Inligting

Hoe presies help mitotiese rekombinasie om beskadigde DNA te herstel?

Hoe presies help mitotiese rekombinasie om beskadigde DNA te herstel?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek verstaan ​​die nut van kruisings tydens meiose, maar hoe is mitotiese rekombinasie presies nuttig om DNA -skade te hanteer? As die een susterchromatied beskadig is, kan die ander 'n funksionele plaasvervanger vir die gebrekkige deel lewer, maar dan sal die skenkerchromatied daardie afdeling ontbreek. Is dit nie 'n nul-som-speletjie nie? Wat mis ek?


Let wel: die tegniese term is homoloë rekombinasie (aangesien DNS-herstel eintlik die primêre funksie daarvan is), en hierdie antwoord fokus op letsels wat beide stringe op ongeveer dieselfde vlak affekteer (aangesien 'n letsel wat slegs een string op 'n spesifieke plek aantas, maklik herstel kan word deur die skoon string as 'n sjabloon te gebruik ), soos simmetriese dubbeldraad-breuke (waar beide stringe van die dubbele heliks op dieselfde vlak afgesny word; word gewoonlik veroorsaak deur [en is verantwoordelik vir die belangrikste dodelike gevolge van] oormatige blootstelling aan ioniserende straling; word gebruik as voorbeeld van skade vir die doel van hierdie antwoord).

Kort antwoord

Die homoloë DNA dien as 'n templaat vir die sintese van nuwe DNA om die beskadigde area te herstel.

Lang antwoord (van hier af geparafraseer)

As beide stringe van 'n chromosoom op of naby dieselfde plek gesny word, trek spesiale ensieme die gebreekte ente af, en ander ensieme knip dan 'n lengte van een van die stringe van elke kant af (die draad wat afgesny word, is altyd die een met die blootgestelde 5-punt einde, as u wonder), en laat 'n blootgestelde enkelstrengs klep aan elke kant van die breek agter.

Op hierdie stadium gryp ander spesiale proteïene hierdie flappe en neem hulle op soek na 'n ongeskonde homoloë stuk DNA (daarom word dit genoem homoloë rekombinasie), wat óf 'n susterchromatied kan wees (wat gewaarborg is om óf identies óf baie byna so te wees, en dus die voorkeuroplossing is wanneer moontlik) of 'n homoloë chromosoom (wat altyd beskikbaar is, behalwe vir haploïede selle [soos bv. as menslike gamete], maar is feitlik gewaarborg om nie heeltemal identies te wees nie, en is dus 'n minder optimale oplossing).

Met behulp van die voormelde spesiale proteïene, steek een van die kleppe dan in die homoloë dubbele heliks, basispare met die string waaraan dit komplementeer (wat 'n struktuur vorm wat bekend staan ​​as 'n Holliday aansluiting [wel, tegnies, sewe-agtstes van 'n Holliday-aansluiting, aangesien een van die aansluiting se vier arms net 'n enkele string het, eerder as twee]), en skop die ander string uit formasie. Die verplaasde draad vorm 'n enkelstrengs lus wat aan die kant hang (bekend, nie verbasend nie, as 'n verplasing lus, of D-lus), terwyl 'n DNA-polimerase aan die kaal 3-priemkant van die indringende string vasklou en dit verleng, met behulp van die homoloë DNA as 'n sjabloon.1

Op hierdie punt kan dinge op een van twee maniere verloop:

  • In die eenvoudiger pad (die sintese-afhanklike draadgloeiing, of SDSA, pad), die polimerase bly eenvoudig die indringerstreng verleng totdat genoeg DNA aan die einde gevoeg is om die gaping tussen die twee gebreekte ente en die basispaar veilig aan die klep aan die ander kant te oorbrug; op hierdie punt trek die indringende strand terug, sodat die binnedringende DNA sy dubbele heliese waardigheid kan hervat, en die nuut verlengde klep gryp die komplementêre flap aan die ander gebreekte kant. Meer DNA -polimerases vul die oorblywende gapings, en 'n ligase verseël die heliks weer. Die SDSA-pad is die belangrikste homoloë-rekombinasie-pad vir selle wat nie van plan is om meiose te ondergaan nie.

  • In die meer ingewikkelde dubbel-string-breek herstel (DSBR) pad, die blootgestelde klep op die ander stukkende einde ook kom in op die aksie, baseparing met die blootgestelde D-lus en word ook verleng deur 'n DNA-polimerase. As genoeg nuwe DNA gesintetiseer is om die enkelstrengs gapings heeltemal te vul, word die blootgestelde ente deur ligases verbind, wat 'n struktuur vorm sonder blootgestelde ente en twee volledige Holliday -aansluitings. Om dit terug te verander in 'n paar aparte bog-standaard dubbelhelikse, word twee van die vier stringe in elke Holliday-aansluiting deur endonukleases gesny, wat veroorsaak dat die twee DNA's skei. (Daar is reëls oor watter twee stringe word gesny; óf beide die twee stringe wat in 'n gegewe Holliday -aansluiting oorsteek, óf albei die twee stringe wat moenie kruis oor in genoemde aansluiting, maar nooit een kruising en een nie-kruisende string [aangesien dit bloot 'n nuwe dubbelstring-breuk by die plek van die aansluiting sal skep].) Afhangende van hoe die Holliday-aansluitings afgesny word, sal die gedeeltes van die twee chrom[atid/osome]s distaal van die oorspronklike breuk kan al dan nie tussen die chrom [atid/osome] verruil word; as albei aansluitings op hul kruisstringe of albei op hul nie-kruisende stringe gesny word, sal hierdie distale DNA nie word uitgeruil, terwyl die een aansluiting op sy kruisings en die ander op sy nie-kruisende drade gesny word, sê DNA sal uitgeruil word. Vanweë die moontlikhede daarvan om stukkies genetiese materiaal te ruil, is dit die voorkeurroete vir selle wat is beplan om meiose te ondergaan (hoewel dit in sekere mate selfs in somatiese selle voorkom).

Hier is 'n prentjie om die proses te illustreer:

(Beeld deur Emw by Wikimedia Commons. Blameer hulle vir die tikfout in "Strand inval", nie ek nie.)


1: Dit is die rede waarom die 5-prime draad teruggesnoei is, en nie die 3-prime string nie; alle DNA-polimerases wat deur die wetenskap bekend is, verleng DNA-stringe uitsluitlik in die 5-prime → 3-prime-rigting, en kan slegs nukleotiede by blootgestelde 3-prime eindes voeg (blootgestelde 5-prime eindes hoef nie van toepassing te wees nie).


Smc5/6: 'n skakel tussen DNA herstel en eenrigting replikasie?

Van die drie strukturele instandhouding van chromosoom (SMC) komplekse, reguleer twee direk chromosoom dinamika. Die derde, Smc5/6, funksioneer hoofsaaklik in homoloë rekombinasie en in die voltooiing van DNA-replikasie. Die literatuur dui daarop dat Smc5/6 DNA-herstel koördineer, deels deur post-translationele modifikasie van ongekarakteriseerde teikenproteïene wat hul subsellulêre lokalisering kan dikteer, en dat Smc5/6 ook funksioneer om DNA-skade-afhanklike kohesie tot stand te bring. 'n Kernspesifieke Smc5/6 funksie is voorgestel omdat Smc5/6 gismutante penetrerende fenotipes van ribosomale DNA (rDNA) onstabiliteit vertoon. rDNA-herhalings word eenrigting gerepliseer. Hier stel ons voor dat eenrigtingreplikasie, gekombineer met globale Smc5/6 -funksies, die skynbare rDNA -spesifisiteit kan verduidelik.


Biologie, Hoofstuk 6, Slimwerk

Benewens die eksperimentele behandeling, het 'n komponent van die eksperimentele stelsel die groei en ontwikkeling van die borsgewas beïnvloed.

Die kernomhulsel breek af.

Die grootte van die sel word nagegaan om te bepaal of die sel op daardie stadium groot genoeg is.

Nonylfenol belemmer die G0 -kontrolepunt.

Nonylfenol boots die werking van estrogeen na.

Mitose:
- Bevat die stadiums profase, metafase, anafase en telofase
- In hierdie stadium word die gerepliseerde genetiese inligting geskei.
- Word beskou as die eerste stap van seldeling

Sitokinese:
- In hierdie stadium skei die nuutgeskepte selle fisies.
- Word beskou as die tweede stap van seldeling

Eukariotiese selle verdeel ongeslagtelik via mitotiese deling. Omdat genetiese materiaal simmetries in twee kerne verdeel is, produseer hierdie proses geneties identiese nageslag wat dogterselle genoem word.

Mitose word gebruik vir ongeslagtelike voortplanting, organismegroei en herstel van weefsels. Produksie van eier- en spermselle en verhoogde genetiese diversiteit word deur meiose bewerkstellig.

Chromosome wat tydens die S -fase gedupliseer word, vorm twee susterchromatiede wat by die sentromere bymekaar gehou word. Tydens die mitose word die susterchromatiede by die sentromere uitmekaar getrek. Uiteindelik beland hierdie twee chromatiede in aparte selle.

Seldeling vind plaas deur twee prosesse: kerndeling en sitoplasmiese verdeling. Kernverdeling verdeel die chromosome eweredig, terwyl sitokinese die inhoud van die sitoplasma skei, wat organelle en ander sellulêre strukture insluit.

'N Gerepliseerde chromosoom bestaan ​​uit twee susterchromatiede wat by die sentromere bymekaar gehou word. Tydens die S -fase word die gerepliseerde chromosome geproduseer ter voorbereiding van mitose. Dit is tydens mitose dat die gerepliseerde chromosoom in twee verdeel word.

Die kernomhulsel breek af sodat die spilmikrotubules kan heg aan die gerepliseerde chromosome. Hierdie proses vind plaas tydens die profase.

Tydens mitose word gerepliseerde chromosome heen en weer gedruk totdat hulle in die middel van die sel beland. Die mitotiese spil is die struktuur wat chromosome op hierdie manier hervestig. By metafase staan ​​die gerepliseerde chromosome in lyn met die metafaseplaat, 'n onsigbare vlak langs die middel van die sel.

Susterchromatiede skei en word individuele chromosome tydens anafase van mitose. Tydens telofase sal hulle in dogterkerne verpak word, en uiteindelik, tydens sitokinese, sal hulle in aparte selle beland.

'n Sel moet om enige van hierdie redes pouseer.

Selle breek op kritieke punte in die selsiklus om te verseker dat die gebeure behoorlik plaasvind. Dit is bekend dat hierdie punte, wat kontrolepunte genoem word, voorkom tydens G1-fase, S-fase, G2-fase en M-fase (mitose).

Een van die kontrolepunte in die selsiklus verseker dat selle op die regte tyd verdeel.


Radiosensitiewe en mitotiese rekombinasie fenotipes van die Saccharomyces cerevisiae dun1 mutant wat gebrekkig is in DNA-skade-induseerbare geenuitdrukking.

Die biologiese betekenis van DNA-skade-geïnduseerde geenuitdrukking in die weerstand teen DNA-beskadigende middels is onduidelik. Ons het die rol van DUN1-gemedieerde, DNA-skade-induseerbare geenuitdrukking in die toekenning van bestralingsweerstand in Saccharomyces cerevisiae ondersoek. Die DUN1 -geen is aan die RAD3 -epistasegroep toegeken deur die stralingsensitiwiteite van dun1, rad52, rad1, rad9, rad18 enkele en dubbele mutante, en van die dun1 rad9 rad52 drievoudige mutant te kwantifiseer. Die dun1 en rad52 enkelmutante was soortgelyk in terme van UV sensitiwiteit, maar die dun1 rad52 dubbel mutant het 'n sinergistiese afname in UV weerstand getoon. Beide spontane intrachromosomale en heteroalleliese geenomskakelingsgebeurtenisse tussen twee ade2-allele is in dun1-mutante verbeter, in vergelyking met DUN1-stamme, en verhoogde rekombinasie was afhanklik van RAD52, maar nie RAD1-geenfunksie nie. Spontane susterchromatieduitruiling (SCE), soos gemonitor tussen afgesnyde 3 fragmente, is nie verbeter in dun1 mutante nie, maar UV-geïnduseerde SCE en heteroalleliese rekombinasie is verbeter. Ioniserende bestraling en metielmetaansulfonaat (MMS)-geïnduseerde DNA-skade het nie groter rekombinogeniteit in die dun1-mutant getoon in vergelyking met die DUN1-stam nie. Ons stel voor dat een funksie van DUN1-gemedieerde DNA-skade-geïnduseerde geenuitdrukking is om die herstel van UV-skade na 'n nie-rekombinogene herstelweg te kanaliseer.


RESULTATE

Identifikasie van 'n menslike homoloog van Eme1

Herhalende PSI-BLAST-soektogte (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast) is gebruik om soogdierhomoloë van Schizosaccharomyces pombe Eme1 (SpEme1). In die eerste iterasie, 'n ongekarakteriseerde oop leesraam (AL356173) van Neurospora crassa is geïdentifiseer as 'n beduidende ooreenkoms met spEme1. Daar is voorheen opgemerk dat dieselfde oop leesraam homologie het met die Mus81 -bindingsvennoot in ontluikende gis Mms4 (Mullen et al., 2001). Herhaling van die soektog het verskeie hoogs verwante, oorvleuelende menslike rye geïdentifiseer met beduidende ooreenkoms met SpEme1 (Figuur 1A). Drie klone wat ooreenstem met die volgorde AK0055926 is uit American Type Culture Collection herwin en is in volgorde geplaas om hul identiteit te bevestig. Verrassend genoeg is gevind dat die drie klone effens verskil en is aangedui as Eme1A, Eme1B en Eme1C (Figuur 1B). Die identifikasie van 'n enkele genomiese lokus (17q21.33) in die Nasionale Sentrum vir Biotegnologie-inligting menslike genoom databasis het voorgestel dat die drie variante afkomstig is van 'n enkele geen. Die afwesigheid van spesifieke volgordes (wat ooreenstem met aminosure 303-331 en 372-384 in Eme1A) het voorgestel dat die verskillende vorms as gevolg van onvolledige splitsing kan wees. Die afwesigheid van 'n enkele kodon (op posisie 138) in die langste volgorde, en die vervanging van 'n cysteïen (by posisie 525) in 'n arginien in die kortste, was egter nie verenigbaar met hierdie interpretasie nie. Om te bepaal watter, indien enige, van die drie vorme van menslike Eme1 aan Mus81 bind, is epitoop-gemerkte konstrukte van al drie variante getoets op die vermoë om met Mus81 te kommunikeer en om Mus81-geassosieerde endonuklease-aktiwiteit te ondersteun. HeLa-selle is tydelik getransfekteer met 3HaMus81 en FLAG-gemerkte Eme1. Soos getoon in figuur 2A, is 3HaMus81 opgespoor in immuun-neerslae van al drie vorme van Eme1. Die hoeveelheid 3HaMus81 wat met FLAG-Eme1B geassosieer word was egter reproduseerbaar hoër as FLAG-Eme1A of C. Human Mus81 het robuuste aktiwiteit teen 'n 3'-flap substraat in vitro (Constantinou) et al., 2002) is Mus81- en Eme1-immuunkomplekse dus getoets op gepaardgaande endonuklease-aktiwiteit deur hierdie substraat te gebruik (Figuur 2B). Die aktiwiteit van 3HaMus81 was aansienlik verhoog in monsters wat saam met FLAG-Eme1B getransfekteer is, maar nie met FLAG-Eme1A of FLAG-Eme1C nie. Net so, toe die verskillende vorme van Eme1 immuun-gepresipiteer is met behulp van die FLAG-teenliggaam, het die B-vorm geredelik waarneembare aktiwiteit gehad. Langer blootstellings onthul endonuklease-aktiwiteit in beide immuun-neerslae van FLAG-Eme1A en FLAG-Eme1C (ons ongepubliseerde data), maar Eme1B-geassosieerde endonuklease-aktiwiteit was deurgaans hoër.

Figuur 1. Identifikasie van 'n menslike homoloog van SpEme1. (A) 'n Menslike cDNA wat kodeer vir 'n oop leesraam van 571 aminosure wat ooreenstem met spEme1 (Boddy et al., 2001) is geïdentifiseer deur die PSI-BLAST-algoritme. Belyning van Eme1 -homoloë is gegenereer met behulp van die Clustal W -program. Identiteite word omgekeerd getoon. (B) Drie ryvariante van menslike Eme1 is verkry uit American Type Culture Collection. Eme1A (ATCC kloon 2899969) kodeer vir 'n proteïen van 583 aminosure, Eme1B (ATCC kloon 3905809) kodeer vir 'n proteïen van 571 aminosure, en Eme1C (ATCC kloon 814686) kodeer vir 'n proteïen van 542 aminosure.

Figuur 2. Eme1 het interaksie met Mus81 en het Mus81-afhanklike endonuklease-aktiwiteit. HeLa-selle is tydelik met 3HaMus81 getransfekteer in die teenwoordigheid of afwesigheid van FLAG-Eme1. Agt en veertig uur na transfeksie is lysate en immuun neerslae ondersoek vir die teenwoordigheid van 3Ha-Mus81 en FLAG-Eme1. (A) 3HaMus81 is opgespoor in FLAG-immuun-neerslae uit selle wat FLAG-Eme1A, B of C. uitdruk (B) Ha en FLAG immuun-presipitate is getoets vir gepaardgaande endonukleaseaktiwiteit deur gebruik te maak van 'n 3'-flapsubstraat. Ko-uitdrukking van 3HaMus81 en FLAG-Eme1B het die hoogste aktiwiteit tot gevolg gehad. (C) FLAG-Eme1B is opgespoor in Ha immuun-neerslae uit selle wat wilde tipe 3Ha-Mus81 (WT) en 'n endonuklease dooie weergawe van Mus81 (AA) uitdruk. 3HaMus81 (wild-tipe en 'n endonuklease dooie weergawe) is opgespoor in 'n FLAG-immuun-neerslag uit selle wat FLAG-Eme1B (D) FLAG-Eme1B immuun-neerslae uit selle wat met 'n wild-tipe, maar nie endonukleas-dood geklou is, uitdruk nie 3HaMus81-splitsing 3′ flap strukture. 3HaMus81WT immuun-neerslae het gepaardgaande endonukleaseaktiwiteit wat verhoog is toe selle met TRAG-Eme1 oorgedra word. S, substraat alleen. Die swart kolletjie verteenwoordig radioaktiewe fosfaatetikettering van die substraat.

Om te bepaal watter vorme van Eme1 in HeLa-selle uitgedruk word, is oligonukleotied-inleiers wat algemeen is vir al drie variante gebruik om volgordes van 'n HeLa-sel cDNA-biblioteek te amplifiseer. Die produkte van PCR is gekloon en die beperking -ensiem analise van ses klone het 'n patroon gegee wat ooreenstem met Eme1B. Opeenvolging van 2 klone het geverifieer dat die transkripsie wat ooreenstem met Eme1B in HeLa -selle uitgedruk word. Alhoewel hierdie analise nie die moontlikheid uitsluit dat die A- of C-vorm van Eme1 in ander seltipes, of teen lae vlakke in HeLa-selle uitgedruk word nie, was transkripsies wat ooreenstem met die B-vorm van die proteïen geredelik waarneembaar, daarom het ons verdere ontleding van Eme1 deur die B -vorm van die proteïen te gebruik.

Ons het eers gevra of die endonuklease-aktiwiteit wat in 'n Eme1-immuun neerslag opgespoor word, van Mus81 afhang. Soos getoon in Figuur 2C, het FLAG-Eme1 geassosieer met wildtipe Mus81 en met 'n mutante weergawe van Mus81 wat nie gepaardgaande endonuklease-aktiwiteit het nie (Chen et al., 2001). Endonuklease-aktiwiteit is opgespoor in 'n immuun-neerslag van FLAG-Eme1 uit selle wat gelyktydig met wild-tipe 3HaMus81 getransfekteer is, maar nie in selle wat alleen met FLAG-Eme1 getransfekteer is nie (Figuur 2D). Dus, Eme1-geassosieerde endonuklease-aktiwiteit is afhanklik van ko-uitdrukking van wilde-tipe Mus81. Soos voorheen berig (Chen et al., 2001), Ha-immuun-neerslae van selle wat met 3HaMus81 getransfekteer is, het waarneembare endonuklease-aktiwiteit gehad in die afwesigheid van getransfekteerde Eme1 (Figuur 2D).

Eme1 lokaliseer in Nucleoli en in streke van beskadigde DNA

Onlangse studies van menslike Mus81 het getoon dat dit lokaliseer na nukleoli en na streke van beskadigde DNA in S-fase selle (Gao) et al., 2003). As Eme1 in kompleks met Mus81 optree, moet dit dieselfde kenmerkende patroon van subcellulêre lokalisering toon. Dit is getoets met behulp van indirekte-immuun-fluoressensie van selle wat getransfekteer is met vektore wat 3HaEme1 en FLAG-Mus81 kodeer. Soos voorheen gesien, is Mus81 behou in die nukleoli van selle wat aan ekstraksie in situ onderwerp is voor fiksasie (Gao et al., 2003). Daar is gevind dat 3HaEme1 presies in twee tot drie streke van die kern met Mus81 gekolokaliseer is (Figuur 3A). Inhoud van 3HaEme1 en die nukleolêre merker nucleophosmin/B23 het bevestig dat die Eme1 binne nucleoli behou word (Figuur 3A). Om vas te stel of Eme1 op 'n selsiklusafhanklike wyse na gebiede van beskadigde DNA gewerf word, is selle by die G1/S-grens met dubbel-timidienblok gesinkroniseer. Inhegte selle, of selle wat vir 5 uur vrygestel is, is deur UV-bestraling deur polikarbonaatfilters met porieë met 'n deursnee van 10 mikrometer bestraal en 15 minute later is monsters vasgemaak en gekleur vir skadegebiede en vir Eme1. Om die herstel van UV-fotoprodukte deur NER te voorkom, is simian virus 40 (SV40) -getransformeerde fibroblaste met 'n defek in XPA in hierdie analise gebruik (Mone et al., 2001). Wanneer selle wat deur thymidien gearresteer is, UV-bestraal is, is gebiede van skade duidelik gevisualiseer (Figuur 3B) met behulp van die siklobutaan pirimidien dimeer-spesifieke monoklonale teenliggaam TDM2 (Mizuno et al., 1991 Mori et al., 1991). 3HaEme1 is gevind in die nukleoli van timidien-gearreste selle, maar daar was geen bewyse dat Eme1 na streke van beskadigde DNA gewerf is nie (1 van 25 gevalle).Daarteenoor, 5 uur na die vrystelling van timidien, toe die meerderheid selle DNA repliseer, is Eme1 gevind in nukleoli en binne skadegebiede (25 van 30 gevalle). Die patroon van lokalisering van Eme1 in beskadigde en onbeskadigde selle is dus identies aan dié wat onlangs vir Mus81 (Gao) gerapporteer is et al., 2003).

Figuur 3. Eme1 kolokaliseer met Mus81 in nucleoli en word gewerf na gebiede van skade in S-fase selle. HeLa-selle wat getransfekteer is met vektore wat vir 3HaEme1 en FLAG-Mus81 kodeer, is 24 uur op deksels gegroei en aan in-plek-ekstraksie onderwerp voordat dit vasgemaak is. (A) Monsters is vir immuun-fluoressensie verwerk deur teenliggaampies teen die Ha-epitope (rooi), teen die FLAG-epitope (groen) of nukleofosmien/B23 (groen) te gebruik. Monsters is gekos met 4,6-diamidino-2-fenielindool om DNA te onthul. (B) XPA-selle is getransfekteer met 3HaEme1 en FLAG-Mus81, gegroei op deksels en by die G1/S-grens gesinkroniseer deur dubbel-timidien (Tdr) blok. 'N UV-ondeursigtige filter wat porieë van ∼10 μm in deursnee bevat, is geplaas op selle wat blootgestel is aan 60 mJm -2 254-nm lig en daarna vir 15 minute gekweek voor in situ fraksie en fiksasie. Selle is gekleur vir Eme1 (rooi) en met TDM-2 (groen) om die streke van UV-geïnduseerde siklobutaan pirimidien dimeer op te spoor. Top, tipiese sel wat tydens bestraling in tymidien was. Onderste, tipiese sel 5 uur na vrystelling van die timidienblok.

Aktiwiteit van rekombinante Mus81-Eme1

Eme1 is noodsaaklik vir Mus81 aktiwiteit en funksie in splitsingsgis (Boddy et al., 2001). Net so is Mms4 noodsaaklik vir Mus81 -aktiwiteit en funksie in ontluikende gis (Kaliraman et al., 2001 Mullen et al., 2001). Om te toets of Eme1 noodsaaklik is vir die aktiwiteit van menslike Mus81, is insekselle besmet met baculovirusse wat vir Gst-Mus81, FLAG-Eme1 of albei kodeer (Figuur 4A). Immuun-neerslag Gst-Mus81 en FLAG-Eme1 is getoets met behulp van 'n 3 ′ flap, 'n replikasie vurk, of 'n Holliday aansluiting struktuur (X12). Gst-Mus81 alleen het geen waarneembare aktiwiteit op enige van hierdie substrate gehad nie. Op dieselfde manier het immuun-neerslag FLAG-Eme1B geen waarneembare endonuklease-aktiwiteit gehad nie (Figuur 4B). In teenstelling hiermee, toe Gst-Mus81 en FLAG-Eme1 immuun neerslae van Mus81 saam uitgedruk het, het die 3'-flap en replikasie vurkstrukture maklik gesplit. 'N Laer maar waarneembare en spesifieke aktiwiteit is ook waargeneem met behulp van die X12 substraat (Figuur 4B). Dus, die endonuklease-aktiwiteit van Mus81 hang af van Eme1 en omgekeerd. 'n Soortgelyke patroon van aktiwiteit is gesien in immuunpresipitate van FLAG-Eme1 en na suiwering van rekombinante Mus81-Eme1 deur GSH-Sepharose-chromatografie (ons ongepubliseerde data). Die data verkry deur immuunpresipitasie van rekombinante Mus81-Eme1 word getoon omdat dit direkte vergelyking met die aktiwiteit van immuun-gepresipiteerde endogene Mus81 moontlik maak. Net soos endogene Mus81, het rekombinante Mus81-Eme1 'n laer aktiwiteit teen 'n Holliday-aansluitingsubstraat. Soos voorheen gesien is vir endogene en getransfekteerde Mus81, was die reaksieproduk lineêre dupleks (Chen et al., 2001). Geen splitsing is opgespoor toe 'n mutante vorm van Mus81 (Mus81AA) gebruik is nie.

Figuur 4. Endonuklease-aktiwiteit van rekombinante Mus81-Eme1. Gst-Mus81 of FLAG-Eme1B is immuun neergeslaan deur Sf9-selle wat besmet is met virusse wat die aangeduide proteïene kodeer. (A) Mus81-immuunpresipitate is ondersoek vir die teenwoordigheid van Gst-Mus81 en FLAG-Eme1B. (B) Rekombinante Mus81-Eme1 kloof 3'-flap, replikasievurk en Holliday-aansluiting (X12) strukture in vitro. Die aktiwiteit wat verband hou met Mus81 immuun-neerslae uit HeLa-selle word getoon ter vergelyking (En). S, substraat alleen. Die swart kolletjie verteenwoordig radioaktiewe fosfaatetikettering van die substrate.

Vereniging van Mus81-Eme1 katalitiese eenhede

Die generering van lineêre dupleksprodukte vereis koördinaat -splitsing van twee teenoorgestelde dele van die X12 -substraat en impliseer dat die ensiem in komplekse bestaan ​​wat twee katalitiese eenhede bevat. Om te bepaal of Mus81-Eme1 bestaan ​​in die hoër orde komplekse wat nodig is om die splitsing van Holliday-aansluitings te koördineer, is menslike selle gelyktydig getransfekteer met plasmiede wat twee verskillende vorme van Mus81, 3HaMus81 en FLAG-Mus81 kodeer. Soos getoon in Figuur 5A, is FLAG-Mus81 opgespoor in 'n immuunpresipitaat van 3HaMus81. Kontrolemonsters waarin selle met een konstruk getransfekteer is, toon dat daar geen kruisreaktiwiteit tussen die immuunpresipiterende teenliggaam is nie. Net so, wanneer 3HaEme1 saam met FLAG-Eme1 getransfekteer is, is 3HaEme1 opgespoor in immuunpresipitate van FLAG-Eme1 (Figuur 5B). Hierdie analise maak nie 'n onderskeid tussen die aantal Mus81- of Eme1 -molekules wat met mekaar saamval nie, maar dit toon wel aan dat ten minste twee molekules van Mus81 en Eme1 in vivo assosieer.

Figuur 5. Mus81 en Eme1 self-assosieer. 293 selle is getransfekteer met 3HaMus81, FLAG-Mus81, of albei. Veertig uur na transfeksie is lysate en Ha immuun neerslae ondersoek vir die teenwoordigheid van 3HaMus81 en FLAGMus81. (A) FLAG-Mus81 is opgespoor in Ha immuun-neerslae uit selle wat 3HaMus81 uitdruk. (B) 3Ha-Eme1 is opgespoor in FLAG-immuunpresipitate van selle wat FLAG-Eme1 uitdruk.

RNA-interferensie met Mus81-uitdrukking verminder lewensvatbaarheid

Die rol van Mus81 in menslike selle is ondersoek met behulp van RNAi om Mus81-uitdrukking te onderdruk (Brummelkamp et al., 2002). Soos getoon in Figuur 6A, is Mus81-proteïenvlakke aansienlik verminder in selle wat getransfekteer is met pSuper-vektore wat 19-nukleotiedvolgordes bevat wat twee streke van Mus81-mRNA (pSuper-178 en pSuper-292) teiken (Brummelkamp) et al., 2002). Geen verlies aan Mus81 is gesien in selle wat met kontrolevektor (pSuper) getransfekteer is nie. Die effek wat Mus81-RNAi op die lewensvatbaarheid van selle gehad het, is bepaal deur die oorlewing van die kolonie te bepaal. Soos getoon in Figuur 6B, was die onderdrukking van Mus81 -uitdrukking geassosieer met 'n beduidende vermindering in die vermoë van selle om lewensvatbare kolonies te vorm. Verlies aan lewensvatbaarheid het spesifiek verband gehou met verminderde Mus81 -uitdrukking omdat dit gesien is na transfeksie met twee verskillende konstrukte wat verminderde Mus81 -uitdrukking veroorsaak en nie gesien is na transfeksie van kontrole -RNAi -vektore nie. Vloeisitometriese analise het nie 'n beduidende verandering in die sel siklusverspreiding 48 of 72 uur na transfeksie met pSuper-178 of pSuper-292 aan die lig gebring nie. Eksperimente om die spesifieke oorsaak van seldood te bepaal was nie insiggewend nie.

Figuur 6. Onderdrukking van Mus81 deur RNAi lei tot verminderde lewensvatbaarheid. (A) Transfeksie met pSuper-178, pSuper-292, maar nie leë pSuper nie, lei tot verminderde Mus81-proteïen. Nie-Tx, ongetransfekteerde selle. (B) HeLa-selle is met pSuper-178, pSuper-292 of pSuper getransfekteer en teen lae digtheid uitgeplaat. Kolonies is getel na 10 d se groei en kleuring met Geimsa. Drievoudige plate is vir elke punt getel. Resultate is die gemiddelde van drie onafhanklike transfeksies.

RNAi-onderdrukking van Mus81 verminder mitotiese rekombinasie

'N Meiotiese defek van Mus81 wat van rekombinasie afhang, is gerapporteer beide in splitsingsgis en ontluikende gis (Interthal en Heyer, 2000 Boddy et al., 2001 Kaliraman et al., 2001). Om te bepaal of Mus81 nodig is vir mitotiese rekombinasie in menslike selle, het ons gebruik gemaak van 'n SV40-getransformeerde menslike fibroblastlyn, GM847L22 (Prince et al., 2001), wat 'n enkele geïntegreerde kopie van die mitotiese rekombinasieverslaggewer plasmied pLrec bevat (Herzing en Meyn, 1993 Meyn, 1993). 'N Skema van die Lrec -kasset word in figuur 7A getoon. Dit bevat twee direkte herhalings van geneties onaktiewe β-galaktosidase (LacZ) gene en kan aanleiding gee tot LacZ+ selle deur geenomskakeling, ongelyke susterchromatied-uitruiling, of deur intrachromosomale rekombinasie (Herzing en Meyn, 1993 Meyn, 1993 Prince et al., 2001). Hierdie stelsel is voorheen gebruik om aan te toon dat selle van ataxia telangiectasia -pasiënte 'n verhoogde mitotiese rekombinasietempo het (Meyn, 1993) en dat die verlies van die Werner -sindroomproteïen (WRN) verband hou met verminderde produktiewe mitotiese rekombinasie (Prince et al., 2001 Saintigny et al., 2002). 'N Kenmerk van hierdie verslaggewer is dat β-galaktosidase-aktiwiteit direk in enkele selle aangeteken kan word, dus is dit verenigbaar met verbygaande afregulering deur gebruik van RNAi. Verder hang dit nie af van die lewensvatbaarheid van die kultuur op lang termyn nie. Na transfeksie met plasmiede wat Mus81-uitdrukking (pSuper-178, pSuper-292) of kontroleplasmiede (pSuper of pCDNA) onderdruk, is GM847L22-selle gegroei in die teenwoordigheid van tymidien om die voorkoms van rekombinasie te verhoog (Lundin et al., 2002). Na 'n verdere 24 uur groei in normale medium, is selle gekleur vir β-galaktosidase aktiwiteit en die frekwensie van rekombinasie is aangeteken. Ontransfekteerde kulture het 1470 ± 180 rekombinante per miljoen selle gegenereer (Figuur 7B). 'n Soortgelyke aantal LacZ + selle is gesien na transfektering van kontrolevektore. Die aantal rekombinante is viervoudig (p = 0.0003) en tweevoudig (p = 0.0006) verminder in selle wat onderskeidelik met die Mus81-RNAi-plasmiede, pSuper-292 en pSuper-178 getransfekteer is. Hierdie data het voorgestel dat onderdrukking van Mus81 mitotiese rekombinasie verminder, maar kan ook aandui dat Mus81-RNAi inmeng met β-galaktosidase uitdrukking. Om te bepaal of Mus81-RNAi-getransfekteerde selle aktiewe ß-galaktosidase kan uitdruk, is selle getransfekteer met 'n plasmied wat 'n enkele ongeskonde kopie van die β-galaktosidase en met pSuper, pSuper-178, of pSuper-292 plasmiede dra. Selle is verwerk en gekleur vir β-galaktosidase aktiwiteit presies soos hierbo beskryf. 'n Soortgelyke persentasie (84 ± 2%) van β-galaktosidase positiewe selle was in alle gevalle teenwoordig. Daarom interpreteer ons hierdie data om aan te dui dat afregulering van Mus81 rekombinasie tussen die twee onaktiewe LacZ-allele onderdruk eerder as uitdrukking van β-galaktosidase-aktiwiteit per se.

Figuur 7. Onderdrukking van Mus81 lei tot verminderde mitotiese rekombinasie en word gered deur uitdrukking van 'n bakteriële resolusie van die Holliday -aansluiting, RusA. (A) pLrec bevat 'n direkte herhaling van twee onaktiewe LacZ-gene geskei deur die neomisienweerstandsgeen (swart boks). Uitdrukking is onder die beheer van die SV40-promotor (grys boks). Basispare (693) van dieselfde volgorde in die twee LacZ -allele word met pyle aangedui. Lx2 is onaktief as gevolg van 'n invoeging by 'n plek wat deur X aangedui word. ΔLx1 het nie 727 basispare van 5'-volgorde nie (Herzing en Meyn, 1993). Die sellyn GM847L22 bevat 'n enkele ongeskonde kopie van pLrec (Prince et al., 2001). (B) Voorkoms van LacZ + -selle. Selle (5 × 105) is 16 uur voor transfeksie met die aangeduide plasmied in G418-vrye medium geplateer. Die hoeveelheid DNA wat getransfekteer is, word deur gebruikmaking van 'n leë vektor konstant gehou. Timidien (2 mM) is by die kultuurmedium gevoeg en selle is vir 16 uur gegroei. Selle word vir 'n verdere 24 uur in normale groeimedium gekweek, voordat dit vir β-galaktosidase-aktiwiteit gekleur word. Duplikaatgeregte is gebruik om selgetal en uitdrukking van Mus81 en RusA te monitor. Foutstawe verteenwoordig data uit vier afsonderlike eksperimente. (C) Ha immuun kolle van sellisate dui aan dat die aktiewe en mutante vorms van RusA op vergelykbare vlakke uitgedruk is. (D) Immuunneerslae van wilde tipe RusA was aktief op X12 strukture, maar nie op 3 ′ flapstrukture in vitro nie. Die 80, 8, 2 en 1 dui die relatiewe verhouding aan van die ensiem wat by 'n konstante hoeveelheid substraat gevoeg word. Mutante weergawes van RusA, RusAN70A, of Mus81-Eme1, Mus81AA, het nie enige struktuur geklief nie. Wild-tipe Mus81-Eme1 het beide X12- en 3'-klepstrukture omskep in lineêre dupleksprodukte. Kwantifisering van die produkopbrengs is bereken met behulp van Image Quant (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) sagteware. S, substraat alleen.

RusA red Mus81-afhanklike rekombinasie

RusA red die meiotiese defek en hipersensitiwiteit vir middels wat replikasievurk tot stilstand bring van Mus81 mutante (Boddy) et al., 2001 Doe et al., 2002). Ons het geredeneer dat indien onderdrukking van Mus81 in menslike selle lei tot die ophoping van Holliday-aansluitings, die vermindering in rekombinasie gered sal word deur die uitdrukking van aktiewe RusA (Bolt en Lloyd, 2002). Soos getoon in figuur 7B, het die uitdrukking van wilde-tipe Ha-gemerkte RusA nie die voorkoms van rekombinasie in selle wat met 'n leë vektor getransfekteer is (p = 0.65) beduidend beïnvloed nie, wat daarop dui dat RusA op hierdie vlak van uitdrukking nie verhoogde dryf nie rekombinasie in menslike selle. In teenstelling hiermee, as dit aktief was, is kern-RusA (RusAWT) gekontransfekteer met plasmiede wat vir Mus81-RNAi kodeer, dit die voorkoms van rekombinasie verhoog tot die vlakke wat in ongetransfekteerde beheerkulture voorkom (Figuur 7B). 'N Endonuklease dooie weergawe van RusA (RusAN70) het die aantal rekombinante in Mus81-RNAi-getransfekteerde selle nie beduidend verhoog nie. Immuunblotting het getoon dat die wilde tipe en mutante vorme van RusA gelyk uitgedruk is (Figuur 7C). Ha-immuun-presipitate en endonuklease aktiwiteit toetse het bevestig dat wilde-tipe, maar nie mutante RusA, aktief was op 'n Holliday aansluiting (X12) substraat (Figuur 7D). Die waarneming dat RusA Mus81-afhanklike rekombinasie red, dui daarop dat die twee ensieme in vivo op 'n gemeenskaplike substraat kan inwerk. Ons het dus die vermoë van RusA en Mus81-Eme1 getoets om 'n X12- of 3'-flapstruktuur in vitro te splits. Beide ensieme is uit die HeLa-selle herwin deur die Ha-teenliggaam te gebruik. Soos in figuur 7D getoon, het Mus81-Eme1 geredelik waarneembare aktiwiteit op beide substrate. Mus81-Eme1 het 10- tot 12 keer meer aktiwiteit op die 3′-flap getoon in vergelyking met die X12 oor die reeks ensiemhoeveelheid wat gebruik is. Net so het RusA die X12-struktuur gesplit, selfs nadat 'n 80-voudige verdunning van die immuun-neerslag RusA die X12-struktuur opgespoor het. Daarenteen het die inkubasie van gelyke hoeveelhede RusA met 'n 3′ flapstruktuur geen waarneembare produk opgelewer nie. Selfs met detektor sensitiwiteit wat 10 keer hoër gestel is, is geen produk opgespoor in die monsters waarin RusA met 'n 3' flap struktuur geïnkubeer is nie. Hierdie analise dui daarop dat as RusA in vitro 3 ′ -flappe afsplits, dit die effektiwiteit wat dit op die X12-struktuur verrig, by 1000 vou.


Erkennings

Ons bedank dr Jeremy Stark vir nuttige opmerkings oor die manuskrip. Hierdie werk is ondersteun deur die National Research Service Award-genootskap (GM18640) aan R.D.J. en Human Frontiers Science Program (RG-270/97) en National Institutes of Health (GM54688) toekennings aan M.J. 'n Gedeelte van hierdie werk is gedoen onder die vaandel van die Amerikaanse Departement van Energie onder kontrak nr. W-7405-ENG-48.

Die publikasiekoste van hierdie artikel is gedeeltelik gedek deur die betaling van bladsykoste. Hierdie artikel moet dus hierby gemerk word 'advertensie' in ooreenstemming met 18 USC artikel 1734 slegs om hierdie feit aan te dui.


MATERIAAL EN METODES

Plasmiede en konstruksies

'N Gewysigde SCneo -vektor is voorberei soos voorheen beskryf [29]. Twee gemodifiseerde gemuteerde estrogeenreseptorpeptiede (Mer) [30] is aan beide die N- en C-terminale van die I-Sce Ek endonuklease volgorde in die pCMV-I-Sce I vektor [31] om die Mer-I- te vormSce I-Mer samesmelting proteïen uitdrukking vektor.

Oprigting van die SCneo-Mer-I-Sce I-sellyn

'N Gewysigde SCneo -vektor [29] is na MRC5/SV -selle getransfekteer (verkry van die Riken Bank). 'N Sellyn wat een kopie van die SCneo -konstruk bevat, is gekies met behulp van Southern blotting -analise soos voorheen beskryf [29]. Die Mer-I-Sce I-Mer vektor is toe saam met 'n puromisien-weerstandige vektor pApuro [32] gekotransfekteer en stabiele klone is geselekteer deur kultuur in medium wat puromisien bevat (0.1 μg/ml). Uitdrukking van die Mer-I-Sce I-Mer-samesmeltingsproteïen in die puromisien-geselekteerde klone is met Western-blotting gekontroleer met behulp van 'n teen-oestrogeen reseptor teenliggaam (Merck-Millipore, #06–935). Die HDR-frekwensie in die Mer-I-Sce I-Mer-uitdrukkende selle is getoets, en 'n sellyn wat die hoogste stabiele HDR-frekwensie met 'n lae agtergrondfrekwensie toon, is verkry na addisionele seleksie. Deur hierdie gevestigde selkloon te gebruik, kan 'n plek-spesifieke DSB geïnduseer word in die S2neo fragment in die SCneo verslaggewer konstrueer deur 4-hidroksitamoksifen (OH-TAM) by die medium te voeg. hitteskokproteïen 90 (HSP90), wat onder normale omstandighede aan die Mer-subeenheid bind, word vervang deur OH-TAM en die Mer-I-Sce I-Mer-nuklease kan dan na die kern vervoer word. Hierdie kerntranslokasie laat die Mer-I-Sce I-Mer gee toegang tot die herkenningsvolgorde daarvan op die S2neo fragment (Fig. 1A). Al die eksperimente wat in hierdie werk beskryf word, is uitgevoer met behulp van een spesifieke kloon.

Kinetika van DSB-induksie deur OH-TAM-behandeling en DSB sluit weer aan na verwydering van OH-TAM. (A) Diagram wat die SCneo-Mer-I-Sce I-selstelsel wys. 'n Terreinspesifieke DSB word geïnduseer in die SCneo verslaggewergen deur die Mer-I-Sce I-Mer fusie nuklease na die byvoeging van OH-TAM. Toegang tot die Mer-I-Sce I-Mer nuklease na sy herkenningsvolgorde op S2neo vind plaas wanneer HSP90 vervang word deur OH-TAM, en die Mer-I-Sce I-Mer nuklease word dan na die kern vervoer. (B) Skedule vir DSB-induksietoetsmonsters na OH-TAM-behandeling. (C) Asynchrone selle is vir 60 minute met OH-TAM (400 nM) behandel. OH-TAM is daarna verwyder en die selle is verder geïnkubeer. Die hoeveelheid ongeskonde S2neo is gemonitor deur intydse PCR -analise. Waardes word uitgedruk as die relatiewe hoeveelheid S2neo in vergelyking met kontrole (met etanol behandel) selle. Swart vertikale strepies verteenwoordig Mer-I-Sce I-Mer-uitdrukkingselle wat met OH-TAM behandel is en wit vertikale stawe verteenwoordig OH-TAM-behandelde selle sonder Mer-I-Sce I-Mer uitdrukking. Die grys vertikale staaf verteenwoordig EtOH-behandelde selle (0,1% etanol). Die grys uitgebroeide staaf met die naam I-Sce I verteenwoordig I-Sce Ek-verteerde genomiese DNA.

Kinetika van DSB-induksie deur OH-TAM-behandeling en DSB-heraansluiting na verwydering van OH-TAM. (A) Diagram wat die SCneo-Mer-I-Sce I-selstelsel wys. 'N Plaasspesifieke DSB word veroorsaak in die SCneo verslaggewergen deur die Mer-I-Sce I-Mer fusie-nuklease na die toevoeging van OH-TAM. Toegang van die Mer-I-Sce I-Mer nuclease tot sy herkenningsvolgorde op S2neo kom voor wanneer HSP90 vervang word deur OH-TAM, en die Mer-I-Sce I-Mer-nuklease word dan na die kern vervoer. (B) Skedule vir DSB-induksietoetsmonsters na OH-TAM-behandeling. (C) Asinchroniese selle is vir 60 min met OH-TAM (400 nM) behandel. OH-TAM is daarna verwyder en die selle is verder geïnkubeer. Die hoeveelheid ongeskonde S2neo is gemonitor deur intydse PCR-analise. Waardes word uitgedruk as die relatiewe hoeveelheid S2neo in vergelyking met kontrole (met etanol behandel) selle. Swart vertikale stawe verteenwoordig Mer-I-Sce I-Mer-uitdrukkingselle wat met OH-TAM behandel is en wit vertikale stawe verteenwoordig OH-TAM-behandelde selle sonder Mer-I-Sce I-Mer uitdrukking. Die grys vertikale staaf verteenwoordig EtOH-behandelde selle (0,1% etanol). Die grys uitgebroeide staaf met die naam I-Sce I verteenwoordig I-Sce Ek-verteerde genomiese DNA.

Ontleding van DSB-induksie en heraansluiting met intydse PCR

Gesinkroniseerde of asynchrone SCneo/Mer-I-Sce I-selle is vir 1 uur met OH-TAM (400 nM) behandel. Op 30, 45, 60, 75 en 90 minute na die byvoeging van OH-TAM, is die selle gelys met Tris-HCl buffer (pH 7.5) aangevul met 2% natriumdodesielsulfaat (SDS) en 0.1 mg/ml proteïnase K (Wako) ), en genomiese DNA is onttrek. Intydse PCR -analise is gebruik om die verhouding van ongeskonde te bepaal S2neo fragmente relatief tot die totale aantal S2neo rye, omdat DSB-induksie by die I-Sce I erkenning webwerf verminder die kopie aantal ongeskonde S2neo rye. Die toetse is uitgevoer volgens die instruksies van die vervaardiger met behulp van TaqMan MGB-meermengsel (Thermo-Fischer) en 'n Step-One Real Time PCR-stelsel (Thermo-Fischer). Die volgorde van die TaqMan -sonde en 'n primer stel vir S2neo was soos volg: die TaqMan-sonde was 5'-AATATCATGGTGGAAAATG-3 'in die primerset, die voorwaartse primer was 5'-GCGAGGATCTCGTCGTGACT-3' en die omgekeerde primer was 5'-ACGGGTAGCCAACGCTATGT-3 '. Die TaqMan-uitdrukkingsbepaling vir glutaraldehied 3-fosfaat dehidrogenase (GAPDH) (Thermo-Fischer) is gebruik as 'n interne kontrole om genomiese DNA te kwantifiseer. Die relatiewe waarde vir delta-Ct vir S2neo om delta-Ct vir GAPDH (die relatiewe waarde van ongeskonde S2neo) is bereken, en die relatiewe aantal DSB's wat geïnduseer is, is aangedui deur die dalende waarde van ongeskonde S2neo relatief tot die waarde uitgedruk in etanol-behandelde selle. Die DSB-positiewe beheer was die I-Sce I-verteerde genomiese DNA wat uit onbehandelde selle onttrek is.

Ontleding van HDR doeltreffendheid en herstel produkte

Selle is vir 1 uur gekweek in serumvrye medium wat OH-TAM (400 nM) bevat. Die selle is twee keer met normale kweekmedium gewas en daarna vir nog 24 uur gekweek. Die selle word dan in 'n medium wat G418 bevat (Calbiochem, 400 ug/ml) uitgeplaat om kolonievorming moontlik te maak. Die frekwensie van HDR (geenomsetting) is bereken uit die aantal G418-weerstandige kolonies. Ontleding van HDR -produkte is uitgevoer soos voorheen beskryf [29, 33]. Kortliks, die S2neo volgorde in G418-weerstandige klone is geamplifiseer met PCR deur gebruik te maak van 'n spesifieke primer stel (5'-CGTCGAGCAGTGTGGTTTTCA-3' en 5'-AAAGCACGAGGAAGCGGTCAG-3') en ExTaq DNA polimerase (TaKaRa). Die geamplifiseerde DNA is verteer met NcoEk of ek-SceI om twee tipes HDR-produkte te identifiseer: kortweg-genomskakeling (STGC) of langweg-genomskakeling/susterchromatieduitruiling (LTGC/SCE).

Sel siklus sinchronisasie

Selle is gesinkroniseer deur gebruik te maak van 'n opeenvolgende behandeling wat bestaan ​​uit serumhonger, blootstelling aan kolcemied en mitotiese afskud. Eerstens is selle vir 31 uur onder serum-gehongerde toestande gekweek. Onder hierdie toestande word selle gedeeltelik gesinchroniseer in die G1 -fase sonder enige toename in die aantal apoptotiese selle. Die medium is dan verwyder en vervang met normale medium (7% fetale bees serum) en die selle is vir 6 uur gekweek om hulle deur die selsiklus te laat vorder. Hierdie gedeeltelik gesinchroniseerde selle is verder vir 8 uur in kolcemied (25 ng/ml)-bevattende medium geïnkubeer. Ten slotte is mitotiese selle losgemaak van die kultuurskottel met ligte vibrasies en pipettering. Losstaande selle is met sentrifugering (500 x g vir 5 min) versamel en is twee keer met normale medium gewas. Die versamelde mitotiese selle is daarna geïnkubeer. Die selsiklusstadia in die gesinchroniseerde populasie is gemonitor met vloeisitometriese analise met behulp van 'n FACS-masjien (BD-Bioscience) of 'n Tali-beeldgebaseerde sitometer (Thermo-Fischer).

Chromatien immunoprecipitation (ChIP) toets

Werwing van DSB herstelfaktore aan die I-Sce I-geïnduseerde DSB-plek is ontleed met 'n ChIP-toets. In kort, is selle vir 10 minute behandel met 1% (vol/vol) formaldehied in fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS), en die verknopingsreaksie is beëindig deur 1,5 M glisien (vir 'n finale konsentrasie van 77,5 mM) en bykomende inkubasie by te voeg vir 5 min. Die selkerne is geïsoleer deur inkubasie in IP-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA pH 8.0, 1.0% Nonidet P-40) vir 15 minute op ys, en is dan met 'n Bioruptor UCD gesoniceer -300 (Cosmo-Bio) om 600–800 bp chromatienfragmente te kry. Die fragmente in oplossing is gesuspendeer in ChIP-verdunningsbuffer (50 mM Tris – HCl pH 8,0, 167 mM NaCl, 1,1% Triton X-100, 0,11% natriumdeoksykolaat, 1/200 protease-remmer cocktail, 1/200 fosfatase inhibeerder) en geïnkubeer met die gewenste teenliggaam vir 2 uur by 4 ° C. Proteïen G sepharose (GE Healthcare) is bygevoeg en oornag geïnkubeer. Die teenliggaampies wat gebruik is, was anti-histoon H2A.X-pS139 (ab81299, Abcam, [1:200]), anti-NBS1 (GTX70224, GeneTex, [1:200]), anti-RAD51 (Bio Academia, [1:200) ]), anti-53BP1 (A300-272A, Bethyl, [1: 200]) en anti-DNA-afhanklike proteïenkinase katalitiese subeenheid (DNA-PKcs) fosfo-S2056 (ab18192, Abcam, [1: 200]). Na die inkubasie is die proteïen G sepharose gewas met 'n reeks 1 × RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.1% natriumdeoksicholaat), 1 × RIPA-buffer/500 mM NaCl (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.1% natriumdeoksicholaat), LiCl-was buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M LiCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.5% NP-40, 0.5% natriumdeoksicholaat) en 1 × TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA). Om die chromatienfragmente te elueer, is die gewasde Proteïen G-sepharose oornag met 200 μL ChIP direkte elueringsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS) by 65°C geïnkubeer. Uitgeskoteerde chromatienfragmente is vir 1 uur by 55 ° C geïnkubeer met 0,1 mg/ml Proteinase K en die genomiese DNA -fragmente is daarna met etanol neergeslaan. Intydse PCR-analise is uitgevoer soos beskryf. Die PCR-inleiders en TaqMan-probes wat gebruik is, was: S2neo#341 (594 nt van die DSB), 5'-CGACCCTGCAGCCAATATG, 5'-AGAACCTGCGTGCAATCCA, en die sonde was 5'-ATCGGCCATTGAAC S2neo#729 van die DSB0n 5, ( ′-CGGCTGCATACGCTTGATC, 5′-GATGCGATGTTTCGCTTGGT, en die sonde was 5′-ACCTGCCCATTCGA.

Statistiese analise

Al die data is verkry uit ten minste drie onafhanklike eksperimente. Statistiese analise is uitgevoer met behulp van die Student se t-toets. Vir HDR-toetse is saamgevoegde data verkry uit ten minste vier onafhanklike eksperimente gebruik vir statistiese analise.


BESPREKING

Ons gee hier verslag oor die identifisering van 'n spesifieke regulerende meganisme van rekombinasie in sentromere. Rad51-afhanklike HR is oorheersend in die sentromere, terwyl beide Rad51-afhanklike HR en Rad51-onafhanklike SSA in die armgebied voorkom. Oorkruisings tussen omgekeerde herhalings op dieselfde chromatied is in die sentromere onderdruk. Mhf1/CENP – S, Mhf2/CENP – X en Fml1/FANCM was nodig om kruisings en GCR's in sentromere te onderdruk.

Sedert 1932 is dit in baie organismes waargeneem dat meiotiese rekombinasie onderverteenwoordig is rondom sentromere (12, 61). Ons het gevind dat mitotiese rekombinasie, in teenstelling met meiotiese rekombinasie, nie in sentromere onderdruk is nie. Rad51, Rad54 en Rad52 was almal noodsaaklik vir herkombinasie by cen1, terwyl Rad51 en Rad54 slegs gedeeltelik benodig was in vergelyking met Rad52 by die ura4 lokus. Die verskillende genetiese vereistes waargeneem by cen1 en ura4 dui daarop dat Rad51-afhanklike HR oorheers in sentromere, terwyl Rad51-onafhanklike SSA ook in die armgebied voorkom. Rad51-onafhanklike SSA blyk spesifiek in sentromere onderdruk te word, aangesien dit in die armstreek in ontluikende gis waargeneem is (62). By soogdier -sentromere veroorsaak SSA tussen tandemherhalings verwyderings, wat lei tot inaktivering van sentromere (63). Soogdier Rad52, wat 'n geringe rol in Rad51-afhanklike HR het, bevorder tumorgenese (64, 65). Onderdrukking van SSA in herhalende streke soos sentromere is dus belangrik om die integriteit van genome te handhaaf. Onderdrukking van SSA kan wees as gevolg van 'n gebrek aan ssDNA, aangesien daar getoon is dat klein hoeveelhede ssDNA-bindende proteïen RPA met sentromeer DNA assosieer tydens replikasie in Xenopus eierekstrakte (66). Post-vertalingswysiging kan ook betrokke wees by die onderdrukking van SSA. SUMOylering van Rad52 inhibeer in vitro SSA -aktiwiteit en mutasie van die SUMOylation -webwerf verhoog spesifiek die verwydering tussen tandemherhalings (67–69).

Oorkruisings hou verband met wederkerige uitruil van chromosomale streke. Hierdie studie het getoon dat die proporsie oorkruisings tussen omgekeerde herhalings by cen1 merkbaar laer is as dié van die ura4 lokus. Oorkruisings maar nie nie-oorkruisings is sterk afgeneem by cen1, wat 'n spesifieke onderdrukking van oorkruisings in sentromere toon. Dit is onwaarskynlik dat die kruisonderdrukking bloot te wyte is aan die voorkoms van Rad51-afhanklike HR. rad51 en rad54 skrapings verminder nie-kruisings meer as kruisings by cen1, maar dit verminder nie-kruisings en kruisings na soortgelyke omvang by ura4, wat 'n sterk voorkeur toon van Rad51-afhanklike HR vir nie-kruisings in sentromere, maar nie in armstreke nie. Daar is waarskynlik twee afsonderlike regulatoriese meganismes agter die voorkoms van Rad51-afhanklike HR en die kruisonderdrukking in sentromere. Heterochromatien is saamgestel op pericentromeriese herhalings in die ura4-Sn (cen) -konstruksie, maar 'n hoë vlak van crossovers en Rad51-onafhanklike SSA is steeds waargeneem, wat toon dat nóg 'n verlenging van die homoloë gebied of heterochromatien-samestelling voldoende is om crossovers en SSA te onderdruk die ektopiese terrein. Deletie van H3K9-metieltransferase Clr4 het nie die proporsie oorkruisings by cen1 aansienlik verhoog nie, terwyl dit die totale tempo van rekombinasie effens verhoog het (Aanvullende Figuur S13), wat daarop dui dat heterochromatiensamestelling nie nodig is vir die spesifieke onderdrukking van oorkruisings in sentromere nie. Dit blyk dus dat die sentromeerproteïene eerder as heterochromatienfaktore SSA en oorkruisings in sentromere onderdruk. Verrassend genoeg blyk Cnp1/CENP-A en sy verwante proteïene egter nie noodsaaklik te wees vir die onderdrukking van oorkruisings nie. 'N Residuele aktiwiteit van die temperatuurgevoelige mutante proteïen kan voldoende wees vir die onderdrukking van die oorkruising by semipermissiewe temperature. Inderdaad, mis18–262 het die verhouding van kruisings van 4 na 12% verhoog (Figuur 5B), hoewel die effek statisties nie betekenisvol is met die beperkte aantal monsters (Bl = 0,087, die tweestert Fisher se presiese toets). Ons sluit dus nie die moontlikheid uit dat Cnp1/CENP – A en sy verwante proteïene betrokke is by die onderdrukking van kruisings in sentromere nie. Onlangs, met behulp van chromosoom-oriëntasie fluoresserende in situ hibridisasie (CO-FISH) in menslike selle, het Giunta en Fanabiki getoon dat CENP-A, CENP-C, CENP-T en CENP-W sentromeer α-satelliet herhalings beskerm teen onwettige rekombinasie ( 75), wat aantoon dat rekombinasie tussen herhalings van sentromere ook by mense beheer word. Interessant genoeg het hulle verder getoon dat die uitruil van susterchromatiede in verskeie kankerselle en tydens replikatiewe veroudering toeneem, wat daarop dui dat sentromeer onstabiliteit betrokke is by tumorigenese en veroudering.

Mhf1/CENP – S en Mhf2/CENP – X vorm twee verskillende komplekse: CENP – T – W – S – X (15, 18, 19) en (Mhf1 – Mhf2)2 ( 15, 19– 22, 59, 70). Hierdie studie het bevind dat mhf1 en mhf2 verhoog kruisings in sentromere. Dit blyk dat (Mhf1–Mhf2)2 eerder as CENP–T–W–S–X is verantwoordelik vir die kruisonderdrukking, soos cnp20-M447T het nie die kruisings verhoog nie, maar wel die sentromere lokalisering van CENP -T verminder. cnp20-M447T het ook die lokalisering van Mhf2 in sentromere verminder (aanvullende figuur S10), wat daarop dui dat die lokalisering van Mhf2 in vaste toestand afhanklik is van CENP – T – W – S – X en dat dit nie noodsaaklik is vir die onderdrukking van die oorkruising nie. fml1Δ verminderde crossovers soortgelyk aan mhf1Δ en mhf2Δ, en het nie oorkruisings in verder verhoog nie mhf1Δ selle, wat daarop dui dat Mhf1–Mhf2 en Fml1 oorkruisings in dieselfde pad onderdruk. In kontras met rad51, rad54 en rad52 mutasies, mhf1, mhf2 en fml1 verhoog die netto koers van crossovers, wat aantoon dat Mhf1 – Mhf2 en Fml1 wel crossovers onderdruk. Mhf1 en Mhf2 vorm Mhf1–Mhf2 heterodimere en interaksie met mekaar om te vorm (Mhf1–Mhf2)2 tetramere wat by voorkeur vertakte DNA bind en interaksie het met FANCM helikase (15, 22, 59, 71). mhf1-L78R het nie die interaksie van Mhf1 – Mhf2 ontwrig nie en slegs 'n ligte gebrek in selgroei en ligte sensitiwiteit vir DNA -beskadigende middels veroorsaak, maar afgeskaf (Mhf1 - Mhf2)2 tetrameer vorming en merkbaar verhoogde oorkruisings by cen1. Dit is dus waarskynlik dat (Mhf1 – Mhf2)2 tetramere is veral belangrik in die onderdrukking van die kruisings en dat Mhf1 ook 'n funksie kan hê, onafhanklik van tetrameervorming. In die ura4-Sn(cen) konstruk, ook nie mhf1-LR ook nie fml1Δ het oorkruisings aansienlik verhoog. Dit is onwaarskynlik dat die heterochromatien ektopies saamgestel op ura4-Sn(cen) oorkruisings in die plek van Fml1 onderdruk, aangesien fml1Δ het die kruisings nie beduidend verhoog nie, selfs in die afwesigheid van Clr4 (aanvullende figuur S14). Ons stel 'n model voor om te verduidelik hoe (Mhf1–Mhf2)2 en Fml1 onderdruk oorkruisings in sentromere (Figuur 7F). In sentromere inhibeer ongeïdentifiseerde sentromere faktore vertakking van gesamentlike molekules. In ooreenstemming hiermee is onderbreking van DNA-replikasievurke waargeneem by sentromere van ontluikende gis (72). Afwykende DNA -strukture soos DNA -lusse word in sentromere opgehoop tydens replikasie in Xenopus -eierekstrakte (66). Sodra vertakte DNA gestabiliseer is, (Mhf1–Mhf2)2 bind dit en werf Fml1 helicase om gesamentlike molekules uitmekaar te haal, wat lei tot sintese-afhanklike stralingsgloeiing wat slegs nie-kruisings genereer (73, 74). In armstreke strek takmigrasie heterodupleks, wat die vorming van Holliday-aansluitings vergemaklik, waarvan die resolusie óf kruisings óf nie-kruisings tot gevolg het. Hierdie studie het dit getoon mhf1-LR en fml1 verhoog die tempo van GCR's waarvan die breekpunte voorkom in herhalings van sentromere. Voorheen het ons dit gewys rad51Δ en rad54Δ verhoog die sentromere GCR's (35, 36). Daarom is twee kenmerke van sentromere-rekombinasie wat in hierdie studie geïdentifiseer is: 'n oorheersing van Rad51-afhanklike HR en kruisonderdrukking belangrike meganismes waardeur homologie-gemedieerde chromosomale herrangskikkings in sentromere voorkom word.


Die homoloë herkombinasie van DNS—die uitruiling van stukke DNS tussen twee soortgelyke DNS-molekules—is sentraal tot die herstel van verskeie tipes DNS-skade, en is ook 'n werklike voorbeeld van 'soek na 'n naald in 'n hooimied'. Hoe bring die rekombinasie-masjinerie binne-in selle 'n kort stuk enkelstrengs-DNA bymekaar en pas dit in ooreenstemming met 'n identiese volgorde van dubbelstrengs-DNA in 'n genoom wat uit miljoene of selfs miljarde basispare bestaan? Skryf in eLife, het navorsers aan die Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign bewys gelewer wat daarop dui dat 'n proteïen genaamd RecA die enkelstrengs-DNA kan help om langs die dubbelstrengs DNA te gly totdat die molekules behoorlik in lyn is (Ragunathan et al., 2012).

Homoloë rekombinasie is 'n komplekse, maar tog baie behoue ​​pad wat nodig is vir die herstel van DNA -dubbelstrengbreuke (Cromie et al., 2001) en replikasievurke wat gestop het (Cox et al., 2000), en dit bied ook 'n middel genetiese diversiteit te genereer. Die belangrikheid van hierdie herstelweg word geopenbaar deur die feit dat dubbele snaarbreuke tot chromosomale afwykings lei, wat 'n kenmerk van kanker is.

Sedert dit in 1965 ontdek is, is die prokariotiese ensiem RecA 'n modelstelsel vir wetenskaplikes wat aan DNA-herstelwerk werk. Tydens homoloë rekombinasie bind RecA aan die enkelstrengs-DNA wat by die dubbelstrengbreuk gegenereer word en vorm 'n kompleks wat bekend staan ​​as die pre-sinaptiese filament. Hierdie kompleks moet dan op een of ander manier die genoom ondersoek om 'n bypassende dubbelstring-DNS-vennoot te vind deur 'n proses waarna verwys word as die 'homologiesoektog' (Figuur 1). Sodra homoloë DNA gevind is en die rye in lyn gebring is, dring die pre-sinaptiese filament die dupleks binne, sodat die DNA-breuk uiteindelik herstel kan word met behulp van die homoloë DNA as 'n sjabloon om getrouheid te verseker.

Stille beelde van 'n video-animasie wat homologiesoektog illustreer (nie volgens skaal nie). Die pre-sinaptiese filament moet 'n spesifieke volgorde van basisse vind (hier in blou en pienk getoon met die naam 'homologie') op 'n lang molekule dubbelstrengs DNA (dsDNA). Dit bind aanvanklik aan die dsDNA deur 3D diffusie (A), en gly dan heen en weer langs die dsDNA terwyl dit na die ry soek (B). As die volgorde nie gevind kan word nie, kan die pre-sinaptiese filament deur 'n intersegmentale oordrag na 'n nuwe plek beweeg (C), en begin weer heen en weer langs die dsDNA -molekule gly (D), totdat dit die volgorde van basisse vind waarna dit soek (E). Die volledige video is beskikbaar op http://youtu.be/BmSrjVLb94c.

BEELDE: MYLES MARSHALL, BRYAN GIBB.

Hierin lê die raaisel: Hoe vind RecA presies die korrekte stuk DNA? Vroeë werk in die middel-1980's het die eerste prikkelende wenke verskaf dat die homologie-soektog aangehelp kan word deur 'n meganisme genaamd intersegmentele oordrag wat die pre-sinaptiese filament toelaat om in werklikheid 'n kortpad te neem deur tussen distale streke van die dubbel- gestrande DNA (Gonda en Radding, 1986 Figuur 1C).

In die laat 1990's het 'n ander studie egter tot die gevolgtrekking gekom dat die pre-sinaptiese filament nie langs DNA gegly het nie: eerder, hierdie werk het voorgestel, is die soekmeganisme hoofsaaklik bemiddel deur driedimensionele (3D) diffusie (Adzuma, 1998). En vroeër hierdie jaar het navorsers van UC Davis die resultate van enkelmolekule-eksperimente gerapporteer wat getoon het dat die pre-sinaptiese filament in staat was om streke van homologie op te spoor toe die dupleks-DNA toegelaat word om te ontspan: die soektog is egter belemmer toe die dupleks DNA is uitgerek (Forget en Kowalczykowski, 2012). Hierdie eksperimente het oortuigend getoon dat intersegmentele oordrag in werklikheid bydra tot die soeke na homologie, en dat die pre-sinaptiese filament gelyktydig kan monster en beweeg tussen verskillende streke van dubbelstrengs DNA wat ver van mekaar is. Maar dit is nie die einde van die storie nie.

In 'n poging om die soeke na homologie in nog meer besonderhede te verstaan, het die Illinois-span-Kaushik Ragunathan, Cheng Liu en Taekjip Ha-enkelmolekule fluorescentie resonansie energie-oordrag (FRET) gebruik om te ondersoek of die pre-sinaptiese filament dubbel kan gly -stranded DNA (Ragunathan et al., 2012). Enkel-molekule FRET is basies 'n 'molekulêre liniaal' wat die afstand tussen twee verskillende molekules kan meet as elkeen gemerk is met 'n klein kleurstofmolekule wat fluoresserende lig uitstraal. In die besonder kan dit baie klein afstandsveranderinge meet, in die orde van net 'n miljardste van 'n meter, sodat dit 'n baie hoër ruimtelike resolusie bied as wat voorheen bereik is.

Die Illinois-span het die pre-sinaptiese filamente aan die oppervlak van die mikroskoopskyfie vasgemaak en daarna intyds gekyk hoe hulle na homologie soek op kort fragmente van dubbelstrengs DNA.Die FRET-seine het op en af ​​gewissel, wat aandui dat die pre-sinaptiese filamente aan die dubbelstrengs DNA gebind is, en onthul ook dat die afstand tussen die punte van die molekules vinnig verander. Deur die lengte van die enkelstrengs-DNA te verander, het Ragunathan, Liu en Ha bepaal dat hierdie skommelinge veroorsaak word deur die pre-sinaptiese filament wat langs die dubbelstrengs DNA-fragmente gly.

Om te bevestig dat die gly plaasvind, het die navorsers die enkelstrengs-DNA-volgorde daarna herontwerp sodat dit op slegs een van twee moontlike homoloë plekke met die dubbelstrengs-DNA in lyn kan kom, maar nie beide tegelyk nie. Dit het hulle in staat gestel om presies te bepaal hoe hulle op 'n gegewe oomblik in lyn was. Soos verwag, het hulle opgemerk dat die DNA -molekules in lyn was met die een of ander van die twee homoloë plekke, maar verrassend genoeg kon die Illinois -span ook oorgange tussen die twee plekke opspoor. 'N Noukeurige ontleding van hierdie oorgange het aan die lig gebring dat die pre-sinaptiese filamente heen en weer tussen die twee streke van homologie kon beweeg deur langs die dubbelstrengs DNA te gly.

Met die eerste oogopslag kan dit voorkom asof hierdie bewyse vir 1D-gly die intersegmentele oordragmeganisme wat deur die UC Davis-groep gerapporteer is, weerspreek. Die twee meganismes is egter nie onversoenbaar nie, en dit lyk waarskynlik dat beide hierdie soektogmetodes betrokke is by homoloë rekombinasie. Een moontlikheid is dat intersegmentele oordrag die pre-sinaptiese filament toelaat om verskillende streke van dubbelstring-DNS oor lang afstande te monster, terwyl 1D-gly gebruik word om oor baie korter afstande te soek (Figuur 1).

Die werk van Ragunathan, Liu en Ha verteenwoordig 'n deurslaggewende vooruitgang in ons begrip van die molekulêre gebeure wat tydens die soektog na homologie plaasvind. Baie belangrike vrae bly egter onbeantwoord. Byvoorbeeld, hoe neem die pre-sinaptiese filament eintlik die volgorde van die dubbelstrengs DNA om streke van homologie te identifiseer? Wat is die relatiewe bydraes van 1D -gly en intersegmentele oordrag? Hoe gereeld moet die pre-sinaptiese filament 'n gebied van homologie monster voordat suksesvolle belyning kan plaasvind? Sal eukariotiese proteïene soortgelyke meganismes gebruik om DNS -rye te belyn? Hoe beïnvloed die ander proteïene wat by homoloë rekombinasie betrokke is, die soeke na homologie? En laastens, hoe word soektogte na ooreenstemmende rye uitgevoer in die meer komplekse fisiologiese omgewings wat in lewende selle voorkom? Moderne enkelmolekule-beeldtegnologieë, soos dié wat deur die Illinois-span gebruik word, is gereed om sommige van hierdie vrae te begin beantwoord.


25.2: DNA-mutasies, skade en herstel

Die integriteit van die DNA-struktuur vir sellewensvatbaarheid word onderstreep deur die groot hoeveelhede sellulêre masjinerie wat toegewy is om die akkurate replikasie, herstel en berging daarvan te verseker. Nogtans is mutasies binne die DNA 'n redelik algemene gebeurtenis.

Mutasies is ewekansige veranderinge wat plaasvind binne die volgorde van basisse in DNS. Hulle kan grootskaals wees, die struktuur van die chromosome verander, of kleinskaal waar hulle slegs 'n paar of selfs 'n enkele basis of nukleotied verander. Mutasies kan om baie redes voorkom. DNA -mutasies kan byvoorbeeld veroorsaak word deur foute wat die DNA -polimerase tydens replikasie begaan het. Soos in hoofstuk 9 opgemerk, is DNA -polimerases hoogs verwerkende ensieme wat proeflees- en redigeringsfunksies bevat. Met hierdie voorsorgmaatreëls is hul foutkoerse tipies baie laag en wissel van een uit 'n miljoen basisse tot een uit 'n miljard basisse. Selfs met so 'n hoë getrouheid sal hierdie foutkoers lei tot tussen 3 en 3 000 foute binne die menslike genoom vir elke sel wat DNS-replikasie ondergaan. DNA -mutasies kan ook ontstaan ​​deur die replikasie van DNA wat deur endogene of eksogene middels beskadig is. In die volgende afdeling word algemene tipes DNA -skade en die gevolge daarvan beklemtoon. As 'n DNS-polimerase 'n beskadigde DNS-basis in die sjabloon-DNS tydens replikasie teëkom, kan dit 'n ewekansige nukleotiedbasis oorkant die letsel plaas. Byvoorbeeld, 'n adenienbevattende nukleotied sal dikwels by 'n letsel gevoeg word, ongeag die korrekte pasmaat. Dit kan lei tot die vorming van oorgang of transversie mutasies.

A oorgang mutasie is 'n puntmutasie wat 'n purienukleotied verander na 'n ander purien (A & harr G) of 'n pirimidienukleotied na 'n ander pirimidien (C & harr T). Terwyl a transversie verwys na die vervanging van 'n purien deur 'n pirimidien of omgekeerd. Soms kan letsels veroorsaak dat basisse oorgeslaan word tydens replikasie of veroorsaak dat ekstra nukleotiede in die ruggraat ingevoeg word. DNA-polimerases kan ook gly tydens die replikasie van streke van die DNA wat herhaalde rye of groot strekke het wat 'n enkele basis herhaal. Groter letsels of kruisings in die DNA tydens replikasie kan lei tot meer katastrofiese DNA-skade, insluitend breuk van DNA-stringe. Mutasies kan ook voorkom tydens die prosesse van mitose en meiose wanneer susterchromatiede en/of homoloë chromosome van mekaar geskei word.

In die natuur, mutagenese, of die proses om DNA -mutasies te genereer, kan lei tot veranderinge wat skadelik, voordelig of geen effek het nie. Skadelike mutasies kan tot kanker en verskillende oorerflike siektes lei, maar voordelige mutasies is die dryfveer van evolusie. In 1927 demonstreer Hermann Muller die effek van mutasies met waarneembare veranderings in chromosome. Hy het mutagenese veroorsaak deur vrugtevlieë met X-strale te bestraal.

As 'n mutasie veroorsaak word deur 'n omgewingsfaktor of 'n chemiese middel, word die middel a genoem mutageen. Tipiese mutagenes sluit in chemikalieë, soos dié wat ingeasem word tydens rook, en bestraling, soos X-strale, ultraviolet lig en kernstraling. Verskillende mutageen het 'n ander manier om DNA te beskadig en word verder in die volgende afdeling bespreek. Dit is belangrik om daarop te let dat DNA -beskadiging op sigself nie noodwendig lei tot die vorming van 'n mutasie in die DNA nie. Daar is uitgebreide DNA -herstelprosesse wat ontwerp is om verskillende tipes DNA -letsels te herken en te herstel. Minder as 1 uit 1 000 DNA -letsels sal eintlik 'n DNA -mutasie tot gevolg hê. Die prosesse van DNA-skadeherkenning en herstel is die fokus van latere afdelings binne hierdie hoofstuk.

Tipes mutasies

Daar is verskillende soorte mutasies. Twee hoofkategorieë van mutasies is kiemlynmutasies en somatiese mutasies.

  • Kiemlyn mutasies kom voor in gamete, die geslagselle, soos eiers en sperm. Hierdie mutasies is veral betekenisvol omdat hulle na die nageslag oorgedra kan word en elke sel in die nageslag sal die mutasies hê.
  • Somatiese mutasies in ander selle van die liggaam voorkom. Hierdie mutasies het min invloed op die organisme omdat hulle beperk is tot slegs een sel en sy dogterselle. Somatiese mutasies kan ook nie aan nageslag oorgedra word nie.

Mutasies verskil ook in die manier waarop die genetiese materiaal verander word. Mutasies kan 'n hele chromosoom of net een of 'n paar nukleotiede verander.

Chromosomale veranderinge is mutasies wat chromosoomstruktuur of getal verander. Hulle kom voor wanneer 'n gedeelte van 'n chromosoom afbreek en weer verkeerd aansluit of glad nie weer aansluit nie. Moontlike maniere waarop hierdie mutasies kan voorkom, word in die figuur hieronder geïllustreer. Chromosomale veranderinge is baie ernstig. Dit lei dikwels tot die dood van die sel of organisme waarin dit voorkom. As die organisme oorleef, kan dit op verskeie maniere aangetas word. 'n Voorbeeld van 'n menslike chromosomale verandering is die mutasie wat Downsindroom veroorsaak. Dit is 'n duplikasie -mutasie wat lei tot vertragings in die ontwikkeling en ander afwykings. Dit kom voor wanneer die individu 'n ekstra kopie van chromosoom 21. erf. Dit word ook trisomie genoem (& quotthree-chromosome & quot) 21. Grootskaalse mutasies in chromosomale struktuur sluit dus in: (1) Amplifikasies (insluitend geenduplikasies) waar herhaling van 'n chromosomale segment of teenwoordigheid van 'n ekstra stuk van 'n chromosoom 'n gebroke stuk van 'n chromosoom aan 'n homoloë of nie-homoloë chromosoom kan koppel, sodat sommige van die gene in meer as twee dosisse teenwoordig is, wat lei tot veelvuldige kopieë van alle chromosomale streke verhoog die dosis van die gene wat daarin geleë is, (2) Skrapingsvan groot chromosomale streke, wat lei tot die verlies van die gene in daardie streke, en (3) Chromosomale herrangskikkings soos translokasies (wat genetiese dele van nie-homologe chromosome uitruil), invoegings (wat segmente van een chromosoom in 'n ander nie-homologe chromosoom plaas), en inversies(wat 'n gedeelte van 'n chromosoom in die teenoorgestelde rigting omkeer of draai) (Figuur 12.1).

Figuur 12.1 Chromosomale veranderings. Chromosomale veranderinge is groot veranderinge in die genetiese materiaal. Prent gewysig van Dietzel65

Daar is ook kleiner mutasies wat kan voorkom wat slegs 'n enkele nukleotied of 'n klein aantal nukleotiede binne 'n gelokaliseerde gebied van die DNA verander. Dit word geklassifiseer volgens die manier waarop die DNA -molekule verander word. Een tipe, a puntmutasie, beïnvloed 'n enkele basis en kom die meeste voor wanneer een basis vervang of vervang word deur 'n ander basis. Mutasies spruit ook uit die byvoeging van een of meer basisse, bekend as 'n invoeging, of die verwydering van een of meer basisse, bekend as a skrap.

Puntmutasies kan 'n wye reeks effekte op proteïenfunksie hê (Tabel 12.1 en Figuur 12.2). As gevolg van die agteruitgang van die genetiese kode, a puntmutasie sal gewoonlik daartoe lei dat dieselfde aminosuur in die gevolglike polipeptied opgeneem word ondanks die volgordeverandering. Hierdie verandering sal geen effek op die proteïen&rsquos-struktuur hê nie, en word dus 'n genoem stille mutasie. A missense mutasie veroorsaak dat 'n ander aminosuur in die resulterende polipeptied opgeneem word. Die effek van 'n missense mutasie hang af van hoe chemies anders die nuwe aminosuur is van die wilde tipe aminosuur. Die ligging van die veranderde aminosuur binne die proteïen is ook belangrik. As die veranderde aminosuur byvoorbeeld deel uitmaak van die ensiem en rsquos aktiewe plek of die vorm van die ensiem baie beïnvloed, kan die effek van die missense mutasie beduidend wees. Baie missense -mutasies lei tot proteïene wat nog steeds funksioneel is, ten minste tot 'n mate. Soms kan die uitwerking van missensmutasies slegs sigbaar wees onder sekere omgewingstoestande soos missensmutasies genoem voorwaardelike mutasies. Selde kan 'n missense -mutasie voordelig wees. Onder die regte omgewingstoestande kan hierdie tipe mutasie die organisme wat dit huisves 'n selektiewe voordeel gee. Nog 'n ander tipe puntmutasie, genaamd a nonsens mutasie, omskep 'n kodon wat vir 'n aminosuur ('n sinkodon) kodeer in 'n stopkodon ('n onsin -kodon). Onsinnige mutasies lei tot die sintese van proteïene wat korter is as die wilde tipe en gewoonlik nie funksioneel is nie (opgesom in figuur 12.3).

Tabel 12.1: Tipes puntmutasies

Tik Beskrywing Voorbeeld Effek
Stil gemuteerde kodon kodes vir dieselfde aminosuur CAA (glutamien) &rarr CAG (glutamien) geen
Missense gemuteerde kodonkodes vir 'n ander aminosuur CAA (glutamien) en rarr CCA (prolien) veranderlike
Nonsens 'n gemuteerde kodon is 'n premature stopkodon CAA (glutamien) &rarr UAA (stop) gewoonlik ernstig

Figuur 12.2 Die potensiële effekte van puntmutasies op proteïenkoderende streke. Die prent toon verskeie tipes puntmutasies (stil, misverstand en nonsens), wat kan lei tot verandering in die proteïenstruktuur.
Figuur uit: Jonsta247

Kleiner skaal skrapings en invoegings veroorsaak ook verskillende gevolge. Omdat kodons drieling van nukleotiede is, kan invoegings of delesies in groepe van drie nukleotiede lei tot die invoeging of uitwissing van een of meer aminosure en mag dit nie beduidende effekte op die gevolglike proteïen en rsquos funksionaliteit veroorsaak nie. Maar raamverskuiwing mutasies, veroorsaak deur invoegings of verwyderings van 'n aantal nukleotiede wat nie 'n veelvoud van drie is nie, is uiters problematies omdat 'n verskuiwing in die leesraam tot gevolg het (Figuur 12.3). Omdat ribosome die mRNA in drielingkodons lees, kan rameverskuiwingsmutasies elke aminosuur na die punt van die mutasie verander. Die nuwe leesraam kan ook 'n stopkodon insluit voor die einde van die koderingsreeks. Gevolglik is proteïene gemaak van gene wat raamverskuiwingsmutasies bevat byna altyd nie-funksioneel.

Figuur 12.3. Opsomming van kleinskaalse mutasies op proteïenkoderende streke. DNS-veranderings wat lei tot veranderinge in die proteïenvolgorde wat deur die DNS gekodeer word, kan puntmutasies, DNS-invoegings en DNS-delesies insluit.

Die meerderheid mutasies het geen negatiewe of positiewe uitwerking op die organisme waarin dit voorkom nie. Hierdie mutasies word neutrale mutasies genoem. Voorbeelde sluit in stilpuntmutasies, wat neutraal is omdat hulle nie die aminosure in die proteïene wat hulle kodeer, verander nie.

Sommige mutasies het 'n positiewe uitwerking op die organisme waarin dit voorkom. Daar word na hulle verwys as voordelige mutasies. As dit in kiemselle (eiers of sperms) voorkom, kan hierdie eienskappe oorerflik wees en van die een geslag na die volgende oorgedra word. Voordelige mutasies kodeer gewoonlik vir nuwe weergawes van proteïene wat organismes help om by hul omgewing aan te pas. As hulle 'n organisme verhoog en die kans op oorlewing of voortplanting verhoog, sal mutasies waarskynlik mettertyd meer algemeen binne 'n populasie kom. Daar is verskeie bekende voorbeelde van voordelige mutasies. Hier is net twee:

  1. Mutasies het plaasgevind in bakterieë wat die bakterieë toelaat om te oorleef in die teenwoordigheid van antibiotika. Die mutasies het gelei tot die ontwikkeling van antibiotika-weerstandige bakteriestamme.
  2. 'N Unieke mutasie word gevind by mense in 'n klein dorpie in Italië. Die mutasie beskerm hulle teen die ontwikkeling van aterosklerose, wat die gevaarlike opbou van vetterige materiale in bloedvate is. Die individu waarin die mutasie die eerste keer verskyn het, is selfs geïdentifiseer.

Skadelike mutasies kan ook voorkom. Stel u voor dat u 'n ewekansige verandering in 'n ingewikkelde masjien, soos 'n motormotor, kan aanbring. Die kans dat die ewekansige verandering die motor se werking verbeter, is baie klein. Die verandering is baie meer geneig tot 'n motor wat nie goed loop nie of moontlik glad nie loop nie. Terselfdertyd sal enige ewekansige verandering in 'n geen se DNA meer waarskynlik lei tot die produksie van 'n proteïen wat nie normaal funksioneer nie of glad nie funksioneer nie, as in 'n mutasie wat die funksie verbeter. Sulke mutasies sal waarskynlik skadelik wees. Skadelike mutasies kan genetiese afwykings of kanker veroorsaak.

  • 'N Genetiese afwyking is 'n siekte, sindroom of ander abnormale toestand wat veroorsaak word deur 'n mutasie in een of meer gene of deur 'n chromosomale verandering. 'n Voorbeeld van 'n genetiese afwyking is sistiese fibrose. 'N Mutasie in 'n enkele geen veroorsaak dat die liggaam dik, taai slym produseer wat die longe verstop en buise in die spysverteringskanale blokkeer. Genetiese afwykings word gewoonlik veroorsaak deur geenmutasies wat binne kiemselle voorkom en oorerflik van aard is.
  • Siektes wat veroorsaak word deur mutasies wat binne 'n individu voorkom, maar nie na hul nageslag oorgedra word nie, is mutasies wat in somatiese selle voorkom. Kanker is 'n siekte wat veroorsaak word deur 'n ophoping van mutasies binne somatiese selle. Dit lei tot selle wat buite beheer groei en abnormale massas selle vorm wat gewasse genoem word. Dit word oor die algemeen veroorsaak deur mutasies in gene wat die selsiklus reguleer, DNA-herstel, angiogenese en ander gene wat selgroei en oorlewing bevoordeel. As gevolg van die mutasies het selle met die gemuteerde DNA ontwikkel om sonder beperkings te verdeel, weg te steek van die immuunstelsel en geneesmiddelweerstand te ontwikkel.

Terug na bo

12.2 Tipes DNS -skade

DNA-skade, as gevolg van omgewingsfaktore en normale metaboliese prosesse binne die sel, vind plaas teen 'n tempo van 1 000 tot 1 000 000 molekulêre letsels per sel per dag. Alhoewel dit slegs 0,000165% van die menslike genoom se ongeveer 6 miljard basisse (3 biljoen basispare) uitmaak, kan dit, indien dit nie herstel word nie, mutasies in kritieke gene veroorsaak (soos tumoronderdrukker-gene) 'n sel se vermoë om sy funksie uit te voer belemmer en aansienlik toeneem. die waarskynlikheid van gewasvorming en siektetoestande soos kanker.

Die oorgrote meerderheid DNA -skade beïnvloed die primêre struktuur van die dubbele heliks, dit wil sê die basisse self is chemies gemodifiseer. Hierdie modifikasies kan op hul beurt die molekulêre gereelde heliese struktuur ontwrig deur nie-inheemse chemiese bindings of lywige addukte aan te bring wat nie in die standaard dubbele heliks pas nie. Anders as proteïene en RNA, het DNA gewoonlik nie 'n tersiêre struktuur nie, en daarom ontstaan ​​daar geen skade of versteuring op daardie vlak nie. DNA is egter supergewikkel en gewikkel om "verpakking" proteïene genoem histone (in eukariote), en beide superstrukture is kwesbaar vir die gevolge van DNS-skade.

Daar is verskillende tipes DNA -skade wat kan ontstaan ​​as gevolg van normale sellulêre prosesse of as gevolg van blootstelling van selle aan DNA -beskadigende middels in die omgewing. DNA-basisse kan beskadig word deur: (1) oksidatiewe prosesse, (2) alkilering van basisse, (3) basisverlies wat veroorsaak word deur die hidrolise van basisse, (4) lywige adduktvorming, (5) DNA-kruisbinding en (6) DNA string breek, insluitend enkel- en dubbelstrengs breek. 'N Oorsig van hierdie tipe skade word hieronder beskryf.

Oksidatiewe skade

Reaktiewe suurstofspesies (ROS) kan aansienlike sellulêre spanning en skade veroorsaak, insluitend die oksidatiewe skade van DNA. Hidroksielradikale (& bull OH) is een van die mees reaktiewe en elektrofiliese van die ROS en kan geproduseer word deur ultraviolet en ioniserende straling of uit ander radikale wat voortspruit uit ensiematiese reaksies. Die & bull OH kan onder andere oksidatiewe produkte die vorming van 8-oxo-7,8-dihydroguanien (8-oxoG) veroorsaak uit guanienreste (figuur 12.4). Guanien is die maklikste geoksideerde van die nukleïensuurbasisse, omdat dit die laagste ionisasiepotensiaal onder die DNA -basisse het. Die 8-oxo-dG is een van die algemeenste DNA-letsels en word beskou as 'n biomerker van oksidatiewe stres. Daar word beraam dat tot 100,000 8-oxo-dG letsels daagliks in DNA per sel kan voorkom. Die verminderingspotensiaal van 8-oxo-dG is selfs laer (0,74 V vs NHE) as die van guanosine (1,29 V vs NHE). Daarom kan dit verder geoksideer word wat 'n verskeidenheid sekondêre oksidasieprodukte skep.

Figuur 12.4 Reaktiewe suurstofspesies en DNA -skade. Onder toestande van oksidatiewe stres is 8-oxoG die gevolg van reaktiewe suurstofspesies (ROS) wat 'n guanien verander.

Soos voorheen genoem, kan verhoogde vlakke van 8-oxo-dG in 'n weefsel dien as 'n biomerker van oksidatiewe stres. Verder word verhoogde vlakke van 8-okso-dG gereeld gevind wat verband hou met karsinogenese en ander siektetoestande (Figuur 12.5). Tydens die replikasie van DNA wat 8-okso-dG bevat, word adenien meestal oorkant die letsel ingewerk. Na replikasie word die 8-oxo-dG uitgesny tydens die herstelproses en 'n timien word in die plek daarvan ingewerk. Dus, 8-oxo-dG mutasies lei tipies tot 'n G tot T transversie.

Figuur 12.5 Oksidatiewe stres en menslike gesondheid. DNS -skade wat veroorsaak word deur oksidatiewe stres word geassosieer met baie siektetoestande by mense.

Alkylering van basisse

Alkyleringsmiddels is wydverspreid in die omgewing en word ook endogeen geproduseer, as neweprodukte van sellulêre metabolisme. Hulle voer letsels in DNA- of RNA -basisse aan wat sitotoksies, mutageen of neutraal vir die sel kan wees. Figuur 12.6 beeld die belangrikste reaktiewe plekke op die DNA -basisse uit wat vatbaar is vir alkylering. Sitotoksiese letsels blokkeer replikasie, onderbreek transkripsie of dui aan dat apoptose geaktiveer word, terwyl mutagene verkeerd kodeer en mutasies in nuut gesintetiseerde DNA veroorsaak. metieladenien (3meA), en O6-metielguanien (O6meG). Kleiner hoeveelhede metilering vind ook plaas op ander DNA-basisse, en sluit die vorming van N1-metieladenien (1meA), N3-metielsitosien (3meC), O4-metieltimien (O4meT) en metielfosfotriësters (MPT) in.

Figuur 12.6 Belangrike plekke van alkylering in DNA. Die diagram toon DNA Watson-Crick-basispare met die belangrikste skadeplekke wat deur klein alkyleringsmiddels (metiel en etiel) verander word. (A) Terreine van basismodifikasie deur SN1- en SN2 -alkyleringsmiddels. Die oranje dui groot skadeplekke aan en die groen geringe skadeplekke. (B) Fosfotriëstervorming aangedui deur die teenwoordigheid van metielgroepe, saam met die Rp- en Sp-isomere.

Alkyleermiddels kan skade veroorsaak by alle eksosikliese stikstowwe en oksigene in DNA en RNA, sowel as by ringstikstof (Figuur 12.6A). Die persentasie van elke gewysigde basisplek hang egter af van die alkyleringsmiddel, die posisie in DNA of RNA en of nukleïensure enkel- of dubbelstrengs is. Interessant genoeg is O-alkylasies meer mutageen en skadelik as N-alkylasies, wat meer sitotoksies kan wees, maar nie as mutageen nie.

Soos ons in hoofstuk 13 sal ondersoek, dien metilering van DNA ook as 'n belangrike meganisme wat gene -uitdrukking reguleer.

Basiese verlies

An AP webwerf (apuriniese/apyrimidiniese terrein), ook bekend as 'n abasiese webwerf, is 'n plek in DNA (ook in RNA maar baie minder waarskynlik) wat nie 'n purien- of 'n pyrimidienbasis het nie, hetsy spontaan of as gevolg van DNA -skade (Figuur 12.7). Daar word beraam dat daar daagliks 10 000 apuriniese plekke en 500 apyrimidinies onder fisiologiese toestande in 'n sel gegenereer kan word.

Figuur 12.7 Abasic Sites. Apuriniese en Apirimidimiese (AP) plekke kom voor as gevolg van onstabiele hidrolise.

AP-plekke kan gevorm word deur spontane depurinering, maar kom ook voor as tussenprodukte in basiseksisie-herstel, die herstelproses wat in afdeling 12.5 beskryf word. As dit nie herstel word nie, kan AP-plekke lei tot mutasie tydens semi-konserwatiewe replikasie. Hulle kan veroorsaak dat replikasievurk vasval en word dikwels omseil translesiesintese, wat in meer besonderhede in afdeling 12.8 bespreek word. In E coli, word adenien by voorkeur by AP -webwerwe ingevoeg, bekend as die & quotA -reël & quot. Die situasie is meer kompleks in hoër eukariote, met verskillende nukleotiede wat 'n voorkeur toon na gelang van die organisme en omgewingstoestande.

Volwasse ontvoering formasie

Sommige chemikalieë is biologies reaktief en vorm kovalente skakels met biologiese molekules soos DNA en proteïene wat groot vorm lywige byvoegsels, of aanhangsels, wat afskei van die hoofmolekule. Ons sal die mutagene/karsinogeen gebruik, benzo[a] pirene, as voorbeeld vir hierdie proses.

Benzo[a] pireen is 'n polisikliese aromatiese koolwaterstof wat ontstaan ​​tydens die onvolledige verbranding van organiese materiaal by temperature tussen 300 & degC (572 & degF) en 600 & degC (1,112 & degF). Die alomteenwoordige verbinding kan gevind word in steenkoolteer, tabakrook en baie kosse, veral vleis. Benzo[a]pyreen is eintlik 'n prokarsinogeen wat biologies geaktiveer moet word deur metabolisme voordat dit 'n reaktiewe metaboliet vorm (Figuur 12.8) Normaalweg, wanneer die liggaam blootgestel word aan vreemde molekules, sal dit 'n metaboliese proses begin wat die molekule meer hidrofiel en makliker verwyder as 'n afvalproduk maak. Ongelukkig, in die geval van benzo[a] pyreen, die gevolglike metaboliet is 'n hoogs reaktiewe epoksied wat by voorkeur 'n lywige addukt met guanienreste in DNA vorm. As dit nie herstel word nie, sal 'n adenien tydens DNA-replikasie gewoonlik oorkant die letsel in die dogtermolekule geplaas word. Latere herstel van die adduk sal lei tot die vervanging van die beskadigde guanienbasis met 'n timien, wat 'n G -& gt T -transversiemutasie kan veroorsaak.

Figuur 12.8 Benzo[a] pireenaktivering en adduksievorming. (A) Benzo[a]pireen word biologies geaktiveer tot 'n dihidrodiale epoksied tydens normale metaboliese prosesse. (B) Sigaretrook is 'n bron van benzo [a] pireen. (C) Die geaktiveerde (+)benzo[a]pireen-7,8-dihidrodiol-9,10-epoksied kan 'n DNA-addukt met guanienreste vorm. (D) Die benzo [a] pirienaddukt vorm 'n lywige letsel wat die DNA -ruggraat verdraai.

Terug na bo

DNA -verknoping

Kruisbinding van DNAkom voor wanneer verskillende eksogene of endogene middels reageer met twee nukleotiede van DNA, wat 'n kovalente skakel tussen hulle vorm. Hierdie verknoping kan binne dieselfde string voorkom (binneland) of tussen teenoorgestelde stringe van dubbelstring-DNS (interstrand) (Figuur 12.9). Hierdie addukte belemmer die sellulêre metabolisme, soos DNA -replikasie en transkripsie, wat die dood van selle veroorsaak.

Figuur 12.9 Skematiese diagram van Intrastrand en Interstrand DNA Crosslinks.

UV -lig kan veroorsaak dat molekulêre verknopings tussen twee pirimidienreste, gewoonlik twee timienreste, opeenvolgend binne 'n DNA -string geplaas word (figuur 12.10). Twee algemene UV-produkte is siklobutaan pirimidien dimere (CPD's) en 6&ndash4 fotoprodukte. Hierdie premutageniese letsels verander die struktuur en moontlik die basisparing. Tot 50 en ndash100 sulke reaksies per sekonde kan tydens 'n blootstelling aan sonlig in 'n velsel voorkom, maar word gewoonlik binne sekondes reggestel deur fotolyase -heraktivering of herstel van nukleotiede. Ongekorrigeerde letsels kan polimerases inhibeer, verkeerde lees tydens transkripsie of replikasie veroorsaak, of lei tot stop van replikasie. Pirimidien dimere is die primêre oorsaak van melanome by mense.

Figuur 12.10 Dubbelstrengs DNA breek en timien dimeer vorming (a) Ioniserende bestraling, soos X-strale en &gamma-strale bevat genoeg energie om enkel- en dubbelstring-breuke in die DNA-ruggraat te veroorsaak. (b) Energie van nie-ioniserende straling soos UV-lig word direk deur die DNA geabsorbeer wat veroorsaak dat timienreste wat aangrensend is binne 'n enkele DNA-string gekruis word. (c) 'n 6,4-dimeer wat 'n enkele kovalente binding vorm en (d) timien-timien siklobutaan dimeer wat 'n twee kovalente bindings tussen die timienreste vorm.

DNA Strand Breaks

Ioniserende straling soos die wat deur radioaktiewe verval of in kosmiese strale ontstaan, veroorsaak breek in DNA -stringe (Figuur 12.10a). Laevlak-ioniserende bestraling kan onherstelbare DNA-skade veroorsaak (wat lei tot replikasie- en transkripsiefoute wat nodig is vir neoplasie of kan virale interaksies veroorsaak) wat lei tot voortydige veroudering en kanker. Chemiese middels wat kruisbindings binne die DNA vorm, veral interstrand -kruisbande, kan ook lei tot breuk van DNA -stringe as die beskadigde DNA DNA -replikasie ondergaan. Verknoopte DNA kan veroorsaak dat topoisomerase -ensieme in die oorgangstoestand tot stilstand kom wanneer die DNA -ruggraat in die gesplete toestand is. In plaas daarvan om supercoiling te verlig en die ruggraat te herseël, bly die gestopte topoisomerase kovalent gekoppel aan die DNA in 'n proses genaamd abortiewe katalise. Dit lei tot die vorming van 'n enkelstrengs breuk in die geval van Top1 ensieme of dubbelstrengs breek in die geval van Top2 ensieme. DNA-dubbelstring-breuke as gevolg van topoisomerase-stalling kan ook tydens die transkripsie van DNA voorkom (Figuur 12.11). In werklikheid, aborsiewe kataliseen die vorming van DNA -stringbreuke tydens transkripsiegebeurtenisse kan dien as 'n beskadigingsensor in die sel en kan help om die DNA -reaksie -seinweë wat DNA -herstelprosesse begin, aan te wakker.

Figuur 12.11 Model van Topoisomerase IIB (TOP2B)-gemedieerde DNA-dubbelstreng breek tydens transkripsie. (Top Diagram) in die ongeïnduseerde toestand van transkripsie, word Pol II tussen +25 en +100 vanaf die transkripsiebeginplek onderbreek. Die pouse word toegeskryf aan verskillende elemente, insluitend pouse-stabiliserende transkripsiefaktore, die +1-nukleosoom en DNA-struktuur en torsie. Positiewe supercoiling voor Pol II kan die funksie van TOP2B vereis. (Middeldiagram) Transkripsie-aktivering wat deur verskeie stimuli geïnduseer word, aktiveer TOP2B om DNS-torsie in die promotor en geenliggaam op te los. (Onderste diagram) In hierdie proses kan breuke met dubbele stringe gevorm word uit aborsiewe katalise van TOP2B, wat gereeld in sommige gene voorkom. Dit kan verantwoordelik wees vir DNA-skade-reaksie-sein wat in 'n aantal stimulus-induseerbare gene by mense waargeneem is.

Terug na bo

12.3 Sellulêre stres en DNA-skadereaksie

Genetiese skade wat deur eksogene of endogene meganismes veroorsaak word, is 'n voortdurende bedreiging vir die sel. Om genoomintegriteit te behou, het eukariotiese selle herstelmeganismes ontwikkel wat spesifiek is vir verskillende tipes DNA -skade. Maar, ongeag die tipe skade, 'n gesofistikeerde toesigmeganisme, wat ontlok Kontrolepunte vir DNA -skade, bespeur en sein die teenwoordigheid daarvan aan die DNA-herstelmasjinerie. Kontrolepunte vir DNA -skade is funksioneel bewaar deur die eukariotiese evolusie, met die meeste van die relevante spelers in die kontrolepunt-reaksie hoogs bewaar van gis tot mense. Kontrolepunte word veroorsaak om die vordering van die siklus te vertraag en om selle tyd te gee om beskadigde DNA te herstel voor DNA -replikasie (Figuur 12.12). Sodra die beskadigde DNA herstel is, veroorsaak die kontrolepuntmasjinerie seine wat die vordering van die siklus sal hervat. Binne selle dra veelvuldige paaie by tot DNA-herstel, maar onafhanklik van die spesifieke herstelroete wat betrokke is, word drie fases van kontrolepuntaktivering tradisioneel geïdentifiseer: (1) Bespeuring van skade, (2) Aktivering van die seinkaskade en (3) Skakel stroomaf aan effektore. Die sensorfase herken die skade en aktiveer die seintransduksiefase om die siklusprogressie te blokkeer en die geskikte herstelweg te kies.

By meersellige organismes kan die reaksie op DNA-skade twee groot fisiologiese gevolge tot gevolg hê: (1) Selle kan sel siklus ondergaan, die skade herstel en weer in die selsiklus kom, of (2) selle kan gerig word op seldood ( apoptose) en uit die bevolking verwyder. Die sel siklus proses is hoogs bewaar en presies beheer om die genoom duplisering en skeiding in die dogterselle te beheer. Die selsiklus bestaan ​​uit vier afsonderlike en geordende fases, genoem G0/G1 (gaping 1), S (DNA-sintese), G2 (gaping 2) en M (mitose). Veelvuldige kontrolepunte bestaan ​​binne elke stadium van die selsiklus om die getroue replikasie van DNA in die S-fase en die presiese skeiding van die chromosome in dogterselle te verseker. Die G1- en G2 -fases is kritieke regulatoriese kontrolepunte, waardeur die beperkingspunt tussen die G1- en S -fase bepaal of die selle die S -fase betree of die selsiklus verlaat om by die G0 -fase te stop. Die progressie van die siklus vereis die aktiwiteit siklin-afhanklike kinases (CDK's), 'n groep serien/treonien kinases. CDK's word geaktiveer wanneer hulle komplekse vorm met siklien regulerende proteïene wat spesifiek uitgedruk word in verskillende stadia van die selsiklus. Sikliene bind aan en stabiliseer CDK's in hul aktiewe konformasie. Die vorming van siklien/CDK's beheer die vordering van die siklus via fosforylering van die teikengene, soos tumoronderdrukker proteïen retinoblastoom (Rb).

Tydens DNA-skade word die selsiklus gestaak of geblokkeer deur die werking van siklienafhanklike kinase-remmers. Soos aangedui in Figuur 12.12, is dit 'n ingewikkelde seintransduksie-kaskade wat 'n aantal stroomaf-effekte het. 'N Primêre funksie van die ophou van die siklus is dat CDK-remming tyd bied vir DNA-herstel voordat die siklus na S-fase of mitose kan vorder. Soos getoon in Figuur 12.12, reageer twee hoofsel-siklus kontrolepunte op DNA-skade, hulle vind voor- en post-DNS-sintese in onderskeidelik die G1- en G2-fases plaas en beïnvloed die aktiwiteit van spesifieke CDK-komplekse. Die kontrolepunt kinases fosfatidielinositol 3-kinase (PI3K)-agtige proteïen kinases (PI3KKs) ataxia telangiectasia en Rad3-verwante (ATR) of ataxia telangiectasia gemuteerde (ATM) proteïen, en die transducer kontrolepunt kinases CHK1 (gekodeer deur die CHEK21 geen) (gekodeer deur die CHEK2-geen) is sleutelreguleerders van DNA-skadesein. Die sein van DNA -skade word opgespoor deur OTM/ATR, wat dan CHF2/CHK1 onderskeidelik fosforyleer en aktiveer. Die geaktiveerde CHK2 is betrokke by die aktivering van p53, wat lei tot p53-afhanklike vroeë fase G1 arrestasie om tyd toe te laat vir DNA herstel. Die aktivering van p53 induseer die uitdrukking van die siklien-afhanklike kinase-inhibeerder (CKI) p21 CIP1 geen, wat lei tot inhibisie van siklien E/CDK2 komplekse en daaropvolgende opregulering van DNA herstel masjinerie.

As die DNA-herstel nie suksesvol voltooi kan word nie, of as die selle nie kan reageer op die spanning van lewensvatbare sel-siklusstilstand nie, staan ​​die selle in die gesig staar die lot van apoptose veroorsaak deur p53. Die geaktiveerde CHK1 bemiddel tydelike S -fase -arrestasie deur fosforylering om CDC25A te deaktiveer, wat ubiquitinasie en proteolise veroorsaak. Boonop fosforyleer en deaktiveer die geaktiveerde CHK1 CDC25C, wat lei tot sel-siklusstilstand in die G2-fase. Die aktiewe CHK1 stimuleer ook direk die fosforylering van WEE1, wat die inhiberende Tyr15-fosforylering van CDK2 en CDK1 verhoog en die daaropvolgende sel-siklusblokkering in die G2-fase. Die aktiwiteit van WEE1 kan ook gestimuleer word deur die lae vlakke van CDK-aktiwiteit in G2-selsiklusfase. Die SAC, ook bekend as die mitotiese kontrolepunt, funksioneer as die monitor van die korrekte aanhegting van die chromosome aan die mitotiese spil in metafase, wat gereguleer word deur die TTK-proteïenkinase (TTK, ook bekend as monopolêre spil 1 (MPS1)). Die aktivering van SAC veroorsaak tydelik die stop van die siklus deur die inhibering van die aktivering van APC/C. Om die mitotiese kontrolepunt te vestig en in stand te hou, werf die TTK baie kontroleproteïene na kinetochore tydens mitose deur die substraat te fosforyleer om voldoende chromosoomsegregasie en genomiese integriteit te verseker. Op hierdie manier word die genomiese onstabiliteit van chromosoomsegregasiedefekte deur SAC beskerm. Sodra die SAC geslaag is, stimuleer en merk die APC/C E3-ligasekompleks siklien B en sekurien vir ubiquitien-gemedieerde afbraak, wat lei tot die aanvang van mitose. Kortliks, die kontrolepunte bied 'n mislukte meganisme om die genomiese integriteit van die ouerlike sel na die dogtersel te verseker. Die seintransduksie-kaskade van kontrolepuntaktivering kom uiteindelik oor in CDK-remming, wat die CDK-funksie aandui as 'n belangrike dryfveer vir die vordering van die siklus.

Figuur 12.12 Sellots na DNA-skade. Selsikluskontrolepunte word veroorsaak deur DNA-skade, wat in rooi getoon word. Siklin-afhanklike kinase-remmers (CIP/KIP), in pers vertoon, blokkeer die siklusprogressie in alle fases van die selsiklus (G1, S, G2 of M) na DNA-skade deur siklienafhanklike kinase-komplekse te inhibeer (in groen getoon ). Seinkaskades wat geaktiveer word as gevolg van DNA -skade, veroorsaak ook DNA -herstelpaaie, of as die DNS -skade ernstig is, word geprogrammeerde seldood (Apoptose) geaktiveer.

Terug na bo

Benewens die blokkering van selsiklus-vordering, aktiveer DNA-skadesensors ook DNA-herstelmeganismes wat spesifiek is vir die tipe skade wat teenwoordig is. Byvoorbeeld, enkelstrengs DNA -breuke word hoofsaaklik herstel deur Base Excision Repair, lywige DNA -addukte en kruisbindings word herstel deur Nucleotide Excision Repair, en kleiner nukleotiedmutasies, soos alkylering, word herstel deur Mismatch Repair. Selle het ook twee hoofmeganismes vir die herstel van Double-Strand-Breaks (DSB's). Dit sluit nie-homoloë eindverbinding (NHEJ) en homoloë rekombinasie (HR) in. As skade te groot is om herstel te word, word apoptotiese paaie ontlok. In die volgende afdelings sal besonderhede oor die belangrikste DNA-herstelroetes gegee word.

12.4 Ongepaste herstel

DNA -mismatch -herstel (MMR) is 'n hoogs bewaarde DNA -herstelstelsel (Tabel 12.2) wat grootliks bydra tot die handhawing van genoomstabiliteit deur die regstelling van basiese pare wat nie ooreenstem nie en klein modifikasies van DNA -basisse, soos alkilering. Die belangrikste bron van basiese pare wat nie ooreenstem nie, is replikasiefoute, hoewel dit ook kan voortspruit uit ander biologiese prosesse. Die MMR -masjinerie moet dus 'n meganisme hê om te bepaal watter deel van die DNA die sjabloonstreng is en watter string nuut gesintetiseer is. In E coli, metilering van die DNA is 'n algemene post-replikatiewe verandering wat plaasvind. In nuut gesintetiseerde DNA word die ongemetileerde string dus herken as die nuwe string en die gemetileerde string word gebruik as die sjabloon om wanpassings te herstel. In E coli, MMR verhoog die akkuraatheid van DNA-replikasie met 20 en 400 keer meer. Mutasies en epigenetiese stilte in MMR -gene is betrokke by tot 90% van die menslike oorerflike nie -polipose -kanker van die mens, wat dui op die belangrikheid van hierdie herstelstelsel vir die handhawing van genomiese stabiliteit. Post-replikatiewe MMR word uitgevoer deur die MMR-meganisme met 'n lang pleister waarby verskeie proteïene betrokke is en 'n relatief lang deel van die oligonukleotied tydens die herstelreaksie uitgesny word. In teenstelling hiermee word spesifieke soorte basiese pare wat nie ooreenstem nie, herstel deur MMR met 'n baie kort pleister waarin 'n kort oligonukleotiedkanaal uitgesny word om die letsel te verwyder.

Tabel 12.2 Mispasherstel-ensieme in bakterieë, gis en mense

Tans is twee tipes MMR-meganismes toegelig: een sal na verwagting deur eukariote en die meeste bakterieë gebruik word, en die ander is spesifiek vir E coli en naverwante bakterieë. Soos getoon in Figure 12.13(a) en 12.13(b), rig MMR in eukariote en meeste bakterieë die herstel na die foutbevattende string van die nie-ooreenstemmende dupleks deur die stringdiskontinuïteite te herken. Aan die ander kant, soos getoon in Figuur 12.13 (c), E coli MMR lees die afwesigheid van metilering as 'n string diskriminasie sein. In beide MMR-stelsels word streng-diskriminasie uitgevoer deur endonukleases te sny. MutL -homoloë van eukariote en die meeste bakterieë sny die diskontinue string om die ingangs- of eindpunt vir die uitsnyingsreaksie bekend te stel. In E coli, MutH knik die ongemetileerde string van die dupleks om die ingangspunt van uitsny te genereer. Na die uitsny van die beskadigde of nie -ooreenstemmende string, sny helikases (soos UvrD) en eksonukleas (soos ExoI) 'n kort gebied nukleotiede uit die beskadigde deel. DNA pol III of DNA pol & delta vul die gaping in en DNA ligase herstel die ruggraat.

Figuur 12.13 'n Skematiese voorstelling van MMR-roetemodelle. (a) Eukariotiese MMR. 'N DNS -wanaanpassing word veroorsaak deur die verkeerde inkorporering van 'n basis tydens DNA -replikasie. MutS & alpha erken wanbepalings tussen basis en basis.MutL&alpha knip die 3'- of 5'-kant van die nie-ooreenstemmende basis op die diskontinue string. Die resulterende DNA-segment word gesny deur die EXO1-eksonuklease, in samewerking met die enkelstrengs DNA-bindende proteïen RPA. Die DNA -string word hersintetiseer deur DNA -polimerase en delta en DNA -ligase. (b) MMR in mutH-sonder bakterieë. Onvergelykbare basisse word erken deur MutS. Na die insnyding van diskontinue string deur MutL, word die foutbevattende DNS-string verwyder deur die samewerkende funksies van DNS-helikases, soos UvrD, die eksonukleases RecJ en ExoI, en die enkelstring DNS-bindende proteïen SSB. DNA -polimerase III en DNA -ligase vul die leemte om die herstel te voltooi. (c) E coli MMR. MutS herken nie-ooreenstemmende basisse, en MutL interaksie met en stabiliseer die kompleks. Dan word MutH -endonuklease geaktiveer om die ongemetileerde GATC -plek in te sny om 'n ingangspunt vir die uitsnyingsreaksie te skep. DNA-helikase, 'n enkelstrengige DNA-bindende proteïen, en verskeie eksonukleases is betrokke by die uitsnyreaksie.

Terug na bo

12.5 Herstel van basisbesnydenis

Die meeste geoksideerde basisse word uit DNA verwyder deur ensieme wat werk binne die Base Excision Repair (BER) -weg. Enkelstrengs DNA -breuke kan ook deur hierdie proses herstel word. Die verwydering van geoksideerde basisse in DNA is redelik vinnig. Byvoorbeeld, 8-oxo-dG is 10-voudig verhoog in die lewers van muise wat aan ioniserende straling blootgestel is, maar die oortollige 8-oxo-dG is verwyder met 'n halfleeftyd van 11 minute. 8-oxoG word uitgesny deur 8-oxoguanine DNA-glikosilase (OGG1) wat 'n apuriniese plek (AP-plek) verlaat (Figuur 12.14). AP-terreine word dan verder verwerk in enkelstreng-breuke via ruggraat-insnyding van AP-endonuklease 1 (APE1). In die herstel van lang pleisterbasis -uitsny word die basis en 'n paar bykomende nukleotiede vervang, afhangend van die aktiwiteit van polimerase delta (Pol & delta) en epsilon (Pol & epsilon), tesame met prolifererende selkernantigeen (PCNA). Die ou draad word deur Flap-endonuklease 1 (FEN1) verwyder, voordat ligase I (LigI) die ruggraat weer saambring. Herstel van kort pleisterbasis-uitsny bestaan ​​uit polimerase beta (Pol & beta) wat die enkele ontbrekende basis vervang, ligase III (LigIII) wat die DNA-ruggraat weer aan mekaar verbind, en X-straal herstel kruis-komplementerende proteïen 1 (XRCC1) wat die proses help en dien steier vir bykomende faktore.

Figuur 12.14 Base Excision Repair. Basis-eksisie herstel (BER) van 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG). Oksidatiewe DNA -skade word deur verskeie herstel -tussenprodukte herstel deur middel van basiese uitsny -herstel (BER). Deur die verwydering van die geoksideerde basis word 'n reaktiewe apuriniese plek (AP -plek) gevorm. Insnyding van die draad skep 'n enkele draadbreuk, en die beskadigde plek word dan herstel deur óf kort óf lang pleister BER

12.6 Nukleotied-uitsny herstel

Omvangryke DNA -addukte en DNA -kruisbindings, soos dié wat deur UV -lig veroorsaak word, word herstel met behulp van Nucleotide Excision Repair (NER) -paaie. In hoër eukariotiese selle sny NER 24-32 nukleotied-DNA-fragmente wat die beskadigde letsel bevat, uiters akkuraat. Herstellende sintese met behulp van die onbeskadigde string as 'n sjabloon, gevolg deur die ligasie van die enkelstrengbreuk wat as gevolg van die skade ontstaan ​​het, is die laaste fase van DNA -herstel. Die proses behels die gekoördineerde werking van ongeveer 30 proteïene wat agtereenvolgens komplekse met veranderlike samestellings op die DNA vorm. NER bestaan ​​uit twee paaie wat onderskei word in terme van aanvanklike skadeherkenning. Globale genoom nukleotied uitsny herstel (GG-NER) ontdek en elimineer lywige skade in die hele genoom, insluitend die ongetranskribeerde streke en stille chromatien, terwyl transkripsie -gekoppelde nukleotied uitsny herstel (TC -NER) werk wanneer skade aan 'n getranskribeerde DNA -string transkripsie -aktiwiteit beperk. TC-NER word geaktiveer deur die stop van RNA-polimerase II op die beskadigde plekke van 'n getranskribeerde string, terwyl GG-NER beheer word deur die proteïen, XPC, 'n gespesialiseerde proteïenfaktor wat die skade openbaar. 'N Skematiese GG-NER-proses word in Figuur 12.15 aangebied.

Figuur 12.15 Skema van Globale Genoom Nucleotide Excision Repair.

Genetiese mutasies in NER-weggene kan UV-sensitiewe en hoë-karsinogene patologieë tot gevolg hê, soos xeroderma pigmentosum (XP), die Cockayne-sindroom (CS) en trichothiodystrophy (TTD), sowel as sommige neurodegeneratiewe manifestasies.

Xeroderma pigmentosum het die name van sommige van die gene wat by NER betrokke is, verstrek. Mutasie van XP-gene en verlies van behoorlike NER-funksie veroorsaak die simptome wat met die siekte geassosieer word. Mense met XP het 'n verswakte vermoë om lywige DNA-addukte en kruisbindings te herstel, soos timiendimere wat deur blootstelling aan UV-lig veroorsaak word. Mense wat aan XP ly, het uiterste fotosensitiwiteit, velatrofie, hiperpigmentasie en 'n hoë velkanker wat deur sonlig veroorsaak word (Figuur 12.16). Die risiko van inwendige gewasse by XP-pasiënte is ook 1000 keer hoër. Boonop word die siekte dikwels geassosieer met neurologiese afwykings. Tans is daar geen effektiewe behandeling vir hierdie siekte nie.

Figuur 12.16 'N Agtjarige meisie uit Guatemala met Xeroderma Pigmentosum. Voorbeeld van die gesig, met groot hiperkeratotiese letsels, met 'n mate van verhitting wat vermoed word van aktiniese keratose en vroeë plaveiselkarsinoom. Ook talle hiperpigmenteerde lentigos en xerose op die hele voorkant van die gesig. Merkbare korneale littekens en inspuiting is duidelik.

Die opsporing van lywige DNA-letsels tydens NER is veral uitdagend vir 'n sel, wat slegs opgelos kan word deur hoogs sensitiewe herkenning wat veelvuldige proteïenkomponente benodig. In teenstelling met BER, waar 'n beskadigde basis gelyktydig herken en uitgeskakel word deur 'n enkele gespesialiseerde glikosilase, is gespesialiseerde groepe proteïene verantwoordelik vir die herkenning van die letsel en die uitsny van die letsel in NER. In eukariotiese NER voer universele sensorproteïene die aanvanklike herkenning van die totale reeks lywige skades uit. In die geval van TC-NER kom dit voor wanneer die transkriberende RNA-polimerase II gestop word deur skade in GG-NER, dit is komplekse van die XPC-faktor en DDB1-DDB2-heterodimeer (XPE-faktor) wat die herstel van UV-skade verbeter (Fig 12.15 ). Oor die algemeen is NER -herkenning van skade 'n proses met meerdere stappe wat verskeie proteïene behels wat naby beskadigde komplekse van veranderlike samestellings vorm. Die proses word voltooi deur die vorming van 'n pre -insinkingskompleks wat gereed is om 'n beskadigde DNA -fragment uit te skakel deur gespesialiseerde NER -endonukleas.

In 'n eukariotiese sel na stabiele XPC/DNA -kompleksvorming tydens die aanvanklike herkenning van die skade, word NER eintlik uitgevoer deur 'n herstelsaam, 'n kompleks van veranderlike samestelling en argitektuur wat bestaan ​​uit 'n groot aantal subeenhede. Individuele subeenhede van die kompleks het nie voldoende affiniteit en selektiwiteit vir die substraat nie (DNA bevat lywige skade). Die situasie verander wanneer spesifieke proteïenkomplekse by die skadeplek gevestig word. Die NER -proteïene van hierdie komplekse word verbind deur die DNA -verwerking. 'N Totaal van 18 polipeptiede moet akkuraat binne twee of drie DNA -draaie geplaas word wanneer 'n stabiele struktuur wat gereed is vir verwydering van skade gevorm word en uitsny begin. Die struktuur van NER-geassosieerde proteïene bied die moontlikheid van kontak met die DNA-substraat en van dinamiese spesifieke proteïen-proteïen interaksies. Die veranderinge in interaksies wat deur dieselfde proteïen uitgevoer word, is een van die meganismes wat die herstelproses reguleer en die komplekse verfyn, wat 'n hoë presisie van nukleotied-uitsny herstel bied.

Terug na bo

12.7 Herstel van dubbelstrengs-DNA-breuke

Selle het twee hoofweë ontwikkel om dubbeldraad-breuke binne die DNA te herstel: die nie-homoloë eindverbindingsweg (NHEJ), wat direkte herseël van DNA-punte verseker en die homoloë rekombinasie (HR) padwat staatmaak op die teenwoordigheid van homoloë DNA -rye vir DSB -herstel (Figuur 2.16)

NHEJ-herstel is die eenvoudigste en mees gebruikte meganisme om DSB wat in DNA voorkom, te herstel. Herstel deur NHEJ behels dat die twee stukkende punte direk her verseël word, onafhanklik van volgordehomologie. Alhoewel dit aktief is regdeur die selsiklus, is NHEJ relatief belangriker tydens G1-fase. Proteïene wat benodig word vir NHEJ sluit in, maar is nie beperk nie tot, die hoogs bewaarde heterodimere Ku70/Ku80-kompleks, DNA-afhanklike proteïenkinase katalitiese subeenheid (DNA-PKcs) en DNA Ligase IV (LIG4) in kompleks met XRCC4. Deur DNS-punte direk te bind, verseker Ku70/Ku80 beskerming teen eksonukleases en tree as sodanig op as 'n inhibeerder van HR. Homologieë met 'n baie kort volgorde help DNA waarskynlik om die belyning te beëindig voor NHEJ-afhanklike herstel, maar dit is nie streng nodig nie. NHEJ beskerm genetiese integriteit deur weer by gebreekte DNA -stringe aan te sluit wat andersins verlore kan gaan tydens DNA -replikasie en selregenerasie. Tydens die proses van NHEJ kan invoegings of skrappings binne die saamgevoegde streke egter voorkom (Fig 2.16).

Figuur 2.16 Hoofpaaie van DNA-dubbelstring-breukherstel. Nie-homoloë eindverbinding (NHEJ) en homoloë rekombinasie (HR) roetes tree mededingend op om DNA-dubbelstring-breuke (DSBs) te herstel. Sleutelspelers van NHEJ en HR word uitgebeeld. Die MRE11/RAD50/XRS2 (MRX) -kompleks word baie vroeg aan DNA -entiteite gewerf en blykbaar 'n belangrike rol te speel vir beide NHEJ en HR. Ku70/Ku80 heterodimeer word benodig vir NHEJ en, deur inhibisie van DNA-eindreseksie (5&prime&ndash3&prime exo), tree op as 'n onderdrukker van HR. Betroubaarheid van NHEJ-afhanklike DSB-herstel is laag en hou meestal verband met die verwydering van nukleotiede en/of invoegings by herstelknooppunte. Die algemene vroeë stap van HR-afhanklike meganismes is die vorming van ssDNA wat dan deur replikasieproteïen A (RPA) bedek word. Enkelstreng-gloeimeganisme (SSA) vereis die teenwoordigheid van direkte herhalings (in oranje getoon) aan beide kante van die breuk. SSA impliseer geen string-indringingsproses nie en is dus nie afhanklik van RAD51-proteïen nie. Strand indringing en D-lus vorming is egter algemene stappe van sintese-afhanklike string uitgloeiing (SDSA) en dubbel Holliday aansluiting (HJ) ontbinding meganismes. In laasgenoemde geval word dubbele Holliday-aansluitings opgelos met of sonder kruising.

In teenstelling met NHEJ, vereis homoloë rekombinasie (HR) 'n homoloë DNS-volgorde om te dien as 'n sjabloon vir DNS-sintese-afhanklike herstel en behels uitgebreide DNS-eindverwerking. Soos verwag, is HR uiters akkuraat, aangesien dit lei tot presiese herstel van die beskadigde lokus met behulp van DNA -rye wat homoloë is met die gebreekte ente. HR gebruik hoofsaaklik die susterchromatied as 'n sjabloon vir DSB -herstel, eerder as die homoloë chromosoom. Dienooreenkomstig word HR grootliks geïnhibeer terwyl selle in die G1-fase van die selsiklus is, wanneer die susterchromatied nog nie gerepliseer is nie (Fig 2.17A). HR-meganismes speel 'n groter rol in DSB-herstel wat plaasvind na S-fase DNA-replikasie (S-fase, G2 en M).

Herstel deur HR word nie deur 'n unieke meganisme gedefinieer nie, maar werk deur verskeie meganisties onderskeibare DSB-herstelprosesse, insluitend sintese-afhanklike stringgloeiing (SDSA), dubbele Holliday-aansluitingsresolusie en enkelstrenggloeiing (SSA). Die algemene stap vir HR-afhanklike DSB-herstelmeganismes is die aanvanklike vorming van enkelstring-DNA (ssDNA) vir paring met homoloë DNA-sjabloonvolgordes. Om dit te kan gebeur, word die 5' -DNA -string by die DSB deur verskeie nukleas en bykomstige proteïene verwerk om 'n 3 -ssDNA -afdeling te skep wat as 'n sjabloon vir rekombinasie gebruik kan word (Fig. 2.16).

Figuur 2.17B bied 'n meer gedetailleerde blik op die HR -proses. Tydens die hoogs gereguleerde HR -proses kan drie hooffases onderskei word. Eerstens word 3 en prima-enkelstrengs DNA (ssDNA) eindes gegenereer deur nukleolitiese afbraak van die 5 & prim-stringe. Hierdie eerste stap word gekataliseer deur endonukleas, insluitend die MRN -kompleks (bestaande uit Mre11, Rad50 en Nbs1). In 'n tweede stap word die ssDNA-punte bedek deur replikasieproteïen A (RPA) filamente. In 'n derde stap word RPA vervang deur Rad51 in 'n BRCA1- en BRCA2-afhanklike proses om uiteindelik die rekombinase-reaksie uit te voer met 'n homoloë DNA-sjabloon.

Belangrik is dat HR nie net gebruik word om DNA -letsels wat deur DNA -beskadigende middels veroorsaak word, te herstel nie, maar is ook noodsaaklik vir behoorlike chromosoomsegregasie tydens meiose. Die relevansie van HR in hierdie fisiologiese prosesse word geïllustreer deur die streng vereiste tydens ontwikkeling. Muise wat nie belangrike HR -gene het nie, soos Brca1, Brca2, of Rad51, vertoon uitgebreide genetiese veranderings wat lei tot vroeë embrionale dodelikheid. Terwyl homosigotiese inaktivering van HR -gene gewoonlik embrionale dodelike, heterosigotiese inaktivering is, byvoorbeeld, BRCA1 en BRCA2, belemmer nie die lewensvatbaarheid van die selle nie, maar stel individue eerder bloot aan kanker, insluitend borskanker en eierstokkanker. Die gewasse wat ontwikkel by persone met heterosigoties BRCA1/2 mutasies verloor altyd hul tweede BRCA1/2 alleel, wat aandui dat in sekere kankers die afwesigheid van BRCA1/2 versoenbaar is met sellulêre proliferasie. Hoe sulke gewasse presies hul HR -defek hanteer, word tans nie ten volle verstaan ​​nie.

Figuur 2.17 Herstel van DNA -dubbelstrengbreuk (DSB's). (A) DNA DSB's herstel roetes in die konteks van sel siklus regulering. Nie-homologe eindverbinding (NHEJ) kan regdeur die selsiklus uitgevoer word en word met die rooi lyn aangedui. Homoloë rekombinasie (HR) kan slegs in S/G2 fases van die selsiklus aangewend word en word in groen aangedui. (B) Die belangrikste stappe in HR -herstelweg word aangedui. Na DSB -erkenning word 5 & prime & ndash3 & prime end reseksie begin deur die MRN (Mre11, Rad50, Nbs1) kompleks en CtIP. Vervolgens word verdere reseksie deur die Exo1-, DNA2- en Sgs1 -proteïene uitgevoer om te verseker dat die reseksie behoue ​​bly. Dan word die resekteerde DNA-ente gebind deur replikasieproteïen A (RPA). Die werklike rekombinasiestap binne HR-herstel, genaamd string-uitruiling, word uitgevoer deur die rekombinase Rad51. Rad51 vervang RPA om uiteindelik heliese nukleoproteïenfilamente genaamd & lsquo te monteerpresinaptiese filamente.& rsquo Hierdie proses word vergemaklik deur ander HR -komponente, insluitend BRCA1 en BRCA2. Die laaste stap van die aansluitresolusie word uitgevoer deur helikases, insluitend Bloom-sindroom, RecQ-helikase-agtige (BLM) helikase.

Terug na bo

12.8 Fout-geneigde omleiding en translesiesintese

As DNS nie voor DNS-replikasie herstel word nie, moet die sel 'n ander strategie gebruik om die DNS te repliseer, selfs in die teenwoordigheid van 'n DNS-letsel. Dit is belangrik om te voorkom dat dubbelstrengs DNA breek wat kan voorkom wanneer 'n herhaling by die replikasie vurk vasstaan. Onder hierdie omstandighede is 'n ander strategie wat selle gebruik om op DNA -skade te reageer, letsels wat tydens DNA -replikasie gevind is, omseil en voort te gaan met die replikatiewe proses. Omseiling van DNA -skade kan plaasvind deur rekombinasie -meganismes of deur 'n nuwe meganisme wat genoem word translesiesintese. Translesiesintesegebruik 'n alternatiewe DNS-polimerase wat 'n DNS-polimerase kan vervang wat by die replikasievurk vasgeval het as gevolg van DNS-skade. Gespesialiseerde DNA -polimerases, wat aktief is in gebiede met DNA -skade, het aktiewe plekke wat fluktuasies in DNA -topografie kan akkommodeer, wat hulle in staat stel om die letsels te omseil en voort te gaan met die replikatiewe proses.

Die evolusie van DNA-polimerases wat die teenwoordigheid van verwronge DNA-letsels kan verdra en kan voortgaan met die replikatiewe proses, kan op alle lewensvlakke gesien word, van prokariotiese, eensellige organismes tot en met eukariotiese meersellige organismes, insluitend mense. Trouens, binne gewerwelde diere was daar 'n groot uitbreiding van DNS-polimerases wat 'n rol speel in DNS-skade-omleidingsmeganismes en beklemtoon die belangrikheid van hierdie prosesse in skadeverdraagsaamheid en seloorlewing (Tabel 12.3).

Tabel 12.3 DNA-polimerases betrokke by fout-geneigde omleiding

Die aktiwiteit van foutgevoelige DNA -polimerases word streng gereguleer om die wydverspreide invoering van mutasies binne die DNA -volgorde te vermy. Een van die belangrikste meganismes wat gebruik word in 'n replisoom wat by die replikasievurk vasstaan ​​as gevolg van DNA -skade, behels die monoubikitinasie van PCNA. Onthou uit hoofstuk 9 dat PCNA die skuifklem is waarmee die DNA -polimerase tydens replikasie styf genoeg met die DNA kan bind om doeltreffende DNA -sintese te bemiddel. Monoubikitinasie van PCNA maak dit moontlik om DNA -polimerases van translesie te werf en die beskadigde letsels te omseil tydens DNA -sintese.

Tydens translesiesintese moet die polimerase 'n dNTP teenoorgestelde van die letsel insit. Dit is waarskynlik dat geen van die dNTP -basisse stabiele waterstofbinding -interaksies met die beskadigde letsel sal kan vorm nie. Dus word die nukleotied wat die minste vervorming of afstoting veroorsaak, gewoonlik teenoor die letsel bygevoeg. Dit kan veroorsaak dat oorgangs- of transversiemutasies by die letselplek plaasvind. Alternatiewelik kan translesiepolymerases geneig wees tot gly, en dit kan óf 'n invoegings- of skrapingsmutasie in die omgewing van die DNA -letsel veroorsaak. Hierdie gly kan lei tot raamverskuiwing mutasies as hulle voorkom binne geen kodering streke. Oor 'n leeftyd kan translesiesintese in meersellige organismes dus lei tot 'n ophoping van mutasies binne somatiese selle en die vorming van gewasse en die siekte van kanker veroorsaak.

Evolusie deur natuurlike seleksie is ook moontlik as gevolg van lukrake mutasies wat binne kiemselle voorkom. Soms kan kiemlynmutasies lei tot 'n voordelige mutasie wat die oorlewing van 'n individu binne 'n populasie verbeter. As hierdie geen die oorlewing van die populasie verbeter, sal dit mettertyd in die populasie gekies word en die evolusie van die spesie veroorsaak. 'N Voorbeeld van 'n voordelige mutasie is die geval van 'n bevolking van mense wat weerstand teen MIV -infeksie toon. Sedert die eerste geval van infeksie met die menslike immuungebrekvirus (MIV) in 1981 aangemeld is, is bykans 40 miljoen mense dood aan MIV -infeksie, die virus wat verworwe immuungebreksindroom (VIGS) veroorsaak. Die virus teiken helper T-selle wat 'n sleutelrol speel in die oorbrugging van die aangebore en aanpasbare immuunrespons, besmetting en dood van selle wat normaalweg betrokke is by die liggaam se reaksie op infeksie. Daar is geen geneesmiddel vir MIV -infeksie nie, maar baie middels is ontwikkel om die vordering van die virus te vertraag of te blokkeer. Alhoewel individue regoor die wêreld besmet is, is die grootste voorkoms onder mense van 15 en 49 jaar oud in Afrika suid van die Sahara, waar byna een uit elke 20 mense besmet is, wat meer as 70% van die infeksies wêreldwyd uitmaak (figuur 2.18). Ongelukkig is dit ook 'n deel van die wêreld waar voorkomingstrategieë en middels om die infeksie te behandel die meeste ontbreek.

Figuur 2.18 MIV kom baie voor in Afrika suid van die Sahara, maar die voorkoms daarvan is redelik laag in ander dele van die wêreld.

In onlangse jare is wetenskaplike belangstelling geprikkel deur die ontdekking van 'n paar individue uit Noord-Europa wat weerstand teen MIV-infeksie is. In 1998 publiseer die Amerikaanse genetikus Stephen J. O & rsquoBrien by die National Institutes of Health (NIH) en kollegas die resultate van hul genetiese analise van meer as 4000 individue.Dit het aangedui dat baie individue van Eurasiese afkoms (tot 14% in sommige etniese groepe) 'n skrapingsmutasie het, CCR5-delta 32 genoem, in die geen wat CCR5 kodeer. CCR5 is 'n koreseptor wat op die oppervlak van T-selle gevind word wat nodig is vir baie stamme van die virus om die gasheersel binne te dring. Die mutasie lei tot die vervaardiging van 'n reseptor waaraan MIV nie effektief kan bind nie en blokkeer virale toetrede. Mense wat homosigoties is vir hierdie mutasie, het die vatbaarheid vir MIV -infeksie aansienlik verminder, en diegene wat heterosigoties is, het ook beskerming teen infeksie.

Dit is nie duidelik hoekom mense van Noord-Europese afkoms spesifiek hierdie mutasie dra nie, maar die voorkoms daarvan blyk die hoogste te wees in Noord-Europa en neem geleidelik af in bevolkings soos 'n mens suid beweeg. Navorsing dui daarop dat die mutasie teenwoordig was sedert voor die verskyning van MIV en moontlik in Europese bevolkings geselekteer is as gevolg van blootstelling aan die plaag of pokke. Hierdie mutasie kan individue beskerm teen plaag (veroorsaak deur die bakterie Yersinia pestis) en pokke (veroorsaak deur die variola -virus) omdat hierdie reseptor ook by hierdie siektes betrokke kan wees. Die ouderdom van hierdie mutasie is 'n kwessie van debat, maar skattings dui daarop dat dit tussen 1875 en 225 jaar gelede verskyn het en moontlik deur Noord -Europa versprei is deur invalle van Viking.

Hierdie opwindende bevinding het gelei tot nuwe moontlikhede in MIV -navorsing, insluitend op soek na medisyne om CCR5 -binding aan MIV te blokkeer by individue wat nie die mutasie het nie. Alhoewel DNA-toetsing om te bepaal watter individue die CCR5-delta 32-mutasie dra, moontlik is, is daar gevalle waar individue homosigoties is vir die mutasie wat MIV opdoen. Om hierdie rede word DNS -toetsing vir die mutasie nie wyd aanbeveel deur amptenare van openbare gesondheid om nie riskante gedrag aan te moedig by diegene wat die mutasie dra nie. Die remming van die binding van MIV aan CCR5 is egter steeds 'n geldige strategie vir die ontwikkeling van geneesmiddelterapieë vir diegene wat met MIV besmet is.


Kyk die video: DNA repair 1. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (September 2022).