Inligting

Hulp met die voorbereiding van Congo Red TSA

Hulp met die voorbereiding van Congo Red TSA


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

So ek wil Kongo Rooi TSA maak. My instrukteur het 'n paar wenke gegee, maar ek het nog 'n paar vrae:

  1. Ek begin deur twee voorraadoplossings te maak: 20 mg/ml kongerooi en coomassie in twee verskillende valkbuise. Sou ek 600 mg in steriele water oplos om 30 ml van elk te berei?
  2. Die finale konsentrasie in 'n 500 ml TSA -oplossing moet 40 μl/ml CR en 20 μg/ml coomassie wees. Hoe bereken ek die hoeveelheid oplossing wat nodig is vir die TSA?

1) Ja, dit is korrek.

2) Dit is net 'n eenvoudige kwessie van die toepassing van die vergelyking $C_1V_1=C_2V_2$. Vir kongo rooi:

  • $ C_1 = 20 frac {mg} {ml} $
  • $ C_2 = 0.04 frac {mg} {ml} $
  • $ V_2 = 500 ml $

Ek is seker jy en 'n sakrekenaar kan die res uitvind.


Aseptiese laboratoriumtegnieke: Plateringsmetodes

Mikroörganismes is teenwoordig op alle lewelose oppervlaktes wat oral bronne van moontlike besmetting in die laboratorium veroorsaak. Eksperimentele sukses berus op die vermoë van 'n wetenskaplike om werkoppervlaktes en toerusting te steriliseer, asook om kontak van steriele instrumente en oplossings met nie-steriele oppervlaktes te voorkom. Hier bied ons die stappe aan vir verskeie plaatmetodes wat gereeld in die laboratorium gebruik word om mikroörganismes soos bakterieë en fage te isoleer, voort te plant of op te tel. Al vyf metodes sluit aseptiese tegniek in, of prosedures wat die steriliteit van eksperimentele materiale handhaaf. Prosedures wat beskryf word, sluit in (1) streep-platering van bakteriële kulture om enkelkolonies te isoleer, (2) giet-platering en (3) verspreiding-platering om lewensvatbare bakteriese kolonies op te som, (4) sagte agar-bedekkings om fage te isoleer en plate op te tel, en ( 5) replika-platering om selle van een plaat na 'n ander oor te dra in 'n identiese ruimtelike patroon. Hierdie prosedures kan op die laboratoriumbank uitgevoer word, mits dit nie-patogene stamme van mikroörganismes behels (bioveiligheidsvlak 1, BSL-1). As daar met BSL-2-organismes gewerk word, moet hierdie manipulasies in 'n bioveiligheidskabinet plaasvind. Raadpleeg die mees onlangse uitgawe van die Bioveiligheid in Mikrobiologiese en Biomediese Laboratoria (BMBL) asook Gegewensblaaie vir materiaalveiligheid (MSDS) vir aansteeklike stowwe om die biogevaarklassifikasie te bepaal sowel as die veiligheidsmaatreëls en inperkingsfasiliteite wat benodig word vir die betrokke mikro-organisme. Bakteriese stamme en faagvoorraad kan verkry word van navorsingsondersoekers, maatskappye en versamelings wat deur spesifieke organisasies soos die Amerikaanse tipe kultuurversameling (ATCC). Dit word aanbeveel dat nie-patogene stamme gebruik word by die aanleer van die verskillende plaatmetodes. Deur die prosedures te volg wat in hierdie protokol beskryf word, behoort studente in staat te wees om: ● plateringsprosedures uit te voer sonder om media te besoedel. ● Isoleer enkele bakteriese kolonies volgens die streep-plateringsmetode. ● Gebruik giet- en strooi-metodes om die konsentrasie van bakterieë te bepaal. ● Voer sagte agar -oorleggings uit wanneer u met fage werk. ● Dra bakteriese selle oor van een plaat na 'n ander met behulp van die replikasieprosedure. ● Gegewe 'n eksperimentele taak, kies die toepaslike plateringsmetode.


Abstrak

Patogeniese biotipes van Yersinia enterocolitica (serotipes O: 3, O: 8, O: 9 en O: 13), maar nie omgewingsbiotipes nie (serotipes O: 5, O: 6, O: 7,8 en O: 7,8,13,19 ), het hul deurlaatbaarheid vir hidrofobiese probes verhoog wanneer hulle by pH 5.5 of in EGTA-aangevulde (Ca 2+ -beperkte) media by 37ଌ gekweek is. 'N Soortgelyke waarneming is ook gemaak toe verteenwoordigende stamme van serotipes O: 8 en O: 5 getoets is na kort kontak met menslike monosiete. Die toename in deurlaatbaarheid was onafhanklik van die virulensie plasmied. Die rol van lipopolisakkaried (LPS) in hierdie verskynsel is ondersoek deur gebruik te maak van Y. enterocolitica serotipe O: 8. LPS-aggregate van bakterieë wat in suur of EGTA-aangevulde sous gekweek is, het meer opgeneem N-fenielnaftielamien as LPS -aggregate van bakterieë wat in standaard sous gegroei het, en toon ook 'n merkbare toename in die asielketting -vloeibaarheid wat korreleer met die deurlaatbaarheid, soos bepaal deur metings verkry in die teenwoordigheid van hidrofobiese kleurstowwe. Geen betekenisvolle veranderinge in O-antigeen polimerisasie is waargeneem nie, maar lipied A asilering het verander na gelang van die groeitoestande. In standaardmedium by 37 ଌ was daar hexa-, penta- en tetraasiellipied A-vorms, en die pentaasielvorm was dominant. Die hoeveelheid tetraasiellipied A het toegeneem in EGTA-aangevulde en suur media, en heksaasiellipied A het byna verdwyn onder laasgenoemde toestande. Ons resultate dui daarop dat patogene Y. enterocolitica stamme moduleer lipied A -asilering koördinaat met die uitdrukking van virulensie -proteïene, wat die verpakking van LPS verminder en die deurlaatbaarheid van die buitenste membraan verhoog. Die veranderinge in deurlaatbaarheid, LPS-asielkettingvloeibaarheid en lipied A-asilering in patogeniese Y. enterocolitica stamme benader die eienskappe in Yersinia pseudotuberkulose en Yersinia pestis en stel voor dat daar 'n gemeenskaplike buitenste membraanpatroon is wat verband hou met patogenisiteit.

Die yersiniae is gram-negatiewe bakterieë wat tot die familie behoort Enterobacteriaceae. Die genus Yersinia omvat nie -patogene spesies wat meestal in die omgewing voorkom, twee patogene spesies (Yersinia pseudotuberkulose en Yersinia pestis), en Yersinia enterocolitica, wat tipies omgewingsstamme sowel as stamme insluit wat, hoewel hulle in die omgewing kan vermeerder, mesenteriese limfadenitis, diarree en enteritis by mense veroorsaak. Die twee soorte Y. enterocolitica stamme kan bakteriologies en serologies onderskei word. Vyf biogroepe (en twee subgroepe van biogroep 1) en verskeie serotipes word erken die omgewingsstamme groepeer in biogroep 1A, en die patogeniese stamme is lede van biogroepe 1B, 2, 3, 4 en 5 en behoort tot 'n relatief min serotipes (serotipes) O:3, O:4, O:5,27, O:8, O:9, O:13 en O:21) (8). Die opvallendste verskil is egter dat die patogene stamme 'n plasmied (pYV) dra wat kodeer vir virulensie proteïene, soos die Yersinia buitenste proteïene (Yops) en die Yersinia adhesin A (YadA), wat fagositose, opsonisering en komplementaktivering blokkeer (13, 16, 23). Die patogene stamme druk ook chromosomaal gekodeerde virulensiefaktore uit, insluitend die Yersinia enterotoksien (Yst), slymvormend Yersinia faktor (Myf), invasin (Inv), en aanhegting-inval (Ail) proteïene wat verband hou met indringing en serum weerstand (22, 44). Aangesien hierdie bakterieë van die omgewing na die ingewande beweeg en dan deur M -selle na aangrensende weefsels beweeg, is dit nie verbasend dat die uitdrukking van die virulensie -gene opeenvolgend aan- en afgeskakel word deur een of meer seine wat as landmerke dien vir die miljoene wat hulle teëkom nie. (44). Gevolglik word pYV-gekodeerde proteïene uitgedruk by 37 ଌ (die liggaamstemperatuur van die gasheer), en die uitdrukking van Yops vereis ook bakterie-eukariotiese selkontak of, in vitro, beperkte Ca 2 + beskikbaarheid (9, 11, 44) . Uitdrukking van Yst en Inv in vitro is hoër by 23 ଌ en in die stilstaande fase, maar beide proteïene word ook uitgedruk by 37 ଌ onder voldoende osmolariteit en pH -toestande. Ail en Myf word uitgedruk by 37 ଌ en word ook gereguleer deur onderskeidelik suurstofspanning en pH (23).

Benewens hierdie klassieke virulensie faktore, Y. enterocolitica patogene stamme verskil van omgewingsstamme in sommige eienskappe van die buitenste membraan (OM). As hierdie bakterieë by 37 ଌ groei, is die OM's van die patogene stamme meer bestand teen bakteriedodende peptiede as die OM's van die omgewingsstamme (4). Boonop word die OM's van die patogene stamme deurdringbaar vir hidrofobiese sondes in Mg 2 + oksalaatmedium (gebruik om die lae Ca 2 + toestande te genereer wat pYV-uitdrukking in vitro veroorsaak), terwyl die OM's van die omgewingsstamme nie ( 4). 'N Aanvullende feit is dat in dieselfde Mg 2 + oksalaatmedium ook 'n toename in deurlaatbaarheid waargeneem word in pYV-geneesde patogene stamme (4), wat daarop dui dat die faktore wat pYV-uitdrukking veroorsaak, OM-struktuur en fisiologie op chromosomale vlak moduleer. Hierdie waarnemings word meer interessant as die feit dat Y. pseudotuberculosis en Y. pestis OM's is deurlaatbaar vir hidrofobiese verbindings in standaardmedia word oorweeg (3), en daarom is dit moontlik dat deurlaatbaarheid vir hidrofobiese verbindings 'n eienskap is wat deur alle patogene Yersinia spp. wat gereguleer word in patogeniese Y. enterocolitica. In die huidige studie het ons hierdie hipotese ondersoek deur die effekte van suur pH, Ca 2 + beperking en kontak met menslike monosiete op die deurlaatbaarheid van Y. enterocolitica na hidrofobiese sondes. Aangesien dit ook bekend is dat die deurlaatbaarheidsversperring ten minste gedeeltelik verband hou met die eienskappe van die OM lipopolysakkaried (LPS) (46, 47), het ons hierdie molekule ook ondersoek vir chemiese en fisies -chemiese veranderinge wat verband hou met veranderings in deurlaatbaarheid. Ons meld hier dat dit patogeen is Y. enterocolitica stamme verander die OM-deurlaatbaarheid en lipied A-samestelling in reaksie op faktore wat bekend is om die uitdrukking van Yersinia virulensieproteïene wat óf pYV óf chromosomaal gekodeer is.


Vlekke

Nie net is die meeste bakterieë baie klein nie, hulle is ook baie duidelik en moeilik om onder 'n mikroskoop te sien sonder om eers te kleur. U moet u bakterieë stewig aan 'n glasplaat vasmaak voordat u dit kan vlek. Daar is twee belangrike dinge wat u moet oorweeg wanneer u 'n skyfie vir kleuring voorberei:

  1. Die bakterieë moet eweredig en lig versprei word. As daar te veel bakterieë op die skyfie is, sal hulle 'n groot bol vorm en jy sal nie die morfologie van die individuele selle kan sien nie. Groot selle vlekke is ook nie behoorlik vlek nie en kan verkeerde resultate lewer as gevolg van die onbehoorlike kleuring.
  2. Die bakterieë moet stewig aan die skyfie vasgemaak word sodat hulle nie tydens die kleurprosedures afgewas word nie. Alle prosedures wat die bakterieë aan die skyfie heg, lei tot morfologiese veranderinge. Die selle krimp tipies in grootte en sal 'n paar veranderinge in vorm en ekstrasellulêre matrikse vertoon.

Jy sal skyfies voorberei vir kleuring van beide sous- en agar-oppervlaktes. Alhoewel die doelwitte dieselfde is vir beide, eweredig en liggies verspreide selle wat stewig aan die skyfoppervlak geheg is, is die tegnieke effens anders. Verf is net soveel kuns as wetenskap. Dit sal ongetwyfeld verskeie pogings neem voordat u suksesvol is.

Materiaal

  • Maak glasplate skoon
  • Ent lusse of naalde
  • Steriele water
  • Merkpen
  • Verskeie sous en bordkulture

Veiligheidsoorwegings

Wees versigtig vir aërosols wanneer bakterieë van jou lus na die skyfie oorgedra word. Die lus is baie buigsaam en dit is maklik om 'n lus vol organismes af te haal. Moenie aanvaar dat u organisme dood is nie. Hitte- of metanolfiksasie is nie gewaarborg om die organisme dood te maak nie. Gooi jou voltooide skyfies weg in die ontsmettingsmiddel emmer by jou bank.

Algemene oorwegings

Jy streef na 'n ligte suspensie van selle wat 'n dowwe bewolkte neerslag op jou skyfie sal laat. U het baie ruimte op u skyfie, gebruik dit! Dit help om aanvanklik 'n sirkel aan die onderkant van die skyfie te teken, sodat u weet waar u die smeer moet soek. Dit is baie maklik om deurmekaar te raak aan watter kant van die skyfie u smeer is. Maak seker dat jy die verste rand van die skyfie merk. Doen dit konsekwent aan dieselfde kant van die skyfie om jou skyfie te help oriënteer.

Wees geduldig en neem die tyd om jou skyfie in die lug te laat droog word voordat jy voortgaan om dit aan die skyfie vas te plak. As jou skyfie nat is en jy dit hitte regmaak, sal die bakterieë kook en die sellulêre morfologie sal verlore gaan. As jou skyfie nat is en maak dit in metanol vas, sal dit heel waarskynlik van die skyfie afwas. Smere wat te dik is, sal heel waarskynlik van die skyfie afwas ongeag die fiksasiemetode.

Smeer van sous

Souskulture is gewoonlik makliker om mee te werk omdat die selle reeds in die sous verdun is. Maak seker dat jy die kultuurbuis versigtig meng om die bakterieë in die sous op te skort.

  1. Benoem jou skyfie. Dra 'n lus vol organisme asepties oor na die middel van jou skyfie.
  2. Gebruik die plat deel van die lus om die sousdruppel rondom die skyfie te smeer. Gebruik 'n sirkelvormige beweging om die druppel te versprei. Omdat die sous vol proteïene is, bly die smeer gewoonlik versprei en vorm dit nie op die oppervlak van die skyfie nie.
  3. Sit die skyfie eenkant sodat dit aan die lug droog word. Dit sal ten minste 'n paar minute neem. Moenie hierdie stap haas nie.

Smeer van bord

Jy kan baie organismes met jou lus afskep. Jy sal dalk 'n inentingsnaald wil gebruik om jou organisme na die skyfie oor te dra. Gebruik steriele water om u monsters te verdun. Gereelde kraanwater of die gedeïoniseerde water in jou spoelbottels is dikwels met bakterieë besmet.

  1. Benoem jou skyfie. Dra asepties 'n lus vol steriele water na die middel van die skyfie.
    • Dit dien om u bakterieë te verdun en om iets te versprei.
  2. Kies 'n goed geïsoleerde kolonie.
  3. Prik dit met jou steriele naald, of skep die rand van die kolonie effens met jou steriele lus.
  4. Plaas jou naald/lus in die middel van die druppel en met 'n spiraalvormige sirkelbeweging versprei die bakterieë op die skyfie.
  5. Sit die skyfie eenkant sodat dit aan die lug droog word. Dit sal ten minste 'n paar minute neem. Moenie hierdie stap haas nie.

Fiksasie

Die fiksasieprosedure is dieselfde ongeag die smeerbron, bord of sous. Daar is twee metodes om jou bakterieë aan die skyfie te heg, hittefiksasie of metanolfiksasie. Hittebinding word slegs met BSL1 -organismes gebruik. Die organismes waarmee ons gaan werk is BSL2, so jy sal die metanolfiksasietegniek moet gebruik. Deur hitte vas te maak, kan aërosols ontstaan, en met BSL2 -organismes moet ons dit soveel as moontlik voorkom. Metanolfiksasie veroorsaak minder veranderinge in sellulêre morfologie en veroorsaak geen aërosols nie.

Wees versigtig as u met metanol werk, as u vergeet dat u dit met metanol reggemaak het en u skyfie nie heeltemal droog is nie, word die oorblywende metanol aan die brand.

Metanolbevestiging (BSL2)

  1. Maak seker jou skyfie is heeltemal droog. Sit dit op die vlekrak oor die wasbak.
  2. Spoel die skyfie versigtig met 95% metanol. Laat dit vir twee minute sit.
  3. Kantel die skyfie en gooi die metanol af.
    • Raak die rand van die skyfie met 'n papierhanddoek om die oortollige metanol af te vee.
  4. Sit die skyfie eenkant sodat dit aan die lug droog is voordat dit vlek.

Eenvoudige vlek

Eenvoudige vlekke is net dit - voeg een vlek by 'n vaste smeerskyfie, laat dit sit, spoel dit af, laat dit droog word en kyk. Dit is 'n vinnige prosedure om die teenwoordigheid en morfologie van bakterieë in kliniese monsters soos ontlasting en afskeidings te bepaal.

Metileenblou word gebruik om die morfologie van fusiforme en spirochete by orale infeksies te bepaal. Dit is ook die vlek van keuse vir die identifisering van die metakromatiese korrels in Corynebacterium diphtheriae. Die korrels sal 'n duidelik dieper blou kleur as die omliggende blou bakterieë. Ander spesies van Corynebacterium het nie die metakromatiese korrels nie. Enige basiese kleurstowwe, soos metileenblou, kristalviolet, malachietgroen of safranien, werk goed.

Basiese (kationiese of positief gelaaide) kleurstowwe bind aan negatief gelaaide komponente in die selmembraan en sitoplasma.

Materiaal

  • Metileen blou
  • Safranin
  • Kristalviolet
  • Malachiet Groen
  • Vlek rakke
  • Mikro gereedskapskaste
  • Voorbereide smeerskyfies

Algemene oorwegings

Vlek is deels kuns en deels wetenskap. Daar is geen vinnige reëls vir vlekke en spoeltye nie. Die tye gelys is voorstelle wat gewoonlik goed werk. Jy sal moet eksperimenteer met wat werk vir die bakterieë wat jy het en die tegnieke wat jy gebruik.

Dit is noodsaaklik dat u presies aanteken wat u doen en die resultate wat u in u laboratoriumboek waarneem. U sal hierdie vlekke later in die semester herhaal en u wil nie u tyd mors met die uitvinding van u suksesvolle kleurprosedure nie. Dit sal nuttig wees vir elke lid van die laboratoriumbank om 'n ander vlek te kies sodat jy kan sien hoe hulle almal lyk.

Eenvoudige vlekprosedure

  1. Plaas u noukeurig voorbereide vlekke op die vlekrak oor die wasbak.
    • Doen een skyfie op 'n slag.
    • Bedek die besmetting met enige van die basiese kleurstowwe wat u beskikbaar het.
    • U benodig net genoeg kleurstof om die besmetting te bedek. Die vlek moet nie van die skyfie drup nie.
  2. Laat die vlek vir 1-5 minute staan.
  3. Gebruik die wasgoedpenner, gryp die lang punt van die skyfie, kantel die skyfie oor die wasbak en spoel die vlek af met 'n stroom water uit die wasbottel.
    • Maak seker dat jy bo die smeer spuit en laat dit afdrup.
    • As u die spuit direk spuit, sal u die besmetting van die skyfie kan was.
    • Spoel af totdat die water helder is of net effens gekleur is.
  4. Raak die rand van die skyfie met 'n papierhanddoek om oortollige water te verwyder. Jy kan dit nou in die lug laat droog word. Alternatiewelik kan u dit met kladpapier droogmaak deur dit in die papier te plaas en liggies te druk. Alhoewel hierdie metode vinniger is, kan jy ook 'n swak gehegte smeer afvee.
  5. Kyk na u skyfie onder onderdompeling in olie en teken u waarnemings op in u laboratoriumboek.
  6. Gooi jou gebruikte gevlekte skyfies weg in die ontsmettingsmiddel emmer in die wasbak.

Negatiewe vlek

Negatiewe vlekke is selfs eenvoudiger as eenvoudige vlekke, want jy hoef nie ’n smeer te maak nie. 'N Druppel selle word op 'n skyfie versprei en sonder fiksasie bekyk. Die vlek is 'n suspensie van koolstof, wat in Indiese ink of nigrosien voorkom. Die koolstofdeeltjies is negatief gelaai, net soos die selmembraan. Die agtergrond lyk swart of sepia -gekleurd en die selle bly duidelik, aangesien dit die kleurstof afweer.

Sommige positief gelaaide insluitingsliggame, soos swael, kan vlek. Hierdie vlek gee akkurate inligting oor selmorfologie en kapsule-teenwoordigheid omdat die selle nie vas is nie. Selgrootte lyk effens groter omdat ekstrasellulêre bedekkings of afskeidings aan die buitekant van die selmembraan ook nie vlek nie. Negatiewe vlekke is nuttig vir vinnige bepaling van die teenwoordigheid van Cryptococcus neformans, die veroorsakende middel van cryptococcisis, in serebrale rugmurgvloeistof. Hierdie tegniek word ook gebruik wanneer u endospore en kapsules vlek.

Materiaal

Algemene oorwegings

Net soos om 'n smeer voor te berei, benodig u slegs 'n klein hoeveelheid organisme. As jy te veel organismes het, sal jy nie die morfologie van individuele selle kan sien nie. Dit is ook belangrik om nie te veel nigrosien te gebruik nie. As dit te dik is, sal die agtergrond 'n gebarste voorkoms hê, soortgelyk aan modderplasse wat in die son droog word. Jy wil 'n ligte film kry. Jou instrukteur sal hierdie tegniek vir jou demonstreer.

Negatiewe kleuringsprosedure

  1. Benoem jou skyfie. As jy van 'n souskultuur werk, plaas 'n lus vol organismes ongeveer driekwart van die pad aan die linkerkant van die skyfie. As jy van 'n plaatkultuur werk, voeg 'n druppel steriele water by die skyfie en verdun jou organisme in die druppel sonder om die druppel te versprei.
  2. Sit een of twee druppels nigrosien op 'n ander skyfie. Gebruik u gesteriliseerde lus om 'n lus vol nigrosien op te tel. Meng dit versigtig met die druppel selle, sonder om die druppel te veel te versprei.

  1. Hou die regterkant van die skyfie in u regterhand vas met u linkerhand, neem nog 'n skyfie in 'n hoek van 45 ° of minder na die eerste skyfie, net verby u nigrosien-/selval.
  2. Skroef die skuins skuif terug langs die oppervlak van die eerste skyfie tot dit vasgemaak is net raak aan die druppel nigrosin en selle. Wag vir kapillêre aksie om die vloeistof langs die voorrand van die skuins skyfie te trek.
  3. Druk die skuins skyfie oor die oppervlak van die plat skyfie. Die meeste van die nigrosin moet steeds op die oorspronklike plek gelaat word. Gooi die skyfie in die ontsmettingsmiddel emmer weg.
  4. Plaas die gekleurde skyfie eenkant om dit aan die lug droog te maak voordat u dit onder olie onderdompel. Maak seker dat u u skyfie in die omgewing met die geringste grys agtergrond begin ondersoek.
  5. Teken u waarnemings op in u laboratoriumboek.
  6. Gooi jou gebruikte gekleurde skyfie in die ontsmettingsmiddel emmer weg.

Spesiale nota

Nigrosin kom baie maklik van die skyfie af en op jou oliedompellens. Maak seker dat u u olielens deeglik skoonmaak as u klaar is. Maak dit dan weer skoon. Sodra dit op die lens droog word, is dit baie moeilik om te verwyder en sal jou vermoë (en die ander mikrostudente wat daardie omvang gebruik) benadeel om duidelik uit die lens te sien.

Gram Vlek

Die Gram-vlek is die mees algemene differensiële vlek wat in mikrobiologie gebruik word. Differensievlekke gebruik meer as een kleurstof. Die unieke sellulêre komponente van die bakterieë sal bepaal hoe hulle op die verskillende kleurstowwe sal reageer. Die Gram -vlekprosedure is basies onveranderd sedert dit die eerste keer in 1884 ontwikkel is. Byna alle bakterieë kan in twee groepe verdeel word, Gram -negatief of Gram -positief. 'N Paar bakterieë is gram veranderlik. Trichomonas, Strongyloidessommige swamme en sommige protosoë siste het ook 'n Gram -reaksie. Baie klein bakterieë of bakterieë sonder 'n selwand, soos Treponema, Mykoplasma, Chlamydia, of Rickettsia het geen gram reaksie nie. Die karakterisering van enige nuwe bakterieë moet hul gramreaksie insluit.

Tipies het 'n differensiële vlek vier komponente die primêre vlek, 'n beitsmiddel wat die vlek stel, 'n ontkleurmiddel om die primêre vlek te verwyder, en 'n teenvlek. In die Gram -vlek is die primêre vlek kristalviolet. Dit gee die sel 'n intense pers kleur. Die mordant, jodium, vorm 'n kompleks met die kristalviolet in die selwand. Die sel word dan gewas met óf Gram se ontkleurmiddel óf 95% etanol. Gram-positiewe selle sal die kleurstofkompleks behou en pers bly. Die kleurstof spoel uit in gram-negatiewe selle. Die teenvlek, safranien, word gebruik om die selle wat die primêre vlek verloor het, te kleur, anders sou hulle kleurloos bly en sou u dit nie kon sien nie.

Die groot jodium-kristalvioletkompleks word binne die selwande van gram-positiewe selle behou as gevolg van die molekulêre struktuur van die baie lae peptidoglycan in die selwand. Daar is baie verknoopte teichoïensure en die jodiumverfkompleks kan nie fisies uitkom nie. Daar is ook minder lipied in die membraan en die verkleuringsmiddel kan ook nie daarby uitkom nie. Gram-negatiewe selle het 'n buitenste membraan en slegs een laag peptidoglikaan, met meer lipied. Die kristalviolet kleurstof word maklik uitgespoel.

Algemene oorwegings

Die akkuraatheid van die Gram -vlek hang af van die integriteit van die bakteriese selwand. Daar is 'n verskeidenheid dinge wat die selwandintegriteit kan beïnvloed ou selle (dws kulture ouer as 24 uur), die monster is van iemand wat behandel is met antibiotika wat daardie selwand soos penisillien teiken, die selle is rofweg hanteer of jy oor hitte het hulle reggemaak. Onder hierdie omstandighede sal gram-positiewe selle as gram-negatief uitkom. As u te lank ontkleur, sal Gram-positiewe selle soos Gram-negatiewe selle lyk. Omgekeerd, as jy nie genoeg verkleur nie, sal Gram-negatiewe soos Gram-positiewe lyk. Die enigste manier waarop jy jou resultate kan vertrou, is om altyd 'n bekende Gram-positiewe en 'n bekende Gram-negatiewe op dieselfde skyfie te laat loop. As dit vlek soos voorspel, kan u seker wees dat die resultaat van u onbekende monster betroubaar is.

Die Gram -kleuring verg oefening om reg te kom. Moenie verwag dat u 'n goeie Gram -vlek met u eerste probeerslag kry nie. Dit is 'n goeie idee om u skyfie met 'n speld vas te hou, en u handskoene word baie psigedelies, net soos alles wat u aanraak!

Gramvlekprosedure

  1. Benoem jou skyfie. Berei jou smere op 'n skyfie voor met 'n Gram-negatief aan die linkerkant, jou onbekende in die middel en 'n Gram-positief aan die regterkant.
    • Moenie vergeet om met methanol u skyfie reg te maak nie!
  2. Plaas u skyfie op die vlekrek en bedek die vlekke vir 1 minuut met kristalviolet.
    • Gebruik net genoeg vlek om die vlek volledig te bedek, maar nie soveel dat dit van die skyfie afloop of drup nie.
  3. Kantel die skyfie en gooi die kristalviolet af en spoel kort met water uit jou wasbottel.
    • Onthou om nie direk op die vlekke te spuit nie, anders spoel u dit af.
  4. Oorstroom die skyfie met jodiumbeitsmiddel vir 1 minuut.
  5. Kantel die skyfie, gooi die oortollige jodium af en ontkleur liggies met Gram se ontkleurmiddel totdat dit net begin helder word.
    • Dit is die moeilike deel!
  6. Kantel jou skyfie op 'n paar papierhanddoeke om oortollige ontkleurmiddel te verwyder.
  7. Oorstroom u skyfie met die safranin vir 1 minuut.
  8. Kantel die skyfie om die oortollige safranien af ​​te gooi en spoel liggies met water af totdat dit helder is.
  9. Laat die skyfie lug droog word
  10. Let op onder onderdompeling met olie.
    • Die Gram positiewe kontrole moet pers wees en die Gram negatiewe kontrole moet pienk wees.
  11. Gooi jou gebruikte skyfie in die ontsmettingsmiddel emmer weg.

Rooi kapsule vlek in Kongo

Die Congo Red Capsule -vlek is 'n wysiging van die negro -negatiewe vlek wat u voorheen gedoen het. Die bakterieë neem die kongo -rooi kleurstof op, en die agtergrond word dan met suur -fuchsin -kleurstof gekleur. Die kapsule- of slymlae, hoogs gehidreerde polimere, sluit beide kleurstowwe uit. Die agtergrond sal blou verskyn, die bakteriese selle sal pienk lyk, en die duidelike stralekrans is die kapsules.

Klinies is die kapsules van sommige hoogs patogene bakterieë (dit wil sê: pneumokokke, Hemophilis influenzae, en meningokokke), kan onderskei word met die gebruik van antisera spesifiek vir die tipe kapsule. Die bakterieë word in die antisera gesuspendeer en dan met metileenblou gemeng. In die antisera-kleurprosedure sal die bakterieë blou voorkom, omring deur 'n duidelike stralekrans en dan omring deur 'n dun blou lyn waar die antisera aan die kapsule geheg het.

Materiaal

  • Kongo Rooi vlek
  • Suur fuchsien vlek
  • Suur alkohol
  • Klebsiella pneumoniae kultuur
  • Enterobacter aerogenes kultuur

Rooi kapsule vlekprosedure in Kongo

  1. Plaas 'n lus vol Congo Red op 'n skyfie
  2. Meng 'n klein hoeveelheid van u organisme in die druppel Congo Red.
    • Versprei die organisme/kleurstofsuspensie goed op die skyfie
  3. Laat die skyfie deeglik aan die lug droog word.
    • Moenie metanol herstel nie!
  4. Bevestig die gedroogde skyfie met suur alkohol vir 15 sekondes.
  5. Spoel met gedistilleerde water en bedek die skyfie met suur fuchsin vir 1-5 minute.
  6. Spoel af met water en laat lugdroog word.
  7. Ondersoek die skyfie onder onderdompeling met olie.
    • Selle vlek rooi/pienk, en die kapsules verskyn as kleurlose stralekrale teen 'n donkerblou agtergrond.

Wirtz se Endospore -vlek

Endospoorvorming is kenmerkend van Clostridum en Bacillus spp. Die vermoë om te konsentreer en hul protoplasma te bedek, stel hulle in staat om die ongunstige omgewingstoestande wat hulle in hul grondhabitat ervaar, te oorleef. Dit stel die spore ook in staat om kleuring te weerstaan. Die "lewende" organismes word maklik gevisualiseer met eenvoudige vlekke en Gram se vlekke.

Endospore is tipies hoogs brekbaar, lig wat hulle tref, word afgebuig. Baie Bacillus spesies het insluitingsliggame wat hoogs brekbaar is. Hierdie opnemingsliggame kan soos endospore lyk met gereelde kleuring. Die teenwoordigheid van endospore moet bevestig word met endosporespesifieke vlekke. Die teenwoordigheid en kenmerkende vorm en posisie van endospore vereis spesiale prosedures om die endospore -laag deur te dring. Die meeste endospore -vlekke behels die verhitting van die skyfies terwyl dit voortdurend klam bly met die kleurstof. Alhoewel dit vinniger is, produseer dit vlugtige chemikalieë en is dit net 'n groot gemors. Dieselfde resultate kan verkry word deur die kleurstof vir 30 minute op die skyfie te laat sit. Dit is 'n goeie idee om eers hierdie skyfie te begin en aan 'n ander vlek te werk terwyl u wag totdat die kleurstof die endospore deurdring.

Algemene oorwegings

Jy sal 'n gebruik Bacillus spesies vir die endospoorvlek. Die vorm en posisie van B. cereus spore is baie soortgelyk aan dié van B. anthracis. Bacillus begin nie spore vorm voordat dit nie meer kos het nie. As die kulture te jonk is, sal jy meestal net die pienk stawe van die bakterieë sien. As die kulture te oud is, sien u meestal net die klein groen ovale van die endospores. Ideaal gesproke moet u die groen ovaalliggame van die endospoor sien omring deur die pienk vegetatiewe bakteriese sel. Kies 'n monster uit die middel van 'n kolonie met die reguit inentingsnaald vir die beste resultate. Die rand van die kolonie groei steeds aktief en sal min endospores hê.


Bou van komplekse rigtinggewende komplementêre DNA -biblioteke in SfiI

Ensiembuffers

Alle beperkingsendonuklease -vertering is uitgevoer in 0,5–2 × KGB -buffer [2 × = 200 mM. kaliumglutamaat, 20 mM. Tris-asetaat, pH 7,6, 20 mM. magnesiumasetaat, 100 μg/ml beeserumalbumien (BSA) 1 mM. 2-merkapto-etanol (2-ME)]. 7 Fosforilasies is uitgevoer in 1 × polinukleotied kinase buffer [PNKB 1 × = 70 mM. Tris, pH 7,6, 10 mM. MgCl2, 50 mM. dithiothreitol (DTT)]. Ligasies is uitgevoer óf in 0.5 × KGB of 1 × PNKB met die byvoeging van ATP tot 'n finale konsentrasie van 1 mM..

Media

SB: Bacto-tripton, 32 g Bacto-gis-ekstrak, 20 g natriumchloried, 5 g. Voeg 1 liter dubbel gedistilleerde H by 2O en steriliseer in outoklaaf

LB: Bakto-tryptoon, 10 g Bakto-gis uittreksel, 5 g natriumchloried, 5 g. Plate word berei deur Bacto-agar, 15 g, by te voeg. Voeg 1 liter dubbel gedistilleerde H by2O en steriliseer in outoklaaf SOC: Bacto-tryptoon, 20 g Bacto-gis uittreksel, 5 g 10 mM. NaCl (2 ml van 5 M. oplossing) 2,5 mM. KCl (1,25 ml van 2 M. oplossing) 10 mM. MgCl2 (1 ml van 1 M. oplossing) 10 mM. MgSO4 (1 ml van 1 M. oplossing) 20 mM. glukose (2 ml van 1 M. oplossing). Voeg 1 liter dubbel gedistilleerde H by2O, deel, en steriliseer in outoklaaf


Resultate

Keratienafbraak van mono-spesies kulture

Keratienafbraak is getoets in skudfleskulture met keratienvloeistofmedium (KLM) wat 10 mg/ml keratien bevat. Na 4 dae van verbouing is keratienafbraak geëvalueer deur die residuele drooggewig te meet. Bevolkingsgroei is geëvalueer deur kolonievormende eenhede (CFU) te tel. X. retroflexus het 'n aansienlik groter hoeveelheid keratien (2.1 ± 0.2 mg/ml, standaardafwyking [SD]) afgebreek (padj < 0.05, Lin.1) (Fig 1A) en het aansienlik hoër CFU-tellings bereik, in vergelyking met die ander enkele spesies (S8A Fig). Keratienafbraak is waargeneem vanaf S. rhizophila, maar M.. oksidane en P. amylolyticus het 'n beperkte vermoë om keratien uit die medium te verwyder. CFU tel in kulture van S. rhizophila en M.. oxydans was hoër as dié van P. amylolyticus, wat die aansienlik laagste CFU -tellings vertoon het (padj & lt 0.05, Lin.1) (S8A Fig). Same-bewerkings het die aantal P. amylolyticus (S8B Fig). Keratienafbraak is genormaliseer na CFU-tellings om die afbraakpotensiaal van elke spesie te ondersoek. Met CFU normalisering, X. retrofleks en S. rhizophila was ewe doeltreffend in keratienafbraak en het 'n aansienlik hoër afbraak as M.. oksidane (S9 Fig) (bladj < 0,05, Lin.1). Berekening van keratienafbraak per CFU vir P. amyloliticus is weggelaat, soos P. amyloliticus het nie as monokultuur gegroei nie. Selvrye supernatante van X. retrofleks wat op keratien gekweek is, kon nie die groei van die ander stamme vergemaklik nie, wat daarop dui dat die omgewing baie min voedingstowwe bevat, en dat verswakte keratien vinnig gemetaboliseer word. Afbraak van keratien is ook ondersteun deur 'n waargeneem alkalisering van die media oor tyd vir X. retroflexus mono- en medekulture. 'n Alkalisering is waargeneem vir hierdie kulture vanaf die aanvanklike pH van 7 na pH 8.5.

S. rhizophila, X. retrofleks, M.. oxydans en P. amyloliticus word verteenwoordig deur die letters S, X, M en P, onderskeidelik. Ko-kulture word voorgestel deur letters wat die bestanddele van die enkele spesie aandui, bv. XS verteenwoordig die mede-kultuur van X. retroflexus en S. rhizophila. Foutstawe verteenwoordig standaardafwyking van drie biologiese herhalings. A) Keratienafbraak (mg/ml) vir monosoortkulture na 4 dae inkubasie. Verskillende letters definieer statistiese groepering (stygende volgorde, bladj < 0.05, Lin.1) B) Vou toename van keratienafbraak in ko-kulture van X. retrofleks, in vergelyking met die X. retrofleks mono-kultuur (aangedui met rooi stippellyn). Statistiese verskil word deur Lin.3 afgelei. C) Gemeet en teoretiese keratienafbraak (mg/mL) in die X. retrofleks monokultuur en medekultuur. ‘Measured’ refers to the measured keratin degradation, whereas ´expected´ refers to the expected theoretical amount of keratin degraded by the given co-culture. The expected amount was calculated as follows: Expected XS co-culture degradation = Degradation potential of X. retroflexus in mono-culture per CFU * CFU count of X. retroflexus in XS co-culture + degradation potential of S. rhizophila in mono-culture per CFU * CFU count of S. rhizophila in the XS co-cultures. For convenience a complete calculation of the XS co-culture has been added as S12 Fig. Significant difference was inferred by a two-tailed independent two-sample t-test.

Keratin degradation in co-cultures

Degradation from co-cultivation was evaluated for all combinations of dual-species and the 4-species cultures. However, only co-cultures containing X. retroflexus had enhanced keratin degradation as compared to the best single species degrader of the individual co-cultures. X. retroflexus constituted the majority of these communities according to CFU counts (S8A Fig). The enhanced degradative effect of co-cultures had an average fold-change of 1.29, indicating that keratin degradation in co-cultures was on average enhanced by

30% as compared to X. retroflexus mono-cultures (Fig 1B). Co-cultures XM (mean fold change [MFC] = 1.297, p = 0.02, Lin.3), XP (MFC = 1.38, p < 0.01, Lin.3) and XSMP (MFC = 1.27, p = 0.03, Lin.3) displayed significantly enhanced keratin degradation (Fig 1B). Measurements of keratin degradation for all X. retroflexus mono and co-cultures are presented in S10A Fig. Although average total cell counts of co-cultures were not significantly different from that of X. retroflexus mono-cultures, keratin degradation was normalized to cell counts to account for potential variations. Measurements of keratin degradation normalised to CFU counts for all X. retroflexus mono and co-cultures are shown in S10B Fig. With CFU normalisation, the co-culture of XP and the four-species co-culture still had significantly enhanced keratin degradation compared to that in X. retroflexus mono-cultures (S10C Fig).

Community-intrinsic properties

To test for the presence of community-intrinsic properties, the measured degradation of the individual co-cultures was compared to the predicted maximum degradation from the sum of their constituent single species cultures (S11A Fig). Data included three biological replicates, yielding three measures of community degradation with associated measures of single species degradation. Notably, co-culture XP had a significantly higher mean degradation than the predicted maximum. The XM co-culture non-statistically supported the trend of co-cultures having higher degradation than the predicted level. However, comparing co-culture degradation to the sum of multiple single species cultures can make identification of community-intrinsic properties difficult. Instead co-culture degradation was compared to a normalised theoretical degradation of the co-culture, e.g. for the XS culture (Fig 1C) Expected theoretical degradation of the XS co-culture = Degradation potential of X. retroflexus in mono-culture per CFU * CFU count of X. retroflexus in XS co-culture + degradation potential of S. rhizophila in mono-culture per CFU * CFU count of S. rhizophila in the XS co-culture. For convenience a complete calculation of the XS co-culture has been added as S12 Fig. All co-cultures had a higher mean of measured keratin degradation, as compared to the theoretical degradation, indicating that community-intrinsic properties resulted in enhanced degradation. For co-cultures of XP and XSMP (p < 0.0073 and 0.0042 respectively, independent two-tailed t-test) the measured mean was significantly higher than the theoretical estimate. Normalizing with CFU revealed that co-cultures XP and the four-species community were still significantly more productive than the expected theoretical degradation (S11B Fig).

Quantitative PCR analysis for keratin adhered cells

Previous studies on microbial degradation of recalcitrant material have linked the degree of degradation to the amount of microbes physically associated to the material. Quantitative analysis using universal eubacterial primers targeting the 16S rRNA gene (qPCR) was used to address the number of cells adhered to the keratin particles, with the assumption that total bacterial cell counts on the particles could indicate a level of biofilm formation on the particles. QPCR analysis was performed on mono- and co-cultures after 2 and 4 days of incubation. Among the mono-cultures cultures of X. retroflexus contained significantly higher counts of copy numbers, as compared to any other type of mono-culture (S13A Fig, p < 0.001, Lin.1) at both time points. S. rhizophila displayed the second highest level of copy numbers, although it was not significantly different from M.. oxydans en P. amylolyticus, (S13A Fig).

After two days of incubation only the co-culture XM contained higher amounts of attached cells, as compared to the X. retroflexus mono-culture (Fig 2). However, after 4 days of incubation all co-cultures contained more attached cells than the X. retroflexus mono-culture, suggesting that a synergistic biofilm production or attachment was at play during co-cultivation. Co-cultures of XM (MFC = 1.61, p = 0.018, Lin.3) and XP (MFC = 1.52, p = 0.014, Lin.3) displayed significantly higher numbers of attached cells, as compared to X. retroflexus mono-cultures. Co-cultures of XS and the four-species culture also presented higher fold change, although not significantly (Fig 2). Biofilm counts from co-cultures are included in S13B Fig.

Q-PCR analysis was based on universal eubacterial 16s rDNA gene primers. Keratin particles were isolated from mono- and co-cultures after 2 and 4 days of incubation. Counts of 16S gene copy numbers were believed to correspond to cells associated to the particles in a biofilm state. Co-culture counts were compared to counts of X. retroflexus mono-cultures. Dotted red line corresponds to the X. retroflexus mono-culture. Co-cultures are represented by letters of their constituent species e.g. X.retroflexus–S.rhizophila (XS), X.retroflexus–M.oxydans (XM) and X.retroflexus–P.amylolyticus (XP). At day 2, the level of adhered cells was not significantly different between co-cultures and the X. retroflexus mono-culture. At day 4, the co-cultures trended an increased fold change of adhered cells, as compared to the X. retroflexus mono-culture. Co-cultures of X.retroflexus–M.oxydans en X.retroflexus–P.amylolyticus had a significantly increased fold change (Lin. 3).

To further investigate the relevance of cell attachment in relation to keratin degradation, we performed a correlation analysis between measured keratin degradation, total cell counts in the supernatant and biofilm counts. The correlation analysis was performed on day 4 data of X. retroflexus mono- and co-cultures. Using Pearson’s correlation, a significant (padj = 0.04, FDR corrected p-value) strong positive (r = 0.98) correlation coefficient was observed between keratin degradation and biofilm counts. Oppositely, total CFU counts from the supernatant (as presented in S8 Fig) showed only a non-significant weak negative correlation with keratin degradation. Hence, biofilm formation on the keratin particles is a better predictor for keratin degradation than total CFU counts (S15 Fig and S2 Table). To further support this observation a Spearman’s ranked correlation approach was also adopted. Similar to the Pearson’s approach a strong positive correlation (rs = 1) was observed for keratin degradation and biofilm counts, although the correlation in this case was only nominal significant (p = 0.01667, padj = 0.14 with FDR correction). Again, total culture CFU and keratin degradation only showed a weak negative non-significant correlation (S15 Fig and S3 Table).

Enzymatic assays and protein measurements

Protease and keratinase activity were measured on a spectrophotometer using azocasein and azokeratin dyed substrates, respectively. Among mono-cultures, protease activity, keratinase activity and soluble protein concentration in the medium were found to increase with time for X. retroflexus en S. rhizophila (S16A–S16C Fig). Vir M.. oxydans en P. amylolyticus, no clear proteinase and keratinase activity was observed, and protein content did not change over time. At day 4, the protease and keratinase activity of X. retroflexus was significantly higher than that of all other mono-cultures (protease: 39.42 ±2.34 U/mL, keratinase: 34.58 ±12.1 U/mL, standard deviation, Lin.1). S. rhizophila had the second highest proteinase and keratinase activity at day 4 (S16A and S16B Fig), which was significantly higher than M.. oxydans en P. amylolyticus in regards to protease activity, but only nominal significant in regards to keratinase activity (protease: 12.26 ±1.96 U/mL, keratinase: 15.57 ±4.59 U/mL, standard deviation, Lin.1). X. retroflexus en S. rhizophila (0.29 ±0.01 mg/ml and 0.24 ±0.005 mg/ml respectively, SD) produced significantly higher amounts of soluble protein (Lin.1) compared to M.. oxydans en P. amylolyticus, but there was no significant difference between the production from X. retroflexus en S. rhizophila (S16C Fig). At day 4, observed protease and keratinase activities for co-cultures of X. retroflexus were similar to that of X. retroflexus mono-cultures Only the protease activity of the XS co-culture deviated significantly, and was significantly lower (padj = 0.0118, Lin.1) (Fig 3A and 3B).

Lines represent a linear regression of three biological replicates across sampling time. A) Protease production by different co-cultures using azo-casein as substrate. One unit protease activity was defined (U) as the amount of protein that increased the absorbance by 0.01. B) Keratinase production by different co-cultures using azo-keratin as substrate. One unit keratinase activity was defined as the amount of protein that increases the absorbance by 0.01 under given conditions. C) Protein production from degraded keratin by different co-cultures. Bradford assay was used for protein quantification with BSA as standard.

When comparing changes in activity over time, steeper activity increases were observed for some co-cultures, as judged from linear slope’s coefficients. Slope coefficients and p-values have been appended as S4 Table. The slope coefficient for the four-species community was higher for both protease and keratinase activity (slope = 7.87 and p = 0.007 and padj = 0.0276 for protease activity slope = 8.03 and p = 0.0184 and padj = 0.0718 for keratinase activity, Lin.2) as compared to the X. retroflexus mono-culture, indicating an increased turn-over within the tested time-span. Co-cultures of XM and XP also trended a higher slope coefficient, although not significantly different (p = 0.0571 and padj = 0.2095 for XM p = 0.064 and padj = 0.2323 for XP, Lin.2).

Although slope coefficients of most co-cultures with X. retroflexus were higher, the soluble protein concentration did not vary significantly between these co-cultures and that of X. retroflexus mono-cultures (Fig 3C).

Observation of protease activity, keratinase activity and protein concentration was included in the correlation analysis with keratin degradation, total CFU counts and biofilm counts, with day 4 observations. For both the Pearson’s and Spearman’s ranked correlation analysis keratinase activity displayed a higher correlation coefficient with keratin degradation than protease activity. However, none of the correlations were significant (S14 and S15 Figs and S2 and S3 Tables). Of the three, protein concentration had the second highest correlation coefficients to keratin degradation, although not significant for neither Pearson’s nor Spearman’s ranked correlations.

Secretome analysis by mass spectroscopy

To further resolve the increased keratin degradation in co-culture, the secretome of X. retroflexus was assessed through LC-MS/MS-based proteomics profiling. Secretome profiling was restricted to X. retroflexus as it was i) the species with the highest potential for degradation and ii) constituted the majority of cells in the co-cultures making it unlikely to obtain good proteome coverage from the other species present in the co-cultures. Secretome profiling was conducted after two days of cultivation, as preliminary tests showed that secretome profiling quality was inversely proportional to incubation time due to build-up of keratin degradation products that hampered identification of secreted bacterial proteins over time. Identified proteins from X. retroflexus were mapped with i) function and subsystem features from the RAST database [60,61], ii) prediction of signal peptides for secretion to the extracellular environment using SignalP [64] and iii) MEROPS protease functions [32,63]. Data quality is summarised in S2–S7 Figs, and the materials and methods section. Identified proteins were filtered according to the presence of signal peptides based on SignalP [64], narrowing the search towards secreted and/or membrane exported proteins. Total counts of identified proteins after SignalP filtration are summarised in Fig 4. Noticeably, several proteins were uniquely observed in the co-culture sample and not in the mono-culture X. retroflexus monsters.

Identified proteins from the secretome samples were filtered by i) removing the two outlying biological replicates and ii) removing proteins which did not contain a signal peptide. A) Identified proteins and their overlap between different sample groups, only requiring that the protein is observed in one sample of all biological replicates. B) Quantifiable proteins are defined as proteins which were detectable in 4 out of the 6 biological replicates of a given culture. From each co-culture type, only proteins shared with the X. retroflexus mono-culture were included in the differential abundance analysis.

Secretome differences of X. retroflexus in mono- and co-cultures were addressed by both a supervised and un-supervised statistical approach. A supervised approach was used to make pairwise comparisons of the secretome profiles of the X. retroflexus mono-cultures to X. retroflexus in the different co-cultures using paired t-test with FDR correction. An unsupervised approach (principal component analysis) was used to identify the proteins causing separation between the different culture types.

For the paired t-test the tested proteins were required to be present in four out of the six biological replicates in both of the compared groups. Fig 4 summarises counts and culture overlap of proteins included in the pairwise comparison. Pairwise comparison identified several proteins of X. retroflexus with a significantly changed abundance between the mono-culture and either the four-species or the XS co-culture (Table 1). Notably, many of the proteins with significant changes in abundance were hypothetical proteins without known functions in the RAST or MEROPS database. When comparing the mono-culture to any of the two co-cultures, the same serine protease (S08A) was found to be significantly more abundant in the mono-cultures. An additional predicted protease was significantly more abundant in the mono-cultures when compared to the four-species co-culture (S08A / U69). Oppositely, a glutathionine peroxidase family protein was significantly more abundant for both co-cultures as compared to the mono-culture. From the four-species co-cultures, a nikel transport family protein (NikM) and a PQQ-dependent oxidoreductase, gdhB family protein were also found to be significantly increased.

Significant proteins (after FDR correction, padj < 0.05) were only observed between mono- and co-cultures of X.retroflexus-S.rhizophila and the four-species culture. Proteins are listed according to their genome reference name (Protein ID) with the log2 fold change between mono- and co-culture and the FDR corrected p-value of the paired two-sided t-test. Proteins are mapped with RAST subsystem function (Function) and MEROPS functions (MEROPS). a The first part of the Protein ID’s (fig|305959.5) were removed from the presented IDs.

Proteins with a nominal significantly increased abundance were observed from comparison of the XM and XP co-cultures to the X. retroflexus mono-cultures, but no proteins presented a significantly changed abundance after FDR correction. Among these nominal significant proteins, the predicted S08A / U69 protease and a M28B protease were more abundant for the X. retroflexus mono-cultures when compared to the XP co-cultures, supporting that X. retroflexus alone had increased abundance of secreted proteases. For the XP co-culture, the glutathionine peroxidase family protein was also found to be nominal significantly more abundant than in the mono-cultures.

Principal component analysis did not yield a complete group separation on the two main axes (PCA1: 47.69% and PCA2: 35.97%). However, a trend was observed with co-cultures of XM, XP and the four-species separating away from the XS co-culture and X. retroflexus mono-cultures (S17 Fig). Focusing on the top ten features causing group separation in either direction of PCA1 and PCA2, revealed a similar protein profile as presented by the supervised approach (S18 Fig). For instance, the three proteins causing the largest separation on PCA2 were proteases, including two serine proteases and a metallo-protease, supporting that a large difference between the X. retroflexus mono-culture and the majority of the co-cultures was related to the abundance of secreted proteases. The protein with the strongest impact on group separation on both PCA1 and PCA2 was a chitinase. However, the effect from the chitinase was mostly due to its fluctuating presence and absence between culture groups, and not its abundance-variation between groups, which was revealed by performing a binary principal component analysis. Oppositely, the effect of the proteases on PCA2 could not be attributed to mere presence and absence between groups.


Affiliasies

Department of Microbial Ecology, Netherlands Institute of Ecology, P.O. Box 50, Wageningen, 6700 AB, The Netherlands

Irene de Bruijn, Victor de Jager, Ruth Gómez Expósito & Jos M. Raaijmakers

Wageningen University and Research Centre, Laboratory of Phytopathology, P.O. Box 8025, Wageningen, 6700 EE, The Netherlands

Irene de Bruijn, Xu Cheng & Ruth Gómez Expósito

Departments of Pharmacology, Chemistry and Biochemistry Center for Marine Biotechnology and Biomedicine, Scripps Institution of Oceanography Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California at San Diego, La Jolla, San Diego, USA

Jeramie Watrous & Pieter C. Dorrestein

Department of Plant Biology & Pathology, Cook College, Rutgers, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ, 08901-8520, USA

Nrupali Patel & Donald Kobayashi

Wageningen University and Research Centre, Plant Research International, PO Box 16, Wageningen, 6700 AA, The Netherlands


W-JL, MX, WH, and S-XG designed the research and project outline. B-BL and M-ML performed the DNA extraction and physicochemical analysis. MN, Z-HL, and Z-YD performed the culture-dependent and culture-independent analyses. MN drafted the manuscript. Alle skrywers het die finale manuskrip gelees en goedgekeur.

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Funding. This work was financially supported by the Key Realm Rɭ Program of Guangdong Province (Grant No. 2018B020206001) and the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32061143043, 91951205, and 31800001). The Scientific Investigation Voyage supported by Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhuhai). The authors are grateful to the Deanship of Scientific Research, King Saud University for funding through Vice Deanship of Scientific Research Chairs.


1. Inleiding

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (voorheen Actinobacillus actinomycetemcomitans) is a member of the Pasteurellaceae, a family of Gram-negative bacteria that includes many important human and animal pathogens. A. actinomycetemcomitans colonizes the human oral cavity and causes periodontitis and nonoral infections including endocarditis [1]. Clinical isolates of A. actinomycetemcomitans are known for their ability to form extremely tenacious biofilms on abiotic surfaces in vitro [2, 3]. Mutants that fail to form biofilms in vitro are unable to colonize the oral cavity of the rat or cause bone loss in a rat model of periodontitis [4, 5]. These findings suggest that biofilm formation is an important virulence factor in A. actinomycetemcomitans.

Tenacious biofilm formation by A. actinomycetemcomitans requires the production of adhesive, bundled, type IV pili (known as Flp-pili) that form on the surface of the cell [3, 6, 7]. Mutants that lack Flp-pili are deficient in surface attachment, autoaggregation, biofilm formation and colonization of the rat oral cavity [3, 5𠄷]. However, Flp-pili mutants still form weak biofilms on abiotic surfaces in vitro [6]. These findings indicate that additional adhesins mediate cohesion in A. actinomycetemcomitans biofilm colonies. Interestingly, biofilms produced by a Flp-pili mutant strain were sensitive to detachment by DNase I [6], which suggests that extracellular DNA (eDNA) may function as a biofilm matrix adhesin in A. actinomycetemcomitans.

Another major component of the A. actinomycetemcomitans biofilm matrix is a hexosamine-rich polysaccharide that is functionally and genetically related to extracellular polysaccharide adhesins produced by Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia coli en Actinobacillus pleuropneumoniae [8]. These polysaccharides, usually referred to as PNAG, PIA (polysaccharide intercellular adhesin), or PGA, consist of linear chains of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) residues in β(1,6) linkage (hereafter referred to as PGA). Various forms of PGA appear to differ in their molecular weight, in the degree of N-deacetylation of the GlcNAc residues, and in the presence of O-succinate substituents [9�]. PGA has been shown to play a role in abiotic surface attachment and intercellular adhesion [11�], protection from killing by antibiotics, antimicrobial peptides and phagocytes [12, 16], and virulence [17]. In A. actinomycetemcomitans, PGA has been shown to mediate intercellular adhesion and resistance to killing by the anionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) [8, 18].

The purpose of the present study was to gain better insight into the structure, synthesis and function of A. actinomycetemcomitans PGA. We purified PGA polysaccharide from a biofilm-producing clinical strain of A. actinomycetemcomitans and analyzed its chemical structure by using NMR spectroscopy. We also investigated the genetics of PGA production and the role of PGA in biofilm cohesion and detergent resistance in A. actinomycetemcomitans. In this report we present evidence that A. actinomycetemcomitans PGA is a β(1,6)-linked GlcNAc polymer that mediates intercellular adhesion and detergent resistance in A. actinomycetemcomitans biofilm colonies.


Surface Spreading Motility Shown by a Group of Phylogenetically Related, Rapidly Growing Pigmented Mycobacteria Suggests that Motility Is a Common Property of Mycobacterial Species but Is Restricted to Smooth Colonies

FIG. 1 . Smooth and rough colonies of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The images are representative of hundreds of colonies obtained through the study. FIG. 2. SEM images of smooth colonies of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The right column shows the same sample as the left column but at greater magnification. These images are representative of the studies performed with six colonies of each species. FIG. 3 . SEM images of rough colonies of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The right column shows the same sample as the left column but at greater magnification. These images are representative of the studies performed with six colonies of each species. FIG. 4 . Spreading of smooth colonies on motility medium after 6 days of growth. (A) M. chubuense (B) M. gilvum (C) M. obuense (D) M. parafortuitum (E) M. vaccae. Arrows indicate the external margins of the colonies. The right column shows pictures obtained with a binocular stereomicroscopy. These images are representative of the studies performed with 10 colonies of each species. FIG. 5 . Spreading of rough colonies on motility medium after 6 days of growth. (A) M. chubuense (B) M. gilvum (C) M. obuense (D) M. parafortuitum (E) M. vaccae. Arrows indicate the external margins of the colonies. In the right column are pictures obtained with a binocular stereomicroscopy. These images are representative of the studies performed with 10 colonies of each species. FIG. 6 . TLC images of chloroform-methanol extracts from M. vaccae (lanes 1 and 2), M. gilvum (lanes 3 and 4), M. obuense (lanes 5 and 6), M. chubuense (lanes 7 and 8), and M. parafortuitum (lanes 9 and 10). In the odd-numbered lanes, extracts are from smooth colonies, and in the even-numbered lanes, extracts are from rough colonies. TLC was developed with methanol-chloroform (90:10, vol/vol) and revealed with anthrone. Red spots indicate SP and SP-L. FIG. 7. Cellular adhesion of smooth and rough variants of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E) strains to glass tubes at 1, 2, 3, 4, and 7 days of incubation. The cellular adhesion level is expressed as the number of CFU/cm 2 . The results are expressed as means ± standard deviations obtained from triplicates. The results are representative of one out of three independent experiments. Cellular adhesion levels of smooth variants were significantly higher than those of rough variants (*, P < 0,05 **, P & lt 0,01). Cellular adhesion levels of rough variants were significantly higher than those of smooth variants (&, P & lt 0,05). FIG. 8 . Cellular adhesion of smooth and rough variants of M. chubuense (A), M. gilvum (B), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E) strains to polystyrene tubes at 1, 2, 3, 4, and 7 days of incubation. The cellular adhesion level is expressed as the number of CFU/cm 2 . The results are expressed as means ± standard deviations obtained from triplicates. The results are representative of one out of three independent experiments. Cellular adhesion levels of smooth variants were significantly higher than those of rough variants (**, P & lt 0,01). Cellular adhesion levels of rough variants were significantly higher than those of smooth variants (&&, P & lt 0,05).


Kyk die video: DR NESTOROVIĆ:Ovo je najmoćniji antibiotik na svetu,utiče na 700 gena,leči više od 160 bolesti (Oktober 2022).