Inligting

Hoe kry ek 'n helderder DNA-bande

Hoe kry ek 'n helderder DNA-bande


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek het probeer om 'n goeie kontras vir my DNA-bande te kry, maar ek was nie so suksesvol nie. Ek het die lere gehardloop net om seker te maak ek kry 'n goeie kontras voor verdere eksperimentering. Ek het die gel geskep met 70 ml 1X TAE -buffer, 0,84 g agarose (ongeveer 1,2% gel) en 28 ul EtBr. Ek het die elektroforese boks op 90V gestel vir ongeveer 1 uur met die hoop om 'n beter gel te kry, maar die resultate het dieselfde gelyk asof ek dit op 110V gehardloop het. Ek het 'n foto van my gel aangeheg. Dit is geneem met 'n DSLR, geen flits, blootstellingstyd van 20 sekondes. Enige wenke sal help. Dankie


Ek gebruik gewoonlik 1-2 ul (afhangende van of my ingewande my vertel dat ek baie DNA het, of 'n bietjie daardie dag) in 'n 70% 1% gel (wat waarskynlik 60-65 ml is nadat dit in die mikrogolf gekook is). Ek sukkel hoegenaamd om lere en DNS-monsters van tot 100 ug in putte wat nie veel groter is as ongeveer 4 mm, te sien nie.

Hier is die faktore wat u kan manipuleer om die helderheid te verander:

  • Bedrag van EtBr. Meer is helderder. (Jy gebruik egter reeds baie - om minder te gebruik kan selfs beter wees, want dit sal agtergrond verminder terwyl jy steeds die DNA met EtBr versadig)
  • Hoeveelheid DNA. Meer is helderder. Om raaiskote te vermy, gebruik 'n leer en raadpleeg die instruksies in die handleiding of die spesifikasieblad. Hulle het gewoonlik 'n voorbeeld van 'n gel en sê presies hoe hulle dit gekry het.
  • Jy het gemors. Kry ander mense in die laboratorium goeie gels? Vra hulle om die protokol saam met jou te doen.
  • Voorbereiding van die monster. Gebruik jy 'n laaikleurstof in die regte hoeveelheid? Diffundeer die DNA uit die putte? Spoel u baie daaruit as u laai?
  • Bandwydte. Dit is duidelik dat as u dieselfde hoeveelheid DNA vier keer so breed in 'n put laai, dit vier keer so flouer sal wees.
  • Sterkte van UV -lig. Baie beligters het 'n knop om die intensiteit aan te pas, mense draai dit af om skadelike DNA te vermy wanneer beperkingsfragmente gelsuiwer word. Jy kan ook met intensiteit, gamma en blootstelling in 'n geldoc-masjien speel.
  • Kwaliteit van EtBr. Ek het dit nog nooit gehad nie, maar jou voorraad kan om een ​​of ander rede sleg wees. Vra 'n ander laboratorium vir 'n ul of twee om dit maklik te beheer.
  • Kwaliteit van DNA. Uiteraard moet u monster eintlik DNA bevat en nie afgebreek word nie. U kan die hoeveelheid en suiwerheid maklik met 'n spektrofotometer kontroleer, maar dit sal u nie vertel of die DNA in sy nukleotiede verteer is nie (dit word gewoonlik met 'n gel nagegaan).
  • Hoeveelheid gel. Die deurslaggewende veranderlike is natuurlik nie die totale hoeveelheid EtBr nie, maar konsentrasie. Minder gel, helderder bande - maar dit lyk of jy 'n standaard hoeveelheid gel gebruik.
  • Kwaliteit van gel. Weereens, dit het nooit gebeur nie, maar probeer om die gel met iemand anders se reagense te maak.

Ek kan sien dat jy 'n leer in die middel het, so daar is beslis 'n bietjie DNA.

Hou ook in gedagte dat kameras van die rak af nie goed is om die EtBr-fluoressensie te beeld nie, want die golflengte is 'n bietjie ongewoon. Die mooi foto's wat u in papiere sien, word geneem met 'n gespesialiseerde geldokmasjien of 'n kamera met 'n geskikte filter.


PGLO Lab Analise

Plasmiede is stukke sirkelvormige DNA wat in bakterieë voorkom, wat kan kodeer vir gene wat kan veroorsaak dat die bakterieë ekstra "eienskappe" het. Met die pGLO-plasmied laat hierdie ekstra "eienskap" bakterieë gloei (van die Groen Fluorescent Proteïen wat ingevoeg is) en het ook weerstand teen ampicillien (van die beta-laktamase-proteïen). Deur die pGLO -plasmied by te voeg, kan die E.coli -bakterie op agar groei met arabinosuiker en ampisillien. Die belangrikste rede om hierdie laboratorium te doen, is om beter te verstaan ​​hoe gene eienskappe beheer; die beste manier om dit te doen is deur mutagenese te doen. Daar is 'n paar verskillende maniere om mutagenese voor te vorm en in hierdie laboratorium word dit gedoen deur 'n transposon by die pGLO-plasmied te voeg en dan te kyk hoe die transposon 'n uitwerking het op hoe die bakterie lyk en groei. Deur te kyk hoe die bakterieë groei en lyk, kan ons bepaal waar die transposon ingevoeg is, dit help ons beter om te verstaan ​​hoe gene eienskappe beheer. In die monster het ons gewerk met die gemutageniseerde bakterieë wat nie groen onder UV -lig gloei nie, wat ons vertel dat die transposon in die araC -geen geplaas is en in die elektroforese gel bevestig word.

Plasmiede is bestudeer in genetiese navorsing sedert hulle in 1952 deur Joshua Lederberg ontdek is. Hulle is gebruik om uit te vind hoe sekere bakterieë op verskillende tipes antibiotika reageer en om te verander hoe bakterieë funksioneer deur dinge by die plasmiede te voeg. In hierdie laboratorium was die plasmied waarop ons gefokus het, die pGLO -plasmied. Hierdie plasmied het drie hoofkoderende streke waarna ons sal kyk. Die eerste gene-gebied is die gebied wat kodeer vir die beta-laktamase (bla) ensiem. “Die beta-laktamase proteïen word geproduseer en afgeskei deur bakterieë wat die plasmied bevat. Betalaktamase inaktiveer die ampisillien wat in die LB-voedingsagar voorkom, wat bakteriële groei moontlik maak. Slegs getransformeerde bakterieë wat die plasmied bevat en beta-laktamase uitdruk, kan oorleef op plate wat ampisillien bevat. (Leatherman 2011). Die Green Fluoresce Protein (GFP) is 'n geenkode wat in die pGLO-plasmied ingevoeg word om dit met behulp van die araC-geen onder UV-lig groen te laat gloei. Die araC-geen kodeer vir 'n proteïen wat aan arabinose en die promotorgebied bind, ook in die teenwoordigheid van arabinose, wanneer dit aan die promotorstreek van die GFP-geen gebind word, vertaal dit die proteïen wat die bakterieë groen sal laat gloei.

Mutagenese kom nie baie gereeld in die natuur voor nie, maar kan gereeld in genetiese laboratoriums gebruik word om verskillende funksies van bakterieë en plasmiede te bestudeer. Deur mutagenese op bakterieë te doen kan ons beter verstaan ​​hoe bakterieë gene vertaal en hoe hulle op hul omgewing reageer wanneer iets verander word. Daar is 'n paar maniere om mutagenese uit te voer, soos om chemikalieë of X-strale te gebruik. In hierdie eksperiment word mutagenese uitgevoer deur 'n transposon in die pGLO plasmied te plaas. Die Tn5 -transposon word ingevoeg in die pGLO -geen wat die Tn5 -transposon kodeer vir 'n proteïen wat kan lei tot weerstand van kanamisien, wat ons sal help om te sien of die transposon korrek ingevoeg is.

Nadat die transposon in die pGLO -plasmied ingevoeg is, sal dit deur transformasie deur die E.coli -bakterie opgeneem word. Transformasie is wanneer bakterieë gratis DNA uit hul omgewing inneem. Sodra die plasmiede ingeneem is, is die bakterieë op voedingsagare gekweek met verskillende kombinasies van ampisillien, kanamisien en arabinose saam met kontrolegroepe om te sien hoe die mutante bakterieë deur die transposon beïnvloed word.

Bakterieë gebruik beperkingsensieme op hul eie om van bakteriofage ontslae te raak deur óf die proteïene wat hulle maak te sny óf deur die faag direk te sny (Aude). Ons is in staat om hierdie beperkingsensieme te gebruik om beperkingsensiemvertering te doen om die plasmiede wat in die bakterieë geplaas is, te sny. 'Beperkingsensieme word algemeen gebruik om DNA by spesifieke nukleotiedreekse te sny. Dikwels is dit om 'n nuwe 'rekombinante stuk DNA' te maak, en word gevolg deur twee stukke saam te lig. (Leatherman 2011). Die plasmiede is op bekende plekke van die plasmied met Nde 1- en EcoR1 -ensieme gesny. As ons die hoeveelheid basispare in die plasmied (5,400 bp) ken en waar die beperkingsensieme sny, kan ons die verskillende stukke van die gesnyde plasmied ondersoek om uit te vind waar die transposon ingevoeg is.

Gebruik die Tn5-invoegstel om die Tn5-transposon in die pGLO-plasmied in te voeg. Die eerste stap was om 6,4 mikroliter water, 1 mikroliter EZ Tn5 10X reaksiebuffer, 1 mikroliter 0,2 mikrogram/mikroliter pGLO-plasmied, 0,6 mikroliter Tn5-transposon en 1 mikroliter EZ-Tn5-transposase te meng (help transposon ) in hierdie volgorde en meng deur vortex, dan sentrifugeer. Inkubeer die buis by 37 grade Celsius vir 50 minute, haal dan die buis uit en draai weer en plaas die buis vir nog 50 minute in die broeikas. Draai nog 'n keer en voeg 1 mikroliter stopoplossing by die buis en meng goed en draai vloeistof weer onder in die buis. Verhit buis tot 70 grade vir 10 minute bêre in vrieskas vir volgende keer.

Dra 1,5 ml E.coli oor na drie mikrosentrifugeringsbuise en sit 10 minute op ys. Sentrifugeer buise vir 1 minuut en raak ontslae van alle supernatant. Voeg 300 mikroliter yskoue CaCl by2 los die korrel heeltemal op deur al drie buise te pipet en plaas buise op ys vir 2 minute. Sentrifugeer buise vir 1 minuut en gooi die supernatant weg. Voeg 60 mikroliter CaCL by2 weer na elke buis en suspendeer die korrel saggies en sit op ys vir 10 minute. Benoem die drie buise, Geen DNA, pGLO wt en pGLO mutant. Voeg niks, 1 mikroliter pGLO DNA, en 1 mikroliter Tn5 mutagenese pGLO reaksie onderskeidelik by elke buis. Meng buise liggies deur daarop te tik en plaas op ys vir 15 minute. Verhit die buise presies 90 sekondes by 42 grade en keer dit onmiddellik terug na ys vir 2 minute. Voeg 1 ml LB -sous by die buise, plaas dan die inhoud van elke buis in 'n proefbuis en inkubeer by 37 grade vir 30 minute met skud. Verkry en benoem 5 verskillende agarplate soos in tabel 1 getoon en benoem dit. Plaas bakterieë in nuwe mikrosentrifugeringsbuise en draai dit vir 1 minuut en verwyder 500 mikroliter supernatant, suspendeer bakterieë weer in sous. Voeg 200 mikroliter van elke reaksie by hul onderskeie agarplate en versprei bakterieë oor die agarplate. Inkubeer borde vir 'n dag by 37 grade in die voorbereidingskamer.

Tabel 1. DNS gevoeg by die verskillende plate en voorspellings.

Berei twee steriele kultuurbuisies voor met 5 mL LB-bouillon, een met ampisillien en een met kanamisien, etiket wat is wat. Ondersoek plate en kies op wilde-tipe kolonie en sit kolonie in die LB-sous met ampisillien. Kyk na plaat met die pGLO-mutant en kyk of enige van die kolonies onder UV-lig groen gloei. Kolonie wat vir hierdie eksperiment gekies is, was wit. Neem kolonie en sit in LB sous met kanamisien. Plaas die buise in die broeikas by 37 grade en inkubeer dit oornag. Kyk na alle plate en vergelyk die resultate met jou voorspellings. Kry kulture uit die broeikas en plaas dit in 15 ml buis om te sentrifugeer. Spin in verkoelde sentrifugeer teen 3000 rpm vir 5 minute en gooi supernatant weg. Voeg 250 mikroliter P1-buffer (verwyder RNA) by elke bakteriekorrel en sit die korrel weer op en plaas dit onmiddellik in die mikrosentrifugerbuis. Voeg 250 mikroliter P2 -buffer (lys van selle) by en meng deur nie meer as 5 minute om te keer nie. Voeg 350 mikroliter N3-buffer by (pH ideaal vir kolombinding) en meng dadelik deur die buis om te keer. Draai vir 10 minute totdat daar 'n wit korrel vorm. Plaas die supernatant in afsonderlike spinkolomme en draai vir 30 sekondes en gooi dan deurvloeiing weg. Voeg 750 mikroliter PE-buffer (was DNA) by kolom en draai vir 30 sekondes en gooi deurvloei weg. Plaas die kolom in 'n nuwe 1,5 ml mikrosentrifudgebuis voeg 50 mikroliter water (eluering van DNA) by die draaikolom en laat dit vir 1 minuut staan. Draai vir 1 minuut, gooi dan die kolom weg en hou die deurvloei. Meet die konsentrasies van die twee DNA-monsters en sit dan in die vrieskas vir volgende week. Konsentrasie van wilde-tipe DNA was 68,2 nano gram/mikroliter met 'n suiwerheid van 1,84 en die mutante DNA het 'n konsentrasie van 81,9 nano gram/mikroliter met 'n suiwerheid van 1,64 wat nie so suiwer was nie

Gebruik die beperkingskaart om die aantal bande in die wildtipe plasmiede wat op die verskillende plekke gesny is, te bepaal.

Tabel 2. Bandgroottes van wilde-tipe plasmiede met verskillende snitte.

Meng elke oplossing op grond van wat elke buis benodig. Gebruik die konsentrasie DNA om te bepaal hoeveel DNA by elke buis gevoeg moet word (500/konsentrasie=hoeveel DNA is nodig).

Ongesny gew Ongesnyde mutant Nde1 gew Nde1 mutant EcoR1 gew EcoR1 -mutant Nde1 + EcoR1 gew Nde1 + EcoR1 mutant
Water 12.67 13.9 10.17 11.4 10.17 11.4 10.12 11.4
10X buffer Geen Geen 2 buffer 4 2 buffer 4 2 EcoR1 buffer 2 EcoR1 buffer 2 EcoR1 buffer 2 EcoR1 buffer
DNA: 5 milligram 7.33 6.1 7.33 6.1 7.33 6.1 7.33 6.1
Nde1 ensiem (20 eenhede/mikroliter) Geen Geen .5 .5 Geen Geen .5 .5
EcoR1 -ensiem (20 eenhede/mikroliter) Geen Geen Geen Geen .5 .5 .5 .5

Tabel 3. Mengsels van elke buis. (alles in mikroliter)

Plaas die agt buise in broeikas by 37 grade vir 1,5 uur vir reaksie om voort te gaan, sodra 1,5 uur op is, sit buise in vrieskas vir volgende keer.

Verdun 50X buffer tot 1X buffer voeg 20 mili liter 1X TAE buffer by in 'n gegradueerde silinder en voeg dan 980 mili liter water by die silinder. Maak 'n 1,2% agarosegel, weeg 0,6 gram poeieragarose en maak dit leeg in 'n fles, neem dan 50 ml 50X TAE -buffer en voeg dit by die fles. Meng die agarose en die buffer en sit dit dan ongeveer 'n minuut in die mikrogolfoond of totdat die oplossing helder is. Laat die fles afkoel totdat u aan die fles kan raak sonder om jouself te verbrand. Plaas die skinkbord in die lopende boks met albei kante na bo en die kam in plek en gooi die agarose-oplossing in die skinkbord. Laat die agarose sit totdat dit 'n melkerige wit kleur word en hard word. Terwyl jy wag, laai 2 mikroliter 10X laai kleurstof in elke buis en meng deur te pipet. Laat sak die kante van die skinkbord en vul dan die loopboks met die TAE-buffer totdat dit die bokant van die jel bedek. Laai die 1 kb -leer heel links met 10 mikro liter 1 kb -leer. Neem die PCR -reaksies van die vorige week en vul die volgende 8 spasies in die gel in met 20 mikro liter van die beperkingsverteerreaksies. Nadat die gel gelaai is, laat die gel ongeveer 45 minute by 100 volt werk, kyk gereeld of die kleurstowwe in die gel beweeg. Sodra die kleurstof halfpad onder die gel is, haal dit uit die doos en plaas die gel in 'n vlekbak. Giet SYBR -groen in die kleurkas totdat die SYBR -groen die bokant van die gel bedek, draai die boks elke 5 minute. Die SYBR-groen bind aan die DNA en stel ons in staat om onder 'n UV-lig na die DNS te kyk. Haal die jel na 15 minute uit die boks en gooi die SYBR-groen terug in sy bottel. Neem jou gel en plaas dit in 'n UV-boks en neem 'n foto van jou gel om die resultate van jou PCR te sien.

Toe die bakterieë die eerste keer ondersoek is, gloei die gemutageniseerde bakterieë nie groen toe hulle onder UV -lig geplaas word nie, wat beteken dat die transposon homself in die araC -geen of in die GFP -geen kon plaas.

Tabel 4. Resultate van die agarplate.

By die vermenging van die beperkingsensieme, word die beperkingsensiem as buffer beskou as dit by die mutantbuise gevoeg is, wat daartoe lei dat die mutante buise onleesbaar op die gel is.

Figuur 2. Ry 1 is die 1kb leer. 2 wilde-tipe ongesnyde plasmied. 3 wild-tipe nde sny. 4 wilde-tipe ekosnit. 5 wilde tipe eco/nde sny. 6 mutant ongesny. 7 mutante nde snit. 8 mutante ekosnit. 9 mutante eco/nde snit

Uit hierdie gel kan ons sien dat die wilde tipe ongesnyde en EcoR1-snit dieselfde is as wat verwag is. Daar is vier bande op die wilde tipe EcoR1/Nde1-snit in die 300 en 500 streke en in die 1000 en 2000 gebiede. En drie bande op die Nde1 sny in die 300, 1000 en 2000 gebiede. Dus was al die wilde tipe monsters waar hulle voorspel is. Ongelukkig is die mutantmonsters nie leesbaar nie.

Figuur 3. Ry 1 is die 1kb leer. 2 wildtipe ongesnyde plasmied. 3 wild-tipe nde sny. 4 wilde-tipe ekosnit. 5 wild-tipe eco/nde sny. 6 mutant ongesny. 7 mutante nde snit. 8 gemuteerde eko-snit. 9 mutante eco/nde snit.

In hierdie figuur kan u sien dat dit in ry 6 nie so ver gegaan het as die wildtipe ongesnyde in ry 2 wat ons vertel het dat die transposon in die monster is nie. As daar na ry 7 en 9 gekyk word, is daar 'n vermiste staaf by ongeveer 1 800 basispare soos in rye 3 en 5. Dit is waar die transposon self in die araC-geen ingevoeg word wat in een van die Nde1-snitte is wat ongeveer 1 800 basisse is. -pare. In die gel veroorsaak die toevoeging van die transposon tot hierdie gebied dat die 1800 bar weer bly waar die 2,800 basispaarstaaf is en dit net soos een staaf op die gel laat lyk.

Die transposon is gevind in die araC geen van die pGLO plasmied vanaf die jel resultate. Omdat die transposon in die araC -geen is, maak dit nie die proteïen wat bind aan die promotorstreek van die GFP -geen nie, wat veroorsaak het dat die gemutageniseerde bakterieë nie groen onder die UV -lig gloei nie. Die invoeging van die transposon in die araC -geen kan ook verduidelik waarom daar so min mutante groei op die plaat was waarop die mutante bakterieë geplaas is. Die probleem met die oorspronklike gel was dat meer ensiem by die buise gevoeg is, wat die mutante monsters onleesbaar op die gel gemaak het.

Aude A Bourniquel, Thomas A Bickle, Komplekse beperkingsensieme: NTP-aangedrewe molekulêre motors, Biochimie, Volume 84, uitgawe 11, 1 November 2002, bladsye 1047-1059, ISSN 0300-9084, 10.1016/S0300-9084 (02) 00020- 2.

Leatherman J. 2011 Genetics Laboratory Manual. Universiteit van Noord -Colorado


Hoe DNA-profilering werk

Die term "DNA", wat eers slegs deur wetenskaplikes gebruik is, het 'n alledaagse deel van ons woordeskat geword. Dit is amper onmoontlik om onbewus te wees van die impak wat die gebruik van DNS op alles van die hofstelsel tot genealogie gehad het. Dit is ook byna onmoontlik om onbewus te wees van die kontroversie. Noudat ons teoreties elkeen 'n profiel kan hê wat ons uitsluitlik deur ons DNA kan identifiseer, is baie mense bekommerd oor hoe daardie profiel gebruik kan word.

Jy het waarskynlik 'n goeie idee van wat DNA is -- indien nie, lees How DNA Works vir die volledige storie. Wat jy egter dalk nie weet nie, is presies watter tipe inligting DNA-bewyse oplewer, hoe dit verwerk word en hoe dit ontleed word. Dit is waar DNA-profiele inkom.


Roger Tully/Stone/Getty Images
As deel van die DNS-profielproses ondersoek 'n tegnikus DNS-volgordebepalinggel.

In enige situasie waar DNA gebruik mag word, moet 'n DNA -profiel geskep word. Ook bekend as DNA of genetiese tik, is DNA-profilering bloot die versameling, verwerking en ontleding van VNTR'e -- unieke rye op die lokusse (area op 'n chromosoom). VNTR staan ​​vir veranderlike getal tandem herhalings - wat beteken dat die tandem herhalings, of pare nukleotiede, in getal wissel. Die meeste DNA -rye in verskillende mense lyk te eenders om van mekaar te onderskei. Na verwerking lei VNTR's egter tot bands wat uniek genoeg is om vir identifikasie gebruik te word. Hierdie verskille is in 1984 deur dr. Alec Jeffreys ontdek terwyl hy na die resultate van 'n eksperiment kyk, met behulp van DNA van verskillende familielede van een van sy laboratoriumtegnici.

Tot 1987 - toe die tegniek gekommersialiseer is - was Jeffreys se laboratorium die enigste ter wêreld wat DNA -vingerafdrukke gedoen het (die oorspronklike naam vir DNA -profilering, wat verander is weens die verwarring met werklike vingerafdrukke).

Alhoewel dit eenvoudig genoeg klink, is daar eintlik verskeie verskillende tegnieke om 'n DNS-profiel te skep, en nuwe tegnologie kom altyd na vore. Ons sal volgende na hierdie tegnieke kyk.

As hulle almal veronderstel is om tot 'n soortgelyke resultaat te kom - 'n unieke DNS-profiel - hoekom is daar dan soveel verskillende tegnieke vir ontleding? Watter tegniek om te gebruik, hang af van 'n paar faktore, insluitend koste, tyd beskikbaar vir analise en die kwaliteit en hoeveelheid van die beskikbare DNA -monster.

Die eerste metode om 'n DNA -profiel te skep, was RFLP, of beperking fragment lengte polimorfisme.RFLP word deesdae nie so gereeld gebruik nie, omdat dit 'n groot hoeveelheid DNS benodig-tot 25 hare of 'n nikkeltjie liggaamsvloeistof-en dit kan so lank as 'n maand neem om te voltooi [bron: Baden]. Dit vereis ook dat verskeie dele van die DNA-string ondersoek word om variasies te vind, wat tydrowend is en meer ruimte vir menslike foute laat. Sommige van die stappe vir RFLP-analise word ook in ander tipes DNA-profiele gebruik. Vir RFLP is die stappe:

  1. Skei wit en rooi bloedselle met 'n sentrifuge.
  2. Onttrek DNA -kerne uit die witbloedselle. Dit word gedoen deur die selle in warm water te bad, dan sout by te voeg en die mengsel terug in die sentrifuge te plaas [bron: Universiteit van Arizona].
  3. Sny DNA -string in fragmente met behulp van a beperking ensiem.
  4. Plaas fragmente in die een kant van 'n bed van agarose gel met elektrodes daarin. Agarose-jel word gemaak van agar-agar, 'n soort seewier wat in gelatien in kokende water in gelatien verander.
  5. Gebruik 'n elektriese stroom om die DNA -segmente volgens lengte te sorteer. Hierdie proses word genoem agarose gel elektroforese. Elektroforese verwys na die proses om die negatief-gelaaide molekules met elektrisiteit deur die jel te beweeg. Korter segmente beweeg verder weg van hul oorspronklike ligging, terwyl langers nader bly. Die segmente belyn in parallelle rye.
  6. Gebruik 'n vel nitrosellulose of nylon om die DNA te klap. Die laken is gevlek sodat die verskillende lengtes van DNA -bande met die blote oog sigbaar is. Deur die vel met bestraling te behandel, kan 'n outoradiograaf geskep word. Dit is 'n beeld op x-straalfilm wat deur die vervalpatroon van die straling gelaat word. Die autoradiograaf, met sy kenmerkende donkerkleurige parallelle bande, is die DNA-profiel.

PCR (polimerase kettingreaksie) analise is gewoonlik die eerste stap in die skepping van 'n DNA -profiel vandag. PCR kan 'n klein hoeveelheid DNA repliseer om 'n groter monster vir ontleding te skep. Dit word gedoen met behulp van 'n herhalingsproses wat ongeveer vyf minute duur. Eerstens, a hitte-stabiele DNA-polimerase -- 'n spesiale ensiem wat aan die DNA bind en dit laat repliseer -- word bygevoeg. Vervolgens word die DNA -monster tot 93 ° C verhit om die drade te skei. Daarna word die monster afgekoel en verhit. Verhitting verdubbel die aantal kopieë. Nadat hierdie proses sowat 30 keer herhaal is, is daar genoeg DNA vir verdere ontleding.

PCR is die eerste stap in die ontleding STRs (kort tandem herhalings), wat baie klein, spesifiek is allele in 'n veranderlike getal tandem herhaal (VNTR). Allele is pare gene wat afwisselend op 'n spesifieke punt voorkom, of loci, op 'n chromosoom. STR's word verder verduidelik in Hoe DNA -bewyse werk. Die ontleding van STR's is meer akkuraat as die RFLP -tegniek, omdat hulle klein grootte dit makliker maak om te skei en te onderskei.

'n Variasie op STR-analise is Y-STR. Slegs STR's wat op die Y-chromosoom gevind word (wat slegs mans het) word ontleed. STR-analise is nuttig as die monster gemengde DNA het (van beide mans en vroue) of in gevalle van seksuele aanranding met 'n manlike aanvaller. Y-STR word andersins net soos 'n gewone STR verwerk.

AmpFLP, polimorfisme van versterkte fragmentlengte, is 'n ander tegniek wat PCR gebruik om DNA te herhaal. Net soos RFLP gebruik dit eers 'n beperkingsensiem. Vervolgens word die fragmente met behulp van PCR versterk en gesorteer met behulp van gelelektroforese. Die voordeel van AmpFLP bo ander tegnieke is dat dit outomaties kan wees en nie baie kos nie. Die DNS-monster moet egter van hoë gehalte wees, anders kan foute ontstaan, wat die geval is met die meeste DNS-ontledingstegnieke. Ontleders kan tyd hê om die lang dele van mekaar te onderskei omdat hulle styf saamtrek.

In hierdie artikel kyk ons ​​na hoe DNA -profiele gebruik word en waarom dit kontroversie veroorsaak.

Gebruik van DNA -profiele in wetstoepassing

DNA is gereeld in die nuus, maar een van die mees onlangse verhale bevat 'n nuwe term: aanraak -DNA. Alhoewel dit nuut in die media is, bestaan ​​daar al 'n paar jaar aanraking -DNA. DNS word gewoonlik herwin uit liggaamsvloeistowwe soos bloed en semen, wat dikwels gevind word deur die vlekke wat hulle agterlaat. Raak -DNA behels die herwinning van DNA uit velselle wat die oortreder gelaat het.

In die JonBenet Ramsey-saak het ondersoekers klere wat JonBenet gedra het, geskraap. Daar was genoeg bewyse op twee verskillende plekke om 'n DNS-profiel te skep wat ooreenstem met een wat reeds uit bloed geskep is - albei behoort aan 'n man wat nie aan JonBenet verwant is nie. Dit het die aanklaers oortuig dat die familie Ramsey nie vir JonBenet se dood verantwoordelik was nie.

Wat is die volgende as die profiel eers geskep is? Dit hang regtig af van hoe die DNS-profiel gebruik moet word. As dit ontstaan ​​uit DNA wat tydens 'n kriminele ondersoek herwin is, sal aanklaers in die Verenigde State dit in CODIS, die Combined Data Index System, invoer. CODIS is 'n rekenaarprogram wat deur die FBI onderhou word, wat databasisse regoor die land bedryf. Hierdie databasisse bevat meer as vyf miljoen profiele. CODIS bevat verskeie verskillende indekse:

  • Die Oortrederindeks bevat die profiele van mense wat skuldig bevind is aan verskeie misdade. Die misdade wat tot die insluiting van die oortredersindeks lei, wissel na gelang van die staat, en wissel van sekere oortredings tot seksuele misdrywe en moord.
  • Die Arresteerde Indeks bevat profiele van mense wat gearresteer is vir die pleeg van spesifieke geweldsmisdade. Die presiese misdade wissel ook per staat.
  • Die Forensiese Indeks bevat profiele wat uit misdaadtoneelbewyse geneem is, insluitend bloed, speeksel, semen en weefsel.
  • Die Vermiste Persone Indeks bestaan ​​uit twee indekse: ongeïdentifiseerde persone, wat die profiele bevat wat uit die oorskot van ongeïdentifiseerde persone herwin is en verwysing, wat profiele bevat van familielede van vermiste persone. Hierdie twee indekse word periodiek met mekaar vergelyk om te bepaal of 'n vermiste persoon se oorskot teruggevind is.


Foto met vergunning: Federale Buro vir Ondersoek (FBI)
Dit is 'n voorbeeld van 'n DNA -profiel in die FBI se CODIS -databasis.

CODIS gebruik algoritmes om 13 verskillende STR -liggings te vergelyk, plus een wat die geslag van die betrokke persoon bepaal. Dit het reëls en voorsorgmaatreëls om die privaatheid te beskerm van mense wie se profiele in die databasis is. Die ooreenstemmende algoritmes-wat deur 'n ontleder bevestig moet word-kan lei vir wetstoepassing of selfs 'n moontlike aanvaller identifiseer. Die nadeel van die gebruik van CODIS is dat dit net so sterk is soos die aantal profiele wat ingesluit is, en daar is 'n agterstand van meer een miljoen profiele wat ingevoer moet word.

Aanklaers kan ook DNA -kundiges gebruik om profiele te pas terwyl hulle sake bou waar die sekerheid van die aanvaller hoog is. DNA -profilering word egter meer en meer gebruik vir mense wat skuldig bevind is voor die algemene gebruik, wat aan die einde van die tagtigerjare begin het. Sedert die vroeë negentigerjare kon veroordeelde misdadigers die nuutste DNA -profileringstegnologie gebruik as deel van hul appèlproses. Die meeste state het wette wat uitdruklik die regte beskryf wat veroordeelde misdadigers op DNA -toetsing het. In sommige gevalle kan mense enige tyd addisionele toetsing versoek, terwyl hulle dit in ander moet doen binne 'n paar jaar na hul skuldigbevinding.

Die aandag op DNA-toetsing ná die skuldigbevinding het werklik begin met 'n verslag van die National Institute of Justice van 1996 wat 28 mense in die kollig geplaas het op skuldigbevinding aan moord en wat vrygespreek is weens latere DNA-toetse. Sedert 1989 is meer as 218 veroordeelde misdadigers vrygelaat nadat DNS-toetse hul onskuld bewys het. Die ware oortreder is in 84 van die gevalle geïdentifiseer [bron: The Innocence Project].

Gebruik van DNA-profiele in Genealogie


Kimberly Butler/Time Life Pictures/Getty Images
DNS-profiele wat gebruik is om afkoms te pas, het Julia Jefferson Westerinen aan die derde president van die Verenigde State verbind. Me Westerinen se oupagrootjie was Eston Jefferson, die seun van Thomas Jefferson en Sally Hemings.

Afgesien van kriminele verhore en appèlle, het DNA -profilering 'n belangrike hulpmiddel in genealogie geword. Baie maatskappye verskaf DNS-profiele vir hierdie doel. Een van die grootstes, Family Tree DNA, gebruik Y-SRT-toetse om vaderlike afstamming en mtDNA (mitochondriale DNA-toetsing) te bepaal om moederlike afstamming te bepaal. Wanneer 'n embrio verwek word, kom sy mitochondria - strukture binne selle wat energie van voedsel omskakel - van die moeder se eiersel, terwyl die vader se sperm slegs kern-DNS bydra [bron: Human Genome Project, US National Library of Medicine]. Raadpleeg Hoe DNA -bewyse werk vir meer inligting oor mtDNA.

Die skep en berging van DNS-profiele is ook baie omstrede. Namate die databasisse wat deur CODIS gesoek is, uitgebrei is om profiele van meer as net veroordeelde misdadigers te bevat, het sommige mense begin bekommerd wees oor wat wetstoepassing, die regering of selfs private ondernemings met die inligting kan doen. Sodra u profiel in 'n databasis is, kan dit slegs deur 'n hofbevel verwyder word. As jy egter 'n privaat databasis vir genealogiedoeleindes gebruik, kan jy die verwydering van jou profiel versoek.

In April 2008 is die Wet op Genetiese Inligting Diskriminasie in wet onderteken. Dit is ontwerp om te verseker dat versekeringsmaatskappye en werkgewers diskrimineer teen mense wat geneties geneig is tot 'n siekte. Om meer te wete te kom oor wat uitbreidings van DNS-databasisse vir die toekoms kan beteken, sien Hoe toekomstige misdaaddatabasisse sal werk.

Die profiele verskil in die hoeveelheid detail wat hulle kan verskaf en in hoe ver terug in u afkoms hulle 'n pasmaat kan bepaal. 'N Y-DNA67 kan byvoorbeeld 'n uiters noue verband tussen voorouers toon. Dit toets die Y -chromosoom vir genetiese ooreenkomste tussen mans. 'N Perfekte kombinasie van 67 merkers op elke persoon se DNA -string beteken dat hulle 'n gemeenskaplike voorouer in die onlangse geskiedenis het [bron: Family Tree DNA]. Family Tree DNA hou databasisse van mense op soek na voorouers, en as 'n wedstryd gevind word, word albei partye in kennis gestel.

Alhoewel DNS-profiele afkoms kan openbaar, doen maatskappye wat daarin spesialiseer nie enige soort toetse spesifiek om oorerflike defekte of siektes op te spoor nie. Genetiese toetse, wat meer as net DNA -profilering behels, help egter om oorerflike aanlegte vir sommige siektes en geboortedefekte te openbaar. Tydens genetiese toetsing word DNA saam met RNA, proteïene en ander faktore geprofileer en geanaliseer.

DNA -profilering kan dus baie nuttig wees, maar hoe akkuraat is dit om 'n wedstryd te bepaal? Family Tree DNA beweer dat dit binne 'n kans van 99,99 persent van ja of 'n 100 persent waarskynlikheid kan bepaal dat daar geen verhouding bestaan ​​nie, in die geval van ooreenstemming met 'n voorouer [bron: Family Tree DNA]. Dit lyk redelik onweerlegbaar, maar DNA -profilering, veral in strafsake, is nie onfeilbaar nie. In die volgende afdeling kyk ons ​​na die kontroversie wat verband hou met DNA -profilering.

Omstredenheid in DNA -profilering

Toe DNS-profiele die eerste keer in kriminele sake gebruik is, was dit dikwels moeilik vir aanklaers en verdedigingsprokureurs, sowel as die kundiges wat hulle gehuur het om te getuig, om die belangrikheid van hul DNS-passing aan die jurie te verduidelik. Vingerafdrukke word steeds deur die meeste mense beskou as 'n ysterbekeerde manier om iemand te identifiseer, maar 'n deskundige wat oor vingerafdrukke getuig, bespreek dit in terme van "punte van ooreenkoms." DNS-passings word bespreek in terme van statistiese waarskynlikheid deur gebruik te maak van wat tans bekend is oor DNS-ooreenkomste binne die algemene bevolking. Dit het die jurie dikwels verwar of verkeerd geïnterpreteer.


Rob Melnychuk /PhotoDisc/Getty Images
'N Wetenskaplike beskou 'n outoradiograaf, wat een van die eerste metodes vir DNA -profilering is.

Byvoorbeeld, 'n deskundige wat oor DNS-profiele vir die vervolging getuig, kan sê dat die DNS-profiel wat uit die getuienis van die misdaadtoneel geskep is, 'n 4-tot-5 waarskynlikheid (of 80 persent kans) het om ooreenstem met die DNS-profiel wat uit die beskuldigde se monster geskep is. Om te sê dat die waarskynlikheid van die wedstryd 80 persent is, is egter nie dieselfde as om te sê dat die waarskynlikheid van die beskuldigde se skuld 80 persent is nie.

Aan die ander kant kan 'n deskundige wat oor DNS-profiele vir die verdediging getuig, iets sê soos: "Die waarskynlikheid dat hierdie persoon se DNS op die misdaadtoneel gevind is, maar hy het nie die misdaad gepleeg nie, is 1 uit 10 (of 10 persent). " Dit is nie 'n baie hoë waarskynlikheid nie, maar dit neem nie die feit in ag dat die beskuldigde nie net een of ander toevallige persoon is wat van die straat gepluk is nie. Dit is nie waarskynlik dat die DNS-profiel die enigste rede is waarom hy of sy vir die misdaad in hegtenis geneem is nie. DNS is net een stuk in 'n baie groot legkaart.

Die DNS-profiele en die interpretasie daarvan het onder skoot gekom. RFLP -analise is gedeeltelik gestaak weens die moontlikheid van foute. Die risiko van 'n toevallige pas met RFLP is 1 uit 100 miljard. In laboratoriuminstellings is hierdie risiko egter waarskynlik hoër omdat tegnici soortgelyke patrone as identies kan mislees of die analise andersins verkeerd kan uitvoer. 'N Studie in 2002 van die Universiteit van Texas wat die akkuraatheid van DNA -laboratoriums in die Verenigde State uitgevoer het, het getoon dat 1 uit 100 profiele 'n vals resultaat kan gee.

STR -analise is nie so subjektief nie, maar enige DNA -profiel kan 'n vals resultaat gee as dit besmet is. Alhoewel daar geen gedokumenteerde gevalle was van 'n laboratoriumwerker wat opsetlik 'n DNS -monster besmet het nie, is DNA -monsters besmet of selfs verval deur misdadigers om vervolging te vermy. In 1992 is dr. John Schneeberger daarvan beskuldig dat hy een van sy pasiënte verkrag het terwyl sy verdoof was. 'N DNS -profiel is geskep met behulp van die monster wat hy op die slagoffer gelaat het. 'N Profiel van 'n monster van sy bloed stem nie ooreen met die steekproef nie, en die saak is gesluit. Die slagoffer het volgehou, en uiteindelik is dr. Schneeberger skuldig bevind nadat bykomende DNS-monsters 'n pasmaat getoon het. Hy kon die eerste wedstryd vermy deur 'n drein in sy arm, gevul met 'n ander man se bloed en 'n antistollingsmiddel, in te plant en die tegnikus wat sy bloed getrek het, vaardig te kry om dit vanaf daardie plek te doen.

Uiteindelik was DNA -profilering 'n wonderlike hulpmiddel. Dit is egter net een van die vele instrumente wat gebruik word om die waarheid te vind in kriminele ondersoeke, genealogiese soektogte en toetse op siektes. Daar is selde 100 % sekerheid van enigiets.

Vir meer inligting oor DNA -profilering en verwante onderwerpe, kyk na die skakels op die volgende bladsy.


Geskiedenis van vaderskaptoetsing

Toetse vir vaderskap-identifikasie en gesinsverbandkoppeling word al vir meer as 100 jaar gebruik. In die vroeë twintigste eeu was bloedtik die algemeenste metode.

Hierdie metode trek voordeel uit die oorerflikheid van bloedgroepe, wat A, B, AB en O is. Omdat bloedgroep in DNA gekodeer is, erf 'n kind een alleel van elke ouer. Die beoordeling van 'n kind se bloedgroep kan dus insig gee oor die moontlike bloedgroepe van die ouers.

Byvoorbeeld, 'n persoon met bloedgroep O moet twee O-allele hê, een wat van elke ouer geërf word. Maar dit is nie altyd so eenvoudig om te bepaal nie. 'n Individu met tipe A-bloed kan óf een A-alleel en een O-alleel hê, óf twee A-allele. Sien figuur 1 vir 'n grafiek met die moontlikhede van 'n kind se bloedgroep.

Figuur 1. Oorerwing van bloedgroepe. 'N Kind se bloedgroep word bepaal deur die allele wat van die moeder en die vader ontvang word. Elke biologiese ouer skenk een van hul twee ABO-allele aan hul kind. Bloed tipe A vorm ten minste een kopie van die A -alleel, maar hulle kan twee kopieë hê. Die genotipe is óf AA óf AO. Net so kan iemand met bloedgroep B 'n genotipe van óf BB óf BO hê.

Ongelukkig is hierdie tipe toets beperk in die inligting wat dit oor 'n kind se ouers kan verskaf. Dit kan nie 'n biologiese verhouding soos vaderskap bevestig nie. In plaas daarvan kan dit net optree om 'n potensiële ouer uit te sluit op grond van moontlike bloedgroep.

Met vooruitgang in DNS-toetstegnologie het vaderskaptoetsing verskuif na akkurate bevestiging van vaderskap eerder as eenvoudige uitsluiting.


Hoe kry ek 'n helderder DNA-bande - Biologie

Forensiese wetenskaplikes moet van tyd tot tyd die DNS-profiel vir 'n vermiste persoon rekonstrueer uit ontleding van DNS-profiele van naasbestaandes. In hierdie geval word 'n ma van vier kinders vermis. Alle kinders het dieselfde biologiese vader. Resultate van 'n enkele locus sonde -DNA -vingerafdruk -analise vir die vier kinders en hul pa word in die figuur getoon. Ongelukkig het die forensiese wetenskaplike vergeet om die baan met die pa se DNA te benoem.

Nietemin, jy kan aflei dat die allele van die vermiste moeder is:

Tutoriaal

Die rekonstruksie van die vermiste ma se profiel
Elke ouer dra een stel allele by tot elke kind. Die autoradiograaf in hierdie geval bevat DNA van vier kinders en hul pa. Elke kind deel een band met die ma en een met die pa. Jy kan die proses van eliminasie gebruik om te bepaal watter baan die pa se DNA bevat. Dan weet u dat die groepe in die kinders wat nie met die vader gedeel is nie, sekerlik deur die vermiste moeder bygedra is. U kan dus die proses van eliminasie gebruik om die vermiste ma se profiel te rekonstrueer.
Soek bane wat nie bande deel nie
Kyk na die bande in bane 2 en 5. Baan 2 bevat die allele A en B, terwyl baan 5 allele C en D. bevat omdat hierdie bane geen bande in gemeen het nie, en ook geen baan die DNA van die vader kan bevat nie. Onthou dat elke kind een band met die vader en een met die moeder sal deel, wie se DNA nie op hierdie outoradiograaf is nie.
Kyk na die bande in bane 3 en 4. Weereens, daar is geen ooreenstemmende allele nie, so hierdie bane bevat nie die pa se DNA nie. Hou in gedagte dat broers en susters nie noodwendig dieselfde allele van hul ouers erf nie en gewoonlik verskillende DNA -profiele van mekaar sal hê.
Elimineer die moontlikhede om die allele van vader en moeder te bepaal

Omdat 4 van die 5 bane uitgesluit is, is die pa se baan maklik om te identifiseer. Kontroleer u werk deur die baan van die vader by elke baan vir die vier kinders te pas. Weereens, een band van die vader moet ten minste een band vir elke kind pas.

As u eers die allele van die vader geïdentifiseer het, is dit maklik om die genotipe van die moeder te bepaal; sy het die 2 allele wat by hul kinders voorkom, maar nie in die vader se profiel nie.


Hoe kry ek 'n helderder DNA -band - Biologie

Die isolasie en mikroskopiese waarneming van chromosome vorm die basis van sitogenetika en is die primêre metode waarmee klinici chromosomale afwykings by mense opspoor. A kariotipe is die aantal en voorkoms van chromosome, en bevat die lengte, bandpatroon en sentromeerposisie. Om 'n beeld van 'n individu se kariotipe te verkry, fotografeer sitoloë die chromosome en knip en plak dan elke chromosoom in 'n grafiek, of kariogram, ook bekend as 'n ideogram (Figuur 1).

Figuur 1. Hierdie kariotipe is van 'n vroulike mens. Let daarop dat homoloë chromosome dieselfde grootte is, en dieselfde sentromeerposisies en bandpatrone het. 'N Menslike mannetjie sou 'n XY -chromosoompaar hê in plaas van die XX -paar wat getoon word. (krediet: Andreas Blozer et al)

In 'n gegewe spesie kan chromosome geïdentifiseer word deur hul getal, grootte, sentromeerposisie en bandpatroon. In 'n menslike kariotipe, outosome of “liggaamschromosome” (al die nie-geslag chromosome) is oor die algemeen georganiseer in benaderde volgorde van grootte van grootste (chromosoom 1) tot kleinste (chromosoom 22). Die X- en Y -chromosome is nie outosome nie.Chromosoom 21 is egter eintlik korter as chromosoom 22. Dit is ontdek na die benaming van Down -sindroom as trisomie 21, wat weerspieël hoe hierdie siekte voortspruit uit die besit van een ekstra chromosoom 21 (drie totaal). Omdat hy nie die naam van hierdie belangrike siekte wou verander nie, het chromosoom 21 sy nommer behou, ondanks die beskrywing van die kortste stel chromosome. Die chromosoom “ -arms ” wat aan weerskante van die sentromere uitsteek, kan as kort of lank aangedui word, afhangende van hul relatiewe lengtes. Die kort arm word afgekort bl (vir “petite”), terwyl die lang arm afgekort word q (want dit volg “p ” alfabeties). Elke arm word verder onderverdeel en aangedui met 'n getal. Deur hierdie naamstelsel te gebruik, kan liggings op chromosome konsekwent in die wetenskaplike literatuur beskryf word.

Genetici gebruik kariogramme om chromosomale afwykings te identifiseer

Alhoewel daar na Mendel verwys word as die “ vader van moderne genetika, het hy sy eksperimente uitgevoer met geen van die gereedskap wat die genetici van vandag gereeld gebruik nie. Een so 'n kragtige sitologiese tegniek is kariotipering, 'n metode waarin eienskappe wat gekenmerk word deur chromosomale afwykings uit 'n enkele sel geïdentifiseer kan word. Om 'n individuele kariotipe te sien, word 'n persoon se selle (soos witbloedselle) eers uit 'n bloedmonster of ander weefsel versamel. In die laboratorium word die geïsoleerde selle gestimuleer om aktief te begin verdeel. 'n Chemikalie genaamd kolgisien word dan op selle toegedien om gekondenseerde chromosome in metafase te stop. Selle word dan laat swel met 'n hipotoniese oplossing sodat die chromosome uitmekaar versprei. Uiteindelik word die monster in 'n fixeermiddel bewaar en op 'n skyfie aangebring.

Die genetikus kleur dan chromosome met een van verskeie kleurstowwe om die duidelike en reproduseerbare bandpatrone van elke chromosoompaar beter te visualiseer. Na kleuring word die chromosome met behulp van helderveldmikroskopie bekyk. 'N Algemene keuse van vlekke is die Giemsa -vlek. Giemsa -kleuring lei tot ongeveer 400–800 bande (van styf opgerolde DNA en gekondenseerde proteïene) wat langs al die 23 chromosoompare geplaas is, wat 'n ervare genetikus elke band kan identifiseer. Benewens die bandpatrone, word chromosome verder geïdentifiseer op grond van grootte en sentromeer -ligging. Om die klassieke uitbeelding van die kariotipe te verkry waarin homoloë chromosome in numeriese volgorde van langste tot kortste in lyn gebring word, kry die genetikus 'n digitale beeld, identifiseer elke chromosoom en rangskik die chromosome handmatig in hierdie patroon (figuur 1).

Op sy mees basiese kan die kariogram genetiese abnormaliteite openbaar waarin 'n individu te veel of te min chromosome per sel het. Voorbeelde hiervan is Down-sindroom, wat geïdentifiseer word deur 'n derde kopie van chromosoom 21, en Turner-sindroom, wat gekenmerk word deur die teenwoordigheid van slegs een X-chromosoom by vroue in plaas van die normale twee. Genetici kan ook groot delesies of invoegings van DNA identifiseer. Jacobsen -sindroom - wat kenmerkende gelaatstrekke sowel as hart- en bloedingdefekte behels - word geïdentifiseer deur 'n verwydering van chromosoom 11. Laastens kan die kariotipe die translokasies identifiseer, wat plaasvind wanneer 'n segment van genetiese materiaal uit een chromosoom breek en weer heg na 'n ander chromosoom. Translokasies is betrokke by sekere kankers, insluitend chroniese myelogene leukemie.

Gedurende die leeftyd van Mendel was erfenis 'n abstrakte konsep wat slegs afgelei kon word deur kruise uit te voer en die eienskappe van die nageslag na te kom. Deur die waarneming van 'n kariogram, vandag’s genetici kan eintlik visualiseer die chromosomale samestelling van 'n individu te bevestig of te voorspel genetiese abnormaliteite in nageslag, selfs voor geboorte.


ELEKTROFORESE

Pulsed Field vir DNA

Agarose -gelelektroforese is die gekose metode om DNA -beperkingsfragmente op te los, mits die fragmente tussen 1000 en 23 000 bp groot is. Vir groter fragmente het Schwartz en Cantor die tegniek van pulserende veldgelelektroforese (PFG) ontwikkel in 1984. In PFG word DNA -fragmente groter as 23 kbp gedwing om hul struktuur tydens elektroforese te verander deur die toegepaste veld te pols, sodat die molekules kan ontspan en uitbrei gereeld en daardeur interaksie met die gelporieë. DNA -molekules tot die grootte van chromosome kan op hierdie manier elektroforeseer word, maar die skeiding kan baie ure of selfs dae neem.


Hoe kry ek 'n helderder DNA -band - Biologie

Fluoresentasie is 'n lid van die alomteenwoordige luminesensiefamilie van prosesse waarin vatbare molekules lig uitstraal van elektronies opgewekte toestande wat geskep word deur óf 'n fisiese (byvoorbeeld absorpsie van lig), meganiese (wrywing) of chemiese meganisme. Die opwekking van luminescentie deur eksitasie van 'n molekule deur ultraviolet of sigbare fotone is 'n verskynsel wat fotoluminescentie genoem word, wat formeel in twee kategorieë verdeel word, fluorescentie en fosforesensie, afhangende van die elektroniese opset van die opgewekte toestand en die emissieweg. Fluoresentasie is die eienskap van sommige atome en molekules om lig op 'n spesifieke golflengte te absorbeer en om daarna lig van langer golflengte uit te straal na 'n kort interval, wat die fluoressensie-leeftyd genoem word. Die proses van fosforessensie vind plaas op 'n wyse soortgelyk aan fluoressensie, maar met 'n baie langer opgewekte toestand leeftyd.

Die fluoressensieproses word beheer deur drie belangrike gebeurtenisse, wat almal plaasvind op tydskale wat deur verskeie grootteordes geskei word (sien Tabel 1). Opwekking van 'n vatbare molekule deur 'n inkomende foton vind plaas in femtosekondes (10E-15 sekondes), terwyl vibrasieverslapping van opgewekte toestandelektrone tot die laagste energievlak baie stadiger is en in pikosekondes (10E-12 sekondes) gemeet kan word. Die finale proses, die uitstoot van 'n langer golflengtefoton en die terugkeer van die molekule na die grondtoestand, vind plaas in die relatief lang tydperk van nanosekondes (10E-9 sekondes). Alhoewel die hele molekulêre fluorescentie-leeftyd, van opwinding tot emissie, slegs in miljardste van 'n sekonde gemeet word, is die verskynsel 'n verstommende manifestasie van die interaksie tussen lig en materie wat die basis vorm vir die uitgestrekte velde van bestendige toestand en fluorescentie wat in tyd opgelos is. spektroskopie en mikroskopie. As gevolg van die geweldig sensitiewe emissieprofiele, ruimtelike resolusie en hoë spesifisiteit van fluoressensie-ondersoeke, word die tegniek vinnig 'n belangrike hulpmiddel in genetika en selbiologie.

Verskeie ondersoekers het luminessensieverskynsels gedurende die sewentiende en agtiende eeue gerapporteer, maar dit was die Britse wetenskaplike sir George G. Stokes wat fluoressensie vir die eerste keer in 1852 beskryf het en verantwoordelik was vir die skep van die term ter ere van die blou-wit fluoresserende mineraal fluoriet (vloeispaat). Stokes het ook die golflengteverskuiwing na langer waardes in emissiespektra wat sy naam dra, ontdek. Fluoressensie is die eerste keer in die vroeë deel van die twintigste eeu in optiese mikroskopie aangetref deur verskeie noemenswaardige wetenskaplikes, waaronder August K hler en Carl Reichert, wat aanvanklik berig het dat fluorescentie 'n oorlas in ultraviolet mikroskopie is. Die eerste fluorescentiemikroskope is tussen 1911 en 1913 deur die Duitse fisici Otto Heimstdt en Heinrich Lehmann ontwikkel as 'n afslag van die ultraviolet instrument. Hierdie mikroskope is gebruik om outofluoressensie in bakterieë, diere- en plantweefsels waar te neem. Kort daarna het Stanislav Von Provazek 'n nuwe era begin toe hy fluoressensiemikroskopie gebruik het om kleurstofbinding in vaste weefsels en lewende selle te bestudeer. Maar eers in die vroeë veertigerjare het Albert Coons 'n tegniek ontwikkel om teenliggaampies met fluoresserende kleurstowwe te merk en sodoende die gebied van immunofluorescentie teweeg te bring. Teen die draai van die een-en-twintigste eeu was die veld van fluoressensiemikroskopie verantwoordelik vir 'n omwenteling in selbiologie, wat die krag van lewende selbeelding gekoppel het aan hoogs spesifieke meervoudige etikettering van individuele organelle en makromolekulêre komplekse met sintetiese en geneties gekodeerde fluoresserende probes.

Tydsberekening vir fluoressensieprosesse
Oorgang Proses Beoordeel konstant Tydskaal
(Sekondes)
S (0) => S (1) of S (n) Absorpsie (opwinding) Oombliklik 10 -15
S (n) => S (1) Interne omskakeling k(ic) 10 -14 tot 10 -10
S (1) => S (1) Vibrasie Ontspanning k (vr) 10 -12 tot 10 -10
S (1) => S (0) Fluoressensie k (f) of G 10 -9 tot 10 -7
S(1) => T(1) Intersisteemkruising k (pT) 10 -10 tot 10 -8
S(1) => S(0) Nie-stralingsverslapping
Uitblus
k (nr), k (q) 10 -7 tot 10 -5
T(1) => S(0) Fosforessensie k (p) 10-3 tot 100
T (1) => S (0) Nie-stralingsverslapping
Blus
k(nr), k(qT) 10 tot 100
Tabel 1

Fluoresensie word oor die algemeen bestudeer met hoogs gekonjugeerde polisikliese aromatiese molekules wat op enige een van verskeie energievlakke in die grondtoestand bestaan, elk geassosieer met 'n spesifieke rangskikking van elektroniese molekulêre orbitale. Die elektroniese toestand van 'n molekule bepaal die verspreiding van negatiewe lading en die algehele molekulêre geometrie. Vir enige spesifieke molekule bestaan ​​verskeie verskillende elektroniese toestande (geïllustreer as S(0), S(1) en S(2) in Figuur 1), afhangende van die totale elektronenergie en die simmetrie van verskeie elektronspintoestande. Elke elektroniese toestand word verder onderverdeel in 'n aantal vibrasie- en rotasie -energievlakke wat verband hou met die atoomkerne en bindingsorbitale. Die grondtoestand vir die meeste organiese molekules is 'n elektroniese enkelspel waarin alle elektrone spin-gepaard is (teenoorgestelde draaie het). By kamertemperatuur het baie min molekules genoeg interne energie om in enige ander toestand as die laagste trillingsvlak van die grondtoestand te bestaan, en dus ontstaan ​​eksitasieprosesse gewoonlik vanaf hierdie energievlak.

Die kategorie molekules wat elektroniese oorgange kan ondergaan wat uiteindelik tot fluorescentie kan lei, staan ​​bekend as fluorescerende probes, fluorochrome of bloot kleurstowwe. Fluorochrome wat gekoppel is aan 'n groter makromolekule (soos 'n nukleïensuur, lipied, ensiem of proteïen) deur adsorpsie of kovalente bindings word fluorofore genoem. Oor die algemeen word fluorofore in twee breë klasse verdeel, wat intrinsiek en ekstrinsiek genoem word. Intrinsieke fluorofore, soos aromatiese aminosure, neurotransmitters, porfiriene en groen fluoresserende proteïene, is dié wat natuurlik voorkom. Ekstrinsieke fluorofore is sintetiese kleurstowwe of gemodifiseerde biochemikalieë wat by 'n monster gevoeg word om fluoressensie met spesifieke spektrale eienskappe te produseer.

Absorpsie, opwekking en emissie

Absorpsie van energie vind plaas deur fluorochrome tussen die vibrasie- en rotasie -energievlakke van die opgewekte toestande in verskillende molekulêre orbitale. Die verskillende energievlakke wat betrokke is by die absorpsie en uitstraling van lig deur 'n fluorofoor word klassiek aangebied deur 'n Jablonski -energiediagram (sien figuur 1), vernoem ter ere van die Poolse fisikus professor Alexander Jablonski. 'N Tipiese Jablonski -diagram illustreer die enkelvoudige grond (S (0)) toestand, sowel as die eerste (S (1)) en tweede (S (2)) opgewekte enkeltoestande as 'n stapel horisontale lyne. In figuur 1 verteenwoordig die dikker lyne elektroniese energievlakke, terwyl die dunner lyne die verskillende vibrasie -energietoestande aandui (rotasie -energietoestande word geïgnoreer). Oorgange tussen die toestande word geïllustreer as reguit of golwende pyle, afhangende van of die oorgang verband hou met absorpsie of uitstoot van 'n foton (reguit pyltjie) of die gevolg is van 'n molekulêre interne omskakeling of nie-stralende ontspanningsproses (golwende pyle). Vertikale opwaartse pyle word gebruik om die onmiddellike aard van opwindingsprosesse aan te dui, terwyl die golwende pyle gereserveer is vir gebeurtenisse wat op 'n baie langer tydskaal plaasvind.

Absorpsie van lig vind baie vinnig plaas (ongeveer 'n femtosekonde, die tyd wat nodig is vir die foton om 'n enkele golflengte te beweeg) in diskrete hoeveelhede wat kwanta genoem word en stem ooreen met die opwekking van die fluorofoor vanaf die grondtoestand tot 'n opgewekte toestand. Net so word die uitstoot van 'n foton deur fluoressensie of fosforesensie ook gemeet in terme van kwanta. Die energie in 'n kwantum (Planck's Law) word uitgedruk deur die vergelyking:

waar E die energie is, h Planck se konstante is, n en l die frekwensie en golflengte van die inkomende foton is, en c die ligspoed is. Planck se wet bepaal dat die stralingsenergie van 'n geabsorbeerde foton direk eweredig is aan die frekwensie en omgekeerd eweredig aan die golflengte, wat beteken dat korter invallende golflengtes 'n groter hoeveelheid energie het. Die absorpsie van 'n foton van energie deur 'n fluorofoor, wat plaasvind as gevolg van 'n interaksie van die ossillerende elektriese veldvektor van die liggolf met ladings (elektrone) in die molekule, is 'n alles- of geen-verskynsel en kan slegs plaasvind met invallende lig van spesifieke golflengtes bekend as absorpsiebande. As die geabsorbeerde foton meer energie bevat as wat nodig is vir 'n eenvoudige elektroniese oorgang, word die oortollige energie gewoonlik in vibrasie- en rotasie-energie omgeskakel. As 'n botsing egter plaasvind tussen 'n molekule en 'n foton wat onvoldoende energie het om 'n oorgang te bevorder, vind geen absorpsie plaas nie. Die spektraal breë absorpsieband spruit voort uit die vibrasie -energievlakke wat op 'n noue afstand is, plus termiese beweging wat 'n reeks foton energieë in staat stel om by 'n bepaalde oorgang te pas. Omdat eksitasie van 'n molekule deur absorpsie normaalweg plaasvind sonder 'n verandering in elektron-spin-paring, is die opgewekte toestand ook 'n enkelvoud. Oor die algemeen word fluoressensie -ondersoeke uitgevoer met straling met golflengtes wat wissel van die ultraviolet tot die sigbare streke van die elektromagnetiese spektrum (250 tot 700 nanometer).

Met ultraviolet of sigbare lig word algemene fluorofore gewoonlik opgewonde tot hoër vibrasievlakke van die eerste (S(1)) of tweede (S(2)) singlet-energietoestand. Een van die absorpsie (of opwinding) oorgange wat in Figuur 1 (groen pyltjie links) aangebied word, vind plaas vanaf die laagste vibrasie-energievlak van die grondtoestand na 'n hoër vibrasievlak in die tweede opgewekte toestand ('n oorgang aangedui as S (0) = 0 tot S (2) = 3). 'N Tweede eksitasie -oorgang word uitgebeeld van die tweede vibrasievlak van die grondtoestand na die hoogste vibrasievlak in die eerste opgewekte toestand (aangedui as S (0) = 1 tot S (1) = 5). In 'n tipiese fluorofoor sal bestraling met 'n wye spektrum van golflengtes 'n hele reeks toegelate oorgange genereer wat die verskillende vibrasie-energievlakke van die opgewekte toestande bevolk. Sommige van hierdie oorgange sal 'n baie hoër mate van waarskynlikheid hê as ander, en wanneer dit gekombineer word, sal dit die absorpsiespektrum van die molekule uitmaak. Let daarop dat die absorpsie- en opwekkingsspektra vir die meeste fluorofore duidelik is, maar dikwels oorvleuel en soms ononderskeibaar kan word. In ander gevalle (byvoorbeeld fluoresceïne) word die absorpsie- en eksitasie -spektra duidelik geskei.

Onmiddellik na die absorpsie van 'n foton, sal verskeie prosesse met verskillende waarskynlikhede plaasvind, maar die waarskynlikste is ontspanning na die laagste vibrasie -energievlak van die eerste opgewekte toestand (S (1) = 0 Figuur 1). Hierdie proses staan ​​bekend as interne omskakeling of trillingsverslapping (energieverlies by afwesigheid van liguitstraling) en kom gewoonlik voor in 'n pikosekonde of minder. Omdat 'n beduidende aantal vibrasiesiklusse gedurende die leeftyd van opgewonde toestande plaasvind, ondergaan molekules feitlik altyd volledige vibrasieverslapping gedurende hul opgewonde leeftyd. Die oortollige vibrasie -energie word omgeskakel in hitte, wat geabsorbeer word deur naburige oplosmiddelmolekules wanneer dit met die opgewekte toestand fluorofoor bots.

'N Opgewonde molekule bestaan ​​in die laagste opgewekte enkeltoestand (S (1)) vir periodes in die orde van nanosekondes (die langste tydperk in die fluorescentieproses met verskeie ordes van grootte) voordat dit uiteindelik ontspan na die grondtoestand. As ontspanning uit hierdie langlewende toestand gepaard gaan met die uitstoot van 'n foton, staan ​​die proses formeel bekend as fluorescentie. Die nou -gespasieerde vibrasie -energievlakke van die grondtoestand lewer, in kombinasie met normale termiese beweging, 'n wye reeks foton energieë tydens emissie. As gevolg hiervan word fluoressensie gewoonlik waargeneem as emissie -intensiteit oor 'n band golflengtes eerder as 'n skerp lyn. Die meeste fluorofore kan die opwindings- en emissiesiklus baie honderde tot duisende kere herhaal voordat die hoogs reaktiewe opgewekte toestandmolekule gefotografeer word, wat die fluorescentie vernietig. Byvoorbeeld, die goed bestudeerde sonde fluoresceïen isothiocyanate (FITC) kan eksitasie en ontspanning ondergaan vir ongeveer 30 000 siklusse voordat die molekule nie meer reageer op invallende beligting nie.

Verskeie ander ontspanningspaaie wat wisselende waarskynlikheid het, kompeteer met die fluorescentie -emissieproses. Die opgewekte toestandsenergie kan nie-bestraling as hitte verdryf word (geïllustreer deur die siaangolwende pyl in Figuur 1), die opgewekte fluorofoor kan met 'n ander molekule bots om energie oor te dra in 'n tweede tipe nie-stralingsproses (byvoorbeeld blus, blus, soos aangedui deur die pers golwende pyl in Figuur 1), of 'n verskynsel bekend as intersisteemkruising na die laagste opgewonde drielingtoestand kan voorkom (die blou golwende pyl in Figuur 1). Laasgenoemde gebeurtenis is betreklik skaars, maar lei uiteindelik tot óf emissie van 'n foton deur fosforessensie óf 'n oorgang terug na die opgewonde singlet toestand wat vertraagde fluoressensie lewer. Oorgange van die drieling opgewekte toestand na die enkelvoudige grondtoestand is verbode, wat lei tot koerskonstantes vir drielingemissie wat verskeie orde van grootte laer is as dié van fluoressensie.

Beide die oorgange van die drielingstoestand word aan die regterkant van die Jablonski-energieprofiel in figuur 1. In diagram getoon. Die lae waarskynlikheid dat kruisings tussen stelsels ontstaan, spruit uit die feit dat molekules eers spinomskakeling moet ondergaan om ongepaarde elektrone te produseer, 'n ongunstige proses. Die primêre belangrikheid van die drielingstoestand is die hoë mate van chemiese reaktiwiteit wat molekules in hierdie toestand toon, wat dikwels lei tot foto -bleek en die produksie van skadelike vrye radikale. In biologiese monsters is opgeloste suurstof 'n baie doeltreffende blusmiddel vir fluorofore in die drielingtoestand. Die grondtoestand suurstofmolekule, wat gewoonlik 'n drieling is, kan opgewek word tot 'n reaktiewe enkelvoudige toestand, wat lei tot reaksies wat die fluorofoor bleik of 'n fototoksiese effek op lewende selle toon. Fluorofore in die triplet-toestand kan ook direk met ander biologiese molekules reageer, wat dikwels lei tot deaktivering van beide spesies. Molekules wat swaar atome bevat, soos die halogene en baie oorgangsmetale, vergemaklik dikwels die kruising van interstelsels en is gereeld fosforescerend.

Die waarskynlikheid dat 'n oorgang van die grondtoestand (S (0)) na die opgewekte enkeltoestand (S (1)) plaasvind, hang af van die mate van ooreenkoms tussen die vibrasie- en rotasie -energietoestande wanneer 'n elektron in die grondtoestand woon teenoor die teenwoordig in die opgewonde toestand, soos uiteengesit in Figuur 2.Die Franck-Condon energiediagram wat in Figuur 2 geïllustreer word, toon die waarskynlikheidsverdeling van die vibrasie-energie tussen die verskillende vlakke in die grond (S (0)) en die eerste opgewonde (S (1)) toestande vir 'n hipotetiese molekule. Opwindingsoorgange (rooi lyne) van die grond na die opgewekte toestand vind plaas in so 'n kort tydsbestek (femtosekondes) dat die interne kernafstand wat met die bindingsorbitale verband hou, nie genoeg tyd het om te verander nie, en dus word die oorgange as vertikale lyne voorgestel. Daar word na hierdie konsep verwys as die Franck-Condon-beginsel. Die golflengte van maksimum absorpsie (rooi lyn in die middel) verteenwoordig die mees waarskynlike interne kern skeiding in die grondtoestand tot 'n toegelate vibrasie vlak in die opgewekte toestand.

By kamertemperatuur is termiese energie nie voldoende om opgewonde energietoestande aansienlik te bevolk nie en die mees waarskynlike toestand vir 'n elektron is die grondtoestand (S (O)), wat 'n aantal verskillende vibrasie -energietoestande bevat, elk met verskillende energievlakke. Die mees gunstige oorgange is diegene waar die rotasie- en vibrasie -elektrondigtheid waarskynlikhede in beide die grond en die opgewekte toestande maksimaal oorvleuel (sien figuur 2). Invallende fotone met verskillende golflengtes (en kwantas) kan egter genoeg energie hê om geabsorbeer te word en veroorsaak dikwels oorgange van ander internukleêre skeidingsafstande en vibrasie -energievlakke. Hierdie effek gee aanleiding tot 'n absorpsiespektrum wat verskeie pieke bevat (Figuur 3). Die wye verskeidenheid foton energieë wat verband hou met absorpsie -oorgange in fluorofore, veroorsaak dat die resulterende spektra eerder as breë bande as diskrete lyne voorkom.

Die hipotetiese absorpsiespektrum geïllustreer in Figuur 3 (blou band) is die gevolg van verskeie bevoordeelde elektroniese oorgange van die grondtoestand na die laagste opgewekte energietoestand (onderskeidelik gemerk S(0) en S(1) ). Vertikale lyne (geel) is bo-oor die absorpsiespektrum gesuperponeer wat die oorgange van die laagste vibrasievlak in die grondtoestand na hoër vibrasie-energievlakke in die opgewekte toestand voorstel. Let daarop dat oorgange na die hoogste opgewekte vibrasievlakke dié is wat voorkom by hoër foton energieë (laer golflengte of hoër golflengte). Die benaderde energieë wat met die oorgange verband hou, word aangedui in elektronvolts (eV) langs die boonste absessie van figuur 3. Trillingsvlakke wat verband hou met die grond en opgewekte toestande word ook langs die regterkantse ordinaat ingesluit.

Deur die absorpsiespektrum van 'n fluorofoor te skandeer terwyl die emissie -intensiteit op 'n enkele golflengte aangeteken word (gewoonlik die golflengte van die maksimum emissie -intensiteit), word die eksitasie -spektrum opgewek. Net so sal die opwekking van die fluorofoor op 'n enkele golflengte (weereens, verkieslik die golflengte van maksimum absorpsie) terwyl deur die emissiegolflengtes geskandeer word, die emissiespektrale profiel openbaar. Die opwindings- en emissiespektra kan as waarskynlikheidsverspreidingsfunksies beskou word dat 'n foton van gegewe kwantumenergie geabsorbeer sal word en uiteindelik die fluorofoor in staat sal stel om 'n tweede foton in die vorm van fluorescentiestraling uit te stuur.

Stokes Shift en die spieëlbeeldreël

As die fluorescentie -emissiespektrum van 'n fluorofoor noukeurig ondersoek word, word verskeie belangrike kenmerke duidelik sigbaar. Die emissiespektrum is onafhanklik van die eksitasie -energie (golflengte) as gevolg van 'n vinnige interne omskakeling van hoër aanvanklike opgewekte toestande na die laagste vibrasie -energievlak van die S (1) opgewekte toestand. Vir baie van die gewone fluorofore is die afstand tussen vibrasie -energievlakke dieselfde vir die grond en opgewekte toestande, wat 'n fluorescentiespektrum tot gevolg het wat sterk lyk soos die spieëlbeeld van die absorpsiespektrum. Dit is te wyte aan die feit dat dieselfde oorgange die gunstigste is vir beide absorpsie en emissie. Ten slotte, in oplossing (waar fluorofore algemeen bestudeer word) gaan die gedetailleerde vibrasiestruktuur gewoonlik verlore en verskyn die emissiespektrum as 'n breë band.

Soos voorheen bespreek, na fotonabsorpsie, sal 'n opgewekte fluorofoor vinnig ontspanning ondergaan tot die laagste vibrasie-energievlak van die opgewekte toestand. 'N Belangrike gevolg van hierdie vinnige interne omskakeling is dat alle daaropvolgende ontspanningspaaie (fluoressensie, nie-stralende ontspanning, interstelselkruising, ens.) Van die laagste trillingsvlak van die opgewekte toestand afloop (S (1)). Soos met absorpsie, is die waarskynlikheid dat 'n elektron in die opgewekte toestand na 'n bepaalde vibrasie-energievlak in die grondtoestand sal terugkeer eweredig aan die oorvleueling tussen die energievlakke in die onderskeie toestande (Figuur 2). Teruggange na die grondtoestand (S (0)) kom gewoonlik na 'n hoër vibrasievlak (sien figuur 3), wat daarna termiese ewewig (vibrasieverslapping) bereik. Omdat die uitstraling van 'n foton die fluorofoor dikwels in 'n hoër vibrerende grondtoestand verlaat, is die emissiespektrum tipies 'n spieëlbeeld van die absorpsiespektrum wat voortspruit uit die oorgang van die grond na die eerste opgewonde toestand. In werklikheid is die waarskynlikheid dat 'n elektron terugkeer na 'n spesifieke vibrasie-energievlak in die grondtoestand soortgelyk aan die waarskynlikheid van daardie elektron se posisie in die grondtoestand voor opwekking. Hierdie konsep, bekend as die Spieëlbeeldreël, word in Figuur 3 geïllustreer vir die emissie-oorgange (blou lyne) vanaf die laagste vibrasie-energievlak van die opgewekte toestand terug na verskeie vibrasievlakke in grondtoestand. Die gevolglike emissiespektrum (rooi band) is 'n spieëlbeeld van die absorpsiespektrum wat deur die hipotetiese chromofoor vertoon word.

In baie gevalle lei opwinding deur fotonen met hoë energie tot die populasie van hoër elektroniese en vibrasievlakke (S (2), S (3), ens.), Wat vinnig oortollige energie verloor namate die fluorofoor ontspan tot die laagste vibrasievlak van die eerste opgewekte toestand (sien figuur 1). As gevolg van hierdie vinnige ontspanningsproses is emissiespektra oor die algemeen onafhanklik van die opwekkingsgolflengte (sommige fluorofore straal uit hoër energietoestande, maar sulke aktiwiteit is skaars). Om hierdie rede is emissie die spieëlbeeld van die grondtoestand na die laagste opgewekte toestandoorgange, maar nie van die hele absorpsiespektrum nie, wat oorgange na hoër energievlakke kan insluit. 'n Uitstekende toets van die spieëlbeeldreël is om absorpsie- en emissiespektra te ondersoek in 'n lineêre plot van die golfgetal (die wederkerige van golflengte of die aantal golwe per sentimeter), wat direk eweredig is aan die frekwensie en kwantumenergie. As dit op hierdie wyse aangebied word (sien Figuur 3), toon simmetrie tussen uitwissingskoëffisiënte en intensiteit van die eksitasie- en emissiespektra as 'n funksie van energie spieëlspieëls op wanneer wedersydse oorgange betrokke is.

Aangebied in Figuur 4 is die absorpsie- en emissiespektra vir kinien, die natuurlik voorkomende antimalariamiddel (en eerste bekende fluorofoor) wie se fluoresserende eienskappe oorspronklik beskryf is deur sir John Fredrick William Hershel in 1845. Kinien hou nie by die spieëlbeeldreël soos dit is nie. duidelik deur die enkele piek in die emissiespektrum te ondersoek (by 460 nanometer), wat nie die twee pieke weerspieël op 310 en 350 nanometers in die bimodale absorpsiespektrum nie. Die korter golflengte ultraviolet absorpsiepiek (310 nanometer) is te wyte aan 'n eksitasie -oorgang na die tweede opgewekte toestand (van S (0) na S (2)) wat vinnig ontspan tot die laagste opgewekte toestand (S (1)). Gevolglik vind fluorescentie -uitstoot uitsluitlik plaas vanaf die laagste opgewekte enkeltoestand (S (1)), wat lei tot 'n spektrum wat die grond na die eerste opgewekte toestand -oorgang (350 nanometer piek) in kinien weerspieël en nie die hele absorpsiespektrum nie.

Omdat die energie wat verband hou met fluoressensie-uitstoot oorgange (sien Figuur 1-4) tipies minder is as die van absorpsie, het die resulterende uitgestraalde fotone minder energie en word dit na langer golflengtes verskuif. Hierdie verskynsel staan ​​algemeen bekend as Stokes Shift en kom voor byna alle fluorofore wat algemeen in oplossingondersoeke gebruik word. Die primêre oorsprong van die Stokes -verskuiwing is die vinnige verval van opgewonde elektrone na die laagste vibrasie -energievlak van die S (1) opgewekte toestand. Boonop gaan fluoressensie -uitstraling gewoonlik gepaard met oorgange na hoër vibrasie -energievlakke in die grondtoestand, wat lei tot verdere verlies aan eksitasie -energie tot termiese ekwilibrasie van die oortollige vibrasie -energie. Ander gebeurtenisse, soos oplosmiddeloriëntasie-effekte, opgewekte-toestandreaksies, kompleksvorming en resonansie-energie-oordrag kan ook bydra tot langer emissiegolflengtes.

In die praktyk word die Stokes -verskuiwing gemeet as die verskil tussen die maksimum golflengtes in die eksitasie- en emissiespektra van 'n spesifieke fluorochroom of fluorofoor. Die grootte van die verskuiwing wissel met molekulêre struktuur, maar kan wissel van net 'n paar nanometer tot meer as 'n paar honderd nanometer. Die Stokes -verskuiwing vir fluoresceïne is byvoorbeeld ongeveer 20 nanometer, terwyl die verskuiwing vir kinien 110 nanometer is (sien figuur 4) en die vir die porfiriene meer as 200 nanometer is. Die bestaan ​​van Stokes -verskuiwing is van kritieke belang vir die uiters hoë sensitiwiteit van fluoressensiebeeldmetings. Die rooi emissieverskuiwing maak die gebruik van presisiebandwydte optiese filters moontlik om effektief opwekkingslig te keer om die detektor te bereik sodat die relatief dowwe fluoressensiesein (met 'n lae aantal vrygestelde fotone) teen 'n lae-geraas agtergrond waargeneem kan word.

Uitsterwingskoëffisiënt, kwantumopbrengs en fluoressensieleeftyd

Drie fundamentele parameters wat algemeen gebruik word by die beskrywing en vergelyking van fluorofore, is die uitwissingskoëffisiënt (e), kwantumopbrengs (F) en die fluoressensie -leeftyd (t). Molêre uitwissingskoëffisiënte word wyd gebruik op die gebiede van spektroskopie, mikroskopie en fluoressensie om absorpsie -eenhede in eenhede van molêre konsentrasie vir 'n verskeidenheid chemiese stowwe om te skakel. Die uitwissingskoëffisiënt word bepaal deur die absorbansie by 'n verwysingsgolflengte (kenmerkend van die absorberende molekuul) te meet vir 'n een molêre (M) konsentrasie (een mol per liter) van die doelchemikalie in 'n kuvet met 'n padlengte van een sentimeter. Die verwysingsgolflengte is gewoonlik die golflengte van maksimum absorpsie in die ultraviolet- of sigbare ligspektrum. Uitsterwingskoëffisiënte is 'n direkte maatstaf van die vermoë van 'n fluorofoor om lig te absorbeer, en daardie chromofore met 'n hoë uitsterwingskoëffisiënt het ook 'n hoë waarskynlikheid van fluoressensie-emissie. Omdat die intrinsieke leeftyd (hieronder bespreek) van 'n fluorofoor omgekeerd eweredig is aan die uitwissingskoëffisiënt, het molekules met 'n hoë uitwissingskoëffisiënt 'n opgewekte toestand met 'n kort intrinsieke leeftyd.

Kwantumopbrengs (soms verkeerdelik kwantumdoeltreffendheid genoem) is 'n maatstaf vir die meting van die doeltreffendheid van fluorescentie -emissie relatief tot alle moontlike ontspanningsmetodes en word algemeen uitgedruk as die (dimensielose) verhouding van fotone wat uitgestraal word tot die aantal geabsorbeerde fotone. Met ander woorde, die kwantumopbrengs verteenwoordig die waarskynlikheid dat 'n gegewe opgewonde fluorochroom 'n uitgestraalde foton (fluoressensie) sal produseer. Kwantumopbrengste wissel gewoonlik tussen 'n waarde van nul en een, en fluoresserende molekules wat algemeen as probes in mikroskopie gebruik word, het kwantumopbrengste wat wissel van baie laag (0,05 of minder) tot byna eenheid (die helderste fluorofore). Oor die algemeen is 'n hoë kwantumopbrengs in die meeste beeldtoepassings wenslik. Die kwantumopbrengs van 'n gegewe fluorofoor wissel, soms tot groot uiterstes, met omgewingsfaktore soos pH, konsentrasie en oplosmiddelpolariteit.

Die fluoressensieleeftyd is die kenmerkende tyd wat 'n molekule in 'n opgewekte toestand bly voordat dit na die grondtoestand terugkeer en is 'n aanduiding van die tyd wat beskikbaar is vir inligting om uit die emissieprofiel versamel te word. Gedurende die leeftyd van die opgewekte toestand kan 'n fluorofoor konformasieveranderinge ondergaan, asook interaksie met ander molekules en diffundeer deur die plaaslike omgewing. Die verval van fluorescentie -intensiteit as 'n funksie van tyd in 'n eenvormige populasie molekules opgewonde met 'n kort ligpuls word beskryf deur 'n eksponensiële funksie:

waar I (t) die fluorescentie -intensiteit gemeet is op tyd t, I (o) is die aanvanklike intensiteit wat onmiddellik na opwekking waargeneem word, en t die fluorescentie -leeftyd is. Formeel word die fluoressensie -leeftyd gedefinieer as die tyd waarin die aanvanklike fluorescentie -intensiteit van 'n fluorofoor tot 1/e (ongeveer 37 persent) van die aanvanklike intensiteit afneem (sien figuur 5 (a)). Hierdie hoeveelheid is die wederkerige van die tempokonstante vir fluoressensieverval vanaf die opgewekte toestand na die grondtoestand.

Omdat die vlak van fluoressensie direk eweredig is aan die aantal molekules in die opgewekte singlet-toestand, kan lewenslange metings uitgevoer word deur fluoressensieverval te meet na 'n kort opwekkingspuls. In 'n eenvormige oplosmiddel is fluoressensieverval gewoonlik 'n monoexponensiële funksie, soos geïllustreer deur die grafieke van fluorescentie -intensiteit as 'n funksie van tyd in figure 5 (a) en 5 (b). Meer komplekse stelsels, soos lewensvatbare weefsels en lewende selle, bevat 'n gemengde stel omgewings wat dikwels multi -eksponensiële waardes oplewer (Figuur 5 (c)) wanneer fluoressensie verval gemeet word. Daarbenewens kan verskeie ander prosesse meeding met fluoressensie-emissie vir die terugkeer van opgewekte toestand elektrone na die grondtoestand, insluitend interne omskakeling, fosforessensie (intersisteem kruising), en blus. Afgesien van fluoressensie en fosforesensie, is nie-stralingsprosesse die primêre meganisme wat verantwoordelik is vir die verslapping van opgewekte toestandelektrone.

Alle nie-fluoresserende prosesse wat meeding vir deaktivering van opgewekte toestand elektrone kan gerieflik gekombineer word in 'n enkele tempo konstante, genoem die nie-straling tempo konstante en aangedui deur die veranderlike k(nr) . Die nie-stralende snelheidskonstante ignoreer gewoonlik enige bydrae van vibrasieverslapping omdat die vinnige snelhede (pikosekondes) van hierdie omskakelings verskeie ordes van grootte vinniger is as stadiger deaktiverings- (nanosekondes) oorgange. Dus kan die kwantumopbrengs nou in terme van tempokonstantes uitgedruk word:

F = fotone uitgestraal/fotone geabsorbeer = k f /(k f + k nf ) = t f / t o

waar k (f) die snelheidskonstante vir fluoressensieverval is (die simbool G word ook gebruik om hierdie snelheidskonstante aan te dui). Die wederkerigheid van die vervaltempo-konstante is gelyk aan die intrinsieke leeftyd (t (o)), wat gedefinieer word as die leeftyd van die opgewekte toestand in die afwesigheid van alle prosesse wat meeding vir opgewekte toestand-deaktivering. In die praktyk word die leeftyd van die fluoressensie-opgewekte toestand verkort deur nie-stralingsprosesse, wat lei tot 'n gemete leeftyd (t (f)) wat 'n kombinasie is van die intrinsieke leeftyd en mededingende nie-fluorescerende ontspanningsmeganismes. Omdat die gemete leeftyd altyd minder is as die intrinsieke leeftyd, oorskry die kwantumopbrengs nooit 'n waarde van eenheid nie.

Baie van die algemene probes wat in optiese mikroskopie gebruik word, het fluoressensieleeftye gemeet in nanosekondes, maar dit kan oor 'n wye reeks verskil, afhangende van molekulêre struktuur, die oplosmiddel en omgewingstoestande. Kwantitatiewe fluoressensie -leeftydmetings stel ondersoekers in staat om te onderskei tussen fluorofore met soortgelyke spektrale eienskappe, maar verskillende lewensduur, en kan ook leidrade vir die plaaslike omgewing oplewer. Spesifiek, die pH en konsentrasie van ione in die omgewing van die sonde kan bepaal word sonder om die gelokaliseerde fluorofoorkonsentrasie te ken, wat van beduidende voordeel is wanneer dit gebruik word met lewende selle en weefsels waar die sondekonsentrasie dalk nie eenvormig is nie. Boonop is lewensduurmetings minder sensitief vir foto -bleek -artefakte as intensiteitsmetings.

Blus en Fotobleik

Die gevolge van blus en foto -bleek is 'n effektiewe vermindering van die hoeveelheid emissies en moet veral van oorweging wees by die ontwerp en uitvoering van fluorescentie -ondersoeke. Die twee verskynsels word onderskei deurdat blus dikwels omkeerbaar is, terwyl fotoblek nie. Uitblus spruit uit 'n verskeidenheid mededingende prosesse wat nie-stralingsverslapping (sonder fotonemissie) van opgewekte toestand elektrone na die grondtoestand veroorsaak, wat óf intramolekulêr óf intermolekulêr van aard kan wees. Omdat nie-stralende oorgangspaaie meeding met die fluoressensieverslapping, verlaag dit gewoonlik dramaties of, in sommige gevalle, die uitstoot heeltemal. Die meeste blusprosesse werk om die opgewekte toestand se leeftyd en die kwantumopbrengs van die geaffekteerde fluorofoor te verminder.

'N Algemene voorbeeld van blus word waargeneem met die botsing van 'n opgewekte toestand fluorofoor en 'n ander (nie-fluorescerende) molekule in oplossing, wat lei tot die deaktivering van die fluorofoor en terugkeer na die grondtoestand. In die meeste gevalle word nie een van die molekules chemies verander tydens die botsingsblusproses nie. 'n Wye verskeidenheid eenvoudige elemente en verbindings tree op as botsende blusmiddels, insluitend suurstof, halogene, amiene en baie elektron-tekorte organiese molekules. Botsingsblus kan die teenwoordigheid van gelokaliseerde blusmolekules of -gedeeltes openbaar, wat deur diffusie of konformasieverandering met die fluorofoor kan bots gedurende die leeftyd van die opgewekte toestand. Die meganismes vir botsingsblus sluit in elektronoordrag, spin-koppeling en interstelsel-kruising na die opgewekte drielingstoestand. Ander terme wat dikwels uitruilbaar met botsingsblus gebruik word, is interne omskakeling en dinamiese blus.

'n Tweede tipe blusmeganisme, genoem statiese of komplekse blus, ontstaan ​​uit nie-fluoresserende komplekse wat tussen die blusder en fluorofoor gevorm word wat dien om absorpsie te beperk deur die populasie van aktiewe, prikkelbare molekules te verminder. Hierdie effek vind plaas wanneer die fluoresserende spesie 'n omkeerbare kompleks vorm met die uitblusmolekule in die grondtoestand, en nie staatmaak op diffusie of molekulêre botsings nie. By statiese blus word fluoressensie-emissie verminder sonder om die lewensduur van die opgewonde toestand te verander. 'N Fluorofoor in die opgewekte toestand kan ook deur 'n dipolêre resonansie-energie-oordragmeganisme geblus word, in die nabyheid van 'n acceptormolekule waarna die opgewekte toestand energie nie-stralend oorgedra kan word. In sommige gevalle kan blus plaasvind deur nie-molekulêre meganismes, soos verswakking van invallende lig deur 'n absorberende spesie (insluitend die chromofoor self).

In teenstelling met blus, vind foto-bleiking (ook bekend as vervaag) plaas wanneer 'n fluorofoor die fluorosie permanent verloor as gevolg van foton-geïnduseerde chemiese skade en kovalente modifikasie. By die oorgang van 'n opgewekte enkeltoestand na die opgewekte drielingstoestand, kan fluorofore in wisselwerking tree met 'n ander molekule om onomkeerbare kovalente modifikasies te produseer. Die drielingstoestand het 'n relatiewe lang lewe ten opsigte van die enkelstatus, waardeur opgewonde molekules 'n baie langer tydsbestek kan ondergaan om chemiese reaksies met komponente in die omgewing te ondergaan. Die gemiddelde aantal eksitasie- en emissiesiklusse wat vir 'n bepaalde fluorofoor voorkom voor fotobleach is afhanklik van die molekulêre struktuur en die plaaslike omgewing.Sommige fluorofore bleik vinnig nadat slegs 'n paar fotone afgestuur word, terwyl ander wat robuuster is, duisende of miljoene siklusse kan ondergaan voordat dit bleik.

Aangebied in figuur 6 is 'n tipiese voorbeeld van fotoverbleking (vervaag) waargeneem in 'n reeks digitale beelde wat op verskillende tydpunte vasgelê is vir 'n vermeerderde kultuur van epiteelselle van bees pulmonêre arteries. Die kerne is gekleur met 4,6-diamidino-2-fenilindool (DAPI blou fluoressensie), terwyl die mitochondria en aktien sitoskelet onderskeidelik met MitoTracker Red (rooi fluoressensie) en 'n falloïdien afgeleide (groen fluoressensie) gekleur is. Tydspunte is met tussenposes van twee minute geneem met behulp van 'n fluorescentiefilterkombinasie met bandwydtes wat ingestel is om die drie fluorofore gelyktydig opgewonde te maak terwyl die gekombineerde emissiesine ook aangeteken word. Let daarop dat al drie die fluorofore 'n relatief hoë intensiteit in figuur 6 (a) het, maar die DAPI (blou) intensiteit begin vinnig om twee minute te daal en is na ses minute amper heeltemal weg. Die mitochondriale en aktienvlekke is meer bestand teen fotobleiking, maar die intensiteit van beide daal in die loop van die tydreeks (10 minute).

'N Belangrike klas fotobbleekgebeurtenisse is fotodinamies, wat beteken dat dit die interaksie van die fluorofoor met 'n kombinasie van lig en suurstof behels. Reaksies tussen fluorofore en molekulêre suurstof vernietig fluoressensie permanent en lewer 'n vrye radikale enkel suurstofspesie wat ander molekules in lewende selle chemies kan verander. Die hoeveelheid fotobleek as gevolg van fotodinamiese gebeure is 'n funksie van die molekulêre suurstofkonsentrasie en die proksimale afstand tussen die fluorofoor, suurstofmolekules en ander sellulêre komponente. Fotoverbleking kan verminder word deur die blootstellingstyd van fluorofore tot beligting te beperk of deur die opwekkingsenergie te verlaag. Hierdie tegnieke verminder egter ook die meetbare fluorescentiesignaal. In baie gevalle kan oplossings van fluorofore of selsuspensies ontoksineer word, maar dit is nie haalbaar vir lewende selle en weefsels nie. Miskien is die beste beskerming teen fotobleiking om blootstelling van die fluorochroom te beperk tot intense beligting (met behulp van neutrale digtheid filters) tesame met die oordeelkundige gebruik van kommersieel beskikbare anti-vervaagde reagense wat by die monteeroplossing of selkultuurmedium gevoeg kan word.

Onder sekere omstandighede kan die fotobleik-effek ook benut word om spesifieke inligting te bekom wat andersins nie beskikbaar sou wees nie. Byvoorbeeld, in fluoressensie herstel na fotobleiking (FRAP) eksperimente, word fluorofore binne 'n teikengebied doelbewus gebleik met oormatige vlakke van bestraling. Namate nuwe fluorofoormolekules in die gebleikte gebied van die monster diffundeer (herstel), word die intensiteit van die fluorescentie -emissie gemonitor om die laterale diffusiesnelhede van die teikenfluorofoor te bepaal. Op hierdie manier kan die translasiemobiliteit van fluorescent gemerkte molekules binne 'n baie klein (2 tot 5 mikrometer) gebied van 'n enkele sel of gedeelte van lewende weefsel vasgestel word.

Oplosmiddeleffekte op fluoressensie-emissie

'n Verskeidenheid omgewingsfaktore beïnvloed fluoressensie-emissie, insluitend interaksies tussen die fluorofoor en omliggende oplosmiddelmolekules (gedikteer deur oplosmiddelpolariteit), ander opgeloste anorganiese en organiese verbindings, temperatuur, pH en die gelokaliseerde konsentrasie van die fluoresserende spesies. Die uitwerking van hierdie parameters verskil baie van een fluorofoor na 'n ander, maar die absorpsie- en emissiespektra, sowel as kwantumopbrengste, kan sterk deur omgewingsveranderlikes beïnvloed word. Die hoë mate van sensitiwiteit in fluoressensie is eintlik hoofsaaklik te wyte aan interaksies wat in die plaaslike omgewing plaasvind gedurende die opgewekte toestand se leeftyd. 'n Fluorofoor kan beskou word as 'n heeltemal ander molekule in die opgewekte toestand (as in die grondtoestand), en sal dus 'n alternatiewe stel eienskappe vertoon ten opsigte van interaksies met die omgewing in die opgewekte toestand relatief tot die grondtoestand.

In oplossing het oplosmiddelmolekules wat die grondtoestandfluorofoor omring ook dipoolmomente wat met die dipoolmoment van die fluorofoor in wisselwerking kan tree om 'n geordende verspreiding van oplosmiddelmolekules rondom die fluorofoor te lewer. Energievlakverskille tussen die grond en opgewekte toestande in die fluorofoor veroorsaak 'n verandering in die molekulêre dipoolmoment, wat uiteindelik 'n herrangskikking van omliggende oplosmiddelmolekules veroorsaak. Die Franck-Condon-beginsel bepaal egter dat die molekule, na opwinding van 'n fluorofoor, in 'n baie korter tydsperiode opgewonde is tot 'n hoër elektroniese energievlak as wat nodig is om die fluorofoor- en oplosmiddelmolekules binne die oplosmiddeloplossing te heroriënteer. interaktiewe omgewing. As gevolg hiervan is daar 'n tydsvertraging tussen die opwindingsgebeurtenis en die herbestel van oplosmiddelmolekules rondom die opgeloste fluorofoor (soos geïllustreer in figuur 7), wat oor die algemeen 'n veel groter dipoolmoment in die opgewekte toestand het as in die grondtoestand .

Nadat die fluorofoor opgewek is tot hoër vibrasievlakke van die eerste opgewekte enkelvoudige toestand (S(1)), gaan oortollige vibrasie-energie vinnig verlore aan omliggende oplosmiddelmolekules, aangesien die fluorofoor stadig ontspan tot die laagste vibrasie-energievlak (wat in die pikosekonde-tyd voorkom) skaal). Oplosmiddelmolekules help om die energievlak van die opgewekte toestand te stabiliseer en verder te verlaag deur heroriënteer (genoem oplosmiddelverslapping) rondom die opgewekte fluorofoor in 'n stadiger proses wat tussen 10 en 100 pikosekondes verg. Dit het die effek dat die energieskeiding tussen die grond en opgewekte toestande verminder word, wat 'n rooi verskuiwing (na langer golflengtes) van die fluoressensie-emissie tot gevolg het. Die verhoging van die oplosmiddelpolariteit lewer 'n ooreenstemmende groter verlaging van die energievlak van die opgewekte toestand, terwyl die vermindering van die oplosmiddelpolariteit die oplosmiddeleffek op die energievlak van die opgewekte toestand verminder. Die polariteit van die fluorofoor bepaal ook die sensitiwiteit van die opgewekte toestand vir oplosmiddeleffekte. Polêre en gelaaide fluorofore vertoon 'n baie sterker effek as nie-polêre fluorofore.

Oplossingsverslappingseffekte op fluorescentie kan 'n dramatiese effek op die grootte van Stokes -verskuiwings tot gevolg hê. Die heterosikliese indooldeel van die aminosuur tryptofaan is byvoorbeeld normaalweg op die hidrofobiese binnekant van proteïene waar die relatiewe polariteit van die omliggende medium laag is. By denaturering van 'n tipiese gasheerproteïen met hitte of 'n chemiese middel, word die omgewing van die triptofaanresidu van nie-polêr na hoogs polêr verander soos die indoolring in die omliggende waterige oplossing uitkom. Fluoresensie-emissie word in golflengte van ongeveer 330 na 365 nanometer verhoog, 'n 35-nanometer verskuiwing as gevolg van oplosmiddeleffekte. Die emissiespektra van beide intrinsieke en ekstrinsieke fluorescerende sondes kan dus gebruik word om oplosmiddelpolariteitseffekte, molekulêre assosiasies en komplekse vorming met polêre en nie-polêre klein molekules en makromolekules te ondersoek.

Kwantitatiewe fluoressensie-ondersoeke moet voortdurend gemonitor word om te soek vir potensiële verskuiwings in emissieprofiele, selfs wanneer dit nie bedoel of verwag word nie. In eenvoudige stelsels waar 'n homogene konsentrasie bepaal kan word, moet 'n progressiewe toename in emissie -intensiteit waargeneem word as 'n funksie van toenemende fluorofoorkonsentrasie, en omgekeerd. In komplekse biologiese stelsels kan die fluorescerende sondekonsentrasie egter plaaslik oor 'n wye reeks wissel, en intensiteitsskommelinge of spektrale verskuiwings is dikwels die gevolg van veranderinge in pH, kalsiumioonkonsentrasie, energie -oordrag of die teenwoordigheid van 'n blusmiddel eerder as fluorofoor stoïgiometrie. Die moontlikheid van onverwagte oplosmiddels of ander omgewings -effekte moet altyd in ag geneem word by die evaluering van die resultate van eksperimentele prosedures.

Fluorescentie-uitstoot van 'n wye verskeidenheid monsters word gepolariseer wanneer die intrinsieke of ekstrinsieke fluorofore opgewek word met vlak-gepolariseerde lig. Die vlak van gepolariseerde emissie word beskryf in terme van die anisotropie, en monsters wat 'n mate van anisotropie vertoon, toon ook 'n waarneembare vlak van gepolariseerde emissie. Waarneming en meting van fluorescentie -anisotropie is gebaseer op die fotoselektiewe eksitasie van fluorofore as gevolg van die verbygaande belyning van die absorpsiedipoolmoment met 'n georiënteerde elektriese veldvektor van verligende fotone (gepolariseerde lig). Wanneer 'n fluorofoor 'n invallende foton absorbeer, ontstaan ​​die opwindingsgebeurtenis uit 'n interaksie tussen die ossillerende elektriese veldkomponent van die inkomende straling en die oorgangsdipoolmoment wat deur die elektroniese toestand van die fluorofoor molekulêre orbitale ontstaan. Fluorofore absorbeer verkieslik daardie fotone wat 'n elektriese veldvektor het wat parallel aan die absorpsie-oorgangsdipoolmoment van die fluorofoor in lyn is.

Fluoressensie -emissie vind ook plaas in 'n vlak wat bepaal word deur die rigting van die emissie -oorgang dipoolmoment. Elke fluorofoor het binne sy molekulêre raamwerk 'n absorpsie- en emissie-oorgangsdipoolmoment vasgemaak (Figuur 8), wat gedefinieerde oriëntasies het met betrekking tot die molekulêre asse van die kleurstofmolekule en deur 'n hoek (q) van mekaar geskei is. Aangebied in Figuur 8 is 'n hipotetiese driekern aromatiese heterosikliese fluorofoor (wat soortgelyk aan die akridienringstelsel gerangskik is) oorgetrek met pyle wat die ruimtelike verhouding van die absorpsie (geel pyl) en emissie (rooi pyl) oorgangsdipoolmomentvektore voorstel. Gedurende die lewensduur van die opgewekte toestand (t), sal rotasie van die fluorofoor sy emissie met betrekking tot die opwekkingsvektor depolariseer, wat lei tot 'n meganisme waarmee die rigiditeit van die omgewing wat die fluorofoor bevat, gemeet kan word.

Beligting van 'n isotropiese oplossing wat ewekansig georiënteerde fluorofore bevat met vlak-gepolariseerde lig sal verkieslik net daardie molekules opwek wie se absorpsie-oorgangsdipoolmomente parallel (of amper so) in lyn is met die polarisasie elektriese vektorvlak. Die waarskynlikheid van absorpsie is eintlik eweredig aan die kosinus kwadraat van die hoek tussen die dipool en die elektriese veldvektor van die invallende lig (absorpsie is maksimum as die hoek nul grade is en 'n minimum bereik as die hoek 90 grade nader). Die resultaat sal 'n spesifieke fotoseleksieproses wees van 'n subpopulasie opgewonde fluorofore uit die oorspronklike ensemble, wat fluorofore van opgewekte toestande oplewer wat parallel aan 'n spesifieke as gerig is. Fluorescentie -uitstoot van hierdie subpopulasie sal ook gedeeltelik gepolariseer word. Metings van die relatiewe hoek tussen die eksitasie- en emissie -oorgang dipoolmomente bepaal die mate van polarisasie (p) of anisotropie (r), soos gegee deur die vergelykings:

p = (I - I )/(I + I ) en r = (I - I )/(I + 2I )

waar I () die fluorescentie -emissie is wat gemeet word in die vlak parallel met die eksitasievlak en I () die fluorescentie -emissie is wat gemeet word in die vlak loodreg op die vlak van eksitasie. In die praktyk word die hoeveelheid gepolariseerde lig bereken deur die emissie te meet wat ingesamel is met 'n polarisator wat in die opwekkingsligpad geplaas is en 'n ontleder geplaas in die emissieligpad wat óf parallel óf loodreg op die opwekkingspolarisator georiënteer is (sien Figuur 9). Anisotropie en polarisasie is albei uitdrukkings vir dieselfde verskynsel en die waardes kan maklik omskakel word. In die meeste gevalle word die anisotropie -uitdrukking verkies omdat die gepaardgaande wiskundige vergelykings eenvoudiger is as dit uitgedruk word in terme van hierdie parameter.

Omdat die emissie -oorgang dipoolmoment verplaas word van die eksitasie -oorgangsmoment as gevolg van ruimtelike oriëntasie (sien figuur 8), sal 'n mate van depolarisasie plaasvind, selfs al is die fluorofore op hul plek vasgemaak. Die absorpsieproses self is dus die eerste bron van fluorescentiedepolarisasie. Rotasiebeweging van die fluorofoor, wat altyd plaasvind tydens die leeftyd van die opgewekte toestand, lei tot 'n verdere verplasing van die emissie -oorgangsdipool vanaf die oorspronklike oriëntasie, en sal die waargenome emisiesanisotropie verder verlaag. Die rotasiesnelheid hang af van die grootte van die fluorofoor (of die makromolekule waaraan dit gebind is) en die viskositeit van die gelokaliseerde omgewing. Die fluorescentie -anisotropie van 'n oplossing kan verband hou met die rotasie -mobiliteit van die fluorofoor deur die Perrin -vergelyking:

waar r(0) die beperkende anisotropie is (die anisotropie waargeneem in die afwesigheid van enige fluorofoorrotasie), r die gemete anisotropie is, h die viskositeit van die omgewing is, V die volume van die roterende molekule is, R die universele gas is. konstant, T is die temperatuur van die oplossing op die Kelvin-skaal, en t is die leeftyd van die fluorofoor-opgewekte toestand. In die praktyk word die Perrin-vergelyking verminder om die tydsafhanklike verval van anisotropie uit te druk in terme van die rotasie-korrelasietyd (f) van die fluorofoor:

r 0 /r = 1 + t / f waar f = ( h V)/(RT)

Van die verskynsels wat lei tot (laer) gemete fluoressensie-anisotropiewaardes wat van die maksimum teoretiese limiet afwyk, is die natuurlike rotasiediffusie van molekules wat gedurende die leeftyd van die opgewekte toestand plaasvind. In oplossing het fluorofore met klein molekulêre gewig (tot etlike duisende Daltons) 'n rotasie-korrelasietyd wat wissel tussen 50 en 100 pikosekondes, wat aansienlik vinniger is as die emissietempo en die emissie-oorgangsdipoolmoment verplaas, of ewekansig versprei. Omdat die gemiddelde lewensduur van 'n opgewekte toestand van 'n tipiese fluorofoor in die nanosekonde-reeks is, is die molekules in staat om talle kere voor vrystelling te draai. As gevolg hiervan word die gepolariseerde emissie ewekansig, sodat die netto anisotropie nul is. 'N Tweede (maar baie meer seldsame) meganisme vir afname in anisotropie wat algemeen waargeneem word, is die oordrag van eksitasie -energie tussen fluorofore.

Assosiasie van 'n fluorofoor met 'n baie groter makromolekule lei tot 'n dramatiese toename in die rotasie-korrelasietyd. In die meeste gevalle wissel die korrelasietyd vir 'n groot proteïen in oplossing van 10 tot 50 nanosekondes, wat gelyk is aan of die gemiddelde leeftyd van 'n opgewekte toestand van 'n tipiese fluorofoor oorskry. Die binding van die fluorofoor vertraag die rotasiebeweging van die fluorescerende sonde en maak dit moontlik om die rotasie -korrelasietyd van die gasheerproteïen te ondersoek. Kleiner proteïene vertoon gewoonlik baie korter korrelasietye as groter proteïene, of proteïene wat by komplekse biologiese samestellings betrokke is, en kan na verwagting laer anisotropieë produseer.

Die instrumentele benadering vir die meting van fluorescentiepolarisasie met 'n optiese mikroskoop word in figuur 9. Vliegtuig-gepolariseerde eksitasielig word opgewek deur lig uit die boogontladingsverligter deur 'n lineêre polarisator te laat vloei. Die vlak-gepolariseerde eksitasielig word maksimaal geabsorbeer deur fluorofore in die monster (op die mikroskoopskyfie) waarvan die absorpsiedipoolmomente parallel met die vlak van die opwindingslig gerig is. Dit lei daartoe dat 'n spesifieke subpopulasie van fluorofore opgewonde is ('n anisotropiese versameling fluorofore). In teorie besit al die opgewekte fluorofore dieselfde oriëntasie van absorpsie- en emissie-dipoolmomente. Die fluoressensie wat vervolgens deur die fluorofoor uitgestraal word, word gemeet in beide parallelle en loodregte oriëntasies met betrekking tot die polarisasievlak van die opwekkingsbeligting. Soos die fluorofoor roteer gedurende sy opgewekte toestand leeftyd, sal die vlak van emissie wat parallel met die opwekkingsvlak waargeneem word voortdurend afneem, terwyl die hoeveelheid emissie wat loodreg op die opwekkingsvlak aangeteken word gelyktydig sal toeneem.

Soos hierbo bespreek, kan fluoressensie -anisotropiemetings inligting verskaf oor die rotasie -mobiliteit van proteïene, waaruit hulle molekulêre gewig en vorm afgelei kan word. Boonop kan intermolekulêre assosiasies gemonitor word, sowel as konformasieveranderinge en proteïen denaturasie. Die tegniek is ook gebruik om die interne buigbaarheid van proteïene en 'n aantal fisiese eienskappe van biologiese membrane te ondersoek, insluitend viskositeit, fase -oorgange, chemiese samestelling en die effek van membraanversteuring op hierdie eienskappe. Fluorescentie-anisotropie-metings kan op steady-state stelsels gedoen word deur gebruik te maak van deurlopende beligting of in tydopgeloste eksperimente wat gepulseerde opwindingsgebeurtenisse gebruik.

Resonansie-energie-oordrag

'n Fluorofoor in die opgewekte toestand kan, soos hierbo bespreek, opwekkingsenergie verloor deur dit om te skakel in lig (fluoressensie), deur termiese ekwilibrasie (vibrasieverslapping), of deur oordrag na 'n ander molekule deur botsing of kompleksvorming (nie-stralingsdissipasie en blus ). By die vorming van 'n kompleks of botsing met 'n oplosmiddelmolekule word energie oorgedra deur die koppeling van elektroniese orbitale tussen die fluorofoor en 'n tweede molekule. Daar is ook nog 'n ander proses, genaamd resonansie-energie-oordrag (RET), waardeur 'n fluorofoor in die opgewekte toestand (genoem die skenker) sy opwekkingsenergie na 'n naburige chromofoor (die akseptor) nie-straling kan oordra deur langafstand dipool-dipool interaksies oor afstande gemeet in nanometers. Die basiese teorie van resonansie -energie -oordrag veronderstel dat die skenkerfluorofoor behandel kan word as 'n ossillerende dipool wat energie kan oordra na 'n soortgelyke dipool op 'n bepaalde resonansfrekwensie op 'n manier analoog aan die gedrag van gekoppelde ossillators, soos 'n paar stemvurke wat vibreer op dieselfde frekwensie.

Resonansie-energie-oordrag is moontlik moontlik wanneer die emissiespektrum van die skenkerfluorofoor die absorpsiespektrum van die akseptor oorvleuel, wat op sigself nie noodwendig fluoresserend is nie. 'N Belangrike konsep om hierdie meganisme van energie -oordrag te verstaan, is dat die proses geen uitstraling van lig van die skenker behels nie, gevolg deur daaropvolgende opname van die uitgestraalde fotone deur die aanvaarder. Met ander woorde, daar is geen intermediêre foton betrokke by die meganisme van oordrag van resonansie -energie nie. Die oordrag van energie word gemanifesteer deur beide blus van die skenkerfluoressensie -uitstoot in die teenwoordigheid van die aanvaarder en verhoogde (gesensitiseerde) emissie van acceptorfluoressensie.

Aangebied in Figuur 10 is veranderinge aan die emissie -intensiteite van die spektrale profiele van 'n gekoppelde skenker en acceptormolekule wat resonansie -energie -oordrag ondergaan. Oorvleueling (grys gebied) tussen die skenkeremissie (sentrale grys kurwe) en acceptor absorpsiespektra (sentrale geel kurwe) is nodig om die proses te kan plaasvind. As hierdie oorvleueling teenwoordig is en die skenker en aanvaarder met minder as 10 nanometer geskei word, kan skenker-eksitasie-energie nie-stralend na die aanvaarder oorgedra word. Die netto resultaat is die blus van die skenkerfluoressensie -emissie (rooi kurwe) en 'n toename in die emissie -intensiteit van die acceptor (sensitiewe emissie, rooi stippelkromme). Die individuele spektrale profiele vir die skenker en aanvaarder in Figuur 10 kan geïdentifiseer word met behulp van die legende in die linker boonste hoek van die figuur.

Die doeltreffendheid van resonansie-energie-oordrag wissel met die mate van spektrale oorvleueling, maar die belangrikste as die omgekeerde van die sesde mag van die afstand (radius, r ) wat die skenker- en akseptorchromofore skei. Energie-oordrag na die aanvaarder vereis dat die afstand tussen die chromofore relatief naby is, binne die beperkende grense van 1 tot 10 nanometer. Die verskynsel kan opgespoor word deur 'n benoemde monster met beligtingsgolflengtes te stimuleer wat ooreenstem met die absorpsie (opwekking) maksimum van die skenker en fluoressensie emissie op te spoor in die piek emissie golflengte area van die akseptor. Alternatiewelik kan die fluoressensieleeftyd van die skenker gemeet word in die teenwoordigheid en afwesigheid van die aanvaarder. Die afhanklikheid van energie-oordragdoeltreffendheid op die skeidingsafstand tussen die skenker en aanvaarder verskaf die basis vir die nut van resonansie-energie-oordrag in die studie van selbiologie. Hierdie faset van resonansie-energie-oordrag maak dit moontlik om die tegniek as 'n spektroskopiese liniaal te gebruik om interaksies tussen sellulêre komponente, sowel as konformasieveranderinge binne individuele makromolekules, op molekulêre vlak te bestudeer en te kwantifiseer.

'N Stel spesifieke voorwaardes moet daargestel word vir die oordrag van resonansie -energie. Die skenkerchromofoor moet in staat wees tot fluoressensie met 'n redelike kwantumopbrengs gekoppel aan 'n voldoende lang leeftyd, en die afstand tussen die skenker- en aanvaardermolekules moet relatief kort wees (in die meeste gevalle slegs 'n paar nanometer). Daarbenewens, soos hierbo bespreek, behels die ontwerp van resonansie-energie-oordragondersoeke nie die oorweging van die werklike herabsorpsie van lig deur die aanvaarder nie. Die tempo van energie-oordrag (K(T)) en energie-oordragdoeltreffendheid (E(T)) hou albei verband met die leeftyd van die skenker in die teenwoordigheid of afwesigheid van die aanvaarder. Die tempokonstante vir energie-oordrag word uitgedruk as:

waar R(0) die kritieke Eerste afstand is, wat die skenker-aanvaarder-skeidingsradius is waar die waarskynlikheid van energie-oordrag gelyk is aan dié van die skenker-ontspanning (verval) tempo in die afwesigheid van die aanvaarder. Dus, die eerste afstand, wat tipies wissel tussen 2 en 7 nanometer vir die meeste resonansie-energie-oordragmetings, is die afstand tussen chromofore waar energie-oordrag 50 persent doeltreffend is. Ook in die vergelyking is t (D) die veranderlike wat gebruik word om die leeftyd van die skenker in die afwesigheid van die aanvaarder aan te dui, en r is die afstand wat die skenker- en aanvaardermolekules skei. Deur die vergelyking te ondersoek, is dit duidelik dat die resonansie-energie-oordragtempo gelyk is aan die skenkervervaltempo (omgekeerd van die leeftyd) in die afwesigheid van die akseptor wanneer die radius tussen chromofore gelyk is aan die Eerste afstand. Op hierdie stadium is die oordragdoeltreffendheid 50 persent en die skenkervrystelling sal verminder word tot die helfte van die normale intensiteit in die afwesigheid van die aanvaarder. Omdat die tempo van energie-oordrag omgekeerd eweredig is aan die sesde mag van die skeidingsafstand, is die nabyheid tussen skenker en aanvaarder duidelik die oorheersende term. Die kritieke eerste afstand, uitgedruk in nanometer, word volgens die vergelyking bereken:

R 0 = 2,11 x 10 -2 [ h -4 Q 0 k 2 J(l)] 1/6

Die eerste afstandsvergelyking stel die konsep van k 2 (k -kwadraat) bekend, wat 'n oriëntasiefaktor is wat die ruimtelike verhouding tussen die skenker- en aanvaarderabsorpsie- en emissiedipole in driedimensionele ruimte beskryf. As dipooloriëntasie ewekansig is tussen die twee chromofore (as gevolg van vinnige rotasie van die skenker- en akseptormolekules), word die oriëntasiefaktor geneem om gelyk te wees aan die statistiese gemiddelde ('n waarde van 2/3 of 0.67) vir die meeste berekeninge van R(0). . Die brekingsindeks van die medium waar energie -oordrag plaasvind, word aangedui deur die veranderlike h, en Q (0) is die kwantumopbrengs van die skenker in die afwesigheid van die aanvaarder. Die oorvleueling integraal, J(l), definieer die area van oorvleueling tussen die skenker emissie en aanvaarder absorpsie spektra (geïllustreer deur die grys geskakeerde area in Figuur 10). Energie-oordragdoeltreffendheid (E(T)) hou verband met die afstand wat die skenker en die aanvaarder (r) skei deur die vergelyking:

r = R 0 [(1/E T) - 1] 1/6 waar E T = 1 - (t DA/t D)

Dus, deur die fluoressensieleeftyd van die skenker in die teenwoordigheid van die akseptor (t (DA)) en sonder die akseptor (t (D)) te meet, kan die energie-oordragdoeltreffendheid en afstand wat die twee chromofore skei bepaal word. Omdat die doeltreffendheid van resonansie-energie-oordrag sterk beïnvloed word deur diffusie van die skenker en aanvaarder gedurende die skenkerleeftyd, is tyd-opgeloste metings die mees geskikte vir ontleding van ruimtelik fluktuerende sisteme. Oordragdoeltreffendheid kan ook gemeet word aan die hand van steady-state tegnieke deur gebruik te maak van die relatiewe fluorescentie-emissie-intensiteit van die skenker in die teenwoordigheid en afwesigheid van die acceptor. Hierdie berekeninge is egter beperk tot situasies waar die skenker en aanvaarder deur 'n vaste afstand geskei word, soos wanneer beide chromofore aan dieselfde makromolekule gebind is. Dit is nie die geval vir skenkers en aanvaarders wat aan verskillende proteïene of 'n proteïen en nukleïensuur gebind is nie, waar tydopgeloste inligting dikwels nodig is. Net so, vir 'n mengsel van chromofore in oplossing, of lukraak versprei in membrane, is meer komplekse berekeninge nodig wat 'n gemiddelde oordragtempo van ruimtelik verspreide molekules in ag neem.

Resonansie-energie-oordragondersoeke verskaf unieke inligting in vergelyking met dié wat verkry word uit alternatiewe eksperimente wat fluoressensie-anisotropie, oplosmiddelverslapping, blus- of mees opgewonde toestandreaksies behels. Die meerderheid van kwantitatiewe fluoressensiemetings maak staat op kortafstandinteraksies tussen die fluorofoor en ander molekules in die onmiddellike omgewing, insluitend die omliggende oplosmiddelmolekules. Daarenteen het oplosmiddeleffekte en selfs die teenwoordigheid van 'n groot makromolekule (soos 'n proteïen of nukleïensuur) min effek op die doeltreffendheid van energie-oordrag tussen die skenker en die aanvaarder. Die primêre faktor vir oorweging by die meting van resonansie-energie-oordrag, anders as ander tegnieke, is die werklike fisiese afstand tussen die skenker- en die aanvaardermolekules.

Selfs al blyk die fluoressensie-verskynsel amper oombliklik te wees, met huidige instrumentasie maak die relatief lang tydsbestek tussen absorpsie van 'n foton en die vrystelling van 'n tweede foton deur 'n fluorofoor die deur oop vir 'n aansienlike aantal ondersoeke wat hierdie merkwaardige metodologie gebruik. Ingesluit in die palet van fluoressensietegnieke is waarneembare veranderinge in absorpsie- en emissiespektra, kwantumopbrengs, lewenstye, blus, fotobleiking, anisotropie, energie-oordrag, oplosmiddeleffekte, diffusie, kompleksvorming en 'n magdom omgewingsveranderlikes. Al hierdie faktore kan geredelik geëvalueer word deur bestendige toestand of tyd-opgeloste interpretasies van die spektrale eienskappe van intrinsieke en ekstrinsieke fluorofore.

Wanneer dit aan die optiese mikroskoop gekoppel word, stel fluoressensie ondersoekers in staat om 'n wye spektrum van verskynsels in sellulêre biologie te bestudeer. Die belangrikste is die ontleding van intrasellulêre verspreiding van spesifieke makromolekules in subsellulêre samestellings, soos die kern, membrane, sitoskeletale filamente, mitochondria, Golgi-apparaat en endoplasmiese retikulum. Benewens bestendige toestand waarnemings van sellulêre anatomie, is fluoressensie ook nuttig om intrasellulêre dinamika en die interaksies tussen verskeie makromolekules te ondersoek, insluitend diffusie, bindingskonstantes, ensiematiese reaksietempo's en 'n verskeidenheid reaksiemeganismes, in tyd-opgeloste metings. Ander belangrike prosesse is ook teikens vir ondersoek deur gebruik te maak van die hoë graad van spesifisiteit en ruimtelike resolusie wat beskikbaar is met fluoressensiemikroskopie. Byvoorbeeld, fluoresserende probes is aangewend om intrasellulêre pH en die gelokaliseerde konsentrasie van belangrike ione te monitor, en vir die studie van sellewensvatbaarheid en die faktore wat die tempo van apoptose beïnvloed. Net so is belangrike sellulêre funksies soos endositose, eksositose, seintransduksie en transmembraanpotensiaalgenerering met fluoressensiemikroskopie bestudeer. In die hersiening van die groot aantal toepassings wat voordeel trek uit fluoressensie-analise, is dit duidelik waarom die beduidende nut van fluoressensiemikroskopie hierdie tegniek na die voorpunt van biomediese navorsing gedryf het.

Brian Herman en Victoria E. Centonze Frohlich - Departement Sellulêre en Strukturele Biologie, Universiteit van Texas Gesondheidswetenskapsentrum, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Joseph R. Lakowicz - Sentrum vir Fluoresensiespektroskopie, Departement Biochemie en Molekulêre Biologie, Universiteit van Maryland en Universiteit van Maryland Biotegnologie-instituut (UMBI), West Lombardstraat 725, Baltimore, Maryland 21201.

Douglas B. Murphy - Departement Selbiologie en Anatomie en Mikroskoopfasiliteit, Johns Hopkins Universiteit Skool vir Geneeskunde, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

Kenneth R. Spring - Wetenskaplike konsultant, Lusby, Maryland, 20657.

Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Die Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


Interpretasie van volgorde-chromatogramme

Outomatiese DNA-sekwenseerders genereer 'n vier-kleur chromatogram wat die resultate van die volgorde-lopie toon, sowel as 'n rekenaarprogram’s beste raaiskoot op die interpretasie van daardie data – 'n tekslêer van volgorde data. Die rekenaarprogram maak egter foute, en u moet die interpretasie van die primêre data handmatig nagaan. Voorspelbare foute kom naby die begin en weer aan die einde van enige opeenvolgingslopie voor. Ander foute kan in die middel opduik, wat individuele basisoproepe of hele stukke data ongeldig maak.
Hierdie dokument verduidelik hoe om die te ondersoek normaal DNA-volgorde-chromatogram, wat algemene probleme beskryf en hoe om dit te interpreteer. Skakels word ook gegee vir meer volledige probleemoplossing van probleme.
Dit is die verantwoordelikheid van die kernkliënte om:

Die huidige weergawe van hierdie dokument weerspieël ons huidige generasie DNS-volgorders, die ABI Model 3730XL. Soms sal inligting in hierdie dokument verwys na ouer opeenvolgers vir historiese doeleindes, en ons sal spesifiek noem wanneer dit die geval is.

Met 'n bietjie oefening kan jy 'n chromatogram binne minder as 'n minuut skandeer en probleme raaksien. Dit is nie nodig om elke basis te lees nie.

1. Kry 'n algemene gevoel van hoe skoon die volgorde is

Hoe duidelik is die nukleotiedpieke in die algemeen? Jy behoort eweredig gespasieerde pieke te sien, elk met net een kleur. Piekhoogtes kan 3-voudig verskil, wat normaal is. “Gaas” (basislyn) pieke kan teenwoordig wees, maar met goeie sjabloon en onderlaag, sal hulle redelik minimaal wees. As jou resultate nie by hierdie beskrywing pas nie, raadpleeg ons Probleemoplossing-bladsye. Hier’s 'n voorbeeld van' n uitstekende volgorde. Let op die pieke wat eweredig versprei is en die gebrek aan baseline ‘lawaai ’ (sien verder af vir voorbeelde van hoër baseline-geraas):

Die volgende voorbeeld het 'n bietjie basislyn geraas, maar die ‘regte’ pieke is steeds maklik om te noem, so daar’s geen probleem met hierdie voorbeeld nie:

Nou kom ons by 'n voorbeeld wat 'n bietjie te veel geraas het. Let op die veelkleurige pieke by 271, 273 en 279, die vreemd gespasieerde interstisiële pieke naby 291 en 301, en dit is onmoontlik om die werklike nukleotied by 310 te bepaal.

Geraas soos bogenoemde kom meestal voor wanneer die monster self te dof is. Gaan die ‘Signaalintensiteit ’ -nommers na vir u chromatogram. Hulle is gewoonlik beskikbaar in 'n aparte oprolvenster via u chromatogram-kykprogram, of as u die chromatogram gedruk het, kan dit aan die bokant gedruk word. Hier is 'n paar voorbeeld seinsterktegetalle, wat arbitrêre “ -relatiewe fluorescentie -eenhede weerspieël ”:


Tel STR'e

Sodra 'n segment van DNA uitgesonder is deur sy spesiale primers en geamplifiseer is deur PCR, kan die aantal motiewe (herhalings) van die teiken STR maklik bepaal word deur gelelektroforese. Die mengsel van biljoene kort fragmente van die PCR word in óf 'n vlak skinkbord óf 'n reeks glaskapillêre buise gelaai wat 'n jeloplossing bevat wat as 'n sifmatriks dien. Hierdie sif laat kleiner molekules makliker deur as groter molekules. Tydens elektroforese word 'n spanning oor die gel geskep sodat die een kant positief en die ander negatief gemaak word. Aangesien DNA effens negatief is, sal sy fragmente na die positiewe kant van die jel beweeg. Die spoed waarmee 'n DNS-segment deur die jel beweeg, word deur die grootte daarvan bepaal. Figuur 1 toon 'n verwysingsmonster van 'n mengsel wat fragmente bevat van al die bekende reeks herhalings wat deur die jel in die "baan" aan die linkerkant gevoer is. Die toetsmonster is langsaan aan die regterkant. Die fragmente van die verwysingsmengsel het volgens lengte versprei en vorm wat bekend staan ​​as 'n alleel leer. Die lengte van die fragmente in die onbekende monster kan deur vergelyking bepaal word. Die aantal basispare vir elke fragment (bekend uit die verwysingsmengsel) is aan die regterkant.

Deur Shinryuu (Eie werk) [Publieke domein], via Wikimedia Commons

Multipleksreaksies

Om tyd, geld en materiaal te bespaar, is baie werk daaraan gegaan om prosedures te ontwikkel waardeur toets-DNS met 'n kombinasie van PCR-inleiders vir verskeie verskillende merkers op 'n slag "geïnkubeer" kan word. Primers is ontwerp om op slegs een plek in die genoom te bind sodat elke primer tydens die PKR besig kan wees om sy eie STR merker uitsluitlik uit te dissekteer en te versterk.

Die taak om die resultate aan die einde uit te sorteer, word vergemaklik deur verskillende gekleurde fluorescerende etikette by die fragmente te voeg. Fluorescerende etikettering van DNA-fragmente kan op verskeie maniere uitgevoer word. Die mees algemene metode is om 'n fluoresserende kleurstof op die 5'-einde van 'n PCR-primer op te neem, sodat tydens die PCR-versterking die voorste of die omgekeerde string van DNA gemerk sal word.

Aan die einde van die PCR sal die mengsel deur 'n gelelektroforeseplaat of 'n reeks mikrotubuli gevoer word wat elk met 'n gel gevul is. Aangesien elke versterkte fragment 'n diskrete lengte het wat afhang van die aantal herhaalde motiewe, sal dit teen 'n ander tempo deur die jel beweeg. Die kleure van die fluoresserende etikette word gekoördineer met die groottereekse van die merkers sodat verskeie merkers in dieselfde groottereeks saam geloop kan word, elkeen met 'n ander kleur gemerk.

Die getal bo elke piek in die figuur 2 hierbo is die DYS -merkergetal vir die fragment. Die X -as verteenwoordig die PCR -produkgrootte, dit wil sê die aantal basispare in die fragment. Die kleinste fragmente is DYS 426 in die boonste spoor en DYS391 in die onderste spoor.

Deur te vergelyk met die mobiliteitsyfers van fragmente van bekende lengtes, is dit moontlik om die lengte in basispare vir elke merker te bepaal en daaruit die aantal herhalings te bereken en die getal wat jy in jou Y-DNA-toetsverslag sal ontvang.

In die naspoor hierbo is vier verskillende fluoresserende etikette gebruik - groen, blou, rooi en swart (wat waarskynlik eintlik geel was wat nie baie goed vertoon nie.) Twee verskillende stelle merkers word getoon. Die boonste natrek verteenwoordig die resultate van die multipleksing van 19 verskillende merkers - elk gemerk deur sy DYS-identifikasienommer. Die onderste spoor toon die resultate van nege van die merkers in die boonste spoor. Let op hoe die merkers DYS389I en DYS388 slegs as twee afsonderlike merkers onderskei kan word vanweë hul verskillende kleure fluoressensie.

Verstaan ​​ook dat die hoogte van die fluoressensie-piek vir elke merker nie 'n belangrike waarde is nie aangesien slegs primers gemerk is - een per fragment, maak nie saak hoe lank of kort die fragment is nie. Die ligging van die piek op die x-as verteenwoordig die aantal basispare in die fragment wat 'n funksie is van die aantal herhalings. Basies, sodra die aantal basispare in die fragment bepaal is, is dit 'n kwessie daarvan om die aantal basispare in die primer af te trek van die totale lengte en dan daardie getal te deel deur die aantal bps wat op merkermotief uitmaak. Dit is 'n oorvereenvoudiging omdat sommige merkers van meer as een herhalende patroon gemaak kan word en sommige primers kan eintlik deel van die werklike STR-streek wees. Tog is die konsep dieselfde. Alle metings en berekeninge word per rekenaar gedoen.


Kyk die video: Anti-aging mask, firms the skin and fights the appearance of fine lines and wrinkles (Oktober 2022).