Inligting

Elektroporasie vs geengewere

Elektroporasie vs geengewere


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wat is die voor- en nadele van die gebruik van elektroporators (links) en geengewere (regs) vir transformasie in terme van:

  • Prys
  • Doelorganisme
  • Doeltreffendheid
  • Gemak van gebruik
  • Onderhoud

Ek is nie 'n kenner van geengewere nie, maar ek sal in elk geval probeer om my antwoord op hierdie vraag te gee.

Prysgewys is hulle altwee relatief goedkoop. Die verbruiksgoedere van elektroporators is slegs die kuvette; dit kos 5-10 dollar/stuk. Die geengewere gebruik mikrokrale as koeëls en afhangende van die materiaal kos hulle tussen 200 en 300 dollar per mikrogram, 10-50 dollar per skoot, 'n bietjie duurder as elektroporasie.

Oor die organismes word gewere meestal vir plantselle gebruik en min ander "moeilik om te elektroporeer" organismes. Ek het nie 'n behoorlike lys van hulle nie, maar rofweg, as jy met bakterieë, giste en soogdierselle werk, gaan dan vir 'n elektroporator. As u met weefsels of hele organismes soos wurm/insekte/plante moet werk, soek dan 'n geweer; u kan beslis nie 'n blaar elektroporeer nie. Maar kyk in die algemeen na die literatuur oor wat tans die beste metode is om u keuse stelsel te transfekteer.

Doeltreffendheid, ook in hierdie geval hang dit af van die selle waarmee u werk. Elektroporasie bereik 10^9/10^10 transformasiemiere per mikrogram DNA in geval van E.coli en dit is die beste doeltreffendheid wat jy deesdae kan kry. Alle ander selle word teen laer doeltreffendheid getransfekteer, hoeveel laer? Dit hang af van die selle!

Maklik om te gebruik. Hulle is albei baie maklik om te gebruik, dit is kwessie van 'n knoppie te druk. Vir die elektroporasie moet u elektrokompetente selle voorberei, maar die prosedure is baie maklik. Vir die gene -gewere moet u die krale met DNA bedek, ook baie maklik.

Onderhoud. Die elektroporator het glad nie onderhoud nodig nie, terwyl die geweer op die lange duur versigtig kan wees, aangesien dit pompe en kamers onder druk het; dit benodig gewoonlik aandag, maar niks spesiaals nie.

Enkele verwysings:

bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9541.pdf

bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf

bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006217A.pdf


Prys

As u deur Google -inkopies kyk en 'n paar webwerwe besoek, blyk dit dat elektroporasie 3000 - 8000 dollar beloop, afhangende van watter funksies u wil hê. Aan die ander kant is gene -gewere baie duurder. Die mees algemene geengeweer, die Helios-model van Bio-Rad, is sowat $17 000, insluitend al die nodige onderdele. Soos u kan sien, kan 'n geengeweer duurder wees.

Die geengeweer het ook koeëls nodig, wat mikrokrale (of mikrodraers, soos Bio-Rad dit noem), en dié kos sowat 600 dollar. Die elektroporasie -kuvette kos elk $ 90. Hulle kan egter skoongemaak en hergebruik word.

Doelorganisme

Volgens Wikipedia word geengewere hoofsaaklik gebruik vir die transformasie van plantweefsels, maar word dit ook vir dierweefsels gebruik. Volgens Bio-Rad is dit goed vir hoofsaaklik plantstelsels en dierestelsels, maar kan vir alge, bakterieë, en meer gebruik word.

Dit lyk asof elektroporasie meer vir bakterieë gebruik word. Hulle het dit ook vir gis gebruik. Dit is ook vir diereweefsel gebruik, maar dit is nie die mees geskikte teikenorganisme nie. Dit lyk beter vir in vitro -stelsels, aangesien die meeste weefsels of selle in die kuvette vir die meeste elektroporasiestelsels nodig is.

Doeltreffendheid

Vir geengewere hang die doeltreffendheid af van die omgewing en die tipe selle wat gebruik word. Die transfeksiedoeltreffendheid wissel vir verskillende seltipes. Ek kan nie baie skattings vind vir die doeltreffendheid van geengewere nie. Maar sommige van hulle is 10-20% van die DNA. Daar word ooreengekom dat elektroporasie 'n baie hoë doeltreffendheid het. Volgens Wikipedia:

Normale voorbereiding van bevoegde selle kan transformasie -doeltreffendheid lewer wat wissel van 106 tot 108 cfu/μg DNA. Protokolle vir die chemiese metode bestaan ​​egter vir die vervaardiging van superkompetente selle wat 'n transformasie -doeltreffendheid van meer as 1 x 109 kan oplewer. [6] Elektroporasiemetode het in die algemeen 'n beter transformasie -doeltreffendheid as chemiese metodes met meer as 1 x 1010 cfu/μg DNA moontlik, en dit laat toe om groot plasmiede van 200 kb groot te transformeer.

Gemak van gebruik

Albei is baie maklik om te gebruik. Hulle benodig slegs die druk van 'n paar knoppies. As jy egter wil uitvind hoe om te gebruik, moet jy die handleidings en protokolle lees. Die handleiding van die Helios genepistoolstelsel is hier beskikbaar. Die MicroPulser elektroporasiestelsel van Bio-Radd bevat ook die handleiding hier.

Onderhoud

Onderhoud vir 'n geengeweer is redelik eenvoudig. Byvoorbeeld, Bio-Rad se draagbare geengeweer het 'n eenvoudige instandhouding (van hier af):

Die verbeterde aangepaste vat het min onderhoud. Dit kan maklik skoongemaak word deur 70% etanol te gebruik. Die punt van die loop bevat 'n sirkelvormige nylon gaas, wat gereeld vervang moet word om optimale prestasie te behou. Om die gaas te verander, skroef u die punt los, verwyder die gebruikte gaas en plaas 'n nuwe een oor die O-ring. Sodra die punt weer vasgeskroef is, is die handgee-geweer in werking.

Elektroporasie benodig ook bykans geen onderhoud nie.


Virale vektore, vervaardigde selle en die CRISPR -rewolusie

Die vermoë om menslike selle te redigeer het die afgelope paar dekades 'n omwenteling in die moderne biologie en medisyne veroorsaak. Met die vordering in genoombewerkingsmetodologieë, het gene-aflewering en selgebaseerde terapieë gerig op die behandeling van genetiese siektes 'n werklikheid geword wat in die kliniese praktyk meer en meer noodsaaklik sal word. Die wysiging van spesifieke mutasies in eukariotiese selle deur gebruik te maak van CRISPR-Cas-stelsels afgelei van prokariotiese immuunstelsels het voorsiening gemaak vir presisie in die regstelling van verskeie siektemutasies. Verder het die lewering van genetiese loonvragte deur die gebruik van virale tropisme 'n deurslaggewende en doeltreffende meganisme geword vir die lewering van gene en geenredigeringstelsels in selle. Laastens het selle wat ex vivo gemodifiseer is, 'n geweldige potensiaal en het effektief getoon in die bestudering en behandeling van 'n magdom siektes. Hierdie hoofstuk poog om belangrike vordering op die gebied van die redigering van menslike selle met behulp van CRISPR-Cas-stelsels, die gebruik van virusse as vektore vir genterapie en die toepassing van gemanipuleerde selle vir die bestudering en behandeling van siektes uit te lig en te hersien.

Sleutelwoorde: CRISPR/Cas Gentherapie Genoomchirurgie Oogheelkunde.


Wat is Transfeksie

Transfeksie is 'n metode van geenoordrag waarin die genetiese materiaal doelbewus in 'n ander sel ingebring word deur chemiese, nie-chemiese of deeltjiegebaseerde metodes te gebruik. Die transfeksiemeganisme behels die skepping van porieë op die selmembraan, waardeur die vreemde DNA in die gasheersel kan oorgaan. Die tipes vektore wat in die transfeksie gebruik word, is plasmiede, kosmiede, BACs, YACs of HACs. Gebaseer op die meganisme om porieë te skep, kan verskillende tipes transfeksiemetodes geïdentifiseer word. Die drie tipes transfeksie is chemies-gemedieerde transfeksie, nie-chemies-bemiddelde transfeksie en partikel-gebaseerde transfeksie. Transfeksie wat nie op chemies gebaseer is nie, word deur BAC aangetoon Figuur 1.

Figuur 1: Elektroporasie

Chemies bemiddelde transfeksie gebruik kalsiumfosfaat, kationiese polimere of liposome. Die nie-chemies gebaseerde transfeksie gebruik elektroporasie, impalefeksie, sonoporasie, optiese transfeksie of hidrodinamiese aflewering. Die deeltjie-gebaseerde transfeksie gebruik die geengeweertegniek waar die vreemde DNA oorgedra word met die gebruik van 'n nanodeeltjie. Magneetofeksie en nukleofeksie is die ander twee metodes van deeltjie-gebaseerde transfeksie. In magnetofeksie word die deeltjies wat vreemde DNA dra, met behulp van 'n magnetiese veld in die gasheersel gekonsentreer. In nukleofeksie word 'n hitteskok gebruik om vreemde DNA na die gasheersel oor te dra.


Vordering

Plasmiedgebaseerde geenoordrag hou voordele in vergelyking met die gebruik van virale vektore

Rekombinante virale vektore is ontwikkel as hoogs doeltreffende metodes vir geenaflewering aan 'n verskeidenheid weefsels. Die doeltreffendheid van hierdie vektore is te wyte aan die teenwoordigheid van virale proteïene wat interaksie met seloppervlakreseptore het. Ongelukkig ontlok hierdie virale proteïene spesifieke immuunresponse wat die vermoë om die vektor te hertoedien kan beperk. Dit kan 'n besondere probleem wees in die vertaling van prekliniese studies na menslike behandelings, aangesien 'n beduidende deel van die bevolking dalk voorheen die virus teëgekom het en dus neutraliserende teenliggaampies het.

Daarteenoor is plasmiedvektore geheel en al saamgestel uit kovalent geslote sirkels van dubbelstring-DNS met geen geassosieerde proteïene nie. Genaflewering met plasmiedvektore is egter hoogs ondoeltreffend, tensy die DNA geassosieer word met ander molekules en/of fisiese energie aangewend word om sel -ingang te vergemaklik. Die gebruik van liposome en dendrimeer komplekse het geenlewering aan sommige weefsels verbeter in vivo, maar die belangrikste verbetering was die gebruik van fisiese afleweringstelsels wat plasmied-gebaseerde geenlewering in staat stel om doeltreffendheid te bereik naby aan dié wat met virale vektore bereik word.

Plasmied-DNS, alhoewel self 'n komplekse molekule is, is aansienlik makliker om in massa te produseer en kwaliteit te beheer as virale vektore. Hierdie probleme, tesame met die lae immunogenisiteit en die gebrek aan integrasie wat met plasmied -DNA gesien word, maak dit 'n baie aantreklike reagens vir menslike genterapie, op voorwaarde dat 'n hoë doeltreffendheidstoestand bereik kan word. Tot dusver is kliniese proewe met die gebruik van kaal plasmied -DNA geen negatiewe gevolge nie. 1, 2

Die fisiese metodes wat getoon word om plasmiedtransfeksie te verbeter in vivo word hieronder hersien. Alle metodes verbeter die oordrag van geen deur die plasmied -DNA in die nabyheid van die selmembraan te bring en/of veroorsaak tydelike mikro -ontwrigting van die selmembraan, wat die deurvloei van plasmied in die sel verhoog.

Toepassing van 'n elektriese veld verhoog die plasmied geenoordrag dramaties in vivo

Die grootste verandering in die doeltreffendheid van plasmiedgebaseerde geenoordrag is gesien wanneer plasmiedaflewering gevolg word deur die toediening van 'n reeks elektriese pulse as 'n vorm van in vivo elektroporasie (ook na verwys as elektropermeabilisering of elektrooordrag). Hierdie tegnologie is gebaseer op die vroeëre studies van in vitro elektroporasie en in vivo aflewering van makromolekules aan plaaslike gewasse. Laasgenoemde metode is suksesvol oorgedra na kliniese toetse met die sitotoksiese geneesmiddel bleomisien. 3

In vivo elektroporasie van plasmied DNA is eers vir vel en lewer gebruik, maar skeletspier het onlangs baie aandag getrek, aangesien uitdrukking van die episomale plasmied lank in hierdie weefsel geleef kan word. 'N Wye verskeidenheid weefsels is inderdaad bestudeer, insluitend vel, niere, long, lewer, skelet- en hartspiere, gewrigte, rugmurg, brein, retina, kornea en bloedvate. 4, 5, 6, 7 In die meeste studies het elektroporasie die gene-uitdrukking met 100- tot 1000-voudig verhoog in vergelyking met die inspuiting van naakte plasmied-DNA. Die presiese meganisme waarmee die toediening van plasmied in selle verbeter word, is nie seker nie, alhoewel dit duidelik is dat membrane effektief deurlaatbaar word sodra 'n kritieke spanning bereik is (in die orde van 200 V/cm in vivo). Daar word vermoed dat dit plaasvind deur die vorming van hidrofiliese porieë en die daaropvolgende beweging van plasmied deur hierdie porieë as 'n plaaslike elektroforetiese effek. 'N Onlangse referaat betwis hierdie algemene mening. Golzio et al 8 het fluoresserend gemerkte plasmied gebruik om die interaksie met enkelselle te visualiseer in vitro. In hul sisteem is gesien dat plasmied by die selmembraan ophoop via 'n elektroforetiese effek, maar het nie dadelik in die sitosol inbeweeg nie. Beweging in die sitoplasma was relatief stadig en het voortgegaan nadat die aanwending van die elektriese veld geëindig het. Dit stem ooreen met die DNS-aktiewe opnamemeganisme wat deur Budker voorgestel is et al, 9 maar kan 'n nuwe fisiese interaksie met die selmembraan verteenwoordig, aangesien die plasmied wat nog nie die sitoplasma binnegekom het nie, mettertyd ontoeganklik geword het vir 'n DNA -kleurstof. Hierdie plasmiedophoping moet egter nog waargeneem word in vivo en die komplekse organisasie van weefsels soos spiere kan hierdie proses aansienlik verander. Baie onlangs, Buro et al 10 het die bestaan ​​van 'n poel plasmied gerapporteer wat blykbaar die aandag van ekstrasellulêre nukleases ontsnap en suksesvol tot 4 uur na die inspuiting van die DNA elektronies oorgedra kan word.

Die keuse van elektrodeontwerp is tans baie veranderlik en daar is 'n duidelike behoefte aan goeie vergelykende studies. Zhang et al 11 het velelektroporasie met behulp van 'n kaliberelektrode ondersoek en dit vergelyk met 'n kronkelelektrode (laasgenoemde is 'n reeks ineenskakelende positiewe en negatiewe elektrodes Figuur 1a). Albei was ewe effektief, maar die kronkelende elektrode blyk 'n meer pasiëntvriendelike ontwerp te wees, aangesien dit die behoefte om die vel tussen die skouers te knyp, vermy word. Vir ander weefsels soos lewer en spiere is daar 'n keuse tussen plaat- en naaldelektrode (figuur 1b en c). Oor die algemeen lyk dit asof die plaatelektrode 'n meer eenvormige elektriese veld gee en meer algemeen gebruik word vir klein dierstudies, maar dit is moontlik nie geskik vir elektrotransfer by groot diere nie weens die groot elektriese velde wat op groter weefsels toegedien moet word. Die patroon van elektriese pulse verskil ook aansienlik tussen studies wat wissel van matige spanning (bv. 200 V/cm) pulse van tientalle millisekondes tot hoëspanning mikrosekonde pulse. Dit is nog nie duidelik wat die optimale patroon is nie maar Buro et al 12 het getoon dat hul beste resultate in skeletspiere behaal is toe 'n enkele hoogspanningspuls gevolg is deur 'n reeks laagspanningspulse. Hulle het voorgestel dat die aanvanklike polsslag 'n elektroporasie van die membraan veroorsaak en dat die daaropvolgende pulse die DNA in die spiervesel elektroforeseer. Tans blyk dit dat die meeste papiere 'n patroon van gemiddeld 6-10 pulse van 20-40 ms by 1 Hz gebruik met 'n veldsterkte in die orde van 200 V/cm.

Meander (a), remklauw (b) en naald (c) elektrodes gebruik vir in vivo elektrotransfer. In die geval van die kronkelelektrode word 'n elektriese veld tussen elke positiewe en negatiewe elektrode opgewek met 'n deel van die veld wat die weefsel binnegaan. Hierdie elektrode -ontwerp is die minste indringende van die drie. Met die kokerelektrode word 'n byna eenvormige elektriese veld tussen die elektrodeplate gegenereer. Met naaldelektrode word 'n veld tussen die naalde gegenereer. In sommige gevalle is verskeie naaldelektrode gebruik.

Een van die beperkings van die elektro-oordrag is dat daar aansienlike skade aan die prosedure geassosieer kan word en dat dit die doeltreffendheid van oordrag kan beperk. 13 'n Onlangse referaat deur Durieux et al 14 toon oortuigend aan dat spierskade nou verband hou met die teenwoordigheid van die plasmied -DNA tydens die elektrotransfer en dat dit vererger word wanneer die LacZ -verslaggewer -geen uitgedruk word. Verandering van die grootte en duur van die elektriese pulse kan al die plasmiedverwante skade verbeter na die behandeling van skeletspiere, maar dit kan nie heeltemal voorkom nie.

Dekaan et al 15 het onlangs 'n dramatiese demonstrasie van die potensiaal van in vivo elektroporasie vir die long. Hulle het kaliberelektrodes weerskante van die toraks van muise aangebring na intratrageale instillasie van 'n oplossing van plasmied DNA. Hulle het aansienlike korttermyn verslaggewer geenuitdrukking in die long getoon na hierdie prosedure met lae mortaliteit in die behandelde diere. Genuitdrukking is veral in die perifere alveoli en in beide die epiteel en dieper selle gesien. Histologiese ontleding van die longe 24 uur na behandeling het geen duidelike tekens van skade aan die lig gebring nie. Elektroporasie lyk dus as 'n relatief veilige prosedure in die longe. Dit kan moontlik op mense toegedien word met behulp van brongoskoop-gerigte elektrodes, maar dit sal slegs lei tot die behandeling van die plaaslike gebiede van die long.

Ander onlangs ontwikkelde teikens vir elektroporasie sluit in gewrigte, 16 rugmurg 17 en die retina. 18 Matsuda en Cepko 19 het dus gerapporteer dat baie hoë gene -oordragdoeltreffendheid na retinale selle, veral die fotoreseptore, bereik kan word met elektroporasie by neonatale rotte en muise. Ons het getoon dat elektroporasie ook gebruik kan word om oligonukleotiede aan spiere af te lewer, spesifiek vir antisense-gemedieerde exon-oorslaan in distrofiese skeletspiere. 20

Elektroporasie is omvattend getoets vir geenoordrag na gewasse. Selfs die oordrag van 'n leë plasmiedvektor is voldoende om in sommige modelle beduidende tumorregressie te veroorsaak. 21 Elektroporasie van plasmiede wat interleukien 12 (IL-12) en interleukien 18 (IL-18) bevat, toon 'n sinergistiese effek om die groei van die tumor te inhibeer, sowel vir die behandelde tumor as vir die onbehandelde kontralaterale tumor. 22 In 'n ander studie het elektrotransfer van 'n kombinasie van bleomisien en 'n plasmied wat vir IL-12 kodeer, nie net volledige remissie veroorsaak by 'n deel muise wat 'n subkutane melanoom dra nie, maar ook 'n beduidende beskermende effek teen gevestigde metastases. 23 Gegewe die sukses van die elektrotransfer van bleomisien in baie kliniese toetse, blyk dit dat die kombinasie met geenoordrag verdere potensiaal bied in die lewering van 'n klinies effektiewe behandeling.

Liu en Huang 24 het 'n kombinasie van vaskulêre aflewering met elektroporasie vir die lewer gebruik. Binneaarse toediening van plasmied via die stertaar in die muis het geenuitdrukking in die lewer verbeter na elektroporasie in vergelyking met direkte inspuiting in die lewer voor elektroporasie. Die uitdrukking is verder verbeter deur bloedvloei deur die vena cava of die portale aar en hepatiese aar tydelik te blokkeer. Dit moet nog gesien word of hierdie kombinasiebenadering in ander weefsels sal werk.

Elektrotransfer kan ook gebruik word vir genetiese inenting, en 'n aantal laboratoriums het aansienlike verbeterings getoon in reaksies op 'n verskeidenheid antigene. 25, 26, 27 Tjelle et al 28 het voorgestel dat elektrotransfer van plasmied -DNA wat vir immunoglobuliene kodeer 'n alternatief kan wees vir die toediening van monoklonale teenliggaampies by die behandeling van 'n verskeidenheid toestande en 'n langdurige uitdrukking by muise en skape kan toon.

N interessante ontwikkeling van in vivo elektroporasie vir navorsingsdoeleindes was die toepassing van hierdie tegnologie op die ontwikkelende sentrale senuweestelsel (SSS) van knaagdiere -embrio's. 29, 30, 31 Deur baie fyn elektrodes te gebruik, is dit moontlik om plasmiede na gedefinieerde streke van die ontwikkelende brein af te lewer om selmigrasie op te spoor en om patrone van ontwikkeling te verander. Onlangs het Wei et al 32 het hierdie tegnologie uitgebrei tot volwasse knaagdiere, wat toon dat dit moontlik is om selektief plasmiedgebaseerde konstrukte uit te druk in spesifieke streke van die volwasse SSS.

Ten slotte is integrasie van plasmied -DNA nog nie voorheen gerapporteer na direkte intramuskulêre inspuiting nie, ondanks 'n aantal noukeurige studies van verskeie laboratoriums. Daarteenoor het Wang et al 33 het onlangs berig dat integrasie van plasmied -DNA opgespoor kan word na elektroporasie van skeletspiere in vivo. Dit is egter steeds 'n baie seldsame gebeurtenis, onder die vlak van genomiese mutasie in die agtergrond, en dit is dus onwaarskynlik dat dit 'n beduidende veiligheidsrisiko met betrekking tot kliniese toepassing sal wees.

Vaskulêre aflewering onder druk verbeter plasmiedtransfeksie in vivo met 'n meer wydverspreide verspreiding as plaaslike inspuiting

Aangesien plasmied -DNA geen proteïene bevat vir aanhegting aan sellulêre reseptore nie, het naakte plasmied geen spesifieke doelwit vir verskillende seltipes nie, en daarom is dit noodsaaklik dat die DNA in noue kontak met die gewenste seltipe geplaas word. Die gebruik van druk om hierdie noue kontak te bewerkstellig, het ook die doeltreffendheid van aflewering, veral aan lewer en skeletspiere, dramaties verhoog.

Die gebruik van vinnig afgelewerde uiters hoë volume (gelykstaande aan totale bloedvolume) inspuitings via die stertaar van die muis lei tot hoogs doeltreffende transfeksie van hepatosiete deur die meerderheid van die lewer. 'n Reeks baie onlangse referate het gepoog om die fisiese basis vir hierdie verskynsel te verduidelik. Zhang et al 34 het getoon dat hidrodinamiese geenaflewering lei tot 'n verbygaande afname in hartfunksie en 'n vinnige styging in veneuse druk wat lei tot vergroting van die fenestrae in die lewer sinusoïede. Dit laat weer hidrostatiese druk toe om op die hepatosietselmembrane in te werk, wat verbygaande porieë of defekte veroorsaak, 'n proses wat hulle hidroporasie noem. Ander groepe 35, 36, 37 het getoon dat die dinamika van die transfeksieproses hierdie konsep van verbygaande hiperpermeabiliteit van die hepatosietselmembraan ondersteun en nie die aktiewe opnamemeganisme ondersteun wat Budker voorstel nie. et al. 9 Die gebruik van hierdie hidrodinamiese tegniek in die muis het vergelyking van die effek van verskillende vektorreekse, 38 die toetsing van optimale uitdrukkingskonstrukte 39 en die doeltreffende aflewering van siRNA aan die lewer moontlik gemaak. 40, 41 Dieselfde tegniek is op rotte toegepas. 42 Alhoewel hierdie benadering nuttig is vir studies by knaagdiere, is dit nie direk van toepassing op mense nie. Eastman et al 43 het plaaslike hidrodinamiese toediening in spesifieke lobbe van die konynlewer met behulp van ballonmanchetkateters ondersoek. Hulle het getoon dat druk-gemedieerde plaaslike aflewering veilig bereik kan word met hierdie benadering sonder die behoefte vir chirurgie om die lewer bloot te stel. Soos met die stert-aar inspuitings, was daar slegs verbygaande verhogings in lewerspesifieke ensieme wat in die bloed vrygestel is. Druk-gemedieerde plasmiedaflewering is ook gebruik vir ander weefsels, soos die nier. 44 Die belangrikheid van plaaslike hidrostatiese druk is getoon deur die werk van Liu et al, 45 wat rapporteer dat meganiese massering van die lewer die gene -oordrag verhoog na intraveneuse toediening van plasmied -DNA.

Huang et al 46 het ook suksesvol plasmied aan die diafragma gelewer deur gebruik te maak van die veneuse benadering met tydelike okklusie van die kraniale vena cava. Vir aflewering aan ledemaatspier word druk-gemedieerde plasmied aflewering gewoonlik via die arteriële sisteem uitgevoer. Hierdie benadering is gebruik vir aflewering van plasmied aan veelvuldige spiere in die tydelik geïsoleerde ledemate van primate, 47 en geïsoleerde ledemaat perfusie is 'n gevestigde tegniek in kliniese praktyk vir die behandeling van gewasse. 48 Plasmiedopname en -uitdrukking was meer doeltreffend as vir direkte binnespierse inspuiting en is in alle spiere van die geperfuseerde ledemaat opgespoor. Daar was geen daaropvolgende publikasies wat hierdie gene -afleweringsmetodiek gebruik nie, alhoewel ongepubliseerde studies in die oorsig deur Herweijer en Wolff gerapporteer is. 49 Ons het die uitdrukking van menslike minidystrofien (met behulp van 'n spesie-spesifieke teenliggaam) in tot 30% spiervesels in die ledemate van rotte waargeneem na drukgemedieerde arteriële aflewering (Fletcher, Wells en Wells, ongepubliseerde resultate). Dieselfde tegniek word tans gebruik om distrofien aan distrofiese spiere in die bene van die hondemodel van X-gekoppelde spierdistrofie te lewer. 50 'n Uiters onlangse referaat van Huang se groep 51 het getoon dat dit nie nodig is om die arteriële roete te gebruik om plasmied aan skeletspiere af te lewer nie. Hulle het opvallend hoë doeltreffendheid van 'n distrofienplasmied aan die distrofiese muisspier getoon deur beide arteriële en veneuse roetes, mits daar 'n tydelike afsluiting van die bloedtoevoer plaasgevind het wat die druk in die spiervaatbed verhoog het.

Klinies toepaslike ultraklank kan plasmiedgebaseerde geenaflewering verbeter in vivo

In vivo elektroporasie- en druk-gemedieerde aflewering, hoewel baie doeltreffend, is taamlik indringende tegnieke. Gevolglik is ander metodes ondersoek na hul vermoë om dryfkrag te verskaf by die aflewering van plasmied -DNA. Ultraklank word algemeen gebruik vir terapeutiese en diagnostiese doeleindes. Ultraklank op lae vlak word gebruik vir diagnostiese beelding, ultraklankskokgolwe word gebruik vir die behandeling van nierstene (litotripter) en hoë-intensiteit gefokusde ultraklank (HIFU) word gebruik vir die termiese vernietiging van gewasse. 'N Aantal groepe het die nut van hierdie verskillende modelle van ultraklank aangetoon om die aflewering van plasmied -DNA te verbeter. Byvoorbeeld, Taniyama et al het 'n lae dosis (1 min. by 1 MHz, 2,5 W/cm 2) ultraklank gebruik om geenaflewering in skeletspier 52 en die halsslagader te verbeter. 53 Net so het ander groepe 'n soortgelyke benadering gebruik vir die oordrag van geen na skeletspiere 54, 55, 56 en die hart. 57, 58 Daarteenoor stel Huber et al 59 het HIFU (1 min by 0.85 MHz, 155 W oor 'n 2 mm breedte) gebruik om geenoordrag na die karotis arterie uit te voer op grond daarvan dat hierdie modaliteit spesifieke lokalisering van die verbeterde geenoordrag moontlik maak. Hulle het 'n agtvoudige toename in die totale uitdrukking van die verslaggewer-gene getoon met HIFU alleen en 'n 17.5-voudige toename wanneer ultraklank kontrasborrels gebruik is. Die gerapporteerde toename in transfeksie met kontras verbeterde HIFU verskil egter nie beduidend van die vouverhogings wat in baie van die laer kraglewering ultraklankstudies getoon word nie. HIFU- en litotripter -skokgolwe is gebruik om tumore gelyktydig te ablateer en gene -oordrag na die oorblywende massa uit te voer, maar geenuitdrukking was baie veranderlik, moontlik as gevolg van veranderlike grade van tumorablation. 60

Die toepassing van ultraklank lei tot akoestiese kavitasie wat weefsels kan ontwrig en verbygaande membraanpermeabilisering kan produseer, en sodoende die aflewering van plasmied na die sitoplasma verbeter. Kerneermiddels soos ultraklank kontrasmiddels kan kavitasie verbeter, en verskeie studies het 'n reeks sulke kontrasmiddels ondersoek en tot die gevolgtrekking gekom dat albumien-bedekte octa-fluoropropaangas mikroborrels (Optison) verkieslik is bo verskeie ander algemeen beskikbare middels. 61, 62 Taniyama et al 52 het elektronmikrofoto's getoon van selle wat met Optison en ultraklank in kultuur behandel is, wat daarop dui dat verbygaande porieë in die selmembraan inderdaad onmiddellik na behandeling oopgemaak word. Selfs met die gebruik van ultraklankkontrasreagense toon die meeste studies slegs 'n gemiddeld van 10- tot 15-voudige toename in verslaggewergeenuitdrukking, wat aansienlik laer is as wat met elektroporasie bereik kan word.

'N Kombinasie van elektroporasie en ultraklank (elektro-sonoporasie) is deur Yamashita beskryf et al. 63 In hul studie was elektro-sonoporasie beter as óf elektroporasie óf ultraklank alleen. Dit is egter moeilik om hierdie studie met ander in die veld te vergelyk as gevolg van onvoldoende metodologiese besonderhede vir die elektroporasie -komponent.

Ander fisiese metodes soos laser, magnetiese velde en ballistiese aflewering kan ook gebruik word om te verhoog in vivo gene -oordrag, maar is oor die algemeen minder effektief

Gefokusde laser verskaf 'n alternatiewe energiebron, en die potensiaal van hierdie tegniek is in 'n onlangse referaat deur Zeira gedemonstreer et al. 64 Die skrywers het gerapporteer dat geenlewering in spiere verbeter kan word deur die toepassing van 'n femtosekonde infrarooi laser (5 s by 30 mW) en hulle het dit vergelyk met in vivo elektroporasie van dieselfde hoeveelheid DNA in dieselfde spier (16 × 20 ms pulse by 200 V/cm). Die skrywers het tot die gevolgtrekking gekom dat daar 'n soortgelyke doeltreffendheid van geenlewering was en dat dit gepaard gegaan het met aansienlik minder skade wanneer laserstraalgeentransduksie (LBGT) gebruik word. Die meganisme waarmee die laserverbetering van geenoordrag was, was nie duidelik nie, maar het waarskynlik plaaslike ontwrigting van die spierselmembraan behels. Twee aspekte ontstaan ​​uit hierdie werk. Die vergelyking met elektroporasie was nie onverwags nie, aangesien verskeie ander groepe, insluitend onsself, getoon het dat veelvuldige pulse by 200 V/cm aansienlike spierskade veroorsaak en dat veranderinge aan die protokol hierdie skade kan verminder. 13, 65 Tweedens is die laser gefokus tot 2 mm onder die vel, terwyl aansienlik dieper fokus nodig sou wees vir perkutane aflewering aan menslike skeletspiere. Dit moet nog gesien word of LBGT aansienlik kan opskaal in studies oor groter spiere of ander weefsels.

Sterk magnetiese velde kan ook gebruik word om 'n energiebron te verskaf om geenoordrag te help wanneer plasmied DNA aan paramagnetiese nanopartikels gekoppel word. Na berig word, word toepassing van magnetiese velde na plaaslike inspuiting van plasmiedverwante nanodeeltjies (magnetofeksie) verbeter in vivo oordrag van geen na die spysverteringskanaal en die vaskulasie van die oor. 66 Die verbeterde geenoordrag wat met magnetofeksie geassosieer word, blyk nie so beduidend te wees as wat gesien word met hidrodinamiese aflewering of elektroporasie nie, alhoewel direkte vergelykings nog nie gemaak is nie.

Bombardering van weefsels deur plasmied-bedekte mikropartikels het voorheen aansienlike aandag geniet vir geenoordrag in diere nadat dit oorspronklik ontwikkel is vir geenlewering aan plante. Die toepassing van die gene -geweer tegnologie by diere is beperk tot oppervlakkige weefsels soos die vel. Onlangse referate het voortgegaan om hierdie benadering te gebruik vir toepassings soos geenterapie van blaaspyn deur gebruik te maak van pro-opiomelanokortien-geenoordrag in 'n rotmodel, 67 die oordrag van IL-10, IL-12 en B7.1 na muriene gewasse, 68 geenoordrag in die hart, 69 gene -oordrag na muis -embrio's 70 en behandeling via die vel van 'n muismodel van lysosomale suur maltase tekort (GAA, ook bekend as glikogeenopslag siekte tipe II). 71 Die belangrikste, Dileo et al 72 het onlangs gerapporteer oor 'n nuwe ontwerp van geengeweer wat mikropartikels by 'n hoër druk lewer, en sodoende toegang tot onderhuidse weefsels, soos spiere of gewasse, verkry en gevolglik gene-uitdrukking op lang termyn verkry.

Ballistiese gene -aflewering is die meeste gebruik vir die aflewering van DNA -entstowwe aan die vel. Na berig word, is hierdie benadering beter as ander metodes van plasmiedaflewering aan die vel 73, 74, maar dit is geneig om 'n Th2 (humorale) eerder as die Th1 (sitotoksiese) immuunrespons te genereer wat gereeld na binnespierse toediening volg. 75, 76 Hierdie verskil in die aard van die immuunrespons kan aangepas word deur verskillende versterkingsstrategieë na die aanvanklike inenting deur plasmied -DNA met geengeweer. 77


Resultate

Transfeksie deur reagense

Ten einde die voorkeur-transfeksiereagens vir elke seltipe te bepaal, het ons die volgende vergelykend oorweeg: die hoeveelheid RTT wat geproduseer word, die verhouding tussen RTT/totale proteïen en die seloorlewing. As ons die resultate in die vier seltipes wat gebruik is, in ag neem, toon die resultate dat die drie beste reagense FuGENE 6, Lipofectamine PLUS en GenePORTER was (tabel 1 en figuur 1). Soos in Tabel 1 aangebied, toon die waardes 'n reeks oor die vier seltipes wat gebruik word. Individuele resultate word in die onderstaande teks en in figuur 1 gerapporteer, waar die resultate wat met die optimale konsentrasie van plasmied vir elke reagens verskyn, vertoon word.

Figuur (a) toon die hoeveelheid chlooramfenikolasetieltransferase (RTT) wat in elk van die sellyne geproduseer word, wanneer die verskillende transfeksiereagens gebruik is, teen 'n optimale hoeveelheid plasmied. Figuur (b) toon die ooreenstemmende % oorlewing toe elk van hierdie reagense en plasmiedhoeveelhede gebruik is. Let wel: die resultate word getoon as 'n gemiddelde +/- SD van twee individuele eksperimente (uitgevoer in duplikaat).

In CoASMC het die gebruik van FuGENE 6 die beste resultate behaal. Dit het byna twee keer soveel CAT per ml media geproduseer as selle wat getransfekteer is met die tweede beste presterende reagens, Lipofectamine PLUS (Figuur 1). Wanneer 1 μg en 2 μg plasmied gebruik is, is verhoudings van 3-5 verkry en die seloorlewingsyfer was onderskeidelik tussen 69 en 74% (Figuur 1). In AoSMC, Lipofectamine PLUS gave the best results. It produced more CAT per ml media than cells transfected with the next best performing reagent, FuGENE 6 (Figure 1). When 0.8 μg and 1.6 μg plasmid was used, ratios of 10–18 were obtained and the cell survival rate was between 53 and 58%, respectively (Figure 1).

In CoAEC, best transfection efficiency was achieved by FuGENE 6 : it produced more than double the amount of CAT per ml than cells transfected using the other reagents (Figure 1). When 1 μg and 2 μg of plasmid were used, ratios of 8–11 were obtained and the cell survival rate was between 64 and 73%, respectively (Figure 1).

FuGENE 6 gave the best results in AoEC, as well : it produced more CAT per ml media than cells transfected with the second best liposome, Lipofectamine PLUS (Figure 1). When 1 μg and 2 μg of plasmid was used, ratios of 7–16 were obtained and the cell survival rate was between 79 and 88%, respectively (Figure 1).

Transfection by electroporation

Electroporator

To optimize the electroporation procedure, a range of voltage, capacitance and resistance settings were used. For SMC the initial resistance and capacitance settings were 725Ω and 125 μF and for EC they were 950Ω and 25 μF. The voltage settings tested varied from 400 – 500 V. The optimal voltage in all four cell types was 450 V, illustrated by AoSMC (Figure 2).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when voltage settings were varied using the ECM 630 electroporator. Capacitance and Resistance were held constant at 125 μF and 725Ω respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

After the voltage settings had been established the optimal resistance and capacitance were found. For CoA and Ao SMC the best resistance setting was found to be in the area 725–900Ω (Figure 3), but best capacitance varied between the two cell types. In CoASMC, the best capacitance setting was 75 μF (Ratio 2.5 and 70% survival). In some experiments, we achieved a ratio of up to 6 when 125 μF was used, but survival dropped to around 30%. Nevertheless, we choose 75 μF as the best setting because it resulted in higher cell survival. In AoSMC the best results were obtained when 125 μF were used (Ratio of 0.92 and a survival of 30%) (Figure 4). The higher the capacitance settings was, the lower become the cell survival (Figure 4b).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when resistance settings were varied using the ECM 630 electroporator. Voltage and capacitance were held constant at 450 V and 125 μF respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when different capacitance settings were used on the ECM 630 electroporator (BTX, San Diego, USA). Voltage and resistance were held constant at 450 V and 800Ω, respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Both CoA and Ao EC reacted similarly to the different settings. Resistance was tested between 850–1050Ω and at 900Ω a ratio of 25 was obtained (55% survival). We tested capacitance varying from 25 – 75 μF. When 50 μF was used, we obtained a ratio of 40 and a survival of 38%. However, 25 μF was the best setting since it resulted in better cell survival (61%) (results not shown).

Nucleofector

Optimized nucleofector protocols were available for AoSMC and CoAEC. These methods were tested and the results were compared with the electroporation results. For AoSMC we tested two cell suspensions, 5 × 10 5 and 1 × 10 6 cells per reaction. Both the ratio and the survival increased by increasing the number of cells used (Figure 5a). At the highest plasmid dose, the cell survival was 80% (Figure 5b).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when different amounts of CAT plasmid were transfected into different cell numbers using the Nucleofector instrument, program U-25. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding plasmid amounts. Results represent mean of duplicates +/- SD.

In CoAEC, we observed a dose-response for the CAT/protein ratio when 1–10 μg plasmid was used (Figure 6a), and at the highest plasmid dose of 10 μg, 30–46 % cell survival was achieved (Figure 6b).

(a) and (b): Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in CoAEC when different amounts of CAT plasmid were transfected, using the Nucleofector instrument (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany), program S-05. Figure (b) shows the % survival at the corresponding plasmid amounts. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Transfection by PCI

The initial experiments with PCI were aimed to find the light dose at which we obtained at least 50 % survival. For AoSMC this was observed to be 100 sec. In further experiments light doses varying from 25 to 100 seconds were used. A low transfection effect, ratio of 0.3, was achieved when the cells were exposed to light before the transfection of 5 μg plasmid (Table 2).

The light dose that gave 50% survival in CoAEC was between 40 and 50 seconds, and for AoEC it was 32 seconds. The best transfection effect obtained had a ratio of 4.7 and 55% survival, when the cells were given 5 μg plasmid before exposure to light for 25 seconds (Table 2). None effect was seen when the cells were exposed to light after addition of plasmid.


Electroporation is based on a simple process. Host cells and selected molecules are suspended in a conductive solution, and an electrical circuit is closed around the mixture. An electrical pulse at an optimized voltage and only lasting a few microseconds to a millisecond is discharged through the cell suspension. This disturbs the phospholipid bilayer of the membrane and results in the formation of temporary pores. The electric potential across the cell membrane simultaneously rises to allow charged molecules like DNA to be driven across the membrane through the pores in a manner similar to electrophoresis (Shigekawa and Dower, 1988).

The main advantage of electroporation is its applicability for transient and stable transfection of all cell types. Furthermore, because electroporation is easy and rapid, it is able to transfect a large number of cells in a short time once optimum electroporation conditions are determined. The major drawback of electroporation is substantial cell death caused by high voltage pulses and only partially successful membrane repair, requiring the use of greater quantities of cells compared to chemical transfection methods. While more modern instrumentation, such our Invitrogen™ Neon™ Transfection System, overcome high cell mortality by distributing the electrical pulse equally among the cells and maintaining a stable pH throughout the electroporation chamber, optimization of pulse and field strength parameters is still required to balance the electroporation efficiency and cell viability.


Electroporation and Nucleofector TM Technology

The ability to introduce DNA, RNA or proteins into cells to alter their genotype or phenotype (a process called transfection) is crucial in a variety of life science applications. Various types of transfection methods exist and choosing which approach to use often depends on its suitability to the application in question. Electroporation is a physical transfection method that permeabilizes the cell membrane by applying an electrical pulse and moves molecules via the electrical field into the cell. It is a powerful tool for transfecting large DNA fragments and achieving good transfection efficiencies in cell lines. However, due to high toxicity traditional electroporation has been less successful for efficiently transfecting more biologically relevant primary cells and stem cells, which has limited its application.

Our solution is an improved electroporation technology, the Nucleofector TM Technology, originally introduced into the market by legacy Amaxa in 2001. It enables highly efficient, transfection of primary cells, stem cells, neurons, and cell lines that have traditionally been difficult to transfect via electroporation and other non-viral transfection methods. In recent years, this has opened novel opportunities for disease research and therapeutic development, including the advancement of gene therapies, immunotherapies, and stem cell generation.

In the following sections, we provide an overview of Nucleofector TM Technology, and explore what benefits it can bring to your research over traditional electroporation methods. We also summarize the transfection capabilities and flexible scaling offered by our various Nucleofector TM Platforms, to help you choose which one is best suited to your specific application. This can ensure you obtain the very highest levels of transfection efficiency and quality for your research.


Affiliasies

Rutgers, The State University of New Jersey, Department of Biomedical Engineering, Piscataway, 08854, United States

Joseph J. Sherba, Stephen Hogquist, David I. Shreiber & Jeffrey D. Zahn

Rutgers, The State University of New Jersey, Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Piscataway, 08854, United States

Jy kan ook vir hierdie skrywer soek in PubMed Google Scholar

Jy kan ook vir hierdie skrywer soek in PubMed Google Scholar

Jy kan ook vir hierdie skrywer soek in PubMed Google Scholar

Jy kan ook vir hierdie skrywer soek in PubMed Google Scholar

Jy kan ook vir hierdie skrywer soek in PubMed Google Scholar

Jy kan ook vir hierdie skrywer soek in PubMed Google Scholar

Bydraes

J.J.S., H.L., J.W.S., D.I.S. and J.D.Z. conceived the study. J.J.S. and S.H. conducted the experiments. All authors analyzed the results. All authors reviewed the manuscript.

Ooreenstemmende skrywer


Agtergrond

Electroporation is a physical method that can be used for gene delivery characterized by application of brief electric pulses to permeabilize the cell membrane, and thereby facilitating the uptake of negatively charged DNA [1, 2]. The application of a potential difference across a membrane is an effective strategy to form transient pores [3]. In principle, cell membranes act as electrical capacitors and the application of a high-voltage electric field results in a temporary depolarization of a cell membrane and the formation of pores, which allows the entrance of macromolecules. The application of electric pulses is not only used for cell permeabilization in vitro for delivery of micro-and macromolecules, but is also used in vivo for permeabilization of tissues during certain specific treatments against cancers via electrochemotherapy (ECT) where electric pulses are applied to enable entry of non-permeant cytotoxic molecules [4]. The conventional electroporation is done in cuvette-style parallel plate setups, where the cell suspension and molecules to-be-delivered are mixed together in the electroporation buffer between two plate electrodes connected to a generator of high electric voltage, and is called bulk electroporation [3]. Electroporation is viewed as a promising method for intracellular delivery of a wide variety of cargos and being relatively efficient as compared to other methods [3, 5]. Fibroblasts are the most preferred somatic cells in gene transfection studies, since they can be derived either from fetal or adult tissue samples [6]. Many authors previously reported the use of electroporation in bovine fibroblasts and in fibroblastoid cells of other mammals as an efficient method of DNA transfection [7]. Though primary fibroblasts are commonly used cells in many studies, they are considered as difficult to transfect cells [8]. Till date, few data are available describing the optimization of electroporation conditions for bovine fetal fibroblasts (BFFs). Cattle is an economically important livestock [9], and increasingly used as a model species for research in artificial reproduction [10, 11]. The establishment of somatic cell nuclear transfer (SCNT) [12] allowed the generation of transgenic and knock-out cattle via the use of genetically modified fibroblast donor cells [13, 14]. The recently developed designer nuclease (ZNF, TALEN and Crispr/Cas9) were also employed to edit endogenous genes or knock-in genes-of-interest into bovine primary cells, which are subsequently used in animal cloning via SCNT [15,16,17,18,19]. These examples highlight the importance of efficient transfection methods for bovine primary cells.

In principal, two distinct wave forms of a pulse can be generated in a bulk electroporation setting, exponential decay and square wave [20]. Whereas both wave forms were used for electroporation, the latter was proven to be optimal [20] for mammalian cells. Square-wave electroporators represent the most widely used systems, they allow to control both voltage and pulse duration, and can produce rapidly repeating pulses. Several factors play a critical role in optimal transfection during electroporation. These include pulse amplitude, number, duration, interval between multiple pulses, and cuvette type [21, 22]. The most important factor that determines ionic strength on the cells and thereby the viability of cells post electroporation is the electroporation buffer. It is recommended to maintain hypo-osmolar conditions during electroporation since it enables easier and controlled electroporation [23]. However, some sources recommend iso-osmolar conditions to promote efficient DNA uptake and cell viability [18].

Whereas the gene delivery is the primary aim and protein expression being the ultimate aim of the transfection, viability is critical in terms of maintaining critical seeding density post electroporation. Though there are recent advances in electroporation technique, like micro- and nano-electroporation, such novel strategies have not yet been demonstrated to supersede the basic cuvette-style electroporation [3]. Hence, in spite of being a well-established technique, there is still a great potential to enhance the square wave electroporation outcome. Also, the rational cell type-dependent approach of electroporation, paves the way for getting additional insights into physical prerequisites for optimum transfection and better electroporation outcomes [24]. Hence, we hypothesized that such improved transfection performances can be obtained with selective interventions at critical steps in the process like choice of electroporation buffer, altering pulse parameters, and type of the cuvettes. The hypothesis was drawn by considering the already established concept of Maxwell-Wagner polarization, a key parameter for electroporation, which is an induced transmembrane voltage generated by an external electric field due to the variations in electrical properties of cell membrane, cytoplasm, and external medium [25]. Here, the transient expression was assessed, but a high initial transfer is of course a prerequisite for a stable long-term transformation.


Electroporation vs gene guns - Biology

Efficient DNA-mediated transformation of Tetrahymena cells has been accomplished by three methods: microinjection [1], electrotransformation [2] and biolistic bombardment [3]. Both the germline nucleus (micronucleus) or the somatic nucleus (macronucleus) can be transformed. (Click here for a description of the two types of nuclei.) Fig. 1 below shows the optimum life cycle stages for various types of transformation. By the appropriate choice of vectors and conditions, the incoming plasmid can be autonomously replicated in the MAC for many fissions, or the plasmid DNA can be inserted at the appropriate chromosome location by exact insert-mediated homologous recombination. The latter phenomenon allows gene replacements and knockouts, either in the MAC [ref.4 Fig. 2 below] or the MIC (ref.5 Fig. 3 below). Replacements and knockout strains are extremely valuable experimental tools, including the testing the indispensability of cloned genes and isolation of mutants after random mutagenesis of cloned genes. (Click here for a general Introduction to Tetrahymena Genetics.)

Verwysings

1. Tondravi,MM Yao,M-C (1986): Transformation of Tetrahymena thermophila by microinjection of ribosomal RNA genes. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. USA 83, 4369-4373.

2. Gaertig,J Gorovsky,MA (1992): Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. USA 89, 9196-9200.

3. Cassidy-Hanley,D Bowen,J Lee,JH Cole,E VerPlank,LA Gaertig,J Gorovsky,MA Bruns,PJ (1997): Germline and somatic transformation of mating Tetrahymena thermophila by particle bombardment. Genetics 146, 135-147.

4. Gaertig,J Thatcher,TH Gu,L Gorovsky,MA (1994): Electroporation-mediated replacement of a positively and negatively selectable beta-tubulin gene in Tetrahymena thermophila. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. U. S. A. 91, 4549-4553.

5. Hai,B Gorovsky,MA (1997): Germ-line knockout heterokaryons of an essential alpha-tubulin gene enable high-frequency gene replacement and a test of gene transfer from somatic to germ-line nuclei in Tetrahymena thermophila. Proc. Natl. Acad. Wetenskaplike. U. S. A. 94, 1310-1315.

Fig. 1. Stages of the Tetrahymena life cycle used for various methods of DNA-mediated transformation.

Hours indicate time after mixing of starved cells to initiate conjugation. BGg, germline transformation with the biolistic gun BGc, conjugant transformation of macronuclei with the biolistic gun CET, conjugant electrotransformation of developing macronuclei BGv, vegetative macronuclei transformation with the biolistic gun INJc, microinjection of developing macronuclei INJv, microinjection of vegetative macronuclei.

Fig. 2. Gene replacement by phenotypic assortment in transformed macronuclei.

Selection for complete gene replacement by phenotypic assortment enables the distinction between essential and non-essential genes. The initial transformant contains one transformed gene which has been disrupted with an expression cassette containing a drug-selectable marker. Its clonal progeny are serially transferred to higher drug concentrations thus killing cells with fewer copies of the selectable markers. For a non-essential gene (top diagram), complete replacement is possible. For an essential gene (bottom diagram), only incompletely assorted cells whose macronuclear copies of the gene have been partially replaced can be obtained. All arrows indicate multiple generations.

Fig. 3. Gene replacement in the germline knockout heterokaryons.

Creation and testing of knockout heterokaryons homozygous for disrupted ATU (alpha tubulin) genes in the micronucleus (deltaATU) and containing only wild type ATU genes in the macronucleus [4]. Chx is a dominant gene conferring resistance to cycloheximide (cy-r) while the wild type Chx+ is sensitive (cy-s). Mpr is a dominant gene conferring resistance to 6-methylpurine (mp-r) to which the wild type Mpr+ gene is sensitive (mp-s). Roman numerals indicate mating types mating types not determined are indicated by ?. Crosses (a), (b) and (d) are normal crosses, while cross (c) is a genomic exclusion cross (see Fig. 4 below for explanation of genomic exclusion). Note that in cross (d) only a mutant deltaATU/deltaATU Round I product of cross (c) is shown. An approximately equal number of non-mutant ATU/ATU Round I cells are obtained that do not yield any pm-r progeny. The genotype of the Mpr locus in Round I exconjugants was not determined. Values obtained for test crosses (b) and (d) are from a single subline.

Fig. 4. Genomic Exclusion

* ("star") strains, have defective micronuclei they can form conjugal pairs, but cannot donate genetic material [Allen,SL (1967) Genetics 55, 797-822]. When mated to a "star" strain, a normal strain ("left" conjugant, round 1) donates a gametic nucleus, but receives nothing in return. The single haploid nucleus in each conjugant then diploidizes and most cells separate without forming a new macronucleus. These cells retain their old (macronuclear) phenotype and are mature (can be immediately re-mated) but can have new micronuclear genotypes, depending on the genetic make-up of the normal parent and which meiotic product was (randomly) selected to form gametic nuclei. This process, referred to as Round 1 of genomic exclusion, greatly facilitates complementation testing and mutant rescue by cytoplasmic exchange during conjugation. Round 1 genomic exclusion or phenotypic assortment of heterozygotes each allow production of heterokaryons, cells with different macro- and micronuclear genotypes. Heterokaryons homozygous or heterozygous for a drug resistance gene in the transcriptionally inert micronucleus but having only drug-sensitive alleles in the macronucleus are drug sensitive. When these cells conjugated, the drug sensitive macronucleus is discarded and the drug resistance allele is expressed in the new macronucleus, allowing simple drug selection for successful mating. Round 1 genomic exclusion also allows creation of strains homozygous for deleterious or even lethal genes in their micronuclei and wild type genes in their macronuclei.