Inligting

Intydse PCR parameter CT

Intydse PCR parameter CT


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wanneer 'n intydse PCR geplaas word, word parameter CT, wat drempelsiklus beteken, gebruik. Wat beteken dit regtig? volgens wikipedia "Die aantal siklusse waarby die fluoressensie die drempel oorskry, word die drumpelsiklus (Ct) genoem" kan iemand dit in konseks stel?


Real-time PCR gebruik 'n fluoresserende kleurstof wat aan dubbelstrengs DNA bind en dit dus moontlik maak om die groeiende hoeveelheid DNA deur elke siklus te meet. Die DNA wat by die reaksie gevoeg word, bind ook die fluoresserende kleurstof en maak 'n deel uit van die fluoresserende agtergrond. Wanneer die PCR-reaksie begin, neem dit 'n rukkie totdat genoeg DNA gesintetiseer is om oor die agtergrond te gaan en om die sein van die geraas betroubaar te kan onderskei. Ek dink dit word duideliker as jy na die prent hieronder kyk (van die NIH):

Die Ct is die punt waar die sein van die agtergrond onderskei kan word wanneer dit die eksponensiële grwoth -fase betree. Die kontrole sonder sjabloon bly onder hierdie drempel.


Wat is Real-Time PCR (qPCR)?

Nukleïensuurversterking en opsporingstegnieke is vandag van die waardevolste instrumente in biologiese navorsing. Wetenskaplikes in alle areas van lewenswetenskap &mdash basiese navorsing, biotegnologie, medisyne, forensiese diagnostiek, en meer &mdash gebruik hierdie metodes in 'n wye reeks toepassings. Vir sommige toepassings is kwalitatiewe nukleïensuuropsporing voldoende. Ander toepassings vereis egter 'n kwantitatiewe ontleding. Intydse PCR kan vir beide kwalitatiewe en kwantitatiewe analise gebruik word om die beste metode vir jou toepassing te kies vereis 'n breë kennis van hierdie tegnologie. Hierdie afdeling bied 'n oorsig van intydse PCR, omgekeerde transkripsie kwantitatiewe PCR-tegnieke en die keuse van instrumente wat Bio-Rad vir hierdie tegnieke bied. Dit bied ook wenke vir stappe in RNA -isolasie, soos monsterversameling, RNA -ekstraksie en die ontleding van die kwaliteit en hoeveelheid RNA.

Inhoud van die bladsy

Toegang opsies

Kry volledige toegang tot joernaal vir 1 jaar

Alle pryse is NETTO pryse.
BTW sal later by die betaalpunt bygevoeg word.
Belastingberekening sal tydens afhandeling gefinaliseer word.

Kry tydsbeperkte of volledige artikeltoegang op ReadCube.

Alle pryse is NETTO pryse.


Delta Delta Ct -metode vir veelvuldige verwysingsgene? - (Jan/23/2011)

Ek het gewonder of iemand my kan vertel of u die delta delta Ct -metode kan gebruik vir qPCR -data -analise met veelvuldige verwysingsgene, en of iemand sou weet hoe om dit te doen?

U kan dit gebruik, maar dink dat delta-delta slegs 'n benaderingsmetode is, aangesien dit nie die verskillende doeltreffendhede van verskillende gene in ag neem nie. Meer huishoudings word gebruik om die resultate meer akkuraat te maak, maar terselfdertyd gooi jy net jou akkuraatheid weg met 'n delta-delta.

U kan hierdie Pfaffl -vergelyking gebruik:

Waar E die doeltreffendheid van elke geen is. As jy "2" as E plaas, is dit dieselfde as delta-delta. Maar as u 'n verdunningsreeks vir elke geen doen en die doeltreffendheid eintlik bereken, kan u meer akkurate resultate kry.

Nou hoe om te normaliseer na veelvuldige verwysings - in plaas van enkele E^deltaCP vir een geen, maak u 'n meetkundige gemiddelde van almal. Dit beteken dat as u twee huishoudings het, in die noemer elke E^deltaCP vermenigvuldig en dan die wortel van die resultaat neem. (as drie, dan weer, vermeerder en neem dan kubuswortel, ensovoorts).

Die finale vergelyking is uit hierdie referaat Hellemans, Mortier, De Paepe, Speleman, Vandesompele (2007) (maar ek moes wiskundiges vra om in te verduidelik, want dit lyk aaklig).


Waar word qPCR gebruik?

As gevolg van sy kragtige voordele, het qPCR 'n wye reeks toepassings. Die metode was lank genoeg bestaan ​​sodat die navorsingsgemeenskap sy betroubaarheid en robuustheid bewys het. Op dieselfde manier het vervaardigers van qPCR-fietsryers betroubare platforms ontwikkel, en dat verskaffers van outomatiese toestelle vir vloeibare hantering qPCR-versoenbare outomatiseringsoplossings (byvoorbeeld robotte) ontwikkel het.

Die duidelikste is die gebruik van qPCR in molekulêre diagnostiek, waar dit konvensionele metodes stadig vervang (Figuur 3). Dit word gebruik om mikroörganismes wat siektes (bakterieë, virusse en swamme) veroorsaak, op te spoor, te identifiseer en te kwantifiseer. Met qPCR word handearbeid verminder en daarmee saam is kommer oor kontaminasie en foutiewe resultate. Dit laat ook toe dat groot hoeveelhede monsters in minder tyd verwerk kan word (tot 384 of selfs 1536 reaksies per lopie) en het dus bewys dat dit 'n onvervangbare metode in diagnostiese laboratoriums is. Daar moet egter op gelet word dat die metode slegs die teenwoordigheid van DNA of RNA van 'n mikro -organisme opspoor en nie die lewensvatbaarheid daarvan rapporteer nie. Gevolglik is konvensionele mikrobiologiese tegnieke soms nog steeds nodig.

Figuur 3: Toon 'n Rupestris stampit-geassosieerde virus (RSPaV) soos gevisualiseer deur 'n transmissie-elektronmikroskoop, een van die konvensionele opsporingstegnieke wat deur RT-qPCR vervang word (foto: NIB).

qPCR word ook gebruik om geneties gemodifiseerde organismes op te spoor en te kwantifiseer of om genotipering uit te voer. Laasgenoemde beteken dat verskillende allele van dieselfde geen of enkele nukleotiedpolimorfismes (SNP's) opgespoor kan word wat as genetiese diagnostiese of prognostiese merkers vir sekere siektes gebruik kan word.

'N Baie belangrike toepassingsveld word verteenwoordig deur geenuitdrukkingsstudies wat ons help om die biologiese prosesse op verskillende terreine van biologie, mikrobiologie, medisyne en ander lewenswetenskappe te verstaan. 'N Baie nuttige, byna grootskaalse kombinasie, is 'n genoomwye geenuitdrukkingsondersoek met DNA-mikroskikkings gevolg deur validering van resultate met qPCR. DNA -mikroskikkings is op sigself 'n baie kragtige metode, maar hulle is minder sensitief en vereis nog steeds bevestiging.


3. Navorsing vs diagnostiese toepassings

Toepassings van qPCR-tegnologie kan breedweg verdeel word in navorsings- en diagnostiese toepassings. Navorsingstoepassings ontleed gewoonlik 'n wye reeks teikens met 'n redelik lae deurset en baie verskillende steekproeftipes. Die belangrikste parameters wat aangespreek moet word, het betrekking op analitiese sensitiwiteit en spesifisiteit van die toets, wat in hierdie konteks verwys na hoeveel doelkopieë die toets kan opspoor en of die kontrole sonder sjabloon (NTC's) onderskeidelik betroubaar negatief is.

Daarteenoor ontleed diagnostiese toepassings gewoonlik 'n beperkte aantal teikens, maar vereis protokolle met 'n hoë deurset wat slegs op 'n paar steekproefsoorte gerig is. Alhoewel al die oorwegings wat van toepassing is op navorsingsaansoeke ook van toepassing is op diagnostiese toetse, het kliniese diagnostiese toetse 'n aantal addisionele vereistes wat in ag geneem moet word. Hierdie vereistes bevat inligting oor analitiese sensitiwiteit en spesifisiteit wat in hierdie konteks verwys na hoe gereeld die toets 'n positiewe resultaat lewer as 'n teiken teenwoordig is en hoe dikwels dit negatief is in die afwesigheid van die teiken. Boonop word die akkuraatheid en presisie binne en tussen laboratoriums gereeld gemonitor deur eksterne QC -programme. Bykomende kliniese laboratoriumvereistes sluit in kriteria vir die generering van rapporteerbare resultate, of herhaalde metings op monsters gemaak word, data oor die resolusie van vals-positiewe/vals-negatiewe data, en die ooreenkoms van resultate van veelvuldige laboratoriums wat dieselfde en verskillende tegnologieë gebruik. Tot dusver is slegs 'n paar interlaboratoriumvergelykings uitgevoer, en albei hierdie studies het die behoefte aan standaardisering van qPCR-diagnostiese toetse beklemtoon (44)(45). 'N Ander interlaboratoriumoefening word beplan binne die European Framework 7-projek: SPIDIA (Standardization and Improvement of Generic Pre-analysis Tools and Procedures for In-Vitro Diagnostics http://www.spidia.eu).


Heid CA, Stevens J, Livak KJ et al (1996) Intydse kwantitatiewe PCR. Genoom Res 6: 986–994. doi: 10.1101/gr.6.10.986

Winer J, Jung CK, Shackel I et al (1999) Ontwikkeling en validering van intydse kwantitatiewe omgekeerde transkriptase-polimerase kettingreaksie vir die monitering van geenuitdrukking in hartmiosiete in vitro. Anal Biochem 270:41–49. doi: 10.1006/abio.1999.4085

Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analise van relatiewe geenuitdrukking data met behulp van intydse kwantitatiewe PCR en die 2(−DeltaDelta C(T)) metode. Metodes 25:402–408. doi: 10.1006/meth.2001.1262

Pfaffl MW (2001) 'n Nuwe wiskundige model vir relatiewe kwantifisering in real-time RT-PCR. Nukleïensure Res 29: 2002–2007. doi:10.1093/nar/29.9.e45

Schefe JH, Lehmann KE, Buschmann IR et al (2006) Kwantitatiewe intydse RT-PCR data-analise: huidige konsepte en die nuwe "geenuitdrukking se CT verskil "formule. J Mol Med 84:901–910. doi:10.1007/s00109-006-0097-6

Abrams SI, Hand PH, Tsang KY et al (1996) Mutante ras epitope as teikens vir entstowwe teen kanker. Semin Oncol 23: 118–134

Minamoto T, Mai M, Ronai Z (2000) K-ras mutasie: vroeë opsporing in molekulêre diagnose en risiko-assessering van kolorektale, pankreas en longkanker-'n oorsig. Kanker Bespeur Vorige 24:1–12

Orlando C, Pinzani P, Pazzagli M (1998) Ontwikkelinge in kwantitatiewe PCR. Clin Chem Lab Med 36:255–269. doi:10.1515/CCLM.1998.045

Bustin SA, Nolan T (2004) Slaggate van kwantitatiewe real-time omgekeerde transkripsie polimerase kettingreaksie. J Biomol Tech 15:155–166

Luu-The V, Paquet N, Calvo E, Cumps J (2005) Verbeterde intydse RT-PCR-metode vir hoë deursetmetings met behulp van tweede afgeleide berekening en dubbele regstelling. Biotegnieke 38:287–293. doi:10.2144/05382RR05

Higuchi R, Fockler C, Dollinger G et al (1993) Kinetiese PCR-analise: intydse monitering van DNA-versterkingsreaksies. Biotegnologie 11: 1026–1030. doi:10.1038/nbt0993-1026

Tichopad A, Dilger M, Schwarz G, Pfaffl MW (2003) Gestandaardiseerde bepaling van intydse PCR-doeltreffendheid uit 'n enkele reaksieopstelling. Nukleïensure Res 31: e122. doi: 10.1093/nar/gng122

Grace MB, Mcleland CB, Blakely WF (2002) Intydse kwantitatiewe RT-PCR-toets van GADD45 geenuitdrukking veranderinge as 'n biomerker vir bestraling biodosimetrie. Int J Radiat Biol 78: 1011–1021. doi: 10.1080/09553000210158056

Suslov O, Steindler DA (2005) PCR-inhibisie deur omgekeerde transkriptase lei tot 'n oorskatting van amplifikasie-doeltreffendheid. Nukleïensure Res 33: e181. doi: 10.1093/nar/gni176


Omvattende algoritme vir kwantitatiewe real-time polimerase kettingreaksie

Kwantitatiewe real-time polimerase kettingreaksies (qRT-PCR) het die gekose metode geword vir 'n vinnige, sensitiewe, kwantitatiewe vergelyking van die oorvloed van RNA-transkripsies. Nuttige data van hierdie metode hang af van die aanpassing van data by teoretiese kurwes wat die berekening van mRNA -vlakke moontlik maak. Om akkurate mRNA-vlakke te bereken, vereis belangrike parameters soos reaksiedoeltreffendheid en die fraksionele siklusgetal by drempel (CT) om gebruik te word, maar baie algoritmes wat tans gebruik word, skat hierdie belangrike parameters. Hier beskryf ons 'n objektiewe metode vir die kwantifisering van qRT-PKR-resultate deur gebruik te maak van berekeninge gebaseer op die kinetika van individuele PKR-reaksies sonder die behoefte van die standaardkurwe, onafhanklik van enige aannames of subjektiewe oordeel wat direkte berekening van doeltreffendheid en CT toelaat. Ons gebruik 'n vier-parameter logistieke model om die rou fluoressensie data te pas as 'n funksie van PCR siklusse om die eksponensiële fase van die reaksie te identifiseer. Vervolgens gebruik ons ​​'n drie-parameter eenvoudige eksponentmodel om by die eksponensiële fase te pas met behulp van 'n iteratiewe nie-lineêre regressie-algoritme. Binne die eksponensiële gedeelte van die kromme identifiseer ons tegniek outomaties kandidaat-regressiewaardes deur die P-waarde van regressie te gebruik en gebruik dan 'n geweegde gemiddelde om 'n finale doeltreffendheid vir kwantifisering te bereken. Vir CT -bepaling het ons die eerste positiewe tweede afgeleide maksimum uit die logistieke model gekies. Hierdie algoritme verskaf 'n objektiewe en geraasbestande metode vir kwantifisering van qRT-PCR-resultate wat onafhanklik is van die spesifieke toerusting wat gebruik word om PCR-reaksies uit te voer.

Syfers

Vloeidiagram wat stappe in...

Vloeidiagram wat stappe toon by die implementering van die beskrywe algoritme. Die proses van kwantifisering...

Pas die hele kromme aan en ...

Pas die hele kromme en bepaling van die eksponensiële fase. Die fluoresserende data van ...

Vergelyking van lineêre regressie versus ...

Vergelyking van lineêre regressie versus nie -lineêre regressie. ( A ) Vergelykings vir lineêre ...

Evaluering van geraasbestande regressie. Die…

Evaluering van geluidsbestande regressie. Dieselfde data in tabel 5 is uiteengesit. Let op…

Vergelyking van metodes vir CT ...

Vergelyking van metodes vir CT-bepaling. ( A ) CT -bepaling met behulp van FDM, ...

Validasie van real-time PCR Miner. ...

Validasie van real-time PCR Miner. Veelvuldige interne beheergene (aktien, G3PDH en 18S ...


Cy0 - 'n Nuwe qPCR -kwantifiseringsmetode

Agtergrond: Intydse PCR-analise is 'n sensitiewe DNA-kwantifiseringstegniek wat onlangs aansienlike aandag getrek het in biotegnologie, mikrobiologie en molekulêre diagnostiek. Alhoewel, die siklus-drempel (Ct) metode is die huidige "goue standaard", dit is ver van 'n standaard toets. Eenvormige reaksiedoeltreffendheid onder monsters is die belangrikste aanname van hierdie metode. Sommige skrywers het egter gemeld dat dit moontlik nie korrek is nie, en 'n effense afname in PCR -effek van ongeveer 4% kan tot 400% fout veroorsaak Ct metode. Hierdie reaksie doeltreffendheid afname kan veroorsaak word deur inhiberende middels wat gebruik word tydens nukleïensuur ekstraksie of saamgesuiwer uit die biologiese monster. Ons stel 'n nuwe metode voor (Cy0) wat nie die aanname van gelyke reaksiedoeltreffendheid tussen onbekendes en standaardkromme vereis nie.
Resultate: Die Cy0 Die metode is gebaseer op die pas van Richards & 39-vergelyking met intydse PCR-data deur nie-lineêre regressie om die beste geskatte ramers van reaksieparameters te verkry. Daarna is hierdie parameters gebruik om die Cy0 waarde wat die afhanklikheid van die waarde daarvan tot PCR kineties verminder.
Die Ct, tweede afgeleide (Cp), sigmoïdale krompassingsmetode (SCF) en Cy0 Metodes is vergelyk deur twee kriteria te gebruik: presisie en akkuraatheid. Ons resultate het getoon dat, in optimale versterkingstoestande, hierdie vier metodes ewe akkuraat en akkuraat is. Wanneer PCR-doeltreffendheid egter effens verminder is, die verdunning van die hoeveelheid amplifikasiemengsel of die byvoeging van 'n biologiese inhibeerder soos IgG, die SCF, Ct en Cp metodes is aansienlik benadeel terwyl die Cy0 Metode het aansienlik meer akkurate en akkurate resultate gegee.

Afsluiting: Ons resultate toon dit Cy0 verteenwoordig 'n beduidende verbetering ten opsigte van die standaardmetodes vir die verkryging van 'n betroubare en akkurate nukleïensuurkwantifisering, selfs in sub-optimale versterkingstoestande wat die onderskatting wat deur die teenwoordigheid van sommige PCR-remmers veroorsaak word, oorkom.

-->

Hallo, jy is die 102953 besoeker, dankie.

Besoek ons ​​van.

Nuutste klik.

In die afgelope paar jaar het die real-time polimerase kettingreaksie (PCR) vinnig die mees gebruikte tegniek geword in moderne molekulêre biologie [1-4].
Hierdie tegniek maak staat op fluoressensie-gebaseerde opsporing van amplikon-DNS en laat toe dat die kinetika van PCR-amplifikasie intyds gemonitor word, wat dit moontlik maak om nukleïensure met buitengewone gemak en akkuraatheid te kwantifiseer. Met 'n groot dinamiese omvang (7-8 groottes) en 'n hoë mate van sensitiwiteit (5-10 molekules), spreek die intydse PKR die duidelike vereiste vir kwantitatiewe data-analise in molekulêre medisyne, biotegnologie, mikrobiologie en diagnostiek aan [5, 6 ].
Alhoewel die intydse PCR-analise aansienlike aandag in baie velde van molekulêre biologie gekry het, is dit ver van 'n standaardtoets. Een van die probleme wat met hierdie toets geassosieer word, wat 'n direkte impak op die betroubaarheid daarvan het, is inkonsekwente data-analise. Op die oomblik is intydse PCR-analise hoogs subjektief en, as dit onvanpas uitgevoer word, verwar dit die werklike resultate [7].
Baie verskillende opsies vir dataverwerking is tans beskikbaar. Die basiese keuse in real -time PCR -berekeninge is tussen absolute kwantifisering, gebaseer op standaardkromme, en relatiewe kwantifisering, gebaseer op PCR -doeltreffendheidsberekening. Met behulp van die sagteware wat tans beskikbaar is, is analise van intydse PCR-data oor die algemeen gebaseer op die "cycle-drumpel " metode. Die siklus-drempel word gedefinieer as die fraksionele siklusgetal in die log-lineêre area van PCR-amplifikasie waarin die reaksie vaste hoeveelhede amplikon-DNS bereik. Daar is twee metodes om die siklus-drempelwaarde te bepaal een metode, naamlik paspunt, word uitgevoer deur 'n lyn parallel aan die x-as van die intydse fluoressensie-intensiteitskromme te trek (Ct) [8]. Die tweede, naamlik tweede afgeleide, bereken die fraksionele siklus waar die tweede afgeleide van die intydse fluoressensie-intensiteitskromme die maksimum waarde (Cp) [9]. Die standaardkrommetode vereis dat seriële verdunnings van 'n gegewe monster gegenereer word en verskeie PCR-reaksies op elke verdunning [10, 11] uitgevoer word, die drumpelsikluswaardes word dan geteken teenoor die log van die verdunning en 'n lineêre regressie word uitgevoer waaruit die gemiddelde doeltreffendheid afgelei kan word. Hierdie benadering is slegs geldig indien die drempelsikluswaardes gemeet word vanaf die eksponensiële fase van die PKR-reaksie en as die doeltreffendheid identies is tussen amplifikasies. Verder word aangeneem dat hierdie doeltreffendheid dieselfde is vir al die standaardverdunnings, maar sommige outeurs het gerapporteer dat hierdie aanname twyfelagtig kan wees [12].
Dit word algemeen erken dat sjabloonkwaliteit een van die belangrikste determinante van real-time PCR-betroubaarheid en reproduceerbaarheid is [13], en talle skrywers het die beduidende afname in die sensitiwiteit en kinetika van intydse PCR-toetse wat veroorsaak word deur inhiberende komponente getoon. dikwels gevind in biologiese monsters [14, 17].
Die inhiberende middels kan reagense wees wat tydens nukleïensuurekstraksie gebruik word of saamgesuiwerde komponente uit die biologiese monster soos galsoute, ureum, heem, heparien en immunoglobulien G. Inhibeerders kan sterk onakkurate kwantitatiewe resultate genereer terwyl 'n hoë mate van inhibisie selfs kan skep vals-negatiewe resultate.
Die Ct metode is die mees gebruikte metode al is die berekening daarvan gebruikerafhanklik. Die Ct Die metode is redelik stabiel en eenvoudig, maar die akkuraatheid van ramings word sterk benadeel as die doeltreffendheid nie in alle reaksies gelyk is nie. Eenvormige reaksiedoeltreffendheid is inderdaad die belangrikste aanname van die Ct metode.
'N Alternatiewe benadering, voorgestel deur Liu en Saint [18], veronderstel 'n dinamiese verandering in die doeltreffendheid van die PCR -versterking met 'n sigmoïde funksie (Sigmoïdale curve faanwysingsmetode, SCF). Een van die voordele van hierdie regressie-analise is dat dit ons toelaat om die aanvanklike sjabloonbedrag direk vanaf die nie-lineêre regressie te skat, wat die behoefte aan 'n standaardkromme uitskakel. Hierdie baanbrekerswerke het getoon dat dit moontlik was om absolute kwantifisering te verkry vanaf intydse fluoressensie-krommevorm. Onlangse verslae het egter getoon dat, in 'n geoptimaliseerde toets, die Ct metode bly die goue standaard as gevolg van die inherente foute van die veelvuldige skattings wat gebruik word in nie-lineêre regressie [19, 20].
Ons stel in hierdie verslag 'n gewysigde standaardkrommegebaseerde metode voor (genoem Cy0) wat nie die aanname van eenvormige reaksiedoeltreffendheid tussen standaarde en onbekende vereis nie en geen keuse van drempelvlak deur die gebruiker behels nie.
Die doel van hierdie werk was ook om die akkuraatheid en akkuraatheid van die SCF, Ct, Cp en Cy0 metodes in die teenwoordigheid van verskillende PCR -kinetika. Ons resultate toon duidelik dat die voorgestelde dataverwerkingsprosedure effektief toegepas kan word in die kwantifisering van monsters wat gekenmerk word deur geringe versterkingsinhibisie en betroubare en presiese resultate behaal.

Die absolute kwantifiseringsmetode maak staat op die vergelyking van afsonderlike monsters, soos die vergelyking van 'n biologiese monster met 'n standaardkromme van bekende aanvanklike konsentrasie [21].
Ons het gewonder hoe akkuraatheid en presisie verander wanneer 'n standaardkromme vergelyk word met onbekende monsters wat deur verskillende doeltreffendheid gekenmerk word. 'N Natuurlike manier om die effek van doeltreffendheidsverskille tussen monsters op kwantifisering te bestudeer, is om die hoeveelhede van 'n gekwantifiseerde geen te vergelyk.
'n Geringe amplifikasie-inhibisie in die kwantitatiewe intydse PKR-eksperimente is verkry deur twee stelsels te gebruik: die vermindering van die amplifikasiemengsel wat in die reaksie gebruik word en die byvoeging van verskillende hoeveelhede IgG, 'n bekende PKR-inhibeerder.
Vir die eerste stelsel het ons die MT-ND1-geen geamplifiseer deur intydse PCR in reaksies met dieselfde aanvanklike hoeveelheid DNA maar verskillende hoeveelhede SYBR Green I Master -mengsel. 'N Standaardkromme is uitgevoer oor 'n wye reeks inset -DNA (3.14x10 7 -3.14x10 1) in die teenwoordigheid van optimale versterkingstoestande (100% versterkingsmengsel), terwyl die onbekendes uitgevoer is in die teenwoordigheid van dieselfde begin -DNA -hoeveelhede, maar met amplifikasiemengselhoeveelhede wat wissel van 60% tot 100%. Dit het verskillende reaksiekinetika veroorsaak, wat die amplifikasie -remming wat dikwels in biologiese monsters voorkom, naboots [17, 22].
Verder is kwantitatiewe intydse PCR -kwantifikasies uitgevoer in die teenwoordigheid van 'n optimale versterkingsreaksiemengsel bygevoeg met seriële verdunnings van IgG (0.0625 - 2 µg/ml) wat dus as die remmende middel [23] optree.
Die reaksiedoeltreffendheid wat verkry is, is volgens die LinReg -metode [24] beraam. Hierdie benadering identifiseer die eksponensiële fase van die reaksie deur die fluorescentie op 'n logskaal in te teken. 'n Lineêre regressie word dan uitgevoer wat lei tot die skatting van die doeltreffendheid van elke PCR-reaksie.

Kwantitatiewe Real-Time PCR

Die DNA-standaard het bestaan ​​uit 'n pGEM-T (Promega) plasmied wat 'n fragment van 104 bp van die mitochondriale geen NADH dehidrogenase 1 (MT-ND1) as insetsel bevat. Hierdie DNA-fragment is geproduseer deur die ND1/ND2-aanvoerpaar (voorwaartse ND1: 5 ' -ACGCCATAAAACTCTTCACCAAAG-3 ' en omgekeerde ND2: 5 ' -TAGTAGAAGAGCGATGGTGAGAGCTA-3 ' ). Hierdie plasmied is gesuiwer deur gebruik te maak van die Plasmid Midi Kit (Qiagen) volgens die vervaardiger se instruksies. Die finale konsentrasie van die standaard plasmied is spektofotometries geraam deur gemiddeld drie herhaal A te bepaal260 absorpsiebepalings.
Intydse PCR amplifikasies is uitgevoer met behulp van LightCycler ® 480 SYBR Green I Master (Roche) volgens die vervaardiger se instruksies, met 500 nM primers en 'n veranderlike hoeveelheid DNA-standaard in 'n 20µl finale reaksievolume. Termofietsry is uitgevoer met behulp van 'n LightCycler ® 480 (Roche) wat geïnisieer is deur 'n 10 min inkubasie by 95°C, gevolg deur 40 siklusse (95°C vir 5 s 60°C vir 5 s 72°C) vir 20 s. enkele fluoresserende lesing aan die einde van elke siklus. Elke reaksiekombinasie, naamlik aanvangs-DNA en amplifikasiemengselpersentasie, is in drievoud uitgevoer en in vier afsonderlike amplifikasielopies herhaal. Al die lopies is voltooi met 'n smeltkurwe -analise om die spesifisiteit van amplifikasie en gebrek aan primer dimere te bevestig. Ct (paspuntmetode) en Cp (tweede afgeleide metode) waardes is bepaal deur die LightCycler ® 480 sagteware weergawe 1.2 en uitgevoer na 'n MS Excel datablad (Microsoft) vir analise na agtergrond aftrekking (beskikbaar as Addisionele lêer 1). Vir Ct (paspuntmetode) evaluasie 'n fluoressensiedrempel wat handmatig op 0.5 gestel is, is vir alle lopies gebruik.

Beskrywing van die SCF metode

Fluorescentiemetings is gebruik om die volgende sigmoïde funksie met 4 parameters te pas met behulp van nie-lineêre regressie-analise:

Vgl. 1
waar x is die siklusgetal, Fx is die reaksie fluoressensie by siklus x, Fmaks is die maksimum fluoressensie van die reaksie, c is die fraksionele siklus waarby die reaksiefluoressensie die helfte bereik Fmaks, b hou verband met die helling van die kromme en Fb is die agtergrondreaksie fluoressensie. Fmaks kwantifiseer die maksimum fluoressensie wat deur die instrument gelees word en dui nie noodwendig die hoeveelheid DNA-molekules aan wat aan die einde van die reaksie teenwoordig is nie. Die feit dat Fmaks Dit beteken nie noodwendig dat die uiteindelike hoeveelheid DNA te wyte is aan die onversadigende kleurstofkonsentrasie of die fluoressensie wat deur remmers gedoof word nie. Vir elke lopie is 'n nie -lineêre regressie -analise uitgevoer en hierdie vier parameters is geëvalueer. 'n Eenvoudige afgeleide van Vgl. 1 het ons toegelaat om te skat F0, wanneer x = 0:
Vgl. 2
waar F0 verteenwoordig die aanvanklike teikenhoeveelheid uitgedruk in fluoressensie-eenhede. Omskakeling van F0 tot die aantal teikenmolekules is verkry deur 'n kalibrasiekurwe waarin die log-invoer-DNA verwant was aan die log van F0 [18]. Vervolgens is hierdie vergelyking gebruik vir kwantifisering met logtransformasie van fluorescentiedata om die fiksheid te verbeter, soos beskryf in Goll et al. 2006 [19].

Beskrywing van die Cy0 metode

Die Cy0 waarde is die snypunt tussen die abscissa-as en raaklyn van die infleksiepunt van die Richards-kromme wat verkry word deur die nie-lineêre regressie van rou data (Fig. 1).

Voorbeeld van modellering van PCR-versterking met 'n 5-parameter Richards-funksie Die doeltreffendheid van hierdie model word geïllustreer deur die voorspelde waardes wat deur Vgl. 3 (oop sirkels) wat ooreenstem met die waargenome fluoressensie (kol en lyn). Krommepassing van eksperimenteel afgeleide fluoressensiedatastel na Vgl. 3 genereer waardes vir die kinetiese parameters waaruit die buigpunt (soliede swart ruit) en die helling van die kromme afgelei kan word. Die kwantitatiewe entiteit Cy0(soliede swart kolletjie), wat in die voorgestelde metode gebruik word, toon die kruispunt tussen die x-as en die raaklyn wat die buigpunt van intydse PCR-fluoressensiekurwe kruis.

Die Cy0 Die metode is uitgevoer deur nie-lineêre regressie van die Richards-funksie [25], 'n uitbreiding van die logistieke groeikurwe, om die fluorescentiemetings by die Richards-funksie met 5 parameters te pas:
Vgl. 3
waar x is die siklusnommer, Fx is die reaksie fluoressensie by siklus x, Fmaks is die maksimum fluoressensie van die reaksie, x is die fraksionele siklus van die draaipunt van die kromme, d verteenwoordig die Richards -koëffisiënt, en Fb is die agtergrondreaksie fluoressensie. Die buigpuntkoördinaat (Buig) is soos volg bereken (Bykomende lêer 2):
Vgl. 4
en die raaklynhelling (m) is geskat as:
Vgl. 5
Wanneer d = 1, word die Richards -vergelyking die logistieke vergelyking hierbo getoon. Die vyf parameters wat elke lopie gekenmerk het, is gebruik om die Cy te bereken0 waarde volgens die volgende vergelyking:
Vgl. 6
Alhoewel die Cy0 is 'n enkele kwantitatiewe entiteit, net soos die Ct of Cp vir drumpelmetodologieë is dit verantwoordelik vir die reaksie kineties omdat dit bereken word op grond van die helling van die infleksiepunt van fluorescentiedata.

Statistiese data-analise

Nie-lineêre regressies (vir 4-parameter sigmoïde en 5-parameter Richards-funksies) is uitgevoer met die bepaling van die ongeweegde kleinste kwadrate-ramings van parameters met behulp van die Levenberg-Marquardt-metode. Die akkuraatheid is bereken met behulp van die volgende vergelyking:, waar was die relatiewe fout, terwyl en was die geskatte en die werklike aantal DNA -molekules vir elke kombinasie van inset -DNA (nDna) en amplifikasiemengsel persentasie (%meng) wat in die PCR gebruik word. Presisie is bereken as:

, waar was die koëffisiënt van variasie, en was die gemiddelde en die standaardafwyking vir elke kombinasie van nDNA en %meng. Om vas te stel dat die Richards -krommes, verkry deur nie -lineêre regressie van fluorescentiedata, nie beduidend van die sigmoïdale kurwes verskil nie, was die waardes van d parameter is vergelyk met die verwagte waarde d= 1, gebruik t toets vir een monster. Vir elke kombinasie van nDna, %meng, die t waardes is soos volg bereken:

, waar en was die gemiddelde en die standaardfout van d waardes vir elke kombinasie van nDna en %meng, met p (t) & lt 0,05 vir betekenisvolheid. waardes is gerapporteer met behulp van 'n driedimensionele spreidingsgrafiek, 'n volledige tweede orde polinoom regressiefunksie is getoon om die tendens van akkuraatheidswaardes te skat. waar ook gerapporteer deur gebruik te maak van 3-d kontoer plotte met behulp van derde-orde polinome spline passing. Alle uitwerkings en grafika is verkry met Excel (Microsoft), Statistica (Statsoft) en Sigmaplot 10 (Systat Software Inc.).

Eksperimentele stelsel 1: vermindering van die amplifikasie -mengpersentasie

Met ons eksperimentele opstelling was die gemiddelde PCR -reaksiedoeltreffendheid 88% onder optimale versterkingstoestande en effens afgeneem in die teenwoordigheid van kleiner versterkingsmengsel tot 84%. Verder, vir dalende amplifikasiemengselhoeveelhede, het die PKR-reaksiedoeltreffendheid hoër dispersievlakke as optimale toestande getoon wat gelei het tot toenemende kwantitatiewe foute (Variasie-interval, VI100%= 1.921-1.852 en VI60%= 1.903-1.776 Fig. 2). Vervolgens is die fluoressensiedata wat in hierdie reaksies verkry is, gebruik om die aanvanklike DNA-hoeveelheid te bereken deur vier verskillende prosedures te gebruik: SCF, Ct, Cp en Cy0.

Presisie en akkuraatheid van die SCF metode

Vorige studies het getoon dat die SCF benadering kan lei tot kwantifisering sonder vooraf kennis van versterkingsdoeltreffendheid [18, 19, 26] daarom het ons die prestasie van hierdie metode op ons datastel geëvalueer. Om die effek van ongelyke doeltreffendheid op akkuraatheid te bepaal, is die berekende inset -DNA, uitgedruk as molekulêre getal, vergelyk met die verwagte waarde om die relatiewe fout (RE) te verkry. Die akkuraatheid is verder geëvalueer deur die variasiekoëffisiënt (CV%) van die beraamde aanvanklike DNS te meet in die teenwoordigheid van verskillende PKR doeltreffendheid en inset DNS.
In ons eksperimentele ontwerp, die SCF Die metode toon 'n baie swak presisie (gemiddelde CV% = 594.74%) en 'n lae akkuraatheid (gemiddelde RE = -5.05). Die impak van die afname in versterkingsdoeltreffendheid op akkuraatheid was baie sterk, wat lei tot 'n onderskatting van monsters tot 500% (addisionele lêer 3). Die logtransformasie van fluoressensie -data voor sigmoïdale pasvorm het die CV% en RE beduidend verminder tot onderskeidelik 66,12% en -0,20, maar die algehele vooroordeel bly dieselfde [19]. Ten slotte het ons ook 'n verbeterde getoets SCF benadering gebaseer op 'n vorige studie deur Rutledge 2004 [26] sonder om beduidende verbetering te verkry (Addisionele lêer 4).

Beraming van PCR-doeltreffendheid deur gebruik te maak van LinReg-metode Doeltreffendheidwaardes is bepaal uit 420 onafhanklike reaksies deur gebruik te maak van 'n kombinasie van 3.14 x 10 7 x 3.14 x 10 1 DNA-molekules as begintemplaat en amplifikasiemengselhoeveelhede wat wissel van 60% tot 100%. Die grafiek toon die verspreiding van PCR-doeltreffendheid in verhouding tot die persentasie amplifikasiemengsel wat in die reaksie gebruik word. Die soliede swart vierkante (?) Verteenwoordig die gemiddelde van elke verdeling.

Die SCF model aanvaar dat die fluoressensie sein eweredig is aan die hoeveelheid produk, wat dikwels die geval is vir SYBR-Green I intydse PCR uitgevoer met versadigingskonsentrasies van kleurstof. Onder sulke toestande word sentraal simmetriese versterkingskurwes verwag. In ons ervaring het ons egter verskeie nie-simmetriese versterkingskrommes gevind wat getoon het dat hulle goeie versterkingsdoeltreffendheid het deur gebruik te maak van standaardkromme-analise (Bykomende lêer 1 en 3). Om 'n geskikte wiskundige voorstelling van die volledige PCR kinetiese kromme te vind, het ons die standaard beramingfout vergelyk wat verkry is deur verskeie vergelykings wat S-vormige krommes genereer (Tab. 1). Soos in Figuur 1 getoon, het hierdie resultate getoon dat real-time PCR-aflees effektief gemodelleer kan word met behulp van die 5-parameter Richards-funksie (Vgl. 3). Die Richards -vergelyking is 'n uitbreiding van die sigmoïdale groeikurwe, spesifiek wanneer d koëffisiënt is gelyk aan 1, die sigmoïdale en Richards -krommes is dieselfde. Daarom het ons die variasie van die ontleed d koëffisiënt in die teenwoordigheid van verskillende inset -DNA en PCR doeltreffendheid. Figuur 3 toon aan dat die d waarde is naby 1 by versterkingsmengpersentasies, wat wissel van 100% tot 90%, terwyl die inhoud van die amplifikasie -mengsel laer is, waar PCR -doeltreffendheid afneem, d coefficient was significantly higher than 1 regardless of the starting DNA content (Fig. 3 Tab. 2). These data demonstrate that sigmoidal fitting represents a good approximation of real-time PCR kinetic only in the presence of optimal amplification conditions while the Richards curve is more suited when PCR is inhibited. Since the Richards growth equation includes sigmoidal amplification curves, when d = 1, this nonlinear fitting was used in our method.

Distribution of Richards coefficients (d) estimated from PCR fluorescence curves using Eq. 3 in nonlinear fitting procedure. Richards coefficient values were determined from 420 independent PCR reactions. The data have been reported in Log10scale, and represented as mean and standard deviation.

Comparison of five S-shaped models to fit the PCR curve: Sigmoid, Richards, Gompertz, Hill and Chapman. In this table, f is the fluorescence at cycle x Fmaksrepresents the maximum fluorescence value Fbis the background reaction fluorescence b, c en d determine the shape of each curve. For each model the determination coefficient (R 2 ), the adjusted determination coefficient (Adj R 2 ) and the standard error of estimate have been calculated.

Naam Vergelyking Estimated Parameters R 2 Adj R 2 Standard Error of Estimate
Fmaks b c Fb d
Sigmoid f = Fb+Fmaks/(1+exp(-(x-c)/b)) 45.11 1.49 22.37 -0.03 1 1 0.1354
Richards f = Fb+(Fmaks/(1+exp(-(1/b)*(x-c)))^d) 45.11 1.58 21.95 0.02 1.20 1 1 0.0926
Gompertz f = Fb+Fmaks*exp(-exp(-(x-c)/b)) 45.19 2.15 21.45 0.29 0.9992 0.9992 0.6006
Hill f = Fb+Fmaks*x^b/(d^b+x^b) 45.18 14.95 0.08 22.34 1 1 0.1351
Chapman f = Fb+Fmaks*(1-exp(-b*x))^d 45.19 0.46 0.29 20615 0.9992 0.9992 0.6006

tstatistic values obtained for all variable combinations. Wanneer t < 0 the Richards coefficient is lower than 1, while for t > 0 the Richards coefficient is higher than 1.
Significance levels:
* 0.05 <bl < 0.01
** bl < 0.01.

Amplification mix percentage
Meld10input DNA 100% 90% 80% 70% 60%
7.5 0.28348 1.15431 2.9303* 5.43493** 4.26067**
6.5 -3.0233* -0.5329 7.8552** 8.68609** 7.28178**
5.5 -2.2195* 2.70419* 4.7185** 8.61406** 4.60465**
4.5 0.97856 1.32162 2.34* 16.5192** 17.5903**
3.5 1.00647 -1.038 2.3307* 13.2572** 4.65683**
2.5 -1.731 -0.5995 5.8385** 6.90378** 6.13465**
1.5 0.14417 1.25452 -0.898 1.87978 3.69668**

Plot of fluorescence observations versus cycle number obtained from the same starting DNA but in presence of decreasing amounts of amplification mix. This slight PCR inhibition produces curves which are less steep than controls and shifted towards the right. When analysed by the threshold method, these curves showed higher Ct values with a CV% of 1.45% (A). 'N Voorbeeld van Cy0procedure has been reported for the same data set (B). In this method, the amplification reactions are described by the tangent crossing the inflection point of fluorescence curves. As shown in this figure, the straight-lines originating from PCRs, characterized by slightly different PCR efficiency and the same starting amounts, tend to cross into a common point near the x-axis leading to small variations in the Cy0values (CV% = 0.6%).

Precision and accuracy of the Ct, Cp en Cy0 metodes.

The performance of the Ct, Cp en Cy0 methods was compared in terms of precision and accuracy over a wide range of input DNA concentrations and under different reaction efficiencies obtained by decreasing the amount of amplification mix as reported in Liu and Saint [18, 27]. As shown in Figure 5A, the Ct method is highly rigorous at maximum reaction efficiency regardless of the starting DNA template. However, the absolute value of RE increased almost linearly with the decrease of efficiency regardless of the template concentrations resulting in an underestimation of the unknown of about 50% at the lowest amplification efficiencies. Die Cp was more accurate than the Ct method in the presence of different amounts of amplification mix. Indeed, the relative error in the presence of 100% amplification mix tended towards zero as it did using the Ct metode. However, when the efficiency declined, the RE increased initially in the same manner at low and high input DNA concentrations, while at 60-70% of the amplification mix, this method markedly underestimated at low concentrations (mean RE60% mix = -0.58 Fig. 5C). Finally, the Cy0method was more accurate than the Cp method (mean RE -0.12 versus -0.18, respectively Fig. 5C, E), which in turn was better than the Ct method (mean RE = -0.31). Notably, at optimal amplification conditions (90-100% of the amplification mix) the Cp en Cy0 methods were equivalent, but at decreasing efficiencies, the Cy0 accuracy was more stable than that of the Cp in the concentration range from 3.14x10 7 to 3.14x10 5 molecules. At lower DNA concentrations, from 3.14x10 4 to 3.14x10 2 molecules, the RE proportionally increased with the efficiency decline, but this underestimate was less marked than that of the Cp method at the same starting DNA (Fig. 5C, E). Regarding the precision of the three methods, the variation coefficients were determined for each combination of initial template amount and amplification mix percentage. The random error of quantification achieved by the Cp en Cy0method was similar (mean CV% 21.8% and 22.5%, respectively), while the Ct procedure produced an overall CV% of about 39.7% (Tab. 3). When the CV was analysed in relation to PCR efficiency and input DNA, an area of low variation coefficients for the three methods was found between 3.14x10 4 and 3.14x10 7 molecules as starting material (Fig. 5B, D, F). With DNA amounts ranging from 3.14x10 3 to 3.14x10 2 molecules, the precision progressively decreased in each analysis procedure. These variations were not efficiency-dependent, but were related to initial DNA quantity as shown by the shapes of level curves reported in figure 5B, D and F, which were perpendicular to the input template amounts.

Comparison of the Ct, Cp en Cy0methods in terms of precision and accuracy. The accuracy of each method has been reported as Relative Error (RE = expected value ? estimated value) while the precision was evaluated measuring the variation coefficient (CV%). The 3D plots show the variation of relative error in relation to amplification mix percentage and log10 input DNA for the Ct (A), Cp (C) and Cy0(E) methods. The areas in the level curve graphs represent the CV% values obtained for each amplification mix percentage and Log10 input DNA combination using the Ct (B), Cp (D) and Cy0(F) methods.

Comparison of mean Relative Error and mean Variation Coefficient among the Ct, Cp, Cy0en SCF metodes. The reported data were calculated on 420 PCRs except for a ) in which the reaction number was 210.

Ct Cp Cy0 SCF Meld10SCF
Mean CV% 39.70% 21.80% 22.52% 594.74% a 66.12% a
Mean RE -0.318 -0.184 -0.128 -5.058 a -0.205 a

Experimental system 2: Real-time PCR quantification in the presence of the inhibitor IgG

The real-time amplification plot of 4.05x10 6 DNA molecules with increasing concentrations of IgG demonstrates the effects of PCR inhibition on amplification efficiency and accumulated fluorescence (Fig. 6A). As inhibitor concentrations increased, the amplification curves showed lower plateau fluorescence levels and a shift towards the right and the bottom of the inflection points, leading to amplification curves that were less steep and not as symmetric as those obtained in absence of the inhibitor agent (Fig. 6A). As shown in figure 6A the amplification curves inhibited by IgG showed a shape very similar to those resulting from the system of amplification mix reduction (system 1 Fig. 4A). Quantitative data analysis of these amplification plots showed that the estimated DNA quantities were systematically underestimated in the presence of IgG concentrations higher than 0.25 µg/ml and 1 µg/ml using Ct en Cp methods, respectively. Die Cy0 method was able to adjust this bias minimizing the RE at high IgG concentrations (RE = 4.98% CV = 4.33% Fig. 6B). Furthermore, in presence of high IgG concentrations, the SCF approach, modified according to Rutledge 2004 [26], was inapplicable because it was impossible to minimize F0 value (Additional file 5).

Real-time PCR amplification plots obtained from the same starting DNA in the presence of IgG acting as reaction inhibitor This inhibition system produces curves which are progressively less steep than non-inhibited reactions with increasing IgG concentrations (A). When analysed by the Ct, Cp en Cy0methods these curves showed a RE% of -25.37%, -9.02% and 4.98% and a CV% of 25.62%, 10.66% and 4.33%%, respectively (B).

Real-time PCR analysis is becoming increasingly important in biomedical research because of its accuracy, sensitivity and high efficiency. Although, real-time PCR analysis has gained considerable attention, it is far from being a standard assay. The standard methods are quite stable and straightforward but the accuracy of estimates is strongly impaired if efficiency is not equal in all reactions. Furthermore, the assumption of uniform efficiency has been reported to be invalid in many cases regarding medical diagnostics. In fact, the biological samples may contain inhibitors that could lead to different amplification efficiencies among samples. We propose, in this report, a modified standard curve-based method, called Cy0, that does not require the assumption of uniform reaction efficiency between standards and unknown.
To the best of our knowledge, this is the first method in which the stability and reliability of a standard curve approach is combined with a fitting procedure to overcome the key problem of PCR efficiency determination in real-time PCR nucleic acid quantification. The data reported herein clearly show that the Cy0 method is a valid alternative to the standard method for obtaining reliable and precise nucleic acid quantification even in sub-optimal amplification conditions, such as those found in the presence of biological inhibitors like IgG.

List of abbreviations used

Cp: crossing point Ct: threshold cycle CV: coefficient of variation IgG: immunoglobulin G RE: relative error SCF: sigmoidal curve fitting.

MG and DS carried out the design of the study, participated in data analysis, developed the Cy0 method and drafted the manuscript. MBLR participated in data collection and analysis and critically revised the manuscript. LS carried out the real-time PCR. VS participated in the design of the study and critically revised the manuscript. Alle skrywers het die finale manuskrip gelees en goedgekeur.

We thank Dr. Pasquale Tibollo for technical assistance and Dr. Giosué Annibalini for helpful comments on the manuscript.

1. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R: Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y) 1993, 11(9):1026-1030.

2. Schmittgen TD: Real-time quantitative PCR. Metodes 2001, 25(4):383-385.

3. Bustin SA, Nolan T: Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J Biomol Tech 2004, 15(3):155-166.

4. Gingeras TR, Higuchi R, Kricka LJ, Lo YM, Wittwer CT: Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics. Clin Chem 2005, 51(3):661-671.

5. Bustin SA, Mueller R: Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Londen) 2005, 109(4):365-379.

6. Nolan T, Hands RE, Bustin SA: Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Natuurprotokolle 2006, 1(3):1559-1582.

7. Marubini E, Verderio P, Raggi CC, Pazzagli M, Orlando C: Statistical diagnostics emerging from external quality control of real-time PCR. The International journal of biological markers 2004, 19(2):141-146.

8. Pfaffl M: Quantification strategies in real time PCR. In A-Z of quantitative PCR Edited by: Bustin SA La Jolla, CA, International University Line 2004.

9. Luu-The V, Paquet N, Calvo E, Cumps J: Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction. Biotegnieke 2005, 38(2):287-293.

10. Livak KJ: ABI Prism 7700 sequence detection system. User Bulletin 2. PE Applied Biosystems 1997.

11. Rutledge RG, Cote C: Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nukleïensure Res 2003, 31(16):e93.

12. Raeymaekers L: A commentary on the practical applications of competitive PCR. Genoom Res 1995, 5(1):91-94.

13. Bar T, Stahlberg A, Muszta A, Kubista M: Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR. Nukleïensure Res 2003, 31(17):e105.

14. Lefevre J, Hankins C, Pourreaux K, Voyer H, Coutlee F: Prevalence of selective inhibition of HPV-16 DNA amplification in cervicovaginal lavages. Journal of medical virology 2004, 72(1):132-137.

15. Sunen E, Casas N, Moreno B, Zigorraga C: Comparison of two methods for the detection of hepatitis A virus in clam samples (Tapes spp.) by reverse transcription-nested PCR. International journal of food microbiology 2004, 91(2):147-154.

16. Jiang J, Alderisio KA, Singh A, Xiao L: Development of procedures for direct extraction of Cryptosporidium DNA from water concentrates and for relief of PCR inhibitors. Applied and environmental microbiology 2005, 71(3):1135-1141.

17. Kontanis EJ, Reed FA: Evaluation of real-time PCR amplification efficiencies to detect PCR inhibitors. J Forensic Sci 2006, 51(4):795-804.

18. Liu W, Saint DA: Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics. Biochem Biophys Res Commun 2002, 294(2):347-353.

19. Goll R, Olsen T, Cui G, Florholmen J: Evaluation of absolute quantitation by nonlinear regression in probe-based real-time PCR. BMC Bioinformatika 2006, 7:107.

20. Karlen Y, McNair A, Perseguers S, Mazza C, Mermod N: Statistical significance of quantitative PCR. BMC Bioinformatika 2007, 8:131.

21. Bustin SA: Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 2000, 25(2):169-193.

22. Tichopad A, Didier A, Pfaffl MW: Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue-specific contaminants. Mol Cell Probes 2004, 18(1):45-50.

23. Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA: SPUD: a quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Anal Biochem 2006, 351(2):308-310.

24. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF: Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett 2003, 339(1):62-66.

25. Richards F: A flexible growth function for empirical use. Journal of experimental Botany 1959, 10:290-300.

26. Rutledge RG: Sigmoidal curve-fitting redefines quantitative real-time PCR with the prospective of developing automated high-throughput applications. Nukleïensure Res 2004, 32(22):e178.

27. Alvarez MJ, Vila-Ortiz GJ, Salibe MC, Podhajcer OL, Pitossi FJ: Model based analysis of real-time PCR data from DNA binding dye protocols. BMC Bioinformatika 2007, 8(1):85.

28. Meijerink J, Mandigers C, van de Locht L, Tonnissen E, Goodsaid F, Raemaekers J: A novel method to compensate for different amplification efficiencies between patient DNA samples in quantitative real-time PCR. J Mol Diagn 2001, 3(2):55-61.

29. Stahlberg A, Aman P, Ridell B, Mostad P, Kubista M: Quantitative real-time PCR method for detection of B-lymphocyte monoclonality by comparison of kappa and lambda immunoglobulin light chain expression. Clin Chem 2003, 49(1):51-59.

30. Feller W: On the logistic law of growth and its empirical verification in biology. Acta Bioth Ser A 1940(2):51-66.

31. Birch C: A new generalized logistic sigmoid growth equation compared with the Richards growth equation. Annale van Plantkunde 1999, 83:713-723.

32. Yin X, Goudriaan J, Lantinga EA, Vos J, Spiertz HJ: A flexible sigmoid function of determinate growth. Ann Bot (Lond) 2003, 91(3):361-371.

33. Lalam N: Estimation of the reaction efficiency in polymerase chain reaction. J Theor Biol 2006, 242(4):947-953.

34. Zhao S, Fernald RD: Comprehensive algorithm for quantitative real-time polymerase chain reaction. J Comput Biol 2005, 12(8):1047-1064.

35. Gevertz JL, Dunn SM, Roth CM: Mathematical model of real-time PCR kinetics. Biotechnol Bioeng 2005, 92(3):346-355.

36. Peirson SN, Butler JN, Foster RG: Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nukleïensure Res 2003, 31(14):e73.

37. Tichopad A, Dilger M, Schwarz G, Pfaffl MW: Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up. Nukleïensure Res 2003, 31(20):e122.

38. Liu W, Saint DA: A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Anal Biochem 2002, 302(1):52-59.

39. Livak KJ, Flood, S.J., Marmaro, J., Giusti, W., Deetz, K.: Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods appl 1995, 4:357-362.

Additional file 2 -
Windows Word file containing first and second derivative of Richards equation and the mathematical formulas for obtaining the coordinate of the Cy0punt. Additional file 4 -
Windows Excel file containing the results obtained with the SCF approach based on a previous study by Rutledge 2004. Additional file 5 -
Windows Excel file containing the results obtained with the SCF approach based on a previous study by Rutledge 2004 in presence of IgG.

1. Torres I, López-Cevallos DF, Sacoto F. Elites can take care of themselves𠅌omment on COVID-19: the rude awakening for the political elite in low-income and middle-income countries. BMJ Global Health. 20205:e003063. doi:10.1136/bmjgh-2020-003063

2. Dong E, Du H, Gardner L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infect Dis. 202020:P533–P534. doi:10.1016/S1473-3099(20)30120-1

3. WHO. Criteria for releasing COVID-19 patients from isolation. World Heal Organ Sci Br. 2020.

4. Gombar S, Chang M, Hogan CA, et al. Persistent detection of SARS-CoV-2 RNA in patients and healthcare workers with COVID-19. J Clin Virol. 2020129:104477. doi:10.1016/j.jcv.2020.104477

5. Xiao AT, Tong YX, Zhang S. False-negative of RT-PCR and prolonged nucleic acid conversion in COVID-19: rather than recurrence. J Med Virol. 202092:1755�. doi:10.1002/jmv.25855

6. Tom MR, Mina MJ. To interpret the SARS-CoV-2 test, consider the cycle threshold value. Clin Infect Dis. 202071:ciaa619. doi:10.1093/cid/ciaa619

7. Krupp KF, Madhivanan P, Perez-Velez CM. Should qualitative RT-PCR be used to determine release from isolation of COVID-19 patients? J Infect. 202010:46. doi:10.1016/j.jinf.2020.06.030

8. Bullard J, Dust K, Funk D, et al. Predicting infectious SARS-CoV-2 from diagnostic samples. Clin Infect Dis. 2020:ciaa638. Doi:10.1093/cid/ciaa638.

9. La Scola B, Le Bideau M, Andreani J, et al. Viral RNA load as determined by cell culture as a management tool for discharge of SARS-CoV-2 patients from infectious disease wards. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 202039:1059�. doi:10.1007/s10096-020-03913-9

10. Yu F, Yan L, Wang N, et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clin Infect Dis. 202071:793�. doi:10.1093/cid/ciaa345

11. Xu K, Chen Y, Yuan J, et al. Factors associated with prolonged viral RNA shedding in patients with COVID-19. Clin Infect Dis. 202071:709�. doi:10.1093/cid/ciaa351

12. Gotelli N, Ellison AM. A Primer of Ecological Statistics. Second ed. Sunderland, MA: Sinauer Associates 2013.

13. Rao SN, Manissero D, Steele VR, Pareja J. A systematic review of the clinical utility of cycle threshold values in the context of COVID-19. Infect Dis Ther. 20209:573�. doi:10.1007/s40121-020-00324-3

14. Wölfel R, Corman VM, Guggemos W, et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Natuur. 2020581:465�. doi:10.1038/s41586-020-2196-x

15. CDC. Discontinuation of isolation for persons with COVID-19 not in healthcare settings (Interim guidance). 2020. Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/disposition-in-home-patients.html. Accessed August 3 , 2020 .

16. Frieden TR, Lee CT. Identifying and interrupting superspreading events—implications for control of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 202026:1059�. doi:10.3201/eid2606.200495

17. Li R, Pei S, Chen B, et al. Substantial undocumented infection facilitates the rapid dissemination of novel coronavirus (SARS-CoV-2). Wetenskap. 2020368:489�. doi:10.1126/science.abb3221

18. Mardani R, Vasmehjani A, Zali F, et al. Laboratory parameters in detection of COVID-19 patients with positive RT-PCR a diagnostic accuracy study. Arch Acad Emerg Med. 20208:e43. doi:10.22037/aaem.v8i1.632

19. Feikin DR, Alraddadi B, Qutub M, et al. Association of higher MERS-CoV virus load with severe disease and death, Saudi Arabia, 2014. Emerg Infect Dis. 201521:2029�. doi:10.3201/eid2111.150764

20. Lalueza A, Folgueira D, Muñoz-Gallego I, et al. Influence of viral load in the outcome of hospitalized patients with influenza virus infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 201938(4):667�. doi:10.1007/s10096-019-03514-1

21. Wishaupt JO, van der Ploeg T, Smeets LC, et al. Pitfalls in interpretation of CT-values of RT-PCR in children with acute respiratory tract infections. J Clin Virol. 202090:1𠄶. doi:10.1016/j.jcv.2017.02.010

22. Drew RJ, O𠆝onnell S, LeBlanc D, et al. The importance of cycle threshold values in interpreting molecular tests for SARS-CoV-2. Diagn Microbiol Infect Dis. 202098:115130. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2020.115130

23. Vashist SK. In vitro diagnostic assays for COVID-19: recent advances and emerging trends. Diagnostics. 202010:202. doi:10.3390/diagnostics10040202

24. Aquino-Jarquin G. The raw Ct values from RT-PCR detection are not viral load quantitation units. Clin Infect Dis. 2020ciaa830. doi:10.1093/cid/ciaa830

25. Poon KS, Tee NWS. Caveats of reporting cycles threshold from SARS-CoV-2 qualitative PCR assays: a molecular diagnostic laboratory perspective. Clin Infect Dis. 2020ciaa1399. doi:10.1093/cid/ciaa1399

26. Tahamtan A, Ardebili A. Real-time RT-PCR in COVID-19 detection: issues affecting the results. Expert Rev Mol Diagn. 202020:453�. doi:10.1080/14737159.2020.1757437

27. Han MS, Byun J, Cho Y, Rim JH. RT-PCR for SARS-CoV-2: quantitative versus qualitative. Lancet Infect Dis. 202021:in press. doi:10.1016/S1473-3099(20)30424-2