Inligting

35.2E: Sinaptiese Plastisiteit - Biologie

35.2E: Sinaptiese Plastisiteit - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

LEERDOELWITTE

  • Onderskei tussen langtermynpotensiëring en langtermyndepressie

Sinaptiese plastisiteit is die versterking of verswakking van sinapse oor tyd as reaksie op toenames of afname in hul aktiwiteit. Plastiese verandering is ook die gevolg van die verandering in die aantal reseptore wat op 'n sinaps geleë is. Sinaptiese plastisiteit is die basis van leer en geheue, wat 'n buigsame, funksionele senuweestelsel moontlik maak. Sinaptiese plastisiteit kan korttermyn (sinaptiese verbetering of sinaptiese depressie) of langtermyn wees. Veral twee prosesse, langtermyn potensiasie (LTP) en langtermyn depressie (LTD), is belangrike vorme van sinaptiese plastisiteit wat in sinapse in die hippokampus voorkom: 'n breinstreek wat betrokke is by die berging van herinneringe.

Korttermyn sinaptiese verbetering en depressie

Sinaptiese plastisiteit op kort termyn werk op 'n tydsbestek van tien millisekondes tot 'n paar minute. Korttermyn-sinaptiese verbetering is die gevolg van meer sinaptiese terminale wat senders vrystel in reaksie op presinaptiese aksiepotensiaal. Sinapse sal vir 'n kort tydjie versterk as gevolg van 'n toename in grootte van die onmiddellik losbare poel verpakte sender, of 'n toename in die hoeveelheid verpakte sender wat in reaksie op elke aksiepotensiaal vrygestel word. Uitputting van hierdie maklik-losmaakbare vesikels veroorsaak sinaptiese moegheid. Korttermyn sinaptiese depressie kan ook ontstaan ​​uit post-sinaptiese prosesse en uit terugvoeraktivering van presinaptiese reseptore.

Langtermyn potensiaal (LTP)

Langtermynversterking (LTP) is 'n aanhoudende versterking van 'n sinaptiese verbinding, wat minute of ure kan duur. LTP is gebaseer op die Hebbiese beginsel: “selle wat saamvuur, dra saam. ” Daar is verskeie meganismes, waarvan geeneen ten volle verstaan ​​word nie, agter die sinaptiese versterking wat met LTP gesien word.

Een bekende meganisme behels 'n tipe postsinaptiese glutamaatreseptor: NMDA (N-Methyl-D-aspartate) reseptore. Hierdie reseptore word normaalweg deur magnesiumione geblokkeer. As die postsynaptiese neuron egter vinnig deur verskeie presynaptiese insette depolariseer word (óf uit een neuron óf verskeie neurone), word die magnesiumione gedwing en Ca2+ ione gaan in die postsinaptiese sel. Volgende, Ca2+ ione wat die sel binnedring, begin 'n seinkaskade wat veroorsaak dat 'n ander tipe glutamaatreseptor, AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) -reseptore in die postsinaptiese membraan geplaas word. Met geaktiveerde AMPA -reseptore kan positiewe ione die sel binnedring.

Dus, die volgende keer wanneer glutamaat uit die presinaptiese membraan vrygestel word, sal dit 'n groter opwindende effek (EPSP) op die postsinaptiese sel hê omdat die binding van glutamaat aan hierdie AMPA-reseptore meer positiewe ione in die sel sal toelaat. Die invoeging van addisionele AMPA -reseptore versterk die sinaps, sodat die postsynaptiese neuron meer geneig is om te brand as gevolg van die vrystelling van presynaptiese neurotransmitter. Sommige middels koöpteer die LTP-pad; hierdie sinaptiese versterking kan tot verslawing lei.

Langtermyn Depressie (LTD)

Langtermyn depressie (LTD) is in wese die omgekeerde van LTP: dit is 'n langtermyn verswakking van 'n sinaptiese verbinding. Een meganisme wat bekend is om LTD te veroorsaak, behels ook AMPA-reseptore. In hierdie situasie begin kalsium wat deur NMDA-reseptore binnedring 'n ander seinkaskade, wat lei tot die verwydering van AMPA-reseptore vanaf die postsinaptiese membraan. Met die afname in AMPA -reseptore in die membraan, reageer die postsynaptiese neuron minder op die glutamaat wat uit die presynaptiese neuron vrygestel word. Alhoewel dit kontra -intuïtief lyk, is LTD net so belangrik vir leer en geheue as LTP. Die verswakking en snoei van ongebruikte sinapse snoei onbelangrike verbindings, en laat slegs die opvallende verbindings versterk deur langdurige versterking.

Kern punte

  • Korttermyn-sinaptiese verbetering vind plaas wanneer die hoeveelheid beskikbare neurotransmitter toeneem, terwyl korttermyn-sinaptiese depressie plaasvind wanneer die hoeveelheid vesikels met neurotransmitters verminder word.
  • Sinapse word versterk met langtermynversterking (LTP) wanneer AMPA-reseptore (wat bind aan negatief gelaaide glutamaat) verhoog word, waardeur meer kalsiumione die sel kan binnedring, wat 'n hoër prikkelende reaksie kan veroorsaak.
  • Langtermyndepressie (LTD) vind plaas wanneer die AMPA-reseptore verminder word, wat die hoeveelheid kalsiumione wat die sel binnedring, verminder, wat die sinaptiese reaksie op die vrystelling van neurotransmitters verswak.
  • Die versterking en verswakking van sinapse oor tyd beheer leer en geheue in die brein.

Sleutel terme

  • langtermyn potensiasie: 'n langdurige (ure in vitro, weke tot maande in vivo) toename, tipies in amplitude, van die reaksie van 'n postsinaptiese neuron op 'n bepaalde patroon van stimuli van 'n presinaptiese neuron
  • langtermyn depressie: 'n langtermyn verswakking van 'n sinaptiese verbinding
  • plastisiteit: die eienskap van neuron waarmee dit versterk of verswak kan word

Persverklaring: Addex se Dipraglurant herstel sinaptiese plastisiteit in modelle van distonie

Genève, Switserland, 17 Mei 2021 Addex Therapeutics
https://www.globenewswire.com/Tracker?data=e5dg578doc8qHh7pGPYQjv0AYZV6AnaYhHtXNv-Qo7IzFD2jGZuIymS1IF2pHsM858409T2ZA0ZM23mtncZ8oMLOMXODKtQw-MLOMXODKt
(SES: ADXN en Nasdaq: ADXN), 'n farmaseutiese onderneming in die kliniese stadium
baanbrekerswerk op basis van allosteriese modulasie-gebaseerde ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddels,
het vandag aangekondig dat dipraglurant langtermyn kan red
verswakking van sinaptiese plastisiteit in twee goed gevalideerde modelle van
distonie. Die data is gepubliseer in die tydskrif, Neuropharmacology
https://www.globenewswire.com/Tracker?data=USLERC4O6Z127yh_CbyFjPMd0BuFEVjfmOMPULQ7D2fqqc4P3kr4lwr365Nj3WjOBUemQqn1VXjZVTo5bxetc4SvWrnpGZTfjp4SvWrnFAY6MP4SvWrnFaY4SvWrnFydv4SvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvSvvs
, onder die titel "Redding van striatale langdurige depressie deur chroniese
mGlu5 reseptor negatiewe allosteriese modulasie in duidelike distonie
modelle ", deur 'n span onder leiding van Antonio Pisani, MD, PhD, van die Departement
van brein- en gedragswetenskappe, Universiteit van Pavia, en Mondino
Foundation, Pavia, Italië.

“Daar is ’n dringende behoefte om teikens te identifiseer en doeltreffend te ontwerp
terapie vir distonie weens die huidige gebrek aan effektiewe behandeling
opsies. Ons studies oor die remming van mGlu5 -reseptore met
dipraglurant in twee etiologies verskillende vorme van distonia -modelle
demonstreer dat hierdie teiken nou bekragtig word as 'n belowende benadering tot
distonie behandel," het dr Pisani gesê. "Daarbenewens dui die data daar
is algemene meganistiese basisse en seinpaaie wat verswak is
verskillende vorme van distonie, wat die potensiaal van dipraglurant beklemtoon
as 'n nuwe terapeutiese metode vir die behandeling van dystonieë. Toets
hierdie hipotese in die kliniek is geregverdig. "

In hierdie studies het die navorsers getoon dat chroniese dipraglurant
Die administrasie kon die verlies aan langtermyn-sinaptiese depressie red
(LTD), 'n vorm van sinaptiese plastisiteit, by kortikostriatale sinapse wat
is aangetas by beide DYT1 -muise en GNAL -rotte, twee verskillende modelle van
distonie.

"Die bevinding dat striatale plastisiteit herstel kan word deur chroniese
toediening van dipraglurant in veelvuldige knaagdiermodelle van distonie is
'n baie belangrike bevinding wat die argument versterk dat dit
benadering kan van groot nut wees vir die normalisering van distonia-verwante
tekorte en ondersteun verder die rasionaal vir die ontwikkeling van dipraglurant
as 'n behandeling vir distonie, insluitend blefarospasme, 'het Robert gesê
Lütjens, hoof van Discovery Biology van Addex. “Dipraglurant gaan oor
om 'n deurslaggewende fase 2b/3 kliniese proef te begin vir die behandeling van
dyskinesie wat verband hou met Parkinson se siekte en 'n Fase 2 -studie in
blefarospasma pasiënte hierdie kwartaal."

Addex ontwikkel 'n verlengde-vrystelling formulering van dipraglurant vir
die behandeling van blefarospasme, 'n vorm van distonie wat gekenmerk word deur
onwillekeurige spiersametrekkings en spasmas van die ooglidspiere
wat lei tot langdurige sluiting van die ooglede wat aansienlike sig veroorsaak
versteuring of funksionele blindheid. 'N Placebo-beheerde fase 2
'n kliniese studie van dipraglurant by blefarospasma -pasiënte word beplan
begin gedurende Q2 2021. Onderhewig aan regulatoriese goedkeuring, meen Addex
dat dipraglurant 'n innoverende en gedifferensieerde behandeling kan bied
benadering vir verskeie tipes distonie en bied 'n beduidende
kommersiële geleentheid.

https://www.globenewswire.com/Tracker?data=e5dg578doc8qHh7pGPYQjpxhnoJHu874BhkqtILq5dFq3BTWBBWrjaoy02kVzL-6UWPsizAP_GROufu1ujzfHUnEvB35udgJXjMCC
Addex Therapeutics is 'n farmaseutiese maatskappy wat op kliniese stadium fokus
die ontwikkeling en kommersialisering van 'n opkomende klas roman
mondelings beskikbare klein molekule middels bekend as allosteriese modulatore vir
neurologiese afwykings. Allosteriese modulators bied verskeie potensiaal
voordele bo konvensionele nie-allosteriese molekules en kan 'n bied
verbeterde terapeutiese benadering tot konvensionele "ortosteriese" klein
molekule of biologiese middels. Addex se allosteriese modulator dwelm
ontdekkingsplatform teiken reseptore en ander proteïene wat is
erken as noodsaaklik vir terapeutiese intervensie. Addex se voorsprong
produk kandidaat, dipraglurant (mGlu5 negatiewe allosteriese modulator of
NAM), is gereed om 'n deurslaggewende kliniese proefneming te begin
Parkinson se siekte levodopa geïnduseerde dyskinesie (PD-LID) in Q2 2021.
Addex ondersoek ook die terapeutiese gebruik van dipraglurant in
blefarospasma ('n tipe distonie), waarvoor 'n kliniese proef is
sal na verwagting in die tweede kwartaal van 2021 begin word. Addex se derde kliniese program,
ADX71149 (mGlu2 positiewe allosteriese modulator of PAM), ontwikkel in
samewerking met Janssen Pharmaceuticals, Inc., is geskeduleer om in te tree
'n fase 2a bewys van konsep kliniese proef vir die behandeling van epilepsie
in Q2 2021. Addex se GABAB PAM-program is gelisensieer aan Indivior PLC,
wat gefokus is op ontwikkeling vir die behandeling van verslawing.
Prekliniese programme sluit in GABAB PAM vir CMT1A, mGlu7 NAM vir PTSD,
mGlu2 NAM vir ligte neurokognitiewe afwykings, mGlu4 PAM vir Parkinson's
siekte en mGlu3 PAM vir neurodegeneratiewe afwykings. Addex-aandele is
genoteer op die SIX Swiss Exchange en American Depositary Shares
wat sy aandele verteenwoordig, is op die NASDAQ Kapitaalmark genoteer, en
handel onder die tikkersimbool "ADXN" op elke beurs.

Tim Dyer Mike Sinclair James Carbonara
Partner van die Hoof Uitvoerende Beampte, Halsin Partners Hayden IR
Telefoon: +41 22 884 15 +44 (0) 20 7318 2955 +1 (646) 755 7412
55 [email protected] [email protected]
[email protected]

Vooruitskouende verklarings:

Hierdie persverklaring bevat vooruitskouende verklarings binne die
betekenis van die Private Sekuriteite Litigasie Hervormingswet van 1995, as
gewysig, ook met betrekking tot die verwagte aanvang en vordering
van kliniese toetse en prekliniese studies, en die toekomstige finansiering daarvan
aktiwiteite. Die woorde "mag", "sal", "kon", "sou", "behoort", "verwag,
"" beplan, "" antisipeer, "" beoog, "" glo, "" skat, "" voorspel, "
'projek', 'potensiaal', 'voortgaan', 'teiken' en soortgelyke uitdrukkings is
bedoel om vooruitskouende verklarings te identifiseer, hoewel nie almal nie
vooruitskouende verklarings bevat hierdie identifiserende woorde. Enige
vooruitskouende verklarings in hierdie persverklaring, is gebaseer op
bestuur se huidige verwagtinge en oortuigings en is onderhewig aan a
aantal risiko's, onsekerhede en belangrike faktore wat kan veroorsaak
werklike gebeure of resultate om wesenlik te verskil van dié uitgedruk of
geïmpliseer deur enige vooruitskouende verklarings vervat in hierdie pers
vrystelling, insluitend, sonder beperking, onsekerhede rakende die mark
voorwaardes. Hierdie en ander risiko's en onsekerhede word beskryf in die
Maatskappy se jaarverslag op Vorm 20-F wat op 11 Maart by die SEC ingedien is,
2021, asook marktoestande en regulatoriese hersiening.

Enige vooruitskouende verklarings in hierdie persverklaring verteenwoordig
Addex Therapeutics se sienings slegs op die datum hiervan en behoort nie so te wees nie
daarop staatgemaak as verteenwoordigend van sy sienings vanaf enige daaropvolgende datum. Addex
Therapeutics ontken uitdruklik enige verpligting om enige by te werk
vooruitskouende verklarings, behalwe soos deur die wet vereis.


35.2E: Sinaptiese Plastisiteit - Biologie

3 ȧ X l B i l嗓 ۲ >stroom x + | endstream endobj 27 0 obj> stroom x S * *T0T0 BC K L UЏ 44Pp W .g ? stroom x + | endstream endobj 29 0 obj> stream x S * *T0T0 BC K L UЏ 44Rp W .g endstream endobj 30 0 obj> stream x + | endstream endobj 31 0 obj >stream x S * *T0T0 BC K L UЏ 4 Pp W .g endstream endobj 32 0 obj >stroom x endstream endobj 33 0 obj> stream x S * *T0T0 BC K L UЏȴPp W *e ) endstream endobj 34 0 obj> stream x + | endstream endobj 35 0 obj >stream x S * *T0T0 BC K L UЏ 44Sp W .g S endstream endobj 36 0 obj >stream x + | endstream endobj 37 0 obj >stream x S * *T0T0 BC K L UЏ 4Pp W *e t endstream endobj 38 0 obj >stream x + | endstream endobj 39 0 obj> stream x S * *T0T0 BC K L UЏ 4Sp W *e % endstream endobj 40 0 ​​obj> stream x + | endstream endobj 41 0 obj> stream x S * *T0T0 BC K L UЏ 4Rp W *e endstream endobj 42 0 obj> stream x + | endstream endobj 43 0 obj> stream x S * *T0T0 BC K L UЏ 42Pp W .g o> endstream endobj 44 0 obj> stream x + | endstream endobj 45 0 obj> stream x S * *T0T0 BC K L UЏ 44Qp W .g endstream endobj 46 0 obj> stroom x + | endstream endobj 47 0 obj >stream x S * *T0T0 BC KL UЏ 4Qp W *e ( ! endstream endobj 61 0 obj >stroom m / F Y w Y ؖ g , H endstream endobj 60 0 obj> stroom H TP = o 0 +nL eA, *14 B ݱ j a > ΀Ru <


Materiale en metodes

Diere

Mannetjies Sprague-Dawley-rotte (3-10 weke oud Harlan Laboratories, Houston, TX, VSA) is in groepe van drie gehuisves en op 'n 12 uur lig/donker siklus gehou met voedsel en water beskikbaar ad libitum. Alle dierprosedures is goedgekeur deur die Universiteit van Texas Institutional Animal Care and Use Committee.

Elektrofisiologie

Horisontale middelbreinskywe (

200 μm) is voorberei van rotte (3–7 weke oud) en opnames is gemaak by 33–35 °C in fisiologiese sout, soos in ons vorige studies. 14, 16, 31 Opnames is uitgevoer in die laterale VTA geleë 50-150 μm van die mediale grens van die mediale terminale kern van die bykomende optiese kanaal. Interne oplossing (in mM): 115 K-metielsulfaat, 20 KCl, 1,5 MgCl2, 10 HEPES, 0,025 EGTA, 2 Mg-ATP, 0,2 Na2-GTP en 10 Na2-fosfokreatien (pH

7.25, ~ 285 mOsm kg −1). Vermeende dopamienneurone is geïdentifiseer deur spontane afvuur (1–5 Hz) met breë AP's (>1.2 ms) in selgehegte konfigurasie en groot ekh strome (& gt200 pA ontlok deur 'n 1,5 s hiperpolariserende stap van 50 mV) in heelselkonfigurasie. Spanningsklemme-opnames is gemaak met 'n houpotensiaal van -62 mV, gekorrigeer vir 'n vloeistofaansluitingspotensiaal van -7 mV. Opnames is weggegooi as die reeksweerstand bo 16 MΩ styg of die insetweerstand onder 200 MΩ val.

'n 2 ms depolariserende puls van 55 mV is gebruik om 'n ongeklemde AP te ontlok. Tyd integraal van die uitwaartse stertstroom, genoem ekK (Ca), is bereken tussen 20 ms en 400–600 ms na die depolariserende pols (uitgedruk in pC). ekK (Ca) so gemeet word uitgeskakel deur tetrodotoksien en deur apamien, 'n selektiewe antagonis van Ca 2+ -geaktiveerde kleingeleiding kalsium-geaktiveerde kaliumkanale, en kan dus gebruik word as 'n uitlees van AP-geïnduseerde Ca 2+ transiënte. 16

20 MΩ seël) is gemaak met pipette gevul met 150 m M NaCl om dopamienneuronvuur te monitor. Aspartaat iontoferese (1 M 1 aspartaat in

10-50 μm van die soma/proksimale dendriete) is gebruik om NMDAR-afhanklike uitbarstings op te wek. 10, 16 Amplitude (

50–150 ms) van die iontoforetiese stroom is aangepas om 'n sarsie van 5-10 spykers te lewer met 'n minimum oombliklike frekwensie van 15 Hz.

NMDAR LTP-eksperimente

Sinaptiese stimuli is elke 30 sekondes toegepas met 'n bipolêre wolframelektrode (

300 μm punt skeiding) geplaas rostraal na die aangetekende neuron. Om NMDAR-opwindende postsynaptiese strome (EPSC's) te isoleer, is opnames uitgevoer in die teenwoordigheid van 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (10 μ M), picrotoxin (100 μ M), CGP55845 (50 n M) en eticlopride (100 n M ) om AMPA/kainate, GABA te blokkeerA, GABAB en D2 dopamienreseptore, en in glisien (20 μM ) en lae Mg 2+ (0.1 m M ) om NMDAR-aktivering te verbeter. Die stimulasie-intensiteit is aangepas na inbraak (binne

100 pA EPSC's.Selle met baseline EPSC amplitude (gemiddeld van 10 spore gedurende 'n venster van 5 minute voor LTP -induksie) buite die 90-110 pA -reeks is uitgesluit.

Na 'n basiese EPSC -opname van 10 minute, het die effek van volgehoue ​​sinaptiese stimulasie (33 stimuli by 33 Hz) op ekK (Ca) is onmiddellik voor LTP -induksie beoordeel. Hier, ekK (Ca) is opgeroep deur 'n enkele AP alleen en 'n AP met voorafgaande sinaptiese stimulasie (140 ms interval tussen die offset van sinaptiese stimulasie en AP wat elke twee keer herhaal is). LTP is geïnduseer deur aanhoudende sinaptiese stimulasie (50 stimuli by 33 Hz) te koppel met 'n sarsie (vyf AP's by 20 Hz), waar die aanvang van die sarsie met 1 s vertraag is vanaf die aanvang van sinaptiese stimulasie. Hierdie sinaptiese stimulasie-uitbarsting-paring is 10 keer elke 20 s herhaal. In LTP-omkeer-eksperimente is volgehoue ​​sinaptiese stimulasie alleen of sinaptiese stimulasie gepaard met 'n enkele AP (vertraag met 1 s vanaf die sinaptiese stimulasie aanvang) herhaaldelik (10 of 30 keer) 30 min na LTP-induksie afgelewer. Die grootte van LTP en die omkering daarvan is bepaal deur die gemiddelde EPSC -amplitude van 'n venster van 5 minute (10 spore) onmiddellik voor LTP -induksie en dit van 5 minute vensters om 25-30 minute na LTP -induksie/omkering. Vir AP5-eksperimente (Figuur 3c), is 'n 5 min-venster voor AP5-perfusie (dit wil sê 20-25 min na LTP-induksie) gebruik.

Plek kondisionering

'N CPP -boks (Med Associates) bestaande uit twee afsonderlike kompartemente wat deur 'n klein middelkamer geskei is, is gebruik vir kondisionering. Rotte (4-10 weke oud) is eers aan 'n voortoets onderwerp, waarin hulle die hele CPP-boks vir 15 minute verken het. Die persentasie tyd wat in elke kompartement spandeer is, is bepaal nadat die tyd in die middelkamer uitgesluit is. Rotte met aanvanklike syvoorkeur >60% is uitgesluit. Gedurende die volgende 6 dae is rotte soutoplossing (1 ml kg −1) toegedien en tot een kompartement (dae 1, 3, 5) beperk of kokaïeninspuiting (10 mg kg −1, intraperitoneale (ip)) toegedien en beperk tot die ander kompartement (dae 2, 4 en 6 15 min elk). Vir etanol CPP is rotte soutoplossing (4,2 ml kg -1) of etanol (0,5 g kg -1, 15% v/v, i.p.) inspuiting gegee en 7 minute lank in 'n kompartement beperk. Die opdrag van die kompartement is teengewig, sodat diere gemiddeld

50% aanvanklike voorkeur vir die dwelmgekoppelde kant in die voortoets. 'N Na -toets van 15 minute is uitgevoer 1 dag na die laaste kondisioneringsessie. In uitwissingseksperimente het diere herhaalde natoetse (een daags) ondergaan. Vir herinstelling het rotte voor die natoetsing 'n inspuiting van kokaïen (10 mg kg -1 ) of etanol (0.5 g kg -1 ) ontvang. In sommige CPP-eksperimente het rotte bilaterale intra-VTA-infusie (0,3 μl per kant, 0,15 μl min −1 ) van (1) isradipien (0,6 pmol) of voertuig (0,01% etanol (=1,7 m M )) ontvang, (2) verbinding 8 (6 pmol) of vehikel (0,02% dimetielsulfoksied) of (3) AP5 (0,6 nmol) of vehikel (fosfaatgebufferde soutoplossing). Intra-VTA-mikro-inspuitingsprosedure word uiteengesit in aanvullende materiale en metodes. Data van rotte met inspuitplekke buite die VTA is uitgesluit van die analise.

Data-analise

Geen statistiese metodes is gebruik om steekproefgroottes vooraf te bepaal nie, maar ons steekproefgroottes is soortgelyk aan dié wat in vorige publikasies gerapporteer is. 14, 16, 31, 32, 33 Groepopdragte is meestal willekeurig gedoen, behalwe vir sekere CPP -eksperimente (Figuur 4 en 5 Aanvullende figure S11 en S12), waar rotte op 'n teenwigtige manier aan behandelingsgroepe toegewys is, gebaseer op die eerste natoetsdata. Die verkryging en ontleding van data is nie verblind nie. Data word uitgedruk as gemiddelde ± sem. met die steekproefgrootte in elke groep aangedui. Daar is aanvaar dat dataverspreiding normaal is, maar dit is nie formeel getoets nie. Statistiese betekenis is bepaal deur tweestert t-toets of ANOVA gevolg deur Bonferroni post hoc toets met behulp van GraphPad Prism (beduidend by P& lt0.05 besonderhede verskaf in figuurlegendes).


BESPREKING

Dit is net die tweede mikroskikkingstudie om te fokus op die uitwerking van slaaptekort op die hippokampus (14), 'n breinarea waarvan die funksie besonder vatbaar blyk te wees vir ontwrigting deur slaapverlies (30-32, 55, 70, 74, 88) , en is die eerste studie wat dit by muise gedoen het. Ons toon aan dat 'n tydperk van slaapgebrek wat tekorte in die hippokampus-afhanklike geheue en sinaptiese plastisiteit veroorsaak (83) wydverspreide veranderinge in die uitdrukking van die hippokampus veroorsaak. Ons identifiseer verskeie gene wat nie voorheen gevind is om deur slaap of slaaptekort gereguleer te word nie. Dit sluit die gevalideerde gene in Tsc22d3, Prkab2, Adamts 2, Htr1a, Kcnv1, en Sirt7 (Fig. 1, Aanvullende tabelle S1 en S2). Hierdie studie beklemtoon nuwe slaaptekort-teikengene wat waarskynlik funksionele impak sal hê. Byvoorbeeld, Tsc22d3 Daar is in ander stelsels getoon dat dit die geheue- en sinaptiese plastisiteitverwante seinmolekule, ekstrasellulêre seingereguleerde kinase (ERK) negatief reguleer (76), waarvan die vlakke 'n hoogtepunt bereik tydens slaap (21) en in die hippokampus verminder word na slaapgebrek ( 32, 69), en Prkab2 is 'n subeenheid van die energie-waarnemende molekule AMP-geaktiveerde kinase (AMPK), wat verhoogde fosforilering ondergaan na korttermyn slaapontneming (11, 20, 62) en 'n rol speel in homeostatiese slaapregulering (11). Ons toon ook aan dat verskeie gene waarvan die uitdrukking verander word deur slaapontneming in die korteks, ook in die hippocampus geraak word, insluitend Boog/Arg3.1, Fos, Hnrpdl, Rbm3, en die chaperones Hspa5/Bip en Hspa8 (sien byvoorbeeld verwysings 58, 85).

Daarteenoor het ons hippokampale mikroarray -studie ook nie induksie gevind nie Homer1a of Zif268/Egr1/NGFI-A, bekende merkers van slaapontneming in korteks (52, 85), wat daarop dui dat daar belangrike verskille kan wees in die patrone van geenuitdrukking wat veroorsaak word deur slaapontneming in verskillende dele van die brein. Dit is nie verbasend nie, gegewe 'n mikroarray -studie wat differensiële gevolge toon van slaaptekort op geenuitdrukking in korteks, basale voorbrein en hipotalamus (79), en 'n vorige studie wat in rottebrein getoon het dat slaaptekort opreguleer Zif268 in korteks, maar dit reguleer dit in die hippocampus (67). Onlangse meta-analise van die beskikbare genomiese data na aanleiding van slaaptekort in die korteks het 'n kernstel van oorvleuelende gene onder studies aan die lig gebring, bestaande uit net 91 gene (85). Ons het die ooreenkoms van ons studie in die hippokampus beoordeel met hierdie 91 konsensusgene wat differensieel uitgedruk is in die korteks na slaapgebrek (85). Ons het 40 presiese ooreenkomste (44% ooreenstemming) en 15 lede van dieselfde genfamilie (60% ooreenkoms) waargeneem (aanvullende tabel S4). Ons toon meer ooreenstemming met die konsensuslys as vorige mikroarraystudies (12, 51, 52) of die Allen Brain Institute (80). Ons analise het dus 'n meer betroubare stel teikengene vir slaaptekort geïdentifiseer as enige ander voorheen beskikbare datastel. Dit is waarskynlik dat die ooreenstemmings met die konsensuslys gene verteenwoordig wat veroorsaak word deur slaapontneming in verskeie breingebiede, terwyl die oorblywende gene uit die konsensuslys gene kan insluit wat nie deur slaapontneming in die hippocampus gereguleer word nie.

'N Belangrike bevinding van ons studie is dat slaaptekort proteïensintese kan belemmer en dat dit op twee maniere kan plaasvind. Eerstens, ons mikroskikking resultate toon dat, op die transkripsievlak, slaapontneming gene wat betrokke is by translasiebeheer afreguleer. Dit sluit vertaalinisiasiefaktore in (Eif4e2 en Eif5) en gene wat gekoppel is aan mRNA verwerking en vervoer (Rprd2, Rbm3, Hnrpdl, Cirbp, RbmX, en Denr) (19, 44, 53, 54, 73). Funksionele annotasiegroepering van geenuitdrukkingresultate ondersteun die gevolgtrekking dat 'n prominente effek van slaapontneming is om transkripsievlakke van gene betrokke by beide RNA-binding en -translasie te reguleer (Fig. 3, Aanvullende Tabel S2). Verrykte padanalise het insulien sein geïdentifiseer as 'n sleutelnetwerk wat geraak word deur slaapontneming, wat komponente van die mTOR -vertaalregulerende pad insluit (tabel 1, fig. 4). TFBS-analise toon verder dat transkripsiefaktore spesifiek afgereguleerde gene op 'n gekoördineerde wyse kan reguleer (Aanvullende Tabel S3). Benewens hierdie effekte op geenuitdrukking, blyk dit dat slaapontneming ook translasie-inisiasie beïnvloed deur posttranskripsionele veranderinge in translasieregulerende meganismes. Dit word ondersteun deur die waarnemings dat die totale en gefosforyleerde mTOR -proteïenvlakke daal na gebrek aan slaap (Fig. 5), terwyl ons mikroarray -data toon dat die mTOR -transkripsievlakke onveranderd is (sien Aanvullende Tabel S1).

Ons bevindings stem ooreen met vroeëre waarnemings dat slaap die breinproteïensintese bevorder (13, 51, 60, 61, 68, 89). Proteïensintese is 'n deurslaggewende stap in beide die konsolidasie van hippokampus-afhanklike geheue en die handhawing van langdurige hippocampus sinaptiese plastisiteit (hersien in Refs. 2, 37, 45). Remming van die reguleerder van proteïensintese mTOR benadeel langdurige plastisiteitsvorme en verskeie vorme van geheue in die knaagdier (7, 64, 71, 75), en verbeterde mTOR-funksie is gekoppel aan verbeterde geheue (16, 39). Navorsers wat 'n ontwikkelingsvorm van plastiese visuele korteks by katte bestudeer, het bevind dat slaap sinaptiese plastisiteit in vivo (24) help konsolideer en dat farmakologiese mTOR -remming spesifiek die konsolidasie van plastisiteit wat tydens slaap voorkom, voorkom (72). Dit is dus moontlik dat slaapafhanklike geheuekonsolidasie gedeeltelik bemiddel word deur mTOR-afhanklike proteïensintese. Onderbreking van hierdie proses kan dus bydra tot die uitwerking van slaaptekort op die plastiek en geheue van die hippokampus. Toekomstige ondersoek sal nodig wees om die molekulêre meganismes te bepaal waarmee slaapgebrek die totale mTOR -proteïen en fosforilering verminder, en watter afwaartse teikens van mTOR beïnvloed word.

Ons het 'n meta-analise uitgevoer wat min oorvleueling gevind het tussen die gene wat deur slaapontneming in ons mikroarray-studie gereguleer is, en die proteïene wat geïdentifiseer word as gereguleer in die muis korteks na slaapontneming met behulp van proteomika (65). Slegs twee van die 43 proteïene pas by ons lys van slaapgebrek-gereguleerde gene, een wat vir 'n algemene fragment op hitte-skokproteïen 8 (NP_112442.2) kodeer en soortgelyk aan hitte-skok, verwante 71 kDa-proteïene (XP_483871.1), en een wat kodeer vir Secernin 1 (NP_081544.1). Vergelyking van ons data met beskikbare proteomiese studies in rotte na slaapgebrek (5, 66) toon ook geen oorvleueling nie. Dit is moeilik om te sê of hierdie gebrek aan korrespondensie bloot te wyte kan wees aan beperkinge van proteïenopsporing deur proteomika, omdat die drie proteomiese studies hierbo genoem slegs gepoog het om kolle met differensiële uitdrukking te identifiseer. Net so het proteomiese studies oor die effek van slaapontneming wat by rotte uitgevoer is, slegs 'n beperkte aantal plekke ontleed met 'n groter oorvloed by slaapgebrekende diere (5, 66). Daarom is 'n treffer in ons mikroarray moontlik nie in hierdie proteomiese studies opgespoor nie omdat dit nie as 'n vlek op die gel waarneembaar was nie, omdat dit teenwoordig was op 'n plek met ander peptiede wat die verandering in uitdrukking belemmer het, of omdat dit teenwoordig was maar dit is nie beduidend verander deur slaaptekort op die proteïenvlak nie. As die derde geval waar is, kan die minimale oorvleueling tussen beskikbare transkriptomiese en proteomiese studies die gevolgtrekking ondersteun dat slaapontneming translasie via mTOR stop, wat 'n gebrek aan korrespondensie tussen transkripsie- en proteïenvlakke veroorsaak. mTOR reguleer kap-afhanklike translasie-inisiasie, wat die meerderheid eukariotiese transkripsies behels. Die presiese subset van gene wat op translasionele vlakke gereguleer word deur mTOR -aktivering, is egter nie bekend nie. Dit is interessant om daarop te let dat die beperkte oorvleueling tussen ons mikroskikking en die Pawlyk et al. (65) muis -proteomiese studie stem ooreen met proteïene wat aan die UPR behoort. Dit is bekend dat die translasie van proteïene wat die sel toelaat om met kortstondige stres die hoof te bied, cap-onafhanklik (50) en dus mTOR-onafhanklik kan wees. Dit kan verklaar waarom daardie oorvleueling bestaan. Namate proteomiese benaderings verbeter (78), sou dit interessant wees om die gevolge van slaaptekort op mRNA- en proteïenvlakke op 'n breë skaal in die hippokampale weefsel te vergelyk.

Die huidige studie fokus hoofsaaklik op veranderings in die uitdrukking van gene aan die einde van 'n periode van 5 uur slaap, met addisionele toetsing van geselekteerde gene na 2,5 uur herstel. Daarom sal dit in toekomstige studies van belang wees om 'n tydsverloop van hierdie effekte te ondersoek, om vas te stel op watter punt tydens slaapontneming spesifieke gene geteiken word, en vir watter duur. Byvoorbeeld, is die gene wat na 5 uur se slaaptekort geïnduseer word opgereguleer vir die volle 5 uur? En sou hulle terugkeer na die basislyn met aanhoudende slaaptekort? Die gegewens in fig. 6 toon ook aan dat nie alle gene op dieselfde tyd herstel na slaapontneming nie, en dit sou interessant wees om uit te brei oor hierdie bevinding in toekomstige studies. Omdat sommige gene nog nie herstel het in die tyd wat dit nodig het voordat slaapskuld verdwyn nie (25, 40), kan dit aandui dat gene wat nie in daardie tydperk herstel nie, bydra tot ander langduriger gevolge van slaapontneming. Dit kan ook handig wees om die huidige analise uit te brei deur slaap-ontneemde en kontrolemonsters te vergelyk tot 'n vasmaakpunt aan die begin van die ontnemingsperiode. Hierdie protokol kan antwoord of mRNA-vlakke vir spesifieke gene styg of daal in slaapgebreke en beheer diere relatief tot die absolute vlak waar hulle begin het, eerder as net relatief tot mekaar.

Ons het hierdie artikel gefokus op die uitwerking van slaaptekort op proteïensintese, maar ons data dui op regulering van bykomende sellulêre prosesse en seinpaaie wat van belang sal wees om in meer besonderhede te bestudeer. Om 'n voorbeeld te gee, dit word duidelik dat metabolisme diep geraak word deur slaap en slaapstoornisse (hersien in verwysings 3, 26, 46, 47, 81), en dat die insulien -seiningsnetwerk wat deur ons verrykte padanalise geïdentifiseer is, deurslaggewend is in metaboliese beheer. In werklikheid het studies by mense 'n verband gevind tussen die kort slaapduur en die aanvang van diabetes (6, 27), en selfs 'n nag se slaapbeperking kan insulienweerstand beïnvloed (18). Gebaseer op ons identifikasie van 'n stel individuele ontwrigte komponente van hierdie seinweg, kan toekomstige studies moontlik bepaal hoe slaaptekort insulienseine ontwrig.

Ten slotte, dit is die eerste studie wat 'n genoomwye analise uitgevoer het oor die uitwerking van slaaptekort op geenuitdrukking in die muishippokampus, en ons het baie gene geïdentifiseer wat nie voorheen gekoppel was aan slaap of gebrek aan slaap nie. Veranderde gene is beduidend gegroepeer deur funksie, met een van die primêr gereguleerde sellulêre prosesse as proteïensintese. Ondersteuning van hierdie bioinformatiese benadering was ons nuwe bevindinge dat vlakke en aktivering van die translasiereguleerder mTOR afgereguleer is deur slaaptekort in die hippokampus. Hierdie werk identifiseer 'n belangrike seinmolekule in plastisiteit en geheue as 'n teiken van slaaptekort in die hippokampus, wat moontlik verduidelik waarom 'n kort tydperk van slaapontneming spesifiek proteïensintese-afhanklike vorme van plastisiteit en geheueberging ontwrig.


Metodes

Transgeniese muise, primêre neuronale kulture en transfeksie

Die heterosigotiese mannetjie R6/1 muise (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) is gekruis met vroulike C57BL/6 muise (Charles River, Lyon). Homosigoties Hdh Q111/Q111 KI -muise van HD op CD1 -agtergrond is 'n ruim geskenk van M.E. MacDonald 56. Die CAG140 is heterosigotiese muise met C57Bl6N/J agtergrond. Die diere is gehuisves met kos en water ad libitum onder 'n 12 uur lig-donker siklus. Alle werk met diere is uitgevoer volgens die etiese reëls van die Komitee van die Universiteit van Bordeaux en die Aquitaine (Frankryk, A50120127) en die Institusionele Dieresorg- en Gebruikskomitee (Europese richtlijn, 2010/63/EU vir die beskerming van laboratoriumdiere , toestemmings # 92-256B, magtelike etiese komitee CEEA 26 2012_100). Polimerase kettingreaksie genotipering met DNA wat uit 'n stuk stert onttrek is, is uitgevoer om muise genotipe te identifiseer.

Primêre kulture van hippocampus neurone is voorberei volgens 'n voorheen beskryf metode van (1) Sprague-Dawley rotte by E18 (2) Hdh Q111/Q111 KI muise en WT rommelmaats by P0 vir AMPAR oppervlak dop en Hdh Q111/Q111 KI muise en WT muise by E15 vir BDNF intrasellulêre dop en (3) R6/1 muise en WT -rommelmaats teen P0 57,58. Selle is met 'n digtheid van 200 × 103 selle vir rottekultuur en 450 × 103 selle vir muiskultuur per 60 mm skottel geplateer op vooraf-bedekte dekstrokies met poli-lysien. Kulture is in serumvrye neurobasale medium (Invitrogen) onderhou en by 37 °C in 5% CO gehou2 maksimum 20 dae in vitro (DIV). Selle is getransfekteer met toepaslike plasmiede met behulp van Effectene (Qiagen).

Plasmiede en chemiese produkte

Homer 1C :: GFP met CaMKII promotor is gegenereer deur homer 1C cDNA te subkloner in die eukariotiese uitdrukkingsvektor pcDNA3 (Invitrogen) EGFP is by die N-terminus van die Homer 1C volgorde ingevoeg. Exon1 mutant huntingtin bevat 69 poliglutamien uitbreiding (exon1-polyQ-HTT) en WT huntingtin met 17 poliglutamien (exon1-wHTT) 24 . Vollengte HTT-plasmiede kodeer vollengte-jagtin met 17 polyQ (FL-wHTT) of 75Q (FL-polyQ-HTT). GFP saamgesmelte 480-17Q, 480-68Q huntingtin plasmiede kodeer die eerste 480 aminosure fragment van huntingtin met 17 (Nter-wHTT) of 68 glutamiene (Nter-polyQ-HTT) 59,60. Tianeptine is gekoop van T & W-groep en MedChemexpress CO., Ltd BDNF van Sigma-Aldrich TrkB-Fc van R&D Systems en kn93 van Tocris. Tuisgemaakte CB en CB wat deur Bio S & ampT gesintetiseer is, is gebruik.

CB sintese

CB is op 'n skaal van 0,05 mmol gesintetiseer. Aminosure is saamgestel deur outomatiese mikrogolf-peptiedsintese in 'n mikrogolfoond op 'n CEM-mikrogolfondersteunde Liberty-1-sintetiseerder volgens die standaard koppelingsprotokolle wat deur die vervaardiger verskaf is. Metionien is vervang deur Norleucine (λ), 'n meer stabiele isostere. Lineêre peptied is gesplit (TFA: H2O: EDT: TIS, 94: 2.5: 2.5: 1) en gesuiwer deur hoëprestasie vloeistofchromatografie (HPLC). Disulfiedbindingsvorming is vir 10 uur in H uitgevoer20 in die teenwoordigheid van dimetielsulfoksied (5%) en ammoniumasetaat (0.05 M) by hoë verdunning van die peptied (100 µM). Oormaat oplosmiddel is verwyder en die peptied is gesuiwer deur omgekeerde fase (RP) -HPLC (YMC C18, ODS-A 5/120, 250 × 20 mm 2, ultravioletopsporing by 228 en 280 nm, met behulp van 'n standaard gradiënt: 5% MeCN wat 0.1% TFA vir 5 min bevat, gevolg deur 'n gradiënt van 10% tot 40% oor 40 min in dH2O wat 0,1% trifluorazynsuur (TFA) bevat teen 'n vloeitempo van 12 ml min -1). Peptiede is gekenmerk deur analitiese RP-HPLC en matriks-ondersteunde lig desorpsie/ionisasie. Peptiede is gekwantifiseer deur absorbansiemeting by 280 nm, verdeel, gevriesdroog en gestoor by -80 °C tot gebruik.

Enkeldeeltjienasporing van AMPAR met behulp van QD

Rat primêre hippokampusneurone is op DIV 10–11 saam met GFP/homer1c-GFP en wHTT/polyQ-HTT getransfekteer in die verhouding 1: 9 om te verseker dat die meerderheid GFP-getransfekteerde neurone met HTT getransfekteer is. Homer1c is gebruik as 'n postsynaptiese merker. Endogene GluA2 en GluA1 QD -opsporing is uitgevoer by DIV 11-12 soos voorheen beskryf 22. Neurone is eers geïnkubeer met muis monoklonale teenliggaampies teen N-terminale ekstrasellulêre domein GluA2 subeenheid ('n vriendelike geskenk van E. Gouaux, Oregon Health and Science University, VSA) (1:1000) of konyn poliklonale teenliggaampie teen N-terminale ekstrasellulêre domein GluA1 subeenheid (PC246, Calbiochem) (1: 200) vir 7 minute, gevolg deur inkubasie met QD 655 Bok F (ab ') 2 anti-muis (Invitrogen, 1: 10,000 tot 1: 20,000) of anti-Rabbit IgG (Invitrogen, 1 :10 000 tot 1:20 000) vir 4 min. Die spesifisiteit van die teenliggaampies is beheer met behulp van hippocampus neuronkultuur van GluA2- of GluA1-knock-out muise in ons laboratorium (data word nie getoon nie). Nie-spesifieke binding is geblokkeer deur 5% bees serum albumien (Sigma-Aldrich). QD's is opgespoor met behulp van 'n kwiklamp en toepaslike opwekking-/emissiefilters. Beelde is verkry met 'n interval van 50 ms en tot 1000 opeenvolgende rame. Seine is opgespoor met behulp van 'n CCD -kamera (Quantem, Roper Scientific). QD's is gevolg op willekeurig geselekteerde dendritiese streke vir tot 20 minute. QD-opnamesessies is met die MetaMorph-sagteware (Molecular Devices, Sunnyvale, VSA) verwerk. Die oombliklike diffusiekoëffisiënt, D, is vir elke baan bereken, uit lineêre pasvorme van die eerste 4 punte van die gemiddelde kwadraat-verplasing versus tydfunksie met behulp van MSD (t) = & lt r 2 > (t) = 4Dt. Die tweedimensionele trajekte van enkele molekules in die fokusvlak is saamgestel deur korrelasie-analise tussen opeenvolgende beelde met behulp van 'n Vogel-algoritme. QD-gebaseerde trajekte is as sinapties beskou as dit gekolokaliseer is met Homer 1C dendritiese trosse vir ten minste vyf rame.

BDNF -intrasellulêre vervoer

Rot-hipokampale neurone is by DIV 9-10 mede-getransfekteer met GFP-gefuseerde 480-17Q (GFP::Nter-wHTT) of 480-68Q (GFP::Nter-polyQ-HTT) en mCherry-BDNF in die verhouding van 4 : 1 met behulp van Effectene (QIAGEN). Live beeldvorming is uitgevoer op DIV 10-11. Die beweging van BDNF-bevattende vesikels is nagespoor met behulp van videomikroskopie op 'n omgekeerde Leica DMI 6000 Jaar mikroskoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland) toegerus met 'n HQ2 kamera (Photometrics, Tucson, VSA). Die objektiewe HCX PL wat gebruik is, was 'n CS APO × 63 NA 1.32 olie. Die atmosfeer was 37 ° C broeikas wat geskep is met jaarkas en lugverhittingstelsel (Life Imaging Services, Basel, Switserland). Verkrygings en berekeninge is gedoen met die MetaMorph -sagteware (Molecular Devices, Sunnyvale, VSA). Vir BDNF aksonale handel in hippocampale neurone van muis Hdh Q111/Q111 KI en WT muise, hippokampale neurone by E15 is gebruik. Mikrokamers, neuronale transfeksie sowel as videomikroskopie is voorheen beskryf 27. Kortliks is beelde in stroommodus versamel met behulp van 'n Micromax -kamera (Roper Scientific) met 'n blootstellingstyd van 100–150 ms. Projeksies, animasies en ontledings is gegenereer met behulp van die ImageJ -sagteware (http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, VSA). Maksimale projeksie is uitgevoer om die vesikelpaaie te identifiseer, wat in ons sisteem ooreenstem met vesikelbewegings in aksone. Kymograwe en ontledings is gemaak met die KymoToolBox, 'n tuisgemaakte inprop 27.

Super-resolusie beelding van AMPAR oppervlak diffusie

uPAINT is gebruik. Die primêre hippokampale neurone van rotte is vir twee weke by DIV 4 saam met homer1c-GFP en FL-wHTT/polyQ-HTT getransfekteer. Homer1c is gebruik as 'n postsynaptiese merker. Atto647-gekonjugeerde muis monoklonale teenliggaam teen N-terminale ekstrasellulêre domein GluA2 subeenheid ('n gawe van E. Gouaux, Oregon Health and Science University, VSA) (1: 5000-1: 10.000) is gebruik. Die mikroskoop was 'n Nikon Ti Eclipse (Nikon France SAS, Champigny-sur-Marne, Frankryk) toegerus met 'n Perfect Focus System (PFS) en 'n TIRF-arm en gebruik objektiewe Apo TIRF × 100 olie NA 1.49 en 'n sensitiewe Evolve EMCCD-kamera (Fotometrie, Tucson, VSA). Die diodelasers wat gebruik is, was by 491 en 635 nm. Hierdie stelsel is toegerus met 'n gemotoriseerde verhoog Ti-S-ER. Die 37 °C atmosfeer is geskep met 'n broeikasboks en 'n lugverhittingstelsel (Life Imaging Services, Basel, Switserland). Hierdie stelsel is beheer deur die MetaMorph -sagteware (Molecular Devices, Sunnyvale, VSA).

BDNF-ensiem-gekoppelde immunosorbent-toets

Die BDNF -konsentrasie is geëvalueer met behulp van die BDNF ELISA Kit (Millipore, Abnova) volgens die protokol wat die onderneming verskaf het.

Westerse klad

Western blot word uitgevoer soos voorheen beskryf 22. Tien µg proteïen is per baan gelaai en deur natriumdodesielsulfaat-poliakrielamiedgelelektroforese (SDS–PAGE) geanaliseer. Primêre teenliggaampies anti-BDNF teenliggaam (Santa Cruz Biotechnology, sc-546, 1: 200) en anti-Tubulin teenliggaam (Sigma-Aldrich, T5168, 1: 4000) is gebruik.

Ko-immunopresipitasie

Vir elke eksperiment is een muisbrein van 5 weke oue rommelmaat WT of HDH-Q111 gehomogeniseer in 6 ml homogeniseringsbuffer (20 mM Hepes, 0,15 mM EDTA, 0,4 mM EGTA, 10 mM KCl, pH 7,5, cocktail van protease inhibeerders (aprotinien, leupeptien, pepstatien-A, MG132, en pefabloc, 10 µg/ml) en vir 10 minute gesentrifugeer by 860 × g. Die supernatant is vir 30 minute by 17 000 × gesentrifugeer g. Die korrel is gehomogeniseer met 20 beroertes in 15 ml van dieselfde buffer, aangepas op 15% sukrose. Die homogenaat is 10 minute by 860 × gesentrifugeer g, ten einde genomiese DNA te verwyder. Die supernatant wat die membrane bevat, is weer vir 30 minute by 17 000 × gesentrifugeer g. Breinmembrane is opgelos in 'n medium wat 20 mM Hepes, 1% Triton-X100, 150 mM NaCl, 0,15 mM EDTA, 4 mM EGTA (pH 7,5) en die antiprotease-skemerkel bevat, met 20 duim met 'n pottebakker. Monster is vir 45 min by 17 000 × gesentrifugeer g. Alle stappe is uitgevoer by 4 ° C. Proteïenkonsentrasie is geëvalueer met 'n BCA-toets. Triton-X100-supernatant (0,5 mg) is geïnkubeer met die anti-stergasien-teenliggaam (AB-9876, Millipore, 1:150) vir 1 uur by 4 °C en dan oornag geïnkubeer met 50 µl proteïen-A Sepharose by 4 °C . Hars is gewas met 1 ml laaibuffer en 0,5 ml dieselfde buffer wat 500 mM NaCl bevat. Krale is hersuspendeer in 100 µl gellaaibuffer, uitgevoer op 4–15% SDS-PAGE, en immunoblot met anti-stergazin (AB-9876, Millipore, 1:1000) en anti-PSD95 (Neuromab, 75-028, 1) : 1000) teenliggaampies. Foto's en kwantitatiewe analise van western blots is uitgevoer met behulp van die Li-Cor apparaat (Odyssey scanner v3.0).

DUOLINK in situ PLA

PLA is uitgevoer om die interaksie tussen stargazin en PSD95 in situ te evalueer met behulp van Duolink In Situ Detection Reagents (Sigma DUO92013) volgens die volgende protokol: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/duolink-fluorescence- gebruikershandleiding.html. Teenliggaampies was anti-stergasien (Millipore 07-577, 1: 100) en anti-PSD95 (Thermo Scientific MA1-046, 1: 100).

Buitesellulêre opname in hippokampale CA1 piramidale neurone

Manlik heterosigoties R6/1 muise, Hdh Q111/Q111 KI -muise en onderskeie WT -rommelmaats is gebruik vir ex vivo ekstrasellulêre opname. Hdh Q111/Q111 KI muise (10-12 weke oud) het 'n enkele inspuiting van tianeptine (ip., 10 mg kg -1 ) met glukose as negatiewe kontrole ontvang R6/1 muise het chroniese behandeling met tianeptien ontvang (25 mg kg −1, daagliks ip) vanaf 4 weke ouderdom tot 12 weke oud. Soos voorheen beskryf 22, is 'n hippocampus sny oorgeplaas na 'n superfusing opname kamer met temperatuur beheer by 33.5 ° C en deurlopend geperfuseer met suurstofryke kunsmatige serebrospinale vloeistof (ACSF) met behulp van 'n peristaltiese pomp (Ismatec, Switserland). 'n Teflon-bedekte wolfram bipolêre stimulerende elektrode (Phymep, Parys, Frankryk) is in stratum radiatum geposisioneer, wat die afferente Schaffer kollaterale-kommissurale pad vanaf die CA3-area na die CA1-gebied gestimuleer kon word. Die fEPSP's is aangeteken vanaf stratum radiatum van CA1 -gebied, met behulp van 'n glaselektrode (3-5 MΩ) wat uit borosilikaatglasbuise (Harvard Apparatus, VSA 1.5 mm OD x 1.17 mm I.D) getrek is en gevul met ACSF. Pulse is op 7,5 sekondes gelewer deur 'n stimulus -isolator (Isoflex, AMPI, Jerusalem, Israel), met die aanpassing van die huidige intensiteit om 30-40% van die maksimum fEPSP te verkry. 'n Theta-burst stimulation (TBS) protokol (4 pulse, onderskeidelik, gelewer by 100 Hz, 10 keer herhaal, met 'n interval van 200 ms) is gelewer deur Clampex10.4 (Molecular Devices, VSA) en die stimulus-isolator om LTP te induseer . Opnames is voortdurend gemaak vir & gt60 min, na aanleiding van die TBS. Data is aangeteken met 'n Multiclamp700B (Axon Instruments, VSA) en verkry met Clampex10.4. Die helling van die fEPSP is gemeet met behulp van die clampfit10.4 sagteware, met alle waardes genormaliseer na 'n 5 min basislyn periode, die waardes van potensiasie gedurende 50-60 min na TBS is in die figure gerapporteer. Die persentasies van potensiasie gedurende die laaste 10 minute van elke opnames is in kumulatiewe waarskynlikheidskurwes geplot. Ons het geen opnames ingesluit waarin die veselvolley verander het nie en gt30% van die basiswaarde of die globale evolusie. Geen verskil in veselsalvo tydsverloop is tussen die vergelykende groepe opgespoor nie. Die opname is blindelings uitgevoer in terme van muise genotipe en behandeling.

Gedragstoetse

Manlik R6/1 en WT werpselmuise is gebruik vir gedragstoetse. Op die ouderdom van 4 weke is muismatte met gemengde genotipes (3-5 per hok) in standaardhokke van polikarbonaat (33 × 15 × 14 cm 3) gehuisves en lukraak toegewys aan voertuig- of geneesmiddelbehandelingsgroepe. Eenvoudige randomiseringsmetode is gebruik vir die toewysing van WT en R6/1 muise na voertuig- of geneesmiddelbehandelingsgroepe. Die steekproefgrootte is gekies op grond van vorige ervaring en publikasies. Muise ontvang daagliks i.p. inspuiting van 0,9% soutoplossing (voertuig) of tianeptien (10 mg kg −1) opgelos in 0,9% soutoplossing tot 12 weke oud, toe die diere aan 'n reeks gedragstoetse onderwerp is. Op dag 1 is alle muise op dag 2 aan 'n oop veldtoets onderwerp; ruimtelike geheue is in Y-doolhof beoordeel. Na 'n week van rus, op dag 9, is 'n subset muise verder getoets vir kontekstuele vrees -kondisionering, wat laastens uitgevoer word om verwarrende faktore te verminder. Alle gedragstoetse is uitgevoer in die ligfase (ligintensiteit: 45-50 lux). Voor elke gedragstoets is muise afsonderlik in standaardhokke met saagsels, kos en water gehuisves en minstens 30 minute voor die aanvang van die toets ongestoord in die eksperimentele kamer gelaat. Gedragstoetse is blindelings uitgevoer rakende die genotipe en behandeling van muise.

Oop veld

Die apparaat bestaan ​​uit 'n wit vierkantige arena (42 × 42 × 20 cm 3 ). Elke dier is in die middel van die arena geplaas en vir 20 minute verken. Beelde wat vanaf 'n kamera bo die doolhof opgespoor is, is met Ethovision (weergawe 9.1) geanaliseer. Die totale afstand afgelê en die tyd wat spandeer word om te beweeg is ontleed as uitlesings van lokomotoriese aktiwiteit. Die apparaat is skoongemaak deur etanol 70% tussen muise.

Y-doolhof

Hippocampus-afhanklike ruimtelike werkgeheue is geëvalueer met behulp van Y-doolhof. Die apparaat bestaan ​​uit drie identiese grys plastiekarms (42 × 8 × 15 cm 3) en op 120 ° afstand van mekaar. Die doolhof was geleë in die middel van 'n kamer wat 'n verskeidenheid van ekstra doolhof leidrade bevat. 'N Digitale kamera is bo die doolhof aangebring wat die data na 'n rekenaar stuur wat die Ethovision -stelsel bestuur. Muise is toegeken aan twee arms (begin en bekende arm) waaraan hulle blootgestel is tydens die eerste fase van die toets (gewoontefase). Die oorblywende derde arm wat deur 'n grys plastiekdeur geblokkeer is, vorm die nuwe arm tydens die tweede fase (toetsfase). Muise is aan die einde van die aanvangsarm geplaas en toegelaat om beide die begin en die ander nie -geblokkeerde arm vir 5 minute vrylik te verken voordat hulle uit die doolhof verwyder is en na die waghok teruggekeer word. Na 10 minute in die waghok het die toetsfase begin. Gedurende hierdie fase is die deur verwyder en al drie die arms is oopgemaak, muise is aan die einde van die beginarm geplaas en die hele doolhof vir 2 minute verken. Tydens die aanpassings- en toetsfase is die videotimer begin sodra die muis die aanvangsarm verlaat en die middel binnegekom het, dus is twee muise wat nie die aanvangsarm tydens die toetsfase verlaat het nie, van die analise uitgesluit. Die apparaat is tussen die twee fases skoongemaak om reukwyses te vermy. Tyd spandeer in die nuwe arm in vergelyking met tyd in al drie arms is gebruik as een uitlees vir hippocampus-afhanklike ruimtelike geheue. Y-doolhof analise is blindelings uitgevoer met betrekking tot genotipe of behandeling.

Kontekstuele vrees kondisionering

Kontekstuele vreeskondisionering bied 'n mate van geheue deur 'n geheue te bepaal vir die verband tussen ligte voetskok en 'n belangrike omgewingswysie. In die vreeskondisioneringstoets word vriesgedrag gedefinieer as die volledige gebrek aan beweging, wat 'n kenmerkende vreesreaksie by knaagdiere is, wat 'n uitlees van hippocampus-afhanklike geheue verskaf. Vreeskondisionering is uitgevoer in 'n toetskamer met 'n interne afmeting van 25 × 25 × 25 cm 3, met deursigtige plastiekwande aan elke kant en staalstawe op die vloer. Elke kamera is aan die een kant gemonteer. Die kamer was geleë in 'n groter, geïsoleerde, deursigtige plastiekkas (67 × 53 × 55 cm 3) wat beskerming bied teen geraas van buite. Die kas het 'n ventilasiewaaier bevat wat tydens die sessies aangedryf is. Muise is voor die toets buite die eksperimentele kamer in individuele hokke gehou. Oefenkamers is skoongemaak met 100% etanoloplossing voor en na elke proef om enige olfaktoriese leidrade te vermy. Die eksperimente het oor twee opeenvolgende dae geduur. Op dag 1 is muise in die kondisioneringskamer geplaas en 2 minute 28 sekondes later een voetstok (2 s, 0,3 mA) ontvang. Muise is 30 s na die skok uit die kamer verwyder. Op dag 2 keer hulle terug na dieselfde kondisioneringskamer vir 'n periode van 3 minute in presies dieselfde toestande as dag 1, maar sonder elektriese skok, om konteks-geïnduseerde bevriesing te evalueer. Kontekstuele vrees -kondisioneringseksperiment is blindelings uitgevoer met betrekking tot genotipe of behandeling.

Verhoogde plus doolhof (EPM)

Manlik CAG 140 heterosigotiese KI muise ontvang daagliks i.p. inspuiting van soutoplossing of tianeptien teen 10 mg kg - 1 op 12 weke ouderdom. Geen ewekansige metodes is gebruik vir die toekenning van WT en CAG 140 muise na voertuig- of geneesmiddelbehandelingsgroepe. Gedragstoetse is blindelings op die ouderdom van 16 weke uitgevoer. Elke dier, oor 'n week, is agtereenvolgens in die EPM en NSF getoets, wat verskillende angs- en depressiegedragparadigmas verteenwoordig. Gedragstoetse is tydens die ligfase tussen 0700 en 1900 uur uitgevoer. EPM is uitgevoer soos voorheen 61. Die doolhof is 'n plus-kruisvormige apparaat met twee oop arms en twee arms wat gesluit is deur mure wat verbind is deur 'n sentrale platform 50 cm bo die vloer. Muise is individueel in die middel van die doolhof geplaas met die gesig na 'n oop arm en is toegelaat om die doolhof gedurende 5 min te verken. Die tydsbesteding en die aantal inskrywings in die oop arms is as 'n angsindeks gebruik. Beweging is ook gemeet om verwarrende effekte te verseker. Alle parameters is gemeet met behulp van 'n videotracker (EPM3C, Bioseb, Vitrolles, Frankryk).

Nuwe onderdrukte voeding (NSF)

Die NSF is 'n konfliktoets wat mededingende motiverings ontlok: die begeerte om te eet en die vrees om in die middel van 'n helder verligte arena te waag. Die latensie om te begin eet word gebruik as 'n indeks van angs/depressie-agtige gedrag, omdat klassieke anxiolitiese middels sowel as chroniese antidepressante hierdie maatstaf verminder. Die NSF-toets is uitgevoer gedurende 'n tydperk van 15 minute soos voorheen beskryf 61 . Kortliks, die toetsapparaat het bestaan ​​uit 'n plastiekboks (50 × 50 × 20 cm 3), waarvan die vloer met ongeveer 2 cm houtbeddegoed bedek was. Vier-en-twintig uur voor gedragstoetsing is alle voedsel uit die huishok gehaal. Ten tyde van toetsing is 'n enkele korrel kos (gewone chow) op 'n witpapierplatform geplaas wat in die middel van die boks geplaas is. Elke dier is in 'n hoek van die boks geplaas, en 'n stophorlosie is dadelik begin. Die latensie om te eet (gedefinieer as die muis wat op sy hurke sit en die korrel byt met die gebruik van voorpote) is ingestel. Onmiddellik daarna is die dier na sy huishok oorgeplaas, en die hoeveelheid voedsel wat die muis in die daaropvolgende 5 minute verbruik het, is gemeet, wat dien as 'n kontrole vir verandering in eetlus as 'n moontlike verwarrende faktor.

Statistiek

Statistiese analise is uitgevoer met behulp van Prism 7.04 (GraphPad, VSA). D’Agostino & amp; Pearson normaliteitstoets en Shapiro – Wilk normaliteitstoets is gebruik om die normale verspreiding te toets. Vir vergelyking met twee groepe, F toets is gebruik om variansie binne elke groep te toets vir meervoudige groepvergelyking, Brown-Forsythe-toets en Bartlett se toets is gebruik. Datastelle, wat nie normaalverspreid of met ongelyke populasieafwykings was nie, is getransformeer deur die waardes om te skakel na hul logaritmes of vierkantswortels om by Gaussiese verspreiding te pas of om die standaardafwykings gelyk te maak. Data waardes is getoon as gemiddelde ± s.m. vir normaal verspreide data mediaan ± 95% vertrouensinterval (95% ci) of mediaan ± interkwartiel reeks vir nie-normaal verspreide data. Normaal verspreide datastelle met gelyke populasie -afwykings is vergelyk met behulp van gepaarde of ongepaarde studente t toets (vir twee-groep, een-faktor vergelyking), eenrigting analise van variansie (ANOVA) toets gevolg deur Tukey se meervoudige vergelyking toets (vir multi-groep, een-faktor vergelyking), of tweerigting ANOVA gevolg deur Tukey se veelvoud vergelykingstoets (vir multi-groep, twee-faktor vergelyking). Nie-normaal verspreide datastelle is getoets deur nie-parametriese Mann – Whitney-toets (vir twee-groep, een-faktor vergelyking) of Kruskal-Wallis-toets, gevolg deur Dunn se meervoudige vergelykingstoets (vir vergelyking met een groep, een faktor). Kumulatiewe waarskynlikheidskurwes is vergelyk met behulp van Mann-Whitney/Wilcoxon se toets. Statistiese betekenisvolheid is aangedui deur P waardes: *P < 0,05, **P & lt 0,01, en ***P & lt 0,001.


35.2E: Sinaptiese Plastisiteit - Biologie

Genetiese kaartposisie - 3R: 105,906..128,309 [+]

SNARE-gemedieerde sinaptiese eksositose word georkestreer deur fasiliterende en inhiberende meganismes. Genetiese ablasies van Complexins, 'n familie van SNARE-kompleks-bindende proteïene, in muise en Drosophila veroorsaak blykbaar teenoorgestelde effekte op neurotransmitter vrystelling, wat lei tot teenstrydige hipoteses van Complexin funksie. Rekonstitusie-eksperimente met verskillende samesmeltingstoetse en kompleksiene lewer ook teenstrydige resultate. Kruis-spesie redding eksperimente is dus uitgevoer om die funksies van muriene en Drosophila kompleksiene in beide muis en vlieg sinapse te vergelyk. Daar is gevind dat murine en Drosophila Complexins bewaarde meganismes gebruik om eksositose te reguleer ten spyte van hul opvallend verskillende algehele effekte op die vrystelling van neurotransmitter. Beide muis- en vlieëkompleksiene bevat verskillende gebiede wat sinaptiese vesikelsmelting vergemaklik of belemmer, en die sterkte van elke fasiliterende of inhiberende funksie verskil aansienlik tussen hulle.Hierdie resultate toon dat 'n relatiewe verskuiwing in die balans van fasiliterende en inhiberende funksies lei tot differensiële regulering van neurotransmittervrystelling deur muriene en Drosophila-kompleksiene in vivo, wat vorige onversoenbare bevindings versoen (Xue, 2009).

SNARE (oplosbare N-etielmaleimied-sensitiewe faktor-aanhegsel proteïenreseptor) -gemiddelde sinaptiese vesikel-eksositose word streng beheer deur 'n groot aantal regulerende proteïene om die uitstekende tydelike en ruimtelike presisie van die vrystelling van neurotransmitter by sinapse te verseker. Kompleksiene vorm 'n familie van klein en hoog gelaaide proteïene wat bind aan die saamgestelde SNARE -kompleks (Ishizuka, 1995 McMahon, 1995 Reim, 2005 Takahashi, 1995). Hulle bevat oor die algemeen 'n sentrale α-heliks en 'n bykomstige α-heliks in die middelste gedeelte van die proteïen, en die N- en C-terminale rye wat waarskynlik grootliks ongestruktureerd is (Pabst, 2000). Kompleksiene bind met hoë affiniteit aan die SNARE-kompleks (Bowen, 2005 Pabst, 2002). Die sentrale helix van Complexins het 'n antiparallelle interaksie met die SNARE-motiewe van Syntaxin-1 (sien Drosophila Syntaxin) en Synaptobrevin-2 binne die SNARE-kompleks (Bracher, 2002 Chen, 2002). Kompleksiene kan ook bind aan die heterodimer van die target-SNAREs (Syntaxin-1 en SNAP-25) met 'n laer affiniteit (Guan, 2008 Weninger, 2008 Yoon, 2008 Xue, 2009 en verwysings daarin).

Biofisiese en fisiologiese studies het verskillende funksies vir komplekse in vesikelsmelting aangedui, waarvan sommige onversoenbaar is (Brose, 2008). Daar is getoon dat kompleksliene SNARE-gemedieerde selversmelting (Giraudo, 2006) en proteoliposoom-samesmelting in grootmaat-ensemble-toetsing (Schaub, 2006) inhibeer, en hierdie remming word vrygestel deur die Ca 2+ sensor Synaptotagmin-1 (sien Drosophila Synaptotagmin) en Ca 2+. Biochemies ding Synaptotagmin -1 mee met Complexins om die SNARE -kompleksbinding en verplaas Complexins van die SNARE -kompleks op 'n Ca 2+ -afhanklike manier (Tang, 2006). Hierdie studies dui op 'n fusieklemmodel vir Complexin -funksie, waarin Complexins die oordrag van die krag wat deur die SNARE -komplekse samestelling gegenereer word na die smeltmembrane belemmer en sinaptiese vesikelsmelting stop voor Ca 2+ -invloei. By Ca 2+ binding verplaas Synaptotagmin-1 Complexins uit die SNARE kompleks om hierdie inhibisie vry te stel en veroorsaak eksositose (Giraudo, 2006 Maximov, 2009 Schaub, 2006 Tang, 2006). Daar is egter ook getoon dat kompleksiene proteoliposoomsamesmelting stimuleer in beide enkelvesikelsamesmeltingstoets (Yoon, 2008) en grootmaat-ensembletoets (Malsam, 2009), wat 'n fasiliterende rol aandui. Hierdie in vitro -resultate word verder verwar deur in vivo genetiese studies. Genetiese uitklophou van Komplekse by muise lei tot 'n afname in beide opgewekte en spontane vrystelling by veelvoudige glutamatergiese en GABAergiese sinapse in kulture en in akute breinskywe (Reim, 2001 Strenzke, 2009 Xue, 2008), en 'n afname in Ca 2+ -gerigte eksositose in bynierchromaffien selle (Cai, 2008), wat 'n stimulerende funksie vir Komplexiene ondersteun. Daarteenoor, genetiese uitwissing van Kompleks in vrugtevlieg Drosophila melanogaster verhoog die spontane vrystelling aansienlik, maar verminder die vrystelling van Ca 2+ (Huntwork, 2007), wat die fusieklem -model bevoordeel. Boonop verminder die afbreek van Komplexiene deur RNA-interferensie in massakultuurde muiskortikale neurone die ontlokte vrystelling en verhoog die spontane vrystelling by glutamatergiese sinapse (Maximov, 2009). Om die verskil tussen hierdie resultaat en dié wat voorheen verkry is te verduidelik Kompleksien uitklopmuise, stel die skrywers (Maximov, 2009) voor dat dit te wyte is aan die verskillende preparate wat gebruik word (autaptiese kulture vir uitklopstudies [Reim, 2001 Xue, 2008) teenoor massakulture vir uitklopstudie (Maximov, 2009), wat die feit ontken dat die uitklopstudies het ook massakulture en akute breinskywe gebruik (Xue, 2008), en soortgelyke resultate is gevind as dié van outaptiese kulture. Daarom lyk baie studies in stryd met mekaar en is die presiese in vivo rol van komplekse by eksositose nog onduidelik (Xue, 2009).

'n In vivo struktuurfunksie-analise van muriene Complexin I (CplxI) in Complexin I/II dubbele uitklopmuisneurone dui aan dat die SNARE -komplekse binding noodsaaklik is vir CplxI -funksie, en dat die N -terminus van CplxI die vrylating vergemaklik, terwyl 'n bykomende helix tussen die N terminus en die sentrale α helix vrystelling belemmer (Xue, 2007 ). ’n Biofisiese studie onthul dat CplxI SNARE-kompleksvorming inhibeer, maar membraansamesmelting sterk stimuleer na die samestelling van die SNARE-kompleks in vitro (Yoon, 2008). Hierdie studies dui daarop dat kompleksiene beide fasiliterende en inhiberende rolle in eksositose speel, maar dit verklaar steeds nie hoekom genetiese delesies van Komplekse in twee modelorganismes, muis en vlieg, het sulke verskillende effekte op die vrystelling van neurotransmitter. Verder is die aminosuurvolgordehomologie laag tussen muriene en Drosophila-kompleksiene behalwe vir die sentrale α-heliks wat noodsaaklik is vir die binding aan die SNARE-kompleks, en deel van die N-terminus. Dus, die dramatiese verskil in verlies aan funksie fenotipes van Kompleks-gebrekkige muise en vlieë lei tot die gevolgtrekking dat Complexin-funksie tussen muise en vlieë moet verskil (Xue, 2009).

Om te toets of die funksies van murine en Drosophila Complexins behoue ​​bly in sinaptiese vesikel -eksositose, en om insig te kry in die funksionele en strukturele verskille daarvan, is dit noodsaaklik om murine en Drosophila Complexins in dieselfde eksperimentele in vivo stelsels te vergelyk. 'N Gedetailleerde struktuur-funksie-analise is ook nodig omdat 'n volledige verwydering van Complexins onwaarskynlik is om alle aspekte van hul funksie te openbaar (Xue, 2007). Daarom is 'n sistematiese kruis-spesie-reddingsbenadering onderneem om die funksies van murine en Drosophila Complexins by beide muis- en vlieë-sinapse te vergelyk. Daar is gevind dat muriene sowel as Drosophila -kompleksiene verskillende funksionele domeine bevat en dubbele rolle speel in die vrystelling van neurotransmitter. Hulle vergemaklik en belemmer vrystelling via soortgelyke domeine, maar die fasiliterende of remmende sterkte van 'n gegewe domein wissel tussen murine en Drosophila Complexins. Sowel murine as Drosophila -kompleksiene gebruik bewaarde meganismes in die vrystellingsproses, maar die integrasie van fasilitering en inhibisie verskil wesenlik tussen hulle, wat lei tot 'n oënskynlik teenoorgestelde algehele effek op eksositose. Hierdie resultate onthul bewaarde funksies van komplekse tussen spesies en dui aan dat die wisselwerking van dubbele funksies die vrystelling van neurotransmitter orkestreer (Xue, 2009).

Sinaptiese eksositose word uitstekend beheer deur 'n stel fasiliterende en inhiberende meganismes, waarvan sommige dikwels deur dieselfde proteïen uitgevoer word (Rizo, 2008). As 'n sleutelreguleerder van die vrystellingsmasjinerie, speel kompleksiene beide fasiliterende en inhiberende rolle in vesikelsamesmelting deur verskillende meganismes (Xue, 2007 Yoon, 2008). Die merkwaardige fenotipiese verskil tussen muis en vlieë Kompleksien nul diere het onverklaarbaar gebly. Hierdie werk vergelyk die funksies van murine en Drosophila Complexins in kruis-spesie-reddingseksperimente. Die data bevestig dat murine en Drosophila Complexins 'n stel bewaarde meganismes in sinaptiese vesikelsmelting deel (Xue, 2009).

Eerstens is die SNARE-kompleksbinding wat bemiddel word deur die sentrale α helix (residue 48-70 vir CplxI en 54-76 vir dmCplx) noodsaaklik vir Complexin-funksie. Mutasies wat die interaksie tussen die sentrale α helix en die SNARE-kompleks verminder, skakel die funksies van beide CplxI (Xue, 2007) en dmCplx af, wat aandui dat die aksies van ander domeine alles afhang van hierdie interaksie met hoë affiniteit. Die binding van die sentrale α helix kan nie net die saamgestelde SNARE -kompleks stabiliseer nie (Chen, 2002), maar miskien nog belangriker, kan die bykomende helix en die N -terminus vir hul optrede strategies geplaas word (Xue, 2007 Xue, 2009 en verwysings daarin).

Tweedens, die bykomstige α-heliks (ongeveer residue 29-47 vir CplxI en 33-53 vir dmCplx) geleë tussen die N-terminus en die sentrale α-heliks inhibeer vesikelfusie. Daar word voorgestel dat die remmende werking van die bykomende helix ontstaan ​​as gevolg van die inmenging daarvan met die binding van Synaptobrevin-2 aan Syntaxin-1 en SNAP-25 heterodimer, wat gevolglik die volledige rits van die SNARE-kompleks sou verhoed (Xue, 2007). Hierdie model is onlangs ondersteun deur die bevindinge dat Complexins in vitro aan Syntaxin-1 en SNAP-25 heterodimeer kan bind (Guan, 2008 Weninger, 2008 Yoon, 2008) en 'n alternatiewe vier-heliks-bundel met teiken-SNARE's kan vorm om te inhibeer samesmelting in 'n hersaamgestelde samesmeltingstelsel (Giraudo, 2009 Xue, 2009 en verwysings daarin).

Derdens bevorder die N termini (residue 1-16) van beide CplxI en dmCplx vrystelling. Daar is bespiegel dat die CplxI N-terminus met lipiedmembrane kan interaksie hê (Maximov, 2009 Xue, 2007), maar tot dusver is daar geen ondersteunende biochemiese data nie. In plaas daarvan word hierdie fasiliterende effek waarskynlik bemiddel deur 'n direkte interaksie van die Complexin N -terminus met die SNARE -kompleks C -terminus. Mutasies van metionien 5 en lysien 6 van CplxI ontwrig die binding van die CplxI N -terminus aan die SNARE -kompleks C -terminus en skaf die fasiliterende aktiwiteit van die N -terminus af. Interessant genoeg word metionien 5 nie in dmCplx bewaar nie en 'n alanienresidu is op posisie 6 (wat ooreenstem met residu 5 van CplxI). Dit is moontlik dat 'n metionien nie absoluut nodig is vir dmCplx nie en ander residue kan kompenseer vir die interaksie met die SNARE-kompleks C-terminus (Xue, 2009).

Boonop bevorder muriene en Drosophila -kompleksplekke by vlieg neuromuskulêre aansluitings Ca 2+ -gerigte vrystelling en onderdruk spontane vrystelling, maar in baie verskillende grade. Neuronale uitdrukking van murine of Drosophila Complexins red die dodelikheid en steriliteit van Kompleks nul mutante vlieë, wat weer toon dat murine en Drosophila Complexins bewaarde funksies deel (Xue, 2009).

Daarom wys hierdie kruis-spesie-reddingseksperimente dat murine en Drosophila Complexins beide fasiliterende en inhiberende funksies het wat verband hou met soortgelyke proteïendomeine in sinaptiese vesikel-eksositose. Daar word voorgestel dat die Complexin central α helix bind aan die middelste gedeelte van die SNARE -kompleks, stabiliseer die SNARE -kompleks en plaas die bykomende α helix en die N terminus (Chen, 2002 Xue, 2007). Die bykomende α helix vervang die C-terminus van die Synaptobrevin-2 SNARE-motief in die bundel met vier heliks, wat voorkom dat die volledige samestelling van die SNARE-kompleks fusie onderdruk (Giraudo, 2009 Xue, 2007). Die N-terminus is direk in wisselwerking met die C-terminale gedeelte van die SNARE-kompleks, wat waarskynlik hierdie onstabiele streek van die SNARE-kompleks stabiliseer om membraanfusie te bevorder. Die relatiewe sterkpunte van hierdie funksies verskil egter merkwaardig tussen muriene en Drosophila-kompleksiene. Daar word voorgestel dat die integrasie van fasilitering en inhibisie, wat met verskillende domeine geassosieer word, die algehele effek van murine en Drosophila Complexins op die vrystelling van neurotransmitter in 'n gegewe sinaps bepaal. Dit is onwaarskynlik dat die algehele werking van murine en Drosophila Complexins 'n lineêr additiewe effek van alle fasiliterende en inhiberende aksies sal wees. Dit is egter duidelik dat die fasiliterende funksie oorheersend is by murine -komplekse, terwyl die remmende funksies van die bykomende helix en die C -terminus oorheers in Drosophila Complexin. 'N Relatiewe verskuiwing in die balans van fasiliterende en inhiberende funksies lei dus tot verskillende rolle van murine en Drosophila Complexins in die vrystelling van neurotransmitter, en lei tot skynbaar baie verskillende funksionele funksionele funksies by vlieë en muise. Hierdie resultate beklemtoon die funksionele ooreenkomste en verskille tussen muriene en Drosophila-kompleksiene, en versoen vorige teenstrydige hipoteses van Complexin in vivo-funksie (Cai, 2008 Huntwork, 2007 Reim, 2001 Xue, 2008). Boonop illustreer die data die kompleksiteit van Complexin -funksie en ondersteun dit sterk die idee dat Complexins dubbele rolle speel in vesikelsmelting (Xue, 2009).

Hierdie model verskil duidelik van die vorige modelle van Complexins gebaseer op die fusieklemhipotese (Giraudo, 2006 Maximov, 2009 Schaub, 2006 Tang, 2006). Hierdie modelle stel voor dat kompleksiene geprimeerde sinaptiese vesikels arresteer by 'n hemifused en metastabiele toestand, wat die substraat verskaf vir Ca 2+ -gebonde Synaptotagmin-1 om die klemfunksie van kompleksiene vry te stel, wat die vinnige en sinchrone samesmelting moontlik maak. Die gebrek aan kompleksiene en dus die gebrek aan metstabiele vesikels vir Synaptotagmin-1-aksie veroorsaak oormatige spontane vrystelling en gebrekkige Ca 2+ -geaktiveerde vinnige vrystelling. Die huidige in vivo -resultate spreek egter teen hierdie model omdat muriene komplekse nie die oormatige spontane vrystelling in Drosophila heeltemal onderdruk nie. Kompleks nul mutante, maar dit verbeter eintlik die vinnige vrystelling van Ca 2+ selfs beter as Drosophila Complexin. Hierdie waarneming dui aan dat die verminderde Ca 2+ vinnige vrystelling by Drosophila veroorsaak Kompleksien nulmutante is nie funksioneel gekoppel aan die verhoogde frekwensie van spontane vrylating nie. Kan dit wees dat die verminderde vrylating in Drosophila ontlok het Kompleks nul mutante te wyte is aan 'n gedeeltelike uitputting van veselblare wat vrygestel kan word deur die spontane vrystelling van hoë frekwensies? Dit is onwaarskynlik omdat die vesikelwerwingstempo gewoonlik ten minste 100-voudig hoër is as die spontane vrystellingstempo op rustende intrasellulêre Ca 2+ vlak, en daarom behoort 'n 20- tot 30-voudige toename in spontane vrystellingstempo nie die vesikelpoel beduidend te verander nie. grootte in Drosophila Complexin nul mutante. Daarbenewens word murine-kompleksin gered Drosophila Complexin nul-sinapse toon steeds sterk verhoogde spontane vrystelling, maar die opgewekte vrystelling is selfs groter as dié van WT-sinapse, met die argument dat hoëfrekwensie spontane vrystelling in nulmutante waarskynlik nie vesikels sal uitput nie, wat 'n verminderde opgewekte vrystelling veroorsaak (Xue, 2009).

'n Onlangse samesmeltingsklemmodel stel voor dat kompleksiene die kragoordrag vanaf die SNARE-kompleks na die membrane beheer en die SNARE's help om krag op die membrane uit te oefen (Maximov, 2009). Hierdie model veronderstel dat Complexins deur Synaptotagmin-1 en Ca 2+ uit die SNARE-kompleks vrygestel word, maar dit is fisies onduidelik hoe Complexins kan help om SNARE krag op die membrane uit te oefen as hulle gedissosieer word by Ca 2+ instroming. In teenstelling hiermee vereis die huidige model dat Complexins gebind bly aan die SNARE-kompleks by Ca 2+ -invloei en dit stem ooreen met die idee dat Complexins onafhanklik van Synaptotagmin-1 kan funksioneer (Xue, 2009).

Drosophila Complexin in Cplx-TKO-neurone skrap beide opgewekte en spontane vrystelling sonder om die aantal fusiebevoegde vesikels te verander wat gemeet word met hipertoniese sukrose-oplossing. Hierdie effek is interessant, want baie min molekulêre manipulasies blokkeer spesifiek die sinaptiese vesikelsiklus tydens die laaste fusiestap. Drosophila Complexin verander nie die aantal geperste vesikels nie, wat daarop dui dat die aanvanklike vorming van die SNARE -kompleks nie deur Drosophila Complexin beïnvloed word nie. Die remmende effek van Drosophila Complexin vereis die binding daarvan aan die SNARE -kompleks. Daarom word die hipotese veronderstel dat wanneer die Drosophila Complexin sentrale α-heliks aan die gedeeltelik saamgestelde SNARE-kompleks bind, die bykomstige α-heliks saam met die C-terminus die verdere samestelling van die SNARE-kompleks C-terminus verhoed, en sodoende vesikels by die geprimeerde toestand. Dit is tans onbekend hoe meganisties die C-terminus van Drosophila Complexin vrystelling inhibeer. Een moontlikheid is dat die C-terminus kan terugvou na die N-terminale rigting en saamwerk met die bykomstige α-heliks om vesikelfusie te inhibeer (Xue, 2009).

Die fenotipiese verskille tussen vlieg- en muisuitklophoue lyk dramaties, maar dit is opmerklik dat 'n toename van net 1,4 kcal/mol in die sterkte van 'n proteïen-proteïen-interaksie, wat bloot kan ontstaan ​​uit die vorming van een waterstofbinding of soutbrug, lei tot 'n 10-voudige toename in affiniteit volgens die Boltzmann-vergelyking. Daarom kan subtiele veranderinge in die molekulêre interaksies van murine en Drosophila Complexins voldoende wees om die balans tussen fasiliterende en inhiberende sterk punte te versterk. Byvoorbeeld, proteïenvolgorde-belyning toon aan dat die lengtes en die aminosuur-samestellings van die bykomende helixse verskil tussen verskillende komplekse, wat verskillende interaksies van die bykomende helix met Syntaxin-1 en SNAP-25 heterodimer kan veroorsaak. die inhiberende sterkte daarvan te verander (Xue, 2009).

Die gevolge van murine -komplekse in murine- en vliegsinapse is nie identies nie, aangesien murine -kompleksins ontlokte vrylating bevorder en spontane vrystelling in vliegneuromuskulêre aansluitings belemmer, en beide tipes vrystelling in sentrale sinapse van die muis bevorder. Net so is die effekte van Drosophila Complexin in muriene en vlieg sinapse ook nie identies nie, aangesien dit spontane vrystelling sterk inhibeer en liggies opgewekte vrystelling in vlieg neuromuskulêre aansluitings bevorder, en beide tipes vrystelling in muis sinapse sterk inhibeer. Hierdie waarnemings dui aan dat, benewens die kompleksin-intrinsieke eienskappe, die molekulêre verskille tussen spesies of sinapse die fasiliterende en inhiberende funksies van murine en Drosophila Complexins differensieel kan beïnvloed, en sodoende die fasiliterings- en remmingsbalans kan kantel en kan bydra tot die fenotipiese verskille (Xue, 2009).

Kompleksiene verteenwoordig 'n familie van proteïene wat 'n hoogs gekonserveerde kern van volgordes handhaaf en terselfdertyd groot diversiteit oor paraloë en ortoloë vertoon (Huntwork, 2007 Reim, 2005). Dit word waarskynlik weerspieël in hul funksies, naamlik bewaarde fasiliterende en inhiberende meganismes met verskillende sterkpunte in die vrystelling van neurotransmitter. Dit sal interessant wees om Complexin-funksie in sommige ander model-organismes langs die filogenetiese boom, soos wurm en visse, te toets om te bepaal of en hoe die balans tussen fasiliterende en inhiberende funksies van Complexins tydens evolusie verander het. By verskillende sinapse kan die sterkpunte van die fasilitering en inhibisie van Complexins differensieel gereguleer word op 'n paralog- en ortoloog-afhanklike manier, waardeur die vrystelling op 'n sinaps-spesifieke manier gereguleer word en kan bydra tot sinaptiese diversiteit en spesifisiteit. Verder bied die vermoë van Drosophila Complexin om die vrystelling van neurotransmitter in neurone van soogdiere te belemmer, 'n kragtige instrument om sinaptiese funksie te manipuleer om neurale stroombane te bestudeer, aangesien u Drosophila Complexin moet kan uitdruk om sinaptiese oordrag in 'n ruimtelik en tydelik spesifieke te inhibeer of selfs af te skaf. manier (Xue, 2009).

Fosforilering van Complexin deur PKA reguleer aktiwiteitsafhanklike spontane neurotransmittervrystelling en strukturele sinaptiese plastisiteit

Sinaptiese plastisiteit is 'n fundamentele kenmerk van die senuweestelsel wat aanpassing by veranderende gedragsomgewings moontlik maak.Die meeste studies oor sinaptiese plastisiteit het die gereguleerde handel met postsynaptiese glutamaatreseptore ondersoek wat veranderinge in sinaptiese oordrag veroorsaak. Of en hoe veranderinge in die presinaptiese vrystelling masjinerie bydra tot neuronale plastisiteit is minder duidelik. Die SNARE-kompleks bemiddel neurotransmitter vrystelling in reaksie op presinaptiese Ca(2+) toetrede. Hierdie studie toon dat die SNARE-fusieklem Complexin aktiwiteitsafhanklike fosforilering ondergaan wat die basiese eienskappe van neurotransmissie in Drosophila verander. Retrograde sein na stimulasie aktiveer PKA-afhanklike fosforylering van die Complexin C-terminus wat die spontane vrystelling selektief en kortstondig verbeter. Verbeterde spontane vrystelling is nodig vir aktiwiteitsafhanklike sinaptiese groei. Hierdie data dui aan dat SNARE-afhanklike samesmeltingsmeganismes op 'n aktiwiteitsafhanklike wyse gereguleer kan word en beklemtoon die sleutelrol van spontane neurotransmittervrystelling as bemiddelaar van funksionele en strukturele plastisiteit (Cho, 2015).

Hierdie bevindinge dui aan dat die SNARE-bindende proteïen Cpx 'n sleutel PKA teiken is wat spontane samesmeltingstempo's en presinaptiese plastisiteit by Drosophila NMJs reguleer. Cpx se funksie kan gewysig word om aktiwiteitsafhanklike funksionele en strukturele plastisiteit te reguleer. In vivo-eksperimente wat Cpx-fosfomimetiese reddings gebruik, demonstreer dat Cpx-fosforilering by residu S126 selektief sy vermoë verander om as 'n sinaptiese vesikelfusieklamp op te tree. Boonop is S126 van kritieke belang vir die uitdrukking van HFMR, 'n aktiwiteitsafhanklike vorm van akute funksionele plastisiteit wat die minifrekwensie by Drosophila-sinapse moduleer. Hierdie data dui aan dat 'n Syt 4-afhanklike retrograde seinweg konvergeer op Cpx om die sinaptiese funksie daarvan te reguleer. Daarbenewens is gevind dat verhoogde spontane fusietempo's korreleer met verbeterde sinaptiese groei. Hierdie roete vereis Syt 4 retrograde sein om die spontane vrystelling te verbeter en om sinaptiese groei te veroorsaak. Boonop is die Cpx S126 PKA-fosforileringsterrein nodig vir aktiwiteitsafhanklike sinaptiese groei, wat daarop dui dat akute regulering van mini's via Cpx-fosforilering waarskynlik bydra tot strukturele sinaptiese plastisiteit. Saam identifiseer hierdie data 'n nuwe meganisme van akute sinaptiese plastisiteit wat direk op die presynaptiese vrystellingsmasjinerie inwerk om spontane vrystellingsnelhede en sinaptiese rypwording te reguleer (Cho, 2015).

Hoe verander akute fosforilering van S126 Cpx se funksie? Die Cpx C-terminus assosieer met lipiedmembrane deur 'n prenyleringsdomein (CAAX-motief) en/of die teenwoordigheid van 'n amfipatiese heliks. Die Drosophila Cpx isovorm wat in hierdie studie gebruik word (Cpx 7B) het nie 'n CAAX-motief nie, maar bevat 'n C-terminale amfipatiese heliks omring deur die S126-fosforileringsplek. S126-fosforilering verander nie sinaptiese teiken van Cpx of sy vermoë om met SNARE-komplekse in vitro te assosieer nie. As sodanig kan fosforilering eerder interaksies van die amfipatiese heliksstreek met lipiedmembrane verander en/of Cpx-interaksies met ander proteïene verander wat sinaptiese vrystelling moduleer. Gegewe die gevestigde rol van die Cpx C-terminus in die regulering van membraanbinding en sinaptiese veselbinding van Cpx, word voorspel dat fosforilering op hierdie webwerf die subsellulêre lokalisering van die proteïen en die toeganklikheid daarvan vir die SNARE-kompleks kan verander. By liposoombinding is egter geen groot verskille tussen WT Cpx en CpxS126D waargeneem nie. Dit is onwaarskynlik dat hierdie toets subtiele veranderinge in lipiedinteraksies deur Cpx sal openbaar, aangesien hierdie studie bevind het dat C-terminale delesies (CTD) sy vermoë om membrane te bind behou. Die vermoë van die CTD -weergawes van Drosophila Cpx om met liposome te assosieer, is anders as wat waargeneem word C. elegans Cpx, en dui aan dat domeine buite Drosophila Cpx se C-terminus ook bydra tot lipiedmembraanassosiasie, wat moontlik die gevolge van S126-fosforylering wat in vivo kan voorkom, verdoesel. Alternatiewelik kan fosforilering van die Cpx C-terminus sy assosiasie met ander SNARE komplekse modulators soos Syt 1 (Cho, 2015) verander.

Die data dui aan dat verbeterde mini's sinaptiese groei reguleer deur verskeie voorheen geïdentifiseerde NMJ -rypwyse. Die Wit -seinroete is nodig vir sinaptiese groei op die agtergrond van verbeterde mini's. Die verstand geen kodeer vir 'n presinaptiese tipe II BMP -reseptor wat retrograde, transsynaptiese BMP -seine van postsynaptiese spiere ontvang. In ooreenstemming met hierdie data het ander studies getoon dat stroomaf seinkomponente van die BMP-pad nodig en voldoende is vir mini-afhanklike sinaptiese groei by die Drosophila NMJ. Daarbenewens is gevind dat die postsinaptiese Ca++ sensor, Syt 4, nodig is vir die bevordering van spontane vrystelling en die verhoging van sinaptiese groei. Die data onderskei tans nie die interafhanklikheid van die BMP- en Syt 4-retrograde seinweë nie, en ander retrograde seinweë kan ook bydra tot mini-afhanklike sinaptiese groei. Onlangs is verskeie retrograde paaie geïdentifiseer wat funksionele homeostatiese plastisiteit by die Drosophila NMJ reguleer. Daar sal toekomstige werk nodig wees om die retrograde seinweë volledig te definieer wat nodig is om mini-afhanklike sinaptiese groei te bemiddel (Cho, 2015).

Hoe kan verhoogde spontane vrystelling deur Cpx-fosforilering sinaptiese groei reguleer? Daar word veronderstel dat die oorskakeling in sinaptiese vesikelvrystellingsmodus na 'n konstitutiewe samesmeltingsweg wat oor 'n paar minute na stimulasie plaasvind, as 'n sinaptiese merkmeganisme dien. Deur voort te gaan om postsynaptiese glutamaatreseptore te aktiveer in die afwesigheid van inkomende aksiepotensiale, sou die verhoging van die mini -frekwensie dien om die postsynaptiese kalsiumvlakke te verbeter deur die stimulering van glutamaatreseptore te verleng. Dit sou die terugwaartse sein wat die stroomaf -kaskades inisieer, verleng om die sitoskeletale argitektuur wat nodig is vir sinaptiese bouton -bot direk te verander. Aangesien verhoogde frekwensies van spontane samesmelting steeds voorkom cpx en syx3-69 in die afwesigheid van Syt 4- en BMP-sein, maar sinaptiese oorgroei word in hierdie toestande onderdruk, is dit onwaarskynlik dat spontane samesmelting self sinaptiese groei direk dryf. Die verbygaande verbetering in spontane vrystelling kan eerder dien om postsinaptiese kalsiumseine te verleng wat verskillende effektore vir strukturele hermodellering betrek wat nie geaktiveer word in die afwesigheid van verhoogde spontane vrystelling nie. Resultate van soogdierstudies dui aan dat spontane vrystelling die postsynaptiese proteïenvertaling op 'n unieke manier kan reguleer en verskillende populasies van NMDA -reseptore kan aktiveer in vergelyking met ontlokte vrystelling, dus is dit moontlik dat spontane samesmelting ook unieke postsynaptiese effektore by Drosophila NMJ's kan aantrek (Cho, 2015).

In die afgelope paar dekades het intensiewe navorsingspogings verskeie molekulêre meganismes van klassieke Hebbiese vorme van sinaptiese plastisiteit, wat langtermynversterking (LTP) en langtermyn depressie (LTD) insluit, veranderings in sinaptiese funksie wat van minute tot ure duur. Die mees bestudeer uitdrukkingsmeganisme vir hierdie vorme van sinaptiese plastisiteit behels modulasie van die post-sinaptiese AMPA-tipe glutamaatreseptorfunksie (AMPAR) en membraanhandel. In teenstelling hiermee bly molekulêre meganismes van korttermyn sinaptiese plastisiteit swak verstaan. Verskeie vorme van plastisiteit op kort termyn is beskryf, soos post-tetaniese versterking (PTP), wat stimulasie-afhanklike toenames in sinaptiese sterkte behels, insluitend veranderinge in mini-frekwensie. Korttermyn plastisiteitsuitdrukking sal waarskynlik die veranderinge aan die presinaptiese vrystellingsmasjinerie stroomaf van geaktiveerde effektormolekules beïnvloed. Byvoorbeeld, Munc 18, 'n presynaptiese proteïen wat betrokke is by die aanvangstap van vesikel-eksositose via sy vermoë om met lede van die SNARE-masjinerie te assosieer, word dinamies gereguleer deur Ca ++-afhanklike proteïenkinase C (PKC), en die regulering daarvan is nodig om uit te druk PTP by die kelk van gehou. Hierdie studie demonstreer dat die presinaptiese vesikelsamesmeltingsmasjinerie ook direk gewysig kan word om spontane neurotransmissie te verander deur aktiwiteitsafhanklike wysiging van Cpx-funksie deur PKA. Proteïenkinase CK2 en PKC fosforileringsterreine binne die C-terminus van soogdiere en C. elegans Cpx is geïdentifiseer. Daarom kan aktiwiteitsafhanklike regulering van Cpx-funksie via C-terminale fosforilering 'n evolusionêr bewaarde meganisme wees om sinaptiese plastisiteit te reguleer. Boonop kan Cpx stroomaf van verskeie effektorpaaie lê om verskillende vorme van plastisiteit op kort termyn, insluitend PTP, op 'n sinaps-spesifieke manier te moduleer. Interessant genoeg word Cpx beide voor- en postsynapties uitgedruk in soogdierhippokampale neurone en moet LTP uitgedruk word via regulering van AMPAR-aflewering na die sinaps, wat daarop dui dat Cpx-gemedieerde sinaptiese plastisiteitsuitdrukkingsmeganismes ook postsynapties kan plaasvind (ACho, 2015 en verwysings daarin).

Samevattend dui hierdie resultate aan dat mini's dien as 'n onafhanklike en gereguleerde neuronale sein wat bydra tot aktiwiteitsafhanklike sinaptiese groei. Vorige studies het bevind dat Cpx se funksie as 'n fasiliteerder en klem vir sinaptiese vesikelfusie geneties skeibaar is, wat duidelike molekulêre meganismes demonstreer wat opgewekte en spontane vrystelling reguleer. Ontwaakte en spontane vrystelling kan ook geskei word buite die Cpx -regulering, aangesien ander studies getoon het dat mini's verskillende komponente van die SNARE -masjinerie, afsonderlike vesikelpoele en afsonderlike individuele sinaptiese vrystellingsplekke kan gebruik. Hierdie bevindinge dui op uiteenlopende reguleringsmeganismes vir spontane vrystelling wat selektief gemoduleer kan word by spesifieke sinapse (Cho, 2015).

Stikstofoksied-gemedieerde posttranslasionele modifikasies beheer die vrystelling van neurotransmitter deur die kompleks in farnesylering te moduleer en die klemvermoë daarvan te verbeter

Stikstofoksied (NO) reguleer neuronale funksie en is dus van kritieke belang vir die afstemming van neuronale kommunikasie. Meganismes waardeur NO proteïenfunksie en interaksie moduleer, sluit in posttranslasionele modifikasies (PTM's) soos S-nitrosilering. Belangrik is dat kruissignaal tussen S-nitrosylering en prenylering groot regulatoriese potensiaal kan hê. Die presiese proteïenteikens en gevolglike veranderinge in funksie bly egter ontwykend. Hierdie studie het die rol van NO-afhanklike PTM's en farnesylering in sinaptiese oordrag ondervra. Daar is bevind dat GEEN sinaptiese funksie by die Drosophila neuromuskulêre aansluiting (NMJ) op 'n cGMP-onafhanklike manier benadeel nie. GEEN het vrystelling onderdruk en die grootte van beskikbare vesikelpoele verminder, wat deur glutathion (GSH) omgekeer is en deur genetiese opregulering van GSH-genererende en de-nitrosilerende glutamaat-sisteïen-ligase en S-nitroso-glutathionreduktase-aktiwiteite afgesluit is. Verbeterde nitrergiese aktiwiteit het gelei tot S-nitrosilering van die fusie-klem proteïenkompleksien (kpx) en die membraanassosiasie en interaksies daarvan met die aktiewe sone (AZ) en oplosbare N-etiel-maleimied-sensitiewe samesmeltingsproteïen Attachment Protein Receptor (SNARE) proteïene verander. Verder genetiese en farmakologiese onderdrukking van farnesylering en 'n nitrosylering mimetiese mutant van cpx identiese fisiologiese en lokalisasie fenotipes geïnduseer soos veroorsaak deur NO. Saam lewer hierdie gegewens bewys van 'n nuwe fisiologiese nitrergiese molekulêre skakelaar wat S-nitrosylering behels, wat farnesilering omkeerbaar onderdruk en sodoende die netklemfunksie van cpx. Hierdie data illustreer 'n nuwe meganistiese seinweg waardeur regulering van farnesylering sinaptiese vrystelling kan verfyn (Robinson, 2018).

Deur die hele sentrale senuweestelsel (SSS) is die volumestuurder stikstofoksied (NO) betrokke by die beheer van die sinaptiese funksie deur verskeie meganismes, insluitend modulasie van die vrystelling van die sender, plastisiteit of neuronale prikkelbaarheid. Veral NO-gemedieerde posttranslasionele modifikasies (PTMs) het toenemend erken as reguleerders van spesifieke teikenproteïene. S-nitrosilering is 'n nie-ensiematiese en omkeerbare PTM wat lei tot die toevoeging van 'n NO-groep tot 'n sisteïen (Cys) tiol/sulfhidrielgroep, wat lei tot die generering van S-nitrosothiole (SNO's). Ten spyte van die groot aantal SNO-proteïene wat tot dusver geïdentifiseer is, is die funksionele uitkomste en meganismes van die onderliggende spesifisiteit van S-nitrosilering in terme van teikenproteïene en Cys-reste binne hierdie proteïene nie duidelik nie (Robinson, 2018).

Sinaptiese sendervrystelling word beheer deur veelvuldige seinproteïene en behels 'n kaskade van seinstappe. Hierdie proses verg die oplos van die oplosbare N-etiel-maleimied-sensitiewe samesmeltingsproteïen Attachment Protein Receptor (SNARE) kompleks en gepaardgaande proteïene, waarvan die meerderheid gereguleer kan word om die sinapsfunksie te moduleer. Regulerende meganismes sluit in fosforilering van SNARE-proteïene sowel as SNARE-bindende proteïene soos Complexin (Cpx), wat by verskillende sinapse soos die Drosophila neuromuskulêre aansluiting (NMJ) of in die rot SSS aangemeld is (Robinson, 2018).

Verskeie kontrasterende effekte op die vrystelling van die sender word veroorsaak deur NO-gemedieerde PTM's. Ander vorme van proteïenmodifikasie om sellulêre sein te moduleer, sluit in prenylering, 'n aanhegting van 'n farnesiel- of geraniel-geranielgroep aan 'n Cys-residu in proteïene wat 'n C-terminale CAAX-prenyleringsmotief het. Hierdie proses maak proteïene geheg aan endomembrane/endoplasmiese retikulum (ER) en Golgi -strukture tot verdere verwerking, soos getoon vir Rab GTPases. Farnesylering reguleer ook muis cpx 3/4 en Drosophila Cpx funksie. Die Cys binne CAAX-motiewe kan ook S-nitrosilering ondergaan, wat inmeng met die farnesileringssein, maar direkte bewyse in 'n fisiologiese omgewing ontbreek. CPX-funksie is in baie verskillende stelsels bestudeer, en daar is kontroversie oor die fusieklem-aktiwiteit daarvan. Cpx ondersteun Ca2+-gerigte eksositose, maar vertoon ook 'n klemfunksie. Ontleding van die muis cpx dubbel-knock-out neurone ontbreek cpx 1 en 2 het slegs 'n vergemaklikende funksie gevind vir CPX by vrylating, en verskillende D. melanogaster en Caenorhabditis elegans cpx mutantlyne vertoon veranderde fenotipes in klem- of priming/fusiefunksie, wat die kontroversiële aksies van Cpx illustreer (Robinson, 2018).

Hierdie studie het die uitwerking van NO op sinaptiese oordrag ondersoek en gevind dat NO Ca2+-geaktiveerde vrystelling verminder sowel as die grootte van die funksionele vesikelpoel, wat omgekeer is deur glutathione (GSH) sein. Terselfdertyd is spontane vrystellingsyfers negatief beïnvloed deur NO. Dit is bevestig dat kpx S-nitrosileer is en dat GEEN die sinaptiese lokalisering van kpx verander nie, soos ook gesien na genetiese en farmakologiese remming van farnesilering. Daar word dus voorgestel dat die funksie van cpx gereguleer word deur S-nitrosilering van Cys binne die CAAX-motief om farnesilering te voorkom. Dit verhoog cpx-SNARE-proteïeninteraksies, waardeur cpx 'n dominante klemfunksie kry, wat spontane sowel as opgewekte vrystelling onderdruk (Robinson, 2018).

NO reguleer 'n menigte fisiologiese en patologiese weë in neuronale funksie deur die opwekking van cGMP, tiol-nitrosilering en 3-nitrotyrosinasie in gesondheid en siektes. Hierdie studie toon deur die gebruik van biochemiese en genetiese instrumente in Drosophila-, muis- en HEK-selle dat NO Cpx kan S-nitrosileer en (op 'n cGMP-onafhanklike wyse) neurotransmittervrystelling by die NMJ kan moduleer deur in te meng met die prenilasiestatus daarvan, en sodoende die lokalisering beïnvloed. en funksie van hierdie samesmelting-klemproteïen. Hierdie nitreergiese effekte word omgekeer deur GSH toediening of ooruitdrukking van GSH-bevrydende en de-nitrosilerende ensieme (GCLm/c, GSNOR). GSH is die belangrikste endogene wegvanger vir die NO-deel deur die vorming van S-nitrosoglutathion (GSNO) en verminder gevolglik proteïen-SNO-vlakke via trans- en de-nitrosilering. Die onderdrukking van NOS-aktiwiteit fasiliteer sinaptiese funksie en die data ondersteun die idee dat endogene of eksogene NO S-nitrosilering verhoog, cpx farnesilering verminder en vrystelling verminder (Robinson, 2018).

Van die talle sinaptiese molekules wat betrokke is by vrystelling, is veral Cpx betrokke by die regulering van beide opgewekte en spontane vrystelling as gevolg van die fusion-clamp-aktiwiteit daarvan. Ten spyte van die oënskynlik eenvoudige struktuur van Cpx, is die fisiologiese funksie daarvan baie kontroversieel, aangesien hierdie klein SNARE-komplekse bindingsproteïen vinnig Ca2+-afhanklike en spontane vrystelling kan vergemaklik, afhangende van die bestudeerde stelsel. Daarbenewens is daar verskillende soogdier-isovorme van Cpx (1-4), wat verskil in hul C-terminale streek, met slegs cpx 3/4 wat die CAAX-prenileringsmotief bevat. Farnesylering bepaal oor die algemeen proteïenmembraanassosiasie en proteïen-proteïeninteraksies, en sommige cpx-isoforme, soos muscpx 3/4 en Dmcpx 7A, word op hierdie manier gereguleer. Muscpx 1/2 beskik egter nie oor 'n CAAX -motief nie, wat dui op differensiële regulerende maniere om die CPX -funksie te moduleer. In Drosophila is daar alternatiewe splitsvariante as gevolg van 'n enkele cpx geen, maar die oorheersende isovorm bevat die CAAX-motief (Dmcpx 7A), wat die belangrikheid van hierdie seinmolekule impliseer. Die ander splitsisoform (Dmcpx 7B) het nie die CAAX-motief nie en word uitgedruk op ongeveer 1000-voudige laer vlakke op die larfstadium [15], waardeur Dmcpx 7A die dominante isoform word wat deur farnesylering gereguleer word. Die gebrek aan Dmcpx 7B-fosforylering deur PKA veroorsaak egter soortgelyke fenotipes soos gesien in die huidige eksperimente wanneer dit beoordeel word na 'n induksie van aktiwiteitsafhanklike versterking van mEJC-frekwensie, wat ook cpx-synaptotagmin 1-interaksies kan behels (Robinson, 2018).

Interessant genoeg onderdruk beide uitputting en oormatige vlakke van kpx Ca2+-afhanklike en onafhanklike eksositose. Cpx kan die SNARE -komplekse samestelling bevorder en terselfdertyd die voltooiing van die samesmelting blokkeer deur dit in 'n hoogs fusogene toestand te hou. Ca2+-afhanklike samesmelting word bevorder onder 'n konsentrasie van 100 nM kpx, terwyl dit bo 200 nM 'n klemfunksie vertoon wat 'n klokvormige reaksiekurwe tot gevolg het. Vorige werk dui daarop dat synaptotagmin 1, een keer gebind aan Ca2+, die cpx -blok verlig en samesmelting moontlik maak. 'N Ander studie het berig dat selektiewe mededinging tussen cpx en synaptotagmin 1 vir SNARE -binding regulering van vrystelling moontlik maak. Die data stem ooreen met laasgenoemde bevindings, aangesien verminderde synaptotagmin 1-Cpx-interaksies waargeneem is na die blok van farnesylering, wat daarop dui dat minder synaptotagminmolekules aan die SNARE-kompleks bind om Cpx te verplaas. Hierdie beperkte vervanging van Cpx deur sinaptotagmin is geïmpliseer in biochemiese studies wat toon dat plaaslike oormaat Cpx vrystelling inhibeer, vermoedelik deur sinaptotagmien-binding uit te kompeteer. Sinaptotagmin-SNARE binding is dus sterk afhanklik van die plaaslike konsentrasie van Cpx. Alternatiewelik, en hierdie moontlikheid kan nie uitgesluit word nie, kan die modulasie van Cpx eenvoudig die binding daarvan aan die SNARE-kompleks verander sonder om synaptotagmin direk te verplaas, maar interpretasie van die data uit die huidige toetse (PLA, ko-lokalisering) sal nie die onderskeid tussen hierdie moontlikhede moontlik maak nie (Robinson, 2018).

Die data is verenigbaar met die idee dat Cpx aan die SNARE -kompleks bind, die samestelling vergemaklik en dan sy klemfunksie uitoefen deur volledige samesmelting te voorkom as gevolg van SNARE -kompleksstabilisering en daaropvolgende verhoogde energieversperring om samesmelting moontlik te maak. Die huidige model kan 'n verduideliking gee van hoe Cpx gereguleer kan word om stroomaf te dui om die vrystelling van die sender te moduleer. Tot dusver is daar geen data beskikbaar nie, behalwe mutasie studies, oor hoe Cpx funksie verander kan word. Hierdie studie verskaf data wat 'n fisiologies relevante meganisme aandui om die Cpx -funksie aan te pas, moontlik aan die vereistes van die neuron om die sinaptiese transmissie aan te pas. Dit gebeur waarskynlik as gevolg van Cys S-nitrosylering en onderdrukking van farnesylering, sodat groter hoeveelhede hidrofiliese Cpx, wat nie aan endomembrane gebind is nie, beskikbaar is vir binding met die SNARE-kompleks in 'n veranderde konfigurasie. Hierdie kruissein tussen nitrosilering/farnesilering is voorgestel om as 'n molekulêre skakelaar op te tree om Ras-aktiwiteit te moduleer. Die huidige data toon dat verbeterde nitrergiese aktiwiteit en blokkering van farnesylering, hetsy geneties (Cpx & DeltaX) of farmakologies, die lokalisering van Cpx by die Drosophila NMJ en die van GFP-CAAX in HEK-selle verander. Verder, deur 'n nitroso-mimetika te gebruik cpx mutant, het hierdie studie 'n verbeterde ko-lokalisering van Cpx met die AZ proteïen Brp gevind, wat 'n lokalisasie-funksie verhouding impliseer. Dit verhoog gevolglik die netklemfunksie as gevolg van verhoogde plaaslike konsentrasies van Cpx. Dmcpx vertoon spesifiek 'n sterk klemfunksie, soos aangetoon na ooruitdrukking in hippocampusneurone, wat veroorsaak dat onderdrukking van ontlokte en spontane vrystelling gepaard gaan met 'n vermindering van die vrystellingskans of verminderde vesikelsmeltdoeltreffendheid in in vitro -toetse (Robinson, 2018).

Twee onafhanklike studies wat die CAAX -motief in Dmcpx uitskakel (cpx 572 en cpx 1257 ) het lokalisasie-funksie-interaksies ondersoek en onenige effekte getoon op beide vrystelling en cpx-lokalisering. In die besonder is ook aangetoon dat die afgeknotte Cpx (cpx 572 , sonder die laaste 25 aminosure) lokaliseer nie saam met Brp. Interessant genoeg veroorsaak hierdie mutant 'n sterk afname in C-terminale hidrofobisiteit en 'n beskeie fisiologiese reaksie (verhoogde mini-frekwensie, verminderde ontlokte amplitudes gelykstaande aan 'n verlies aan klem en verlies aan samesmeltingsfunksie) in verhouding tot die totale knock-out (KO). Daarteenoor het die cpx mutant met 'n enkele aminosuur verwydering (cpx 1275 ) veroorsaak geen effek op ontlokte nie, maar identiese effekte op die frekwensie van spontane vrystelling, wat dui op 'n gebrek aan klem, maar geen gebrek aan fusiefunksie nie. Boonop lokaliseer hierdie mutant nou saam met die AZ by die NMJ. Hierdie twee studies dui aan dat die verskillende mutasies kontrasterende elektrofisiologiese en morfologiese fenotipes veroorsaak, wat aandui dat dit te wyte is aan die aard van die mutasie (gebrek aan die laaste 25 aminosure teenoor 1 aminosuur), wat die belangrikheid van 'n funksionele C-terminus beklemtoon. . Meer onlangse studies het getoon dat die verwydering van die finale aminosure (6 of 12 residue) die membraanbinding van Cpx-1 heeltemal afgeskaf het, wat die remmende funksie daarvan benadeel en die vereiste bevestig van 'n ongeskonde C-terminus vir die remming van vrystelling. Hierdie studie het 'n endogene Cpx met ongeskonde hidrofobiese C-terminus gebruik, wat fisiologiese membraanbinding moontlik maak. Dit is noodsaaklik vir inhiberende funksie, aangesien die C-terminus nodig is vir selektiewe binding aan hoogs geboë membrane, soos dié van vesikels. Dus, aangesien verskillende benaderings gebruik word om farnesilering te verander, en 'n enkele 'n enkele aminosuurmutant cpx (Dmcpx 7AC140W) geskep is, wat die C-terminus ongeskonde gelaat het, hierdie studies is uitgevoer onder toestande van endogene regulering van Cpx-funksie en verskaf dus nuwe funksionele data oor Cpx-sein. Dit is belangrik dat die data toon dat hierdie regulasie cpx-funksie verander, en dit is die eerste studie wat 'n verduideliking verskaf vir die differensiële effekte wat waargeneem word met cpx mutante of selfs Cpx-proteïenfragmente in soogdiere, wurms en vlieg in verskeie kruisspesie-reddingseksperimente (Robinson, 2018).

Die data stem ooreen met 'n model dat nie-gefarnesileerde hidrofiliese en oplosbare sitosoliese Cpx via sy C-terminale interaksies aan die vesikulêre membraan bind, en sodoende die inhiberende effek daarvan uitoefen. Wanneer proteïene gefarnesileer word, is hulle waarskynlik vasgemaak aan endomembrane, anders as vesikelmembrane. Dit moet onderskei word tussen Cpx-interaksie met die vesikelmembraan as gevolg van die hidrofobiese C-terminus, sodat Cpx naby die AZ kan kom, en Cpx-endomembraanbinding na farnesylering, wat Cpx-interaksies met die AZ voorkom. In die huidige kan SNO-modifikasie egter die binding aan ander proteïene (bv. SNAREs) verbeter, en sodoende die effekte vergroot. Hierdie bykomende interaksies met onbekende bindingsvennote kan die behoorlike Cpx -funksie beïnvloed en sommige van die teenstrydighede wat in studies met ander geneties veranderde Cpx's gesien word, verduidelik (Robinson, 2018).

Samevattend bied hierdie studie nuwe data om 'n moontlike meganisme om te reguleer, te illustreer cpx funksioneer in 'n fisiologiese omgewing, en daar is getoon dat NO as 'n endogene seinmolekule dien wat die sinaptiese membraangerigtheid van Cpx reguleer, 'n weg wat sommige van die kontroversiële bevindings met betrekking tot Cpx -funksie kan versoen. Daar word voorgestel dat verhoogde S-nitrosilering en gevolglike gebrek aan farnesilering lei tot verhoogde sitosoliese vlakke van 'n oplosbare hidrofiliese Cpx en minder endomembraangebonde fraksies, omdat farnesylering-onbevoegde proteïene in die sitosol bly. Hierdie nuwe waarnemings bevorder begrip van soortgelyke nitregiese regulering van farnesilering wat relevant kan wees vir soogdier cpx-afhanklike sinaptiese oordrag by die retina lint sinaps en ander breinstreke. Laastens het hierdie werk breër implikasies vir die fisiologiese of patologiese regulering van die prenyleringstraat, nie net tydens neurodegenerasie en veroudering nie, wanneer verbeterde S-nitrosilering kan bydra tot abnormale farnesyleringsignalering, maar ook in ander biologiese stelsels waarin nitrergiese aktiwiteit en prenylasie belangrike regulasies het funksies soos in kardiovaskulêre of kanker-sein (Robinson, 2018).

Differensiële regulering van ontlokte en spontane vrystelling van neurotransmitter deur C-terminale modifikasies van kompleksien

Kompleksiene is klein alfa-helikale proteïene wat neurotransmitter vrystelling moduleer deur te bind aan SNARE komplekse tydens sinaptiese vesikel eksositose. Daar is gevind dat hulle as samesmeltingsklemme funksioneer om spontane sinaptiese vesikelsamesmelting in die afwesigheid van Ca2+ te inhibeer, terwyl dit ook opgewekte neurotransmittervrystelling na 'n aksiepotensiaal bevorder. Kompleksiene bestaan ​​uit 'n N-terminale domein en 'n bykomende alfa-heliks wat onderskeidelik die aktiverende en inhiberende eienskappe van die proteïen reguleer, en 'n sentrale alfa-heliks wat die SNARE-kompleks bind en noodsaaklik is vir beide funksies. Daarbenewens bevat kompleksiene 'n grootliks ongestruktureerde C-terminale domein waarvan die rol in sinaptiese vesikelsiklus swak gedefinieer is. Hierdie studie demonstreer dat die C-terminus van Drosophila-kompleksien (DmCpx) lokalisering na sinapse reguleer en dat alternatiewe splitsing van die C-terminus spontane en opgewekte neurotransmitter vrystelling differensieel kan reguleer. Karakterisering van die enkele DmCpx-geen deur mRNA-analise het uitdrukking aan die lig gebring van twee alternatiewelik uitgedrukte isovorme, DmCpx7A en DmCpx7B, wat proteïene kodeer met verskillende C-termini wat 'n membraanbindende prenilasiedomein bevat of ontbreek. Die oorheersende isovorm, DmCpx7A, word verder gemodifiseer deur RNA redigering binne hierdie C-terminale streek. Funksionele analise van die splitsing isovorme het getoon dat beide soortgelyk gelokaliseer is na sinaptiese boutons by larwale neuromuskulêre aansluitings, maar het differensiële effekte op die regulering van opgewekte en spontane samesmelting. Hierdie gegewens dui aan dat die C-terminus van Drosophila complexin beide spontane en opgewekte vrystelling deur afsonderlike meganismes reguleer en dat alternatiewe splicing isoforme genereer met duidelike effekte op die twee belangrikste maniere van sinaptiese vesikelsmelting by sinapse (Behl, 2013).

Complexin beheer spontane en ontlokte neurotransmittervrystelling deur die tydsberekening en eienskappe van sinaptotagmin-aktiwiteit te reguleer

Die vrystelling van neurotransmitter na samesmelting van sinaptiese vesikel (SV) is die fundamentele meganisme vir neuronale kommunikasie. Sinaptiese eksositose is 'n gespesialiseerde vorm van intersellulêre kommunikasie wat 'n gemeenskaplike SNARE-gemedieerde samesmeltingsmeganisme met ander membraanhandelpaaie deel. Die regulering van sinaptiese vesikel samesmelting kinetika en korttermyn plastisiteit is van kritieke belang vir vinnige enkodering en oordrag van seine oor sinapse. Verskeie families SNARE-bindende proteïene het ontwikkel om sinaptiese eksositose te reguleer, insluitend Synaptotagmin (Syt) en Complexin (Cpx). Hierdie studie demonstreer dat Drosophila Cpx opgewekte samesmelting beheer wat plaasvind via die sinchrone en asinchrone weë. cpx -/ - mutante toon verhoogde asynchrone vrystelling, terwyl Cpx -ooruitdrukking die asynchrone komponent van samesmelting grootliks uitskakel. Daar is ook gevind dat Syt en Cpx die kinetika en Ca (2+) ko-operasie van vrystelling van neurotransmitter reguleer. CPX funksioneer gedeeltelik as 'n positiewe reguleerder van vrystelling deur die Ca (2+) sensor Syt aan die samesmeltingsmasjinerie te koppel en sy aktiwiteit te sinchroniseer om versmelting te bespoedig. In teenstelling hiermee skakel syt -/- cpx -/- dubbelmutante die verhoogde spontane vrystelling wat in cpx -/- mutante alleen waargeneem word heeltemal af, wat aandui dat Cpx as 'n samesmeltingsklem optree om voortydige eksositose gedeeltelik te blokkeer deur onvanpaste aktivering van die SNARE-masjinerie te voorkom Syt. CPX-vlakke beheer ook die grootte van sinaptiese vesikelpoele, insluitend die onmiddellike losbare swembad en die gereed losbare poel-sleutelelemente van korttermyn plastisiteit wat die vermoë van sinapse definieer om reaksies tydens burst-skiet te onderhou. Hierdie waarnemings dui aan dat Cpx spontane sowel as ontlokte samesmelting reguleer deur die tydsberekening en eienskappe van Syt -aktivering tydens die sinaptiese vesikelsiklus te moduleer (Jorquera, 2012).

'n Kompleksinfusieklem reguleer spontane neurotransmittervrystelling en sinaptiese groei

Neuronale sein vind plaas deur middel van beide aksiepotensiaal-geaktiveerde sinaptiese vesikelsmelting en spontane vrystelling, hoewel die fusieklampmasjinerie wat voortydige eksositose van sinaptiese vesikels voorkom in die afwesigheid van kalsium, onbekend is. Hierdie studie demonstreer dat spontane vrystelling by sinapse gereguleer word deur kompleksien, 'n SNARE-kompleksbindende proteïen. Analise van Drosophila kompleksien nulmutante het 'n merkbare toename in spontane samesmelting en 'n diepgaande oorgroei van sinapse getoon, wat daarop dui dat kompleksien in vivo as die fusieklem funksioneer en die strukturele heropbou van neuronale verbindings kan moduleer deur die tempo van spontane vrystelling te beheer (Huntwork, 2007).

Om die funksie van kompleksien in vivo te bepaal, is 'n volledige uitklop van kompleksien gegenereer. Drosophila het 'n enkele geen wat vir die kompleksienproteïen kodeer (Tokumaru, 2001). Antisera is gegenereer vir rekombinante Drosophila-kompleksienproteïen wat 'n 16-kDa-proteïen in breinekstrakte herken het wat in beide SSS en perifere sinapse verryk is. Koste vir komplekse en skyfies groot (Dlg) of die aktiewe sone proteïen Bruchpilot het getoon dat kompleksien uitgedruk word in presynaptiese terminale. 'N Intrageniese verwydering van 17 kb binne kompleks (cpx SH1 ) wat die grootste deel van die koderingsgebied verwyder het, is gegenereer deur onnauwkeurige uitsny van 'n P -element. 'n Presiese uitsnyding wat enige delesie ontbreek, is ook gegenereer, en het gedien as 'n kontrole vir genetiese agtergrond in alle eksperimente. Westerse analise en immunositochemie bevestig die verlies aan uitdrukking van kompleksien in cpx SH1 . Nulmutante sonder kompleksien is halfdodelik, en die meeste diere vrek voor volwasse omgang. Ontsnappingsvolwassenes is onvrugbaar, toon ernstige motoriese defekte en het nie die aan- en af-vergange wat normale sinaptiese transmissie in die visuele sisteem verteenwoordig nie. Pan-neuronale uitdrukking van a UAS-kompleks transgen met die elav-GAL4 neuronale bestuurder red die verminderde lewensvatbaarheid en abnormale sinaptiese oordrag van cpx SH1 mutante (Huntwork, 2007).

Om die rol van kompleksien in neurotransmitter vrystelling te ontleed, is elektrofisiologiese opnames uitgevoer by Drosophila derde-instar larwale buikspier 6 sinapse. cpx SH1 mutante het ernstige gebreke in spontane vesikelsmelting. Die frekwensie van miniatuur -opwindende aansluitingspotensiale (minis) is aansienlik verhoog cpx SH1 mutante sinapse, wat voortdurende eksositose van sinaptiese vesikels demonstreer in die afwesigheid van enige stimulasie. Neuronale uitdrukking van a UAS-kompleks transgeen het die verhoogde frekwensie van spontane vrystelling gered. In hoë ekstrasellulêre [Ca 2+], het reaksies ontlok in cpx SH1 mutante na senuwee stimulasie is aansienlik verminder in vergelyking met kontrole, terwyl daar in lae ekstrasellulêre [Ca 2+] geen verskil waargeneem is nie. Soos hieronder beskryf, kompleksin mutante sinapse het 'n toename van 64% in die aantal aktiewe sones getoon, wat aandui dat sinusse van die neuromuskulêre aansluiting (NMJ) 'n afname in die samesmeltingsgebeurtenisse per aktiewe sone het, wat by hoë kalsiumvlakke vererger is, waar 'n groot aantal sinchrone sinaptiese vesikelsmeltgebeurtenisse plaasvind benodig (Huntwork, 2007).

Om te bevestig dat die toename in miniatuur postsynaptiese potensiale die gevolg was van verhoogde spontane vesikelsmelting, in teenstelling met nie-vesikulêre storting van glutamaat by die sinaps, 'n temperatuurgevoelige allel van dinamien (shibire TS1 ) is gebruik wat endositose by 32°C blokkeer. Hoëfrekwensie stimulasie by 32°C put die sinaptiese vesikelpoel in shibire mutante en sal voorspel word om die verbeterde spontane vesikelfusie in dubbelmutante uit te skakel. Na 'n 5-minute 10-Hz stimulasietrein by 32 °C in shibire TS1 cpx SH1 dubbele mutante, wat ontlokte vrystelling afgeskaf het, is die verhoogde mini-frekwensie wat by permissiewe temperature waargeneem is, uitgeskakel. Die frekwensie van spontane vrylating in cpx SH1 mutante bly sterk verhoog in 0 mM ekstrasellulêre kalsium, wat 'n afwykende toevoer van kalsium in die presynaptiese senuwee terminale uitsluit as die oorsaak van die verhoogde spontane vrystelling. Hierdie waarnemings dui daarop dat kompleksien funksioneer as die sinaptiese vesikelsamesmeltingsklem in vivo, en met die verlies daarvan versmelt sinaptiese vesikels voortdurend in die afwesigheid van stimulasie (Huntwork, 2007).

Die groot toename in spontane samesmelting waargeneem by kompleks mutante NMJ's het 'n geleentheid gebied om die gevolge van veranderde kompleksienfunksie en verhoogde minifrekwensie op sinaptiese groei te bepaal. Om die sinaptiese struktuur te ontleed, is sinaptiese varicosities getel in ouderdoms-ooreenstemmende beheer en cpx SH1 derdejaar-NMJ's. cpx SH1 mutante het 'n tweevoudige oorproliferasie van boutons getoon by elke spier wat ondersoek is, sowel as 64% meer aktiewe sones. Neuronale uitdrukking van a kompleks transgeen het die sinaptiese oorgroeifenotipe omgekeer. Hierdie data skakel enige strukturele oorwegings uit wat vir die verbeterde mini's kan verantwoordelik wees, aangesien die 64% toename in die aantal aktiewe sones verreweg onvoldoende is om die >20-voudige toename in spontane vrystelling te verklaar (Huntwork, 2007).

Hierdie analise demonstreer dat die interaksies van kompleksien met SNARE's 'n molekulêre samesmeltingsklem verskaf om spontane vrystelling by sinapse in die afwesigheid van stimulasie te voorkom. Hierdie in vivo waarnemings pas goed by die voorspelde model van die fusieklem wat gebaseer is op die in vitro vermindering van SNARE-gemedieerde samesmelting deur kompleksien. Alhoewel ontleding van gekweekte hippokampale outaptiese neurone sonder twee van die vier muis kompleksin gene het 'n verminderde vrystelling van die neurotransmitter getoon, wat ooreenstem met die waarnemings in Drosophila, en die mini -frekwensie in die muisstelsel is onveranderd. Alhoewel dit onduidelik is wat die verskil in die mini -frekwensie tussen modelle ten grondslag lê, is 'n moontlike verklaring dat komplekse 3 of 4 of ander onbekende komponente van die fusieklampmasjien by die muis vergoed vir die verlies aan kompleksien (Huntwork, 2007).

Dit is lank reeds bekend dat minis enkele vesikelsamesmeltingsgebeurtenisse verteenwoordig, maar hul onderliggende funksie het onduidelik gebly. Die huidige resultate het onverwags 'n merkbare effek op sinaptiese groei by die Drosophila NMJ in kompleks mutante. Alhoewel vorige studies oor hiperexciteerbare Drosophila -mutante getoon het dat verhoogde neuronale aktiwiteit sinaptiese groei bevorder, is die bydraes van spontane versus opgewekte sein onbekend. Daar is ook getoon dat aktiwiteitsafhanklike retrograde sein deur die postsynaptiese kalsiumsensor Synaptotagmin 4 tydelik die mini-frekwensie 100-voudig verhoog en verhoogde sinaptiese groei by Drosophila embrioniese NMJ's veroorsaak. Dit is aanloklik om te spekuleer dat regulering van kompleksien tydens retrograde signalering die aktiwiteitsafhanklike verbetering van spontane samesmelting en sinaptiese groei ten grondslag lê. Daar is tans geen bewyse dat die verhoogde minis die morfologiese oorgroei veroorsaak nie, en verdere studies sal nodig wees om die meganisme te dissekteer waardeur kompleksin mutante bevorder sinaptiese groei. Onlangse werk by soogdiere dui daarop dat spontane vrystelling dendritiese morfogenese van die ruggraat en dendritiese proteïensintese kan reguleer. Complexin disfunksie is ook geïmpliseer in menslike siektes, insluitend skisofrenie, wat aandui dat abnormale spontane samesmelting kan bydra tot sekere neurologiese siektes. Aangesien kompleksien en die sinaptiese vesikelkalsiumsensor Synaptotagmin 1 kan meeding om binding aan SNARE -komplekse, is 'n aantreklike model vir sinaptiese vesikel -eksositose dat kompleksien 'n halfgemaakte tussenproduk stabiliseer wat volledige samesmelting kan voltooi na kalsiumaktivering van Synaptotagmin 1. Saam met Synaptotagmin 1, complexin verskaf 'n sleutel neuronale modulator van SNARE funksie wat die alomteenwoordige membraan handel masjinerie aanpas vir sinaptiese vesikel samesmelting (Huntwork, 2007).

Kompleksien aktiveer eksositose van duidelike sekretoriese vesikels wat deur verskillende sinaptotagmine beheer word

Kompleksiene is SNARE-komplekse bindende proteïene wat noodsaaklik is vir die Ca(2+)-geaktiveerde eksositose wat deur sinaptotagmin-1, -2, -7 of -9 bemiddel word, maar die moontlike rol van kompleksiene in ander tipes eksositose wat deur ander sinaptotagmien-isovorme beheer word bly onduidelik. Hierdie studie toon aan dat synaptotagmin-1 in die olfbolneuron van die muis lokaliseer na sinaptiese vesikels en na groot sekretoriese vesikels, soos voorheen gerapporteer, terwyl synaptotagmin-10 gelokaliseer word na 'n aparte klas peptidergiese sekretoriese vesikels wat IGF-1 bevat.Beide sinaptotagmien-1-afhanklike sinaptotagmien-eksositose en sinaptotagmien-10-afhanklike IGF-1-eksositose is ernstig benadeel deur die afbreek van kompleksiene, wat demonstreer dat kompleksien as 'n kofaktor vir beide sinaptotagmin-1 en sinaptotagmien-10 optree ten spyte van die funksionele verskille tussen hierdie sinaptotagmine . Reddingseksperimente het aan die lig gebring dat slegs die aktiverende maar nie die klemfunksie van kompleksiene nodig is vir IGF-1-eksositose wat deur synaptotagmin-10 beheer word nie. Dus, die data dui aan dat kompleksiene noodsaaklik is vir aktivering van verskeie tipes Ca(2+)-geïnduseerde eksositose wat deur verskillende sinaptotagmin-isovorme gereguleer word. Hierdie resultate dui daarop dat verskillende tipes gereguleerde eksositose bemiddel word deur soortgelyke sinaptotagmien-afhanklike samesmeltingsmeganismes, dat spesifieke sinaptotagmien-isovorme spesifisiteit verleen aan verskillende tipes gereguleerde eksositose, en dat kompleksiene dien as universele sinaptotagmien-adapters vir al hierdie tipes eksositose, onafhanklik daarvan sinaptotagmin isoform is betrokke (Cao, 2013).

Sinaptiese vesikels plaas kompleksin om spontane samesmelting te blokkeer

Sinapse vul voortdurend hul sinaptiese vesikel (SV) poele aan terwyl hulle spontane samesmeltingsgebeure onderdruk, en behou dus 'n hoë dinamiese omvang in reaksie op fisiologiese stimuli. Die presinaptiese proteïenkompleksien kan samesmelting beide bevorder en inhibeer deur interaksies tussen sy alfa-helikale domein en die SNARE-kompleks. Daarbenewens is kompleksien se C-terminale helfte nodig vir die remming van spontane samesmelting in wurm, vlieë en muis, hoewel die molekulêre meganisme onverklaarbaar bly. Hierdie studie toon dat kompleksien se C-terminale domein lipiede bind deur 'n nuwe proteïenmotief, wat kompleksien toelaat om spontane eksositose in vivo te inhibeer deur kompleksien na SVs te rig. Daar word voorgestel dat die SV -swembad dien as 'n platform om komplekse te sekwestreer en te plaas waar dit die vinnig saamgestelde SNARE's kan onderskep en die tempo van spontane samesmelting kan beheer (Wragg, 2013).

Bowen, M. E., et al. (2005). Enkel-molekule studies van sinaptotagmin en kompleksien binding aan die SNARE kompleks. Biofise. J. 89: 690-702. PubMed ID: 15821166

Bracher, A., et al. (2002). Röntgenstruktuur van 'n neuronale kompleksin-SNARE-kompleks van inkvis. J. Biol. Chem. 277: 26517-26523. PubMed ID: 12004067

Brose, N. (2008). Ten goede of ten kwade: kompleksiene reguleer SNARE -funksie en vesikelsmelting. Verkeer 9: 1403-1413. PubMed ID: 18445121

Buhl, L. K., Jorquera, R. A., Akbergenova, Y., Huntwork-Rodriguez, S., Volfson, D. en Littleton, J. T. (2013). Differensiële regulering van ontlokte en spontane vrystelling van neurotransmitter deur C-terminale modifikasies van kompleksien. Mol Cell Neurosci 52: 161-172. PubMed ID: 23159779

Cai, H., et al. (2008). Kompleksien II speel 'n positiewe rol in Ca2+-gerigte eksositose deur die voorbereiding van vesikels te vergemaklik. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. 105: 19538-19543. PubMed ID: 19033464

Cao, P., Yang, X. en Sudhof, T. C. (2013). Complexin aktiveer eksositose van duidelike sekretoriese vesikels wat deur verskillende sinaptotagmine beheer word. J Neurosci 33: 1714-1727. PubMed ID: 23345244

Cho, R. W., Buhl, L. K., Volfson, D., Tran, A., Li, F., Akbergenova, Y. en Littleton, J. T. (2015). Fosforilering van Komplexien deur PKA reguleer aktiwiteitsafhanklike spontane vrystelling van neurotransmitter en strukturele sinaptiese plastisiteit. Neuron 88: 749-761. PubMed ID: 26590346

Chen, X., et al. (2002). Driedimensionele struktuur van die kompleksin/SNARE-kompleks. Neuron 33: 397-409. PubMed ID: 11832227

Giraudo, C. G., et al. (2006). 'n Klemmeganisme betrokke by SNARE-afhanklike eksositose, Science 313: 676-680. PubMed ID: 16794037

Giraudo, C. G., et al. (2009). Alternatiewe ritssluiting as 'n aan-af skakelaar vir SNARE-gemedieerde samesmelting. Wetenskap 323: 512-516. PubMed ID: 19164750

Guan, R., Dai, H. en Rizo, J. (2008). Binding van die Munc13-1 MUN-domein aan membraan-geankerde SNARE-komplekse. Biochemistry 47: 1474-1481. PubMed ID: 18201107

Huntwork, S. en Littleton, J. T. (2007). 'n Kompleksinfusieklem reguleer spontane neurotransmittervrystelling en sinaptiese groei. Nat. Neurosci. 10: 1235-1237. PubMed ID: 17873870

Ishizuka, T., et al. (1995). Synaphin: 'n proteïen wat verband hou met die dok-/fusiekompleks in presinaptiese terminale. Biochem. Biofise. Res. Kommun. 213: 1107-1114. PubMed ID: 7654227

Jorquera, R. A., Huntwork-Rodriguez, S., Akbergenova, Y., Cho, R. W. en Littleton, J. T. (2012). Kompleksien beheer spontane en ontlokte neurotransmitter vrystelling deur die tydsberekening en eienskappe van sinaptotagmin aktiwiteit te reguleer. J Neurosci 32: 18234-18245. PubMed ID: 23238737

Malsam, J., et al. (2009). Die karboksie-terminale domein van kompleksien I stimuleer liposoomsamesmelting. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. 106: 2001-2006. PubMed ID: 19179400

Maximov, A., et al. (2009). Complexin beheer die kragoordrag van SNARE-komplekse na membrane in samesmelting. Science 323: 516-521. PubMed ID: 19164751

McMahon, H. T., et al. (1995). Kompleksiene: sitosoliese proteïene wat SNAP-reseptorfunksie reguleer, Sel 83: 111-119. PubMed ID: 7553862

Pabst, S., et al. (2000). Selektiewe interaksie van kompleksien met die neuronale SNARE -kompleks. Bepaling van die bindende streke. J. Biol. Chem. 275: 19808-19818. PubMed ID: 10777504

Pabst, S., et al. (2002). Vinnige en selektiewe binding aan die sinaptiese SNARE -kompleks dui op 'n modulerende rol van kompleksiene in neuroexositose. J. Biol. Chem. 277: 7838-7848. PubMed ID: 11751907

Reim, K., et al. (2005). Struktureel en funksioneel unieke kompleksiene by retinale lint sinapse, J. Cell Biol. 169: 669-680. PubMed ID: 15911881

Rizo, J. en Rosenmund, C. (2008). Sinaptiese vesikelsmelting. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 15: 665-674. PubMed ID: 18618940

Robinson, SW, Bourgognon, JM, Spiers, JG, Breda, C., Campesan, S., Butcher, A., Mallucci, GR, Dinsdale, D., Morone, N., Mistry, R., Smith, TM, Guerra-Martin, M., Challiss, RAJ, Giorgini, F. en Steinert, JR (2018). Stikstofoksied-gemedieerde posttranslasionele modifikasies beheer die vrystelling van neurotransmitter deur die kompleks in farnesylering te moduleer en die klemvermoë daarvan te verbeter. PLoS Biol 16 (4): e2003611. PubMed ID: 29630591

Schaub, J. R., et al. (2006). Hemifusie-arrestasie deur kompleksien word verlig deur Ca (2+)-synaptotagmin I. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 13: 748-750. PubMed ID: 16845390

Strenzke, N., et al. (2009). Kompleksien-I word benodig vir hoë-betroubaarheidstransmissie by die eindbol van die gehoor-sinaps. J. Neurosci. 29: 7991-8004. PubMed ID: 19553439

Takahashi, S., et al. (1995). Identifikasie van twee hoogs homoloë presinaptiese proteïene wat duidelik gelokaliseer is by die dendritiese en somatiese sinapse. FEBS Lett. 368: 455-460. PubMed ID: 7635198

Tang, J., et al. (2006). 'N Kompleksien/sinaptotagmin 1 -skakelaar beheer die vinnige sinaptiese vesikel -eksositose. Sel 126: 1175-1187. PubMed ID: 16990140

Tokumaru, H. et al. (2001). SNARE komplekse oligomerisering deur sinafien/kompleksien is noodsaaklik vir sinaptiese vesikel -eksositose. Sel 104: 421-432. PubMed ID: 11239399

Weninger, K., et al. (2008). Toebehore proteïene stabiliseer die acceptor kompleks vir synaptobrevin, die 1: 1 Sintaxin/SNAP-25 kompleks. Struktuur 16: 308-320. PubMed ID: 18275821

Wragg, R. T., Snead, D., Dong, Y., Ramlall, T. F., Menon, I., Bai, J., Eliezer, D. en Dittman, J. S. (2013). Sinaptiese vesikels plaas kompleksin om spontane samesmelting te blokkeer. Neuron 77: 323-334. PubMed ID: 23352168

Xue, M., et al. (2007). Onderskeie gebiede van kompleksien I reguleer die vrystelling van neurotransmitter differensieel. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 14: 949-958. PubMed ID: 17828276

Xue, M., et al. (2008). Kompleksiene vergemaklik die vrystelling van neurotransmitter by opwindende en inhiberende sinapse in die sentrale senuweestelsel van soogdiere. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. 105: 7875-7880. PubMed ID: 18505837

Xue, M., et al. (2009). Deur die balans tussen fasiliterende en inhiberende funksies van soogdier- en Drosophila-kompleksiene te kantel, orkestreer sinaptiese vesikeleksositose. Neuron 64: 367-380. PubMed ID: 19914185

Yoon, T. Y., et al. (2008). Complexin en Ca2+ stimuleer SNARE-gemedieerde membraanfusie. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 15: 707-713. PubMed ID: 18552825 Biologiese oorsig