Inligting

Hoe om monster voor te berei vir SDS BLADSY?

Hoe om monster voor te berei vir SDS BLADSY?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek neem gewoonlik my proteïenmonster 0.8ml en monsterbuffer (2X) 0.2ml vir my monstervoorbereiding in SDS PAGE. Gebruik ek die regte verhouding? my proteïenmonster konsentrasie is 4.1mg/ml. Wat is die standaard protokol?


Voorbereiding van monsters vir proteïengele is nie 'n ingewikkelde taak nie. Meng eenvoudig die gepaste hoeveelheid monsterbuffer met u monster en laai dit. Gebruik 'n 2x monsterbuffer gelyke hoeveelhede monster en buffer, vir 5x monsterbuffer gebruik 4 dele monster en 1 deel buffer (vir voorbeeld 40µl + 10µl). Verhit die gemengde monsters vir 5 minute by 95 ° C, afkoel dit onmiddellik op ys en plaas 'n gepaste hoeveelheid daarvan op die gel. Hoeveel moontlik is hang regtig af van die tipe gel wat jy gebruik - 20-30µl behoort gewoonlik moontlik te wees.

Moenie te veel proteïene laai nie, anders sal jy hulle nie behoorlik kan skei nie. Ek gebruik gewoonlik tussen 20-30 μg totale proteïen per putjie of so min as 50ng vir gesuiwerde proteïene (dit hang ook af van die teenliggaampies).

Kyk gerus op hierdie webblad vir meer inligting.

Vir voorbeeldbuffers gebruik ek gewoonlik die volgende resepte. Ek verkies die 5x, want ek kan meer proteïene laai as die voorbereiding nie baie goed is nie. Ek verkies ook die gebruik van DTT bo Mercaptoethanol, aangesien dit baie minder stinkend is. As jy geen DTT het nie (of mercaptoethanol verkies) kan dit vervang word deur 'n gelyke hoeveelheid (200mM in die 2x, 500mM in die 5x buffer). As u DTT gebruik, moet u hoeveelhede van die buffer maak en dit by -20 ° C stoor; 'n werkende hoeveelheid kan ongeveer twee weke by 4 ° C gehou word.

2x monster buffer:

  • 4% SDS
  • 20% gliserol
  • 100 mM Tris-Cl, pH 6,8
  • 2 mM EDTA (etileendiamien tetraasynsuur)
  • 200 mM DTT (dithiothreitol)
  • 0,1 % (w/v) broomfenolblou kleurstof

5x monsterbuffer

  • 10% SDS
  • 50% gliserol
  • 250 mM Tris-Cl, pH 6,8
  • 5 mM EDTA (etileendiamien tetraasynsuur)
  • 200 mM DTT (dithiothreitol)
  • 0,25 % (w/v) bromfenolblou kleurstof

Die Laemmli buffer word dikwels voorberei as 'n 2X of 4X oplossing en word met die monster gemeng tot 1X.

Die standaard Laemmli -monsterbuffer bevat:

Reagens Molekulêre gewig Konsentrasie (M of %) Voeg vir 50 ml 2X by Voeg by vir 50 ml van 4X
1X 2X 4X
Tris basis 1 121.14 0,0625 M 0,125 M 0,250 M 0,747 g 1,514 g
SDS 2 288.37 0,07 M (2%) 0,14 M (4%) 0,28 M (8%) 2 g 4 g
gliserol 92.09 10% 20% 40% 10 ml 20 ml
2-merkapto-etanol 78.13 5% 10% 20% 5 ml 10 ml
Broomfenol blou 3 691.94 - - - 100 mg 200 mg

1 Tris-basis is tris (hidroksimetiel) aminometaan. U kan die gebruik van kristallyne Tris vermy deur Tris -buffer te gebruik, ingestel met HCl tot 6,8.

2 SDS is natriumdodecylsulfaat.

3 Bromfenolblou is beskikbaar as natriumsout of oplossing. Sommige moderne protokolle gebruik hoër konsentrasie (0.005 % Bio-rad, 0.002 % Sigma-Aldrich) om helder kleur te verkry.

Let wel: Daar is baie resepte beskikbaar. Ons het 'n paar van hulle aan die einde verskaf. Hulle kan as 'n alternatief vir die samestelling hierbo gebruik word.


Hoe om bloedmonsters voor te berei vir western blotting? - (18/11/2007)

het ek 'n lyseringsstappe nodig as ek proteïene (groeifaktore) in die bloedmonster wil uitvee?
hoe berei ek my bloedmonster voor vir western blotting?

Dit is wat ek al verskeie kere gedoen het om 'n afgeskeide proteïen in serum te bestudeer (ek veronderstel dat dit dieselfde is vir 'n groeifaktor omdat dit normaalweg afgeskei word).

1.Sentrifugue bloed (3000 rpm 15 min) om serum te verkry (selle sal in die rooi korrel wees) waar jy jou proteïen van belang het.
2.Neem die serum en gooi die korrel weg.
3. Voer 'n toets uit om die proteïenkonsentrasie in serum te bepaal. Ek het Biuret beter gedoen as Bradford omdat die prot -konsentrasie in serum hoog is. Vir menslike serum het ek 77 mg/ml verkry.
4.Verdun jou monster in Laemmli buffer tot die hoeveelheid wat jy in die jel wil laai.
5. Doen die WB soos gewoonlik.
6. Let daarop dat die verhoogde konsentrasie van albumien in serum u proteïen kan masker. Ek beveel aan dat, om betroubare resultate te verkry, verseker dat die molekulêre gewig van u proteïen nie baie naby is aan die MW van albumien nie.

In my geval, met 'n minigel, was my proteïengewig 30 KDa (albumien is 66 KDa, dink ek), so ek het geen probleme gehad nie; hulle was geskei. Ek veronderstel dat as u proteïen ongeveer 60-70 KDa is, dit gemasker kan word. Ek dink dit hang af van die grootte van jou jel en hoe dit proteïene oplos. Maar ek het nie te veel ondervinding oor proteïenelektroforese nie, miskien kan ander lede jou beter raad gee.


Beginsel en protokol van natriumdodesielsulfaat-poliakrielamiedgelelektroforese (SDS-PAGE)

Die konsentrasie van poliakrielamiedgels kan voorberei word soos benodig in twee elektroforesestelsels—genoem “kontinue stelsel” en “diskontinue stelsel”. Die grootste kenmerk van "diskontinue stelsel" lê in sy sterk verbeterde monsterskeidingsresolusie. Die belangrikste kenmerke van hierdie elektroforese is: (1) Gebruik van twee jelstelsels met verskillende konsentrasies (2) Oplossingsamestelling en pH verskil vir die bereiding van die twee gel en verskil ook van elektroforese buffersamestelling en pH in elektroforese tenk. In die eksperiment word elektroforese gel in twee lae verdeel: die boonste is 'n makroporeuse gel met 'n lae konsentrasie, genoem stapelgel, buffer vir die formulering van hierdie laag is Tris-HCl, pH6.7 die onderste een is gatgom met hoë konsentrasies, genoem skeidingsgel of elektroforesegel, en die buffer hiervoor is Tris-HCl, pH8.9. Elektrodebuffer in die elektroforesetenk is Trisglisien, pH8.3. Uiteraard verskil die jelkonsentrasies, samestellings, pH en die elektroforesebufferstelsels van mekaar en vorm dus 'n diskontinue sisteem.

Tydens die eksperiment is die proteïenmonster in die stapel gel gelaai. Om te voorkom dat proteïenmonsters in die elektrodebuffer diffundeer, is 'n goeie keuse om 'n gelyke volume 40% sukrose of 50% gliserol by te voeg om die digtheid te verhoog. Om die mobiliteit van proteïenmonsters waar te neem, is dit beter om bromfenolblou kleurstof of ander spoorstofkleurstof in die monster te voeg. Hierdie gekleurde stowwe kan vinniger migreer as enige makromolekules. Solank die kleurstofdosis nie uit die gel beweeg nie, is daar geen gevaar vir die monster nie.

In die diskontinue stelsel, sodra die krag aangeskakel word, sal Glycine, proteïene, chloriedione en broomfenol in HCI in anion gedissosieer word, wat 'n ioonvloei vorm en na die anode beweeg. Die mobiliteit daarvan hang af van die aantal elektriese ladings van die ioon, molekulêre grootte en vorm. Toe die glisienione van elektroforese -buffer (pH8.3) egter in die stapelgel kom en 'n laer pH (6.7) teëkom, wat met byna twee eenhede verlaag het, byna naby die isoelektriese punt (5.97) van glisien, het die dissosiasiegraad van glisien skielik daal, die hoeveelheid lading het aansienlik verminder en toe het die mobiliteit stadiger geword. Proteïenmonster het in die stapelgel ingegaan, pH-veranderinge het ook 'n impak op die dissosiasiegraad daarvan, maar die impak is baie kleiner as op glisien. Dit het dus groter mobiliteit as glisien. Wat meer is, die poriegrootte van stapelgel is te groot om obstruksie vir proteïenmolekulêr te veroorsaak. In die stapelgel is die mobiliteit van verskillende ione dus in die volgorde van: glisien & ltproteïen & ltBPB & ltCl.

Die afname in dissosiasiegraad nadat die glisien die stapelgel binnegekom het, laat die skielike afwesigheid van mobiele ione vloei, wat lei tot verminderde geleidingsvermoë en afname in elektriese stroom. Die hele elektriese stroom van die ander deel van die elektroforesestelsel bly egter onveranderd. Op die basis dat geleidingsvermoë omgekeerd eweredig is aan potensiële gradiënt (E = I/n, E staan ​​vir potensiële gradiënt, I staan ​​vir huidige intensiteit en N staan ​​vir geleidingsvermoë), vorm daar skielik 'n hoë plaaslike potensiële gradiënt tussen Leading Ion-CI en stadige ioon-glisien. Proteïenkomponente in hierdie plaaslike potensiële gradiëntgebied migreer vinnig na die CI-ione-gebied met verskillende spoed onder die funksie van die hoë elektriese veld. Deur hierdie proses is die proteïenmonster 'n paar honderd keer gekonsentreer en word die proteïenkomponente in 'n sekere volgorde gerangskik om laag te vorm.

Toe die ioonvloei voortgaan om vorentoe te beweeg en die oplosgel binnedring wat deur 'n buffer van pH 8,9 berei is, het die proteïenmolekule weerstand ondervind. Toe het die mobiliteit stadig geword. Terselfdertyd, onder die toestande van pH8.9, sal glisien ten volle dissosieer. Die elektrisiteit daarvan sou toeneem, wat die verskynsel van ioonvermising uitskakel. Elke gedeelte van die gel herstel met 'n konstante elektriese sterkte. As gevolg van die sif -eienskappe van die gel, begin proteïene teen verskillende snelhede migreer. Kleiner proteïen-SDS-komplekse migreer vinniger as groter proteïen-SDS-komplekse. Binne 'n sekere reeks bepaal deur die porositeit van die gel, is die migrasietempo van 'n proteïen in die lopende gel omgekeerd eweredig aan die logaritme van sy MW.

Uit die beginsel hierbo gesien, is die belangrikste voordele van ononderbroke poliakrylamiedgelelektroforese dat wanneer die proteïenmonsters deur die stapelgel gaan, dit 'n dig saamgeperste laag kan vorm en in die skeidingsgel kan vloei. Met die proteïenkomponente wat voorheen geskei en in laag saamgepers is, kan dit die interferensie wat veroorsaak word deur die sone-oorvleueling verminder, en sodoende die onderskeidvermoë van elektroforese verbeter. Net as gevolg van hierdie voordeel kan 'n klein hoeveelheid proteïenmonsters ook goed geskei word.

Materiale en reagense

1. 30% akrielamied: weeg 29g akrielamied, 1g N, N & # 8211 metileen bis-akrielamied. Voeg 60 ml warm gedeïoniseerde water by en verhit tot 37 ℃. Voeg gedeïoniseerde water by om 'n finale volume van 100ml filter te maak. Dan het ons 30% (w/v) akrielamied voorraadoplossing Akrielamied en bis-akrielamied is stadig in akrielsuur en dubbel akrielsuur getransformeer tydens berging, dus moet die pH van die oplossing wees nie meer as 7.0 nie en dit moet in 'n wenkbroubottel by 4 ℃ geplaas word.

2. 10% natriumdodecielsulfaat (SDS): weeg 10g SDS en 90ml gedeïoniseerde water verhit tot 68 ℃ en voeg 'n paar druppels gekonsentreerde soutsuur by totdat die pH 7.2 word, dan water tot 100ml na die hele prosesse, ons het 10% (w/v) SDS.

3. Stapelgelbuffer (1 mol / L Tris-HCl pH 6,8): los 12,12 g Tris op in 80 ml gedeïoniseerde water. Verstel die pH na 6.8 met gekonsentreerde soutsuur, voeg gedeïoniseerde water by tot 100ml en stoor by 4℃.

4. Los gelbuffer op (1.5mol / L Tris-HCl pH 8.8): los 18.16g Tris op in 80ml gedeïoniseerde water, verstel die pH na 8.8 met gekonsentreerde soutsuur voeg gedeïoniseerde water by tot 100ml stoor by 4 ℃.

5. 10% ammoniumpersulfaat (AP): ammoniumpersulfaat verskaf die vrye radikale wat nodig is vir die katalise van die polimerisasie van akrylamied en bis-akrylamied Gebruik gedeïoniseerde water om 'n klein hoeveelheid van 10% (w/v) oplossing voor te berei en te bewaar by 4 ℃. Aangesien ammoniumpersulfaat stadig sal ontbind, moet dit elke tweede week vars voorberei word.

6. TEMED (N, N, N, N – tetramethylethylenediamine): deur ammouniumpersulfaat te kataliseer om vrye radikale te vorm, versnel TEMED die polimerisasie van akrylamied en bis-akrylamied. Aangesien TEMED slegs in 'n vrye basisvorm funksioneer, word die polimerisasiereaksie gerem as die pH laag is.

7. Tris-glisien elektroforese buffer: weeg 15,1 g Tris en 94 g glisien Los op in 900 ml gedeïoniseerde water, voeg dan 50 ml 10% (w/v) SDS en gedeïoniseerde water by tot 1000 ml. Verdun 5 keer wanneer dit gebruik word. Die finale konsentrasie sal wees: Tris, 25mmol/L glisien, 250mmol/L SDS, 0.1% en die pH van die buffer is 8.3.

8. Polyacrylamide gel elektroforese tenk en elektroforese kragtoevoer.

9. Dra pipet en punt oor, ens.

Werkingsmetode

1. Monteer glasplaat volgens die vertikale elektroforese-tenk-instruksies bepaal die konsentrasie en volume van die skei-gel. Berei die verlangde skei-gel voor volgens die bestanddele wat gelys is vir die voorbereiding van Tris-glisien SDS-poliakrielamied-gelelektroforese.

2. Spuit die skeidingsgel vinnig in die gaping van die twee glasblaaie en laat ruimte vir die infusie van stapelgel (kam tande lengte plus 1 cm) bedek die skeidingsgel met 0,1% SDS versigtig (wanneer die konsentrasie van akrylamied ≤ 8%) of isobutanol of water (wanneer die akrylamiedkonsentrasie ≥10%) kan die deklaag die verspreiding van suurstof in die gel voorkom en die polimerisasie van die gel belemmer, die gel vertikaal by kamertemperatuur plaas.

3. As die polimerisasie van die skeidingsgel voltooi is, gooi die dekvloeistof verskeie kere bo -op die gel om die akrylamied wat nie gepolymeriseer is nie, te verwyder, en sluit die vloeistof so ver moontlik op die gels uit.

4. Bepaal die volume van die stapelgel wat nodig is, berei die gewenste stapelgel voor volgens die bestanddele wat gelys is vir die bereiding van Trisglycine SDS-poliakrylamiedgelelektroforese van stapelgel. Pipetteer die stapelgel direk op die skeidingsgel en plaas skoon stut kam dadelik, om lugborrels te vermy, voeg dan stapelgeloplossing by om die gaping tussen kam te vul. Verwyder die kam na stapeling van gelpolimerisasie, dan word die monstergat gevorm.

5. Verdun 5-voudig van die Tris-glisien elektroforese buffer voorraadoplossing met gedeïoniseerde water gooi die oplossing in elektroforese tenk vul die monster gat sodat die borrels in die monster gate uitgesluit kan word deur die elektroforese buffer.


DMCA-klag

As u van mening is dat die inhoud wat op die webwerf beskikbaar is (soos omskryf in ons diensbepalings) inbreuk maak op een of meer van u outeursregte, moet u ons daarvan in kennis stel deur 'n skriftelike kennisgewing ('inbreukskennisgewing') met die onderstaande inligting aan die aangewese agent hieronder gelys. As Varsity Tutors optree na aanleiding van 'n oortredingskennisgewing, sal dit te goeder trou probeer om die party wat sodanige inhoud beskikbaar gestel het, te kontak deur middel van die mees onlangse e -posadres, indien enige, wat deur sodanige party aan Varsity Tutors verskaf is.

Jou oortredingskennisgewing kan aangestuur word na die party wat die inhoud beskikbaar gestel het of aan derde partye soos ChillingEffects.org.

Let asseblief daarop dat u aanspreeklik gehou sal word vir skade (insluitend koste en prokureursfooie) as u wesenlik wanvoorstel dat 'n produk of aktiwiteit u outeursreg skend. As u dus nie seker is dat inhoud wat op die webwerf geleë is of 'n skakel daaraan het, u kopiereg skend nie, moet u eers oorweeg om 'n prokureur te kontak.

Volg hierdie stappe om 'n kennisgewing in te dien:

U moet die volgende insluit:

'N Fisiese of elektroniese handtekening van die eienaar van die outeursreg of 'n persoon wat gemagtig is om namens hulle op te tree. detail sodat Varsity Tutors die inhoud kan vind en positief kan identifiseer. Ons benodig byvoorbeeld 'n skakel na die spesifieke vraag (nie net die naam van die vraag nie) wat die inhoud bevat en 'n beskrywing van watter spesifieke gedeelte van die vraag - 'n beeld, skakel, die teks, ens – jou klagte verwys na jou naam, adres, telefoonnommer en e-posadres en 'n Verklaring deur jou: (a) dat jy te goeder trou glo dat die gebruik van die inhoud wat jy beweer dat dit jou kopiereg skend, is nie deur die wet gemagtig is nie, of deur die outeursregteienaar of sodanige eienaar se agent (b) dat al die inligting in u inbreukberig akkuraat is, en (c) onder straf van meineed, dat u óf die eienaar van die outeursreg of 'n persoon wat gemagtig is om namens hulle op te tree.

Stuur jou klagte aan ons aangewese agent by:

Charles Cohn Varsity Tutors LLC
101 S. Hanley Rd, Suite 300
St. Louis, MO 63105


  • 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8
  • 2.5  % SDS
  • 0,002 % Broomfenol Blou
  • 0,7135 M (5%) β-merkaptoetanol
  • 10  % gliserol

Om 10 ml 10x aftreksel te maak

  • Los die volgende in 70  % gliserol / 30 en#160% water op:
    • 0,606 g Tris-basis
    • 2,5 g SDS
    • Pas die pH aan met behulp van pH -aanwyserstroke tot 6,8
    • Voeg 2 mg Bromophenol Blue by en maak seker die poeier is heeltemal opgelos
    • Pas die finale volume aan tot 10 ml met 70  % gliserol / 30 en#160% water voordat dit by -20 ° C geberg word.
    • Voeg die toepaslike volume van 'n β-merkapto-etanol 100% voorraad by jou monsters net voordat dit by 95°C gedenatureer word.

    Amerikas

    Die webwerf sal in Engels vertoon word.

    Ons gebruik hierdie koekies om te verseker dat ons webwerf veilig en behoorlik funksioneer, dit is nodig vir ons dienste om te funksioneer en kan nie in ons stelsels afgeskakel word nie. Hulle word gewoonlik slegs ingestel in reaksie op aksies wat deur jou gemaak word wat neerkom op 'n versoek vir dienste, soos om aan te meld, 'n inkopiemandjie te gebruik of vorms in te vul. U kan u blaaier instel om u te blokkeer of u te waarsku oor hierdie koekies, maar sommige dele van ons dienste werk nie sonder hulle nie. Soos die ander koekies wat ons gebruik, kan streng noodsaaklike koekies óf eerstepartykoekies óf derdepartykoekies wees.

    Ons gebruik hierdie koekies om u instellings en voorkeure te onthou. Ons kan byvoorbeeld hierdie koekies gebruik om jou taalvoorkeure te onthou.
    Laat voorkeurkoekies toe

    Ons gebruik hierdie koekies om inligting te versamel oor hoe u met ons dienste omgaan en om ons te help om dit te meet en te verbeter. Byvoorbeeld, ons kan hierdie webkoekies gebruik om te bepaal of jy met 'n sekere bladsy interaksie gehad het.
    Laat prestasie-/statistiek -koekies toe

    Ons en ons advertensievennote gebruik hierdie koekies om advertensies te lewer, om dit meer relevant en betekenisvol vir u te maak en om die doeltreffendheid van ons advertensieveldtogte op te spoor, beide op ons dienste en op ander webwerwe en sosiale media.
    Laat bemarkingskoekies toe


    Hoe om 'n monster voor te berei vir SDS PAGE? - Biologie

    4/12/98 Strategiese Beplanning: Proteïengelelektroforese word gebruik om proteïenmonsters te ontleed, en kan onder denaturerende toestande gebruik word om spesifieke komponente van 'n mengsel wat meer as een proteïen bevat te suiwer. Likenukleïensuur -elektroforese, die verhouding tussen lading en massa van elke proteïen bepaal die migrasietempo deur die gel. Omdat die koolstofruggraat van proteïenmolekules nie negatief gelaai is nie, word negatiewe lading verskaf deur die insluiting van natriumdodesielsulfaat (SDS) in die laai-, jel- en elektroforesebuffers. Die negatief gelaaide SDS bind aan die proteïen -ruggraat en veroorsaak dat die proteïen ontvou. Die hoeveelheid SDS wat aan proteïene gebind is, is eweredig aan die molekulêre gewig daarvan, en die migrasietempo deur die gel is eweredig aan die molekulêre gewig deur 'n log-lineêre verband. Omdat baie klein proteïene, minder as ongeveer 10KD, egter nie SDS goed bind nie, is klein proteïene moeiliker om op te los, en vereis dus gemodifiseerde elektroforese toestande. Elektroforese van kovalent gekoppelde proteïen-nukleïensuur samesmeltings kan ook gemodifiseerde toestande vereis vir optimale resolusie van verskillende spesies. Dit spruit uit die feit dat die nukleïensuurkomponent dikwels die oorgrote meerderheid van beide die molekulêre gewig en die negatiewe lading van fusiemolekules bydra, waardeur die elektroforetiese eienskappe van hierdie molekules verander word. Ek sal eers die voorbereiding en uitvoer van waarna ek verwys as 'n standaard proteïengel bespreek. Hierdie standaardgel is die stelsel wat gereeld gebruik word vir elektroforese van die meeste proteïenmonsters. Ek sal dan modifikasies bespreek wat gebruik word vir 'n beter oplossing van klein proteïene of peptiede, en ook modifikasies vir elektroforese van nukleïensuur-proteïenfusies.

    1. Standaard Proteïen-Gel Elektroforese

    Materiale 30% Acrylamide stock (37.5: 1 acrylamide: bisacrylamide) Tris Base en soutsuur SDS Ammonium Persulfate TEMED Glycine EDTA 50% Glycerol b-Mercaptoethanol Bromophenol Blue Pre-Stained Molecular Weight Markers (opsioneel) beskikbaar by GIBCO-BRL

    VOORBEREIDING VAN 'N PROTEIENGEL: Drie -basiese reagense word benodig wat uit die materiaallys hierbo berei kan word: (1) akrielamiedgelbuffers, (2) elektroforese buffer en (3) monster laai buffer.

    Die eerste stap is om die akrielamidegel voor te berei. Ek berei en werk byna altyd proteïengele met glasplate van 20 cm lank, en gebruik dit af en toe met behulp van die mini-gel-stelsel van die standaard. Standaard proteïengele bestaan ​​gewoonlik uit twee lae (figuur 1). stapelgel, en dit beslaan ongeveer 10-20% van die gelhoogte. Die stapellaag bevat 'n lae persentasie asielamied, gewoonlik 3,5-4,0%, en word gebuffer by pH 6,8. Die onderste laag akrielamied, wat die oorblywende gedeelte van die gel uitmaak, is die skei- of oplosgel. Die akrielamiedkonsentrasie van die skeidingsgel wissel na gelang van die monsters wat uitgevoer moet word. Gewoonlik word waardes van 8-15% akrielamied gebruik. Die pH van die skeigel is 8,8. Die verskil in pH en akrylamiedkonsentrasie by die stapel- en skeidingsgel -koppelvlakfunksies om die monster op die koppelvlak saam te pers en bied 'n beter resolusie en skerper bande in die skeidingsgel. Sommige mense kies om die stapelgel weg te laat, maar ek persoonlik stel dit nie voor nie.

    Die proteingel word voorberei op 'n manier wat baie ooreenstem met die nukleïensuur poliakrylamidegels, maar as 'n gel wat 'n stapelgel bevat, uitgegiet word, moet 'n onderafstandhouer gebruik word en die gel word in die vertikale posisie gegooi. Die akrielamiedoplossings word berei deur gebruik te maak van 'n voorraad van 30% akrielamied (37.5:1akrielamied: bisakrielamied) verdun tot die toepaslike konsentrasie in 1X stapel/skei gelbuffer. Om 'n gladde oppervlak te verkry en die bokant van die skeidingsgel aan die bokant te koppel, word isopropanol bo die gel geplaas terwyl dit polymeriseer. Nadat die jel heeltemal gepolimeriseer is, het die isopropanolis afgegooi, en die bokant van die jel word met gedeïoniseerde water afgespoel. Gebruik dan Whatman -papier om oortollige water van die geloppervlak en die glasplate versigtig op te suig. Met die kam in posisie bo-op die glasplate gooi ek die stapelgel bo-op die skeigel. Dit word die maklikste gedoen deur die akrielamiedoplossing in die gel te pipet.

    OPSTEL VAN 'N PROTEÏEN-GEL: Die primêre nota om hier te maak, is dat benewens die spoel van die putte, soos gedoen vir nukleïensuurgels, die spasie aan die onderkant van die gel wat geskep word deur die onderste spasieerder te verwyder, met 'n spuitnaald gespoel moet word om te spoel enige lugborrels wat die elektroforese kan belemmer. Vir hierdie doel het ek 'n spuitnaald wat ek gebuig het sodat dit in die spleet kan uitkom. 'N Laaste belangrike opmerking is dat die gelloopbuffer 'n tris-glisienbuffer is wat verskil van die buffer wat gebruik word om die gel voor te berei. Dit word gebruik teen 'n 1X konsentrasie.

    UITVOERING VAN MONSTERE OP 'N PROTEIENGEL: Soos 'n mens sou verwag, is monsters wat op 'n proteïengel uitgevoer word, baie soortgelyk aan 'n nukleïensuurgel. Die monster word voorberei deur dit in 'n gekonsentreerde monster laaibuffer te verdun sodat die laai buffer by 'n finale konsentrasie van 1X is. Die monsters word dan vir 3 minute by 90 0 C verhit en dan op die jel gelaai, wat nie vooraf gehardloop word voordat monster gelaai word nie. Proteïengele loop stadiger as nukleïensuurgele, en dit kan dus meer tyd verg. 'n Gel van 20 cm lank loop gewoonlik vir ongeveer 3-4 uur. Die benodigde tyd is natuurlik veranderlik, afhangende van die aard van die monster. Die monsters word ongeveer 2-3 watt vir ongeveer 30 minute in die stapelgelat geloop, waarna die krag tot 8-10 watt verhoog word totdat dit voltooi is. Ek bevat altyd 'n baan op die gel wat vooraf gekleurde molekulêre gewigmerkers bevat, wat twee doeleindes dien: (1) dit laat jou toe om die gel te monitor, 'n aanduiding van hoe die gel werk, en (2) molekulêre gewigaanwysers dat u kan bepaal hoe lank u die gel moet laat loop.

    BEVESTIG EN DROOG PROTEÏENJELS: Na voltooiing van elektroforese word die gel soos 'n nukleïensuurgel uitmekaar gehaal. Die stapelgel word verwyder, maar kyk of dit radioaktief is en gooi dit weg. As die gel 32 gemerkte monsters bevat, kan dit direk gedroog word, net soos 'n nukleïensuurgel. As die gel 35 S-metionienmonsters bevat, moet die gel vasgemaak word en dan gewas word in 'n gepatenteerde oplossing genaamd "amplify", beskikbaar by Amersham, wat verkort u blootstellingstyd aan outoradiografiefilm aansienlik. Om die gel vas te maak, word dit 20 minute lank gewas in 'n oplossing van: 50% metanol, 10% asynsuur en 40% water. Die gel word in water gespoel en dan 20 minute in die "versterkingsoplossing" gewas, waarna dit weer met water gespoel word. Die Amplify-oplossing kan 3-4 keer gestoor en hergebruik word, of meer as daar nie baie vrye metion is wat in die oplossing diffundeer nie. Met herhaalde gebruik sal hierdie gratis metionien 'n verhoging in die agtergrondvlak van jou gel veroorsaak. Die gel word oorgedra na saran wrap en dan na Whatman -papier, en laastens word dit onder vakuum gedroog. Jelle wat 32 P-monsters bevat, word blootgestel terwyl dit met saran-wrap bedek is. Die saran-wrap moet egter verwyder word van gels wat 35 Smonsters bevat. Dit is baie belangrik om 'n dun bedekking van babapoeier op die oppervlak van hierdie gels aan te bring, sodat die autoradiografiefilm nie aan die gel kleef nie. Ek wend dit aan, en vee die oortollige af met 'n kimwipe. Nie-radioaktiewe eienskappe word vasgemaak en gekleur met óf coomassie-blou, óf silwer vlekke. Hierdie protokolle is anders, maar aangesien ons tans nie hierdie tipe gels gebruik nie, dek ek dit nie. As iemand ooit vind dat hulle 'n nie-radioaktiewe gel moet vlek, sal ek graag 'n protokol by daardie tyd verskaf.

    RESEPTE:

    1. Stapelgelbuffer
    125 mM Tris-HCl pH 6,8
    0.1% SDS

    Om 'n 4X voorraad (500 ml) te maak:
    30,35 g Tris -basis pH tot 6,8 met HCl.
    20,0 ml 10% SDS (of 2,0 g vaste stof)

    400 ml ddH20

    2. Skeidende gelbuffer
    375 mM Tris-HCl pH 8,8
    0,1% VE 20,0 ml

    Om 'n 4x voorraad (500 ml) te maak
    91.0 g Tris basis pH'd tot 8.8 met HCl
    10% SDS (of 2,0 g vaste stof)

    350 ml ddH20

    3. Elektroforese buffer
    25 mM Tris pH 8,3
    250 mM glisien
    0.1% SDS
    pH = 8,3 sonder verstelling
    Om 'n 5X voorraad (1L) te maak:
    15,1 g Tris-basis
    72,0 g glisien
    5,0 g SDS

    850 ml ddH 2 O

    4. Proteïengelmonsterlaaibuffer
    50 mM Tris-HCl pH 6,8
    2% SDS
    10% gliserol
    1% b -Mercaptoethanol
    12,5 mM EDTA
    0,02 % broomfenolblou
    Om 'n 4X voorraad (10 ml) te maak
    2.0 ml 1M Tris-HCl pH 6.8
    0,8 g SDS
    4,0 ml 10% gliserol
    0,4 ml 14,7 M BME
    1,0 ml 0,5 M EDTA
    8 mg Bromophenol Blue
    2. SDS Tricine Gels: Verbeterde resolusie van peptiede minder as 10 KD.

    STRATEGIE: Ek gebruik hierdie gelstelsel vir die oplossing van peptiede, en veral vir die oplos van monsters van vertaalreaksies. Alhoewel die RNA-proteïensamesmeltingsmolekules baie groter is as 10 KD, het ek gevind dat hierdie stelsel die skerpste bande gee, en die beste resolusie van beide die ongefuseerde peptied en die RNA-peptiedfusie. Met die huidige pool, 232 nukleotied -RNA -transkripsie wat vir 'n 7,4 KD peptied kodeer, gebruik ek 8,5% skeidingsgel en 'n stapelgel van 4%. Hierdie gelstelsel is gebaseer op die van Sh & aumlgger en von Jagow (Analytical Biochemistry 1987. 166, 368-379), maar as u die naslaanbrief opsoek, sal u besef dat ek dit effens aangepas het. Ek het dit naamlik vereenvoudig deur 'n enkele elektroforesebuffer vir beide die anode- en katode-reservoirs te gebruik, en ek gebruik 'n akrielamied:bisakrielamiedverhouding van 37.5:1.

    Materiale 30% Acrylamide stock (37.5: 1 acrylamide: bisacrylamide) Tris Base en soutsuur Tricine Glycerol Ammonium Persulfate b -Mercaptoethanol TEMED Bromophenol Blue SDS Pre -faint Molecular Weight EDTAMarkers (optional)

    BEREIDING VAN DIE GEL: Hierdie gel word tegnies voorberei soos hierbo beskryf. Waar dit verskil, is die buffers wat gebruik word vir die bereiding van die gel en vir elektroforese. Die resepte word hieronder in detail beskryf. Ek gebruik 'n baie vlak stapelgel wat ongeveer 5% van die totale gelhoogte uitmaak. Voorbeeld laai buffer, en monster voorbereiding is dieselfde as hierbo beskryf.

    1. Gelbuffer:
    1,0 M Tris-HCl, pH 8,45
    0,1% SDS


    Om 'n 3X voorraad (500 ml) te maak
    181,6 g Tris -basis

    340 ml ddH20

    2. Elektroforesebuffer:
    100 mM Tris pH = 8,25
    100 mM Tricine
    0.1% SDS


    Om 'n 10X voorraad (500 ml) te maak
    60,56 g Tris -basis
    89,60 g Tricine
    5,0 g SDS

    400 ml ddH 2 O
    pH = 8.25 sonder aanpassing

    3. 8,5 % skeidingsgel (30 ml):
    8,5 ml 30% akrielamied (37,5: 1)
    10,0 ml 3X gelbuffer
    8,5 ml 50% gliserol
    3,0 ml ddH20

    4. 4% stapelgel (7,5 ml):
    1,0 ml 30% akrielamied
    2,5 ml 3X gelbuffer
    2,0 ml 50% gliserol
    2,0 ml ddH 2 O

    HARDING VAN DIE GEL: Die gel word uitgevoer soos hierbo beskryf. Ek gebruik 2 ul van 'n 12,5 ul translasie reaksie op die gel (plus 4 ul gel laai buffer). Ek het begin om 0.1% Triton X-100 en 2M ureum in my monsterlaaibuffer in te sluit omdat dit lyk of ek minder goed aan die bokant van die skeigel het. Ek voer die monster oor die algemeen in die stapelgel by 2 watt vir 20 minute, gevolg vir 20 minute by 6 watt. Ek verhoog dan die krag na 8 watt en laat die gel vir so 3 ure laat loop. Die broomfenolblou hoef nie na onder te loop nie. Ek hou daarvan om dit so 60-75% na onder te laat loop.

    VAS EN DROOG VAN DIE GEL: Dieselfde soos hierbo beskryf. 'n Oornagblootstelling van die gel aan outoradiografie is voldoende. Blootstelling aan die fosforimager verg ongeveer 2 dae blootstelling.

    3. TBE-Ureumgels: Elektroforese van kern-suur-proteïenfusies.

    STRATEGIE: TBE-ureum gels (nukleïensuur gels) kan gebruik word vir monsters wat nukleïensuur-proteïen samesmelting bevat om 'n baie goeie resolusie van proteïen en nie-proteïen konjugate te gee. In hierdie stelsel word die negatiewe lading van daardie molekules wat die jel binnedring verskaf deur die aangehegte nukleïensuur. Vir hierdie tipe gel is die monsterladingbuffer die standaard ureum -laaibuffer wat vir nukleïensure gebruik word. Hierdie stelsel werk die beste as die monster nie 'n komplekse mengsel van baie proteïene is wat aggregate met 'n hoë molekulêre gewig kan vorm nie. Daarom het ek nie gevind dat dit baie goed werk met ru-translasie-reaksiemonsters nie, maar onlangs het ek matige sukses behaal deur 0.1% triton X-100 by beide die gelbuffer en die laai van die monster te voeg. Nietemin, ek gebruik tans nie hierdie tipe jel vir die ontleding van samesmeltingsmonsters nie, maar eerder die SDS-trisienstelsel wat hierbo bespreek is. Ek gebruik gewoonlik "proteïen-gel akrielamied"-voorraad om hierdie gels voor te berei, want die hoër akrielamied:bisacrylamideratio (37.5:1) werk gewoonlik beter met hierdie monsters. Ek berei die akrielamiedoplossing voor om 8 M ureum, 1X TBE, en die toepaslike konsentrasie akrielamied te bevat. Ek het oor die algemeen gels gebruik wat wissel van 6-10% akrielamied. Die huidige swembad genereer samesmeltings wat ongeveer 94 KD is,

    87 KD nukleïensuur en 7,4 KD peptied. Vir hierdie molekules sal ek ongeveer 'n 6% gel gebruik. Ek het baie gels van hierdie tipe gebruik, en ek sal graag besonderhede en aanpassing vir 'n spesifieke toepassing bespreek.


    Hoe om 'n monster voor te berei vir SDS PAGE? - Biologie

    TRICINE GELS-protokol

    Vir lae MW proteïene (& lt25000) en peptiede

    Hou in porties van 1ml by -20C

    OPLOSSINGS Skeidende gel
    Kort gels: 4 Groot gels: 2
    Skeidende gel
    Kort gels: 2
    Stapelgel
    Kort gels: 4
    Stapelgel
    Kort gels: 2
    Akrylamied oplossing 10 ml 5,00 ml 2,12 ml 1,05 ml
    Gel buffer 10 ml 5,00 ml 5 ml 2,5 ml
    Gliserol 70% 4 ml 2,00 ml 0 ml 0 ml
    H2O 6,2 ml 3,1 ml 13,44 ml 6,70 ml
    10% TPT 133 & mikrol 66 en mikrol 160 &mikrol 80 &mikrol
    TEMED 13,2 & mikrol 6,6 ul 16 &mikrol 8 & mikrol

    Voeg TEMED en APS aan die einde by. Draai die fles saggies om te meng, en wees versigtig om nie borrels te genereer nie. Pipetteer die oplossing tot 'n vlak van 4 cm
    die top. Voeg 0,3 ml n-butanol by. 'n Baie skerp vloeistof-koppelvlak sal binne 10-20min sigbaar wees. Laat die jel vir ten minste nog 'n uur polimeer. Spoel die oppervlak van die gel met H2O voordat die stapelgel gegooi word.

    Voordat die monsterbuffer bygevoeg word, hou monsters by 0&°C. Voeg die SDS -monsterbuffer (RT) by die monster (nog op ys) en kook onmiddellik 3 tot 5 minute by 100 ° C. MOENIE die monster in SDS-monsterbuffer laat sonder om te verhit nie endogene proteases is baie aktief in SDS-monsterbuffer en kan ernstige afbraak veroorsaak. Sodra dit verhit is, kan die monster 'n kort tydjie by kamertemperatuur bly totdat dit gelaai word, of lank by -20 ° C.
    Vir 'n geldikte van 0,75 mm en 15 putte word 10-25 g proteïen van 'n komplekse mengsel toegedien, met kleurstof met Coomasie Blue en 0,5 tot 5ug vir monsters vir een of paar proteïene. As silwer vlek gebruik word, kan 10 tot 100 keer minder proteïen gebruik word.
    Monsters kan gekonsentreer word of interferensies (soute, ens.) uitgeskakel word met TCA, asetoon, TCA-DOC, etanol, ens. (sien aangehegte protokol). Veral kaliumione moet verwyder word aangesien hulle die SDS presipiteer.
    Sommige proteïene, soos kern-nie-histonproteïene en membraanproteïene, benodig die teenwoordigheid van 8M ureum in die SDS-monsterbuffer om volledige oplosbaarheid te verkry.
    Sommige membraangebonde proteïene ondergaan aggregasie by temperature bo 40-50 & degC. In hierdie geval, inkubeer 30 minute by 40 °C met monster buffer.
    'N Verskuiwing in die migrasieafstande van proteïene
    met interne disulfiedbrue kan waargeneem word deur monsters in SDS te inkubeer in die teenwoordigheid of afwesigheid van reduktiemiddels (mercaptoethanol, DTT, DTE, ens.)

    Looptoestande: Begin hardloop by 60mA 200V 10 minute (om monsters in stapelgel te kry), en gaan dan voort met 35mA 200V