Inligting

BSA vir foutopsporing van mislukte PCR's?

BSA vir foutopsporing van mislukte PCR's?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek gebruik PCR om 'n 1000bp -gebied van die CytB mt -geen te versterk. Sommige van die monsters was nie versterk nie, en ek wil die reaksiekomponente verander (of bymiddels soos BSA gebruik) om te probeer versterk. Die DNA is onttrek uit lewer-/spiermonsters, so ek verwag nie baie remmers nie, maar ek elimineer monsters in AE -buffer.

Ek het die volgende kombinasies van PCR-mengsel gebruik, maar die reaksies het steeds misluk (reaksievolume 20ul)

Kombinasie1: MasterMix (10ul), Primer 1 (1ul), Primer 2 (1ul), BSA 2mg/ml (2ul), water (4ul), DNA (2ul) Kombinasie2: MasterMix (10ul), Primer 1 (1ul), Primer 2 (1ul), BSA 2mg/ml (4ul), water (3ul), DNA (1ul): Probeer om BSA-konsentrasie te verhoog en DNA te verminder om die volume inhibeerders (indien enige) wat in die reaksiemengsel ingaan, te verminder.

Iemand wat voorheen BSA gebruik het om PCR's suksesvol op te los, gaan ek op die regte manier te werk? As ek 'n ander benadering moet volg, help my asseblief.

Dankie!


BSA vir die oplos van mislukte PCR's? - Biologie

Die artikel spreek baie vrae aan wat verband hou met reagense wat in PCR-reaksies gebruik word, insluitend die foutkoerse van DNA-polimerases en opnameresultate gebaseer op formele artikels. 'N Tipiese PCR -protokol en 'n paar gereeld gestelde vrae is ook ingesluit.

Raadpleeg die huidige PCR -metodes vir 'n bespreking oor verskillende PCR -metodes PCR -masjiene vir 'n opname oor PCR -masjiene gebaseer op literatuur en sagtewareprogramme in biomediese navorsing vir 'n bespreking en opname -resultate oor molekulêre biologie sagtewareprogramme, insluitend dié vir PCR -primerontwerp.

Verskeie PCR -polimerases is by kommersiële verskaffers beskikbaar. Die polimerases is van verskillende bronne en met verskillende grade van replikasiegetrouheid en met verskillende uitbreidingspoed. Tabel 1 gee 'n lys van die belangrikste PCR -polimerases en 'n paar van hul belangrike kenmerke. Taq-polimerase is aanvanklik gesuiwer van T. aquaticus selle, en later is die geen gekloon en in E. coli-selle uitgedruk. Die rekombinante Taq -polimerase, genaamd AmpliTaq DNA -polimerase, is algemeen gebruik [2]. Taq-polimerase kan chemies geïnaktiveer word by lae temperature, en hierdie verandering kan by 'n hoë temperatuur omgekeer word, hierdie temperatuurafhanklike omkeerbare modifikasie van die Taq-proteïen, AmpliTaq Gold, wat voorkom in mengsels soos Thermo Power SYBR ™ Green PCR Master Mix, kan gebruik as die warmbegin PCR-ensiem [2]. Phusion-DNA-polimerase versmelt Pfu-DNA-polimerase met die DNA-bindende proteïen, Sso7d, van S. solfataricus [3] om sy prosessiwiteitsprestasie te verhoog, terwyl die hoë getrouheid van Pfu-polimerase behou word [2]. Gespesialiseerde DNA-polimerases is ook ontwerp [4].

Labome stel stelselmatig inligting saam oor reagense, instrumente en sagtewareprogramme uit ewekansig geselekteerde formele artikels. Tabel 2 gee 'n lys van die mees algemene PCR -polimerases en hul belangrikste verskaffers uit 'n opname van formele artikels met verwysing na DNA -polimerases vir PCR. Byvoorbeeld, Liu Y et al het RNA-vlakke van veelvuldige gene van muis-peritoneale makrofage in qPCR gemeet met SYBR Green Realtime PCR Master Mix van TOYOBO (QPK-201) deur QuantStudio 7 Flex van Thermo Fisher Scientific na totale RNA-ekstraksie met TRIzol-reagens en reverse transkripsie met behulp van ReverTra Ace qPCR RT Master Mix met gDNA Remover van TOYOBO (FSQ301) [15]. Chopra S et al het PerfeCTa SYBR groen fastmix van Quantabio en TaqMan Universal PCR meestermengsel van Thermo Fisher gebruik vir kwantitatiewe RT-PCR [16]. Flaherty SE et al het die uitdrukking van veelvuldige gene in beenmurg-afgeleide makrofage met kwantitatiewe PCR geëvalueer deur gebruik te maak van QIAGEN PCR SYBR Green I QuantiTect Master Mix [21].

Die foutkoerse van DNA -polimerases is afhanklik van die PCR -toestande. Byvoorbeeld, toe die reaksie-pH van pH 8 na 9 verander het, het die foutsyfer van Pfu ∼2-voudig afgeneem en die fouttempo van ekso-gebrekkige Pfu het ∼9-voudig [36]. Dr. Peter McInerney en kollegas het in 2014 ses algemeen gebruikte DNA-polimerases in PCR-toepassings in buffers wat deur verkopers aanbeveel word, vergelyk [1]. Figuur 1 gee 'n lys van die tabelle uit hul artikel, wat aandui dat Pfu (Agilent), Phusion (Finnzymes) en Pwo (Roche) 10 X minder foute as die gewone Taq -polimerase veroorsaak het en dat die meeste foute oorgangsmutasies is. Q5 High-fidelity-polimerase van NEB, gebaseer op 'n nuwe DNA-polimerase, blyk een van die gewilde polimerase met 'n lae foutkoers [37, 38] te wees. Volgens sy verskaffer, NEB, het dit 'n foutkoers

280 keer laer as dié van Taq DNA Polimerase. Boettcher S et al gebruik Q5 High-Fidelity DNA-polimerase vir New England Biolab (M0491L) vir TP53 MITE-seq skerm [39]. de Goffau MC et al het ten doel gehad om bakteriële 16S rRNA geen uitputtend op te spoor van menslike plasentale weefsels met dieselfde Q5 polimerase [40]. D Cervettini et al. Het dit ook gebruik vir hul werk oor die ontwikkeling van nuwe aminoasiel-tRNA sintetase-tRNA pare [41]. Invitrogen Platinum SuperFi DNA Polimerase met 100 × hoër getrouheid in vergelyking met inheemse Taq, is gebruik in hoë uitgloeiingsstrengendheid PCR om APP geen somatiese mutasies in Alzheimer siekte en normale neurone op te spoor [22]. Lee J et al gebruik PrimeSTAR GXL DNA-polimerase van Clontech om enige mutasie buite die teiken op te spoor in TALEN-gemedieerde LMNA genomiese redigering [42].

PCR-reaksies kan direk op biologiese monsters uitgevoer word sonder enige vooraf suiwering van DNA-molekules. Dr. Miura en kollegas het ses direkte PCR-tipe DNA-polimerases (KOD FX, Mighty Amp, Hemo KlenTaq, Phusion Blood II, KAPA Blood en BIOTAQ) vergelyk in gedroogde bloed wat uit 'n filtreerpapier met TE-buffer geëlueer is en tot die gevolgtrekking gekom dat KOD FX was die beste vir bloedgebaseerde direkte PCR as gevolg van sy weerstand teen bloedkomponent-inhibisie en teen ligte skoonmaakmiddels [43].

DNA templates, primers, ddH2O, DNA -polimerase van kommersiële verskaffers met spesifieke reaksie buffers, dNTP's, MgSO4 (opsioneel) en DMSO (opsioneel).


BSA, molekulêre biologie graad

Die volgende reagense word by hierdie produk voorsien:

Stoorbuffer

20 mM Tris-HCl
100 mM KCl
0,1 mM EDTA
50% gliserol
pH 8 @ 25 & degC

Metgeselprodukte

  • B9000Datablad-Lot0011301
  • B9000Gegevensblad-Lot0011306
  • B9000Gegevensblad-Lot0011406
  • B9000Gegevensblad-Lot0011403
  • B9000Gegevensblad-Lot0021403
  • B9000Gegevensblad-Lot0081404
  • B9000Gegevensblad-Lot0031409
  • B9000Datablad-Lot0051502
  • B9000Gegevensblad-Lot0061506
  • B9000Gegevensblad-Lot0071511
  • B9000Gegevensblad-Lot0081601
  • B9000Gegevensblad-Lot0091603
  • B9000Gegevensblad-Lot0101607
  • B9000Gegevensblad-Lot0111610
  1. Wat is die bron van jou BSA?
  2. Wat is die buffersamestelling van u BSA?
  3. Hoekom moet ek BSA by my reaksie voeg?
  4. Is die BSA in sy oorspronklike vorm?
  5. Kan ek u BSA as 'n merker vir molekulêre gewig gebruik?
  6. Kan ek u BSA as konsentrasie -standaard gebruik?
  7. Wat is die verskil tussen BSA (B9001S) wat gestaak is, teenoor BSA, graad molekulêre biologie (B9000S)?
  8. Hoekom sien ek bykomende DNS-bande op my jel na 'n beperkingsvertering?
  9. Waarom sny my beperkingensiem nie DNA nie?
  10. Waarom sien ek 'n DNA -smeer op 'n agarosegel na 'n beperking?
  11. Hoeveel nukleotiede moet ek by die RE -herkenningsterrein voeg om doeltreffend te sny?
  12. Is die BSA asetileer?

Gereedskap vir produkaanhaling

Spesifikasies

  • B9000S_v1_0161802
  • B9000S_v1_0171803
  • B9000S_v1_10009983
  • B9000S_v1_10016817
  • B9000S_v1_10019779
  • B9000S_v1_10021425
  • B9000S_v1_10024698
  • B9000S_v1_10028862
  • B9000S_v1_10031199
  • B9000S_v1_10036291
  • B9000S_v1_10037313
  • B9000S_v1_10041622
  • B9000S_v1_10043774
  • B9000S_v1_10045577
  • B9000S_v1_10048048
  • B9000S_v1_10050913
  • B9000S_v1_10054773
  • B9000S_v1_10056382
  • B9000S_v1_10059003
  • B9000S_v1_10062038
  • B9000S_v1_10065261
  • B9000S_v1_10068234
  • B9000S_v1_10073280
  • B9000S_v1_10075172
  • B9000S_v1_10079103
  • B9000S_v1_10082649
  • B9000S_v1_10085543
  • B9000S_v1_10091352
  • B9000S_v1_10093221
  • B9000S_v1_10097971
  • B9000S_v1_10098505
  • B9000S_v1_10105384
  • B9000S_v1_10109473
  • B9000Gegevensblad-Lot0011301
  • B9000Gegevensblad-Lot0011306
  • B9000Datablad-Lot0011406
  • B9000Datablad-Lot0011403
  • B9000Datablad-Lot0021403
  • B9000Datablad-Lot0081404
  • B9000Gegevensblad-Lot0031409
  • B9000Gegevensblad-Lot0051502
  • B9000Gegevensblad-Lot0061506
  • B9000Gegevensblad-Lot0071511
  • B9000Datablad-Lot0081601
  • B9000Gegevensblad-Lot0091603
  • B9000Gegevensblad-Lot0101607
  • B9000Gegevensblad-Lot0111610

Hierdie produk word gedek deur een of meer patente, handelsmerke en/of outeursregte wat besit of beheer word deur New England Biolabs, Inc (NEB).

Terwyl NEB sy produkte vir verskillende toepassings ontwikkel en bekragtig, kan die gebruik van hierdie produk van die koper vereis om bykomende intellektuele eiendomsregte van derde partye vir sekere toepassings te verkry.

Kontak NEB se Global Business Development -span by [email protected] vir meer inligting oor kommersiële regte.

Hierdie produk is slegs vir navorsingsdoeleindes bedoel. Hierdie produk is nie bedoel om gebruik te word vir terapeutiese of diagnostiese doeleindes by mense of diere nie.

New England Biolabs (NEB) is daartoe verbind om etiese wetenskap te beoefen &ndash ons glo dit is ons taak as navorsers om die belangrike vrae te vra wat, wanneer dit beantwoord word, sal help om ons lewenskwaliteit en die wêreld waarin ons leef te bewaar. Hierdie navorsing moet egter altyd op veilige en etiese wyse gedoen word. Leer meer.


BSA vir foutopsporing van mislukte PCR's? - Biologie

Massaspektrometrie, chromatografie, spektroskopie, sagteware, ontbinding, monsterhantering en vakuumtegnologiekursusse

Voortgesette opleiding op aanvraag

Instrumentopleiding en werkswinkels

Regstreekse of on-demand webinars oor produkbekendstellings, toepassings en sagtewareverbeterings

Wêreldwye handelskoue, konferensies, plaaslike seminare en gebruikersgroepvergaderings

Lab Bestuursdienste

Diensplanne, herstelwerk op aanvraag, voorkomende instandhouding en herstel van dienssentrums

Sagteware om fasiliteite, toegang tot/gebruik van instrumente, monsterverwerking en meer te bestuur

Instrument/sagteware-kwalifikasies, konsultasie en data-integriteit-validasies

Onderhou, optimaliseer, implementeer of ontwikkel metodes op nuwe/bestaande Agilent-oplossings

Die nuutste tagtegnologie wat gebruik word om hulpbronne op te spoor sonder om personeel te ontwrig

Ander dienste Opskrif1

CrossLab Connect-dienste gebruik laboratoriumdata om beheer en besluitneming te verbeter

Bevorder laboratoriumbedrywighede met laboratoriumwye dienste, batebestuur, hervestiging

Verkort die tyd wat dit neem om die volle waarde van u instrumentbelegging te sien


Additiewe effekte van beeserumalbumien, ditiothreitol en gliserol op PCR

Die effekte van beeserumalbumien, ditiothreitol en gliserol op PCR is bestudeer. PCR onder standaardtoestande het die amplifikasie van 'n enterohemorragiese E. coli -DNA -fragment misluk toe die gekookte bakteriese sellysaat as sjabloon gebruik is. Die byvoeging van óf een van beeserumalbumien, dithiothreitol, óf gliserol in die reaksiemengsel het die spesifieke fragmentversterking moontlik gemaak en die optimum konsentrasies was soos volg: beeserumalbumien, 1 mg/ml dithiothreitol, 10 mM en gliserol, 5%. Toe al die drie middels by die bogenoemde konsentrasies ingesluit is, is die PCR -opbrengs verder verhoog. Die effek van die drie-agent mengsel was nie die patroon spesifiek nie. Verder het die mengsel lang PCR van meer as 20 kb moontlik gemaak toe Taq DNA-polimerase met 3'-5 'eksonuklease-aktiwiteit vir die amplifikasie gebruik is. Ons eenvoudige PCR-metode laat robuuste PCR toe, onafhanklik van sjabloonsuiwerheid of amplifikasielengte.


Rekombinante albumien, graad molekulêre biologie

Moet BSA of albumien van 'n dierlike bron vermy word? Rekombinante albumien, molekulêre biologie graad, is 'n nie-bees afgeleide albumien wat kan dien as 'n alternatief vir Bees Serum Albumin (BSA). Soos BSA, is getoon dat dit adhesie van ensieme aan reaksiebuise en pipetoppervlaktes voorkom. Dit stabiliseer ook sommige proteïene tydens inkubasie. Kies Rekombinante Albumien, wanneer dit nodig is om BSA te vermy.

Ekwivalente stabiliteitsprestasie tussen BSA en rekombinante albumien. BSA en rekombinante albumien word gebruik om ensieme in 'n reaksie te stabiliseer. NcoI -HF (NEB #R3193) is geformuleer met óf BSA, molekulêre biologie graad of rekombinante albumien en daarna vir 2 jaar by -20 & degC geberg. Serieverdunnings is dan uitgevoer. Die data toon ekwivalensie tussen ensiem geformuleer met BSA, molekulêre biologie graad en rekombinante albumien.

Rekombinante albumien wat kan dien as 'n alternatief vir BSA, wat die hechting van ensieme aan reaksiebuise en pipetoppervlaktes kan voorkom, asook sommige proteïene tydens inkubasie stabiliseer. Doen navraag oor aangepaste formulerings met rekombinante albumien.

Reagens verskaf

Die volgende reagense word saam met hierdie produk voorsien:

Stoorbuffer

20 mM Tris-HCl
100 mM KCl
0,1 mM EDTA
50% gliserol
pH 8 @ 25°C


Verwysings

Meyerhans, A., Vartanian, J.P. & Wain, H.S. DNA -rekombinasie tydens PCR. Nukleïensure Res. 18, 1687–1691 (1990).

Polz, M.F. & amp; Cavanaugh, C.M. Vooroordeel in sjabloon-tot-produk-verhoudings in multitemplate PCR. Appl. Omgewing. Mikrobioloë. 64, 3724–3730 (1998).

Qiu, X. et al. Evaluering van PCR-gegenereerde chimeras, mutasies en heteroduplekse met 16S rRNA geen-gebaseerde kloning. Appl. Omgewing. Mikrobioloë. 67, 880–887 (2001).

Ghadessy, F.J., Ong, J.L. & Holliger, P. Gerigte evolusie van polimerase-funksie deur kompartementaliseerde selfreplikasie. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. VSA 98, 4552–4557 (2001).

Ghadessy, F.J. et al. Generiese uitbreiding van die substraatspektrum van 'n DNA-polimerase deur gerigte evolusie. Nat. Biotegnologie. 22, 755–759 (2004).

Nakano, M. et al. Enkel-molekule omgekeerde transkripsie polimerase kettingreaksie met behulp van water-in-olie emulsie. J. Biosci. Bioeng. 99, 293–295 (2005).

Wetmur, J.G. et al. Molekulêre haplotipering deur die koppeling van emulsie PCR: analise van paraoxonase 1 haplotipes en fenotipes. Nukleïensure Res. 33, 2615–2619 (2005).

Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K.W. & Vogelstein, B. Transformasie van enkele DNA-molekules in fluoresserende magnetiese deeltjies vir opsporing en opsomming van genetiese variasies. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. VSA 100, 8817–8822 (2003).

Kojima, T. et al. PCR-versterking van enkele DNA-molekules op magnetiese krale in emulsie: toepassing vir 'n hoë deursettingskeuring van transkripsiefaktor-teikens. Nukleïensure Res. 33, e150 (2005).

Margulies, M. et al. Genoomvolgordebepaling in mikrovervaardigde hoëdigtheid pikoliterreaktore. Natuur 437, 376–380 (2005).

Shendure, J. et al. Akkurate multiplex polonie volgorde van 'n ontwikkelde bakteriese genoom. Wetenskap 309, 1728–1732 (2005).


Amerikas

Die webwerf sal in Engels vertoon word.

Ons gebruik hierdie koekies om te verseker dat ons webwerf veilig en behoorlik funksioneer, dit is nodig vir ons dienste om te funksioneer en kan nie in ons stelsels afgeskakel word nie. Hulle word gewoonlik slegs ingestel in reaksie op aksies wat deur jou gemaak word wat neerkom op 'n versoek vir dienste, soos om aan te meld, 'n inkopiemandjie te gebruik of vorms in te vul. U kan u blaaier instel om u te blokkeer of u te waarsku oor hierdie koekies, maar sommige dele van ons dienste werk nie sonder hulle nie. Soos die ander koekies wat ons gebruik, kan streng noodsaaklike koekies óf eerstepartykoekies óf derdepartykoekies wees.

Ons gebruik hierdie koekies om u instellings en voorkeure te onthou. Ons kan byvoorbeeld hierdie koekies gebruik om jou taalvoorkeure te onthou.
Laat voorkeurkoekies toe

Ons gebruik hierdie koekies om inligting te versamel oor hoe u met ons dienste omgaan en om ons te help om dit te meet en te verbeter. Byvoorbeeld, ons kan hierdie webkoekies gebruik om te bepaal of jy met 'n sekere bladsy interaksie gehad het.
Laat prestasie-/statistiek -koekies toe

Ons en ons advertensievennote gebruik hierdie koekies om advertensies te lewer, om dit meer relevant en betekenisvol vir u te maak en om die doeltreffendheid van ons advertensieveldtogte op te spoor, beide op ons dienste en op ander webwerwe en sosiale media.
Laat bemarkingskoekies toe


Ammoniumsulfaat verbeter sensitiwiteit en vermy vals negatiewe van polimerase kettingreaksie (PCR) vir die opsporing van skaalvalsiektevirus (SDDV)

Akkuraatheid is van kardinale belang vir polimerase kettingreaksie (PCR) diagnostiese laboratoriums. Ons het inkonsekwente PCR -resultate of vals negatiewe opgemerk wat soms plaasgevind het by die verandering van die handelsmerk van Taq DNA -polimerase -ensiem. Hier het ons 6 primer-stelle getoets wat spesifiek is vir 3 belangrike akwakultuurvirusse (skaalvalsiektevirus (SDDV), tilapia-meervirus (TiLV) en witvleksindroomvirus (WSSV)) met behulp van 7 handelsmerke van Taq DNA-polimerase-ensieme (RBC Bioscience, Invitrogen, PCRBiosystems, Bio-Helix, biotechrabbit, GeneAll en New England BioLabs) met hul oorspronklike reaksie buffers. Vals negatiewe opsporing en variasie in sensitiwiteit van 10-1000 keer is waargeneem. Dit is interessant dat slegs ensieme van RBC Bioscience en Invitrogen SDDV 252 bp -produkte kan versterk, terwyl 5 ander handelsmerke dit nie kon doen nie. Die gebruik van reaksiebuffer van RBC Bioscience met Taq-polimerase-ensieme van ander handelsmerke het gelei tot verbetering van opsporingsensitiwiteit en vals negatiewe vermy. Vergelyking van bestanddele van die 7 reaksiebuffers het aangedui dat beeserumalbumien (BSA) en ammoniumsulfaat teenwoordig was in die RBC Bioscience buffer maar afwesig of nie gespesifiseer in 6 ander handelsmerke nie. Vervolgens het ons gevind dat die byvoeging van ammoniumsulfaat by die oorspronklike buffers van die 4 geselekteerde handelsmerke die opsporingsdoeltreffendheid vir die meeste toetsreaksies verbeter het, terwyl die byvoeging van BSA alleen of BSA plus ammoniumsulfaat geen of min verbetering getoon het nie. As dit getoets word met seriële verdunnings van DNA wat uit 2 SDDV-besmette visse onttrek is, kan die byvoeging van ammoniumsulfaat in die oorspronklike buffer van die biotechrabbit-merk 100 keer die opsporingsgevoeligheid verbeter, gelykstaande aan die resultaat van die RBC Bioscience-kit. Ons beveel dus aan dat PCR -reaksiebuffer met ammoniumsulfaat (10 mM) bygevoeg die opsporingsgevoeligheid kan verbeter en vals negatiewe resultate in PCR -opsporingstoetse kan vermy.

Dit is 'n voorskou van intekeninginhoud, toegang via jou instelling.


BSA vir die oplos van mislukte PCR's? - Biologie

IN DIE SOMER VAN 1984 die senior wetenskaplikes van Cetus Corp., 'n biotegnologiemaatskappy in Berkeley, het hulself in die moeilikheid bevind. Een van hul werknemers, 'n belowende jong wetenskaplike met die naam Kary Mullis, het 'n tegniek bedink om klein stukkies DNA eksponensieel te herhaal. Hy noem dit polimerase kettingreaksie (PCR), en as dit werk, sal dit die wêreld verander en waarskynlik Cetus 'n berg geld verdien. Die enigste probleem was Mullis was 'n interpersoonlike wrakbal.

Hy het met sy base baklei. Hy het met sy kollegas baklei. Hy het met Cetus-sekuriteitswagte en ontvangsdames baklei. Hoewel hy getroud was, het hy met sy laboratoriummaats uitgegaan - en ook met hulle baklei. Agter Mullis se onwrikbaarheid blyk 'n blywende sekerheid te wees dat hy briljant is en dat almal 'n dwaas is, wat sy werk wil ondermyn. Cetus-bestuur het gewonder: Wat maak ons ​​met hierdie ou?

PCR het uiteindelik die wêreld verander, en Mullis het by die geledere van UC Berkeley se 53 Nobelpryswenners aangesluit. Die bekroonde is in Augustus 2019 op die ouderdom van 74 oorlede aan komplikasies van longontsteking.

'N Hele aantal sterfkennisse het behendig om Mullis se netelige persoonlike eienskappe gedans, maar miskien is daar nou genoeg tyd verby dat ons 'n vraag kan beantwoord wat nie anders is as die wat Cetus -bestuur in 1984 gedoen het nie: Hoe moet ons hierdie man onthou?

HET DINGE 'N BIETJE ANDERS GEGAAN, PCR sou moontlik 'n glans in die oog van sy uitvinder gebly het. Gelukkig vir Mullis - en waarskynlik die res van ons - het hy 'n advokaat gehad.

Jare tevore as 'n doktorale student in biochemie by Berkeley, het Mullis naby aan 'n jonger klasmaat genaamd Tom White gegroei nadat hy gehelp het om 'n stukkende klep op White se stukkende VW-gogga te herstel.

'Ek het gesê, as u hierdie man Mullis aanstel, is hy 'n uitstekende sintetiese chemikus. Ek het geweet dat hy 'n goeie apteker was, want hy het hallucinogene medisyne in Berkeley gesintetiseer. "

"[Mullis] het my as 'n universele minister bedien," sê White. 'En ek het die huwelikseremonie vir sy tweede vrou in die hippiedae op die kampus gehou.

Mullis was berug in Berkeley vir sy oneerbiedige benadering tot die wetenskap en sy vaardigheid in die sintese van psigedeliese middels. Sy nuuskierigheid strek veel verder as chemie. Op 22 het hy 'n artikel na die gesogte tydskrif gestuur Natuur beskryf, in sy woorde, “die hele heelal van begin tot einde”.

'Ek het baie gelees oor astrofisika en 'n paar psigo -aktiewe middels geneem, wat my begrip van die kosmos verbeter het,' onthou Mullis in sy memoires, Dans kaal in die gedagteveld. Die artikel was getiteld “The Cosmological Significance of Time Reversal”. Ongelooflik, Natuur dit gepubliseer het. Nie sleg vir 'n gegradueerde in biologie nie.

Toe die tyd aanbreek vir sy mondelinge eksamens, was Mullis onvoorbereid. White onthou: 'Hy het sy stellings nie reggekry nie. Hy het nie algemene biochemie geken nie. ” Mullis het self geglo dat dit die Natuur artikel wat die wiele met die komitee gesmeer het. Net so was sy tesis so eksentriek dat die proefskrifkomitee aanvanklik geweier het om daarop af te teken. Volgens White het verskeie van sy goeie vriende sy konsepte geredigeer in 'n poging om "al die ghacko-goed daaruit te sny." Tog het die finale weergawe sy eienaardigheid behou.

"Die diep geheimenisse van die kosmos is uiteindelik binne ons bereik," skryf Mullis in die slot. “Die vraag wat ons onsself moet afvra, is of ons verder moet gaan of nie. Miskien is daar organismes met ander ysterbindings op ander planete. Kernmagnetiese resonansie wag. Sal hulle die gierige vingers en prikkelende oë van die tweebeen soogdier ontsnap?”

In sy herinneringe onthou Mullis hoe hy langs die donker pad gegaan het en by homself gedink dat die idee hom beroemd sou maak dat hy die Nobelprys sou wen.

Na baie steun van Mullis se adviseur, onderteken die komitee.

Nadat hy afgestudeer het, verhuis Mullis na Kansas met vrou nommer twee, skei, ontmoet toekomstige vrou nommer drie en keer dan terug na Berkeley. Terwyl hy 'n kafee in besit van sy eerste vrou bestuur het, het hy sy ou vriend Tom White, nou 'n postdoc by UCSF Medical Center, raakgeloop. White het vir Mullis 'n laboratoriumwerk by UCSF gekry. Kort daarna is White aangestel as navorsingswetenskaplike by Cetus Corp. En weer het hy vir Mullis gaan kolf.

'Ek het gesê, as u hierdie man Mullis aanstel, is hy 'n uitstekende sintetiese chemikus,' sê White. 'Ek het geweet dat hy 'n goeie apteker was, want hy het hallucinogene medisyne in Berkeley gesintetiseer.

Ten spyte van die feit dat hy min van molekulêre biologie geweet het, is Mullis gehuur om in die maatskappy se DNA-sinteselaboratorium te werk waar hy die taak gehad het om die produksie van oligonukleotiede te stroomlyn, klein molekules wat gebruik word om dele van natuurlike DNA vir studie te isoleer. Danksy sy vindingrykheid het die produksie van oligonukleotiede gegroei. Toe White bevorder word tot direkteur van molekulêre en biologiese navorsing, het hy Mullis hoof van die DNA -sinteselaboratorium geword.

Een van die hoofprojekte by Cetus was die strewe om 'n algemene diagnostiese DNS-toets vir siekte te skep. Wetenskaplikes van Cetus het 'n metode ontwikkel om klein fragmente van DNA te isoleer en te toets op relevante mutasies. Die probleem was dat die doelfragmente in sulke klein hoeveelhede was, en dat die monsters so vol was met ander stukkies DNA, dat die toetsuitslae swak en dubbelsinnig was.

Mullis was nie deel van die DNA -diagnostiese span nie (hy was nie juis gekwalifiseerd nie), maar soos gewoonlik het sy hiperaktiewe gedagtes gedwaal. '[Cetus -bestuur] het gesê dat 10 persent van u tyd moet doen wat u wil,' het Mullis later in 'n onderhoud gesê. 'Ek het gesê, dit is vir hulle moeilik om te meet wat 10 persent van my tyd is. Dus kan ek soveel van my tyd gebruik as wat ek wil vir my eie nuuskierigheid. ” Een van daardie nuuskierighede was die uitdaging wat die DNS-diagnostiese span in die gesig staar.

Mullis het later die doelwit -DNA -fragmente geïdentifiseer, soos om 'n spesifieke kenteken op die snelweg 5 van die maan af te lees. Om sy metafoor verder te neem, het Cetus-wetenskaplikes 'n kragtige genoeg teleskoop gehad om nommerplate te lees, maar hulle het gesukkel om die teikenmotor van al die ander op die snelweg te onderskei.

'Hy het eintlik niks van molekulêre biologie geweet nie. En toe hy aan al die molekulêre bioloë probeer sê dat dit 'n goeie idee was, was die meeste van hulle baie skepties. "

Dit is gepas dat Mullis se belydenis in sy motor kom terwyl hy deur die heuwels van die Mendocino County ry. Hy het geredeneer dat deur twee oligonukleotiede aan 'n gesplete DNA-string te heg, hy 'n gewenste gedeelte kan isoleer, soos die DNA-segment wat sekelselanemie bepaal. Deur polimerase, 'n natuurlike ensiem wat vir DNA-replikasie benodig word, by te voeg, kon hy twee identiese kopieë van die fragment skep. Sy volgende gedagte het hom soos 'n openbaring getref: As hy eenvoudig hierdie proses herhaal, sal elke herhaling die teikenfragment verdubbel, 'n eksponensiële ontploffing van die teiken-DNS skep en die ongewenste segmente uitwis. In wese sou Cetus -wetenskaplikes nou 'n verkeersknoop hê om deur hul teleskoop te ondersoek. En belangrik, elke motor sal dieselfde nommerplaat hê.

In sy herinneringe onthou Mullis hoe hy langs die donker pad gegaan het en by homself gedink dat die idee hom beroemd sou maak dat hy die Nobelprys sou wen.

Hy het dit polimerase-kettingreaksie genoem en sy bom-idee gretig aan ander wetenskaplikes by Cetus gerapporteer. Hulle was nie beïndruk nie. Dit was nie die eerste sogenaamde "revolusionêre" idee wat Mullis voorgehou het nie.

"Hy het regtig niks van molekulêre biologie geweet nie," sê White. 'En toe hy aan al die molekulêre bioloë probeer sê dat dit 'n goeie idee was, was die meeste van hulle baie skepties. Wetenskaplikes is altyd skepties. ”

Vir Mullis was die skeptisisme 'n belediging. Na 'n aantal mislukte eksperimente het hy resultate gekry wat hy geglo het dat PCR gewerk het. Maar Mullis was nog nooit 'n deeglike eksperimentalis nie, en hierdie pogings om sy konsep te bewys, het nie gepaste kontroles en herhaling gehad nie. Die skeptici bly skepties.

Mullis se wisselvallige gedrag by Cetus het hom nie gehelp om iemand na sy kant te bring nie. 'N Ondernemingspartytjie moes vroeg gesluit word nadat Mullis amper met 'n ander wetenskaplike in die gesig gestaar het. Hy het ook met 'n kollega in sy laboratorium begin uitgaan, en die twee was betrokke by rusies van openbare minnaars. In een voorval het hy jaloers geword oor romantiese interaksies tussen twee laboratoriummaats en gedreig om 'n geweer werk toe te bring.

'Dit het my beslis in 'n moeilike posisie geplaas,' sê White. "Sy gedrag was so verregaande dat die ander wetenskaplikes gedink het dat die enigste rede waarom ek hom nie reguit afgedank het nie, was dat hy 'n vriend van my was."

Mullis het 'n ewige wrok. Hy het gevoel hy is afgeruk, dat White, Erlich, Randall Saiki en ander krediet gesoek het vir wat net syne behoort te wees. Hy het hulle aasvoëls genoem.

In plaas daarvan het White besluit om Mullis 'n laaste skoot te gee om te bewys of PCR werk. Hy het hom as hoof van die DNA -sinteselaboratorium verwyder en hom aangesê om voltyds te werk om sy idee te bewys. "Ek het geweet Mullis is so 'n vasberade, obsessiewe persoonlikheid dat hy op 'n fenomenaal gekke manier daaraan sou werk om dit te laat werk, ongeag wat," sê White. White het 'n aparte groep eksperimentele spesialiste opdrag gegee om parallel aan die projek te werk.

Gedurende die volgende paar maande, terwyl Mullis aanhou om dubbelsinnige resultate te lewer, het die tweede groep onder leiding van Henry Erlich en Norman Arnheim die boerpot behaal. Mullis was heeltyd reg. PCR het gewerk.

Die tegniek was 'n wetenskaplike keerpunt. Binne net 'n paar jaar het die gebruik van PCR ontplof, wat die uitbreiding van die biotegnologiebedryf aangevuur het. Berkeley, professor in molekulêre en selbiologie, David Bilder, sê: 'PCR het 'n rewolusie in alles gemaak. Dit het werklik die molekulêre biologie aangedryf - wat toe ander velde getransformeer het, selfs verafgeleë soos ekologie en evolusie. ... Dit is onmoontlik om die impak van PCR te oorskat. Die vermoë om soveel DNA van 'n spesifieke volgorde te genereer as wat u wil, vanaf 'n paar eenvoudige chemikalieë en 'n paar temperatuurveranderings - dit is net magies. "

In 1986 het Mullis sy werk by Cetus bedank. Voordat hy vertrek het die bestuur hom 'n bonus van $ 10 000 toegeken vir sy idee, maar die regte op PCR behoort aan die onderneming. Jare later sou Cetus daardie regte vir $300 miljoen verkoop. Mullis het 'n ewige wrok. Hy het gevoel hy is afgeruk, dat White, Erlich, Randall Saiki en ander krediet gesoek het vir wat net syne behoort te wees. Hy het hulle aasvoëls genoem.

Hy verhuis na La Jolla, begin branderplankry, en draai grootliks sy rug op die wetenskap. Maar die wetenskap was nie heeltemal klaar met hom nie. Op 13 Oktober 1993 het Mullis om 06:15 uit Swede gebel. 'Baie geluk, dr Mullis,' sê die stem. “Ek is verheug om aan u te kan aankondig dat u die Nobelprys ontvang het.”

"Ek sal dit neem!" Antwoord Mullis.

AS JY EEN VAN DIE TIENE MILJOENE WAS van Amerikaners wat ingeskakel het op die O.J. Simpson -verhoor in Maart 1995, het u moontlik 'n blik op Mullis in die galery gesien. Hy is deur O.J. se verdediging as 'n deskundige getuie gehuur om die aanklaer se DNS-bewyse in twyfel te trek. Normaalweg sou 'n Nobelpryswenner in jou span 'n aas in die gat wees, maar Mullis was meer soos die grapjas in die dek.

Hy het 'n skerp kritikus geword van algemeen aanvaarde wetenskaplike idees, en het die bespotting gemaak van die feit dat KFK die osoongat veroorsaak, dat mense klimaatsverandering veroorsaak en dat MIV vigs veroorsaak. Hoofstroomwetenskaplikes was korrup, beweer hy, en lok finansiering vir hul navorsing deur paranoia te versprei.

"Wetenskaplikes kan iets wees om ons te vermaak en lekker dinge vir ons uit te vind," het Mullis geskryf. 'Hulle hoef nie hul bestaan ​​te regverdig deur ons uit ons verstand te skrik nie.

Ironies genoeg het Mullis ook die DNA -analise wat deur sy uitvinding van PCR moontlik gemaak is, bevraagteken - dus die belang van die Simpson -regspan in sy dienste. Moeilikheid het gekom toe die vervolging hul plan duidelik gemaak het om Mullis se geloofwaardigheid te ondermyn deur sy teenstrydige wetenskaplike sienings en sy dwelmgebruik aan te haal (hy het steeds met LSD gedobbel). Adjunk D.A. Rockne Harmon het die hof versoek om te verseker dat Mullis nie te veel suur sal bevat terwyl hy getuig nie.

Op die ou end het die verdediging gekies om nie die risiko om hul Nobelgetuie op die tribune te plaas nie, en dit was waarskynlik vir die beste. Mullis het geskryf dat as hulle het, hy beplan het om wraak te neem op Harmon deur hom voor die jurie – en die wêreld – te beskuldig van 'n geheel en al saamgeflansde voorval waarby twee jong seuns in 'n park betrokke was. "Ek dink LSD sou verbleek het langs fiktiewe jong seuns," het hy geskryf.

As die O.J. Simpson-hoofstuk van Mullis se post-Nobel-lewe was vreemd, dit was net in pas met die res daarvan. Hy het grootliks professionele wetenskap opgegee en saam met branderplankry het hy begin rolskaats, kitaar gespeel en astrologie studeer. Hy was 'n stigter van 'n onderneming genaamd StarGene, wat beplan om juweliersware te verkoop met die DNA van dooie bekendes daarin. "Ek is nie 'n 'ernstige' genie soos Einstein nie," het hy aan die Los Angeles Times. 'Ek is 'n meer speelse soort genie.'

In 1994 is Mullis genooi om oor PCR te praat by die jaarlikse wetenskaplike vergadering van die European Society for Clinical Investigation. In plaas daarvan het hy die geleentheid gebruik om die wetenskap agter vigsmedisyne te betwis. Die voorsitter van die organisasie beskryf later die prestasie van Mullis in 'n blaserige brief wat in Natuur: "Sy praatjie was in styl rondloop en in inhoud onvanpas vir 'n openbare verskyning van 'n leier van die wetenskap. ... Sy enigste skyfies (oor wat hy sy 'kuns' genoem het) was foto's wat hy geneem het van naakte vroue met gekleurde ligte wat op hul liggame geprojekteer is. " Sy bespreking van vigs was “onsamehangend en onbeduidend”.

Professor Randy Schekman vergelyk hom met die man in die Wit Huis. 'Hy is die ekwivalent van molekulêre biologie van Donald Trump in terme van sy persoonlike
gedrag.”

Sy siening oor vigs het nie net sleg gelyk nie; dit het moontlik dodelike gevolge gehad. Teen die laat negentigerjare was Suid -Afrika te midde van 'n katastrofale vigs -epidemie. President Thabo Mbeki, onder die betowering van VIGS -ontkennings, waaronder Mullis, het verklaar dat VIGS deur armoede veroorsaak word, nie MIV nie. Baie Suid-Afrikaners is toegang tot behandeling geweier. 'N 2008-studie gepubliseer in die Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome Na raming is 35 000 babas met MIV gebore en 330 000 Suid -Afrikaners is onnodig aan vigs dood.

'Ek sal hom nooit daarvoor vergewe nie,' sê White.

Dit is nie ongewoon dat Nobelpryswenners hul nuutgevonde roem gebruik om hul troeteldieroorsake te bepleit nie. Berkeley-professor in selbiologie, Randy Schekman, het die Nobelprys in 2013 gewen en sy nuwe kansel gebruik om lesings te gee en artikels te skryf wat basiese navorsing, openbare hoër onderwys en open source-tydskrifte bevorder. Wat ongewoon is, is dat 'n laureaat hul Nobelprys gebruik om ander wetenskaplikes en die instellings wat hul loopbaan gekweek het, te beklemtoon.

Toe Mullis die Nobel wen, het Schekman daardie jaar met een van die ander bekroondes ’n weddenskap aangegaan dat Mullis die enigste Amerikaanse Nobelpryswenner sou wees wat nooit tot die Nasionale Akademie van Wetenskappe verkies sou word nie. "Ek kan nou op daardie weddenskap insamel," sê hy. "Mullis sou nie kwalifiseer nie omdat hy nie genoeg onafhanklike koerante gepubliseer het om eers oorweeg te word nie."

Schekman, wat Mullis se Nobel 'n 'volledige toeval' noem, vergelyk hom met die man in die Withuis. "Hy is die molekulêre biologie-ekwivalent van Donald Trump in terme van sy persoonlike gedrag," sê hy.

Die Nobelprys het Mullis 'n stortvloed van media-aandag gebring, terwyl verslaggewers regoor die wêreld geskarrel het vir 'n onderhoud met die malcap-wetenskaplike. Die meeste van die gevolgde profiele beskryf Mullis as 'n grillige, sjarmante storieverteller wat geniet van wat hy sy 'vakansielewe' noem. Maar Emily Yoffe, 'n verslaggewer wat deur gestuur is Esquire om hom persoonlik in La Jolla te ondervra, 'n ander prentjie geskets. Sy beskryf 'n dom ego met 'n roekelose streep. "Mullis voer nie gesprekke nie," het sy geskryf, "hy hou uit en spoeg opinies soos 'n walvis wat sy blaasgat skoonmaak." Sy het opgemerk dat sy yskas bedek was met foto's van gedeeltelik geklede vroue met wie hy uitgegaan het. Op 'n stadium tydens hul onderhoud in sy woonstel het Mullis haar aan die nek gegryp en probeer om haar met geweld te soen. Sy weerlê hom. Maar hy het weer probeer. En weer. Hy vra haar: 'Hoe kan u sê dat u my ken sonder om by my te slaap?'

'Kary was so aanhoudend en so verregaande en het teen die einde so nare geword dat hy meer en meer dronk geword het,' het Yoffe gesê. Tipies, vir so 'n belangrike profiel, was sy van plan om verskeie onderhoude met die onderwerp te voer. Nie hierdie een nie. "Ek het gedink, ek gaan beslis nie weer saam met hom in 'n kamer wees nie."

In Esquire Yoffe het geskryf dat "... genialiteit en gentiliteit nie altyd dieselfde chromosoom deel nie."

EEN NAG IN 1985, terwyl Mullis op sy eiendom in Mendocino County gaan stap het, het hy 'n gloeiende wasbeer teëgekom.

'Goeienaand, dokter,' het die wasbeer gesê.

Die volgende ding wat Mullis onthou het, het hy in die lig van die oggend langs 'n nabygeleë pad gestap, 'n tydgaping wat hy aan vreemdelinge-ontvoering toegeskryf het. Hy beskryf die ontmoeting in sy memoires, Dans kaal in die gedagteveld.

"Mullis het 'n goeie idee gehad, wat hy opgevolg het met jare se wanvoorstelling en selfbevordering."

In die boek vertel Mullis ook sy weergawe van die uitvinding van PCR. Dit is die verhaal van 'n eensame genie wat, toe hy nie vroue oor die astrale vlak gejaag het nie, geveg het teen korporatiewe oorheersers en klein, offensiewe bestuurders om polimerase-kettingreaksie na die wêreld te bring. Dit is 'n aantreklike verhaal, een wat Mullis aktief gekweek het, sê Berkeley-antropoloog Paul Rabinow.

"Die publiek wil individuele genieë sien en miskien is daar sulke dinge, ek weet nie," sê hy. "[Mullis] het besef dat dit die soort storie is wat verkoop word en waaroor mense stories sou skryf."

In sy eie boek, Maak PCR, 'n etnografiese geskiedenis van die ontwikkeling van PCR, gee Rabinow 'n meer genuanseerde en deeglike weergawe.

"Die strewe na ... wetenskaplike waarheid is nie 'n individuele spel nie," sê Rabinow. 'Dit verg verskillende bydraes ... om so iets te laat gebeur. En dit is nie om enige krediet van Mullis weg te neem nie. Dit is net nie wat wetenskap is nie. ”

Rabinow het Erlich en Saiki, twee wetenskaplikes wie se eksperimentele strengheid PCR moontlik gemaak het, gevra hoe hulle daaroor voel dat Mullis die Nobel wen. 'Ek voel sleg dat ek nie beter daaroor kon voel nie,' het Saiki gesê. "Kary het sy goeie punte en slegte punte, die punt is dat ons saamgewerk het." Erlich het gesê: 'Mullis het 'n goeie idee gehad, wat hy opgevolg het met jare van wanvoorstelling en selfbevordering. Die herskryf van geskiedenis was meer produktief as om vraestelle te skryf.”

Miskien is die beste manier om Mullis en sy uitvinding van PCR te onthou om ruimte te maak vir die ander wat dit 'n werklikheid gemaak het.


Genomiese DNA PCR - RE vertering van gDNA voor amplifikasie (Sep/14/2005)

Hallo,
Ek wil PCR 'n nie-koderende gebied versterk vanuit genomiese DNA (1,5 kb). Na verskeie mislukte pogings om die genoemde gebied te versterk, het ek besluit om PCR uit te voer van gDNA wat verteer is met 'n beperkingsensiem wat nie in die volgorde van belang sny nie. Ek dink dat vertering op een of ander manier gDNA 'n beter sjabloon kan maak. Miskien kan gesnyde DNA meer toeganklik wees vir Taq of kan dit minder sekondêre struktuur hê of kan dit makliker gedenatureer word. Ek weet nie.

Om seker te maak dat ek eintlik die volgorde van my belangstelling versterk, wil ek die gDNA -sjabloon verteer met 'n beperkingsensiem wat binne die amplikon sny, en dan sal ek dit PCR doen. Ek verwag dat as my primers spesifiek is, hulle nie daardie sjabloon sal versterk nie.

Vertel my asseblief wat u daarvan dink of as u nog idees het om moeilike sjablone te versterk.

Is die gebied wat u 'n hoë GC wil versterk? Dit kan probleme veroorsaak met die smelt van die sjabloon en uiteindelik die PCR. U kan probeer om betaïne of DMSO by te voeg om sekondêre strukture te verbreek. Ek vind ook dat 'n warm begin van 10 minute werk (die taq word bygevoeg nadat die 10 minute verby is). As u in die eerste ronde 'n versterking van u 1,5 kb gekry het, behoort die normale smeltyd (30 sekondes - 1 minuut) genoeg te wees, aangesien die sjabloon klein is.

quote=Marvilla, 15 September 2005, 14:17]
Hallo,
Ek wil PCR 'n nie-koderende gebied versterk vanuit genomiese DNA (1,5 kb). Na verskeie mislukte pogings om die genoemde gebied te versterk, het ek besluit om PCR uit te voer van gDNA wat verteer is met 'n beperkingsensiem wat nie in die volgorde van belang sny nie. Ek dink dat vertering op een of ander manier van gDNA 'n beter sjabloon kan maak. Miskien is gesnyde DNA meer toeganklik vir Taq, kan dit minder sekondêre struktuur hê of kan dit makliker gedenatureer word. Ek weet nie.

Om seker te maak dat ek eintlik die volgorde van my belangstelling versterk, wil ek die gDNA -sjabloon verteer met 'n beperkingsensiem wat binne die amplikon sny, en dan sal ek dit PCR doen. Ek verwag dat as my primers spesifiek is, hulle nie daardie sjabloon sal versterk nie.

Vertel my asseblief wat u daarvan dink of as u nog idees het om moeilike sjablone te versterk.

By watter konsentrasie gebruik jy DMSO in jou PCR's?,

Benewens DMSO, word daar ander middels in PCR gebruik om probleme met die sekondêre struktuur te oorkom? Vertel my asseblief hoe gebruik u dit (konsentrasie)?

Ek gebruik gewoonlik 5-10% DMSO vir PCR's van genomiese DNA. U moet ook in ag neem dat versterking in die eerste paar siklusse baie ondoeltreffend kan wees, dus probeer 35 PCR-siklusse of versterk u produk weer (doen 20 siklusse, en neem 'n paar daarvan as 'n model in 'n ander PCR).

Vertering behoort ook met die PCR te help.

By watter konsentrasie gebruik u DMSO in u PCR's ?,

Benewens DMSO, word daar ander middels in PCR gebruik om probleme met die sekondêre struktuur te oorkom? Vertel my asseblief hoe gebruik u dit (konsentrasie)?


Kyk die video: Delphi XE5 Android Up and Running EN (September 2022).


  1. Tyndareus

    Ek vra om verskoning, maar na my mening erken u die fout. Voer ons bespreek.

  2. Wylingford

    It seems to me a magnificent idea

  3. Hungas

    Ek vra om verskoning, dit kom nie naby my nie. Kan die variante nog bestaan?

  4. Whitfield

    How often does a person have to choose between a tit in his hands and a crane hovering over his head. But in reality, he chooses between fears. He is afraid to leave everything as it is, if it does not suit him. And he is afraid that he will not achieve what he hopes for, but will lose the tit.

  5. Schmaiah

    Hurray Hurray .... Skrywer Senks!



Skryf 'n boodskap