Inligting

Is daar 'n omgekeerde transkripsie -optimalisering vir lang transkripsies van 9 kb?

Is daar 'n omgekeerde transkripsie -optimalisering vir lang transkripsies van 9 kb?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Het iemand RT geoptimaliseer vir lang transkripsies (9kb)? Die stroomaf -toepassing sal PCR -versterking en voorbereiding van die Illumina -biblioteek wees. Dit sal triviaal wees om interne primers stelle vir die PCR te maak wat spesifiek is solank daar geen chimeriese volgordes is nie. As daar is, sal hulle waarskynlik ook voorberei word. As iemand weet van 'n optimalisering en/of ander potensiële slaggate, sal ek dit graag wil hoor.


RT-PCR behoort u tot ongeveer 10 kb te kry. As u agterkom dat dit nie werk nie, kan u kommersiële RT-PCR-stelle vir lang afstande doen (kyk byvoorbeeld na Stratagene en Qiagen). Die Qiagen kan tot 12,5 kb in 'n tweestap RT-PCR-stelsel hanteer.


Met langer rye word die dNTP's beperkend. Probeer om meer dNTP's by te voeg terwyl die hoeveelheid primer dieselfde bly. Moenie bang wees om verskeie reaksies met verskillende hoeveelhede reagens uit te voer om die optimale hoeveelheid te vind nie. Verhoog ook u reaksietyd. Die omgekeerde transkriptase en DNA -polimerase benodig meer tyd om 'n langer transkripsie te dek.


Is daar 'n omgekeerde transkripsie -optimalisering vir lang transkripsies van 9 kb? - Biologie

Gradeer op na 'n moderne webblaaier vir die beste blaaiervaring.

Promega se koekiebeleid

Ons gebruik webkoekies en soortgelyke tegnologieë om ons webwerf te laat werk, analise uit te voer, ons webwerf te verbeter en vir jou gepersonaliseerde inhoud en advertensies te wys. Sommige van hierdie koekies is noodsaaklik vir ons webwerf om te werk. Vir ander het ons dit gewen, tensy u dit aanvaar. Om meer uit te vind oor koekies en hoe om koekies te bestuur, lees ons Koekiebeleid.

As u in die EER, die Verenigde Koninkryk of Switserland geleë is, kan u u instellings te eniger tyd verander deur te klik op Bestuur koekietoestemming in die voetskrif van ons webwerf.

Ons webwerf ondersteun u blaaier nie ten volle nie.

Ons het ontdek dat u 'n ouer weergawe van Internet Explorer gebruik. Jou handelservaring kan beperk wees. Dateer u blaaier op na Internet Explorer 11 of hoër.


Inleiding

Omgekeerde transkriptases (RT's), ook bekend as RNA-gerigte DNA-polimerases, is die eerste keer geïdentifiseer in retrovirusse (1) (2). Benewens die kritieke rol wat hierdie ensieme speel in 'n verskeidenheid groot menslike siektes (MIV, hepatitis en sommige kankers), is RT's 'n fundamentele komponent van die molekulêre bioloog se gereedskapskas. RT-aktiwiteit is van kritieke belang vir baie basiese tegnieke, waaronder real-time en eindpunt RT-PCR, genaamde-sonde-generasie vir mikroskikkings en cDNA-kloning. Die ideale omgekeerde transkripsie is robuust (hoogs aktief onder 'n verskeidenheid toestande) en skakel alle voorbereide RNA binne 'n monster om na cDNA, ongeag die oorvloed, lengte of sekondêre struktuur daarvan.

Die mees gekenmerkde RT's wat vir molekulêre biologie gebruik word, is die retrovirale RT's: aviaire myeloblastose virus (AMV) en Moloney murine leukemie virus (MMLV). Genetiese ingenieurswese en ontwikkeling van eie RT-verbeterende buffers het gelei tot die kommersiële beskikbaarheid van nuwe ensieme wat voortreflike prestasie bo hierdie natuurlik voorkomende RT's bied.

Ons het 'n kop-tot-kop-vergelyking gedoen tussen vyf gewilde handelsmerke: GoScript ™ (Promega Cat.# A5003), SuperScript® II en SuperScript® III (onderskeidelik Invitrogen Cat.# 18064 en 18080), en Omniscript® en Sensiscript® (Qiagen Cat.# 205113 en 205213, onderskeidelik) reverse transkriptases. Ons het hierdie vyf RT's vergelyk vir hul bruikbaarheid in die opsporing van spoortranskripsies deur intydse PCR, die vermoë om 'n lang RNA te transkribeer en sensitiwiteit vir etanol, 'n algemene kontaminant in RNA-preparate. Ons het ook SuperScript® III en GoScript® omgekeerde transkriptases vergelyk vir hul vermoë om 'n uitdagende GC-ryke mRNA te transkribeer.


INLEIDING

Enkele nukleotiedpolimorfismes (SNP's) en puntmutasies is die algemeenste tipes genetiese polimorfisme (1), en dit word wyd as belangrike merkers in verskillende biomediese toepassings (2) benut. Allel-spesifieke polimerase kettingreaksie (AS-PCR) en modifikasies daarvan, wat gebaseer is op die onvermoë van 'n DNA-polimerase om 'n nie-ooreenstemmende primer uit te brei, was gewild in die opsporing van enkel-nukleotiedvariante vanweë hul robuustheid en eenvoud (3– 24). AS-PCR het egter gewoonlik 'n beskeie selektiwiteit as gevolg van aansienlike kruisversterking. Alhoewel 'n beter selektiwiteit bereik kan word in sekere mutasie -opsporingstoetse, blyk dit afhanklik te wees van die plaaslike volgorde en die tipe polimorfisme (25) en kan dit dus nie veralgemeen word vir verskillende mutasie -opsporingstoetse nie. Verder vereis die ontleding van RNA-variante deur AS-PCR en bestaande tegnologie aan die begin van die prosedure 'n bykomende stap om RNA nie-spesifiek om te skakel in cDNA voor DNA-gebaseerde mutasie-opsporing (26-28), wat gewoonlik die stappe van teiken-DNA-versterking, 'n allel diskriminasie reaksie en opsporing van alleelspesifieke produkte (29).

In teenstelling met AS-PCR sou allelspesifieke priming tydens omgekeerde transkripsie in beginsel direkte transformasie van hoogs soortgelyke RNA-variante in onderskeibare allel-spesifieke produkte in 'n enkele stap moontlik maak; daarom word lankal verwag dat dit 'n belowende alternatief vir ontleding van RNA-variante. Pionierondersoekers het egter getoon dat omgekeerde transkripsas 'n primer -uitbreiding kan begin vanaf 'n nie -gepaste primer met voldoende hoë doeltreffendheid (30, 31), wat kan lei tot 'n beduidende vlak van mismatch -priming. As gevolg van hierdie struikelblok was allel-spesifieke aanvang tydens omgekeerde transkripsie tot onlangs onbereikbaar met gepaste selektiwiteit. 'n Paar benaderings is beskryf vir die vermindering van mispassing-priming tydens omgekeerde transkripsie deur die gebruik van 'nie-verlengbare' mededingende blokkeerprobes, maar sulke benaderings het steeds gely aan 'n redelik lae selektiwiteit (32), wat hul breë bruikbaarheid in verskillende omgewings beperk.

In hierdie verslag beskryf ons die eerste strategie met behulp van 'n 'uitbreidbare' kompeterende blokkeersonde in omgekeerde transkripsie (ExBP-RT) om alleelspesifieke priming met superieure selektiwiteit te verkry, wat akkurate opsporing en kwantifisering van RNA-variante moontlik maak. In ExBP-RT-strategie word die gemuteerde RNA-sjabloon selektief geprimeer tydens omgekeerde transkripsie deur die mutasie-spesifieke primer, wat gekoppel is aan 'n unieke handtekening aan sy 5'-kant om opsporing/diskriminasie van die alleel-spesifieke produkte in die volgende stap te ondersteun . Die belangrikste is dat wanaanpassing met die meer volop wilde-tipe RNA-sjabloon aansienlik onderdruk word deur die verlengbare wild-tipe-spesifieke mededingende blokkeringsonde met behulp van 'n warmbeginprotokol in omgekeerde transkripsie.

ExBP-RT is 'n eenvoudige, universele strategie vir ultraklankgevoelige opsporing van mutasies in RNA-monsters, en dit maak dit ook moontlik om die RNA-vlakke van uitgedrukte mutasies akkuraat te bepaal, wat die funksionele gevolge van die selle of weefsels getrouer kan weerspieël as 'n DNA- gebaseerde mutasie -opsporingstoets (33). Hierdie strategie sal 'n gerieflike navorsingsinstrument bied vir epigenetiese studies om alleel-spesifieke geenuitdrukking te analiseer (34, 35), RNA redigering (36) sowel as opsporing van RNA mutasies binne virale RNA genome soos mutasies wat middelweerstand in MIV en griep verleen virusse (20, 37).


Aansoek [wysig | wysig bron]

Die eksponensiële amplifikasie via omgekeerde transkripsie polimerase kettingreaksie maak voorsiening vir 'n hoogs sensitiewe tegniek waarin 'n baie lae kopiegetal RNA-molekules opgespoor kan word. RT-PCR word wyd gebruik in die diagnose van genetiese siektes en, semikwantitatief, in die bepaling van die oorvloed van spesifieke verskillende RNA-molekules binne 'n sel of weefsel as 'n maatstaf van geenuitdrukking.

Navorsingsmetodes [wysig | wysig bron]

RT-PCR word algemeen gebruik in navorsingsmetodes om geenuitdrukking te meet. Byvoorbeeld, Lin et al. gebruik qRT-PCR om die uitdrukking van Gal-gene in gisselle te meet. Eerstens, Lin et al. 'n mutasie gemaak van 'n proteïen wat vermoedelik deelneem aan die regulering van Gal -gene. Daar word vermoed dat hierdie mutasie die Gal -uitdrukking selektief sou afskaf. Om dit te bevestig, is geenuitdrukkingsvlakke van gisselle wat hierdie mutasie bevat, geanaliseer met behulp van qRT-PCR. Die navorsers was in staat om afdoende vas te stel dat die mutasie van hierdie regulatoriese proteïen Gal-uitdrukking verminder het. ⎴ ] Northern blot -analise word gebruik om die RNA se geenuitdrukking verder te bestudeer.

Gene Invoeging [ wysig | wysig bron]

RT-PCR kan ook baie nuttig wees in die invoeging van eukariotiese gene in prokariote. Omdat die meeste eukariotiese gene introne bevat, wat in die genoom voorkom, maar nie in die volwasse mRNA nie, is die cDNA wat uit 'n RT-PCR-reaksie gegenereer word, die presiese (sonder inagneming van die foutgevoelige aard van omgekeerde transkriptases) direk na transkripsie in proteïen vertaal word. Wanneer hierdie gene in prokariotiese selle uitgedruk word ter wille van proteïenproduksie of suiwering, hoef die RNA wat direk vanaf transkripsie geproduseer word nie splitsing te ondergaan nie aangesien die transkripsie slegs eksons bevat. (Prokariotes, soos E. coli, het nie die mRNA -splitsingsmeganisme van eukariote nie). RT-PCR word algemeen gebruik om die genome van virusse te bestudeer waarvan die genome uit RNA bestaan, soos Influenzavirus A en retrovirusse soos MIV.

Genetiese Siekte Diagnose [ wysig | wysig bron]

RT-PCR kan gebruik word om genetiese siektes soos Lesch – Nyhan-sindroom te diagnoseer. Hierdie genetiese siekte word veroorsaak deur 'n wanfunksie in die HPRT1-geen, wat klinies lei tot die noodlottige uriensuur-uriensteen en simptome soortgelyk aan jig.[6] Deur 'n swanger moeder en 'n fetus te analiseer vir mRNA -uitdrukkingsvlakke van HPRT1, sal dit blyk of die moeder 'n draer is en of die fetus waarskynlik die Lesch – Nyhan -sindroom sal ontwikkel. ⎵ ]

Kankeropsporing [wysig | wysig bron]

Wetenskaplikes werk aan maniere om RT-PCR in kankeropsporing te gebruik om te help om prognose te verbeter en reaksie op terapie te monitor. Sirkulerende tumorselle produseer unieke mRNA-transkripsies, afhangende van die tipe kanker. Die doel is om te bepaal watter mRNA-transkripsies dien as die beste biomerkers vir 'n spesifieke kankerseltipe en dan die uitdrukkingsvlakke daarvan met RT-PCR te ontleed. ⎶ ]

RT-PCR word algemeen gebruik om die genome van virusse te bestudeer waarvan die genome uit RNA bestaan, soos Influenzavirus A en retrovirusse soos MIV.


Bespreking

RT-LATE-PCR-toetse in die eenstap-formaat bied 'n betroubare en sensitiewe manier om patogene organismes beide in die laboratorium en in die veld op te spoor. Hierdie studie beskryf die toepassing van hierdie diagnostiese tegnologie vir die opsporing van FMDV, die patogeen wat die grootste ekonomiese gevaar vir huishoudelike vee inhou. Ons het getoon dat FMDV-volgordevariante maklik opgespoor kan word deur gebruik te maak van primers wat hibridiseer met gekonserveerde volgordes van die 3D-geen, plus 'n wanpas-verdraagsame probe wat op 'n temperatuurafhanklike wyse aan 'n meer veranderlike volgorde binne die amplikon bind. Sulke sondes kan nie gebruik word met tradisionele PCR -tegnieke wat gelyke primerkonsentrasies gebruik nie, omdat die twee produkstringe met mekaar hybridiseer en verhindering voorkom met 'n sonde wat nie ooreenstem nie. Dus, RT-LATE-PCR oorkom grootliks die uitdaging van volgordeveranderlikheid wat inherent is aan RNA-virusse.

Ons resultate toon ook aan dat een-stap RT-LATE-PCR doeltreffend enkelstrengs DNA-amplikone kan genereer wat op eindpunt gekwantifiseer kan word eerder as in real-time. Dit maak dit moontlik om termiese siklusstappe vir amplifikasie geoptimaliseer te word sonder dat dit nodig is om toestande vir hibridisasie en opsporing van die sonde aan te pas. Sodoende kan glans- en uitbreidingstappe van PCR verkort word, wat dikwels nie -spesifieke versterking verminder en die reproduceerbaarheid van die toets verbeter. Smeltontleding kan gebruik word om die versterking van die verdagte middel te bevestig, en in sommige gevalle bykomende inligting te verskaf rakende stamidentifikasie.

Een-stap RT-PKR-protokolle is gerieflik, maar hou die risiko in dat opsporing vertraag of minder sensitief sal wees in vergelyking met twee-stap-protokolle, omdat omgekeerde transkripsie en PCR-amplifikasie nie afsonderlik geoptimaliseer kan word nie (Nolan et al. 2006, Hartshorn en Wangh, 2010). Die gebruik van Tfi-polimerase, eerder as Taq-polimerase, het die eenstap-protokol aansienlik verbeter, vermoedelik omdat Tfi-polimerase versoenbaar is met dithiothreitol en ander chemikalieë wat nodig is om SuperScript III te stabiliseer. Dieselfde stabiliseerders inhibeer Taq -polimerase, maar die weglating daarvan lei tot minder robuuste transkripsie. Daarbenewens het ons 'n kamertemperatuur pre-inkubasiestap ingestel, voor die byvoeging van reagense vir omgekeerde transkripsie en PKR, waartydens die LAAT-PKR van primers hibridiseer met hul RNA-teikenvolgordes in 'n buffer met 'n verlaagde soutkonsentrasie. Die gebruik van 'n pre-inkubasie by verhoogde temperature om RT-PCR resultate te verbeter is voorheen beskryf ( Goblet et al.1989 Smith et al. 1992). Maar die aanbevole temperature is tipies ver bo die smelttemperatuur van die primers tot by hul RNA-teikens, veral as die magnesium of ander soute afwesig is of in lae konsentrasies is tydens die pre-inkubasiestap. Primers hibrideer dus nie na die teiken tydens sulke pre-inkubasies nie, en die sekondêre struktuur van die RNA-doelwitte kan hervorm word namate die temperatuur verlaag word. Gelukkig het die intermolekulêre basters van die primers en RNA-teikens gewoonlik groter stabiliteit as die haarnaaldjies, en die hibridisasie sal oor die algemeen plaasvind as inkubasie by temperature onder die Tm. Daar moet kennis geneem word dat die RNA-volgorde van die HCV-kontrole wat hier gebruik word vanaf die 5' UTR van die virale genoom is en 'n hoogs gevoude struktuur by kamertemperatuur het. Tog toon ons resultate duidelik dat die primer en HCV RNA hybridiseer tydens die pre-inkubasie in die lae-sout buffer.

In die meeste studies word omgekeerde transkripsie vir 15-30 minute uitgevoer. Ons het gevind dat die tyd kan verkort word tot 5 minute of minder as 'n pre-inkubasie met 'n lae temperatuur gebruik word. Die verkorte omgekeerde transkripsie stap is moontlik ook moontlik gemaak deur die verbeterde aktiwiteit van SuperScript III in die Tfi polimerase reaksie buffer. 'N RT-inkubasie van 90 s was voldoende om byna maksimum vlakke van 'n HCV cDNA te verkry, soos bepaal deur daaropvolgende CT waardes. Die verkorte RT-stap is belangrik, nie net vir die verskaffing van 'n vinniger diagnose nie, maar ook vir die beperking van verkeerde voorbereiding tydens die stap en meer konsekwente resultate. Gebeurtenisse wat verkeerd voorkom, kan die vorming van primer-dimeer deur Tfi-polimerase of deur die DNA-afhanklike DNA-polimerase-aktiwiteit van Superscript III insluit.

Die toetse wat hier beskryf word, het RNA suksesvol geïdentifiseer van verskillende FMDV-stamme wat gekies is om die genetiese variasie in die streek van die 3D-geen te dek wat met die wanpassing-verdraagsame sonde hibridiseer. Die laaste stappe in die ontwikkeling van die LATE-PCR panFMDV-toets is laboratoriumtoetse van virale monsters uit 'n wye reeks stamme wat al sewe serotipes dek, en veldtoetse in die BioSeeqII, 'n draagbare toestel wat beide monstervoorbereiding en RT-LATE uitvoer -PCR vir 'punt-van-sorg' diagnose van MKS in die veld. Hierdie toetse duur voort.

Die wanpas-tolerante aard van LAAT-PKR-probes en die vermoë om veelvuldige beperkende primers te gebruik, behoort dit moontlik te maak om 'n serotipe-spesifieke FMDV-toets te ontwerp. So 'n toets sal inligting verskaf wat belangrik is vir die keuse van entstowwe, die voorkoming van siektes en epidemiologie. Probes kan by die panFMDV-toets gevoeg word om addisionele volgordes binne die 3D-geen te identifiseer, maar hierdie strategie sal waarskynlik nie genoegsame inligting oplewer om alle serotipes en stamme ondubbelsinnig te onderskei nie omdat volgordes in hierdie streek nie tipies op 'n serotipe basis groepeer nie. Alternatiewelik kan die virale mantel 1D-geen geamplifiseer word deur 'n ander konsensusbeperkende primer en wanpas-verdraagsame sonde vir elke serotipe in kombinasie met 'n enkele oormaat primer in te sluit by die aangrensende 2A/B-gene, wat 'n relatief bewaarde volgorde het. Voorlopige resultate van die ontwerp is bemoedigend (Pierce en Wangh, ongepubliseer).


Toerusting

  • RNA (voorraad, ongeveer 1 μg/μL)
  • Kwantitatiewe RT-PCR Ready Mix (QR0200)
  • PCR -graad water: PCR -graad water (W1754 of W4502) as 20 ml -hoeveelhede vries, gebruik 'n vars aliquot vir elke reaksie.
  • Voorwaartse en omgekeerde primers konsentrasievoorrade (10 μM werkvoorrade is geskik vir gebruik in enkele reaksies, terwyl 100 μM werkvoorrade geskik is vir gebruik in multiplexreaksies).
  • Spesifieke doelopsporingsondersoeke (PCR/qPCR/dPCR Assay Design) gekonsentreerde voorrade (10 μM werkvoorrade is geskik vir gebruik in enkele reaksies, terwyl 100 μM werkvoorrade geskik is vir gebruik in multiplexreaksies).
    • Pasgemaakte oligo's kan by oligos bestel word.

    Abstrak

    By soogdiere was die studie van geenuitdrukking in die voorimplantasie -embrio moeilik omdat die standaardprosedures wat gebruik word om mRNA te kwantifiseer, oor die algemeen groot hoeveelhede uitgangsmateriaal benodig. Die ontwikkeling van protokolle deur gebruik te maak van verskillende kwantitatiewe strategieë wat oor die algemeen die polimerase kettingreaksie (PCR) behels, het nuwe instrumente verskaf vir die verkenning van geenuitdrukking in pre -inplantings embrio's. Die gebruik van 'n interne standaard, wat dikwels 'n huishoudelike geen genoem word, is egter noodsaaklik om die mRNA -vlakke te normaliseer. RNA -vlakke van agt huishoudelike gene is gekwantifiseer deur gebruik te maak van real -time PCR gedurende die hele pre -inplantingsperiode van die bees embrio om die mees geskikte geen te vind wat as standaard gebruik kan word. Histon H2a was die beste interne standaard omdat die transkripsievlakke konstant was oor die voor-inplantingsperiode. Lineêre versterking van antisense RNA met behulp van die T7 -promotor vir in vitro -transkripsie van die hele RNA -poel is geëvalueer as 'n geskikte manier om die uitgangsmateriaal vooraf te kwantifiseer voor kwantifisering en was effektief in die verskaffing van akkurate RNA -oorvloedprofiele gedurende die pre -inplantingsperiode. Die amplifikasie blyk egter templaatafhanklik te wees omdat die amplifikasiefaktore hoër was vir sommige gene.


    Amerikas

    Die webwerf sal in Engels vertoon word.

    Ons gebruik hierdie koekies om te verseker dat ons webwerf veilig en behoorlik funksioneer, dit is nodig vir ons dienste om te funksioneer en kan nie in ons stelsels afgeskakel word nie. Hulle word gewoonlik slegs ingestel in reaksie op aksies wat deur jou gemaak word wat neerkom op 'n versoek vir dienste, soos om aan te meld, 'n inkopiemandjie te gebruik of vorms in te vul. U kan u blaaier instel om u te blokkeer of u te waarsku oor hierdie koekies, maar sommige dele van ons dienste werk nie sonder hulle nie. Soos die ander koekies wat ons gebruik, kan streng noodsaaklike koekies óf eerstepartykoekies óf derdepartykoekies wees.

    Ons gebruik hierdie koekies om u instellings en voorkeure te onthou. Ons kan byvoorbeeld hierdie koekies gebruik om jou taalvoorkeure te onthou.
    Laat voorkeurkoekies toe

    Ons gebruik hierdie koekies om inligting te versamel oor hoe u met ons dienste omgaan en om ons te help om dit te meet en te verbeter. Byvoorbeeld, ons kan hierdie webkoekies gebruik om te bepaal of jy met 'n sekere bladsy interaksie gehad het.
    Laat prestasie-/statistiek -koekies toe

    Ons en ons advertensievennote gebruik hierdie koekies om advertensies te lewer, om dit meer relevant en betekenisvol vir u te maak en om die doeltreffendheid van ons advertensieveldtogte op te spoor, beide op ons dienste en op ander webwerwe en sosiale media.
    Laat bemarkingskoekies toe


    Aanvullende inligting

    Verslagdoening Opsomming

    Aanvullende tabelle

    Aanvullende tabel 1: bindingsparameters van SPR -eksperimente. Aanvullende Tabel 2a: lys van transkripsies wat aansienlik verryk is vir SMN-geprimeerde ribosome. Aanvullende Tabel 2b: lys van transkripsies wat beduidende veranderinge in aktiewe ribosoombesetting in SMA vertoon. Aanvullende Tabel 2c: data en karteringstatistieke van alle RNA-volgende ontledings van breinbeheer en op vroeë-simptomatiese SMA-stadium. Aanvullende tabel 3: lys van gene wat beduidend verryk is vir SMN-geprimeerde ribosome met beduidende veranderinge in die aktiewe ribosoombesetting in SMA. Aanvullende Tabel 4: lys van primers vir 5′ UTR kloning en SMN-spesifieke motiewe. Aanvullende tabel 5: lys van primers vir ddPCR en RT – qPCR. Aanvullende tabel 6: lys van primers vir ribosoomprofielering.


    Kyk die video: Laurika Rauch sing vir Mannetjies Roux (Oktober 2022).