Inligting

Bind RNA-molekules mekaar?

Bind RNA-molekules mekaar?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek het 'n vraag, miskien 'n naïewe.

Kom ons neem aan dat ons RNA van 'n weefsel geïsoleer het. Kan RNA-molekules mekaar bind as hulle die komplementêre volgorde het? Ek weet dat sommige klein RNA -molekules ander RNA's kan bind en reguleer, maar ek weet nie dat dit moontlik is in hierdie geval nie? Dit is asof 2 verskillende mRNA mekaar kan bind of nie?


Die verskil tussen RNA en DNA is redelik klein, en albei kan 'n dubbelheliksstruktuur vorm. As u dus twee rye RNA het wat mekaar aanvul, sou hulle 'n basiese paar hê en 'n heliks vorm.

Daar was ook 'n paar idees om dit vir terapeutiese doeleindes te gebruik, antisense RNA, 'n RNA-oligo wat aanvullend is tot 'n boodskapper-RNA, kan teoreties gebruik word om geenuitdrukking te stil deur baseparing met die mRNA.


@MadScientist antwoord is baie goed. Ek wil net 'n detail byvoeg wat nie in 'n opmerking kon pas nie.

Dubbelstrengs RNA is niks uitsonderliks ​​nie. U kan 'n RNA -string sien wat in tRNA en byvoorbeeld in RNAi aan sy antisense bind.

tRNA

RNAi


Multidimensionele oorspraak tussen RNA-bindende proteïene en nie-koderende RNA's in kankerbiologie

Dit is bekend dat RNA-bindende proteïene (RBP's) RNA bind via 'n stel RNA-bindende domeine (RBD's) en die lot en funksie van hul RNA-teikens omgekeerd bepaal, maar sommige RBP's kan in sekere gevalle deur die gebonde RNS eerder as om hul RNA vennote te reguleer. Huidige proteoomwye studies toon dat byna die helfte van RBP's geen kanoniese RBD's het nie, en die ontdekking van tienduisende niekoderende RNA's (ncRNA's), veral dié met 'n grootte groter as 200 nt (naamlik lang niekoderende RNA's, lncRNA's), maak die oorspraak tussen RBP's en RNA's meer ingewikkeld. Dit is duidelik dat makromolekulêre komplekse wat deur RBP en RNA gevorm word nie net 'n vorm van bestaan ​​van hul RBP- en RNA-komponente in selle is nie, maar ook 'n funksionele entiteit verteenwoordig waardeur daardie RBP's en regulatoriese ncRNA's deelneem aan die konstruksie van regulatoriese netwerke in organisme. In hierdie oorsig gee ons 'n opsomming van die multidimensionele oorspraak tussen RBP's en ncRNA's in kanker en bespreek hoe RBP's hul funksie bereik via die gebonde ncRNA's in verskillende aspekte van geenuitdrukking, asook hoe RBP's modifikasie en verwerking van ncRNA's rig, ten einde tumor beter te verstaan biologie en bied nuwe insigte oor die ontwikkeling van strategieë vir kankerterapie en vroeë opsporing.


Het 'n vroeër genetiese molekule DNA en RNA voorafgegaan?

In die chemie van die leefwêreld heers 'n paar nukleïensure - DNA en RNA - die hoogste. As draermolekules van die genetiese kode, voorsien hulle aan alle organismes 'n meganisme om hulself getrou voort te plant sowel as die generering van die magdom proteïene wat noodsaaklik is vir lewende sisteme.

Tog volgens John Chaput, 'n navorser by die Sentrum vir Evolusionêre Geneeskunde en Informatika, by Arizona State University se Biodesign Institute®, was dit dalk nie altyd so nie.

Chaput en ander navorsers wat die eerste voorlopige flikkering van lewe op aarde bestudeer, het verskeie alternatiewe vir bekende genetiese molekules ondersoek. Hierdie chemiese kandidate is aantreklik vir diegene wat die steeds ontwykende geheim wil ontsluit van hoe die eerste lewe begin het, aangesien primitiewe molekulêre vorms moontlik makliker na vore gekom het tydens die planeet se prebiotiese era.

Een benadering om molekules te identifiseer wat moontlik as genetiese voorlopers van RNA en DNA opgetree het, is om ander nukleïensure te ondersoek wat effens verskil in hul chemiese samestelling, maar tog oor kritieke eienskappe beskik van selfassemblage en replikasie, asook die vermoë om in vorms te vou. nuttig vir biologiese funksie.

Volgens Chaput is 'n interessante aanspraakmaker op die rol van 'n vroeë genetiese draer 'n molekule bekend as TNA, wie se aankoms op die oertoneel moontlik sy bekendste familielede voorgekom het. 'N Nukleïensuur wat soortgelyk is aan beide DNA en RNA, TNA verskil in die suikerkomponent van sy struktuur deur gebruik te maak van threose eerder as deoksiribose (soos in DNA) of ribose (soos in RNA) om die ruggraat saam te stel.

In 'n artikel wat vandag aanlyn in die tydskrif Nature Chemistry gepubliseer is, beskryf Chaput en sy groep die Darwinistiese evolusie van funksionele TNA -molekules uit 'n groot poel willekeurige rye. Dit is die eerste geval waar sulke metodes toegepas is op ander molekules as DNA en RNA, of baie noue strukturele analoë daarvan. Chaput sê "die belangrikste bevinding uit hierdie werk is dat TNA in komplekse vorms kan vou wat kan bind aan 'n gewenste doelwit met 'n hoë affiniteit en spesifisiteit". Hierdie kenmerk dui daarop dat dit in die toekoms moontlik kan wees om TNA-ensieme te ontwikkel met funksies wat nodig is om vroeë lewensvorme te onderhou.

Byna elke organisme op aarde gebruik DNA om stukke genetiese inligting in gene te kodeer, wat dan in RNA gekopieer word. Met behulp van gespesialiseerde ensieme bekend as polimerases, stel RNA aminosure saam om noodsaaklike proteïene te vorm. Dit is opmerklik dat die basiese funksionering van die genetiese kode dieselfde bly, of die organisme 'n slak of 'n senator is, wat wys op 'n gemeenskaplike voorouer in die DNA-gebaseerde mikrobiese lewe wat reeds 3,5 miljard jaar gelede floreer het.

Tog was sulke voorouers teen hierdie tyd taamlik ingewikkeld, wat sommige wetenskaplikes laat bespiegel het oor nog vroeëre vorme van selfreplikasie. Voordat DNA na vore gekom het om sy oorheersende rol as die ontwerpbloudruk vir lewe te speel, het 'n eenvoudiger genetiese wêreld wat deur RNA oorheers is moontlik geheers. Die RNA -wêreldhipotese, soos dit bekend is, beweer dat ribonukleïensuur (RNA) opgetree het om genetiese inligting op te slaan en chemiese reaksies te kataliseer, net soos 'n proteïenensiem, in 'n tydperk voordat DNA, RNA en proteïene die geïntegreerde stelsel gevorm het wat vandag in die hele wêreld voorkom.

Terwyl die ikoniese dubbelheliks van DNS gevorm word uit twee komplimentêre stringe nukleotiede, wat aan mekaar geheg is deur basisparing in 'n heliese trap, is RNA enkelstrengs. Die twee nukleïensure DNA en RNA is vernoem na die tipe suikerkompleks wat elke molekule se suiker-fosfaat-ruggraat vorm-'n soort molekulêre draad wat die nukleotiedkrale bymekaar hou.

Kon 'n eenvoudiger, self-repliserende molekule bestaan ​​het as 'n voorloper van RNA, wat dalk genetiese materiaal vir die aarde se vroegste organismes verskaf het? Chaput se eksperimente met die nukleïensuur TNA bied 'n aantreklike geval. Om mee te begin, gebruik TNA tetrose suikers, vernoem na die vierkoolstofringgedeelte van hul struktuur. Hulle is eenvoudiger as die vyf-koolstof pentose suikers wat in beide DNA en RNA voorkom en kan makliker in 'n prebiotiese wêreld saamstel, uit twee identiese twee-koolstof fragmente.

Hierdie voordeel in strukturele eenvoud was oorspronklik 'n Achilleshiel vir TNA, wat sy bindingsgedrag onverenigbaar maak met DNA en RNA. Verrassend genoeg het navorsing egter nou getoon dat 'n enkele TNA-string inderdaad kan bind met beide DNA en RNA deur Watson-Crick-baseparing-'n feit van kritieke belang as TNA werklik bestaan ​​as 'n oorgangsmolekule wat inligting met meer bekende nukleïne kan deel sure wat uiteindelik die lewe sou kom oorheers.

In die huidige studie gebruik Chaput en sy groep 'n benadering bekend as molekulêre evolusie om TNA se potensiaal as 'n genetiese biomolekule te ondersoek. Sulke werk put uit die verrassende besef dat fundamentele Darwiniaanse eienskappe-selfreplikasie, mutasie en seleksie-op nie-lewende chemikalieë kan werk.

Om hierdie tegniek tot TNA uit te brei, benodig polimerase -ensieme wat 'n biblioteek van ewekansige DNA -rye in TNA kan vertaal. Sodra so 'n poel TNA -stringe gegenereer is, moet 'n proses van seleksie lede suksesvol identifiseer wat 'n gegewe funksie kan verrig, die res uitgesluit. As 'n proefgeval het die span gehoop om deur molekulêre evolusie 'n TNA-string te produseer wat kan optree as 'n hoë-spesifisiteit, hoë affiniteitsbindende reseptor vir die menslike proteïen trombien.

Hulle het eers probeer aantoon dat TNA-nukleotiede deur komplementêre baseparing aan 'n ewekansige volgorde van DNA kan heg, wat 'n hibriede DNA-TNA-string vorm. ’n DNA-polimerase-ensiem het die proses bygestaan. Baie van die ewekansige volgordes het egter herhaalde gedeeltes van die guaniennukleotied bevat, wat die effek gehad het om die transkripsie van DNA na TNA te onderbreek. Sodra ewekansige DNA-biblioteke gebou is, uitgesluit guanine, is 'n hoë opbrengs van DNA-TNA-hibriede stringe geproduseer.

Die rye wat verkry is, was 70 nukleotiede lank, volgens Chaput lank genoeg, sodat hulle in vorms met gedefinieerde bindingsplekke kan vou. Die DNA-TNA-basters is daarna met die doelmolekule trombien geïnkubeer. Sekwensies wat met die teiken gebind is, is herwin en versterk deur middel van PCR. Die DNA-gedeelte is verwyder en gebruik as 'n templaat vir verdere amplifikasie, terwyl die TNA-molekules wat hoë-affiniteit, hoë spesifisiteit-bindingseienskappe vertoon, behoue ​​gebly het.

Daarbenewens is die bindingsaffiniteit van die geëvolueerde en geselekteerde TNA-molekules getoets teen twee ander algemene proteïene, waarvoor hulle geen affiniteit getoon het nie, wat die saak versterk dat 'n hoogs spesifieke bindingsmolekule voortgespruit het uit die groep se gerigte evolusieprosedure.

Chaput stel voor dat kwessies rakende die prebiotiese sintese van ribose-suikers en die nie-ensiematiese replikasie van RNA omvangelike bewys kan lewer van 'n vroeëre genetiese stelsel wat makliker onder primitiewe aardtoestande geproduseer kan word. Alhoewel dit 'n moeilike bewys is dat TNA as 'n RNA -voorloper in die prebiotiese wêreld opgetree het, dui Chaput op die aantrekkingskrag van hierdie molekule as 'n sterk kandidaat, wat inligting kan stoor, seleksieprosesse kan ondergaan en in tersiêre strukture kan invou wat komplekse kan verrig funksies. Hierdie resultaat bied die motivering om TNA as 'n vroeë genetiese stelsel te ondersoek.

Chaput is optimisties dat belangrike vrae oor die prebiotiese sintese van TNA, die rol daarvan in die ontstaan ​​en vroeë evolusie van lewe op aarde en die uiteindelike genetiese oorname deur RNA mettertyd beantwoord sal word.


RNA's: Versamel!

Sommige wetenskaplikes veronderstel dat lewe op aarde met 'n enkele molekule begin het: ribonukleïensuur, of RNA. Gemaak van kettings van fosfaat, suiker en nukleïensure, kon RNA-molekules in die oersop gevorm en opgelos het totdat 'n self-repliserende, immer-ontwikkelende RNA na vore gekom het, wat die basis vorm waarop die hele lewe gebou is.

Hierdie idee word die "RNA World" hipotese genoem - en hoewel dit 'n gedebatteerde onderwerp is, is dit onmiskenbaar dat RNA-molekules van die mees dinamiese en veelsydige molekules in lewende organismes vandag is. Hulle dien as die boodskappers wat die skepping van proteïene uit DNA-volgordes fasiliteer; hulle reguleer hoe lank ander molekules in selle kan bly, hulle kan reaksies tussen proteïene kataliseer, wat uiteenlopende akteurs bymekaar bring om 'n doel te bereik en belangriker, hulle kan saamspan met ander RNA's en proteïene om sellulêre prosesse te vergemaklik.

DNA, RNA se dubbelstring-neef, is hoofsaaklik belangrik vanweë die volgorde daarvan. RNA het ook 'n volgorde, maar een rede waarom hierdie klein molekules soveel verskillende funksies in die sel dien, is as gevolg van hul fisiese eienskappe. Trouens, wetenskaplikes weet van duisende RNA's wat nie vir proteïene kodeer nie (baie van hul doeleindes is nog onbekend).

"RNA's kan aan hulself bind om sekondêre strukture te maak, hulle kan aan ander RNA's bind om tersiêre strukture te maak, daar is soveel variasie in die interaksie met mekaar - en baie hiervan is nie volgorde -spesifiek nie," sê Ruth, direkteur van Whitehead Institute. Lehmann. 'Daarom stel sommige mense RNA's in die middel van die RNA -wêreld.'

In hierdie artikel sal ons verder as die volgorde waag om sommige van die chemiese en fisiese eienskappe van RNA te verken, en hoe daardie eienskappe hulle in staat stel om met ander RNA's te groepeer om die sel te help funksioneer - of siektes te veroorsaak.

Plakbandmolekules


Om te verstaan ​​hoe RNA in die sel groepeer, help dit om die basiese eienskappe van RNA -molekules te verstaan. Anders as DNA, wat uit twee verweefde stringe bestaan, is RNA 'n enkelstrengige molekule. Die ruggraat van die molekule bestaan ​​uit afwisselende suiker- en fosfaatgroepe, en die ander kant - die 'taai kant' - hou die nukleïensure adenien, guanien, sitosien en urasiel soos die tande van 'n kam.

Stel jou voor jy hou 'n lang stuk band vas. As u u hande bymekaar bring, trek onsigbare kragte die stuk band op homself en bind dit in draaie en lusse. Dit is omtrent wat gebeur met RNA-stringe in die sel, sê Whitehead Instituut-lid Ankur Jain. "Nukleïensure kan basispare vorm, A kan basispaar met U, G kan basispaar met C vorm," sê Jain. "Daar is baie, baie plekke waar 'n enkele RNA-molekule aan homself kan bind."

Hierdie selfbinding lei tot 'n RNA se 'sekondêre struktuur', wat nodig is vir sommige prosesse wat in die sel plaasvind. Alhoewel die vorming van hierdie strukture te wyte is aan die RNA se nukleotiedvolgorde, kry hulle 'n eie lewe sodra die struktuur gevorm is. Sommige RNA's, wat ribozyme genoem word, vou in bruikbare vorms wat help met chemiese reaksies in die sel.

As goeie RNA sleg gaan

Dieselfde eienskappe wat RNA perfek maak vir die skep van nuttige sekondêre strukture, kan soms 'n rol speel by siektes - veral as mutasies in die DNA tot talle herhalende rye lei. Ankur Jain bestudeer wat gebeur wanneer hierdie tipe mutasie, wat herhaalde uitbreiding genoem word, in die menslike liggaam voorkom.

Herhaalde uitbreidings kan gebeur deur DNA-replikasiefoute op verskeie kort herhalings wat die menslike genoom strooi. Hierdie vorm van mutasie maak die aangetaste gedeelte van DNA baie langer as voorheen. Dit lei weer tot baie lang RNA -molekules wanneer die DNA getranskribeer word.

Hierdie super-lang RNA's is taai, net soos gewone RNA's-behalwe met al die ekstra grootmaat, is dit maklik vir hulle om in die war te raak. "Dit is dieselfde fisiese beginsel waarvolgens hare of 'n lang slap stuk tou verstrengel raak, hier toegepas op 'n molekulêre vlak," sê Jain.

Hierdie verwarring kan op mekaar saamsmelt en skadelike, onomkeerbare aggregate vorm. "Hierdie aggregate van RNA kan sellulêre proteïene klonter," sê Jain. "Hulle tree op soos stukke spons en sekwestreer ander proteïene binne die sel."

Dit kan allerhande probleme in sellulêre funksies bydra - en wanneer RNA-aggregate in selle in die senuweestelsel voorkom, kan dit bydra tot siektes soos ALS, Huntington-siekte en Fragile X-sindroom. Jain en sy laboratorium ondersoek hoe hierdie aggregate 'n rol kan speel by siektes, en soek na maniere om dit in selle te ontwrig of op te los.

RNA's van 'n veer ...

Alhoewel hierdie onomkeerbare aggregate van RNA skadelik vir selle kan wees, is daar 'n ander soort groepering wat RNA's behels wat eintlik baie nodig is vir die sel om funksies soos transkripsie te voltooi. "Die ander kant van die RNA-selfassemblage is hierdie nie-membraangebonde liggame in die sel wat RNA- en RNA-bindende proteïene bevat," sê Jain.

Hierdie groeperings, genoem kondensate, is klein, membraanlose organelle wat vinnig en maklik kan vorm en oplos, anders as die skadelike aggregate wat Jain bestudeer. Kondensate bestaan ​​dikwels uit RNA's, proteïene wat RNA-bindende proteïene genoem word, en ander sellulêre komponente wat verskil na gelang van die funksie van die kondensaat. Wetenskaplikes het hierdie kondensate vergelyk met druppels olie in 'n glas water.

In die afgelope dekades het nuwe inligting oor kondensate die manier waarop ons selbiologie verstaan, gevorm. Baie studente het geleer van die binnekant van 'n sel as 'n sop, met al die nodige komponente vir sellulêre funksies wat gemeng en eweredig deur die sitoplasma versprei is. Nou erken wetenskaplikes dat die sel voortdurend kondensate skep en oplos om spesifieke funksies soos transkripsie, RNA-splyting of die skepping van ribosome te verrig.

Daar is verskeie laboratoriums by Whitehead Institute wat verskillende soorte kondensate ondersoek. In 2018 het die lid van Whitehead Institute Richard Young en sy laboratorium 'n nuwe soort druppel ontdek wat 'n transkripsionele kondensaat genoem word. Hierdie nuwe kondensate bring al die verskillende proteïene bymekaar wat nodig is om 'n geen suksesvol te transkribeer.

Twee jaar later, in 2020, het die Young -laboratorium iets interessants ontdek oor die effek van RNA op hierdie kondensate: RNA -molekules self - die produkte van transkripsie - is verantwoordelik vir die regulering van hul vorming deur middel van 'n terugvoerlus. Te min RNA-molekules, en die sel begin transkripsie om meer te skep. Te veel, en transkripsie staan ​​tot stilstand.

Hierdie gedrag was onafhanklik van die volgorde van die RNA-molekules, en was eerder afhanklik van nog een van hul eienskappe: hul lading. Terwyl die een kant van 'n RNA -molekule die nukleotiede bevat, bestaan ​​die ander kant uit 'n "ruggraat" van afwisselende suiker- en fosfaatmolekules. Baie RNA -interaksies is te danke aan hierdie deel van die molekule, wat 'n uiters negatiewe lading dra.

"Baie proteïene, teen die pH wat jy in biologie het, sal 'n netto positiewe lading hê," sê Young. “En as gevolg hiervan is hulle geneig om mekaar af te stoot. Maar as jy 'n ander polimeer soos RNA het wat net 'n string negatiewe ladings is, kan dit daardie afstoting neutraliseer, en dinge help om bymekaar te kom. Waar die RNA die netto positiewe lading van die proteïene balanseer, kry u die maksimum hoeveelheid kondensaatvorming. ”

Young vergelyk dit met die manier waarop weerlig in 'n storm ontstaan. Die onderkant van die stormwolk is vol negatiewe ladings, en die grond onder is meer positief - en om die lading te balanseer, sluit baie negatiewe ladings saam in 'n knetterende bout om positiewe ladings van die grond af te ontmoet.

Deur te dink aan RNA in terme van lading in plaas van volgorde, het Young en sy laboratorium laat wonder of sommige RNA's wat in die genoom gekodeer is wat nie vir proteïene kodeer nie, eerder 'n funksie kan hê om kondensate te beheer.

"Ons groot vraag op die oomblik is, wat is die funksie van die lang nie-koderende RNA's in selle?" Young sê. 'Navorsers het gedink dat baie nie 'n funksie het nie, maar wat ons ons nou voorstel, is dat hierdie RNA's die transkripsionele kondensate afstel op die plekke op die genoom waar dit getranskribeer word. Ons begin net daaraan werk. ”

Partner proteïene

Terwyl Young se laboratorium op transkripsionele kondensate fokus, bestudeer die direkteur van Whitehead Instituut, Ruth Lehmann, 'n ander tipe kondensaat, wat 'n kiemkorrel genoem word. Gemaak van verskeie RNA- en proteïenmolekules, word geglo dat hierdie korrels die translasie van boodskapper-RNA (mRNA)-molekules binne kiemselle reguleer - die selle wat eiers en spermselle veroorsaak - tydens ontwikkeling.

Lehmann het die eerste keer in kiemkorrels begin belangstel tydens haar nagraadse werk oor gene wat die patroonvorming van embrio's beïnvloed het.Sy het 'n paar proteïene in kiemselle opgemerk wat noodsaaklik was vir die behoorlike vorming van die embrio - en veral een wat belangrik blyk te wees om die een van die twee "pole" van die eier te skep (hierdie pole plaas die voorkant op die rug bloudruk vir die embrio om later te ontwikkel).

Nadat sy 'n paar eksperimente uitgevoer het, het sy besef dat hierdie proteïen, wat sy Oskar genoem het, 'n RNA -bindende proteïen was wat gedien het as die lewe van die kiemkorrelparty as Lehmann die Oskar -proteïen verander sodat dit aan die teenoorgestelde kant van die kiemsel versamel word, al die ander "partytjiegaste" - RNA's en proteïene wat noodsaaklik is vir kiemselfunksie - het gevolg.

Soos dit geblyk het, dien Oskar as die "saad"-proteïen vir die kiemkorrels deur 'n paar spesifieke RNA's en ander RNA-bindende proteïene te bind, wat op hul beurt meer proteïene bind en ander RNA's aantrek. Hierdie meganisme van kondensaatvorming toon 'n ander metode vir kondensaatvorming - een waarin RNA -lading steeds 'n rol speel, maar word ondersteun deur proteïene soos Oskar.

'Wat mooi is aan Ruth se kiemselsisteem, is dat die proteïene wat sy bestudeer het, help om 'n pool van die ontwikkelende embrio op te stel - en Oskar het 'n RNA -bindingsdomein wat 'n verskeidenheid RNA's op daardie plek sekwestreer en dit vorm 'n kondensaat deur die meganisme , ”Sê Young. "Daar is dus ten minste twee meganismes: een behels spesifieke RNA-bindende proteïene, en een behels die lading-gebalanseerde eienskappe van proteïene en RNA."

Transkripsiekondensate en kiemkorrels is nie die enigste kondensate wat in selle kan vorm nie. David Bartel, lid van die Whitehead Institute, bestudeer byvoorbeeld 'n ander soort kondensaat genaamd P -korrels. Navorsers ontdek nog steeds nuwe rolle vir RNA in die vorming van kondensate.

Whitehead Institute se eie "RNA World"

Die afgelope paar jaar het Whitehead Institute ietwat 'n RNA -hotspot geword. Van die werk van Whitehead -mede Silvi Rouskin oor sekondêre struktuur, tot die fokus van David Bartel op klein RNA's, genaamd mikroRNA's, stel navorsers by die Instituut vrae oor RNA en kondensaatbiologie vanuit 'n aantal hoeke aan.

"Daar is soveel sinergieë wat ons by Whitehead Institute kan gebruik," sê Ankur Jain. “Silvi se laboratorium bestudeer byvoorbeeld RNA-struktuur, en as ek op 'n ander plek was, sou dit vir my baie moeilik gewees het om haar tegnologie aan te neem om RNA-aggregate te bestudeer. Maar nou kan studente in my laboratorium net na haar laboratorium gaan en die truuks leer wat sy gebruik het om die struktuur daarvan in vivo te bestudeer. Dit is regtig stimulerend om aan die voorpunt te wees van RNA -navorsing. ”


Vir studente en onderwysers

Slegs vir onderwysers

BLYWENDE BEGRIP

Lewende sisteme is georganiseer in 'n hiërargie van strukturele vlakke wat interaksie het.

LEERDOELWIT

NOODSAAKLIKE KENNIS

Hidrolise en ontwateringsintese word gebruik om kovalente bindings tussen monomere te skei en te vorm.

UITSLUITINGSTATE

Die molekulêre struktuur van spesifieke nukleotiede en aminosure is buite die omvang van die AP -eksamen.

Die molekulêre struktuur van spesifieke koolhidraatpolimere is buite die bestek van die AP-eksamen.


Intrasellulêre RNA-opsporingsmetodes

Met RNA-opsporing kan navorsers RNA-molekules in selle en weefsels visualiseer en belangrike ruimtelike tydelike inligting verskaf oor RNA-dinamika en -funksie. Metodes soos fluoresserende in situ hibridisasie (FISH) en molekulêre bakens maak staat op komplementêre oligonukleotiede om endogene transkripsies te benoem en te sien. Ander metodes skep kunsmatige chimere transkripsies, tesame met bakteriofage-afgeleide jasproteïene (bv. MS2, λN) om molekules in lewende selle te merk. In ander benaderings word endogene RNA's herken deur komplementêre RNA's wat saamgestel is met nie -katalitiese Cas -proteïene. Elke tegniek het sy eie sterk punte en beperkings wat in ag geneem moet word by die beplanning van 'n eksperiment. Hier bespreek ons ​​die meganismes, voordele en swakpunte van in situ hibridisering, molekulêre bakens, MS2-etikettering en Cas-afgeleide stelsels, asook hoe RNA-opsporing gebruik kan word om verskillende aspekte van molekulêre biologie te bestudeer.

1. Inleiding

RNA -molekules speel 'n wye verskeidenheid rolle in die sel. Koderende RNA's (boodskapper (m) RNA's) dien as sjablone vir die translasie van proteïene, terwyl nie -koderende RNA's (insluitend mikroRNA's (miRNAs) en lang nie -koderende RNA's (lncRNAs)) gene -uitdrukkingsprogramme op baie vlakke reguleer [1,2]. RNA's beheer alle aspekte van selmetabolisme en het dus getoon dat dit noodsaaklike reguleerders van fisiologiese en siekteprosesse is [3,4].

Onlangse vordering in RNA -biotegnologie het navorsers in staat gestel om die transkripsie te ondervra in hul massas. Microarrays is vinnige en koste-effektiewe metodes om RNA-vlakke in verskillende populasies te kwantifiseer, en RNA-volgordebepaling (RNA-seq) kan die identiteit van die RNA's op die sel- of weefselvlakke [5–7] verder toelig. Immunopresipitasie (IP) van inheemse of verknoopte ribonukleoproteïen (RNP) komplekse (onderskeidelik RIP en CLIP) kan die teikens van 'n gegewe RNA-bindende proteïen verder identifiseer en insig gee in RNA-proteïeninteraksies [8]. Hierdie metodes het die RNA veld verander. Nie een van hierdie tegnieke verskaf egter inligting oor die ruimtelike of tydelike dinamika van die RNA in die sel nie, insluitend die ligging daarvan terwyl die RNA verwerk, vervoer, gestoor, vertaal of afgebreek word. Om hierdie parameters te bestudeer, moet navorsers op een of ander manier 'n RNA van belang benoem en dit met mikroskopie ontleed.

Vooruitgang in RNA-lokalisering op sub-sellulêre vlak het ons begrip van virale en neurodegeneratiewe siektes verbeter deur die karakterisering van RNA-gemedieerde patologiese meganismes. Byvoorbeeld, ontleding van die handel in hepatitis C-virus (HCV) RNA het aan die lig gebring dat gasheerselle die produksie van tipe-I-interferone verhoog deur virale RNA's in eksosome te verpak, wat dan na nabygeleë dendritiese selle vervoer word, wat die TLR-7-gemedieerde antivirale middel aktiveer. reaksie [9]. Ander studies het aan die lig gebring dat RNA -uitvoer uit die kern belemmer word deur die vorming van giftige proteïenaggregate [10], 'n waarneming wat byvoorbeeld relevant kan wees vir Alzheimer en Huntington se siektes, aangesien dit deur die ophoping van giftige proteïene [11] aangedryf word. .

RNA -lokalisering is ook belangrik vir die bepaling van selpolariteit en asimmetrie tydens ontwikkeling. Ontwikkelingspatrone word bereik deur mRNA -translasie na die een kant van die sel te beperk, en die onderskeie proteïenprodukte effektief in subcellulêre kompartemente te plaas. Dit is duidelik in Drosophila oosiete, waarin regulering van bioïed mRNA lokalisering vestig kop- en toraksgebiede in die eier [12]. Soortgelyke meganismes is ook geïdentifiseer in Xenopus en sebravisontwikkeling [13,14].

By volwasse soogdiere word 'n noemenswaardige voorbeeld van langafstand-mRNA-vervoer in neurone gevind in die vorm van boodskapper-ribonukleoproteïen (mRNP) korrels [15]. Hierdie mRNP -korrels word in 'translasie -hotspots' binne die neurone gestoor [16]. Neurale depolarisasie lei tot die mobilisering van bergingskorrels om aktief translerende polisome te vorm [17]. Die komplekse biologiese rolle van mRNP -komplekse is die afgelope 20 jaar bestudeer, wat belangrike skakels onthul het met neuronale oorlewing en funksie [15,18,19].

Om die lokalisering en vervoer van sellulêre RNA te bestudeer, is verskeie metodes van RNA -opsporing ontwikkel wat 'n rewolusie in die veld gemaak het. Hierdie oorsig beskryf spesifiek die gewildste onder hierdie tegnieke; ons bespreek metodologieë om endogene RNA's te merk deur fluorescerende oligomeermerkers (fluorescerende in situ hybridisatie (FISH)) of bakens, om individuele RNA's op te spoor deur chimere RNA's te maak wat drabare elemente bevat (bv. MS2, boxB, RNA aptamers), en om endogene RNA's te identifiseer deur 'n komplementêre RNA wat saamgestel is met nie -katalitiese Cas9/Cas13 (tabel 1). Ons bespreek ook hoe hierdie tegnologieë help om belangrike RNA -biologie toe te lig.

Tabel 1. Oorsig van RNA -opsporingstegnieke. RNA FISH gebruik antisense oligomere wat aan fluorofore gekonjugeer is om teikentranskripsies in vaste selle op te spoor. Molekulêre bakens is konseptueel soortgelyk, maar die byvoeging van 'n blusder verminder agtergrondgeraas van ongebonde probes, wat hul bruikbaarheid in lewendige sel-eksperimente verbeter. MS2-merking en soortgelyke aptamer-gebaseerde metodes behels die kloning van unieke volgordes (MS2-haarnaaldjies, RNA-aptamer-volgordes, ens.) in die 3'UTR van die transkripsie van belang hierdie volgorde word dan herken en gebind deur 'n fluoresserend gemerkte proteïen of ander molekule met behulp van lewendige of vaste selle. RNA -dop met Cas -proteïene gebruik katalities onaktiewe Cas -proteïene gemerk met 'n fluoresserende proteïen. Hierdie fluoresserende proteïene identifiseer teiken -RNA's gebaseer op sgRNA -doelwit, afhangende van die Cas -proteïen wat gebruik word, en addisionele oligomere genaamd PAMmers kan ook nodig wees.

2. RNA fluoresserend in situ hibridisasie (RNA FISH) en RNA bakens

In situ hibridisasie is 'n kragtige molekulêre biologie tegniek wat alomteenwoordig in die veld van nukleïensure navorsing was sedert sy debuut in die 1960's [20]. Antisense oligonukleotiede (ASO's) met outoradiografiese etikette soos 3H of 32P het navorsers toegelaat om DNA- of RNA-volgordes te teiken wat aanvullend tot die oligomeer was, wat die visualisering van hierdie volgordes binne vaste selle of weefsels moontlik maak [21]. Oor die jare het hierdie tegniek ontwikkel met die bekendstelling van nuwe metodes van opsporing, soos goue etikettering in samewerking met elektronmikroskopie of ensiem-gekoppelde chromogene verslaggewers [21].

2.1. RNA VIS

FISH is in 1980 deur die Van Duijin -laboratorium [22] bekendgestel, en is wyd aangeneem om die lokalisering van nukleïensuur tydens ontwikkeling, virale infeksie en ander sellulêre en molekulêre reaksies te bestudeer. Aanvanklik ontwikkel om genomiese DNA-streke te identifiseer wat spesifiek aanvullend tot sintetiese antisense-RNA-probes was (figuur 1a), FISH is gou aangepas om verskeie tipes RNA-molekules op te spoor [23-25]. 'n Sleutelvooruitgang in RNA FISH-tegnologie was die ontwikkeling van enkel-molekule FISH (smFISH), waar verskeie opeenvolgende fluoresserende probes die RNA hibridiseer op 'n 'teël' wyse, en die teenwoordigheid van veelvuldige probes die sein versterk (figuur 1)b) [26]. Hierdie tegniek is veral nuttig vir die opsporing van lae-kopie-transkripsies, aangesien die hoë aantal probes wat aan 'n transkripsie gebind is, 'n enkele RNA-molekule met veelvuldige fluorofore kan verlig.

Figuur 1. RNA VIS. (a) Kort oligomere word gesintetiseer met 'n teikenvolgorde wat antisense is vir die RNA van belang. Antisense oligomere (ASO's) word gekonjugeer met fluoresserende kleurstowwe wat opgewonde kan word met konfokale of fluoresserende mikroskopie. Tans word RNA FISH oligomere verskaf as 'n 'cocktail' van verskillende ASO's wat die teiken RNA kan teël. (b) ASO's hybridiseer met die teiken -RNA met die antisense -teikensekwensie. Deur die RNA van belang met ASO's te teël, word die sein versterk om opsporing van lae kopie of diffuse transkripsies in die sel te vergemaklik. (c) Voorbeeld van RNA VIS in HeLa -selle wat met konfokale mikroskopie afgebeeld is (ongepubliseerde beeld van die outeurs). GAPDH mRNA (liggroen), gemerk met Quasar 670 ASO's, word in die sitoplasma opgespoor. MALAT1 (rooi), gemerk met Quasar 570 ASO's, is gelokaliseer in kernspikkels.

Alhoewel RNA FISH RNA -molekules in selle kan opspoor, is dit ook 'n waardevolle hulpmiddel om die ruimtelike verspreiding en kopienommer van 'n teiken -RNA te kwantifiseer. RNA-seq en omgekeerde transkripsie (RT) gevolg deur intydse kwantitatiewe polimerase kettingreaksie (qPCR) toetse kan transkripsies direk in weefsels of enkele selle [6,27,28] kwantifiseer, maar dit gee gewoonlik nie inligting oor die lokalisering en uitdrukking nie van 'n spesifieke RNA in subsellulêre kompartemente soos die kern. Kwantifisering deur RNA FISH is dus uniek nuttig vir die bepaling van kopienommer en ligging. Vandag word RNA FISH beskou as een van die goue standaarde vir RNA lokalisering.

VIS word sedert die koms daarvan gebruik om sellulêre RNA -handel te bestudeer. VIS analise van individu β-aktien (ACTB) mRNA's het aan die lig gebring dat hul lokalisering in die voorste lamelle in fibroblaste bydra tot selmotiliteit [29]. Net so, β-aktien mRNA-vervoer via poskode-bindende proteïen 1 in neurale groeikegels reguleer die rigting van aksonale groei, soos gedemonstreer deur FISH tesame met immunokleuring [30]. Die bogenoemde eksperimente met die handel in HCV RNA [9] en kern -RNA uitvoer inhibisie [10] is ook uitgevoer met behulp van FISH.

RNA FISH kan vermenigvuldig word om verskillende transkripsies in dieselfde monster te identifiseer. Kosman en kollegas [31] het hierdie benadering gebruik om lokalisering van vyf unieke transkripsies op te spoor Drosophila embrio's. Die hoofbeperking van hierdie benadering is die aantal beskikbare mikroskoopfilters, aangesien die emissiespektrum van elke fluorofoor uniek is. Alhoewel FISH -metodes ideaal is vir in situ analise van vaste monsters, is hulle nie vatbaar vir visualisering van RNA in lewende selle nie. Die behoefte om die monsters vir ontleding reg te maak, maak dit onmoontlik om subsellulêre RNA-dinamika in reële tyd te bestudeer. Boonop kan die fiksering en voorbereiding van monsters met sterk chemikalieë soos paraformaldehied of soutsuur tot biochemiese veranderinge in die selle lei, selstrukture ontwrig of proteïene en organelle denatureer [32]. Om hierdie bekommernisse te verlig en die ontleding van lewende selle moontlik te maak, is molekulêre bakens, wat metodes soos FISH gebruik, ontwikkel om RNA in vaste en lewende selle te visualiseer.

2.2. RNA molekulêre bakens

Die basiese beginsel van molekulêre bakens is dieselfde as FISH: om fluorescerend gemerkte oligo's te gebruik wat komplementêre transkripsies van belang in die sel bind. Die belangrikste verskil lê in die koppeling van die fluorofoor aan 'n blusser [33]. Blussers is verbindings wat die energie wat deur die fluorofoor uitgestraal word absorbeer en dit as hitte in plaas van lig afvoer, wat die agtergrondsein van ongebonde probes dramaties verminder [33]. Die mees gebruikte vorm van molekulêre bakens is die stam-lus (figuur 2a) [34]. Die teikenvolgorde (15-20 nts) vorm 'n lus geflankeer deur 'n palindromiese volgorde aan elke kant, die 5'-punt word dikwels aan 'n fluorofoor gekonjugeer, terwyl die 3'-punt 'n blusmiddel aangeheg het [33]. As die baken nie aan 'n komplementêre teiken gebind is nie, vorm die palindromiese rye 'n haarnaaldstingel, wat die fluorofoor en die blusser naby genoeg bring sodat die blusser die fluorescentie kan onderdruk, maar as gevolg van die binding aan die doelvolgorde, kan die haarnaald en die aangehegte fluorofoor en afslukker apart, wat lei tot die vrystelling van fluoressensie (figuur 2b) [33]. Die afwesigheid van sein wanneer bakens ongebonde is, verminder geraas. Sodoende kan bakens in lewende selle ingebring word, sodat 'n mens hul onderskeie RNA -teikens in reële tyd kan waarneem. Aangesien RNA-teikens gebind word deur antisense fluorofoor-gemerkte oligomere, is multipleksing met molekulêre bakens moontlik [35]. Bakkies kan in selle ingebring word deur elektroporasie, mikro-inspuiting, toksien-gemedieerde membraanpermeabilisering, of selfs deur swaarmetaal bioballistiese gaspistole. Elke metode het sy spesifieke beperkings, maar gesamentlik maak dit RNA -visualisering moontlik in verskillende selmodelle [36,37].

Figuur 2. Molekulêre bakens. (a) Die mees algemene molekulêre bakenstruktuur is ’n stingellusstyl-sonde. Die stamlus-struktuur bring die fluoresserende kleurstof naby die blusmolekule. Hierdie blusmiddel absorbeer die energie wat deur die kleurstof vrygestel word en stel dit as hitte vry, wat fluoresserende agtergrondgeraas verminder. Die lus bevat die doelwitvolgorde wat met die RNA van belang sal hybridiseer. (b) Die haarnaald dissosieer wanneer die doelwitreeks met die teiken -RNA hybridiseer. Hierdie skeiding beweeg die fluoresserende kleurstof buite die omvang van die blusmiddel, wat die vrystelling van waarneembare fluoressensie moontlik maak.

2.3. RNA -omvang

Alhoewel RNA-visualisering algemeen gebruik word in basiese biomediese navorsing, word hierdie tegnieke nie wyd gebruik in diagnostiek nie, waar RT-qPCR-analise verkies word vir die opsporing van onkogene of virale transkripsies [38]. Soos hierbo beskryf, het PCR-gebaseerde benaderings egter nie ruimtelike resolusie nie, en hul sensitiwiteit kan deur heterogene weefselmonsters ontwrig word. RNAscope is ontwikkel om die diagnostiese vermoëns van RNA -opsporing te verbeter. Die tegniek verteenwoordig 'n verbetering op enkel-molekulêre FISH wat die opsporing van lae-kopie transkripsies in weefselmonsters fasiliteer [39]. Alhoewel dit ontwerp is vir RNA-opsporing in paraffien-ingebedde weefselmonsters, kan dit ook aangepas word vir basiese sel- en molekulêre navorsing.

In plaas daarvan om antisense-oligomere te gebruik wat direk aan 'n fluorofoor gekonjugeer is, versterk RNAscope fluoressensie deur eers 'n steier op die RNA van belang te monteer, waarvan die fondament bestaan ​​uit Z-vormige sondes (figuur 3). Hierdie sondes het 'n doelwitvolgorde van 18-25 nukleotiede wat aanvullend is tot die teiken. Aan hierdie sonde is 'n afstandhouer, wat gekoppel is aan 'n 14-nukleotied lang stert volgorde, aangeheg. Doelvolgordes is so ontwerp dat twee sondes op dieselfde manier direk aan mekaar hibried, die twee sterte vorm 'n deurlopende 28-nukleotiedhibridisasie-plek. Die gekoppelde sterte vorm 'n volgorde wat herken en gebind word deur die voorversterker, 'n ruggraatagtige struktuur wat 20 bindingsplekke bevat. Hierdie bindingsplekke is aanvullend tot versterkers, wat die steier heg en voltooi. Sodra die versterkers gebind is, kan tot 20 kleurstofmolekules elke versterker bind om 'n robuuste fluorescerende sein binne die sel of weefsel te lewer [39]. Aangesien baie algemene kleurstowwe, soos Alexa 488 of Alexa 647, versoenbaar is met RNAscope, kan beeldvorming op die meeste fluoresserende of konfokale mikroskope gedoen word.

Figuur 3. RNAscope sonde ontwerp. Twee Z-vormige probes bind aangrensende rye op die RNA van belang en vorm 'n platformagtige struktuur oor die stertvolgordes. Hier bind die voorversterker, en kan slegs bind wanneer twee Z probes gebind is. Versterkers bind die voorversterker en dien as stellasies om die fluoresserende sondes te bind. Elke stel Z-probes verskaf bindingsplekke vir honderde fluoresserende probes, wat fluoressensie op 'n enkele molekule dramaties versterk. Z -sondes kan langs 'n RNA -molekule geteël word om die opsporing verder te verbeter.

Z-sondes moet direk langs die teikentranskripsie bind om die RNAscope-steier volledig te monteer, wat die agtergrondfluoressensie verminder en die sein-ruisverhouding aansienlik verbeter. Boonop kan een stel Z -sondes tot 400 kleurstowwe bevat, en die ontwerp van veelvoudige Z -sondes om die RNA van belang te betrek, verhoog die vermoë om enkele RNA -molekules op te spoor, dramaties. By die opsporing van seldsame of geïsoleerde transkripsies in groot weefselafdelings, bied een stel RNAscope -probes 'n sterk sein vir opsporing daarteenoor, maar standaard RNA FISH vereis teëlwerk van oligomere, wat tientalle ontwerp van tientalle oligomeervolgordes vir 'n enkele teiken -RNA behels. Afhangende van die lengte van die RNA van belang, is dit moontlik nie eens moontlik nie, wat RNAscope 'n meer geskikte benadering maak.Die kort lengte van die Z-sonde-teikenvolgorde (twee rye van 18-25 bp) maak dit geskik vir die doelwit van miRNA's, en miskien ook sirkelvormige RNA's by splitsingsaansluitings. RNAscope kan tot vier onafhanklike teikens in 'n enkele monster [39] vermenigvuldig word, hoofsaaklik beperk deur die aantal beskikbare kleurstowwe. Hierdie tegniek is egter hoofsaaklik ontwerp vir gebruik in weefsel, en as sodanig is dit tans beperk vir gebruik in geparaffieniseerde monsters.

3. Bakteriofaag-afgeleide RNA-merkers

Die metodes wat tot dusver beskryf is, maak staat op komplementêre basisparing van oligomere met die teikentranskripsie. 'N Nadeel van hierdie benaderings is dat as die doelvolgorde nie beskikbaar is nie, hetsy omdat dit in 'n haarnaald ingebed is, gebind is aan 'n ander nukleïensuur, of geassosieer word met 'n RNA-bindende proteïen (RBP), kan hibridisering nie plaasvind nie [40]. Daarbenewens kan die oorvloed van endogene transkripsies laag wees, wat die sensitiwiteit van die benadering verder beperk. Om hierdie beperkings te oorkom, het navorsers etiketteringstelsels ontwikkel wat gebaseer is op die toevoeging van 'n bakteriofaag-afgeleide RNA-etiket om die dinamika van 'n individuele RNA in lewende selle te bestudeer. Eerstens gedemonstreer in gis [41], is die tegniek ontwikkel om RNA-mobilisering binne selle en interaksie met verskillende trans-werkende faktore, insluitend RBP's, miRNA's en lncRNA's [42,43].

3.1. MS2/MS2-BP en boks B/λN

Die MS2-etiketteringstelsel is gebaseer op die mantelproteïen van die MS2-bakteriofaag, wat 'n RNA-bindingsplek bevat met 'n hoë bindingsaffiniteit vir RNA-stamlusstrukture wat slegs in die bakteriofag RNA voorkom [44]. Bakteriofage gebruik gewoonlik hierdie mantelproteïen om die omhulsel van die virale RNA -genoom [45] te verseker. Aangesien hierdie haarnaaldstrukture nie in soogdier -RNA bestaan ​​nie, wissel die MS2 -proteïen nie met proteïene of RNA's wat deur die sel gesintetiseer word nie. Die bekendstelling van 'n plasmied wat 'n transkripsie van belang transkribeer wat veelvuldige MS2-haarnaaldjies dra (dikwels ingevoeg in die 3'-onvertaalde streek (UTR) van die chimeriese mRNA) stel die mantelproteïen egter in staat om hierdie eksogene transkripsies met hoë affiniteit en spesifisiteit te bind (figuur 4). ). Deur 'n fluoresserende proteïen soos GFP aan die MS2-mantelproteïen (generies MS2-XFP) te smelt, word die RNA in die sel maklik waargeneem [39]. Die sein kan versterk word deur addisionele haarnaaldjies by die 3'UTR in te sluit, waardeur die aantal MS2-bindingsplekke verhoog word. Die meeste konstrukte het 6 tot 24 MS2-haarnaaldjies vas, om 'n langer chimeriese RNA te vorm. 'N Soortgelyke stelsel is ontwikkel om 'n ander bakteriofag -draagbare tag, die boxB -volgorde, wat deur die bakteriofaagproteïen λN herken word, te benut. Etiketteringsmetodes is ontwikkel om 'n λN-XFP-samesmeltingsproteïen op te spoor wat in wisselwerking is met 'n boxB-motief wat in 'n chimere transkripsie van belang geplaas is [46], maar dit is die afgelope jare minder gereeld gebruik as die MS2-stelsel.

Figuur 4. MS2 RNA -etikettering. (a) MS2 -eksperimente vereis dat twee konstrukte gegenereer word. Een konstruk kodeer die RNA van belang (of 'n sekere streek, soos slegs die 3'UTR) met MS2 haarnaaldjies wat stroomaf gekodeer is. As dit getranskribeer word, vorm die MS2 -haarspelde in die 3' -einde van die transkripsie en word herken deur die MS2 -bindingsproteïene (BP's). MS2-BP's word uit die ander konstruk uitgedruk en bevat gewoonlik 'n fluoresserende proteïen soos GFP. (b) Na transfeksie word beide konstrukte getranskribeer en die MS2-BP's getranslateer. Die ektopiese afskrif van belang word opgespoor en gebind deur die fluoresserende MS2-BP's. Die aantal haarnaaldjies wat in die plasmied gekodeer is, sal die aantal MS2-BP-bindingsplekke bepaal wat meer haarnaaldjies kloneer, sal die sein versterk en opsporing verbeter. Aangesien ongebonde MS2-BP's steeds in die sel sal fluoresseer, is die bepaling van behoorlike plasmiedtransfeksieverhoudings noodsaaklik vir die maksimum sein-tot-geraasverhoudings.

Die MS2 -stelsel is gebruik om RNA -lokalisering in 'n menigte biologiese kontekste te bestudeer. Sheth en Parker [47] het dit gebruik om aan te toon dat gis -RNA -verval tussenprodukte in sitoplasmiese verwerkingsliggame (PB's) gelokaliseer is. Soortgelyke eksperimente is later gebruik om bewyse te verkry dat miRNA's en Argonaute mRNA -vertaling in soogdiere PB's onderdruk [48]. Leef Drosophila oösiete wat ektopies uitdruk nrs-MS2 en MS2-GFP is gebruik om die tydsberekening van mRNA-vervoer in die ontwikkeling van oosiete en die rol van die sitoskelet in transkripshandel [49] aan te toon. MS2-gemerk Pkp4 3'UTR-konstrukte is gebruik om die voorkeur-werwing van RNA's gevind in adenomatous polyposis coli-bevattende ribonukleoproteïen (APC-RNP) komplekse te demonstreer na korrels wat mutante vorms van die proteïen FUS bevat en gekoppel is aan amiotrofiese laterale sklerose [50,51] . Onlangse navorsing deur Morisaki en kollegas [52] het MS2-mRNA-merking gebruik as deel van 'n eksperiment om enkel-transkripsie-vertaling op te spoor in vivo. mRNA's is opgespoor met MS2, en die ontluikende FLAG-gemerkte polipeptiede is gemerk met fluorescent gemerkte anti-FLAG Fab-fragmente. Dit is belangrik dat nie die etikette of die fluoresserende proteïene die normale proteïen- of transkripsie -verspreiding ontwrig het nie.

In elk van hierdie studies is RNA -lokalisering relatief tot subcellulêre strukture gevolg deur die assosiasie daarvan met fluorescent gemerkte proteïene en/of immunokleuring van proteïenmerkers. Die MS2 -stelsel maak dit makliker om assosiasie van 'n RNA van belang met 'n endogene proteïen makliker te maak as FISH, aangesien fixasie dikwels nie nodig is nie.

3.2. Voordele en nadele van bakteriofag -etikette

MS2 -etikettering is die beste geskik om RNA in lewende selle op te spoor, 'n feitlik onmoontlike taak met FISH. 'N Belangrike voordeel van die MS2 -stelsel is dat die MS2 RNA -etiket in teorie nie 'n invloed op die natuurlike funksie van die endogene RNA het nie. As daarenteen 'n afskrif van belang opgespoor word deur geassosieerde (gemerkte) antisense -oligomere, is daar 'n kans dat die oligomere 'n RBP -bindingsplek kan bedek, wat normale prosesse soos handel of laai in 'n RNP -kompleks kan versteur. Omgekeerd, in lewende selle, kan antisense -oligomere direk inmeng met mRNA -translasie of ander RNA -funksies. Boonop kan antisense -oligomere wat in vaste selle herken dieselfde plek as 'n RBP in vaste selle gemasker word wanneer die RBP gebind word, en sodoende visualisering voorkom. Terwyl versigtige oligomeerontwerp sommige van hierdie inmenging kan vermy, kan onbekende interaksies tussen oligomere en RBP's verdere artefakte skep. Daarenteen, aangesien MS2-haarnaaldjies oor die algemeen by die distale einde van die 3'UTR gevoeg word, en die pelsproteïen hierdie haarnaaldherhalings uitsluitlik sal bind, is daar minder kommer om sellulêre prosesse per ongeluk tydens eksperimentering te onderbreek.

Ten spyte van hierdie voordele, is daar ook beperkings op hierdie tegniek. Terwyl kloning van ekstra haarnaaldherhalings opsporing kan verbeter, kan replikasie en transkripsie van lang reekse palindromiese DNA-herhalings onstabiel wees en lei tot gly in die DNA-polimerase, wat kan lei tot verlies of ekstra invoegings van hierdie haarnaaldjies [53]. Daarbenewens moet 'n mens 'n nuwe konstruk skep vir elke chimeriese transkripsie van belang, wat aparte kloningpogings vir elke konstruk vereis. Ongebonde MS2-XFP-molekules kan ook hoë vlakke van agtergrondgeraas veroorsaak. Om sein-ruisverhoudings te verbeter, moet selle 'n 'korrekte' hoeveelheid MS2-gemerkte RNA ontvang relatief tot MS2-XFP-plasmiede [54]. Die MS2-stelsel vereis transfeksie of elektroporasie van ten minste twee plasmiede (een wat die MS-mantelproteïen uitdruk, die ander die MS2-gemerkte RNA), en die optimalisering van transfeksie kan uitdagend wees. Laastens, aangesien MS2-XFP enige RNA met die MS2-haarnaaldstruktuur sal bind, kan twee verskillende MS2-RNA's wat in 'n enkele sel uitgedruk word, nie onderskei word nie, dus is die stelsel nie vatbaar vir multiplexing nie. As opsporing van veelvuldige RNA's vereis word, moet MS2-opsporingsmetodes gekombineer word met ander stelsels soos molekulêre bakens (hierbo), die boxB/λN-stelsel, of miskien 'n CRISPR/Cas-afgeleide metode (hieronder).

4. Cas-afgeleide stelsels en lewende-sel RNA-nasporing

CRISPR/Cas-gebaseerde tegnologieë is bekend vir hul enorme potensiaal in genoomredigering en genetiese ingenieurswese [55]. Die tegnologie is onlangs uitgebrei om fluoresserend gemerkte Cas-proteïene in te sluit om RNA in lewende selle te bind en op te spoor.

4.1. Cas9

Die Cas -proteïen wat die meeste bestudeer word, is Cas9 van Streptococcus pyogenes [56,57]. Onlangs het die Yeo-laboratorium getoon dat katalities onaktiewe Cas9 (dCas9) uitgebuit kan word om endogene mRNA's in die sitoplasma op te spoor tydens die samestelling van streskorrels, sitoplasmiese ribonukleoproteïenaggregate wat kortstondig vorm in reaksie op skadelike seine (figuur 5) [58,59] . Omdat katalities onaktief is, kan dCas9 nie die teiken -RNA skei nie, maar bly dit gebind, maar bind net nukleïensure wat 'n protospacer aangrensende motief (PAM) aanbied. Vir DNA moet die PAM op die nie-teikenstreng wees (hersien in [60]) aangesien soogdiere-RNA enkelstrengs is, het Yeo en kollegas [58] PAMmers ontwikkel, kort oligonukleotiede wat 'n volgorde bevat wat aanvullend is tot die teiken-RNA, effektief die nie-teiken-string te vervang. Op hierdie manier assosieer PAMmers met die dCas9-sgRNA-kompleks en bind aan die transkripsie van belang. Deur FISH as 'n kontrole te gebruik, is bewys dat dCas9 mRNA met 'n hoë spesifisiteit bind en sonder om die transkripsie, halfleeftyd of translasie daarvan te beïnvloed [58]. As dit nie aan sgRNA gebind is nie, is die fluoresserende dCas9-proteïene beperk tot die kern, as gevolg van dubbele kernlokalisasie seine (NLS's) by die C-terminus, wat sitoplasmiese sein verminder as dit nie aktief in gebruik is nie. Die dCas9-stelsel het minder geraas getoon as FISH en was effektief in die opsporing van endogene RNA-teikens in lewende selle [58].

Figuur 5. dCas RNA-opsporingsmetodes. (a) Twee plasmiede is nodig vir dCas -eksperimente. Een plasmied kodeer die katalities onaktiewe Cas-proteïen, met mutasies om enige nuklease-aktiwiteit te inhibeer. Cas word ook aangepas met twee kernlokalisasie seine en 'n fluorescentiedomein, soos GFP of mCherry. Die ander plasmied bevat die sgRNA -steier, en sal die sgRNA sintetiseer wanneer dit getranskribeer word. Die doelwitvolgorde word bepaal deur die volgorde van die sgRNA. As dCas9 van S. pyogenes gebruik word, moet 'n aparte oligomeer, 'n PAMmer, ook na die sel oorgedra word. Die PAMmer is nie nodig as u dLwaCas13a proteïen gebruik nie. (b) Struktuur van 'n volledig saamgestelde dCas9 -kompleks. Die teiken-RNA word geïdentifiseer deur die sgRNA-teikenvolgorde. dCas9 vereis dat 'n PAM-volgorde teenwoordig moet wees op die buite-teikenstring. Aangesien RNA enkelstring is, bind die PAMmer stroomaf om 'n PAM-volgorde te verskaf vir dCas9 om te herken en te bind. (c) Die NLS's verbeter die sein-ruis-verhouding deur ongebonde dCas-proteïene te sekwestreer. As dCas vry is, of slegs gebind is aan die sgRNA, word die proteïen in die kern gehou as gevolg van die dubbel-NLS tag. Slegs volledig saamgestelde komplekse, wat bestaan ​​uit dCas, die sgRNA, die teiken-RNA en die PAMmer (indien nodig), word na die sitoplasma uitgevoer. In beginsel is enige fluoressensie wat in die sitoplasma waargeneem word, ware sein.

Beperkings van hierdie metode sluit in die noodsaaklikheid om PAMmers te ontwikkel, wat die kompleksiteit van implementering van hierdie metode verhoog, wat die transfektasie van (i) 'n plasmied vereis wat dCas9 uitdruk (wat redelik groot is, 10–14 kbp), (ii) die sgRNA, en (iii) die PAMmer -oligomere (figuur 5a). Blootstelling van selle aan hierdie volume vreemde nukleïensure kan stresvol wees [61]. Meer ingewikkelde eksperimente, soos dié wat addisionele samesmeltingsproteïene benodig om kolokalisasie te bestudeer, staar verdere uitdagings in die gesig om optimalisering van DNA -hoeveelhede en verhoudings te handhaaf om aanvaarbare doeltreffendheid van transfeksie te behou terwyl sel homeostase behoue ​​bly. Aangesien daar onlangs oor hierdie RNA -opsporingstelsel gerapporteer is, is daar geen hulpbronne beskikbaar om sgRNA's of PAMmers te ontwerp wat op 'n spesifieke RNA gerig is nie, dus is die implementering daarvan traag. Dit kan moontlik wees om sommige van hierdie beperkings te oorkom deur die RNA-opsporingskomponente direk aan die sel te lewer as voorafgevormde dCas9-sgRNA RNP's. Die vooraf-samestelling van PAMmers-, sgRNA- en Cas-proteïene om die doelwit te vaartbelyn is reeds bewys vir genoomredigering, sodat dit ook maklik na dCas-sgRNA-komplekse kan vertaal [62].

4.2. Ander Cas proteïene

Nog 'n Cas-stelsel, Cas13a, geïsoleer van Leptotrichia wadei (LwaCas13a) [63], is onlangs voorgestel vir die opsporing van RNA in lewende selle. LwaCas13a is in staat om ssRNA te teiken, wat die behoefte aan PAMmers elimineer en sgRNA die enigste determinant vir RNA -doelwit maak. Fluorescerend gemerk, katalities onaktiewe LwaCas13a (dLwaCas13a-XFP) het endogene RNA's in lewende selle effektief opgespoor. Soos met die dCas9 -stelsel, het die dLwaCas13a -stelsel 'n NLS, wat die fluorescerende dCas13a -proteïen tot die kern beperk, tensy dit gebind is aan beide die sgRNA en die teiken -RNA, waarop dit na die sitoplasma [63] uitgevoer word. Hierdie tegniek blyk beter te wees as die dCas9 -stelsel, aangesien dLwaCas13a nie 'n PAMmer benodig nie en die kleiner 'transfeksielading' groter doeltreffendheid en meer komplekse eksperimentele ontwerpe moontlik maak. Aanlyn hulpbronne word ontwikkel vir data-analise [63]. Nie een van die metodes kan tans endogene opsporingsteikens vermenigvuldig nie, aangesien elke dCas9- of dCas13a-kompleks sgRNA's onoordeelkundig sal bind

Die gebruik van dLwaCas13a -tegniek het verskeie tekortkominge. Die eerste is dat verskeie sgRNA's getoets moet word om volgordeherkenning te optimaliseer. Met die katalities aktiewe LwaCas13a, het die gidsposisie 'n dramatiese impak op die vlak van afslaan gehad, en die verskuiwing van die gidsposisie 'n paar basisse het geen-afslag verminder [63]. Dit is moontlik dat hierdie beperking ook gesien kan word met die katalities onaktiewe variant, wat die spesifisiteit daarvan verminder. Boonop kan die binding van die sgRNA -Cas -kompleks aan die teikentranskripsie die RBP -binding ontwrig, indien die sgRNA -teikensekwensie oorvleuel met die RBP -bindingsplek.

'n Onlangse studie [64] het getoon dat Cas9 van S. aureus (SauCas9) kan ssRNA bind en skei, wat slegs die sgRNA benodig, nie 'n PAMmer nie. Terwyl die studie slegs die splitsingsvermoë van SauCas9 toon, sou 'n onaktiewe variant met 'n fluorescerende merker waarskynlik RNA in lewende selle kan bind en opspoor. In hierdie geval sou die gemerkte variant op dieselfde manier as die dLwaCas13a -stelsel funksioneer. Gegewe hoe goed gekenmerk Cas9-stelsels, kan dit moontlik 'n volgende robuuste metode word om RNA-opsporing van Cas te verkry.

5. Bykomende oorwegings

Ons het verskeie gewilde RNA-visualiseringsmetodes beskryf wat óf staatmaak op fluoresserende RNA's (FISH, molekulêre bakens, RNAscope) óf fluoresserende proteïene wat unieke RNA-merkers herken (MS2/λN en katalities onaktiewe Cas).

5.1. Verdere sterk punte en beperkings

Soos hierbo bespreek, gebruik FISH en molekulêre bakens fluorofoorgemerkte antisense-oligo's wat teiken-RNA's bind op grond van komplementêre rye [22,26]. Die gebruik van FISH is beperk tot vaste selle, terwyl molekulêre bakens hierdie beperking oorkom deur gekoppelde quenchers wat agtergrondgeraas verminder wanneer dit na lewende selle ontplooi word. Geen van die metodes kan egter in komplekse lewende organismes gebruik word nie, aangesien daar geen doeltreffende manier is om die probes in groot streke van lewende weefsel, soos die brein, in te voer nie, maar molekulêre bakens kan in lewende enkelsel-organismes gebruik word. As dit in vaste monsters gebruik word, is beide hibridiseringstegnieke van toepassing op selle en weefselmonsters, maar RNAscope word hoofsaaklik gebruik vir die opsporing van transkripsies in paraffien-ingebedde weefsels vir kliniese diagnostiek [39]. Aangesien beide tegnieke komplementêre reekse op teikentranskripsies bind, hang hul sukses af van die toeganklikheid van hierdie reekse as die teiken in strukturele motiewe soos haarnaaldjies versteek is, of deur 'n RBP bedek is, dan verloor beide tegnieke sensitiwiteit. Die gebruik van teël-oligomere kan opsporing verhoog, aangesien meer fluorofore met die transkripsie van belang kan inwerk. Aangesien die RNAscope-metode inherent die sein van 'n enkele sonde versterk sonder dat dit nodig is om teëls te maak, is hulle beter geskik vir die opsporing van seldsame of geïsoleerde transkripsies. FISH, RNAscope en molekulêre bakens is ook die enigste tegnieke wat hier bespreek word, wat veelvuldige RNA's (bekend as multiplex -opsporing) in 'n enkele toets kan opspoor as probes met verskillende fluorofore gemerk is.

RNA -etikettering met behulp van chimere fluorescerende RBP's maak staat op die toevoeging van RNA -rye in cis (bv. MS2, boxB) of trans (gRNA). Wanneer bakteriofaag-RNA's (MS2, boxB) gebruik word, word een plasmied wat die fluorescent gemerkte MS2- of λN-proteïene uitdruk en 'n ander plasmied wat die RNA van belang gemerk met MS2- of boxB-haarnaaldherhalings uitdruk, in selle ingebring. Die fluoresserende proteïene bind dan die RNA -etikette, wat die lokalisering van eksogene transkripsies in lewende selle moontlik maak. Aangesien hierdie toets nie afhanklik is van komplementêre oligomere nie, is daar minder risiko dat RNA-struktuur of bindingsproteïene die sensitiwiteit verminder en minder kommer oor agtergrond. Die sensitiwiteit vir 'n enkele transkripsie kan verhoog word deur addisionele MS2/boxB-merkers in die chimeriese RNA te kloneer, wat meer RBP-herkenningsplekke skep. Bakteriofaag-afgeleide RNA-nasporingsmetodes vereis transfeksie van twee plasmiede (die faag-gemerkte RNA en die merker-bindende proteïen), en transfeksieverhoudings moet geoptimaliseer word om 'n aanvaarbare sein : geraas verhouding te bereik. Die plasmiede word tipies ingevoer deur verbygaande transfeksie sonder stabiele inkorporering in die genoom, so hierdie metode is hoofsaaklik nuttig vir gekweekte selle en enkelsel organismes, soos gis. Na transfeksie en toetsuitvoering kan monsters ook vir statiese beelding reggemaak word.

Net so kan fluoresserende, nuklease-gebrekkige Cas-proteïene (bv. DCas9-GFP) deur sgRNA's gerig word om RNA's in lewende selle te rig in die teenwoordigheid van 'n addisionele oligomeer, 'n PAMmer [58,63]. 'N Variasie van hierdie metode sluit in die gebruik van fluorescerende dLwaCas13a, wat ook 'n sgRNA benodig, maar nie 'n PAMmer nodig het nie. Die NLS's in Cas -proteïene beperk ongebruikte Cas -proteïene tot die kern, en slegs volledig gevormde Cas -teikenkomplekse word na die sitoplasma uitgevoer, wat sitoplasmiese geraas verminder en sensitiwiteit verhoog. Of MS2-, λN- of Cas -proteïene die gekose gemerkte fluorescerende proteïene is, die behoefte aan plasmiedtransfeksies verhoog die kompleksiteit van die toets en kan die toets van addisionele komponente (bv. SiRNA's of addisionele plasmiede) in hierdie selle verhoed. Ander beperkings sluit in opsporing van veelvuldige teiken-RNA's op dieselfde tyd deur dieselfde benadering te gebruik, ontleding van selle wat nie getransfekteer kan word nie, en ontleding van RNA in argiefmonsters. Fluorescerende Cas-afgeleide stelsels staar baie van dieselfde beperkings in die gesig as die bakteriofaag-afgeleide metodes: die behoefte om veelvuldige plasmiede te transfekteer, die beperking van gebruik in lewende selle of enkelsel-organismes, en die beperking om enkeltranskripsies op te spoor. Dit vereis egter nie uitgebreide optimalisering van transfeksie nie, aangesien die dubbel-NLS-merkers op die fluoresserende Cas-proteïene hulle tot die kern sal beperk totdat die hele kompleks vorm.Hierdie funksie verminder die agtergrondsein in die sitoplasma en vergemaklik die opsporing van bona fide transkripsie seine [63,64].

5.2. Fluorescerende RNA aptamers

RNA -aptameerders is opvallend spesifieke RNA -strukture wat talle doelwitte [65] kan bind. Aptamere word gegenereer deur kunsmatige seleksie, 'n proses bekend as SELEX (sistematiese evolusie van ligande deur eksponensiële verryking), wat identifikasie van RNA's moontlik maak wat baie ligande bind, soos proteïene, ander RNA's, en selfs klein molekules soos fluorofore [66].

Hierdie aptamers word gekies deur rondtes van kunsmatige seleksie vir RNA's wat kleurstowwe bind, soos die sintetiese GFP wat DFHBI (Spinazie) of tiasooloranje (TO) -derivate naboots. Wanneer hierdie kleurstowwe nie aan aptamere gebind is nie, word opgewonde energie vrygestel deur molekulêre beweging, soos bindingsrotasie [67]. Die kleurstowwe kan egter nie beweeg as hulle aan die RNA -aptamer gebind is nie, dus moet hierdie energie vrygestel word deur ligemissie (figuur 6). Hierdie proses verminder inherent die agtergrondgeraas wat deur vrye kleurstowwe geproduseer word, wat een van die grootste uitdagings oorkom wat deur bakteriofage-afgeleide RNA-etiketteringstelsels opgelewer word. Sodra die aptamerreeks deur SELEX geïdentifiseer is, kan hierdie ry maklik in 'n plasmied gekloon word om die aptamer te produseer.

Figuur 6. Fluorescent RNA aptamers. (a) Struktuur van 'n RNA-aptameer. Na aanleiding van SELEX vir 'n aptamer wat die verlangde kleurstof bind, word hierdie volgorde in die 3'UTR van die transkripsie van belang gekloneer. (b) Die meeste kleurstofmolekules, soos DFHBI (Spinasie), fluoreer nie as dit nie aan die aptamer gebind is nie. Energie word vrygestel deur bindingsrotasie en ander molekulêre beweging. Wanneer die kleurstof deur die aptamer gebind word, word beweging beperk. Daarom moet energie as lig uitgestraal word, wat die sein-ruisverhouding en vertroue in molekulêre opsporing verbeter.

Toepassing van hierdie aptamers is merkwaardig buigsaam. Die aptamerreeks kan gekloneer word in die 3' -gebied van 'n RNA van belang, soortgelyk aan 'n MS2 -haarspeld, maar die volgorde is baie korter, gewoonlik in die reeks 20-80 nts [67]. Sodra dit gekloon is, kan hierdie gemerkte RNA's gebruik word in beide vaste- en lewende sel eksperimente. Vir vastesel-eksperimente druk getransfekteerde selle die plasmiede vir 'n paar uur tot dae uit, dan word hulle vasgemaak en gekleur met die kleurstof van keuse [68]. Hierdie monsters is ook nog steeds geskik vir immunofluorescerende kleuring, wat die RNA aptamerbenadering verenigbaar maak met die ontleding van RNA -proteïenkomplekse. Lewendige sel eksperimente behels transfeksie van RNA-aptamer transkripsies wat geproduseer is in vitro en vooraf geïnkubeer met kleurstof [68]. Na transfeksie van aptamer-kleurstof kan transkripsies opgespoor word in vivo met minimale agtergrondsein.

Ten spyte van die bekendstelling van fluorescerende Spinazie RNA aptamers in 2011 [69], was daar min gebruik van fluorescerende RNA aptamers in die RNA veld. Sitotoksisiteit veroorsaak deur malachietgroen aptamers en swak sein-ruisverhoudings van spinasie aptamers was beperkings op vroeë RNA aptamer tegnologie [67]. Onlangs het verbeterings op 'n bestaande RNA Mango aptamer egter die aptamerbenadering tot RNA -visualisering aantrekliker gemaak [68]. Hierdie RNA Mango aptamers bind TO-biotien, waar die TO kleurstof gekonjugeer word aan 'n biotienmolekule deur 'n poliëtileenglikolketting, met nanomolêre affiniteit. Die hoë affiniteit, gekombineer met die lae agtergrondgeraas van ongebonde kleurstowwe, maak die RNA Mango -stelsel effektief om RNA's van belang in vaste of lewende selle te lokaliseer. Behalwe beeldvorming, is RNA aptamers gebruik as fluorescerende biosensors, wat klein molekules soos ADP of kaliumione kan opspoor [70,71]. Aangesien TO gebiotinileer is, kan hierdie stelsel ook gebruik word om die RNA's en proteïene wat AAN bind [72] te suiwer. RNA Mango is redelik goedkoop, maar ondersoeke na verskeie RNA's van belang sal kloning van nuwe konstrukte vereis om die aptamerreeks aan die teiken -RNA 3'UTR bekend te stel. Hulpbronne vir RNA Mango aptamers is reeds beskikbaar, en gegewe die veelsydigheid daarvan, is dit waarskynlik dat hierdie tegnologie binnekort wydverspreid sal wees.

5.3. Fluoresserende in situ RNA volgorde

Terwyl RNA FISH insig in transkripsiehoeveelheid kan gee, word opsporing beperk deur die teikenvolgorde wat gekies is. Gevolglik kan antisense probes moontlik nie splitsvariante of transkripsies met enkelnukleotiedpolimorfismes (SNP's) opspoor nie. Onlangse werk van die Kerk-laboratorium het nuwe metodes vir fluoressering bekendgestel in situ volgordebepaling (FISSEQ) van RNA's in vaste selle en weefsels [73]. Monsters word op skyfies vasgemaak en die RNA word omgeskakel na cDNA via in situ omgekeerde transkripsie. Tydens sirkularisasie word amiene wat in die cDNA opgeneem is, gebruik om kruisverbinding te voorkom en diffusie te voorkom. Die cDNA word gesirkuleer en geamplifiseer deur rolsirkel amplifikasie kruisbinding van amiene produseer cDNA biblioteke in situ. Die cDNA word dan onderwerp aan opeenvolging deur middel van SOLiD-volgordebepaling, 'n volgorde-vir-ligasie-benadering (hersien in [74]).

Hierdie tegniek bewaar die sitoskelet en algehele monsterstruktuur, en dit kan biologies aktiewe RNA's opspoor, sodat navorsers funksionele verskille tussen seltipes of weefselstreke kan opspoor. Dit kan gebruik word in selle, formalien-gefixeerde weefsels, Drosophila embrio's en organoïede afkomstig van geïnduseerde pluripotente stamselle [73]. Die hele prosedure word uitgevoer op 'n konfokale, breëveld epifluorescerende of draaiende skyfmikroskoop, maar die volgorde kan 'n paar weke duur, en hierdie metode is moontlik nie beskikbaar vir navorsers wat kernmikroskoopfasiliteite gebruik nie. Die skrywers het aanvanklik ongeveer 200 mRNA -lesings per sel behaal, maar het optimalisering voorgestel wat hierdie opbrengs tot ongeveer 5000 lesings per sel kan verhoog, hoofsaaklik deur uitputting van endogene rRNA's [73]. Teen die tyd dat dit ontwikkel is, kon die tegniek tot 8102 gene opspoor, soos gesien in fibroblaste in 'n wondgenesingstoets [75] geen tegniek wat hier beskryf word, kan die lokalisering van hierdie vele transkripsies tegelyk bepaal nie. Die outeurs het aangedui dat FISSEQ moontlik nie transkripsies wat aan RBP's gebind is of in komplekse toegesluit is, akkuraat kan opspoor nie, waarskynlik omdat sulke komplekse tydens die voorbereiding van die monster herstel word.

5.4. Bestudeer RNA-lokalisering om RNA-funksie te verstaan

Gegewe hul funksionele diversiteit, het RNA -studies die belangrikste rol gespeel in sellulêre biologie. mRNA's kodeer proteïene wat nodig is vir sellulêre prosesse, terwyl nie-koderende RNA's strukturele en regulatoriese funksies kan verrig, soos chromatien-organisasie, ribosoom-samestelling en transkripsionele beheer, post-transkripsionele RNA-regulering en post-translasionele beheer van proteïenvlakke en funksie [76-78] ]. Die koms van nuwe metodes om die transkriptoom te bestudeer, veral RNA-seq, het RNA's ontbloot wat betrokke is by baie fisiologiese prosesse en patologieë [9,11,12,79,80]. Alhoewel ons uitgebreide inligting oor RNA-identiteit en oorvloed kan kry, het ons nie die ruimtelike-tydelike resolusie om te verstaan ​​hoe RNA-molekules interaksie het met sellulêre masjinerie en strukture nie. In hierdie verband kan die gebruik van RNA -opsporingstegnieke soos dié wat hier beskryf word, begin om hierdie kritieke vrae aan te spreek.

Een gebied wat baat by RNA -opsporing is die veld van ekstrasellulêre vesikels (EV's, insluitend eksosome en mikrovesikels) [81,82]. Daar word vermoed dat hierdie klein membraan-omhulde strukture 'n rol speel in die uitskakeling van sitoplasmiese komponente [83], maar is onlangs betrek by kankermetastase, aangebore immuniteit en aflewering van terapeutiese molekules [9,84,85]. Hulle bevat baie proteïene en nukleïensure, insluitend miRNAs (bv. let-7) en lncRNAs (MALAT1), [86,87], maar min is bekend oor hoe hul vrag gesorteer word, asook hoe voertuie in en uit selle verhandel word [88]. Nasporing van RNA's om hul reis van sintese tot verpakking gevolg deur afskeiding en uiteindelike aflewering aan ontvangerselle te volg, kan belangrike insig gee in die masjinerie en weë betrokke by EV-metabolisme.

5.5. RNA lokalisering in siekteprosesse

Dit is bekend dat RNA's van baie soorte (mRNA's, miRNA's en lncRNA's) 'n belangrike rol speel in kankers [79,80] en dat dit as prognostiese merkers gebruik is. Byvoorbeeld, die lncRNA's MALAT1 en WARM LUG is metastase -merkers by kanker soos long-, bors- en nasofaryngeale karsinoom [89–91]. Alhoewel dit moontlike doelwitte is vir terapeutiese ingryping by kanker, is hul spesifieke rol in maligniteite onbekend, en daarom is die ontwerp van klein molekules wat hul funksie sal versteur of herstel, uitdagend [92]. Dit is moeilik om in te gryp op moontlike onkogene teikens as die kankerveroorsakende funksie daarvan nie heeltemal bekend is nie [93,94]. Daarom is die begrip van die ruimtelike-tydelike rolle van hierdie RNA-molekules 'n belangrike stap in die rigting van die onderskeid tussen gesond en kankerselle. Geneeskundige skerms kan ook klein molekules blootstel wat die RNA's teiken en die funksie daarvan versteur, en dit kan dus voordelig wees om die funksie van hierdie transkripsies voor en na die behandeling waar te neem om die effek van die intervensie te verstaan.

5.6. Toekomstige aanwysings

Buiten biomediese toepassings is daar baie raaisels rondom RNA, veral nie-koderende RNA's. Die projek ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) het ten doel om alle funksionele streke in die menslike genoom te identifiseer en hul doel in die sel te karakteriseer [95]. Hierdie projek het aan die lig gebring dat ongeveer 75% van die menslike genoom getranskribeer word, terwyl slegs 1,22% van die genoom uit proteïenkoderende eksons bestaan ​​[95,96]. Benewens die uitdaging van die 'rommel -DNA' -hipotese wat al jare bestaan, het die groot hoeveelheid nie -kodende RNA's wat op 'n sekere punt in sommige weefsels getranskribeer is, gesuggereer dat baie van hierdie transkripsies 'n funksie het. Om die biologiese waarde van hierdie ongekarakteriseerde transkripsies te verstaan, sluit in die toeligting van die subsellulêre kompartemente waarin dit woon. Die lokalisering van 'n nie -koderende RNA in die kern, kan byvoorbeeld 'n rol in gene -organisasie, transkripsie en/of vroeë verwerking voorstel. Die lokalisering van 'n nie -koderende RNA in die sitoplasma kan 'n rol in die regulering van stabiliteit, translasie, berging en/of mobilisering van mRNA's of ander sitoplasmiese molekules voorstel. Verdere bewyse sal nodig wees om die impak van nie-koderende RNA's volledig te karakteriseer, maar om hul ruimtelike verspreiding te verstaan ​​is 'n onbevooroordeelde eerste stap om hul funksies toe te lig.

Ten spyte van belangrike vooruitgang in die veld, is daar egter steeds sekere beperkings op die toepassing van RNA-opsporingsmetodes. Die stelsels wat hier beskryf word, vereis in die algemeen 'n bekende RNA -ry, óf deur komplementêre nukleïensure te skep wat die transkripsie van belang soek, óf deur die ontwikkeling van vektore wat chimere (verwerkbare) weergawes van die RNA kodeer. Daarom is die meeste van die huidige opsporingstegnologieë nie voldoende om nuwe RNA's te ontdek nie en is dit beperk tot die bestudering van die funksie van bekende RNA's.

Daar word toenemend erken dat kodering en nie-kodering van RNA 'n deurslaggewende funksie speel in alle sellulêre prosesse, insluitend chromatienorganisasie, transkripsionele beheer, regulering van post-transkripsionele gebeure (mRNA-vervoer, stabiliteit, berging en translasie), en post-translasionele prosesse soos proteïenstabiliteit en multiproteïensamestelling. Saam met hierdie uitbreidende funksies word daar ook bewyse ophoop dat RNA-disregulering kan lei tot groot siektekategorieë, insluitend kanker, neurodegenerasie, kardiovaskulêre siekte en metaboliese sindroom. Namate ons vermoë om RNA's op te spoor verbeter, sal ons insig kry in hul werkingsmeganismes, ons funksionele begrip van RNA's uitbrei en die ontwikkeling van terapeutiese plekke moontlik maak.


Helikase en Polimerase

DNA -replikasie begin as 'n ensiem, DNA-helikase, breek die waterstofbindings wat die twee stringe bymekaar hou en vorm a replikasie vurk (sien Figuur ( PageIndex <6> ). Die gevolglike struktuur het twee vertakkende stringe DNA -ruggraat met blootgestelde basisse. Deur hierdie blootgestelde basisse kan die DNA deur 'n ander ensiem deur 'n ander ensiem gelei word, DNA polimerase, wat dan die komplementêre DNA -string bou. Namate DNA -helikase die dubbele heliks oopmaak, groei die replikasievurk.

Voorste en agterblywende stringe

Twee DNA -polimerase ensieme werk by 'n replikasie vurk. Hierdie ensiem kan slegs nuwe DNA bou in die 5 '& rarr 3' rigting. Dit benodig ook 'n onderlaag gebou deur primase om DNA te begin bou. Daarom is die twee nuwe stringe, die leading strand en die agterblywende strand, van DNA is & ldquobuilt & rdquo in teenoorgestelde rigtings. Die voorste string is die DNA -string wat DNA -polimerase konstrueer in die 5 '& rarr 3' rigting. Hierdie DNA -string word deurlopend gemaak en beweeg namate die replikasievurk groei. Die & quotlagging & rdquo -string word gesintetiseer in kort segmente, bekend as Okazaki-fragmente. Op die agterblywende strand, primase bou 'n kort RNA -onderlaag. DNA-polimerase kan dan die vrye 3'-OH-groep op die RNA-primer gebruik om DNA in die 5'- en rarr 3'-rigting te maak totdat dit bereik tot aan die einde van die sjabloonstreng. DNA-polimerase van die agterblywende string spring dan om verder in die replikasievurk te gaan om nog 'n Okazaki-fragment te maak. Die RNA -fragmente word dan afgebreek en nuwe DNA -nukleotiede word bygevoeg om die gapings te vul waar die RNA teenwoordig was. 'N Ander ensiem, DNA ligase, is dan in staat om die DNA -nukleotiede aan mekaar te heg (ligateer), wat die sintese van die sloerende string voltooi (Figuur ( PageIndex <6> )).

Figuur (PageIndex<6>): DNA-replikasie. Die twee DNS-stringe word deur helikase oopgemaak. Die drade word oop gehou deur 'n enkele string bindingsproteïene, wat voorkom dat voortydige herneting. Topoisomerase los die probleem op wat veroorsaak word deur die spanning wat veroorsaak word deur die winding/afwikkeling van DNA. Hierdie ensiem draai om DNA en maak 'n snit sodat die heliks kan draai en ontspan. Sodra DNA ontspan is, verbind topoisomerase gebroke stringe weer. DNA -primase sintetiseer 'n kort RNA -primer wat die Okazaki -fragment en die voorste string begin. DNA -polimerase sintetiseer die voorste streng en Okazaki -fragmente. Okazaki -fragmente word deur DNA -ligase geheg nadat die primers verwyder is.


'N Homodimer -koppelvlak sonder basispare in 'n RNA -nabootsing van rooi fluoresserende proteïene

Mielies, 'n 28-nukleotied RNA, verhoog die geel fluoressensie van sy verwante ligand 3,5-difluor-4-hidroksibensiliedene-imidasoolon-2-oksim (DFHO) met 400 gervoudig. Mielies is gekies in vitro om die beperkings van ander fluorogene RNA's te oorkom, veral vinnige fotoverbleking. Ons rapporteer nou die Koring-DFHO-ko-kristalstruktuur, en ontdek dat die funksionele spesie 'n kwasi-simmetriese homodimeer is. Die dimeer-koppelvlak, waarin ses ongepaarde adenosiene die algehele tweevoudige simmetrie breek, het ongewoon geen intermolekulêre basispare nie. Die homodimeer omhul een DFHO by sy interprotoom-koppelvlak, en sit dit met 'n G-kwadrupleks van elke protoom in. Mielies en die groen-fluoresserende Spinazie RNA is struktureel nie verwant nie. Hul konvergente gebruik van G-quadruplexes beklemtoon die bruikbaarheid van hierdie motief vir RNA-geïnduseerde kleinmolekule fluorescentie. Die asimmetriese dimeer -koppelvlak van Corn kan 'n basis bied vir die ontwikkeling van mutante wat slegs as heterodimere fluoreer. Sulke variante sal analoog wees aan Split GFP en kan nuttig wees vir die ontleding van RNA-mede-uitdrukking of assosiasie, of vir die ontwerp van self-samestellende RNA-nanostrukture.


Hoe word die aminosure korrek aan tRNA -molekules toegeken?

Die toewysing van die korrekte aminosuur aan elk van die vorme van tRNA is uiters belangrik vir die vertaalproses. Hierdie opdrag word uitgevoer deur twintig verskillende ensieme genaamd aminoacyl-tRNA sintetases (aaRS) vir die twintig aminosure wat in proteïene opgeneem is. Daar word vermoed dat daar 31 verskillende tRNA's is, maar hierdie 20 sintetases kan almal die regte aminosuur "laai".


CH 105 - Chemie en samelewing

DNA is die draer van genetiese inligting in organismes. Wat beteken dit? Groot molekules in die organisme kan baie funksies hê: hulle kan struktuur verskaf, as katalisator vir chemiese reaksies dien, dien om veranderinge in hul omgewing aan te voel (wat lei tot immuunrespons op vreemde indringers en neurale reaksies op stimuli soos lig, hitte, klank, aanraking, ens.) en gee beweeglikheid. DNA doen regtig niks van hierdie dinge nie. U kan dit eerder as 'n inligtingstoorstelsel beskou. Die inligting moet dekodeer word om die konstruksie van ander groot molekules moontlik te maak. Die ander molekules is gewoonlik proteïene, 'n ander klas groot polimere in die liggaam. Chromosome is in die kern van 'n sel geleë.

Chromosome is geleë in die kern van 'n sel. DNA moet gedupliseer word in 'n proses wat genoem word replikasie voordat 'n sel verdeel. Deur die replikasie van DNA kan elke dogtersel 'n volledige aanvulling van chromosome bevat.

Die werklike inligting in die DNA van chromosome word gedekodeer in 'n proses wat genoem word transkripsie deur die vorming van 'n ander nukleïensuur, ribonukleïensuur of RNA. Die RNA, wat deur die ensiem RNA-polimerase gemaak word, is komplementêr tot een string van die DNA. RNS verskil van DNA deurdat RNA 'n ribose, nie deoksiribose nie, suiker in die ruggraat bevat. Daarbenewens het RNA die basis T. Die gevormde RNA dien as 'n boodskapper, wat van die kern na die sitoplasma van die sel beweeg. In werklikheid word hierdie tipe RNA dikwels messenger RNA, mRNA, genoem. Aangesien die inligting in 'n nukleïensuur (DNS) in inligting in die vorm van 'n ander nukleïensuur (RNA) omgeskakel word, word hierdie proses transkripsie genoem (aangesien die taal steeds dieselfde is, soos wanneer jy 'n geskrewe toespraak in Engels transkribeer na Engels geskryf).

Die inligting van die DNA, nou in die vorm van 'n lineêre RNA-volgorde, word gedekodeer in 'n proses wat genoem word vertaling, om 'n proteïen te vorm, 'n ander biologiese polimeer. Die monomeer in 'n proteïen word 'n aminosuur genoem, 'n heeltemal ander soort molekule as 'n nukleotied. Daar is twintig verskillende aminosure wat natuurlik voorkom en wat verskil in een van die 4 groepe wat aan die sentrale koolstof gekoppel is. In 'n aminosuur het die sentrale (alfa) koolstof 'n amiengroep (RNH2), 'n karboksielsuurgroep (RCO2H), en H, en 'n R -groep wat daaraan geheg is. Aangesien die inligting in 'n nukleïensuur (RNA) omgeskakel word in inligting in die vorm van 'n ander molekule, 'n proteïen, word hierdie proses genoem vertaling (aangesien die taal van nukleïensure na dié van proteïene verander word, soos wanneer jy Engels in Chinees vertaal).

In teenstelling met die komplementariteit van DNA en RNA (1 basis in RNA komplementêr tot 1 basis in DNA), is daar nie 'n 1:1 ooreenkoms tussen 'n basis (deel van die monomeriese eenheid van RNA) in RNA met die monomeer in 'n proteïen . Na baie werk is ontdek dat 'n aangrensende lineêre volgorde van 3 nukleotiede in RNA deur die molekulêre masjinerie van die sitoplasma gedekodeer word, met die gevolg dat 1 aminosuur by die groeiende proteïen gevoeg word. Daarom bevat 'n drieling nukleotiede in DNA en RNA die inligting vir 1 aminosuur in 'n proteïen.Dat daar nie 'n 1:1 ooreenkoms tussen nukleotiede in nukleïensure en aminosure in proteïene was nie, was lank gelede duidelik aangesien daar net 4 verskillende DNA-monomere (met A, T, G en C) en 4 verskillende RNA-monomere (met A) is , U, G en C), maar daar is 20 verskillende aminosuurmonomere wat proteïene saamstel.

Nou blyk dit dat nie al die inligting in die DNA-volgorde van 'n organisme vir 'n proteïen kodeer nie. Trouens, net sowat 2% van die 3 biljoen basispare blyk getranskribeer te word in RNA wat in proteïen vertaal kan word. Die funksie van die res van die DNA is tans onseker. Hoe weet die molekulêre masjinerie van die sel watter deel van die DNA vir proteïene kodeer? Dit blyk dat daar unieke DNA -rye aan die begin en einde van die deel van die DNA -ry is wat vir 'n proteïen kodeer. Gaan voort met die DNA van 'n chromosoom en skielik kom jy by daardie seine, wat deur die selle-masjinerie herken word. 'N Komplementêre RNA word uit daardie gedeelte gemaak, en die komplementêre RNA word dan in 'n enkele proteïen gedekodeer. Gaan verder in die DNA -volgorde en 'n ander so 'n koderingsreeks word gevind, wat na 'n mRNA getranskribeer kan word, wat dan in 'n ander unieke proteïen vertaal kan word. In totaal is daar ongeveer 30 000 sulke dele van DNA in al die chromosome wat die inligting vir 30 000 unieke proteïene kodeer. Hierdie unieke koderingsgedeeltes van DNA wat uiteindelik oorgeskryf word in unieke mRNA wat in unieke proteïene vertaal word, word genoem gene. Vir ons doeleindes kom ons tot die gevolgtrekking dat een geen die inligting vir een proteïen het. Elkeen van die proteïene verskil van mekaar in beide lengtes en in die spesifieke volgorde van aminosure in die proteïen. Die DNA is inderdaad die bloudruk van die sel. Wat die werklike eienskappe van die selle bepaal, is die werklike proteïene wat deur die sel gemaak word.

Nie net moet DNS in DNS getranskribeer word nie, maar die genetiese inligting in die DNS moet gerepliseer word voordat 'n gegewe sel verdeel, sodat die dogterselle albei dieselfde genetiese inligting bevat. In replikasie skei die dsDNA, en 'n ensiem, DNA-polimerase, maak komplimentêre kopieë van elke string. Die twee resulterende dsDNA -stringe skei tydens die verdeling van verskillende dogterselle. Die proses waar DNS gerepliseer word wanneer selle verdeel, en getranskribeer word in RNA wat in proteïen vertaal word, word die Sentrale Dogma van Biologie genoem. (ignoreer tRNA, rRNA en snRNA in die voorafgaande webskakel)

Soos hierbo genoem, word elke aminosuur gespesifiseer deur 'n bepaalde kombinasie van drie nukleotiede in RNA. Die drie basisse word 'n kodon genoem. Die Genetiese Kode bestaan ​​uit 'n grafiek wat wys watter drieling-RNA-volgorde of kodon in mRNA vir watter van die 20 aminosure kodes. Een van die kodone kodeer vir geen aminosure nie en dien om die sintese van die proteïen uit die mRNA -volgorde te stop. Die genetiese kode word hieronder getoon:

Bepaling van die proteïenvolgorde uit 'n DNA -volgorde.

Vir 'n gegewe geen dien slegs een string van die DNA as die sjabloon vir transkripsie. 'n Voorbeeld word hieronder getoon. Die onderste (blou) string in hierdie voorbeeld is die sjabloon strand, wat ook die genoem word minus (-) strand, of die sin strand. Dit is hierdie string wat dien as 'n templaat vir die mRNA-sintese. Die ensiem RNA -polimerase sintetiseer 'n mRNA in die 5 'tot 3' -rigting wat komplementeer tot hierdie sjabloonstreng. Die teenoorgestelde DNA-string (rooi) word die genoem c oding strand, die nie-sjabloon strand, die plus (+) strand, of die antisense strand.

Die maklikste manier om die ooreenstemmende te vind mRNA volgorde (getoon in groen hieronder) is om die c oding, nie bepeins nie, plus (+) , of antisense string direk in die 5 'tot 3' -rigting deur U te vervang deur T. Vind die drieling in die kodingstreng, verander enige T's na U's, en lees uit die genetiese kode die ooreenstemmende aminosuur wat in die groeiende proteïen opgeneem sou word. (Die onderstaande stringe word in drielinge geskei om die visualisering makliker te maak.) 'N Voorbeeld word hieronder getoon.

EINDE BASIS OORSIG SENTRALE DOGMA VAN BIOLOGIE

In teenstelling met die lineêre polimere van DNA en RNA, vou proteïene (lineêre polimere van aminosure) in 3D -ruimte om strukture van unieke vorms te vorm. Elke unieke proteïenvolgorde (van 'n gegewe lengte en volgorde van aminosure) vou tot 'n unieke 3D -vorm. Daarom is daar ongeveer 30 000 proteïene van verskillende vorms by mense. Proteïene het nie net unieke vorms nie, maar het ook unieke hoekies en sakke wat hulle in staat stel om ander molekules te bind. Binding van ander molekules aan proteïene of DNA begin of beëindig die funksie van die proteïen of nukleïen, baie soos 'n aan/af-skakelaar. Die onderstaande voorbeeld toon verskillende proteïenstrukture, waarvan sommige klein molekules of groot molekules (soos DNA) daaraan gebind het. Sommige algemene motiewe word in die 3D -struktuur van die proteïen aangetref. Dit bevat alfa helices en beta sheets. Dit word bymekaar gehou deur H-bindings tussen die effens positiewe H op die N in die proteïen ruggraat en 'n effens negatiewe O verder weg op die proteïen ruggraat. In die Chime-modelle hieronder, gebruik die muiskontroles om die molekule te draai. (Verskuif L-muisklik sal ook die grootte van die molekule verander). Klik op die opdrag in die regterkantste raam om die weergawe van die proteïene te verander. Die spotprentaansig laat 'n eenvoudige manier toe om die algehele struktuur van die hoofketting te interpreteer.

As die DNA -volgorde in 'n koderingsgebied verander word, sal die gevolglike mRNA ook verander word, wat sal lei tot veranderinge in die proteïenvolgorde. Hierdie veranderinge mag dalk geen effek hê nie en sal stil wees as die verandering in die proteïen nie die vou van die proteïen of die binding daarvan aan 'n ander belangrike molekule beïnvloed nie. As die veranderinge egter óf die vou- óf die bindingsgebied beïnvloed, kan die proteïen dalk nie sy gewone funksie verrig nie. Mutasies wat nie -polêre aminosure vervang met polêre/gelaaide aminosure (of omgekeerd), het die grootste kans om beduidende veranderinge in struktuur en/of aktiwiteit te veroorsaak.

As die funksie die seldeling onderbreek, kan die gevolg wees dat die sel kankeragtig word. Net so, as die normale proteïen 'n rol speel om die sel te laat sterf na die beoogde lewensduur, sterf die sel met die mutante proteïen moontlik nie en word dit waarskynlik 'n gewas. Die teenoorgestelde scenario's kan gebeur, wat lei tot 'n voortydige dood van die sel.

  • Puntmutasies: Van ongeluk en nukleotied -analoë
  • Puntmutasies: Uit chemiese mutageen
  • Groot mutasies: Skrapings, invoegings, duplikasies en inversies

Kyk na die model van sekelselhemoglobien hieronder, wat wys hoe 'n enkele basispaarverandering in die DNA een aminosuur in 'n proteïen kan verander met dodelike gevolge.

Gene en siektes

Aktivering en onderdrukking van geentranskripsie:

  1. Hoe kan geenuitdrukking onderdruk word in die afwesigheid van kwik?
  2. Hoe kan geenuitdrukking geaktiveer word in die teenwoordigheid van kwik

Een van die sentrale vrae van die moderne biologie is wat gene -uitdrukking beheer. Soos ons voorheen beskryf het, moet gene op die regte tyd, in die regte sel, "aangeskakel" word. Tot 'n eerste benadering bevat al die selle in 'n organisme dieselfde DNA (met die uitsondering van kiemselle en immuunselle). Seltipe word bepaal deur watter gene op 'n gegewe tydstip uitgedruk word. Net so kan sel verander ( onderskei ) in verskillende tipes selle in deur die uitdrukking van gene te verander. Die sentrale dogma van biologie beskryf hoe gene eers na RNA getranskribeer word, en dan word die mRNA in 'n ooreenstemmende proteïenvolgorde vertaal. Proteïene kan dan post-translasioneel aangepas word, gelokaliseer word na sekere plekke binne die selle en uiteindelik afgebreek word. As funksionele proteïene as die eindproduk van geenuitdrukking beskou word, kan die beheer van geenuitdrukking teoreties op enige van hierdie stappe in die proses plaasvind.

Meestal word geenuitdrukking egter op die vlak van transkripsie beheer. Dit maak baie biologiese sin, aangesien dit minder energiek verkwistend sou wees om die uiteindelike uitdrukking van 'n funksionele proteïen in 'n stadium vroeg in die proses te veroorsaak of te belemmer. Hoe kan geenuitdrukking op transkripsionele vlak gereguleer word? Baie voorbeelde is gedokumenteer. Die hoofbeheer word tipies uitgeoefen op die vlak van RNA -polimerase bindend net stroomop (5') van 'n terrein vir transkripsie-inisiasie. Ander faktore, wat transkripsiefaktore genoem word (wat gewoonlik proteïene is), bind aan dieselfde streek en bevorder die binding van RNA polimerase op die bindingsplek, die promotor. Proteïene kan ook bind aan DNA -plekke (operateur in prokariote) en die samestelling van die transkripsiekompleks en dus transkripsie belemmer. Regulering van geen transkripsie word dan 'n kwessie van bindend die toepaslike transkripsie faktore en RNA -polimerase na die toepaslike gebied by die beginplek vir geen transkripsie. Regulering van geenuitdrukking deur proteïene kan óf positief óf negatief wees. Regulering in prokariote is gewoonlik negatief, terwyl dit positief is in eukariote.

Die meeste eukariotiese gene het ongeveer 5 regulatoriese plekke vir binding van transkripsiefaktore en RNA-polimerase. Voorbeelde van hierdie transkripsiefaktore word in die onderstaande figuur getoon.

STRUKTURELE KENMERKE VAN SPESIFIEKE DNA -BINNENDE WEEFWERKE

Aangesien RNA -polimerase op die promotorplek van alle gene moet wissel, kan u verwag dat alle gene 'n soortgelyke nukleotiedvolgorde in die promotorstreek het. Dit blyk dat dit geld vir beide prokariotiese (soos bakterieë) en eukariotiese gene. U sou egter verwag dat alle transkripsiefaktore nie identiese DNA -bindingsreekse sou hê nie. Die rye van DNA net stroomop van die beginplek van die geen wat proteïen bind (RNA -polimerase, transkripsiefaktore, ens.) promotors. Die tabel hieronder toon die algemene DNS-volgordemotief wat die Pribnow of TATA boks gevind by ongeveer -10 basispare stroomop van die beginplek, en nog een by -35. Proteïene bind aan hierdie plekke en vergemaklik die binding van RNA -polimerase, wat lei tot geen transkripton.

Prokarioties Promotor -rye

Boonop word in eukariote -promotors sekwense verder stroomop genoem reaksie -elemente bind spesifieke proteïene (soos CREB of sikliese AMP respons element bindende proteïen) om geen transkripsie verder te beheer.

Eukariotiese reaksie -elemente (RE) s

Proteïene kan spesifiek met DNA reageer deur elektrostatiese, H-binding en hidrofobiese interaksies. AT- en GC-basispare het beskikbare H-bindingskenkers en -aannemers wat in die hoof- en kleingroef van die ds DNA-heliks blootgestel word, wat spesifieke proteïen-DNA-interaksies moontlik maak.

Jmol: Eenvoudige DNA -tutoriaal (sien laaste keuseknoppies om donateurs en aanvaarers van H -bindings in die groot bos te sien.

STRUKTURELE KENMERKE VAN DNS-BINDENDE PROTEÏEN

  • helix-draai-heliks : gevind in prokariotiese DNA-bindende proteïene. Die figure toon twee sulke proteïene, die cro -repressor vorm bakteriofaag 434 en die lambda -repressor van die bakteriofaag lambda. (Bakteriofage is virusse wat bacteia besmet.) Let op hoe spesifisiteit gedeeltelik bereik word deur die vorming van spesifieke H-bindings tussen die proteïen en die hoofbos van die DNA van die operateur.
  • Lambda Repressor/DNA -kompleks
  • H Bindingsinteraksies tussen l repressor en DNA
  • sinkvinger : (eukariote) Hierdie proteïene het 'n gemeenskaplike volgorde -motief van
    X3- Cys -X2-4- Cys -X12- Syne -X3-4- Syne -X4- waarin X enige aminosuur is. Zn 2+ is tetraëdries gekoördineer met die Cys- en His-sykettings, wat onderskeidelik op een van twee antiparallelle beta-stringe en 'n alfa-heliks is. Die sinkvinger, gestabiliseer deur die sink, bind aan die belangrikste groef van DNA.
  • steroïedhormoonreseptore : (eukariote) In teenstelling met die meeste hormone, wat aan die seloppervlakreseptore bind, gaan steroïedhormone (derivate van cholesterol) deur die selmembraan en bind dit aan sitoplasmiese reseptore deur 'n hormoonbindingsdomein. Dit verander die vorm van die reseptor wat dan deur 'n DNA-bindende domein aan 'n spesifieke plek op die DNA (hormoonresponselement) bind. In 'n struktuur analoog aan die sinkvinger, is Zn 2+ tetraëdries gekoördineer tot 4 Cys, in 'n bolvormige struktuur wat as 'n dimeer aan twee identiese, maar omgekeerde volgordes van DNS (palindroom) binne die hoofbos bind. ('N Voorbeeld van 'n palindroom: ek kon Elba sien.)
  • leucine ritsen : (eukariote) Hierdie proteïene bevat stukke van 35 aminosure waarin Leu herhaaldelik aangetref word met tussenposes van 7 aminosure. Hierdie streke van die proteïen vorm amfifiele helices, met Leu op een gesig. Twee van hierdie proteïene kan 'n dimeer vorm, gestabiliseer deur die binding van hierdie amfifiele helices aan mekaar, wat 'n opgerolde spoel vorm, net soos in die spierproteïen myosien. Daarom verteenwoordig die leucine rits die proteïenbindingsdomein van die proteïen. Die DNS-bindingsdomein word gevind in die eerste 30 N-terminale aminosure, wat basies is en 'n alfa-heliks vorm wanneer die proteïen aan DNS bind. Die leucine-ritssluiter funksioneer dan om twee DNA-bindende proteïene bymekaar te bring, wat die N-terminale basishelikse in staat stel om op 'n basisspesifieke wyse met die hoofgroep DNA in wisselwerking te tree.

FOSFORILERING EN BEHEER VAN GENE -UITDRUKKING

'n Algemene manier om geenuitdrukking te beheer is deur die fosforilering van transkripsiefaktore deur ATP te beheer. Hierdie wysiging kan die transkripsiefaktor aktiveer of inhibeer om geenuitdrukking aan te skakel. Die bygevoegde fosfaatgroepe kan nodig wees vir direkte bindingsinteraksies wat lei tot geen transkripsie, of dit kan lei tot 'n konformasionele verandering in die transkripsiefaktor, wat geen transkripsie kan aktiveer of belemmer. 'n Onlangse voorbeeld van hierdie latere geval is die beheer van die aktiwiteit van die transkripsiefaktor p53. p53 het baie aktiwiteite in die sel, 'n primêre een as 'n onderdrukker van tumorselgroei. As 'n sel spanning ondervind wat genetiese skade tot gevolg het ('n bewys wat 'n sel kan laat omskep in 'n gewassel), word hierdie proteïen 'n aktiewe transkripsiefaktor, wat lei tot die uitdrukking van baie gene, insluitend diegene wat betrokke is by geprogrammeerde sel dood en sel siklus regulering. Beide hierdie effekte kan selproliferasie duidelik belemmer. Daarom is p53 'n tumoronderdrukker geen. p53 word gewoonlik gebind aan die proteïen HDM2 wat die aktiwiteit daarvan reguleer deurdat dit tot agteruitgang kan lei. Stres seine lei tot die aktivering van proteïenkinases in die sel (soos p38, JNK en cdc2), wat fosforilering van serien- en threnien-aminosure in p53 (Ser 33 en 315 en Thr 81) veroorsaak. Dit lei tot die binding van die proteni Pin 1, wat die vorm van p53 verander en lei tot die aktivering daarvan as 'n transkripsiefaktor.