5B, bindingsmetodes wat vergelykbaar is met die bestaande teenliggaam (effens groter interaksie -energie en nog 'n paar kontakte en polêre kontakte). Dus, die reeks bindingsmetrieke vir OptCDR (Tabel II) bereik slegs die vlakke van 1CZ8, alhoewel die voorspelde strukture almal opvallend verskillend is en waarvan die meeste die planêre bindingsak vertoon wat verwag word vir proteïenbindende teenliggaampies.

CDR–VEGF komplekse. VEGF word as groen bolle getoon, die CDR's word as oranje linte getoon, en CDR -reste wat binne 4 Å van VEGF is, word eksplisiet getoon. Alle beelde is vanuit dieselfde perspektief relatief tot die teenliggaambindende sak. (A) Die struktuur van PDB 1CZ8. (B) Die beste OptCDR -ontwerp wat gegenereer is om dieselfde gedeelte van VEGF te bind as bevacizumab deur al ses CDR's te gebruik terwyl (C) is die beste ontwerp om 'n epitoop aan die teenoorgestelde kant van VEGF te bind. (D) Die beste nanobody OptCDR-ontwerp.

CDR–VEGF komplekse. VEGF word as groen sfere getoon, die CDR's word as oranje linte getoon, en CDR-reste wat binne 4 Å van VEGF is, word eksplisiet getoon. Alle beelde is vanuit dieselfde perspektief relatief tot die teenliggaambindende sak. (A) Die struktuur van PDB 1CZ8. (B) Die beste OptCDR-ontwerp wat gegenereer is om dieselfde gedeelte van VEGF as bevacizumab te bind deur al ses CDR's te gebruik terwyl (C) is die beste ontwerp om 'n epitoop aan die teenoorgestelde kant van VEGF te bind. (D) Die beste nanobody OptCDR-ontwerp.

Vervolgens het ons 'n ander stel OptCDR-ontwerpe ondersoek deur 'n epitoop aan die teenoorgestelde kant van VEGF te rig vanaf die gedeelte wat deur 1CZ8 en ons ander ontwerpe gebind is. Sover ons weet word hierdie gedeelte van VEGF nie herken deur sellulêre VEGF -reseptore of enige ontwerpte teenliggaampies nie. Een van die voorspelde ontwerpe word in Fig. 5C getoon en die berekeningsbindingsmetrieke word in Tabel II gegee. Selfs al is die verkrygde ontwerpe baie verskillend aangesien hulle 'n heeltemal ander epitoop van VEGF teiken, is die berekeningsbindingsmaatstawwe wat behaal is, redelik soortgelyk in waarde. Die resultate wat verkry is, demonstreer die doeltreffendheid van OptCDR om ontwerpe te genereer wat VEGF bind met ekwivalente rekenaarbindingseienskappe as die wildtipe teenliggaampie met nuwe CDR's of wat 'n ander epitoop van die VEGF-molekule teiken, wat verwys na die ingeboude oortolligheid van molekulêre herkenning.

Ons het besluit om VEGF-bindende ontwerpe verder te ondersoek deur op slegs drie uit die ses CDR's te fokus, soos in nanoliggame. Nanobodies is enkel-domein proteïene wat afkomstig is van die veranderlike domein van swaar kettings uit 'n spesiale subset teenliggaampies in kameliede wat nie ligte kettings het nie en dus slegs drie CDR's in plaas van ses het. OptCDR is gebruik om nanobody CDR-ontwerpe te genereer deur slegs die H1, H2 en H3 CDR's te oorweeg. Ondanks die vermindering van die aantal strukturele vryheidsgrade, het OptCDR ontwerpe geïdentifiseer wat uitsluitlik gebaseer was op die swaarketting -CDR's (Tabel II) wat soortgelyke berekeningbindings het as die ses CDR -ontwerpe. Hierdie verrassende bevinding stem ooreen met die eksperimentele waarneming dat nanobodies bindingsaffiniteite kan hê wat gelykstaande is aan teenliggaampies ondanks hul kleiner grootte. Ons is van mening dat OptCDR dit bereik het deur die keuse van langer as tipiese kanonieke strukture, veral vir die H3 CDR, soos tipies in eksperimentele nanobodies. Boonop laat die afwesigheid van die ligte ketting die antigeen toe om posisies en oriëntasies in te neem wat normaalweg weens steriese botsings verbied is. 'N Verteenwoordigende ontwerp in figuur 5D illustreer hoe die keuse van langer strukture vir die H3 -domein die verlies van die ligketting teenwerk.


Bespreking

Die suksesvolle identifikasie van twee DP-mutante, H-K30Q/H-E54H en L-N34D/L-H91S met affiniteit verbeterde bo of vergelykbaar met dié van die WT D3h44 demonstreer die sukses van die dubbelpuntmutasiestrategie. Die belangrikste proses vir die seleksie van die vier DP -mutante uit die 3D -modelle van 59 stelle residupare was 'n visuele ondersoek van die verandering in interaksies tussen die WT en die DP -mutant. Die suksesvolle verkryging van twee DP-mutante het ook aangedui dat die ontleding van die interaksies tussen die gemuteerde residue, teenliggaampies na aan die gemuteerde residue, die antigeen en omliggende watermolekules insiggewend en nuttig is vir die ontwerp van nuwe samewerkende DP-mutante. Hierdie werk dui ook aan dat dit moontlik kan wees om die bindingsaffiniteit van ontwerpte teenliggaampies te voorspel gebaseer op inligting oor hul interaksies.

Die H-K30Q/H-E54H DP-mutant vertoon 'n 1,5-voudige toename in affiniteit (29 pM) bo die van die WT D3h44 (45 pM). Daar is twee moontlike redes vir die verbetering in affiniteit van die DP -mutant. Een daarvan is die versterking van die interaksie tussen die antigeen en die teenliggaam deur die bykomende waterstofbinding tussen H-H54 en S202 van die antigeen (Fig. 6b). Die ander is die vervanging van swakker elektrostatiese en CH-O-interaksies tussen H-K30 en H-E54 van die WT (Fig. 6a) deur die sterk waterstofbinding tussen H-Q30 en H-H54 van die DP-mutant (Fig. 6b) ). Die interaksie tussen H-K30 en H-E54 is nie 'n sterk ioniese interaksie nie, maar 'n minder sterk elektrostatiese interaksie, gebaseer op hul afstand en hoek. Hierdie voorkeur-interaksies tussen die antigeen en die DP-mutant, en tussen die gemuteerde residue, is 'n goeie voorbeeld van die samewerkende mutasie wat deur die dubbelpunt-mutasiestrategie gekombineer word met interaksie-analise.

(a) Interaksies van H-K30 en H-E54 van die wilde tipe (WT). (b) Interaksies van H-K30Q en H-E54H. (c) Interaksies van L-N34 en L-H91 van die WT. (d) Interaksies van L-N34D en L-H91S. Die antigeen en die swaar ketting van die teenliggaam is onderskeidelik in magenta en groen gekleur. 'N Watermolekule word uitgebeeld as 'n rooi bol.

Die ander suksesvolle DP-mutant was L-N34D/L-H91S, met 'n 1,8-voudige toename in affiniteit (25 pM) bo die van die WT (45 pM). Hierdie geval is insiggewend, omdat die DP -mutasie insluitend residu 34, wat nie met die antigeen in aanraking kom nie, die bindingsaffiniteit verbeter het. Die toename in affiniteit het moontlik plaasgevind omdat die mutasie addisionele swak interaksies, soos CH – O, verskaf het terwyl die interaksies rondom L-34 en L-91 behou en/of vervang is. Twee nuwe CH-O-interaksies is gevorm: tussen L-D34 en L-S91 en tussen L-S91 en L-Y32 (Fig. 6d). Alhoewel 'n CH -O -interaksie 'n swak interaksie is, het twee addisionele CH -O -interaksies bygedra tot die stabilisering van die hele teenliggaam/antigeen kompleks en die affiniteit van die DP -mutant verhoog (Fig. 6d). Met betrekking tot die interaksies tussen die antigeen en die gemuteerde residue, is die interaksienetwerke van die WT/antigeen kompleks (K169 van antigeen, L-H91 en L-N34) suksesvol vervang deur die interaksienetwerke (K169 van antigeen, L-S91 en L-D34) van die DP-mutant/antigeen (Fig. 6c,d). In die algemeen blyk dit dat 'n 1.8-voudige toename in die affiniteit van die L-N34D/L-H91S DP mutant bereik is. Dit is nog 'n voorbeeld van die koöperatiewe mutasies wat die 'DP -mutasie' -strategie met die interaksie -analise veroorsaak.

Een van die unieke kenmerke van die interaksie-analise is die insluiting van swak interaksies soos CH–O en CH–π. Hierdie interaksies word erken as belangrik vir die struktuurgebaseerde geneesmiddelontwerp van klein molekules 19,20, soos beskryf in "Inleiding". Oor die algemeen vereis hierdie swak interaksies klein desolvasie-energie. Inteendeel, hoë verlossingsenergie is nodig om 'n sterk waterstofbinding -interaksie te vorm. Die balans tussen wins (vorming van interaksie) en verlies (verwoesting) van hierdie swak interaksies het aandag getrek. In die geval van hierdie studie is sulke swak interaksies gereeld waargeneem. Byvoorbeeld, 14 en 16 CH – O interaksies tussen gemuteerde residue en hul omliggende residue is onderskeidelik gevind in die WT- en L-N34D/L-H91S DP-mutant. Hierdie getalle dui aan dat die effek van hierdie swak interaksies nie weglaatbaar is nie, al is die individuele interaksie swak.

Alhoewel twee DP-mutante met affiniteit verbeterde oor of vergelykbaar met die WT suksesvol verkry is, is die huidige prosedure vir die seleksie van DP-mutante nie perfek nie, want nie al die vier DP-mutante het goeie affiniteit getoon nie. Vir die H-A101S/H-A102H DP mutant het die affiniteit afgeneem tot 150 pM, 'n 3.3-voudige vermindering in vergelyking met die WT. Hierdie vermindering was waarskynlik as gevolg van die grootte van die gemuteerde residue, veral H-H102. Op grond van die H-A101S/H-A102H mutante model, is verwag dat mutasies gunstige interaksies sou verhoog, soos beskryf in die afdeling "Resultate". Die mutasie van die kleiner H-A102 na die groter H-H102 veroorsaak egter konformasieveranderinge van I152 van die antigeen en L-Y49, deur van der Waals-botsings (Fig. S9). Die onstabiliteit wat voortspruit uit die konformasieveranderinge kan die 3.3-voudige vermindering van die affiniteit veroorsaak.

Die H-Y33Q/H-A101R DP-mutant het 'n volledige verlies aan affiniteit getoon. Die hoofrede vir die verlies van die affiniteit blyk te wees uit die konformasionele voorkeur van die gemuteerde residue. Die konformasionele voorkeur van H-Q33 van die model is 3,4% van al die 54 konformasies van Gln en die van die H-R101-model is 0,06% van al 81 sykettingkonformasies van Arg, volgens die rotamerbiblioteek van aminosure 28 (Fig. S10 en Tabel S3). Die voorkeur-interaksies tussen H-Q33 en H-R101 wat in die model waargeneem word, kom dus selde voor; die waarskynlikheid word op 3,4% × 0,06% = 0,002% geraam.

Die ander belangrike bevinding was dat koöperatiewe DP -mutante nie verkry kon word as 'n tipiese prosedure, die kombinasie van verbeterde SP -mutante, gevolg is nie. In die geval van die H-K30Q/H-E54H-koöperatiewe DP-mutant (KD = 29 pM), het die individuele SP-mutant H-K30Q 'n 2,2-voudige vermindering in affiniteit getoon (KD = 97 pM) in vergelyking met die WT (KD = 45 pM), en die H-E54H SP-mutant is nie uitgedruk nie. Met hierdie benadering is die kans om die affiniteit van die mutant te ondersoek met 'n kombinasie van die residu met 'n 2,2-voudige vermindering van die affiniteit (H-K30Q) en die residu wat nie uitgedruk word nie (H-E54H) skaars. In die L-N34D/L-H91S DP-mutant (KD = 25 pM), het die individuele SP-mutant L-N34D 'n 6,9-voudige vermindering in affiniteit (KD = 310 pM) en die affiniteit van die L-H91S SP mutant was 17 000 pM, 1/378 van die van die WT. Die waarskynlikheid om 'n mutant te ontwikkel met die kombinasie van 'n residu met 'n 6,9-voudige vermindering (L-N34D) en 'n residu met 'n 378-voudige vermindering (L-H91S) is baie laag. 'N Kombinasie van die negatiewe gevolge van 'n SP -mutasie - 'n vermindering van affiniteit of geen uitdrukking - en 'n ander SP -mutasie kan 'n positiewe effek tot gevolg hê: 'n toename in affiniteit. Gelyktydige samewerkende mutasies wat voortspruit uit die komplementariteit van twee residue word beskou as belangrik vir hierdie verskynsel.

As gevolg van beperkte hulpbronne, is die aantal mutante wat in die eerste ronde van die ontwerp gekies is vir eksperimentele evaluering, op tien gestel. Ten spyte van die generering van 3D-modelstrukture vir 59 stelle residu-pare met 19 aminosure vir elke residuposisie, is vier DP-mutante geselekteer, omdat hulle die enigste DP-mutante was wat visuele inspeksie van interaksies geslaag het. Hierdie lae getal het voorgestel dat die gelyktydige mutasie van twee kontakresidu's met gunstige interaksies skaars kan wees.

'N Ander moontlikheid is dat nie alle moontlike aktiewe mutante met gunstige interaksies nagestreef is nie. By die evaluering van die mutantmodelle is slegs visuele inspeksie uitgevoer op slegs die top 20 van 361 DP -mutantmodelle (elke stel twee aminosuurposisies, 19 × 19 = 361), gebaseer op die berekende MM/GBVI -bindingsenergiewaarde met behulp van MOE 29. Die ander mutante modelle is weggegooi. Die aantal modelle wat visueel ondersoek moet word, is verhoog tot 'n maksimum van 80 as daar nie 'n mutant met gunstige interaksies tussen die top 20 modelle bestaan ​​nie.Nóg die totale nóg die elektrostatiese 12 MM/GBVI -bindingsenergie korreleer met die verandering in eksperimentele bindingsaffiniteit (Fig. S11). Dus is die filtrasie van die mutantmodelle volgens MM/GBVI bindingsenergie nie ideaal nie, en daar is 'n moontlikheid dat nie al die DP mutante met gunstige interaksies aan verdere visuele inspeksie onderwerp is nie. Alhoewel dit nie ideaal was nie, was filter deur MM/GBVI -bindingsenergie gevolg deur visuele inspeksie van die interaksies effektief, aangesien die eerste ontwerpronde gelei het tot die identifisering van twee DP -mutante met 'n verbeterde of vergelykbare affiniteit met die van die WT.

Die affiniteit van die driepunt-mutante L-N34D/L-H91S/H-N57Y is verhoog tot 7,6 pM, 'n 5,9-, 3,2- en 2,0-voudige toename bo die affiniteit van die WT, L-N34D/L-H91S DP-mutant en H-N57Y SP-mutant, onderskeidelik. Die driepuntmutant is geskep om die positiewe effekte van twee mutante wat ver geleë is, L-N34D/L-H91S en H-N57Y, by te voeg, wat 17 Å uitmekaar is in 3D (Fig. 1 en Fig. S12). Die 5.9-voudige toename in affiniteit van die trippelpunt mutant was byna gelyk aan die produk van die vou toename van die N34D/L-H91S DP mutant, 3.2, en dié van H-N57Y SP mutant, 2.0. In hierdie geval is die aanname dat die effek van die mutasies van verafgeleë plekke in 3D onafhanklik van mekaar is en additief kan wees, gevalideer. Alhoewel die beginpunt van die affiniteit van die WT baie hoog was (45 pM), is 'n 5,9-voudige toename van die affiniteit van die driepunt-mutant (7,6 pM) behaal. Hierdie prestasie het die belangrikheid van 3D-inligting in die ontwerp van mutante versterk, omdat die byvoeging van die positiewe effek van twee mutante slegs moontlik is wanneer die gemuteerde residue ver in 3D is.

Die verandering in die bindingsaffiniteit, KD, word hoofsaaklik beheer deur die verandering van die dissosiasie konstante kaf. In die ontwerpproses is die 3D-strukture van die antigeen/teenliggaam-kompleks ondersoek met die fokus op interaksies op kort afstand rondom die mutasie-residue. Daar is gerapporteer dat die dissosiasieproses beheer word deur kortafstand-interaksies tussen proteïene 30. Dit is dalk die moontlike verduideliking van ons resultate op kaf. Boonop word die affiniteitsveranderinge wat afkomstig is van struktuurgebaseerde teenliggaamontwerp gebaseer op SP-mutasies tipies beheer deur verandering in kaf 16. Die ontwerp van mutante gebaseer op die 3D -struktuur van die antigeen/teenliggaampompleks het moontlik nie 'n beduidende effek op die assosiasiesnelheid nie, kop. Ontwerp gebaseer op die kompleks, en wat bedoel is om die kompleks te stabiliseer, het wel die dissosiasie koers beïnvloed, kaf. Dus, kaf is verbeter as die ontwerp suksesvol was en versleg as dit misluk.

Die stabiliteit van die mutante is nie eksplisiet in die ontwerpproses in ag geneem op dieselfde manier as kop en kaf. Alhoewel sommige studies berig het dat affiniteit en stabiliteit 'n afruilverhouding het 31, is die verandering van die smelttemperatuur ∆Tm het binne die reeks van - 2 tot + 2 ° C geval vir die meeste van ons mutante (Fig. 5). Geen korrelasie tussen die affiniteitsverandering en ∆ nieTm waargeneem is. Die gebrek aan korrelasie tussen die affiniteit en stabiliteit veranderinge kan daarop dui dat die oorweging van die bewaring van die intra-teenliggaam interaksies in die ontwerp proses bygedra het om die mutante van beduidende vermindering in stabiliteit te voorkom.

Tien DP en SP mutante is prospektief ontwerp deur gebruik te maak van 'n dubbelpunt mutasie strategie, met interaksie analise gebaseer op die 3D struktuur van die mutant modelle. Twee DP- en twee SP -mutante met 'n affiniteit wat verbeter is of vergelykbaar is met die van die WT, is suksesvol verkry. Van die vier individuele SP -mutante, waarby die bestanddele van die twee aktiewe DP -mutante betrokke was, het drie verminderde affiniteit getoon, en een is nie uitgedruk nie. Hierdie resultate het aangedui dat die twee aktiewe DP-mutante moeilik verkry kan word deur 'n SP-mutasiestrategie te gebruik. Die driepunt-mutant, wat 'n kombinasie is van die aktiewe DP- en SP-mutante, is ontwerp en 'n verdere toename in affiniteit is bereik.

Alhoewel die DP-mutasiestrategie met interaksie-analise suksesvol was, is daar verskeie kwessies wat nog oorkom moet word. Die mees kritieke kwessie is die handmatige identifisering van die interaksies, wat arbeidsintensief en tydrowend is. Die outomatiese identifisering van interaksies gebaseer op die 3D -struktuur van die mutasiemodel is 'n huidige fokuspunt van ons navorsing, en die sagteware vir outomatiese identifisering van interaksies is 'n prototipe gemaak. As voorlopige toetsgevalle is hierdie prototipe sagteware toegepas op die tien mutante wat ontwerp is, en dit het die interaksies wat met die hand verkry is, weergegee. Die besonderhede van die outomatiese identifisering van interaksies sal elders gepubliseer word. 'N Ander belangrike kwessie is die beste manier om die veranderinge van interaksies wat deur mutasie aangebring word, te evalueer. Die evaluering is tans nie kwantitatief nie en is gebaseer op persoonlike ervaring van die struktuurgebaseerde ontwerp. Verdere ondersoek na die verwantskappe tussen die veranderings in affiniteit en veranderings van die interaksies, gebaseer op data wat deur die sagteware vir outomatiese interaksie -opsporing en die outomatiese mutant -modelleringsagteware verskaf word. 'N Ander probleem is die modellering van die mutant/antigeen kompleks, insluitend watermolekules. Met betrekking tot die verhouding tussen water herrangskikking in die mutant modelle en affiniteit verandering, enige beduidende verband tussen die omvang van water herrangskikking en die vou verbetering in affiniteit is nie waargeneem (Fig. S13). Affiniteitsverbetering het plaasgevind in beide gevalle waar die waterherrangskikking klein is (RMSD & lt 0.2 Å) en relatief groot (RMSD & gt 0.6 Å). Hierdie waarnemings dui aan dat die herrangskikking van die water van die mutante modelle nie die resultate grootliks in ons studie beïnvloed het nie. Dit mag egter nie in alle gevalle waar wees nie. As 'n voorbeeld van waterherrangskikking is gevind dat 'n holte wat deur die mutasie geproduseer is, wat 'n watermolekule kan huisves, nie in sommige mutantmodelle vervul is toe alle moontlike kombinasies van DP -mutante ondersoek is nie. Die modellering van DP -mutante wat watermolekules insluit, word tans oorweeg. Byvoorbeeld, 'n kort molekulêre dinamika -simulasie van opgeloste antigeen/teenliggaampompleks met beperkende proteïenatome is 'n opsie om waterherrangskikking op 'n gepaste wyse te bewerkstellig. Daarbenewens word versteuring van vrye energie van DP en veelvuldige mutante vir affiniteitsvoorspelling beskou as een van die rigtings om die akkuraatheid van die affiniteitsvoorspelling 32 te verbeter. Alhoewel ons aangeneem het dat die struktuur van die algehele antigeen-teenliggaamkompleks behou is tydens mutasie 33, kan daar gevalle wees waar DP- en selfs SP-mutasie 'n groot strukturele verandering veroorsaak, wat buite die omvang van die mutantmodelleringsmetode is wat ons aangeneem het in hierdie studie. Ander metodes kan nodig wees om so 'n scenario te bestudeer. Die insluiting van die effek van syketting buigsaamheid is 'n ander kwessie, soos gesien in die mislukking van die ontwerp van die H-Y33Q/H-A101R DP mutant. Na die oplossing van die kwessies wat hierbo beskryf is, hoop ons om die DP-mutasiestrategie uit te brei na 'n driepuntmutasiestrategie.


Hoe immuniteit teen respiratoriese sinsitiale virus in die kinderjare ontwikkel, versleg by volwassenes

Die belangrikste aansteeklike oorsaak van ernstige respiratoriese siektes by babas, respiratoriese sincytiale virus (RSV), is ook 'n belangrike oorsaak van respiratoriese siektes by bejaardes. Goedgekeurde entstowwe bestaan ​​nog nie, en ondanks die ontwikkeling van gedeeltelike immuniteit na infeksie tydens die kinderjare, bly individue lewenslank vatbaar vir herinfeksie van RSV. 'n Omvattende karakterisering van die teenliggaam-reaksie op RSV gepubliseer op 21 April in PLOS Patogene bevorder ons begrip van die menslike immuunrespons teen RSV en het implikasies vir die ontwerp van entstowwe.

RSV kom byna oral voor en die meeste kinders word gebore met 'n beskermende immuniteit wat deur moederlike teenliggaampies oorgedra word. Soos die moederlike teenliggaampies mettertyd afneem, word babas vatbaar, en word dikwels vir die eerste keer tussen nege maande en twee jaar oud besmet.

Studies oor die afgelope drie dekades het die antilichaamreaksies voor en na RSV -infeksie in verskillende ouderdomsgroepe ondersoek. Ons weet dat menslike teenliggaampies wat die vernietiging (of neutralisering) van die virus kan bemiddel, gerig is op die twee belangrikste proteïene op die virusoppervlak, naamlik die aanhegtingsproteïen G en die samesmeltingsproteïen F. Watter teenliggaamkombinasie bied egter die beste immuunbeskerming, en waarom RSV-infeksies deur die lewe herhaal word, bly oop vrae.

Om hulle aan te spreek, het Surender Khurana en kollegas van die Amerikaanse voedsel- en dwelmadministrasie in Silver Spring, VSA, eers 'n omvattende en onbevooroordeelde ontleding van die menslike teenliggaampeaksie op die RSV F- en G-proteïene by babas uitgevoer voor en na RSV-infeksie. Hulle het dan die veranderinge in die reaksie oor tyd gekenmerk deur die ontleding van teenliggaampies van kinders, adolessente en volwassenes.

Die bloed van jong babas, het die navorsers bevind, bevat teenliggaampies van die moeder wat verskeie dele van beide die F- en G -proteïene herken. By ouer babas wat met RSV besmet was, het hulle 'n dramatiese toename in hoeveelheid en diversiteit van die teenliggaampies wat die G -proteïen herken, gesien. Verbasend genoeg het infeksie slegs 'n beskeie toename in die teenliggaampertorium teen die F-proteïen veroorsaak. Deur na veranderinge te kyk, het die navorsers bevind dat die teenliggaampies teen die F -proteïen met die ouderdom bly uitbrei, terwyl die teen die G -proteïen verswak het.

Omdat die G-proteïenvolgorde tussen RSV-stamme verskil, terwyl die F-proteïen hoogs behoue ​​bly onder stamme, gebruik sommige entstowwe onder ontwikkeling slegs die meer hanteerbare F-proteïen as 'n entstofantigeen. Die resultate hier-sterk uitbreiding van anti-G-reaksies by babas na infeksie sowel as sterk anti-F-reaksies, maar verswakte anti-G-reaksies by volwassenes-dui daarop dat so 'n entstofontwerp problematies kan wees. Aan die ander kant, die feit dat die sterk anti-G-reaksies wat by kinders gesien word, 'n relatief bewaarde gebied in die G-proteïen teiken, dui daarop dat variasie in ander dele van die G-proteïen nie noodwendig G se bruikbaarheid as 'n entstofantigeen in die gedrang bring nie.

Gesamentlik, sê die navorsers, dui hul resultate op ''n ongebonde evolusie van die teenliggaampiesreaksies op F- en G-proteïene by mense', en stel voor dat 'die beduidende afname in anti-G-teenliggaamvlakke 'n faktor kan wees vir 'n volgehoue ​​vatbaarheid vir RSV -infeksies lewenslank. " Gevolglik verklaar hulle dat hul bevindings "die behoefte impliseer om G-proteïene in toekomstige RSV-entstowwe in te sluit om die anti-G-reaksies te versterk."


Studiefinansiering

Die skrywers het finansiële steun ontvang van die EPSRC, BBSRC, ERC en die Frances and Augustus Newman Foundation. Hierdie werk is ondersteun deur die programme “Investissements d'avenir” ANR-10-IAIHU-06, “Santé Publique France,” en toekennings van NIH (R01NS103848) en CDC (UR8/CCU515004). Die versameling van monsters in die Massachusetts General Hospital is befonds deur Prion Alliance. Die befondsers het geen rol gespeel in studieontwerp, data -insameling en -analise, besluit om te publiseer of die voorbereiding van die manuskrip nie.


Agtergrond

Saam met sanitasie is entstowwe die doeltreffendste en mees ekonomiese instrumente vir openbare gesondheid vir die beheer van aansteeklike siektes [1]. Die ontwikkeling van entstowwe staan ​​egter voor 'n aantal uitdagings, soos die oorkom van die beperkte doeltreffendheid van 'n aantal entstowwe, die behoefte aan gereelde herformulering van entstowwe, sowel as 'n volledige gebrek aan entstowwe vir sommige siektes. 'N Sentrale doel van inenting is om langdurige en wyd beskermende immuniteit teen teikenpatogene te genereer, maar hierdie doelwit word belemmer deur die veranderlikheid van beide die teikenpatogene en die menslike immuunstelsel [2]. Huidige praktiese oplossings vir die probleem sluit in meerwaardige entstowwe, soos dié wat ontwikkel word vir dengue -virus [3] of seisoenale entstofherformulering teen griep [4].

Die meerderheid tradisionele entstowwe bied beskerming deur neutralisering van teenliggaampies en T -selle alleen bied selde beskerming en voorkoming van siektes. Hulle neem egter deel aan vermindering, beheer en opruiming van intrasellulêre patogene en is gekoppel aan beskermende immuniteit teen 'n aantal virale patogene [5-8]. Die grootste sukses van immunologiese bioinformatika is die ontwikkeling van algoritmes vir voorspelling van peptiedbindingsaffiniteit met die menslike leukosietantigeen (HLA) - een van die tempobeperkende stappe in T-selgebaseerde immuunrespons [9]. Alhoewel huidige vorme van hierdie algoritmes hoogs akkuraat [10–12] is, is die uitset alleen nie genoeg om die keuse van epitope vir terapeutiese toepassings in te lig nie. In die konseptuele raamwerk vir omgekeerde inenting, het Rino Rappouli beskryf in siliko voorspellings van immuun epitope uit biologiese volgorde data as 'n "naïewe benadering" in vergelyking met eksperimentele toeligting immunogeniese peptiede. Baie parameters van 'n goeie entstofdoelwit wat doeltreffende, blywende immuniteit bied, moet nog in ag geneem word na voorspelling van HLA-binding: verskeie tempo-beperkende stappe van peptiedvoorverwerking, wat bevestig in vivo uitdrukking, met inagneming van dinamika van uitdrukking in verskillende ontwikkelingstadia en sellulêre omgewings, teenwoordigheid van epitoop oor patogeenpopulasie, reaksie oor gasheerpopulasie, epitoopstabiliteit oor tyd, en ander [13]. Hier spreek ons ​​die kwessie van veranderlikheid aan deur die antigeenseleksiestap te wysig met 'n berekeningsmetode om verskeie T -selteikens uit funksioneel homoloë proteïengebiede te kies.

Tradisioneel word entstofteikens gekies uit bewaarde streke in die genoom van die betrokke patogeen, met die doel om breë en blywende immuniteit te verleen. Die eerste stap is 'n veranderlikheidsanalise wat uitgevoer word deur die frekwensie van nukleotiede of aminosure op elke posisie in 'n meervoudige volgordebelyning (MSA) van homoloë gene of proteïene [14] te bereken. Gebiede, waarin verskeie opeenvolgende residue 'n hoë bewaring toon (tipies dat gt90% bewaring as die drempel gekies word), word dan verder ontleed op immunogeniese potensiaal, hetsy deur berekeningvoorspellings, eksperimentele toetse of 'n kombinasie daarvan. Hierdie sistematiese uitsluiting van lae frekwensie variante by die gebruik van tradisionele benaderings [15–19] verteenwoordig 'n belangrike beperkende faktor, aangesien immunogene potensiaal nie altyd korreleer met die frekwensie in die virale populasie nie - beide skaars en algemene peptiede kan immunogeen en waardevol wees in entstofkonstruksies mik vir breë dekking [20].

Aangesien die evolusie van die menslike immuunstelsel op 'n aansienlik langer tydskaal plaasvind as vinnig muterende patogene [21], veroorsaak hoë selektiewe druk dat hulle die uitdrukking van sommige immunogene antigene vinniger verander as wat die immuunstelsel kan ontwikkel om by te bly met die veranderinge [22]. Die HLA -bindingsaffiniteit van 'n peptied relatief tot die frekwensie daarvan in 'n virale of kwaadaardige selpopulasie staan ​​bekend as die doelgerigte doeltreffendheid (TE). Daar is getoon dat die TE van peptiede in verskillende organismes verskil, en in sommige hoogs veranderlike virusse is dit geneig om laag te wees [20]. Streke met hoë TE bestaan ​​uit peptiede wat hoogs behoue ​​bly, waarskynlik as gevolg van die proteïen se funksionele belangrikheid wat die kapasiteit van 'n patogeen beperk om die proteïen te verander terwyl sy fiksheid behou word [23]. Gebiede van lae TE bestaan ​​uit een of meer peptiede, moontlik almal met 'n hoë HLA -bindingsaffiniteit, maar elkeen van hulle het 'n lae frekwensie in die patogeenpopulasie. Vir vinnig muterende virusse, soos RNA-virusse [24], beteken die selektiewe druk wat op HLA-bindende peptiede uitgeoefen word, dat gasheerimmuniteit dikwels, en in sommige gevalle by voorkeur, op lae frekwensie-epitope [20] teiken.

Seleksie van entstofdoelwitte uit proteïengebiede met bewaarde HLA -binding

Ons stel 'n nuwe metode en visualiseringskema voor vir die beoordeling van die stabiliteit van proteïenstreke vir T-sel-teikenontdekking, wat die evolusionêre verwantskap tussen HLA en patogeen-epitope in ag neem. Hierdie metode is gebaseer op die ontleding van kolomme van skuifvensters met 'n gepaste grootte (hierna "blokke" genoem) uit die rye rye in 'n MSA (Figuur 1). 'N MSA van homoloë proteïenvolgorde kan uitgevoer word met behulp van 'n aantal algoritmes [25] en blokke peptiede van 'n gegewe grootte (gewoonlik 8-11 aminosure lank vir HLA klas I beperkte epitope en 13-25 aminosure lank vir HLA klas II beperkte T-sel-epitope) word uit elke posisie in die belyning onttrek. Die aantal peptiede in elke blok dui die diversiteit van die blok aan, waarvoor Shannon -entropie en konsensusfrekwensie bereken kan word as informatiewe statistieke [26].

Onttrekking van blokke uit MSA. Onderverdeling van 'n MSA in blokke peptiede, l aminosure in lengte. In hierdie voorbeeld, l = 9. Blok 1 word in blou gemerk. Deur die skuifvenster na regs in die MSA te skuif in stappe van een posisie, word alle blokke in die MSA gegee.

Ten einde potensiële T-sel-teikens te identifiseer, word HLA-bindingsaffiniteite vir alle peptiede in alle blokke voorspel. Omdat blokke onttrek word uit belynde streke van homoloë proteïene, is dit waarskynlik dat die peptiede in 'n gegewe blok 'n hoë volgorde -homologie vertoon en die meerderheid soortgelyke HLA -bindende eienskappe toon, selfs al is daar sekwensievariasies. Net so sal die streke rondom 'n blok van hoë homologie wees, wat dus die waarskynlikheid verhoog dat peptiede van dieselfde blok op 'n soortgelyke wyse verwerk en op die oppervlak van teikenselle aangebied sal word [27].

Blokke van een of meer peptiede wat na verwagting almal aan dieselfde HLA -allele met soortgelyke affiniteit sal bind, is potensieel waardevolle doelwitte vir meerwaardige entstofontwerpe. Dit maak voorsiening vir gelyktydige immunisering met verskeie epitope - 'n noodsaaklike taktiek teen hoogs muterende virusse waarin mutasies wat geneesmiddelweerstand inbring binne 'n enkele dag kan voorkom [28, 29]. Ons het voorheen 'n rudimentêre weergawe van die blokbewaringsanalise gebruik om entstofteikenontdekking by dengue-virus (DENV) [30] te gebruik en 'n 10-voudige groter aantal potensiële kandidate vir CD8 + -entstof te rapporteer in vergelyking met 'n vroeëre studie van die DENV-entstofdoelwit kandidate [31]. Ons formaliseer die benadering en bied 'n sagteware -implementering aan. Om die nut van blokbewaring verder te demonstreer, het ons 'n ontleding van HLA klas I epitope in griep A H7N9 hemagglutinien (HA) uitgevoer. Die sagteware is geïntegreer in 'n gratis beskikbare webdiens op http://met-hilab.cbs.dtu.dk/blockcons/.


Afkortings

Komplementêre Bepaalde Streek van die Teenliggaam.

antigeen-bindende fragment van teenliggaam wat 'n volledige ligte ketting bevat, gepaard met 'n swaarkettingfragment wat die veranderlike domein en die eerste konstante domein bevat.

antigeen-bindende fragment van die teenliggaam wat die veranderlike domein van die swaar ketting insluit.

antigeenbindende fragment van teenliggaampies wat veranderlike domeine van swaar en ligte kettings insluit.

antigeen-bindende fragment van die teenliggaam wat die kovalent gekoppelde veranderlike domeine van die swaar en ligte kettings insluit.

monster standaardafwyking.

FP, TN, FN - onderskeidelik ware positiewe, vals positiewe, ware negatiewe en vals negatiewe.

Ontvanger Bedryfskenmerke.


Monoklonale teenliggaampies wat nie-strukturele virale antigene teiken kan ADCC teen menslike sitomegalovirus aktiveer

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, Skool vir Geneeskunde, Cardiff Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitaanse Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infection and Immunity, School of Medicine, Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Foon: 44.0.7969.148916 E-pos: [email protected]

Skrywerskapnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

Vind artikels van Vlahava, V. in: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, Skool vir Geneeskunde, Cardiff Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infection and Immunity, School of Medicine, Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

Vind artikels van Murrell, I. in: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, Skool vir Geneeskunde, Cardiff Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infeksie en Immuniteit, Skool vir Geneeskunde, Henry Wellcome-gebou, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MNR Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infection and Immunity, School of Medicine, Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

Vind artikels deur Aicheler, R. in: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, Skool vir Geneeskunde, Cardiff Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MNR Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infection and Immunity, School of Medicine, Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywerskapnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infection and Immunity, School of Medicine, Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Foon: 44.0.7969.148916 E-pos: [email protected]

Skrywerskapnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitaanse Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MNR Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infeksie en Immuniteit, Skool vir Geneeskunde, Henry Wellcome-gebou, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

Vind artikels van Ladell, K. in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MNR Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infeksie en Immuniteit, Skool vir Geneeskunde, Henry Wellcome-gebou, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Foon: 44.0.7969.148916 E-pos: [email protected]

Skrywerskapnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, Skool vir Geneeskunde, Cardiff Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infection and Immunity, School of Medicine, Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infeksie en Immuniteit, Skool vir Geneeskunde, Henry Wellcome-gebou, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywerskapnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

Vind artikels deur Davison, A. in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infection and Immunity, School of Medicine, Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

Vind artikels van Wilkinson, G. in: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitaanse Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Institute for Medical Research, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infeksie en Immuniteit, Skool vir Geneeskunde, Henry Wellcome-gebou, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Foon: 44.0.7969.148916 E-pos: [email protected]

Skrywerskapnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, Skool vir Geneeskunde, Cardiff Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Instituut vir Mediese Navorsing, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infeksie en Immuniteit, Skool vir Geneeskunde, Henry Wellcome-gebou, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Foon: 44.0.7969.148916 E-pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, Skool vir Geneeskunde, Cardiff Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitaanse Universiteit, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MNR Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Instituut vir Mediese Navorsing, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infection and Immunity, School of Medicine, Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

1 Afdeling Infeksie en Immunologie, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

2 Cardiff Metropolitan University, Cardiff, Verenigde Koninkryk.

3 Departement Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

4 Universiteit van Glasgow-MRC Sentrum vir Virusnavorsing, Glasgow, Verenigde Koninkryk.

5 Cambridge Instituut vir Mediese Navorsing, Universiteit van Cambridge, Cambridge, Verenigde Koninkryk.

Rig korrespondensie aan: Richard J. Stanton, Infeksie en Immuniteit, Skool vir Geneeskunde, Henry Wellcome-gebou, Heath Park, Cardiff CF14 4XN, Verenigde Koninkryk. Telefoon: 44.0.7969.148916 E -pos: [email protected]

Skrywingsnota: VMV en IM het ewe veel tot hierdie werk bygedra.

Vind artikels deur Stanton, R. in: JCI | PubMed | Google Scholar

Gepubliseer op 15 Februarie 2021 - Meer inligting

Menslike sitomegalovirus (HCMV) is 'n alomteenwoordige patogeen wat ernstige siektes veroorsaak na aangebore infeksie en by individue met immuunonderdrukking. Geen entstowwe is gelisensieer nie, en daar is beperkte behandelingsopsies. Ons wys nou dat die byvoeging van anti-HCMV-teenliggaampies (Abs) NK-selle kan aktiveer voor die produksie van nuwe virions, deur Ab-afhanklike sellulêre sitotoksisiteit (ADCC), wat virale immuun-evasines oorkom. Kwantitatiewe proteomika het die volopste HCMV-proteïene op die seloppervlak gedefinieer, en ons het hierdie teikens gekeur om die virale antigene te identifiseer wat verantwoordelik is vir die aktivering van ADCC. Dit was verbasend dat dit nie strukturele glikoproteïene was nie, maar die immuun evasiene US28, RL11, UL5, UL141 en UL16, elk afsonderlik gegrond ADCC. Ons het menslike monoklonale Abs (mAbs) spesifiek vir UL16 of UL141 van 'n seropositiewe skenker geïsoleer en dit vir ADCC geoptimaliseer. Gekloonde Abs wat 'n enkele antigeen (UL141) gerig het, was voldoende om ADCC teen HCMV-geïnfekteerde selle te bemiddel, selfs by lae konsentrasies. Gesamentlik bekragtig hierdie bevindinge 'n onbevooroordeelde metodologiese benadering tot die identifisering van immunodominante virale antigene, wat 'n weg bied na 'n immunoterapeutiese strategie teen HCMV en moontlik ander patogene.

Menslike sitomegalovirus (HCMV) vestig lewenslange infeksie in die lig van robuuste humorale en selgemedieerde immuunrespons. Die virus is 'n beduidende oorsaak van morbiditeit en mortaliteit by individue met immuunonderdrukking soos oorplantingsontvangers en pasiënte met MIV en na aangebore infeksie. 'N Entstof teen HCMV word as die hoogste prioriteit beskou, veral vir die voorkoming van aangebore siektes (1), maar nie een is gelisensieer nie. Die standaard vir behandeling is dus antivirale middels, maar dit word beperk deur toksisiteit en die voorkoms van weerstandbiedende stamme (2).

As 'n alternatief is teenliggaam (Ab) reaksies ondersoek as 'n basis vir verbeterde entstowwe en immunoterapieë (3-9). Verskeie bewyse ondersteun 'n beskermende rol vir Abs in infeksie, insluitend waarnemingstudies van natuurlike immuniteit, wat 'n korrelasie tussen Ab titers en die voorkoming van intrauteriene oordrag (10-13) gedokumenteer het. Boonop kan die toediening van hiper -immuunglobulien (HIG) die oorlewing verbeter by pasiënte wat vaste orgaanoorplanting ondergaan (14), en Ab -titels korreleer met beskerming in entstofproewe (8, 9). As gevolg hiervan is 'n reeks Abs wat teen virion-omhulselglikoproteïene gerig is, wat die toegang van selvrye virus kan neutraliseer, ontwikkel (5, 15, 16). Neutraliserende monoklonale teenliggaampies (mAbs) wat as terapieë toegedien is, het egter slegs beskeie effekte gehad en/of het nie aan primêre eindpunte in kliniese proewe voldoen nie, naamlik 'n vermindering in viremie en/of die behoefte aan voorkomende terapie (17, 18).

Een moontlike verklaring vir hierdie gebrek aan kliniese doeltreffendheid lê in die biologie van virusverspreiding. Verspreiding tussen individue behels 'n selvrye virus, wat doeltreffend geïnhibeer kan word deur Abs te neutraliseer. In teenstelling hiermee berus verspreiding binne 'n gasheer waarskynlik primêr op direkte sel-tot-sel verspreiding (19-24), wat bestand is teen neutraliserende teenliggaampies (25), ongeag die Ab-repertorium van die skenker (26). Alhoewel klassieke neutralisering van Abs 'n rol kan speel in die voorkoming van oordrag tussen mense, kan dit minder effektief wees om die verspreiding van virus binne 'n individu te voorkom. Dit stem ooreen met kliniese toetse van 'n sub -eenheid gB -entstof, waarin beskerming gekorreleer is met Ab -vlakke, maar die geïnduseerde teenliggaampies het nie openlike neutraliserende aktiwiteit getoon nie (27, 28). Ons het dus probeer om Ab-gebaseerde immunoterapeutiese benaderings te prioritiseer wat geïnfekteerde selle direk kan teiken.

NK -selle is van kardinale belang vir virusbeheer in vivo (29). Hierdie feit word beklemtoon deur die indrukwekkende arsenaal van HCMV-gekodeerde immuun-evasiene wat saamwerk om NK-selaktivering te onderdruk deur die manipulasie van ligande vir aktiveer- en remmende reseptore (30, 31). Benewens die werk deur hierdie reseptore, neem NK-selle egter deel aan Ab-afhanklike sellulêre sitotoksisiteit (ADCC) (32, 33). ADCC behels die aktivering van NK -selle by ingryping van Fc -reseptore (FcR's) op die NK -seloppervlak, met die Fc -gedeelte van 'n Ab gebind aan 'n teikensel. In vivo word HCMV -infeksie geassosieer met 'n dramatiese uitbreiding van "aanpasbare" NK -selle wat gekenmerk word deur die uitdrukking van CD94/NKG2C, en CD57 en deur die verlies van FcεR1γ (29, 34). Hierdie selle is buitengewoon doeltreffend om ADCC te bemiddel (35 - 38) en word geassosieer met beskerming teen siektes (35, 39 - 41). Gevolglik kan ADCC 'n belangrike meganisme van immuunbeheer tydens natuurlike infeksie wees. In hierdie scenario tree Abs op as kritieke stimulators van sellulêre immuniteit, eerder as deur middel van virusneutralisering.

Ons was dus geïnteresseerd in hoe ADCC in die konteks van 'n HCMV-infeksie opereer en of dit vir terapeutiese gebruik ontgin kan word. Ons het gevind dat anti-HCMV Abs NK-selle vroeg na HCMV-infeksie kan aktiveer, voor die vervaardiging van nuwe virions, en dat hierdie Abs 'n merkwaardige vermoë het om die kragtige HCMV-gekodeerde NK-selontduikingsmeganismes in vitro te oorweldig. Ons het voorheen die krag van proteomika ontgin om virale en gasheer-geenuitdrukking tydens HCMV-infeksie in ongeëwenaarde detail te karakteriseer, wat die maniere openbaar waarop die virus die gasheersel manipuleer om oorlewing te bevorder, en om maniere te identifiseer om die virus teë te werk deur middel van antivirale beperkingsfaktore ( 33, 42 – 47). Hier kombineer ons hierdie tegniek met funksionele immunologiese sifting om die teikens op die geïnfekteerde seloppervlak te identifiseer wat antivirale ADCC bemiddel. Verbasend genoeg het hierdie tegnieke aan die lig gebring dat die optimale teikens nie die strukturele glikoproteïene was wat tradisioneel aanvaar word as ADCC-teikens nie, maar immuun-evasines wat vroeër tydens die virale lewensiklus uitgedruk word. Hulle identifikasie het ons in staat gestel om menslike mAbs wat teen hierdie doelwitte gerig is, te isoleer wat, sodra ons dit geneties gemanipuleer het, NK-selle kan aktiveer in reaksie op HCMV-besmette selle. Ons tegnologieë het dus die identifisering van optimale antigene teikens vir die ontwikkeling van antivirale terapieë moontlik gemaak, en die isolasie van wat ons glo die eerste menslike mAbs is wat gerig is op 'n enkele HCMV-proteïen wat voldoende is vir die bemiddeling van verbeterde NK-aktivering deur ADCC, ondanks virus- gekodeerde immuun -evasiene. Ons platform is dus in staat om nuwe antivirale immunoterapieë te genereer wat antivirale sellulêre immuniteit doeltreffend kan aktiveer.

HCMV-besmette selle is vatbaar vir ADCC tydens die vroeë fase van infeksie. Ons het die vermoë van Cytotect (HIG van kliniese graad wat saamgevoeg is van donateurs met hoë anti-HCMV-neutraliserende titers) ondersoek om die aktivering van NK-selle te verbeter in die teenwoordigheid van teikenselle wat besmet is met 'n HCMV-stam (Merlin) wat die volledige repertoire van viraal gekodeerde immuun uitdruk. evasins.Aangesien adaptiewe NK-selle die primêre bemiddelaars van ADCC in PBMC's van HCMV-seropositiewe skenkers (29, 35-38) is, het ons die aktivering van CD56+ NK-selle in die CD57+ en NKG2C+ subsets ondersoek, en degranulasie gemeet via oppervlakmobilisering van CD107a . Beide selpopulasies het 'n groter toename in degranulasie getoon toe Ab bygevoeg is, vergeleke met die NKG2C - CD57 -selpopulasie. In die meerderheid skenkers het ons egter 'n groot oorvleueling tussen die CD57 + en NKG2C + sel populasies waargeneem, en die vlakke van degranulasie was feitlik ononderskeibaar tussen hulle. Aangesien NKG2C + NK -selle selde by onbesmette individue voorkom, en tot 4% van die mense nie die ooreenstemmende geen (KLRC2) bevat nie, is daaropvolgende data aangeteken vir CD57 + NK -selle.

Cytotect verbeter NK -selaktivering teen 'n minimum konsentrasie van 12,5 μg/ml en word toenemend sterker namate die konsentrasies tot 50 μg/ml toeneem, wat 'n relatief steil aktiveringskromme verteenwoordig (figuur 1A). Eksperimente is tot hierdie maksimum beperk, omdat verhoogde agtergrondaktivering waargeneem is met hoër konsentrasies IgG Abs van HCMV-seronegatiewe skenkers. Interessant genoeg was doeltreffendheid nie afhanklik van NK-selstimulasie nie, aangesien ekwivalente resultate verkry is of selle vooraf met IFN-α geïnkubeer is of nie (Figuur 1, A en B). Gegewe dat HCMV die vrystelling van IFN'e aktief onderdruk (48), ondersteun dit 'n belangrike rol vir ADCC in die vinnige aktivering van NK-selle teen HCMV sonder 'n vereiste vir bykomende stimulasies.

Karakterisering van ADCC-gemedieerde NK-selaktivering teen HCMV-geïnfekteerde fibroblaste. HFFF's wat verewig is met hTERT of soortgelyke onsterflike outoloë SF's, is besmet met HCMV -stam Merlin. Spot-geïnfekteerde HF-TERT's of SF's is as kontroles ingesluit. (A en B) Persentasie van degranulasie van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van HF-TERT's wat 48 uur lank met HCMV besmet is en verskillende konsentrasies van óf Cytotect óf seronegatiewe IgG's (Neg IgG). PBMC's is óf onbehandeld (A) of 18 uur vooraf behandel met IFN-α (B). (C en D) Persentasie van degranulering van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van HF-TERT'e wat vir 24 uur, 48 uur of 72 uur met HCMV en óf Sitotect óf seronegatiewe IgG's (elk teen 50 μg/ml) geïnfekteer is. PBMC's is óf onbehandeld (C) of voorbehandel vir 18 uur met IFN-α (D). (E en F) Persentasie degranulering van CD56 + CD57 + NKG2C + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van HF-TERT'e (E) of SF's (F) 48 uur besmet is met HCMV en óf Cytotect óf seronegatiewe IgG's (elk teen 50 μg/ml). Resultate is verteenwoordigend van ten minste 3 eksperimente. Alle data word getoon as die gemiddelde ± SD van drievoudige monsters. *P < 0,05, **P & lt 0,01, ***P & lt 0.001, en ****P < 0,0001, deur 2-rigting ANOVA.

Toe die sensitiwiteit van HCMV-geïnfekteerde selle vir ADCC in die loop van infeksie ondersoek is, het ons NK-selaktivering so vroeg as 24 uur na infeksie (hpi) opgespoor, ongeag vooraf-inkubasie met IFN-α, maar dit het dramaties toegeneem by 48 hpi ( Figuur 1, C en D) voordat dit effens afneem by 72 hpi. Hierdie vermindering kan verband hou met die uitdrukking op hierdie later tydpunt van virale FcR's en ander NK-inhibeerders, wat ADCC antagoniseer (32, 45, 49). HCMV -antigene wat met 48 hpi op die seloppervlak uitgedruk word, word dus herken deur natuurlik voorkomende Abs en dien as effektiewe doelwitte om ADCC te dryf. Dit is belangrik dat HCMV 'n stadige replikasiesiklus het, met virions wat nie in beduidende getalle geproduseer word tot 72 hpi nie, so hierdie waarnemings het 'n terapeutiese geleentheid uitgelig om die verspreiding van HCMV te beperk.

HCMV reguleer die uitdrukking van endogene HLA klas I -molekules, maar skrap dit nie. NK-selaktivering kan dus beïnvloed word deur interaksies tussen residuele HLA-I en moordenaar immunoglobulienagtige reseptore (KIR's). Om hierdie moontlikheid aan te spreek, het ons NK -selherkenning van allogene en outoloë doelwitte in die konteks van ADCC ondersoek. Die krag van HCMV-gekodeerde NK-selontduikingsfunksies word geïllustreer deur die feit dat onbesmette outoloë en allogene teikens NK-selle baie meer doeltreffend geaktiveer het as die ooreenstemmende HCMV-geïnfekteerde teikens (Figuur 1, E en F). In beide gevalle het die insluiting van seropositiewe Abs egter die sterk beskermende effekte van HCMV-gekodeerde NK-ontduikingsfunksies oorkom om hoë vlakke van NK-selaktivering te stimuleer, ongeag voorafinkubasie met IFN-α (Figuur 1, E en F). Die byvoeging van anti-HCMV Abs was dus in staat om NK-selle kragtig te aktiveer en virale immuunontduiking te oorkom voor die produksie van nuwe virions, ongeag NK-selstimulasie of betrokkenheid van HLA-I.

Antigene wat op die seloppervlak met 48 hpi uitgedruk word, bevorder ADCC. ADCC het die potensiaal om besmette selle te teiken tydens die vroeë fase van die HCMV -replikasiesiklus. Om te bepaal watter virale antigene ADCC geprimeer het, het ons data van ons kwantitatiewe temporale viromiese ondersoek van die HCMV-besmette seloppervlakproteoom (45) herontleed. Ons het drie duidelike kinetiese klasse van proteïenuitdrukking geïdentifiseer (Figuur 2A). Tien proteïene bereik ten minste 25% van hul maksimum seloppervlakke met 24 hpi, en nog 5 proteïene bereik minstens 25% van hul maksimum vlakke met 48 hpi. Dus word 'n aansienlike aantal virale proteïene na die selmembraan vervoer voor die produksie van nuwe virions. Verder het veelvuldige proteïene 'n maksimum algehele oorvloed bereik gelyk aan of hoër as dié van strukturele proteïene wat tydens die latere fases van infeksie uitgedruk word (Figuur 2B). Daarom sal die teiken van proteïene wat vroeg tydens die virale lewensiklus uitgedruk word, waarskynlik net so effektief wees as om later-uitgedrukte faktore te teiken. 'N Ontleding van die verdeelde oorvloed van elke proteïen met verloop van tyd het aangedui dat UL16, RL12, UL141 en US28 op die seloppervlak met 48 hpi uitgedruk is, een van die mees voorkomende virale proteïene op hierdie tydstip is en dus potensiële kandidate sou wees vir ADCC -teikens (figuur 2C).

Identifikasie van virale proteïene op die plasmamembraan wat ADCC kan primer. (A) Temporele profiele van virale proteïene (n = 27) wat voorheen geïdentifiseer is op die oppervlak van selle wat met HCMV besmet is. Proteïene is slegs by die analise ingesluit indien dit in eksperimente PM1 en PM2 opgespoor en deur 2 of meer peptiede in eksperiment PM1 of eksperiment PM2 gekwantifiseer is. Data word getoon vir eksperiment PM2. Proteïene word gegroepeer op grond van uitdrukkingskinetika, wat aandui dat meer as 25% van die maksimum sein teen 24 uur (links), 48 uur (middel) of 72 uur (regs) bereik is. (B) Gemiddelde totale oorvloed van elke oppervlak-uitgedrukte virale proteïen gemeet met IBAQ. Foutstawe dui reekse van eksperimente PM1 en PM2 aan. (C) Verdeel die IBAQ-oorvloed van elke oppervlak-uitgedrukte virale proteïen oor tyd. Gemiddelde IBAQ-oorvloedwaardes in B is vermenigvuldig met die fraksionele oorvloed op elke tydstip vanaf A. (D) HF-TERTs getransfekteer met die coxsackie-adenovirus reseptor (HFFF-hCARs) is getransduseer met RAds wat individuele virale proteïene uitdruk. 'N Identiese vektor sonder 'n transgeen is as kontrole gebruik. Oppervlak-uitgedrukte proteïene is geïsoleer deur aminooksie biotinilering gevolg deur immunopresipitasie met streptavidien krale 48 uur na transduksie. Western blots toon die opsporing van die C-terminale V5-etikette wat in elke proteïen vervaardig is, met die uitsondering van UL141, wat met 'n UL141-spesifieke Ab opgespoor is. UL141 -vlek van die gel is afsonderlik uitgevoer, maar word op dieselfde prentjie oorgetrek. (E) Persentasie van degranulering van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van HFFF-hCARs, getransduseer soos in D, en óf Cytotect óf seronegatiewe IgG's (elk teen 50 μg/ml). Resultate is verteenwoordigend van 3 eksperimente. Data word getoon as die gemiddelde ± SD van drievoudige monsters (E). *P & lt 0,05 en ****P < 0,0001, deur 2-rigting ANOVA. ctrl, beheer.

Op grond van hierdie resultate het ons repenasie-gebrekkige adenovirus (RAd) -vektore gegenereer wat elk van die 15 virale proteïene uitdruk wat met 48 hpi reproduseerbaar op die oppervlak van HCMV-besmette selle geïdentifiseer is (Figuur 2D). Elke RAd is daarna afsonderlik getoets vir sy vermoë om ADCC te bevorder in die teenwoordigheid van saamgevoegde poliklonale HIG (Figuur 2E). UL16, UL141, US28, RL11 en UL5 het elkeen 'n beduidende toename in NK-selaktivering veroorsaak wat afhang van die teenwoordigheid van Cytotect, wat daarop dui dat hierdie virale antigene ADCC in die vroeë fase kan veroorsaak.

Abs wat ADCC rig, kan van menslike skenkers geïsoleer word. Om te ondersoek of die geïdentifiseerde virale proteïendoelwitte ADCC in die konteks van HCMV -infeksie kan bemiddel, het ons 'n reeks mAbs genereer. RL11 is 'n Fc-bindende proteïen (50) wat beide die produksie van spesifieke Abs en die ontleding van funksionele toetse bemoeilik. US28 is 'n tipe 3 transmembraan proteïen, en dus sou die generasie van US28-spesifieke Abs minder eenvoudig wees. Daarom bied RL11 en US28 moontlik nie roetine -teikenantigene nie. Aangesien UL5 geassosieer word met slegs beskeie vlakke van NK -selaktivering, is die tipe 1 membraanproteïene UL16 en UL141 geprioritiseer. Sekwensies wat vir die ekstrasellulêre domeine van elke proteïen kodeer, is as gemodifiseerde konstrukte met 'n C-terminale 6xHis-merker (UL16) of 'n C-terminale Strep-merker (UL141) in aparte RAd vektore gekloon vir uitdrukking. Die ooreenstemmende proteïene is gesuiwer vanaf sel supernatante via affiniteitschromatografie, gemerk met fluorochrome, en gebruik as probes om IgG + B-selle van 'n skenker wat met HCMV geïnfekteer is, te kleur. UL141-spesifieke B-selle was meer as UL16-spesifieke B-selle (figuur 3A). Enkele antigeen-spesifieke B-selle is dan vloei-gesorteer in kultuurmedium wat CD40L + voerders, IL-2, IL-4, IL-21 en B sel aktiveer faktor (BAFF) bevat om plasma selle te genereer (51). Alle afgeskeide mAbs is dan gesif teen selle wat UL16 of UL141 uitdruk. Beide proteïene bevat 'n ER-retensiesein in die C-terminale sitoplasmiese domein, wat seloppervlak-uitdrukking beperk het (Aanvullende Figuur 1A aanvullende materiaal aanlyn beskikbaar met hierdie artikel https://doi.org/10.1172/JCI139296DS1). Om die sensitiwiteit van hierdie vloeisitometrie-gebaseerde Ab-skerm te verhoog, het ons die seloppervlak-oorvloed van teikenantigene verhoog deur hierdie streek te skrap (Aanvullende Figuur 1A). Deur die 60 B -sel -supernatante teen hierdie proteïene te toets, is onthul dat 9 UL141 en 5 UL16 gebind het (aanvullende figuur 1B).

Anti-UL16 en anti-UL141 mAbs kan van seropositiewe skenkers geïsoleer en gekloon word. (A) IgG + B-selle van 'n HCMV-seropositiewe skenker is bevlek met fluorescerend gemerkte UL16- of UL141-proteïene om B-selle te sorteer wat spesifieke mAbs uitdruk. FSC, voorwaartse strooi SSC, systrooi. (B en C) HFFF-hCAR's is oorgedra met RAd's wat UL141 of UL16 uitdruk, sonder hul ER-retensie seine. Selle is gekleur met die gekloonde menslike anti-UL141 of anti-UL16 mAbs en geanaliseer deur vloeititometrie. Cytotect is gebruik as 'n positiewe kontrole. (D) HFFF-hCAR's is oorgedra met RAd's wat 'n transgen ontbreek, of RAds wat wilde tipe UL141 of UL16 uitdruk. Monsters is gelys, geskei deur SDS-PAGE, en geanaliseer deur immunoblotting met menslike anti-UL16 of anti-UL141 mAbs. As 'n positiewe kontrole is die UL16-lysaat gekleur met 'n anti-V5 Ab, en die UL141-lysaat is met 'n muriene anti-UL141 Ab gekleur. (E en F) HFFF-hCAR's is oorgedra met RAd's wat wilde tipe vorme van UL141 of UL16 uitdruk. Agt-en-veertig uur later is hulle gekleur met menslike anti-UL141 of anti-UL16 mAbs of Cytotect en dan deur vloeisitometrie geanaliseer.

B-selreseptor (BCR) volgordebepaling het aan die lig gebring dat die voorspelde aminosuurvolgorde van hierdie mAbs uiteenlopend was en beide κ en λ ligte kettings geïnkorporeer het, wat daarop dui dat Abs die potensiaal het om verskillende epitope te teiken (Aanvullende Figuur 2). Ons subkloneer die veranderlike domeine van hierdie BCR's in 'n uitdrukkingsplasmied wat 'n menslike IgG1 -ruggraat verskaf, met die spesifieke doel om die nut van die Ab -fusie vir ADCC te optimaliseer. Wanneer uitgedruk, het hierdie rekombinante menslike mAbs hul vermoë behou om aan UL141 en UL16 op die seloppervlak (Figuur 3, B en C) te bind, maar nie aan gedenatureerde antigeen (Figuur 3D), wat daarop dui dat almal aan konformasie-epitope bind.

Anti-UL16 en anti-UL141 menslike mAbs aktiveer ADCC wanneer antigeen in isolasie uitgedruk word. Alhoewel die mAbs gebind aan UL16 en UL141 wanneer dit geoptimaliseer is vir hoë uitdrukking op die seloppervlak (Figuur 3, B en C), was binding aan die natuurlike vorme nie waarneembaar deur vloeititometrie nie (Figuur 3, E en F, Aanvullende Figuur 1A), wat aandui dat baie lae vlakke van hierdie proteïene natuurlik na die seloppervlak verkeer. Nietemin het ADCC-toetse meer sensitief voorgekom as vloeisitometrie, aangesien die natuurlike weergawes van beide gene ADCC met beide Cytotect en mAbs kon induseer (Figuur 4, A en B).

Menslike anti-UL16 en anti-UL141 mAbs aktiveer ADCC doeltreffend teen adenoviraal uitgedrukte UL16 en UL141. (AD) HFFF-hCARs is getransduseer met RAds wat wildtipe UL16 of UL141 uitdruk. 'N Identiese vektor sonder 'n transgeen is as kontrole gebruik. (A) Persentasie van degranulasie van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van getransduceerde HFFF-hCAR's en Cytotect (40 μg/ml), seronegatiewe IgGs (40 μg/ml), of UL16-spesifieke mAbs (elk teen 30 μg/ml) ml). Al 4 mAbs is by ekwimolêre konsentrasies in die mengsel ingesluit. (B) Soos in A vir UL141. Vyf mAbs is ingesluit teen ekwimolêre konsentrasies in 1 mengsel (B2, D3, G3, G4 en G11), en 8 mAbs is ingesluit by ekwimolêre konsentrasies in 'n ander mengsel (B2, C3, D3, E5, G2, G3, G4, en G11). (C) Persentasie van degranulering van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van getransduseerde HFFF-hCARs en verskillende konsentrasies van die vierwaardige UL16-spesifieke mAb-mengsel. (D) Soos in C vir die vyfwaardige UL141-spesifieke mAb-mengsel. (E en F) HF-TERT's is met HCMV-stam Merlin geïnfekteer. Spot-geïnfekteerde HF-TERTs is ingesluit as kontroles. (E) Persentasie van degranulasie van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van besmette HF-TERT's en Cytotect, seronegatiewe IgG's, of die UL16-spesifieke mAb-mengsel (elk teen 30 μg/ml). (F) Soos in E vir UL141. Resultate is verteenwoordigend van ten minste 3 eksperimente. Data word getoon as die gemiddelde ± SD van drievoudige monsters (AF). Alle eksperimente is 48 uur na transduksie uitgevoer (AD) of infeksie (E en F). *P < 0,05, **P & lt 0,01, ***P & lt 0.001, en ****P < 0,0001, deur 2-rigting ANOVA.

Elke nuwe UL16 mAb kon ADCC maklik dryf teen fibroblaste wat UL16 van wilde tipe uitdruk met 'n doeltreffendheid wat vergelykbaar is met die wat met Cytotect waargeneem is (Figuur 4A). Die vlak van ADCC wat deur verskillende anti-UL16 mAbs ontlok is, was merkwaardig soortgelyk, ten spyte van die diversiteit van hul antigeenbinding (Fab) volgordes. Toe die 5 mAbs by ekwimolêre konsentrasies saamgevoeg is, is die ADCC -effek nie verder as die vlak van elke individuele Ab verbeter nie. Hierdie bevindinge het voorgestel dat elke mAb dieselfde immunodominante epitoop geteiken het met soortgelyke doeltreffendheid, ongeag diversiteit in die ooreenstemmende antigeen-bindende domeine.

In teenstelling hiermee was slegs 2 van die UL141-spesifieke mAbs in staat om ADCC in isolasie te bemiddel, en aktivering was uiters swak (Figuur 4B). Wanneer al 8 gesuiwerde Abs egter teen gelyke konsentrasies saam gemeng is, is ADCC doeltreffend geaktiveer. Drie van die Abs was geneig om nie-spesifieke aktivering teen kontrole-geïnfekteerde selle te ontlok, en daarom het ons 'n mengsel van die ander 5 Abs getoets en gevind dat hulle ewe in staat was om ADCC te aktiveer, maar met verminderde agtergrondvlakke (Figuur 4B). Die feit dat anti-UL141 mAbs hoër degranulasievlakke gestimuleer het as 'n mengsel, dui daarop dat ten minste sommige van hulle aan verskillende epitope op UL141 bind. In dosis-titrasie-eksperimente teen die ooreenstemmende doelwitte, het mengsels van UL16-spesifieke of UL141-spesifieke mAbs maksimum geaktiveerde NK-selle by konsentrasies bo 15 μg/ml (Figuur 4, C en D), wat dui op groter doeltreffendheid in vergelyking met Cytotect (Figuur 1, A en B).

Alhoewel hierdie resultate bemoedigend was in terme van terapeutiese ontwikkeling, kon saamgevoegde mAbs spesifiek vir UL16 of UL141 nie NK -selle aktiveer in die teenwoordigheid van teikens wat met HCMV besmet was nie, alhoewel Cytotect effektief was (Figuur 4, E en F). HCMV kodeer vir 4 Fc-bindende proteïene (FcRs) (RL11, RL12, RL13 en UL119) wat die potensiaal het om ADCC te antagoniseer. Gevolglik het menslike IgG's selle gebind wat met 'n HCMV-mutante stam wat al 4 van hierdie gene (HCMVΔFc) ontbreek, in 'n mindere mate gebind as wat hulle selle gebind het wat met wilde-tipe HCMV besmet is (Aanvullende Figuur 3A). NK -selle is egter onder beide toestande op dieselfde manier geaktiveer in die teenwoordigheid van Cytotect (aanvullende figuur 3B). Die gebrek aan doeltreffendheid van die spesifieke Abs teen HCMV-besmette selle word dus nie veroorsaak deur antagonisme van ADCC deur virale FcR's nie. Dit kan laer proteïenvlakke op die seloppervlak weerspieël tydens HCMV -infeksie in vergelyking met RAd -uitdrukking (aanvullende figuur 3C), of die gesamentlike werking van verskeie viraal gekodeerde immuun evasiene wat NK -aktivering belemmer (30).

Ab engineering stel mAbs in staat om ADCC teen HCMV te aktiveer. 'N Groot voordeel van gekloonde mAbs is dat hulle gemanipuleer kan word om verskillende effektorfunksies te verbeter. Ons het hiervan gebruik gemaak om die mAbs se vermoë om ADCC te aktiveer, te optimaliseer deur 2 veranderings in die aminosuurvolgorde in die Fc -gebied in te voer, wat voorheen getoon is dat dit die binding aan CD16 op NK -selle verbeter (52). In ooreenstemming met vorige data wat aandui dat virus- en gasheer -FcR's Fc op verskillende maniere bind (53), het hierdie wysigings nie die binding aan virale FcR's beïnvloed nie (aanvullende figuur 3, D en E). Dose-titrasie-eksperimente het aan die lig gebring dat mengsels van gemanipuleerde mAbs spesifiek vir UL16 of UL141 NK-selle sterker en met baie laer konsentrasies geaktiveer het as die ooreenstemmende onveranderde mAbs (Figuur 5, A en B) of Cytotect (Figuur 5, C en D). Soos voorheen, al afsonderlik getoets, het al die mAbs teen UL16 ADCC geaktiveer, en ons het geen toename in aktivering waargeneem toe dit gekombineer is nie (Figuur 5E). Anders as die onveranderde weergawes, het al die aangepaste UL141 mAbs ADCC individueel geaktiveer (Figuur 5F). Boonop het hulle die vermoë behou om verbeterde aktivering te toon wanneer dit in kombinasie gebruik word, hetsy as 'n mengsel van 5 of 8 mAbs (Figuur 5F).

Geoptimaliseerde anti-UL16 en anti-UL141 mAbs aktiveer ADCC doeltreffend teen adenoviraal uitgedrukte UL16 en UL141. HFFF-hCARs is getransduseer met RAds wat wildtipe UL16 of UL141 uitdruk. 'n Identiese vektor sonder 'n transgeen is as 'n kontrole gebruik. (A) Persentasie van degranulering van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van getransduseerde HFFF-hCARs en verskillende konsentrasies van inheemse of Fc-gemanipuleerde (gemodifiseerde) UL16-spesifieke mAbs (vierwaardige mengsels). (B) Soos in A vir UL141 (vyfwaardige mengsels). (C) Persentasie degranulering van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van getransduseerde HFFF-hCARs en Cytotect, seronegatiewe IgG's, of tetravalente mengsels van inheemse of Fc-gemanipuleerde (gemodifiseerde) UL16-spesifieke mAbs (inheemse Abs elk by 30) /ml Fc-vervaardigde [gewysigde] mAbs elk by 1 μg/ml). (D) Soos in C vir UL141 (vyfwaardige mengsels). (E) Soos in C vir individuele Fc-gemanipuleerde (gemodifiseerde) UL16-spesifieke mAbs. (F) Soos in D vir individuele FC-gemodifiseerde (aangepaste) UL141-spesifieke mAbs. Resultate is verteenwoordigend van ten minste 3 eksperimente. Alle data word getoon as die gemiddelde ± SD van drievoudige monsters. Alle eksperimente is 48 uur na transduksie uitgevoer. ***P & lt 0,001 en ****P < 0,0001, deur 2-rigting ANOVA. Mod, aangepas.

Vervolgens het ons die doeltreffendheid van die mAbs in die konteks van HCMV -infeksie afsonderlik en in kombinasie getoets. Selfs in hul aangepaste vorm, kon die anti-UL16 mAbs nie ADCC reproduseerbaar aktiveer teen HCMV-besmette selle nie (Figuur 6, A – C). Daarteenoor is ADCC doeltreffend teen HCMV bereik met behulp van die aangepaste anti-UL141 mAbs. Individueel het ons gevind dat hierdie mAb's ADCC slegs baie swak geaktiveer het, maar die kombinasie van 5 Abs was suksesvol om ADCC amper net so effektief as Cytotect te aktiveer, ten spyte daarvan dat dit teen 'n 40-voudige laer konsentrasie gebruik is (Figuur 6, D en E). Hierdie effek was hoogs spesifiek, omdat aktivering nie duidelik was toe 'n virus wat die verwante antigeen ontbreek, gebruik is nie (Figuur 6F). Verder was hierdie Abs ook in staat om NK-selle te aktiveer om TNF-α en IFN-y af te skei, wat kragtige antivirale effektorfunksies aandui in die teenwoordigheid van teikens wat met HCMV geïnfekteer is (Figuur 6, G en H).

Anti-UL141-geoptimaliseerde Abs aktiveer ADCC doeltreffend teen HCMV. HF-TERTs is besmet met HCMV-stam Merlin (AH.) of Merlin ΔUL16 ΔUL141 (C en F). Spot-geïnfekteerde HF-TERTs is ingesluit as kontroles. (A) Persentasie van degranulering van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van geïnfekteerde HF-TERT's en verskillende konsentrasies van Fc-gemanipuleerde (gemodifiseerde) UL16-spesifieke mAbs (vierwaardige mengsel). (B) Persentasie van degranulering van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van geïnfekteerde HF-TERT's en Cytotect (40 μg/mL), seronegatiewe IgG's (40 μg/mL), of Fc-gemanipuleerde (gemodifiseerde) UL16-spesifieke mAbs individueel of in kombinasie getoets (elk teen 1 μg/ml). (C) Persentasie degranulering van CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van besmette HF-TERT's en Cytotect (40 μg/mL), seronegatiewe IgG's (40 μg/mL), of die vierwaardige mengsel van Fc-gemanipuleerde (gemodifiseerde) UL16-spesifieke mAbs (elk by 1 μg/ml). Aktiwiteit is getoets teen HF-TERT's wat met Merlin of Merlin ΔUL16 ΔUL141 besmet is. (D) Soos in A vir UL141 (vyfwaardige mengsel). (E) Soos in B vir UL141. (F) Soos in C vir UL141. (G) Persentasie van intrasellulêre TNF-α-produksie deur CD56 + CD57 + NK-selle onder PBMC's in die teenwoordigheid van besmette HF-TERT's en Cytotect (50 μg/mL), seronegatiewe IgG's (50 μg/mL), of Fc-gemanipuleerde (gemodifiseerde) UL141-spesifieke mAbs afsonderlik of in kombinasie getoets (elk met 1 μg/ml). (H.) Soos in G vir IFN-γ. Resultate is verteenwoordigend van ten minste 3 eksperimente. Data word getoon as die gemiddelde ± SD van drievoudige monsters (AH.). Eksperimente is 48 uur na infeksie uitgevoer (AF). *P < 0,05, **P & lt 0,01, ***P & lt 0.001, en ****P < 0,0001, deur 2-rigting ANOVA.

Laastens het ons die vermoë van ons mAbs ondersoek om direkte doodmaak van selle te bevorder. Deur die korttermyn sitotoksisiteit te meet met behulp van chroom-vrystellingstoetse, is geblyk dat 'n mengsel van 5 gemodifiseerde anti-UL141 Abs gelei het tot 'n aansienlike toename in NK-gemedieerde seldood wanneer UL141 in isolasie uitgedruk is (Figuur 7A), of wanneer fibroblaste met HCMV besmet is (Figuur 7B). Hierdie effek is nie deur seltipe beperk nie, want ons het soortgelyke resultate verkry wanneer HCMV-geïnfekteerde epiteelselle gebruik is (Figuur 7C). Boonop presteer ons gedefinieerde Abs merkbaar beter as Cytotect in hierdie toetse, ondanks die feit dat dit teen 'n laer konsentrasie gebruik is. Interessant genoeg, in teenstelling met in degranulasie -toetse (aanvullende figuur 3B), het die virale FcR's, toe ons sitotoksisiteitseksperimente uitgevoer het, seldood wel beperk, aangesien doodmaak aansienlik verbeter is in hul afwesigheid (figuur 7B). Hierdie effek was egter meer uitgespreek met Cytotect as met ons gemanipuleerde mAbs. Ab -ingenieurswese om NK -selaktivering te verbeter, kan dus ook die funksie verbeter deur virale teenmaatreëls te oorkom. Ons het ook ondersoek ingestel na die vermoë van die UL141 mAbs om die beheer van virus te bevorder met behulp van 'n onlangs ontwikkelde 10-dae virale verspreidingstoets (VDA), wat die gevolge van beide sitotoksiese en nie-sitotoksiese virusbeheer in 'n volledig outoloë stelsel vaslê (Figuur 7, D en E, en verwysings 54, 55). Die UL141 mAbs het 'n opvallende vermoë getoon om NK-gemedieerde virusbeheer in hierdie toets te verbeter, wat bevestig dat hulle as kragtige effektore kan dien vir langtermyn beheer van virusinfeksie, selfs by lae effektor/teiken (E/T) verhoudings.

Anti-UL141-geoptimaliseerde Abs bemiddel doeltreffende doodmaak van HCMV-besmette selle. (AC) 51 Cr vrystelling in die supernatant is gebruik as 'n maatstaf van die vermoë van NK-selle om teikenselle dood te maak. Teikens is gemeng met ex vivo -gesuiwerde NK -selle as effektore in 'n E/T -verhouding van 20: 1, en 51 Cr -vrystelling is 4 uur later gemeet. Seronegatiewe IgG (50 μg/ml), Cytotect (50 μg/ml) of 'n mengsel van 5 Fc-gemodifiseerde (aangepaste) UL141-spesifieke mAb's is ingesluit soos aangedui. Teikens was HF-CAR's wat geïnfekteer is met RAd vektore wat UL141 (RAd-UL141) uitdruk, of wat 'n transgeen ontbreek (RAd Ctrl) (A) HFFF-skyn besmet of besmet met wilde tipe HCMV (HCMV) of HCMV sonder die virale FcR's (ΔFc) (B) of ARPE19 skyn besmet of besmet met wilde tipe HCMV (C). Vir ARPE19 -infeksie is selle 24 uur lank met gesuiwerde fibroblaste gekweek en daarna op suiwerheid gesorteer. Alle eksperimente is 48 uur na infeksie uitgevoer. (D en E) HCMV wat mCherry uitdruk wat gekoppel is aan 'n onmiddellike vroeë geen (UL36), en EGFP gekoppel aan 'n laat geen (UL32), is gebruik om SF's teen 'n lae MOI te besmet. Outoloë NK-selle is dan alleen of saam met 'n kontrole mAb of die mengsel van 5 gemodifiseerde anti-UL141 mAbs (elk teen 1 μg/mL) bygevoeg. Agt tot 10 dae later, die persentasie van besmette selle wat uitdrukking van onmiddellike vroeë (D) of laat (E) virale proteïene is gemeet deur vloeisitometrie vir mCherry of EGFP, onderskeidelik, en genormaliseer tot die persentasie van besmette selle in die afwesigheid van NK-selle. Resultate is verteenwoordigend van ten minste 2 eksperimente. Data word getoon as die gemiddelde ± SD van drievoudmonsters. **P & lt 0,01, ***P & lt 0.001, en ****P < 0,0001, deur 2-rigting ANOVA.

Veelvuldige menslike anti-HCMV mAbs is ontwikkel wat virusneutralisasie teiken as hul meganisme van werking (5, 17, 18, 56 – 58). Alhoewel hierdie mAbs voordele bo HIG bied, deurdat hulle gedefinieerde produkte met 'n spesifieke aktiwiteit is, die hoogs sel-geassosieerde aard van kliniese HCMV-stamme en die intrinsiek groter weerstand teen neutralisasie van sel-tot-sel verspreiding in vergelyking met selvrye toegang beteken dat hul vermoë om verspreiding binne die gasheer te voorkom beperk kan word (25, 26). Daarteenoor ly Ab-gemedieerde aktivering van sellulêre immuniteit nie aan hierdie beperkings nie en is dit betrokke by die beheer van verskeie verskillende virusse, insluitend Wes-Nyl-virus, pokkevirus, herpes simplex-virus, griepvirus, geelkoorsvirus, Ebola-virus, en Epstein-Barr-virus. Dit korreleer ook met die beheer van MIV in beide inenting en natuurlike infeksie (59, 60) en word vermoedelik onderliggend aan die doeltreffendheid van talle antitumor Abs in kliniese ontwikkeling (61, 62). Daar is dus aansienlike belangstelling in die ontginning van hierdie kragtige meganisme van beheer oor veelvuldige patogene en siektes. Dit vereis egter kartering van die antigene wat ADCC optimaal aktiveer en produksie van gekloonde menslike mAbs wat ADCC kan bemiddel. Ons bewys dat plasmamembraanproteomika en funksionele immunologie gekombineer kan word om nuwe ADCC-teikens te identifiseer, maak nie net 'n beter begrip van natuurlike immuniteit teen HCMV moontlik nie, maar kan ook gebruik word vir die ontginning van Ab-gemedieerde aktivering van sellulêre immuniteit in ander aansteeklike siektes, en moontlik selfs kanker.

As 'n virus wat lewenslank voortduur, staar HCMV groot uitdagings in die gesig om te voorkom dat dit deur die immuunrespons skoongemaak word en het as gevolg daarvan 'n buitengewone wye reeks tegnieke ontwikkel om immuunaktivering te beperk (30, 31). Die studie hiervan het besonderhede onthul oor die onderliggende werking van die immuunstelsel, maar toon ook aan dat die virus 'n besondere uitdaging bied vir die ontwikkeling van metodes om antivirale immuniteit te aktiveer. Dit is dus des te meer indrukwekkend dat ons tegnologie die ontwikkeling van Abs moontlik gemaak het wat in staat is om die vermoë van virale immuun-evasines om te keer om NK-selaktivering te inhibeer, selfs wanneer die HCMV-stam die volledige repertorium van gene wat teenwoordig is in 'n kliniese isolaat uitgedruk het (19, 20). , 33). Benewens die kodering van funksionerende immuun-evasins, blyk dit ook waarskynlik dat HCMV ontwikkel het om die uitdrukking van virale proteïene op die seloppervlak te beperk om ADCC tot 'n minimum te beperk. As gevolg hiervan was die uiterste sensitiwiteit van massaspektrometrie nodig om virale sel-oppervlak antigene te identifiseer. Nietemin, alhoewel seloppervlak-antigeenvlakke uiters laag was, is dit duidelik dat ADCC ontwikkel het om buitengewoon sensitief te wees, met Ab-ingenieurswese wat sterk NK-aktivering moontlik gemaak het om plaas te vind ten spyte van Ab-binding wat onopspoorbaar is deur vloeisitometrie, wat die potensiaal van ons pyplyn om te produseer onderstreep. hoogs effektiewe Abs. Die streng spesie-spesifisiteit van CMV's en die feit dat ons primêre teikens (UL16 en UL141) nie in muis- of rot-CMV bewaar word nie, en slegs 32% homologie in rhesus CMV toon, sluit doeltreffendheidstoetsing van ons Abs in dieremodelle uit. Toekomstige werk sal nodig wees om veiligheid en doeltreffendheid by mense aan te toon.

Die keuse van seloppervlakantigeen sal waarskynlik 'n belangrike parameter wees wat die doeltreffendheid van mAbs wat ADCC aktiveer, definieer. Verbasend genoeg was die antigene wat ons geïdentifiseer het as ADCC bemiddel nie die klassieke virale strukturele proteïene waarop ADCC -studies tradisioneel gefokus het nie. Ons vorige proteomika -analise het 5 tydelike klasse virale gene -uitdrukking (45) gedefinieer, met voorbeelde uit verskeie klasse wat op die besmette seloppervlak gevind is. Die doelwit van 48 hpi bied egter 'n aantal voordele. ADCC-aktiwiteit met poliklonale IgG van seropositiewe skenkers was op hierdie tydstip so hoog as wat dit later in infeksie was, wat impliseer dat baie van die antigene wat ADCC-gemedieerde beheer in gesonde individue behartig binne 48 uur teenwoordig is. Nuwe virions het nog nie gevorm nie, wat die kanse verhoog dat selle doodgemaak sal word voordat die virus kan versprei, en die oorvloed van die proteïene wat ons geteiken het, was van die hoogste van enige virale proteïen, op enige tydstip. Daarbenewens, deur te fokus op nie-strukturele proteïene, was daar 'n beperkte risiko van onopsetlike verbetering van siekte deur Ab-afhanklike verbetering (ADE) van infeksie (63). Alhoewel ons UL16 en UL141 geprioritiseer het, kan US28 of RL11 ook nuttige teikens wees as geskikte Abs gegenereer kan word, hoewel dit tans nie eenvoudig is nie. Abs wat veral US28 teiken kan belangrik wees, aangesien US28 tydens latensie uitgedruk word en daar bewyse is dat poliklonale Abs wat hierdie proteïen teiken kan lei tot die vernietiging van latent besmette monosiete via neutrofiel-gemedieerde ADCC (64). Laastens is ons teikenantigene gekies op grond van hul vermoë om ADCC met HIG te aktiveer. Sommige van die ander sel-oppervlak proteïene wat ons geïdentifiseer het, kan ADCC ook effektief bemiddel, maar as dit nie hoë Ab-vlakke veroorsaak tydens natuurlike infeksie nie, sou dit in ons funksionele toetse stilgebly het. Vir hierdie proteïene kan muriene immuniseringstrategieë gebruik word om addisionele ADCC-bekwame mAbs te genereer. Dit is eweneens moontlik dat ons potensiële doelwitte deur ons massaspektrometrie -strategie misgeloop het as die peptiede wat hulle gegenereer het, swak geïoniseer het.

Dit is opmerklik dat al die doelwitte wat in die huidige studie geïdentifiseer is, immuunontduiking -gene is. Onder sy vele rolle, dien US28 as 'n sitokiene sink op die seloppervlak (65). UL141 verminder die sel-oppervlak-uitdrukkingsvlakke van CD112 en CD155 (66, 67), wat ligande is vir die aktiverende NK-selreseptor DNAM1, asook TRAIL-reseptore (68), terwyl UL16 seloppervlakvlakke van ULBP1-3 en MICB, wat bind aan die aktiverende NK -selreseptor NKG2D (69, 70). UL141- en UL16 -verkeer kan na die seloppervlak beweeg om hul doelwitte op te vang. As daar dus virale mutante in vivo ontstaan ​​om Ab -erkenning te ontduik, kan besmette selle meer vatbaar raak vir NK -selgemedieerde immuunbeheer, wat weer die wydverspreide seleksie van sulke mutante kan belemmer. Die gebruik van veelvoudige Abs wat op dieselfde antigeen gerig is, kan ook die keuse van virale ontsnappingsmutasies beperk. Die rye van beide UL141 en UL16 word goed bewaar onder kliniese HCMV -isolate, wat daarop dui dat Abs wat daarop gemik is 'n wye verskeidenheid virusstamme kan beheer (71, 72).

Gekloonde mAbs bied groot voordele bo poliklonale produkte soos HIG. Dit is gedefinieerde produkte met 'n konsekwente spesifisiteit oor tyd, en molekulêre ingenieurswese kan gebruik word om funksionaliteit vir spesifieke doeleindes te optimaliseer. As gevolg hiervan het ons mAbs ADCC geaktiveer by konsentrasies wat meer as 40 keer laer was as dié van Cytotect, iets wat die doeltreffendheid in vivo aansienlik kan verhoog (73). Verder het die opwekking van immunoterapieë teen kanker gelei tot die ontwikkeling van verskeie Ab -optimalisasies, wat nou geskik is vir implementering teen HCMV. Dit sluit in die "bewapening" van Abs met dwelms of gifstowwe, of die omskakeling daarvan in bispesifieke of trispesifieke NK-beoefenaars om ADCC-doeltreffendheid nog verder te verbeter (74). Benewens ADCC, kan oppervlakgebonde Abs ook fagositose-, komplement- en T-selle aktiveer (75) en kan lei tot 'n adaptiewe sellulêre reaksie deur aan FcR's op DC's te bind. Die induksie van sulke meganismes, bykomend tot ADCC, is getoon om effektief te wees om tumorbeheer te bemiddel (61, 62), en modifikasies bestaan ​​om hierdie aktiwiteite verder te optimaliseer (76). Die ontwikkeling van ons mAbs bied dus 'n platform waarmee verskeie aspekte van die immuunstelsel bewapen kan word, wat die doeltreffendheid in vivo nog verder verhoog. Benewens die moontlikheid om geoptimaliseerde Abs vir passiewe infusie te benut, kan die teiken wat ons geïdentifiseer het, ook as deel van 'n entstofstrategie beskou word. Byvoorbeeld, deur inenting met UL141-proteïen, kan dit moontlik wees om 'n poliklonale anti-UL141 Ab-reaksie te genereer, wat verbeterde immuniteit kan verskaf via Fc-gemedieerde effektorfunksies. In hierdie konteks is dit belangrik om die doeltreffendheid van ADCC Abs te bepaal in die beheer van HCMV -infeksie by individue wat verskillende repertore van NK -sel -subgroepe vertoon, insluitend by diegene wat HCMV seropositief of seronegatief is en by individue met 'n groter of kleiner aantal aanpasbare NK -selle .

Ten slotte het ons 'n metodologiese pyplyn ontwikkel wat proteomika kombineer met funksionele immunologie, enkelsellekloning en molekulêre ingenieurswese wat nuwe terapeutiese teikens geïdentifiseer het, wat aan die lig gebring het dat "klassieke" seloppervlakantigene nie noodwendig die optimale doelwitte was wat moontlike probleme met ADE vermy en geproduseer word nie. Abs wat in staat is om teikens te bind en sellulêre immuniteit te aktiveer, ten spyte van die teenwoordigheid van veelvuldige immuun evasines en ten spyte van die feit dat teiken uitdrukkingsvlakke te laag kan wees om deur vloeisitometrie op te spoor. Ons verwag dat ons benadering algemeen van toepassing sal wees op ander patogene en gewasse, beide wat passiewe immunisering en entstofontwerp betref, met breë implikasies vir immunoterapeutiese strategieë buite HCMV. Hier het ons dit egter gebruik om aan te toon dat ADCC 'n buitengewoon kragtige effektormeganisme is om NK-selle teen HCMV-besmette selle te aktiveer. Ons het verskeie seloppervlakteikens geïdentifiseer vir die ontwikkeling van nuwe antivirale immunoterapieë of inentingstrategieë wat ADCC kan aktiveer, en ons het gegenereer wat ons glo die eerste menslike Abs is wat op 'n enkele HCMV-antigeen fokus wat voldoende is om ADCC te aktiveer. Saam glo ons dat hierdie resultate die weg oopmaak vir die ontwikkeling van nuwe immunoterapeutiese strategieë wat verskeie verskillende sellulêre immuniteite kan aktiveer en verbeterde beheer van HCMV in vivo moontlik maak.

Selle. Menslike fetale voorhuidfibroblaste (HFFF's), HFFF's verewig met menslike telomerase omgekeerde transkriptase (HF-TERTs) (77), HF-TERT's wat met die coxsackie adenovirus reseptor (HFFF-hCARs) (78), TERT-onsterflike gesonde donorvelfibblaste (getransfekteer) SF's) en 293 TREX -selle (Thermo Fisher Scientific) is gekweek onder standaardomstandighede in DMEM (Thermo Fisher Scientific) aangevul met 10% FCS, penisillien (100 U/m) en streptomycien (100 μg/ml). Expi293F -suspensieselle (Thermo Fisher Scientific) is in 'n bevochtigde, skudende broeikas gehou by 150 rpm, 37 ° C en 8% CO2 en is gekweek in Gibco Expi293 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific). Ms40L lae selle was 'n geskenk van Garnett Kelsoe (Duke Universiteit, Durham, Noord-Carolina, VSA) en David Baltimore (Caltech, Pasadena, Kalifornië, VSA) (79, 80). Hulle is gehou in DMEM aangevul soos hierbo met die toevoeging van 50 μM β-mercaptoethanol.

Virusse. Alle virusse is afgelei van 'n bakteriële kunsmatige chromosoom (BAC) wat die volledige wilde-tipe HCMV-genoom bevat, met die uitsondering van RL13 en UL128, aangesien die afwesigheid van hierdie gene die stabiliteit in fibroblaste verhoog (20, 81). Mutasies is ontwerp met behulp van rekombinasie of passante mutagenese, soos voorheen beskryf (20, 82 - 85). Die primer rye word in Tabel 1 gelys. Virusse is gegenereer deur transfeksie van BAC's (20) na HF-TERT's en getitreer op HFFF's. Alle veranderings is volgens die volgorde geverifieer voor BAC-transfeksie, en alle virusse is op volgorde van die hele genoom opgevolg na rekonstitusie om die voorkoms van mutasies op die tweede plek uit te sluit (86).

Primer-reekse wat in hierdie studie gebruik is

RA's is gegenereer soos voorheen beskryf (84).Hulle was soos volg: RAd-Ctrl (geen eksogene proteïenkoderende streek nie) RAd-UL141ΔER (wat UL141 uitdruk wat 'n delesie van die sitoplasmiese stert dra en 'n eksogene seinpeptied wat 'n HA-merker na die splitsingsplek bevat) RAd-UL16ΔER (wat UL16 dra 'n verwydering van die sitoplasmiese stert en 'n eksogene seinpeptied wat 'n HA-tag bevat na die splitsingsplek) RAd-sUL141 (wat die ekstrasellulêre domein UL141 uitdruk met 'n C-terminale Strep-tag) RAd-sUL16 (wat die UL16 ekstrasellulêre domein met 'n C uitdruk -terminaal 6xHis-tag) RAd-UL141 (wat die inheemse vorm van UL141 ref. 67 uitdruk) en RAd-UL16 (wat die inheemse vorm van UL16 uitdruk). RA's wat ander HCMV-proteïene uitdruk, is voorheen beskryf (84), en almal het 'n C-terminale V5-epitoopmerker bevat. Alle RAds is gepropageer deur transfeksie van die relevante plasmiede in 293 TREX -selle soos voorheen beskryf (84).

Proteomika. Data oorspronklik gepubliseer deur Weekes et al. (45) is herontleed om die absolute oorvloed van elke sel-oppervlak virale proteïen te skat. Om by hierdie analise ingesluit te word, het proteïene kwantifisering vereis, in beide eksperimente PM1 en PM2, van 2 of meer peptiede in ten minste 1 van die 2 eksperimente. In die algemeen bevat dit 27 van 29 van die virale proteïene wat ons oorspronklik gemeet het. Eksperiment PM1 ondersoek selle wat met stam Merlin besmet is in biologiese duplikate om 0 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur. Heranalise is gebaseer op die gemiddelde waardes vir elke tydstip. Eksperiment PM2 ondersoek selle wat met dieselfde HCMV -stam besmet is in enkele herhalings om 0 uur, 6 uur, 12 uur, 18 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur. In heranalise is die gemiddelde waardes vir tydpunt 0 gebruik, en infeksie met bestraalde HCMV op 12 uur is uitgesluit van analise. In figuur 2A, vir PM2 -eksperimentdata, is die proteïene gegroepeer volgens wanneer meer as 25% van die maksimum sein bereik is. Oorvloed vir elke proteïen is genormaliseer tot 'n maksimum van 1, soos voorheen beskryf (45). Vir Figuur 2B is die metode van intensiteit-gebaseerde absolute kwantifisering (IBAQ) aangepas vanaf die oorspronklike beskrywing (87) om die relatiewe oorvloed van elk van die 27 virale proteïene te skat. Die maksimum MS1 -voorloperintensiteit vir elke gekwantifiseerde peptied is bepaal, en 'n opgesomde MS1 -voorloperintensiteit vir elke proteïen oor alle bypassende peptiede is bereken, met inagneming van data vir eksperimente PM1 en PM2 afsonderlik. Intensiteite is gedeel deur die aantal teoretiese tryptiese peptiede van elke proteïen tussen 7 en 30 aminosuurreste in lengte om geskatte IBAQ -waardes te gee. Vir elk van die eksperimente PM1 en PM2 is die beraamde IBAQ waardes gedeel deur die som van alle waardes om die genormaliseerde IBAQ waardes te gee. Die gemiddelde en omvang van die genormaliseerde IBAQ-waardes vir elke proteïen word in Figuur 2, B en C getoon. Om die proporsie van die gemiddelde genormaliseerde IBAQ-waardes wat by elke tydpunt van infeksie ontstaan ​​het, te bepaal, is die IBAQ-waardes in verhouding tot die genormaliseerde tandem massa tag (TMT) waardes getoon in Figuur 2A.

Proteïen suiwering en etikettering. Oplosbare UL141 en UL16 is geproduseer in HFFF-hCAR's wat oorgedra is met RAd-sUL141 of RAd-sUL16, onderskeidelik, oor 'n tydperk van 10 dae by 'n MOI van 40 PFU/sel. Supernatante is versamel en gesuiwer met behulp van Strep-Tactin (IBA GmbH) of HisTrap HP Columns (GE Healthcare). Beide proteïene is onderworpe aan buffer -uitruiling in PBS en fluorescerend gemerk met behulp van die Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit (Thermo Fisher Scientific).

Ab isolasie. PBMC's is geïsoleer van 'n gesonde HCMV-seropositiewe skenker, en IgG + geheue B selle is geïsoleer met 'n IgG + geheue B sel isolasie kit (Miltenyi Biotec). Die verrykte B -selle is 30 minute lank by 4 o C gekleur met 2 μg/ml Alexa Fluor 647 -gemerkte proteïen (oplosbare UL141 of UL16) en vloei gesorteer met behulp van 'n BD FACSAria III (BD Biosciences). Enkel selle is gesorteer in individuele putte wat Ms40L lae voerselle bevat, 10% FCS, 5% menslike AB serum, IL-4 (10 ng/ml), BAFF (10 ng/ml), IL-21 (10 ng/ml) , en IL-2 (50 ng/ml) in 'n finale volume van 100 μL (alle sitokiene was van Peprotech). Kulture is 1 week later aangevul met 'n bykomende 100 μL van dieselfde medium. Twee weke na kweek is 50 μL supernatant uit elk van die eenselkolonies deur vloeititometrie gesif vir binding aan UL141 (RAd-UL141ΔER) en UL16 (RAd-UL16ΔER). RNA is onttrek uit die selle wat positief was vir binding met behulp van die RNEasy Plus Kit (QIAGEN). Die Ab-volgorde is bepaal deur geneste omgekeerde transkripsie PCR (RT-PCR) soos voorheen beskryf (88). Sekwensies is deur die IgBLAST-instrument ontleed om die V- en J-samestelling van die swaar en ligte kettings te identifiseer, dan PCR geamplifiseer met behulp van spesifieke primers en afsonderlik gekloneer in 'n uitdrukkingsplasmied wat 'n menslike IgG1 konstante domein bevat, verskaf deur Patrick Wilson (Universiteit van Chicago, Chicago, Illinois, VSA) ( 88 ).

Ab ingenieurswese. S239D- en I332E -modifikasies is deur die Gibson -eenheid (52) in die Fc -gebied van elke mAb ingebring. Die 2 fragmente van die plasmied, wat oorvleuelende streke met die gewenste modifikasies bevat, is gegenereer met behulp van die volgende primer rye: 5'-GGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCA-3 'en 5'-GGTTTCTCCTCGGGGGCCTGGAGAGGG-3', of 5'CAGCAGCAGG -CAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA-3 '. Die gevolglike fragmente is saamgestel met behulp van die NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs).

Ab produksie en suiwering. Expi293F -suspensieselle is in korrels geskors, geresuspendeer by 20 × 106 selle/ml en getransfekteer met die relevante lig- en swaarkettingplasmiede in 'n verhouding van 70:30 (1,25 μg/10 6 selle totale plasmied -DNA) met behulp van polyethylenimine (PEI) verdun in ultra suiwer water (3,75 μg/106 selle) en 0,1% Pluronic F-68 (89). Getransfekteerde selle is vir 3 uur gekweek en daarna verdun tot 10 6 selle/ml met Expi293 Expression Medium wat forskolien (10 μM) bevat. Ab-bevattende supernatante is 7 dae na transfeksie versamel.

Beide mAbs en Abs uit die serum van seronegatiewe skenkers is gesuiwer soos voorheen beskryf (88). Kortliks, supernatante is deur 'n 0.45 μm spuitfilter gefiltreer en oornag by 4˚C met proteïen G agarose krale geïnkubeer. Die volgende dag is die kraal-supernatantreaksies vir 2 uur na kamertemperatuur oorgeplaas en dan by 3000 gesentrifugeerg vir 10 minute. Die krale is oorgeplaas na 'n chromatografiekolom, gewas met 5 harsbedvolumes van 1 M NaCl, en twee keer met 2.5 harsbedvolumes PBS geëlueer. Abs is in Tris-HCl, pH 9,0, geëlueer met 2,5 harsbed-volumes glikienbuffer, pH 2,8 (Pierce, Thermo Fisher Scientific), wat verseker dat die finale pH ongeveer 7,0 was. Die Abs is daarna aan bufferuitruiling teen PBS onderwerp.

CD107a -toetse. Degranulasiebepalings is gebaseer op die vloeisitometriese opsporing van CD107a (90). PBMC's is oornag gerus in RPMI aangevul met 10% FCS, penisillien (100 U/ml), streptomisien (100 μg/mL), en l-glutamien (2 mM) in die afwesigheid of teenwoordigheid van IFN-α (1000 U/mL) ). HF-TERTs (allogeen) of SF's (outoloog) is sonder DMV in DMEM geplateer en die volgende dag met HCMV (MOI = 5 PFU/sel) besmet. Die medium is 24 hpi vervang met DMEM wat 10% FCS bevat. Assays is 48 hpi uitgevoer, tensy anders vermeld. Teikens is geoes met behulp van TrypLE Express (Gibco, Thermo Fisher Scientific), vooraf geïnkubeer vir 30 minute met die relevante Ab-preparate, en gemeng met PBMC's teen 'n E/T-verhouding van 10:1 in die teenwoordigheid van GolgiStop (0.7 μL/ml, eBioscience) ) en anti-CD107a – PerCP-Cy5.5 (kloon H4A3, BioLegend). Toetse is in drievoud uitgevoer in U-bodem, 96-put plate teen 'n finale volume van 200 μL/put. Agtergrondaktivering is bepaal in putte wat effektore bevat sonder doelwitte. Selle is vir 5 uur geïncubeer, in koue PBS gewas en gekleur met LIVE/DEAD Fixable Aqua (Thermo Fisher Scientific), anti-CD3-BV711 (kloon UCHT1, BioLegend), anti-CD56-BV605 (kloon 5.1H11, BioLegend) , anti-CD57-APC (kloon HNK-1, BioLegend), en anti-NKG2C-PE (kloon 134591, R&D Systems). In sommige eksperimente is selle ook vasgemaak en deurlaatbaar met Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) en gekleur met anti-TNF-α – BV421 (kloon MAb11, BioLegend) en anti-IFN-γ – PE – Cy7 (kloon B27, BioLegend) . Data is verkry met behulp van 'n Attune NxT Flow Sitometer (Thermo Fisher Scientific) en ontleed met Attune NxT sagteware of FlowJo sagteware, weergawe 10 (Tree Star). Alle toetse is herhaal met monsters van veelvuldige skenkers. Wanneer dit direk ex vivo gebruik word, kan NK-selle van verskillende skenkers aansienlik verskil in die omvang van hul response, dus word slegs eksperimente ingesluit waar resultate konsekwente patrone tussen skenkers getoon het. Skenkers het beide HCMV-seropositiewe en -seronegatiewe individue ingesluit.

Sitotoksisiteitsbepalings van chroom. Toetse is uitgevoer soos voorheen beskryf (91). In kort, teikens is geïnkubeer met 150 μCi natriumchromaat (51 Cr) vir 1 uur, gewas en toegelaat om te loog vir 1 uur, en dan geïnkubeer met gesuiwerde NK selle en Abs. Na 4 uur is supernatante verwyder en gemeng met scintillasievloeistof (Optiphase HiSafe 3, PerkinElmer), voordat die cpm in 'n MicroBeta 2 (PerkinElmer) gelees word. Maksimum lysis is gegenereer met behulp van 2,5% Triton X-100. Spesifieke lise is soos volg bereken: (monster cpm – spontane cpm)/(maksimum cpm – spontane cpm).

Virale verspreidingstoetse. Assays is uitgevoer soos voorheen beskryf (54). Kortliks is SF's besmet teen 'n MOI van 0,05 met 'n virus wat 'n P2A-mCherry-kasset bevat na UL36, en 'n EGFP-etiket wat direk met UL32 saamgesmelt is. By 24 hpi is gesuiwerde ex vivo (NK Isolation Kit, Miltenyi Biotec) outoloë NK-selle bygevoeg teen 'n reeks E/T-verhoudings, in die teenwoordigheid of afwesigheid van Abs. Na 8-10 dae is nie -aanhangende selle afgespoel en weggegooi, en kleefselle is getripsiseer, in 4% PFA vasgemaak en deur vloeititometrie geanaliseer vir mCherry- en/of EGFP -uitdrukking. Om die vlakke van die NK-gemedieerde kontrole te bepaal, is die persentasie fluorescerende selle in die teenwoordigheid van Ab- en NK-selle genormaliseer tot die persentasie fluorescerende selle in die teenwoordigheid van Ab alleen.

Immunoblotting. HFFF-hCARs is getransduseer met RAd-UL141 of RAd-UL16 (MOI = 5 PFU/sel) vir 48 uur. Heelsellisate is versamel en gekook in reduksie-denaturerende Nu-PAGE lysisbuffer (Thermo Fisher Scientific), geskei deur elektroforese in Criterion TGX Gels (Bio-Rad) en oorgedra op nitrocellulosemembrane (GE Life Sciences). Membrane is geblokkeer in TBS-T buffer met 5% gedroogde vetvrye melk en bevlek met anti-V5 (kloon CV5-Pk1, Bio-Rad) of anti-aktien (A2066, MilliporeSigma) Abs. Proteïene is gevisualiseer met SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) en afgebeeld op 'n GBOX-Chemi-XX6 gel dokumentasie stelsel (Syngene) wat GeneSys sagteware bedryf.

Studiegoedkeuring. Gesonde volwasse skenkers het skriftelike ingeligte toestemming gegee vir die versameling van veneuse bloedmonsters en dermale fibroblaste volgens die beginsels van die Verklaring van Helsinki. Studiegoedkeuring is verleen deur die Cardiff University School of Medicine Research Ethics Committee (verwysingsnommer 16/52).

Statistiek. Statistiese betekenis is bepaal met behulp van 'n 1- of 2-rigting ANOVA, soos toepaslik, met Sidak se posttoetse. A P waarde van 0,05 of minder is as betekenisvol beskou.

VMV, IM, RJA, KL, DAP, AJD, GWGW, MRW, ECYW en RJS ontwerp eksperimente. VMV, IM, LZ, RJA, EL, MRW, KLM, NMS, MPW en RJS het eksperimente uitgevoer en data ontleed. VMV, DAP, AJD, GWGW, MPW, ECYW en RJS het die manuskrip geskryf.

Hierdie werk is ondersteun deur befondsing van die Wellcome Trust (100326/Z/12/Z, 204870/Z/16/Z, 108070/Z/15/Z) en die Mediese Navorsingsraad (MNR) (MR/S00971X/1, MR/L008734/1, MR/P001602/1, MC_UU_12014/3, MR/S00081X/1. LZ is befonds deur 'n toekenning van Kymab, maar Kymab het geen rol gespeel in die ontwerp, uitvoering of ontleding van die eksperimente wat in Die grafiese opsomming is gemaak met behulp van BioRender.

Konflik van belange: Die teenliggaampies wat in hierdie manuskrip beskryf word, is die onderwerp van 'n patentaansoek met die titel "Anti-viral therapeutics" (patent nr. GB2101066.5).

Kopiereg: © 2021, Vlahava et al. Dit is 'n oop toegangsartikel wat gepubliseer is onder die voorwaardes van die Creative Commons Attribution 4.0 International License.