Inligting

FPLC-gebaseerde skeiding van serumproteïene

FPLC-gebaseerde skeiding van serumproteïene



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek werk aan 'n projek wat bio-merker-ontdekking in neuro-ontwikkelingsafwykings behels. Ek het 'n akta-prime FPLC-instrument in my laboratorium, maar ek weet nie hoe ek dit moet gebruik nie.

Volgens teorie bevat plasma, of serum, normaalweg talle proteïene met hoë molekulêre gewig - wat die konsentrasie van klein-molekulêre gewig proteïene wat vir my studie relevant kan wees, kan masker.

Ek soek die abnormale uitdrukking, indien enige, van sulke proteïenmolekules.
Maar ek is bekommerd dat as ek die serummonster direk laat loop, ek te veel bande sal kry om my in staat te stel om my gewenste molekule te identifiseer.

Watter kolom moet gebruik word om sulke maskeringsproteïene van serum te skei - of, alternatiewelik, watter vorige skeidings moet gedoen word?

Watter reagenskonsentrasies moet ek ook gebruik (veral re: bindingsbuffer en elueringsbuffer)?


Eerstens, mag ek voorstel 2D elektroforese as 'n tegniek om verskille in proteïen/merker uitdrukkingsvlakke te identifiseer. Hierdie tegniek gee u 'n groter resolusie en makliker om u monster in basies een stap/eksperiment te vergelyk. Bygevoeg bonus sodra u u belangstellende proteïen bepaal het, kan u dit maklik uitsny en vir 'n massaspesifikasie -analise stuur om u proteïen te identifiseer. Kortom, 2D elektroforese skei proteïene op grond van hul pI (isoelektriese punt) in die 1ste dimensie en dan deur hul grootte in die 2de dimensie. Sodra jy die proteïen van belang geïdentifiseer het, kan jy dit suiwer deur die onderstaande stappe te gebruik.

Beeldbron

Gaan nou na die probleem om u proteïene te skei vir analise. Die algemene uiteensetting wat u kan volg om 'n proteïen te skei, is soos volg:

  1. Ion -ruilkolom
  2. Hidrofobiese interaksiekolom (HIC)
  3. Grootte-uitsluiting Chromatografie (SEK)

Ionruil eers omdat u die proteïen uit die kolom elueer met 'n toenemende konsentrasie sout (0 -> 1M NaCl). Terwyl jy 'n hoë konsentrasie sout benodig om die proteïen op HIC-kolom te laai. Dus, die eluaat van opstelling 1 kan maklik met 'n 5M (Nh4)2SO4 gespuit word en op HIC-kolom gelaai word (Geen dialise). Ion-uitruil en HIC is ook kolomme met 'n hoë kapasiteit waarvan die resolusie verbeter kan word met vlak soutgradiente. Daarom word my aanbeveling eers gebruik. As u egter seker is dat u merker/proteïen van belang klein is, kan u die SEC -kolom direk gebruik

Ionuitruilkolom, soos die naam aandui, skei proteïene op grond van hul lading (Minste ---> Meest ionies, let ook op lading +/- van die proteïen, aangesien die pH belangrik is). Die buffer om vir Ion -uitruil te gebruik, is:

1. Bindingsbuffer 10-50mM Fosfaatbuffer pH7.4 (plasma pH) 0-25mM NaCl 2. Elueringsbuffer 10-50mM Fosfaatbuffer pH7.4 1M NaCl

Gebruik so min as moontlik sout om die mees doeltreffende binding aan die kolom te kry. Eluering word uitgevoer met 'n gradiënt van NACL van 0% van elueringsbuffer tot 100% eluering oor ongeveer ~ 20 kolomvolumes.

HIC -kolom skei die proteïen op die hidrofobisiteit van die proteïen. Die volgorde van die eluering uit die kolom is die minste -> die meeste hidrofobies.

1. Bindingsbuffer 10-50mM Fosfaatbuffer 1M (Nh4)2SO4 2. Elueringsbuffer 10-50mM Fosfaatbuffer (Geen Sout)

U kan hier 'n goeie protokol vir HIC vind. Die eluering word ook meer as ~ 20 CV gedoen met 'n gradiënt van 0-100% elueringsbuffer, soortgelyk aan ionenuitruiling-eluering.

Ten slotte, grootte Uitsluiting of SEC skei proteïene op grond van hul groottes. Die elueringsorde is die grootste ---> kleinste grootte. Die kolom word in 'n isokratiese modus uitgevoer, dit wil sê slegs een buffer word gebruik. Buffer samestelling:

1. 50-100 mM Fosfaatbuffer 2. 150mM NaCL

Die sout in buffer is om nie-spesifieke interaksie van die proteïen met kolom te voorkom, wat tot gevolg kan hê dat proteïen later as wat nodig elueer word. Dit kan lei tot swak resolusie.

Die belangrikste ding om te besef is dat elkeen van die bogenoemde kolomme hul eie stelle kavette het. 1) Ionuitruilkolomme is spesifiek vir die lading van proteïene, dus u sal baie proteïene hê wat glad nie aan die kolom bind nie, gebaseer op die tipe (anioon/katioon) van die kolom wat gebruik word. 2) Net so kan HIC-kolom dalk ook nie goed aan jou proteïen bind nie. Die byvoeging van 1M (Nh4)2SO4 sal ook proteïene presipiteer wat jou proteïen van belang kan insluit. 3) SEC -kolomme het 'n boonste limiet vir proteïengrootte wat hulle kan aanvaar, waarbo al die proteïene saam elueer by die leemtevolume wat die resolusie verminder (dit behoort egter nie 'n probleem in u geval te wees nie, aangesien u die laer molekulêre gewig probeer skei) proteïene van die hoër gewigte.)

Ten slotte, al die bogenoemde stappe werk uitstekend, aangesien jy weet watter proteïen jy wil suiwer (skei). Aangesien dit nie die geval is nie, moet u SDS-gelelektroforese van die breuke by elke suiweringsfase van die kolom versamel en uitvoer. Doen ook 'n vergelyking langs mekaar van kontrole en monsterplasma om uit te vind watter proteïene anders uitgedruk word.

Ter afsluiting wil ek u daarop wys dat 2D -elektroforese u in elk geval 'n gel gee om te vergelyk, soos op die foto getoon. Dit kan dus 'n beter oplossing vir u probleem wees. Ek erken egter dat u moontlik suiwering moet instel om u bevindings te bevestig.

Hoop dit help, sterkte!


Die chemiese spesievorming van aluminium in menslike serum

Chemiese spesie van aluminium in die lae molekulêre massa (LMM) en hoë molekulêre massa (HMM) breuke van menslike serum word bespreek. 'N Kritiese oorsig van die literatuur oor verskillende analitiese prosedures wat beskryf word vir die spesiëring van aluminium in menslike serummonsters word hier aangebied. Die metodologieë, die eksperimentele en instrumentele vereistes en die vermoë van die gerapporteerde analitiese prosedures vir die identifisering van HMM- en LMM -aluminiumspesies in menslike serum word breedvoerig ondersoek. Nie-chromatografiese skeidings gekoppel aan elektrotermiese atoomabsorpsiespektrometrie vir aluminiumopsporing word vergelyk met chromatografiese tegnieke (grootte-uitsluitingschromatografie, anioonuitruilchromatografie en vinnige proteïenvloeistofchromatografie) gekoppel aan ETAAS of induktief gekoppelde plasmamassaspektrometrie (ICP-MS) opsporing vir Al- HMM spesie ondersoeke. Studies en tegnieke wat gerapporteer is vir Al-LMM-verbindings word ook saamgevat, beide vir gesonde vrywilligers en dialise pasiënte. Op grond van die kennis verkry uit die toepassing van die ontwikkelde analitiese prosedures op werklike serumanalise, is gedemonstreer dat die meeste van Al in menslike serum aan Al-transferrien gebind is, terwyl die LMM-Al fraksie (10–20% van totaal Al) bevat hoofsaaklik Al-sitraat, Al-fosfaat en ternêre Al-sitraat-fosfaat komplekse.


Definisies

Elektroforese is 'n metode om proteïene te skei op grond van hul fisiese eienskappe. Serum word op 'n spesifieke medium geplaas, en 'n lading word toegepas. Die netto lading (positief of negatief) en die grootte en vorm van die proteïen word algemeen gebruik om verskeie serumproteïene te onderskei.1

Verskeie subgroepe van serumproteïenelektroforese is beskikbaar. Die name van hierdie substelle is gebaseer op die metode wat gebruik word om die verskillende serumkomponente te skei en te onderskei. In sone-elektroforese word verskillende proteïensubtipes byvoorbeeld op aparte fisiese plekke op 'n jel wat van agar, sellulose of ander plantmateriaal gemaak is, geplaas.2 , 3 Die proteïene word gekleur, en hul digthede word elektronies bereken om grafiese data oor die absolute en relatiewe hoeveelhede van die verskillende proteïene. Verdere skeiding van proteïensubtipes word verkry deur kleuring met 'n immunologies aktiewe middel, wat immunofluoressensie en immunofiksering tot gevolg het.


Elektroforese: skeiding en analise

In die vorige laboratorium het ons die beweging van 'n deeltjie in 'n vloeibare medium bespreek, waar die sedimenterende krag die gravitasie-aantrekking was (op 'n vloeiende vloeistof), en die opponerende krag 'n wrywingskrag was wat eweredig is aan die snelheid van die deeltjie. Hierdie kragte werk in teenoorgestelde rigtings en balanseer mekaar uiteindelik, wat lei tot die eenvormige beweging van die deeltjie in die mobiele vloeibare medium (dws die deeltjie beweeg teen konstante snelheid). As die eksterne veld 'n elektriese veld in plaas van 'n gravitasieveld is, is daar 'n twee -maniere waarop 'n makromolekule op die eksterne veld kan reageer. As die molekule gelaai is, sal dit in 'n elektriese veld na die elektrode van teenoorgestelde lading migreer. Dit is die beginsel onderliggend aan die tegniek van elektroforese. As die makromolekule 'n asimmetriese ladingverspreiding het (dws 'n permanente dipoolmoment het), sal die molekule geneig wees om in 'n elektriese veld te oriënteer. Hierdie beginsel bied die basis vir die tegnieke van elektriese dubbele breking en dikroïsme. Ons sal slegs elektroforese bespreek.

Beskou die eenvoudige geval van 'n gelaaide deeltjie (+Q) wat in 'n elektriese veld (E) in 'n nie -geleidende medium, soos water, beweeg. As die deeltjie teen 'n konstante snelheid na die katode beweeg (- elektrode), sal die netto krag Ftot op die deeltjie is 0 (aangesien F=ma, en die versnelling (a) van die deeltjie 0 is teen konstante snelheid). Twee kragte word op die deeltjie uitgeoefen, een FE, die krag wat op die gelaaide deeltjie uitgeoefen word deur die veld, wat in die rigting van die beweging is (na die katode), en die ander, Ff, die wrywingskrag op die gelaaide deeltjie, wat sy beweging na die katode vertraag en dus in die rigting teenoor die beweging is (na die anode (+) elektrode). Dit word in die diagram hieronder getoon:

(1) Ftot = Fe + Ff = 0, waar
(2) Fe = QE (die elektriese krag) en
(3) Ff = -fv (die wrywingskrag),

waar v die snelheid van die deeltjie is, en f 'n konstante is wat die wrywingskoëffisiënt genoem word. Vergelyking (3) toon dat die krag Ff verhinderende beweging na die katode is eweredig aan die snelheid van die deeltjie. Dit is intuïtief, aangesien 'n mens sou verwag dat hoe hoër die snelheid, hoe groter die Ff wat die beweging belemmer. Die wrywingskoëffisiënt hang af van die grootte en vorm van die molekule. Hoe groter die molekule, hoe groter is die wrywingskoëffisiënt (d.w.s. meer weerstand teen beweging van die molekule). Dit kan aangetoon word dat die wrywingskoëffisiënt vir 'n sferiese deeltjie gegee word deur

waar & eta die viskositeit is (maatstaf van die weerstand teen vloei van 'n vloeistof - water het 'n lae viskositeit, regte esdoringstroop 'n hoë viskositeit) en Rs (Stokes-radius) is die radius van die gehidreerde sfeer (die groter Rs, hoe groter die wrywingskoëffisiënt, hoe groter is die Ff wat beweging na die katode weerstaan). Van (1), (2) en (3), Fe = Ff , of

Daarom v/E = Q/f = U = elektroforetiese mobiliteit, of

Daarom is die elektroforetiese mobiliteit U eweredig aan die ladingsdigtheid (lading/grootte, Q/Rs) van die deeltjie. Makromolekules van verskillende ladingsdigtheid kan dus deur elektroforese geskei word. Hierdie bespreking handel oor die eenvoudigste geval, aangesien daar in werklikheid teenione in die oplossing (van soute) is wat 'n wolk rondom die gelaaide makromolekule sou vorm, en die gelaaide deeltjie gedeeltelik van die elektriese veld E sou beskerm.

Moderne elektroforese word uitgevoer in soliede gels (soos poliakrielamied), wat gevorm word uit vloeibare akrielamiedoplossings na die byvoeging van 'n polimeriserende middel. Die vaste gel is poreus tot oplos- en oplosmolekules en dien as 'n medium vir elektroforese, terwyl dit help om konveksie kragte in die vloeistof uit te skakel wat die skeiding kan belemmer. Elektroforetiese eksperiment is op die ruimtependeltuig in gewiglose toestande uitgevoer om sulke versteurings te voorkom.

Een komplikasie wat hierdie geïdealiseerde beskrywing van elektroforese in poliakrielamiedgels affekteer, is dat die gels porieë het waardeur die makromolekules beweeg. Soos met gelchromatografie, kan die kleiner molekules makliker deur die porieë as groter molekules gaan, dus is daar 'n ekstra sifmeganisme wat bydra tot die effektief mobiliteit (die gel kan ook die plaaslike effektiewe elektriese veld verander). Die sif -effek van die gel verhoog eintlik die oplosvermoë van hierdie tegnieke.

Daar is vasgestel dat die werklike elektroforetiese mobiliteit van die proteïen, U, 'n funksie is van die mobiliteit van die proteïen in 'n gekonsentreerde sukrose -oplossing (Uo) en T, die totale konsentrasie van die akrylamied in die gepolymeriseerde gel. Hoe hoër die konsentrasie van akrielamied in die ongepolimeriseerde geloplossing, hoe kleiner is die grootte van die porieë in die gepolimeriseerde gel. 'n Vergelyking wat die verwantskap tussen U, Uo en T toon, word hieronder getoon:

waar Kr is die helling van 'n plot van log U vs T vir 'n gegewe proteïen. Sedert Kr is 'n funksie van die radius van die molekule, is dit moontlik om die molekulêre gewig van 'n proteïenmolekule te bepaal deur verskeie elektroforetiese skeidings in gels van verskillende akrielamiedkonsentrasies (T) uit te voer, en resultate te ekstrapoleer na T = 0, om sodoende porieëgrootte-effekte uit te skakel . Probleme ontstaan ​​egter as die proteïene nie sferoïed van vorm is nie

Is daar 'n manier om bykomend tot suiwerheidsbepaling inligting oor molekulêre gewig op 'n enkele gel te verkry? Wat sou die gevolg wees as twee verskillende proteïene, elk met dieselfde molekulêre gewig en totale netto lading, maar verskillende vorms, op 'n enkele akrielamiedgel uitgevoer word? Die een met die meer langwerpige vorm (groot Stokes-radius) sal 'n laer elektroforetiese mobiliteit hê (U = Q/6&pi&etaRs). 'n Groter Rs sal ook veroorsaak dat die proteïen die porieë teen 'n stadiger tempo binnedring. Gevolglik sal beide elektroforetiese mobiliteit en sif-effekte veroorsaak dat hierdie proteïen abnormaal stadig loop en 'n hoër oënskynlike molekulêre gewig het. Verbeel jou ook twee bolvormige proteïene van verskillende grootte, maar met kompenserende ladingverskille wat die twee proteïene kan toelaat om teen dieselfde spoed in die gel te migreer.

'N Algemene tegniek wat gebruik word om die interpretasie van elektroforetiese lopies in 'n enkele gel te vereenvoudig, is om die gel onder denaturerende toestande te laat loop. Die denaturant van keuse is gewoonlik natriumdodesielsulfaat (SDS), wat 'n ioniese skoonmaakmiddel is met die struktuur CH3(CH2)10CH2OSO3 - ('n enkele ketting amfifiel). Hierdie skoonmaakmiddel bind aan en denatureer die meeste proteïene, met ongeveer 1,4 g SDS-binding/g proteïen (ongeveer 1 SDS/2 aminosure). Aangesien daar 1 negatiewe lading/SDS is, masker die binding van SDS enige van die ladings op die proteïen en gee dit aan alle proteïene 'n algehele groot negatiewe lading. VerderDaar is getoon dat SDS-proteïene komplekse oor die algemeen 'n langwerpige silindriese vorm het. Aangesien die hoeveelheid SDS gebind per massameenheid proteïen konstant is, is die algehele ladingsdigtheid op alle proteïene soortgelyk, dus word die elektroforetiese mobiliteit slegs bepaal deur sifeffekte. SDS skakel ook vormverskille in die proteïene uit as 'n veranderlike wat sif bepaal, aangesien alle proteïene dieselfde algemene staafagtige vorm het. (Die gebruik van SDS is analoog aan die gebruik van 8M ureum by die gelchromatografiese skeiding van proteïene om molekulêre gewigte te bepaal). Mobiliteit word slegs 'n funksie van die molekulêre gewig van die proteïen, en nie vorm nie. Die molekulêre gewig van 'n onbekende proteïen kan bepaal word deur die proteïen se posisie op 'n SDS-poliakrielamiedgel te vergelyk met 'n reeks bekende molekulêre gewigstandaarde waaruit 'n lineêre plot van die ln Mr vs Rf kan gebruik word om onbekende molekulêre gewigte te bereken. Dit is soortgelyk aan die analise in jelchromatografie, waar ln Mr 'n lineêre funksie van K isgem, die verspreidingskoëffisiënt, wanneer die gel onder denaturerende toestande uitgevoer word. Sommige proteïene loop egter anomaal op sulke gels (as gevolg van onvolledige of oortollige bindende SDS), daarom moet alternatiewe tegnieke vir die bepaling van molekulêre gewig saam met hierdie tegniek gebruik word.

Proteïene word gewoonlik in SDS verhit tot 100 oC vir 3 minute, in die teenwoordigheid van 'n reduktiemiddel soos b-mercaptoethanol, om die proteïen heeltemal te denatureer tot 'n staafvormige proteïen. Blykbare molekulêre gewig kan verkry word onder nie-verminderende toestande (sonder b-ME), maar dit moet as net skattings beskou word. Lopende proteïene beide in die teenwoordigheid en afwesigheid van die reduseermiddel kan belangrike inligting verskaf oor die subeenheidstruktuur van 'n proteïen. 'n Multimeriese proteïen waarvan die subeenhede deur disulfiedbindings bymekaar gehou word, kan in sy individuele komponente opgelos word wanneer die reduseermiddel bygevoeg word. Indien die subeenhede bymekaar gehou word deur niekovalente intermolekulêre aantrekkings, sal die proteïene identies loop onder die denaturerende toestande (SDS), wat subeenheid interaksies sal elimineer, in die teenwoordigheid of afwesigheid van b-ME. Om die subeenheidsamestelling van 'n proteïen wat deur nie -kovalente interaksies gehou word, te bepaal, moet die elektroforese uitgevoer word in die afwesigheid van denatureringsmiddels.

  • Nobel E-Museum: Virtuele Biochemie Lab. Skeidingsaal: Elektroforese - volg skakels

Let wel: Elektrodenomenklatuur kan vir sommige van u verwarrend wees. Soos hierbo genoem, beweeg katione na die katode (waar reduksie plaasvind), dus moet die katode negatief wees. Net so beweeg anioon na die anode (waar oksidasie plaasvind), dus moet die anode positief wees. Dit is die teenoorgestelde van wat u moontlik sou onthou uit die algemene of analitiese chemie, toe u hoofsaaklik galvaniese selle bespreek het. In galvaniese selle word 'n elektriese stroom opgewek uit 'n spontane stel redoks-halfreaksies. Ons het te doen met elektrolitiese selle, soos in die elektrolise van water (2H2O(l) --> 2H2 (g) + O2(g)) of in die produksies van Cl2(g) en Mg(s) van die waterige elektroliet MgCl2(aq). In elektrolitiese selle moet 'n kragbron die stroom verskaf om die nie-spontane (onbevoordeelde termodinamiese) reaksies, soos hierbo uiteengesit, aan te dryf. Kyk na die resensiefiguur hieronder.

Galvaniese en Elektrolitiese selle

Elektroforese word uitgevoer in 'n poreuse, maar soliede medium, om probleme wat met konveksiestrome verband hou, uit te skakel. Sulke media word gevorm deur die polimerisasie van 'n vloeibare oplossing van agarose (meestal gebruik vir elektroforese van DNA -fragmente en baie groot proteïene) of akrylamied. Polimerisasie van akrielamied word geïnisieer deur die byvoeging van ammoniumpersulfaat in die teenwoordigheid van tetrametileendiamien (TEMED), saam met 'n dimeer van akrilamied (N,N'-metileen-bis(akrilamied) wat kovalent tussen die amiedstikstof van die akrielamiede verbind is deur 'n metileen Die strukture van hierdie verbindings word hieronder getoon:

Die vrye radikale polimerisasie van die akrilamied word geïnisieer deur die byvoeging van ammoniumpersulfaat, wat by oplos in water vrye radikale vorm, soos hieronder getoon:

Die radikale begin polimerisasie van die akrylamied, soos hieronder getoon. Die TEMED, deur sy vermoë om as 'n vrye radikaal te bestaan, dien as 'n bykomende katalisator vir die polimerisasie. 'N Stywe gel word egter slegs gevorm wanneer N, N'-metileen-bis (akrylamied by die mengsel gevoeg word tydens die polimerisasie, wat aangrensende akrielamiedpolimere verbind soos hieronder getoon:

Die hoeveelheid bis wat tydens polimerisasie bygevoeg word, bepaal die mate van verknoping en dus die poriegrootte van die gepolymeriseerde gel. Die effek van poriegrootte is TEENOORGESTELDE daarby in jelchromatografie. In albei gevalle het groot proteïene dit moeilik om die porie binne te kom. In jelchromatografie verdeel groot proteïene verkieslik in die mobiele vloeistoffase (die leemtevolume) en word die meeste geëlueer VINNIG uit die kolom. By elektroforese word groot proteïene, wat nie maklik die porieë van die gel kan binnedring nie, nie so maklik deur die elektriese veld deur die gel vervoer nie, en word die meeste ontwrig STADIG. Poriegrootte kan nie so akkuraat beheer word as by die vervaardiging van gelchromatografiehars nie.

Hoe migreer proteïene deur die gel? ’n Viskose proteïenoplossing word bo-op die jel gelaag in ’n klein put wat in die jel gevorm is tydens die polimerisasieproses. Die onderste en boonste dele van die gel word in reservoirs met 'n gebufferde oplossing en die toepaslike elektrode ingevoeg. Die elektriese veld word toegepas en die proteïene migreer deur die gehidreerde jel. Die aard van die bufferoplossing in die reservoir en in die gepolimeriseerde jel is belangrik. Die komponente van die buffer moet nie bind aan die proteïene wat geskei moet word nie. Daarbenewens moet die pH van die medium sodanig wees dat die proteïene die toepaslike lading het, sodat hulle in die verwagte rigting sal migreer.

Diskontinue gelelektroforese:

Daar is baie variasies van elektroforese wat algemeen gebruik word. Gele kan in buise of blaaie gepolimeriseer word en in die teenwoordigheid of afwesigheid van denaturerende middels. Daarbenewens kan 'n gegewe blad bestaan ​​uit twee afsonderlike blaaie wat een bo-op mekaar gepolimeer is, elk met 'n ander akrielamiedkonsentrasie en pH. Hierdie tipe word diskontinue pH-gelelektroforese genoem, of skyfelektroforese. Ons sal hierdie tegniek in vandag se laboratorium gebruik. Die twee verskillende pH- en akrylamiedkonsentrasie -gels (die stapelgel en loopgel) word in die onderstaande prentjie getoon.

Die stapelgel is 'n lae konsentrasie akrielamied (2-4%) wat in 'n Tris HCl buffer oplossing (pH 6.5) gepolimeriseer is, twee pH eenhede laer as wat gebruik word in die lopende gel en die onderste reservoir (Tris HCl buffer, pH 8.7). Die laer of lopende jelkonsentrasie wissel van 7-15% akrielamied, afhangende van die molekulêre gewig van die proteïene wat geskei moet word. Die boonste bufferreservoir bevat Tris gebuffer met 'n swak suur, soos glisien (pKa2 = 9.6) tot dieselfde pH as die lopende gel.

Wat is die voordele in die resolusie van 'n diskontinue pH -gelstelsel? Die grootste voordeel is dat die proteïene vinnig deur die stapelgel en 'stapel' by die koppelvlak tussen die twee gele elektroforeseer, voordat hulle die gel binnedring. Dit verhoog die kompaktheid van die proteïene voordat hulle die lopende gel binnedring en verhoog resolusie. Hoe werk hierdie stapelproses? As die elektroforese begin word, kom glisienione uit die boonste reservoir (by pH 8,7) in die stapelgel, aangesien hulle by daardie pH 'n gemiddelde gedeeltelike negatiewe lading het. Die stapelgelbufferione beweeg steeds in die stapelgel, maar wanneer die glisienione die pH 6,5 van die stapelgel binnedring, word dit zwitterione met 'n netto lading van nul, en stop gevolglik die beweging na die anode. Die elektriese weerstand in die stapelgel neem dan toe aangesien die aantal ione wat deur die stapelgel beweeg afneem. Om 'n konstante stroom deur die stroombaan te handhaaf, sal daar 'n gelokaliseer toename in die spanning in die stapelgel (uit Ohms Law, V = iR). Dit sal veroorsaak dat die proteïene vinnig migreer en almal in 'n enkele, baie dun skyf reg agter die Cl-ione in die stapelgel (wat voor is omdat hulle die hoogste ladingsdigtheid en elektroforetiese mobiliteit van enige ioon in die stapelgel het) ). Die proteïene sal nie die Clions verbygaan nie, want as dit sou gebeur, sou dit onmiddellik vertraag word, aangesien dit nie meer in 'n gebied van verminderde gelaaide draers en hoër spanning sou wees nie. By die stapelgel/loop-gel-koppelvlak kan die proteïene nie almal teen dieselfde spoed migreer nie, as gevolg van sifeffekte van die meer gekonsentreerde gel, en sal dus in die lopende gel geskei word. Die glisien gaan uiteindelik die lopende jel binne, neem sy volledig gelaaide toestand by daardie pH (8.7) aan, sal die proteïene deurlaat en herstel die tekort in lading wat in die stapelgel voorgekom het.

Java Applet: Proteïen Elektroforese

Opsporing van proteïene in die gel:

Die meeste proteïene absorbeer nie sigbare golflengtes van lig nie, en sal dus nie sigbaar wees tydens die verloop van elektroforese nie. Om te verseker dat die proteïene nie uit die gel in die onderste bufferreservoir uitgeskakel word nie, word 'n klein molekulêre gewig, anioniese kleurstof, bromfenolblou by die proteïen gevoeg voordat dit op die gel geplaas word. Die elektroforese word gestaak wanneer die kleurstof naby die einde van die lopende gel kom. Die gel-samestelling word uit die elektroforesekamer verwyder, die glasplate geskei en die gel word in 'n reeks oplossings gewas met die doel om die gebandproteïene vir die oog sigbaar te maak.

Verskeie tegnieke word tans gebruik. Die algemeenste is om die jel te kleur met Coomassie Blue, opgelos in 'n metanol/asynsuuroplossing. Soos in laboratorium twee ontdek, bind proteïene Coomassie Blue, met 'n gepaardgaande spektrale verskuiwing in die absorpsie -eienskappe van die gebonde kleurstof. Die metanol en asynsuur in die kleurstofoplossing help ook om die proteïen in die gel te "fix" en voorkom dat dit in die oplossing versprei. Nadat die gel gekleur is, word die agtergrondvlek in die gel verwyder met asynsuur/metanol, wat die bloukleurige proteïenbande laat. Weereens 'n waarskuwing: sommige proteïene word nie met Coomassie -blou gevlek nie. Nog 'n algemene kleurtegniek behels silwerkleuring, wat die reduksie van Ag(I) tot elementêre silwer en die afsetting daarvan deur proteïen in die toepaslike reaksie-oplossings behels, net soos in 'n fotografiese proses. (Onthou in die BCA -toets, peptiedbindings verminder Cu (II) tot Cu (I), wat tot BCA gekelateer word.) 'N Ontwikkelaar- en fixeeroplossing is nodig. Hierdie tegniek is 10-50 X meer sensitief as Coomassie Blue-kleuring. Pre-elektroforese fluoresserende of radioaktiewe modifikasie van die proteïene laat selfs groter sensitiwiteit toe. Na die elektroforese van 'n radio-gemerkte proteïen, kan die jel gedroog word, en oorgetrek word met X-straal film vir periodes so lank as maande, indien nodig, om voldoende blootstelling van die film deur 'n lae konsentrasie proteïen toe te laat. Hierdie visualiseringstegnieke word outoradiografie genoem.

Figuur: SDS PAGE Gel met MW -standaarde

DNS-fragmente word gewoonlik op horisontale agarosegelstelsels geskei, wat baie makliker is om te giet.

Figuur: DNA -fragmente geskei op 'n agarosegel

Variasies op gelelektroforese:

Iso-elektriese fokus: In hierdie tegniek word 'n pH -gradiënt in die poliakrylamiedgel opgestel. Dit word bewerkstellig deur 'n reeks lae molekulêre gewig molekules wat amino- en karboksielgroepe genoem amfoliete bevat, vooraf te elektroforeseer. Wanneer dit aan 'n elektriese veld onderwerp word, sal die mees negatiewe van die spesie by die anode konsentreer, terwyl die mees positiewe na die katode sal konsentreer. Die oorblywende amfoliete migreer tussenin, met die netto effek dat die amfoliete na hul isoelektriese punt migreer en 'n lineêre pH-gradiënt in die gel opstel. 'n Proteïen wat op die gel toegedien word, sal migreer na die pH wat ooreenstem met sy iso-elektriese punt en stop.

2D elektroforese: Dit behels tipies die onderwerping van die proteïene aan iso-elektriese fokuselektroforese in 'n poliakrielamiedgel wat in 'n smal silindriese buis gegiet is. Na hierdie elektroforese word die buisgel verwyder, en oor die bokant van die stapelgel geplaas en aan SDS-poliakrielamiedgelelektroforese in 'n rigting 90o vanaf die aanvanklike iso-elektriese fokuseksperiment onderwerp. As die proteïene afkomstig is van selle wat met 35 Met gemerk is, kan unieke proteïene van 'n gegewe selpopulasie verkry word.

  • Voorbeeld van 2D elektroforetigram
  • 2D Elektroforese vir Proteomics

Western blotting: Nadat 'n standaard elektrodeforese-eksperiment met SDS-plaat uitgevoer is, word die gel met 'n stuk nitrocellulosefilterpapier bedek. Die toebroodjie van gel en filterpapier word terug in 'n elektroforese -kamer geplaas, sodat die proteïene van die gel na die nitrocellulose migreer, waar dit onomkeerbaar bind. Die filterpapier kan verwyder word en geweek word in 'n oplossing wat 'n spesifieke teenliggaam bevat teen 'n proteïen van belang op die nitrocellulose. Hierdie proteïen-teenliggaamkompleks op die filtreerpapier kan dan opgespoor word deur byvoorbeeld 'n fluoresserend-gemerkte teenliggaam wat die eerste teenliggaam bind, by te voeg.

Figuur: SDS PAGE -gel en Western Blot om CKK47 op te spoor

Figuur: Opsporing in Western Blots

Fluoresensie

Wanneer elektrone in 'n molekule energie absorbeer, word dit bevorder tot hoër elektroniese energietoestande. Hierdie opgewekte toestand -elektrone kan terugkeer na die grondtoestand in prosesse wat nie -stralend of stralend is. In stralingsdeeksitasie word lig uitgestraal. Hierdie proses van liguitstraling word genoem luminessensie, wat in twee kategorieë verdeel kan word:

  • fluoressensie: As een elektron van 'n grondtoestand -elektronpaar opgewonde is na 'n hoër energietoestand, kan die opgewonde elektrone steeds met die aardtoestand van die aardtoestand gespin word - dit wil sê hulle het teenoorgestelde draaie. Die opgewekte elektron kan terugkeer na die grondtoestand sonder om sy spin om te keer. (Die opgewonde toestand is 'n enkellopend toestand met S, die totale spin -toestand, gegewe die formule S = 2s +1 waar s = o en S = 1 vir sinlget.) Hierdie proses, wat 'n vinnige emissie van 'n foton tot gevolg het, is & quotspin toegelaat & quot. Die tempo van fotonemissie is ongeveer 10 8 s -1, wat 'n leeftyd (die gemiddelde tyd tussen opwekking en emissie) van die opgewekte toestand van ongeveer 10 ns tot gevolg het.
  • fosforesensie: As, in teenstelling met die bogenoemde geval, die spin van die opgewekte elektron omgekeer word, dan is sy oorgang terug na die grondtoestand "spin verbode" aangesien die opgewekte toestand-elektron en sy grondtoestand-eweknie dieselfde spintoestand het. (Die opgewonde toestand is 'n drieling staat met S, die totale draaitoestand, gegewe die formule S = 2s +1 waar s = 1 en S = 3 vir drieling). Hierdie oorgang vind dus stadig plaas (binne die ms - s -reeks). Speelgoed wat in die donker gloei, vertoon nog langer lewenslange fosforesensie. (Let wel: hierdie gids konsentreer op fluoressensie.)

Kompeterende met die twee ontspanningsprosesse is nie-stralingsprosesse (soos deur botsings). Gegewe hierdie mededingende prosesse, kan verwag word dat fosforesensie in vloeibare oplossings by kamertemperatuur nie waarneembaar is nie

Molekules wat fluoresseer is tipies aromaties, wat maklik absorbeer in die UV- en sigbare ligstreke. Algemene fluorofore is kinien, wat in tonikumwater aangetref word (let op die dowwe blou gloed op die oppervlak wanneer dit in direkte sonlig geplaas word), en fluoresceïen en rhodamien, twee fluorofore wat dikwels by antivries gevoeg word. Atome is gewoonlik nie-fluoresserend, met die uitsondering van europium- en terbiumione uit die lantaniedreeks. Hierdie fluoresseer wanneer elektroniese oorgange plaasvind tussen f orbitale, wat van oplosmiddels in hierdie spesifieke ione beskerm word.

Die elektroniese oorgange onderliggend aan luminescentie kan deur 'n Jablonski -diagram voorgestel word.

Dus, S1 en S2 stem ooreen met die enkelgrondtoestand en eerste en tweede opgewekte elektroniese toestande van 'n elektron. Binne elke elektroniese toestand is daar verskeie vibrasie -energievlakke 0, 1, 2. Hierdie eenvoudige diagram ignoreer die blus van fluoressensie, resonansie -energie -oordrag, ens. Die oorgange, wat deur vertikale lyne voorgestel word, word as onmiddellik beskou. In werklikheid neem dit ongeveer 10 -15 sekondes, sodat die kerne nie in die proses beweeg nie. Die elektron van die grondtoestand word beskou as in die 0 -trillingsvlak van So, aangesien termiese energie onvoldoende is om dit na die volgende vibrasievlak te bevorder. Wanneer lig geabsorbeer word, word die elektron bevorder tot 'n hoër vibrasievlak binne 'n hoër elektroniese vlak. Gewoonlik ontspan die opgewonde elektrone vinnig (& lt 1 ps) tot die laagste vibrasievlak van S1 of moontlik S2 deur 'n proses genaamd interne omskakeling. Fluoressensie -emissie kan dan plaasvind vanaf die laagste vibrasie toestand van S1 tot enige van die vibrasie toestande van So. Daarom is die uitgestraalde foton laer in energie (langer in golflengte) as die geabsorbeerde foton. Aangesien beide prosesse die beweging van die elektron na verskillende vibrasievlakke behels met absorpsie of emissie van 'n foton, en nie -stralende vibrasieverslapping binne hierdie vlakke, is die emissiespektra dikwels die spieëlbeeld van die absorpsiespektra. (Dit neem aan dat die vibrasievlakke in So en S1 soortgelyk gespasieer is. Alternatiewelik kan elektrone in S1 draai draai en omskakel na die T1-toestand, in proses genoem intersisteemkruising, wat lei tot fosforesensie.

Eienskappe van fluoressensie-emissie

  1. Stokes Shift: Die emissienergie is minder as die absorpsie -energie, wat veroorsaak dat die emissiegolflengtes hoër is as die absorpsiegolwe. (Sien verduideliking hierbo.)
  2. Emissiespektra is gewoonlik onafhanklik van die opwindingsgolflengte (Kasha se reël): Dit gebeur as gevolg van die vinnige ontspanning na die laagste vibrasie -energievlak van die opgewekte toestand.
  3. Uitsonderings op die miror -beeldreël: Afwykings ontstaan ​​as gevolg van 'n verandering in geometrie van kerne in die opgewekte toestand molekule. Dit kan voorkom as die leeftyd van die S1-toestand lank is, wat tyd toelaat vir beweging voor emissie. 'n Voorbeeld hiervan kan gesien word met p-terfeniel in sikloheksaan, waarin die ringe meer koplanêr word in die opgewekte toestand. Aangesien daar elektronverskuiwing in die opgewonde toestand is, kan 'n kompleks tussen die opgewonde fluorofoor en 'n ander oplossingskomponent ontstaan ​​(lading-oordragkompleks). Alternatiewelik komplekse fluorofore met hulself (pireen). Dit het 'n hoogs struktuur emissiespektrum by lae konsentrasies (dit wil sê geen komplekse nie), maar by hoë konsentrasies vind veranderinge in die emissiespektrum plaas as gevolg van emissie van 'n dimer in opgewekte toestand of excimer. Acridine toon twee emissiespektra by verskillende pH's, wat voortspruit uit veranderinge in die pka by eksitasie (5.45 tot 10.7).

Opwekking van 'n fluorofoor by drie verskillende golflengtes (EX 1, EX 2, EX 3) verander nie die emissieprofiel nie, maar produseer wel variasies in die intensiteit van die fluorescentie -emissie (EM 1, EM 2, EM 3) wat ooreenstem met die amplitude van die eksitasiespektrum. Figuur uit Molecular Probes Catalog, skakel hierbo.

Fluoresensie Resonansie Energie Oordrag (FRET)

As 'n absorberende spesie in die nabyheid van 'n opgewekte toestand fluorofoor is, en as die emissiespektra van die fluorofoor die absorbsiespektra van die tweede spesie oorvleuel, kan koppeling van die twee dipole plaasvind, en energie kan oorgedra word vanaf die opgewekte toestand van die fluorofoor (skenker D) na die tweede absorberende spesie (akseptor A). Hierdie oordrag van energie geskied deur dipoolkoppeling en nie deur die triviale vrystelling en absorpsie van 'n uitgestraalde foton nie. Geen foton word geproduseer nie. Hierdie proses word genoem fluorescentie resonansie energie oordrag (FRET). die tempo van energie -oordrag, k (r) word gegee deur:

k (r) = (1/ & tau) (Ro/r) 6 waar Ro is die Forster-afstand wat 'n maatstaf is van die spektrale oorvleueling van die skenker en acceptor (waarvoor die meeste biologiese makromolekules 'n soortgelyke waarde van 30-60 angstrom het), en tau is die leeftyd van die skenker in die afwesigheid van FRET, en r is die afstand tussen die skenker en die aanvaarder. Doeltreffendheid, E, van FRET vir 'n enkele skenker/aannemer -paar op 'n vaste afstand word gegee deur:

E = Ro 6 /(Ro 6 + r 6). Dit toon 'n doeltreffendheid wat afhanklik is van 1/r 6, wat FRET uiters sensitief maak vir afstand.

Biologiese fluorofore

Nie alle molekules fluoreer nie. Onder biologiese molekules bevat sommige, veral makromolekules, aromatiese substituente wat fluoreseer. Dit word genoem intrinsieke fluorofore, en sluit in, in die geval van proteïene, die sykettings van triptofaan, tirosien en fenielalanien, die aromatiese aminosure. Die indoolsyketting van triptofaan is die mees fluoresserende, en sy emissiespektra, wat sensitief is vir oplosmiddeltoestande, is dikwels blouverskuif wanneer dit begrawe word, en rooiverskuif wanneer oplosmiddel blootgestel word. Nukleïensure, hoewel hulle ook aromatiese basisse bevat, is swak fluorofore. Baie biologiese molekules kan deur middel van kovalent verander word (deur nukleofiele op die biologiese molekule) met eksogeen bygevoegde fluorofore, soos fluoresceïne isotisanaat, rhodamien isothiocyante, dansielchloried, ens. ekstrinsieke fluorofore. Dit sluit molekules in wat nie-kovalent bind aan strukture soos ds-DNA (ethidium bromide) of lipiedmembrane (difenielheksatrien). Sommige biologiese fluorofore is substrate vir ensiemreaksie. 'N Voorbeeld is die geoksideerde flaviene (FAD, FMN) en die verminderde vorm van NAD (dws NADH). Nog 'n tipe bruikbare fluorofoor is aanwysers waarvan die fluoresserende eienskappe verander met verandering in 'n parameter, soos pH of [Ca-ioon].

Inligting oor fluoressensie

Inligting oor molekulêre struktuur kan afgelei word uit baie fluoresserende eienskappe:

  • Stokes verskuif in emissiespektra: Hierdie verskuiwing is die grootste vir fluorofore in polêre omgewings (soos hierbo genoem vir indoolfluoressensie. Afleidings kan gemaak word, oorweeg die aanleg van die syketting (begrawe of oppervlak) indien veranderinge op proteïendenaturasie opgemerk word. Baie probes is ook swak fluoresserend in water. oplossing, maar fluoreer intens in nie -polêre mediums (gebind aan 'n hidrofobiese sak in 'n proteïen, in 'n tweelaag of lipoproteïen, ens.)
  • Uitblus: Dit kan inligting gee oor fluorofoor toeganklikheid. Byvoorbeeld, 'n begrawe tiptofaan of sonde toon min verandering in fluorescentie -intensiteit in die teenwoordigheid van 'n groot, polêre quencher, terwyl 'n oppervlak -tryptofaan of sonde 'n beduidende afname in die fluorescerende intensiteit sal toon.
  • Anisotropie of polarisasie: Dit meet die mate van rotasie van die fluorofoor gedurende sy fluoresserende leeftyd. As 'n klein fluorfore aan 'n groot molekule bind, neem sy rotasie-diffusiekonstante af, en sy anisotropie neem toe. Aangesien viskositeit die tempo van rotasiediffusie verlaag, kan veranderinge in fluoressensie (soos binne 'n dubbellaag) uit hierdie metings afgelei word. Byvoorbeeld, membrane wat meer in versadigde vetsure verryk is, moet 'n verhoogde anisotropie van 'n hidrofobiese, fluoresserende sonde toon, in vergelyking met dieselfde sonde in 'n tweelaag wat verryk is in poli -onversadigde vetsure.
  • FRET: Dit kan gebruik word om byvoorbeeld binding tussen monomere aan te toon (as die een proteïen 'n tryptofaan het en die ander 'n ekstrinsieke fluoresserende sonde.

Molekulêre sondes - fantastiese fluorofore en dokumentasie

  • 'N Opleiding van BioProbes:
    • 'n basiese begrip van fluoressensie kry
    • Leer hoe om opwekking en emissiespektra te interpreteer
    • Verstaan ​​die verskil tussen eksitasie- en emissiefilters

    Potensiële addisionele materiaal om by hierdie afdeling te voeg:

    3.1 Proteïensuiwering

    Suiwering van proteïene is 'n reeks prosesse wat bedoel is om een ​​of 'n paar proteïene uit 'n komplekse mengsel te isoleer, gewoonlik selle, weefsels of hele organismes. Proteïensuiwering is noodsaaklik vir die karakterisering van die funksie, struktuur en interaksies van die proteïen van belang.Die suiweringsproses kan die proteïen- en nie-proteïendele van die mengsel skei en uiteindelik die gewenste proteïen van alle ander proteïene skei. Skeiding van een proteïen van alle ander is tipies die mees moeisame aspek van proteïensuiwering. Skeidingsstappe ontgin gewoonlik verskille in proteïengrootte, fisies-chemiese eienskappe, bindingsaffiniteit en biologiese aktiwiteit. Die suiwer resultaat kan genoem word proteïen isolaat.

    Proteïensuiwering is ook voorbereidend of analities. Voorbereidende suiwering poog om 'n relatief groot hoeveelheid gesuiwerde proteïene te produseer vir latere gebruik. Voorbeelde sluit in die voorbereiding van kommersiële produkte soos ensieme (bv. laktase), voedingsproteïene (bv. sojaproteïenisolaat) en sekere biofarmaseutiese middels (bv. insulien). Verskeie voorbereidende suiweringstappe word dikwels gebruik om tweeprodukte, soos gasheer-selproteïene, te verwyder, wat 'n moontlike bedreiging vir die pasiënt se gesondheid kan inhou. Analitiese suiwering produseer 'n relatief klein hoeveelheid proteïene vir 'n verskeidenheid navorsings- of analitiese doeleindes, insluitend identifisering, kwantifisering en studie van die proteïen se struktuur, post-translasionele modifikasies en funksie. Pepsien en urease was die eerste proteïene wat gesuiwer is tot die punt dat dit gekristalliseer kon word.

    Onttrekking

    As die proteïen van belang nie deur die organisme in die omliggende oplossing afgeskei word nie, is die eerste stap van elke suiweringsproses die ontwrigting van die selle wat die proteïen bevat. Afhangende van hoe broos die proteïen is en hoe stabiel die selle is, kan u byvoorbeeld een van die volgende metodes gebruik: i) herhaalde vries en ontdooiing, ii) sonikasie, iii) homogenisering deur hoë druk (Franse pers), iv ) homogenisering deur maal (kraalmeul), en v) permeabilisering deur skoonmaakmiddels (bv. Triton X-100) en/of ensieme (bv. lisosiem). Uiteindelik kan die puin verwyder word deur sentrifugering sodat die proteïene en ander oplosbare verbindings in die supernatant bly.

    Proteases word ook tydens sellise vrygestel, wat die proteïene in die oplossing sal begin verteer. As die proteïen van belang is sensitief vir proteolise, word dit aanbeveel om vinnig voort te gaan, en om die ekstrak afgekoel te hou, om die vertering te vertraag. Alternatiewelik kan een of meer protease-inhibeerders onmiddellik voor selontwrigting by die lisisbuffer gevoeg word. Soms is dit ook nodig om DNAse by te voeg om die viskositeit van die sellysaat wat veroorsaak word deur 'n hoë DNA -inhoud, te verminder.

    Neerslag en differensiële solubilisasie

    By grootmaat proteïensuiwering, is 'n algemene eerste stap om proteïene te isoleer neerslag met 'n sout soos ammoniumsulfaat (NH4)2SO4. Hierdie proses word genoem Insouting of Uitsout(Figuur 3.1) Dit word uitgevoer deur toenemende hoeveelhede ammoniumsulfaat by te voeg en die verskillende fraksies neerslagproteïen te versamel. Ammoniumsulfaat word dikwels gebruik, aangesien dit hoogs oplosbaar in water is, relatief vry is van temperatuur -effekte en gewoonlik nie skadelik is vir die meeste proteïene nie. Verder kan ammoniumsulfaat deur dialise verwyder word (Figuur 3.2). Die hidrofobiese groepe op die proteïene word blootgestel aan die atmosfeer, lok ander hidrofobiese proteïengroepe en word saamgevoeg. Die neerslag van proteïene sal groot genoeg wees om sigbaar te wees. Een voordeel van hierdie metode is dat dit goedkoop met baie groot volumes uitgevoer kan word.

    Figuur 3.1 In- en uitsout. Tydens die soutproses verhoog soutmolekules die oplosbaarheid van proteïene deur die elektrostatiese interaksies tussen proteïenmolekules te verminder. Namate die soutkonsentrasie verhoog word, word proteïen-proteïeninteraksies meer energiek gunstiger as proteïen-oplosmiddelinteraksies en die proteïene word uit die oplossing neergeslaan.

    Die eerste proteïene wat gesuiwer moet word, is wateroplosbare proteïene. Suiwering van integrale membraanproteïene vereis ontwrigting van die selmembraan om enige spesifieke proteïen te isoleer van ander wat in dieselfde membraankompartement is. Soms kan 'n spesifieke membraanfraksie eers geïsoleer word, soos om mitochondria uit selle te isoleer voordat 'n proteïen in 'n mitochondriale membraan gesuiwer word. 'N Wasmiddel soos natriumdodecylsulfaat (SDS) kan egter gebruik word om selmembrane op te los en membraanproteïene in oplossing te hou tydens suiwering, omdat SDS denaturasie veroorsaak, kan ligter skoonmaakmiddels soos Triton X-100 of CHAPS gebruik word om die proteïen se oorspronklike te behou konformasie tydens volledige suiwering.

    Figuur 3.2 Dialise. Die dialise -proses skei opgeloste molekules deur hul grootte. Die biologiese monster word binne 'n geslote membraan geplaas, waar die proteïen van belang te groot is om deur die porieë van die membraan te gaan, maar waardeur kleiner ione maklik kan beweeg. Namate die oplossing in ewewig kom, word die ione eweredig oor die hele oplossing versprei, terwyl die proteïen in die membraan gekonsentreer bly. Dit verminder die algehele soutkonsentrasie van die suspensie.

    Ultrasentrifugering

    Sentrifugering is 'n proses wat sentrifugale krag gebruik om mengsels van deeltjies van verskillende massas of digthede wat in 'n vloeistof gesuspendeer is, te skei. Wanneer 'n houer (tipies 'n buis of bottel) wat 'n mengsel van proteïene of ander deeltjies bevat, soos bakteriële selle, teen hoë spoed geroteer word, lewer die traagheid van elke deeltjie 'n krag in die rigting van die deeltjies se snelheid wat eweredig is aan sy massa. Die neiging van 'n gegewe deeltjie om deur die vloeistof te beweeg as gevolg van hierdie krag, word geneutraliseer deur die weerstand wat die vloeistof op die deeltjie uitoefen. Die netto effek van "spin" van die monster in 'n sentrifuge is dat massiewe, klein en digte deeltjies vinniger uitwaarts beweeg as minder massiewe deeltjies of deeltjies met meer "drag" in die vloeistof. As suspensies van deeltjies in 'n sentrifuge gespin word, kan 'n "korrel" aan die onderkant van die vaartuig vorm wat verryk is vir die mees massiewe deeltjies met 'n lae weerstand in die vloeistof.

    Nie-saamgepakte deeltjies bly meestal in die vloeistof genaamd "supernatant" en kan uit die houer verwyder word om sodoende die supernatant van die korrel te skei. Die sentrifugeringstempo word bepaal deur die hoekversnelling wat op die monster toegepas word, tipies gemeet in vergelyking met die g. As monsters lank genoeg gesentrifugeer word, sal die deeltjies in die vaartuig ewewig bereik waarin die deeltjies spesifiek ophoop by 'n punt in die vaartuig waar hul dryfdigtheid gebalanseer is met sentrifugale krag. So 'n "ewewig" sentrifugering kan uitgebreide suiwering van 'n gegewe deeltjie toelaat.

    In sukrose gradiënt sentrifugering, word 'n lineêre konsentrasiegradiënt van suiker (tipies sukrose, gliserol of 'n silika-gebaseerde digtheidsgradiëntmedium, soos Percoll) in 'n buis gegenereer sodat die hoogste konsentrasie aan die onderkant en die laagste bo is. Percoll is 'n handelsmerk van GE Healthcare -ondernemings. 'N Proteïenmonster word dan bo -op die gradiënt gelê en teen hoë snelhede in 'n ultrasentrifuge gespin. Dit veroorsaak dat swaar makromolekules vinniger na die onderkant van die buis migreer as ligter materiaal. Tydens sentrifugering in die afwesigheid van sukrose, soos deeltjies verder en verder van die rotasiemiddelpunt beweeg, ervaar hulle meer en meer sentrifugale krag (hoe verder hulle beweeg, hoe vinniger beweeg hulle). Die probleem hiermee is dat die nuttige skeidingsgebied van binne die vaartuig beperk is tot 'n klein waarneembare venster. 'n Behoorlik ontwerpte sukrosegradiënt sal die toenemende sentrifugale krag teenwerk sodat die deeltjies in noue verhouding beweeg met die tyd wat hulle in die sentrifugale veld was. Monsters wat deur hierdie gradiënte geskei word, word na verwys as "rate sonal" centrifugasies. Nadat die proteïen/deeltjies geskei is, word die gradiënt gefraktioneer en versamel.

    Figuur 3.3 Sukrose digtheidsgradiënt.

    Terug na bo

    Suiweringstrategie

    Die keuse van 'n beginmateriaal is die sleutel tot die ontwerp van 'n suiweringsproses. In 'n plant of dier word 'n spesifieke proteïen gewoonlik nie homogeen deur die liggaam versprei nie, verskillende organe of weefsels het 'n hoër of laer konsentrasie van die proteïen. Gebruik van slegs die weefsels of organe met die hoogste konsentrasie verminder die volumes wat nodig is om 'n gegewe hoeveelheid gesuiwerde proteïen te produseer. As die proteïen in klein hoeveelhede voorkom, of as dit 'n hoë waarde het, kan wetenskaplikes rekombinante DNA -tegnologie gebruik om selle te ontwikkel wat groot hoeveelhede van die gewenste proteïen sal produseer (dit staan ​​bekend as 'n uitdrukkingsisteem). Met rekombinante uitdrukking kan die proteïen gemerk word, bv. deur 'n His-tag of Strep-tag om suiwering te vergemaklik, wat die aantal suiweringstappe verminder. Hierdie tegnieke sal in meer besonderhede in hoofstuk 5 bespreek word.

    'N Analitiese suiwering gebruik oor die algemeen drie eienskappe om proteïene te skei. Eerstens kan proteïene volgens hul iso-elektriese punte gesuiwer word deur hulle deur 'n pH-gegradeerde gel of 'n ioonuitruilkolom te laat loop. Tweedens kan proteïene volgens hul grootte of molekulêre gewig geskei word deur middel van grootte-uitsluitingschromatografie of deur SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elektroforese) analise. Proteïene word dikwels gesuiwer deur 2D-PAGE te gebruik en word dan geanaliseer deur vingerafdrukke van die peptiedmassa om die proteïenidentiteit vas te stel. Dit is baie nuttig vir wetenskaplike doeleindes en die opsporingslimiete vir proteïen is deesdae baie laag en nanogram hoeveelhede proteïen is voldoende vir die ontleding daarvan. Derdens kan proteïene geskei word deur polariteit/hidrofobisiteit deur middel van hoë werkverrigting vloeistofchromatografie of omgekeerde fase chromatografie. Gelelektroforesetegnieke word in meer besonderhede in Afdeling 3.2 bespreek. Hierdie afdeling fokus hoofsaaklik op chromatografiese skeidings.

    Vir voorbereidende proteïensuiwering bevat die suiweringsprotokol gewoonlik een of meer chromatografiese stappe. Die basiese prosedure in chromatografie is om die oplossing wat die proteïen bevat, deur 'n kolom te vloei wat met verskillende materiale gepak is. Verskillende proteïene reageer verskillend met die kolommateriaal en kan dus geskei word deur die tyd wat nodig is om die kolom te verby, of die omstandighede wat nodig is om die proteïen uit die kolom te elueer. Gewoonlik word proteïene opgespoor as hulle uit die kolom kom deur hul absorpsie by 280 nm. Daar bestaan ​​baie verskillende chromatografiese metodes, met die algemeenste wat hieronder beskryf word:

    Grootte-uitsluitingchromatografie (ook bekend as gelfiltrasiechromatografie)

    Chromatografie kan gebruik word om proteïene in oplossing of onder denaturerende toestande te skei deur poreuse gels te gebruik. Hierdie tegniek staan ​​bekend as grootte uitsluiting chromatografie. Die beginsel is dat kleiner molekules 'n groter volume in 'n poreuse matriks moet deurkruis. Gevolglik benodig proteïene van 'n sekere grootte grootte 'n veranderlike volume eluens (oplosmiddel) voordat dit aan die ander kant van die gelkolom versamel word. Proteïene sal dus geskei word op grond van hul grootte (Figuur 3.4).

    In die konteks van proteïensuiwering word die eluent gewoonlik in verskillende proefbuise saamgevoeg. Alle proefbuise wat geen meetbare spoor van die proteïen bevat om te suiwer word weggegooi. Die oorblywende oplossing word dus gemaak van die proteïen om te suiwer en enige ander soortgelyke proteïene.

    Figuur 3.4 Grootte -uitsluitingskromatografie. Ook bekend as Gel Filtration Chromatography, is 'n lae resolusie isolasie metode wat die gebruik van krale behels wat klein &ldquotunnels" in het wat elkeen 'n presiese grootte het. Daar word na die grootte verwys as 'n &ldquo-uitsluitingslimiet", wat beteken dat molekules bo 'n sekere molekulêre gewig nie in die tonnels sal pas nie. Molekules met groottes groter as die uitsluitingslimiet gaan nie die tonnels binne nie en gaan relatief vinnig deur die kolom deur hul pad tussen die krale te maak. Kleiner molekules wat die tonnels kan binnedring, doen dit en het dus 'n langer pad wat hulle deur die kolom loop. As gevolg hiervan sal molekules wat groter is as die uitsluitingslimiet, die kolom vroeër verlaat, terwyl kleiner molekules wat deur die krale gaan, later uit die kolom sal kom. Hierdie metode maak dit moontlik om molekules volgens hul grootte te skei.

    Hidrofobiese interaksiekromatografie (HIC)

    HIC media is amfifiel, met beide hidrofobiese en hidrofiliese streke, wat proteïene skei op grond van hul hidrofobiese oppervlakte. Doelproteïene en hul produksoortreksoorte het verskillende hidrofobiese eienskappe en die verwydering daarvan via HIC suiwer die proteïen van belang verder. Boonop het die gebruikte omgewing gewoonlik minder moeilike denatureringstoestande as ander chromatografie -tegnieke, wat die proteïen van belang in sy oorspronklike en funksionele toestand help behou. In suiwer water sal die interaksies tussen die hars en die hidrofobiese streke van proteïen baie swak wees, maar hierdie interaksie word versterk deur 'n proteïenmonster toe te pas op HIC-hars in hoë ioniese sterkte buffer. Die ioniese sterkte van die buffer word dan verminder om proteïene te elueer in volgorde van dalende hidrofobisiteit (Figuur 3.5).

    Figuur 3.5 Hidrofobiese interaksiechromatografie. Die kolommatriks, in blou getoon, het 'n hidrofobiese ligand wat kovalent geheg is. In hoë souttoestande bind proteïene met verskillende affiniteit aan die matriks, met meer hidrofobiese proteïene (in geel getoon) wat digter bind as meer hidrofiliese proteïene (in groen getoon) As die soutkonsentrasie verminder word, sal proteïene wat meer hidrofiel is eerste vrygestel, gevolg deur meer hidrofobiese proteïene.

    Ion -uitruilchromatografie

    Ionuitruilchromatografie skei verbindings volgens die aard en graad van hul ioniese lading. Die kolom wat gebruik gaan word, word gekies volgens die tipe en sterkte van die lading. Anioonuitruilharse het 'n positiewe lading en word gebruik om negatief gelaaide verbindings (anione) te behou en te skei, terwyl katioonuitruilharse 'n negatiewe lading het en gebruik word om positief gelaaide molekules (katione) te skei.

    Voordat die skeiding begin, word 'n buffer deur die kolom gepomp om die teenoorgestelde gelaaide ione te ewewig. Met die inspuiting van die monster sal opgeloste stofmolekules met die bufferione uitgeruil word aangesien elkeen kompeteer vir die bindingsplekke op die hars. Die lengte van retensie vir elke opgeloste stof hang af van die sterkte van sy lading. Die mees swak gelaaide verbindings sal eerste elueer, gevolg deur dié met opeenvolgende sterker ladings. As gevolg van die aard van die skeidingsmeganisme speel pH, buffertipe, bufferkonsentrasie en temperatuur almal belangrike rolle in die beheer van die skeiding.

    Figuur 3.6 toon 'n tipe ioonuitruilkolom bekend as a katioonuitruilkolom. In hierdie geval bestaan ​​die ondersteuning uit klein kraletjies waaraan chemikalieë wat 'n lading het, geheg is. Elke gelaaide molekule het 'n teenioon. Die figuur toon die krale (blou) met negatief gelaaide groepe (rooi) aan. In hierdie voorbeeld is die teenioon natrium, wat positief gelaai is. Die negatief gelaaide groepe kan vanweë hul kovalente binding nie die krale verlaat nie, maar die teenione kan verander word vir molekules van dieselfde lading. Dus, 'n katioonuitruilkolomsal positief gelaaide teenione hê en positief gelaaide verbindings wat in 'n mengsel deur die kolom voorkom, sal met die teenione en & ldquostick & quot na die negatief gelaaide groepe op die krale uitruil. Molekules in die monster wat neutraal of negatief gelaai is, sal vinnig deur die kolom beweeg. Aan die ander kant, in anioonuitruilchromatografie, die chemiese groepe wat aan die krale geheg is, is positief gelaai en die teenione is negatief gelaai. Molekules in die monster wat negatief gelaai is, sal &ldquostick" en ander molekules sal vinnig deurgaan. Om die molekules &ldquovas" na 'n kolom te verwyder, moet 'n mens eenvoudig 'n hoë konsentrasie van die toepaslike teenione byvoeg om hulle te verplaas en vry te stel. Met hierdie metode kan alle komponente van die mengsel wat dieselfde lading deel, herwin word.

    Ionuitruilchromatografie is 'n baie kragtige instrument vir proteïensuiwering en word gereeld gebruik in beide analitiese en voorbereidende skeidings.

    Figuur 3.6 Katioonuitruilchromatografie. In hierdie diagram is die negatief gelaaide molekules (in rooi getoon) kovalent geheg aan die kolommatrikskrale (in blou getoon). Natriumione (Na+) is die teenione wat deur positief gelaaide proteïene in die proteïenmengsel vervang word. Neutrale en negatief gelaaide proteïene kleef nie en gaan deur die kolom. Die positief gelaaide proteïene kan dan uit die kolom verwyder word deur hoër konsentrasies van die teenioon (in hierdie geval die natriumione) by te voeg.

    Affiniteitskromatografie is 'n skeidingstegniek gebaseer op molekulêre konformasie, wat gereeld toepassingspesifieke harse gebruik. Hierdie harse het ligande (klein molekules) wat aan hul oppervlaktes gekoppel is, wat spesifiek is vir en verbind sal word met die verbindings wat geskei moet word. Hierdie ligande funksioneer meestal op 'n manier soortgelyk aan dié van interaksie teenliggaam-antigeen. Hierdie "slot en sleutel" pas tussen die ligand en sy teikenverbinding maak dit hoogs spesifiek, wat gereeld 'n enkele piek genereer, terwyl al die ander in die monster nie teruggehou word nie (Figuur 3.7).

    Baie membraanproteïene is byvoorbeeld glikoproteïene en kan deur lektienaffiniteitschromatografie gesuiwer word. Wasmiddel-oplosbare proteïene kan toegelaat word om te bind aan 'n chromatografiehars wat gemodifiseer is om 'n kovalent aangehegte lektien te hê. Proteïene wat nie aan die lektien bind nie, word weggespoel en dan kan spesifiek gebonde glikoproteïene geëlueer word deur 'n hoë konsentrasie van 'n suiker by te voeg wat kompeteer met die gebonde glikoproteïene by die lektienbindingsplek. Sommige lektiene het 'n hoë affiniteitsbinding aan oligosakkariede van glikoproteïene wat moeilik is om met suikers te kompeteer, en gebonde glikoproteïene moet vrygestel word deur die lektien te denatureer.

    Figuur 3.7 Voorbeeld van Affiniteit Chromatografie. In hierdie voorbeeld het proteïen P1 affiniteit vir ligand Z en sal dit aan die kolom bind terwyl proteïene P2 en P3 deur die kolom gaan. Proteïen P1 kan dan uit die kolom geëlueer word deur hoë konsentrasies vry ligand Z te gebruik.

    'N Algemene tegniek behels die ontwerp van 'n reeks van 6 tot 8 histidienreste in die N- of C-terminale van 'n rekombinante proteïen. Die polihistidien bind sterk aan tweewaardige metaalione soos nikkel en kobalt. Die proteïen kan deur 'n kolom wat geïmmobiliseerde nikkelione bevat, wat die polyhistidien -etiket bind, oorgedra word. Alle ongemerkte proteïene gaan deur die kolom. Die proteïen kan geëlueer word met imidasool, wat kompeteer met die polihistidienmerker vir binding aan die kolom, of deur 'n afname in pH (tipies tot 4,5), wat die affiniteit van die merker vir die hars verlaag. Alhoewel hierdie prosedure algemeen gebruik word vir die suiwering van rekombinante proteïene met 'n gemanipuleerde affiniteitsmerker (soos 'n 6xHis merker), kan dit ook gebruik word vir natuurlike proteïene met 'n inherente affiniteit vir tweewaardige katione.

    Immunoaffiniteitschromatografie

    'n Spesiale tipe affiniteitschromatografie is Immunoaffiniteitschromatografie (Figuur 3.8).Hierdie tegniek gebruik die spesifieke binding van 'n teenliggaam met sy antigeen (teikenmolekule waarmee die teenliggaam selektief sal bind) om die proteïen van belang te suiwer. Die prosedure behels die immobilisering van 'n teenliggaam teen 'n soliede substraat (bv. 'n poreuse kraal of 'n membraan), wat dan die teiken selektief bind, terwyl alles anders deurvloei. Die teikenproteïen kan geëlueer word deur die pH of die soutgehalte te verander. Die geïmmobiliseerde ligand kan 'n teenliggaam wees (soos Immunoglobulien G) of dit kan 'n proteïen (soos Proteïen A) wees. Omdat hierdie metode nie tegniek in 'n etiket behels nie, kan dit gebruik word vir proteïene uit natuurlike bronne. Teenliggaampiesstruktuur en hul gebruik in proteïenidentifikasie sal in meer besonderhede in Afdeling 3.2 bespreek word.

    Figuur 3.8. 'n Antigeen Immunopresipitasie-eksperiment. Die teenliggaam word óf vooraf geïmmobiliseer na 'n soliede ondersteuning (links) óf geïmmobiliseer deur gebruik te maak van teenliggaambindende proteïene na inkubasie met die monster (regs). Immobilisasie laat toe dat die immuunkompleks uit die komplekse monster onttrek word, gewas en elueer, wat 'n hoë verryking van die proteïen wat ondersoek word, verkry

    Terug na bo

    Hoëprestasie vloeistofchromatografie (HPLC) en vinnige proteïen vloeistofchromatografie (FPLC)

    Vloeistofchromatografie of hoë druk vloeistofchromatografie (HPLC)is 'n vorm van chromatografie wat hoë druk toepas om die opgeloste stowwe vinniger deur die kolom te dryf. Dit beteken dat die verspreiding beperk is en die resolusie verbeter word. Die mees algemene vorm is 'teruggekeerde fase' HPLC, waar die kolom materiaal hidrofobies is. Die proteïene word geëlueer deur 'n gradiënt van water en toenemende hoeveelhede van 'n organiese oplosmiddel, soos asetonitril. Die proteïene elueer volgens hul hidrofobisiteit. Na suiwering deur HPLC is die proteïen in 'n oplossing wat slegs vlugtige verbindings bevat, en maklik kan wees gevriesdroog (gevriesdroog). HPLC -suiwering lei gereeld tot denaturasie van die gesuiwerde proteïene en is dus nie van toepassing op proteïene wat nie spontaan hervou nie.

    As gevolg van die nadele van HPLC, is 'n alternatiewe tegniek met 'n laer drukstelsel ontwikkel en word genoem Vinnige proteïen vloeistofchromatografie (FPLC). FPLC is 'n vorm van vloeistofchromatografie wat dikwels gebruik word om mengsels van proteïene te ontleed of te suiwer. Soos met ander vorme van chromatografie, is skeiding moontlik omdat die verskillende komponente van 'n mengsel verskillende affiniteite het vir twee materiale, 'n bewegende vloeistof (die "mobiele fase") en 'n poreuse vaste stof (die stilstaande fase). In FPLC is die mobiele fase 'n waterige oplossing, of "buffer". Die buffervloeisnelheid word beheer deur 'n pomp met positiewe verplasing en word normaalweg konstant gehou, terwyl die samestelling van die buffer gewissel kan word deur vloeistowwe in verskillende verhoudings uit twee of meer eksterne reservoirs te trek. Die stilstaande fase is 'n hars wat bestaan ​​uit krale, gewoonlik van kruisgebonde agarose, wat in 'n silindriese glas- of plastiekkolom verpak is. Afhangende van die toepassing, is FPLC -harse beskikbaar in 'n wye verskeidenheid kralgroottes en oppervlakligande.

    In die mees algemene FPLC-strategie word 'n ioonuitruilhars tipies gekies (Figuur 3.9). 'n Mengsel wat een of meer proteïene van belang bevat, word in 100% buffer A opgelos en in die kolom gepomp. Die proteïene van belang bind aan die hars terwyl ander komponente in die buffer uitgevoer word. Die totale vloeitempo van die buffer word egter konstant gehou, maar die verhouding van buffer B (die & quotelution & quot buffer) word geleidelik verhoog van 0% tot 100% volgens 'n geprogrammeerde konsentrasieverandering (die & quotgradient & quot). Buffer B bevat hoë konsentrasies van die wisselaarioon. Soos die konsentrasie van die Buffer B dus geleidelik toeneem, sal gebonde proteïene dissosieer afhangende van hul ioniese interaksies met die kolommatriks en verskyn in die eluant. Die eluent gaan deur twee detektore wat die soutkonsentrasie (deur geleidingsvermoë) en die proteïenkonsentrasie meet (deur absorpsie van ultraviolet lig by 'n golflengte van 280 nm). Soos elke proteïen geëlueer word, verskyn dit in die eluant as 'n "piek" in proteïenkonsentrasie en kan versamel word vir verdere gebruik.

    FPLC is in 1982 deur Pharmacia in Swede ontwikkel en bemark en is oorspronklik genoem vinnige werkverrigting vloeistofchromatografie om dit te kontrasteer met HPLC of hoëprestasie vloeistofchromatografie. FPLC word oor die algemeen slegs op proteïene toegedien, vanweë die wye keuse van harse en buffers het dit breë toepassings. In teenstelling met HPLC is die bufferdruk wat gebruik word relatief laag, tipies minder as 5 bar, maar die vloeitempo is relatief hoog, tipies 1-5 ml/min. FPLC kan maklik afgeskaal word van ontleding van milligram mengsels in kolomme met 'n totale volume van 5 ml of minder tot industriële produksie van kilogram gesuiwerde proteïen in kolomme met volumes van baie liter.

    Figuur 3.9 Tipiese FPLC -stelsel. A. Skema van basiese komponente en tipiese vloei -pad vir 'n chromatografiestelsel. B. Picrue van GE Healthcare AKTA FPLC-apparaat.

    Suiweringskema

    Tydens die proteïensuiweringsproses is dit nodig om 'n kwantitatiewe stelsel te hê om te bepaal hoeveel proteïen gesuiwer is, watter konsentrasie die proteïen uit die oorspronklike mengsel verteenwoordig, hoe biologies aktief die gesuiwerde proteïen is, en die algehele suiwerheid van die proteïen. Dit sal help om die suiweringsmetode wat ontwikkel word, te lei en te optimaliseer. Oneffektiewe skeidingstegnieke kan buite rekening gelaat word en ander tegnieke wat 'n hoër opbrengs lewer of die biologiese aktiwiteit van die proteïen behou, kan gebruik word.

    Elke stap in die suiweringskema word dus kwantitatief geëvalueer vir die volgende parameters: totale proteïen, totale aktiwiteit, spesifieke aktiwiteit, opbrengs, suiweringsvlak. Elkeen van hierdie parameters sal gedefinieer word binne die voorbeeldprotokol wat hieronder gegee word.

    Maak asof jy 'n navorser is wat 'n nuwe, onbekende proteïen van 'n bakteriekultuur wil isoleer. Jy kweek 500 ml van die bakterieë oornag by 37 o C en oes die bakterieë deur sentrifugering. U verwyder die kweekbouillon en behou die bakteriese korrel. U ontlont die bakterieë dan met vries/ontdooi in 10 ml reaksiebuffer. U sentrifugeer dan die gelyseerde bakterieë om die onoplosbare materiale te verwyder en behou die supernatant wat die oplosbare proteïene bevat. U proteïen van belang het 'n biologiese aktiwiteit wat u kan meet met behulp van 'n eenvoudige toets wat 'n kleurverandering in die reaksiemengsel veroorsaak (Figuur 3.10). U merk ook op dat hierdie reaksietempo toeneem met toenemende konsentrasies van u proteïen -supernatant (Figuur 3.10)

    Figuur 3.10. Voorbeeld van 'n chemiese reaksie wat 'n kleurverandering van oranje na bruin veroorsaak, afhangende van toenemende konsentrasie.

    Op hierdie punt kan jy jou basislynkonsentrasies meet vir die eerste suiweringsvlak (bakteriële lise en verwydering van onoplosbare proteïene en ander sellulêre puin deur sentrifugering).

    Totale proteïene word bereken deur die konsentrasie in 'n fraksie van u monster te meet en dit dan te vermenigvuldig met die totale volume van u monster. In hierdie geval begin u met 10 ml supernatant. In 'n tipiese toets om die proteïenkonsentrasie te meet, gebruik u 50 - 200 & muL monster om die proteïenkonsentrasie te bepaal. Byvoorbeeld, as jy bereken dat daar 7,5 &mug/&muL in jou aanvanklike toets is, sal jy daardie waarde in mg/ml moet omskakel en dit dan met 10 mL vermenigvuldig vir 'n totaal van 75 mg proteïen in 10 mL supernatant ( Tabel 3.1)

    Totale aktiwiteitword gemeet as die ensiemaktiwiteit in die toets, vermenigvuldig met die totale volume van die monster. Byvoorbeeld, in die aanvanklike monster kan u 5 tot 50 ml oplossing in u biologiese reaksie gebruik (Figuur 3.10). As u die aktiwiteit in u toets tot 2,5 eenhede/ml bereken het, sou dit gelykstaande wees aan 2500 eenhede/ml of 25 000 eenhede/10 ml supernatant. Let daarop dat die ensiem eenheid, of internasionale eenheid vir ensiem (simbool U, soms ook IU) is a eenheid van ensiem se katalitiese aktiwiteit. 1 U (&mumol/min) word gedefinieer as die hoeveelheid van die ensiem wat die omskakeling van een mikromol substraat per minuut onder die gespesifiseerde toestande van die toetsmetode kataliseer.

    Spesifieke aktiwiteitword gemeet deur die totale aktiwiteit deur die totale proteïen te deel. In ons voorbeeld is 25 000 eenhede gedeel deur 75 mg proteïen = 333,3 eenhede/mg.

    Opbrengs is 'n maatstaf van die biologiese aktiwiteit wat in die monster na elke suiweringstap behoue ​​bly. Die bedrag in die eerste stap is 100%. Alle daaropvolgende opbrengsstappe sal deur die eerste suiweringstap geëvalueer word. Dit word bereken deur die totale aktiwiteit van die huidige stap te deel, deur die totale aktiwiteit van die eerste stap en dan vermenigvuldig met 100.

    Suiweringsvlakevalueer die suiwerheid van die proteïen van belang deur die spesifieke aktiwiteit wat na elke suiweringstap bereken is, te deel deur die spesifieke aktiwiteit van die eerste suiweringstap. Die eerste stap het dus altyd 'n waarde van 1.

    Tabel 3.1 Tipiese Proteïensuiweringskema

    Let daarop dat na elke suiweringstap die Totale proteïen daal, terwyl u u proteïen suiwer van ander proteïene in die mengsel. Totale aktiwiteit gaan ook af met elke suiweringstap, aangesien sommige van u proteïene van belang ook by elke suiweringstap verlore gaan, omdat (1) sommige proteïene by die proefbuise en glasware sal plak, (2) sommige proteïene sal nie met 100% bind nie doeltreffendheid vir u kolommatriks, (3) sommige proteïene kan te styf bind om tydens die eluering uit die kolommatriks verwyder te word, en (4) sommige proteïene kan tydens die suiweringsproses gedenatureer of afgebreek word.

    Die hoeveelheid proteïene wat u belangstel, word verlore, word in die geheel aangetoon persent opbrengsvir elke suiweringsstap. As die persent opbrengs is te laag alternatiewe suiweringsmetodes moet ondersoek word.

    Let daarop dat in 'n goeie proteïensuiweringskema die spesifieke aktiwiteit behoort aansienlik toe te neem met elke suiweringsvlak aangesien die hoeveelheid van jou proteïen van belang 'n groter persentasie van die totale proteïen binne daardie fraksie uitmaak. As die spesifieke aktiwiteit slegs beskeie toeneem binne 'n suiweringstap, of as dit afneem tydens 'n suiweringstap, kan dit daarop dui dat (1) u proteïen van belang aansienlik verlore gaan tydens daardie stap, (2) dat u proteïen van belang is gedenatureer of afgebreek en is nie meer biologies aktief nie, of (3) dat 'n vereiste kofaktor of bindingsproteïen tydens die suiweringstap verminder word. Bykomende eksperimente moet moontlik uitgevoer word om te bepaal watter een van die oorsake die oorheersende is, sodat stappe gedoen kan word om die inaktivering van proteïene te verminder. Baie proteïene is byvoorbeeld temperatuurgevoelig en sal by kamertemperatuur afbreek of denatureer. Die voltooiing van suiweringsstappe op ys kan dikwels agteruitgang verminder.

    Oor die algemeen neem die vou toe suiweringsvlak behoort eksponensieel toe te neem tydens die suiweringsproses. Let daarop dat as ons proteïene na vier suiweringstappe na 95% suiwer is, dit in ons voorbeeld dui dat ons proteïen van belang ongeveer 1,24% van die totale proteïen in die monster uitmaak.

    Terug na bo

    3.2 Proteïenidentifikasie en visualisering

    Analitiese tegnieke wat gebruik kan word om 'n proteïen van belang binne 'n mengsel positief te identifiseer of te visualiseer, kan ook 'n waardevolle hulpmiddel wees om die biologiese aktiwiteit en betekenis van 'n proteïen binne 'n lewende sisteem te verstaan ​​en kan ook gebruik word om proteïensuiweringskemas te help lei.

    Gel elektroforese

    Agarose is 'n natuurlike lineêre polimeer wat uit seewier onttrek word wat 'n jelmatriks vorm deur waterstofbinding wanneer dit in 'n buffer verhit word en toegelaat word om af te koel. Vir die meeste toepassings is slegs 'n enkel-komponent agarose nodig en geen polimerisasie katalisators word benodig nie (Figuur 3.11). Daarom is agarose-gels eenvoudig en vinnig om voor te berei. Hulle is die gewildste medium vir die skeiding van matige en groot nukleïensure en het 'n wye reeks skeiding, maar 'n relatief lae oplosvermoë, aangesien die bande wat in die gels gevorm word, geneig is om vaag te wees en uitmekaar te sprei. Dit is die gevolg van poriegrootte en kan nie grootliks beheer word nie. Hierdie en ander voordele en nadele van die gebruik van agarosegels vir elektroforese word in Tabel 3.2 opgesom. Agarose -gels word nie tipies vir proteïenmonsters gebruik nie en sal nie verder in hierdie hoofstuk bespreek word nie. Dit sal egter hersien word in hoofstuk 5 wat nukleïensuurtegnieke dek.

    Tabel 3.2. Voordele en nadele van Agarose Gel Elektroforese.

    Poliakrielamiedgels is chemies kruisgekoppelde gels wat gevorm word deur die polimerisasie van akrilamied met 'n kruisbindingsmiddel, gewoonlik N,N&rsquo-metileenbisakrielamied (Figuur 3.11). Die reaksie is 'n vryradikale polimerisasie, gewoonlik uitgevoer met ammoniumpersulfaat as die inisieerder en N, N, N & rsquo, N & rsquo-tetramethylethylendiamine (TEMED) as die katalisator. Alhoewel die gels oor die algemeen moeiliker is om voor te berei en te hanteer, wat langer bereidingstyd behels as agarosegel, het dit groot voordele bo agarosegel. Hulle het 'n groter oplosvermoë, kan groter hoeveelhede monster akkommodeer sonder 'n noemenswaardige verlies aan resolusie en die suiwerheid van die monster wat uit poliakrylamiedgels herwin word, is uiters hoog. Boonop kan die poriegrootte van die poliakrylamiedgels op 'n maklike en beheerbare manier verander word deur die konsentrasies van die twee monomere te verander. Dit word dus algemeen gebruik om proteïene en kleiner fragmente van DNA te skei. Daar moet op gelet word dat poliakrylamied 'n neurotoksien is (as dit nie gepolymeriseer is nie), maar met behoorlike laboratoriumsorg is dit nie gevaarliker as verskillende chemikalieë wat gereeld gebruik word nie. 'N Paar voordele en nadele van die gebruik van poliakrylamiedgels vir elektroforese word in tabel 3.3 uitgebeeld.

    Tabel 3.3. Voordele en nadele van poliakrielamiedgelelektroforese.

    Gehidreerde gelnetwerke het baie wenslike eienskappe vir elektroforese. Hulle laat 'n wye verskeidenheid meganies stabiele eksperimentele formate toe, soos horisontale/vertikale elektroforese in bladgels of elektroforese in buise of kapillêre. Die meganiese stabiliteit vergemaklik ook post-elektroforetiese manipulasie, wat verdere eksperimentering moontlik maak, soos blotting, elektro-eluering of massaspektrale identifikasie /vingerafdruk van ongeskonde proteïene of proteïene wat in gelskywe verteer word. Aangesien gels wat in biochemie gebruik word, chemies redelik onreaktief is, reageer hulle minimaal met biomolekules tydens elektroforese, wat skeiding moontlik maak op grond van fisiese eerder as chemiese verskille tussen monsterkomponente.

    Figuur 3.11 Gels wat algemeen in elektroforese gebruik word. (A) Agarose bestaan ​​uit agarbiose, (B) Die polimerisasie van akrylamied en bisakrylamied om poliakrylamiedgel te vorm. Die polimerisasiereaksie word deur persulfaatradikale geïnisieer en deur TEMED gekataliseer.

    Gelelektroforese van proteïene met 'n poliakrylamiedmatriks, algemeen genoem poliakrielamiedgelelektroforese (PAGE)is ongetwyfeld een van die mees gebruikte tegnieke om komplekse proteïenmengsels te kenmerk. Dit is 'n maklike, vinnige en goedkoop metode omdat dit slegs die hoeveelheid proteïene in mikrogram benodig.

    Die proteïene het 'n netto elektriese lading as hulle in 'n medium is met 'n pH anders as hul isoelektriese punt en het dus die vermoë om te beweeg wanneer hulle aan 'n elektriese veld blootgestel word. Die migrasiesnelheid is eweredig aan die verhouding tussen die ladings van die proteïen en die massa daarvan. Hoe hoër lading per massa-eenheid, hoe vinniger is die migrasie.

    Proteïene het nie 'n voorspelbare struktuur as nukleïensure nie, en hul migrasietempo's is dus nie soortgelyk aan mekaar nie. Verder migreer hulle nie wanneer 'n elektromotoriese krag toegepas word nie, as die pH van die stelsel dieselfde is as die isoelektriese punt. PAGE gels wat op hierdie manier bestuur word, word genoem Inheems BLADSY, aangesien die proteïene steeds gevou word in hul oorspronklike toestand gevind in vivo. In hierdie situasie migreer proteïene volgens hul lading, grootte en vorm.

    Alternatiewelik kan proteïene gedenatureer word voor elektroforese. Die mees algemene manier om die proteïene te denatureer, is deur 'n skoonmaakmiddel soos natriumdodecylsulfaat (SDS) by te voeg. Dit ontken nie net die proteïene nie, maar dit bedek ook die proteïen met 'n negatiewe lading, sodat al die proteïene na die positiewe lood sal loop wanneer dit in 'n elektriese veld geplaas word. Daar word na hierdie tipe elektroforese verwys SDS-BLADSY en skei proteïene uitsluitlik volgens molekulêre gewig. SDS is 'n reduktiemiddel wat disulfiedbindings verbreek, die proteïen in sy sub-eenhede skei en ook 'n netto negatiewe lading gee wat hulle in staat stel om deur die gel te migreer in direkte verhouding tot hul grootte. Daarbenewens veroorsaak denaturasie dat hulle hul tersiêre struktuur verloor en die migrasiesnelheid is dus eweredig aan die grootte en nie aan die tersiêre struktuur nie.

    Opsporing van proteïene in gels

    Proteïene wat op 'n poliakrylamiedgel geskei word, kan op verskillende maniere opgespoor word, byvoorbeeld kleurstowwe en silwer vlekke (Figuur 3.12).

    Met die Coomassie -blou kleuring kan tot 0,2 tot 0,6 en mikrogram proteïen opgespoor word, en is kwantitatief (lineêr) tot 15 tot 20 & mikrogram. Dit word dikwels gebruik in metanol-asynsuuroplossings en word verkleur in isopropanol-asynsuuroplossings (Fig. 1 A). Vir die kleuring van 2-DE-gels word aanbeveel om amfoliete te verwyder deur trichloorasyn (TCA) by die kleurstof te voeg en dan met asynsuur te verkleur.

    Dit is 'n alternatief vir roetine -kleuring van proteïengele (sowel as nukleïensure en lipopolisakkariede), want dit is maklik om te gebruik en 'n hoë sensitiwiteit (50 tot 100 keer meer sensitief as Coomassie -blou kleuring) (Fig. 1 B). Hierdie kleurtegniek is veral geskik vir tweedimensionele gels.

    Die outoradiografie is 'n opsporingstegniek van radioaktief gemerkte molekules wat fotografiese emulsies gebruik wat sensitief is vir radioaktiewe deeltjies of lig wat deur 'n intermediêre molekule geproduseer word. Die emulsie wat silwer bevat, is sensitief vir deeltjiesstraling (alfa, beta) of elektromagnetiese straling (gamma, lig. ), sodat dit as metaalsilwer presipiteer. Die emulsie sal ontwikkel as donker neerslae in die gebied waarin radioaktiewe proteïene opgespoor word.

    Figuur 3.12. SDS-BLADSY. Proteïene geskei op SDS-PAGE en opgespoor deur Coomassie blou (A) en silwer kleuring (B). Standaarde van proteïene om die molekulêre gewig te ken, word ook aan die kante gelaai.

    Isoelektriese fokus

    Hierdie tegniek is gebaseer op die beweging van molekules in 'n pH -gradiënt. Amfoteriese molekules soos aminosure en proteïene word geskei in 'n omgewing waar daar 'n verskil van potensiaal en pH-gradiënt is. Die area van die anode (+) is suur en die katode (-) is alkalies. Tussen hulle 'n pH -gradiënt af sodat die molekules wat geskei moet word, hul iso -elektriese punt binne die omvang het. Stowwe wat aanvanklik in streke is met 'n pH onder die isoelektriese punt, word positief gelaai en migreer na die katode, terwyl die wat in media is met 'n pH laer as sy pI, negatiewe lading sal hê en na die anode migreer (Figuur 3.13).Die migrasie sal lei tot 'n gebied waar die pH saamval met sy pI, 'n nul netto lading het (vorm zwitterione) en stop. Amfoteriese molekules is dus geleë in smal bande waar die pI saamval met die pH. In hierdie tegniek is die toedieningspunt nie van kritieke belang nie, aangesien molekules altyd na hul pI -gebied sal beweeg. Die stabiele pH -gradiënt tussen die elektrodes word verkry met behulp van 'n mengsel van amfoliete met 'n lae molekulêre gewig, wat pI 'n voorafbepaalde pH bereik.

    Figuur 3.13. Iso-elektriese fokus. 'N pH -gradiënt word in 'n gel vasgestel voordat die monster gelaai word. Nadat die monster gelaai is, word 'n spanning toegepas. Die proteïen migreer na hul iso -elektriese pH, wat geen netto lading het nie.

    Tweedimensionele gelelektroforese

    Tweedimensionele gelelektroforese (2-DE) is gebaseer op die skeiding van 'n mengsel van proteïene volgens twee molekulêre eienskappe, een in elke dimensie. Die mees gebruikte is gebaseer op 'n eerste dimensie skeiding deur iso-elektriese fokus en tweede dimensie volgens molekulêre gewig deur SDS-PAGE (Figuur 3.14).

    Die algemene werkvloei in 'n 2-DE eksperiment sal wees:

    Die metode van monstervoorbereiding hang af van die doel van die navorsing en is van kardinale belang vir die sukses van die eksperiment. Faktore soos die oplosbaarheid, grootte, lading en isoelektriese punt (pI) van die proteïene wat van belang is, tree in die monstervoorbereiding. Voorbereiding van monsters is ook belangrik om die kompleksiteit van 'n proteïenmengsel te verminder. Die proteïenfraksie wat op 'n 2-DE-gel gelaai moet word, moet in 'n denaturerende buffer met 'n lae ioniese sterkte wees wat die inheemse ladings van proteïene handhaaf en dit oplosbaar hou.

    Hierdie deel word uitgevoer deur IEF. Deur hierdie tegniek te gebruik, word proteïene geskei op grond van hul pI, die pH waarteen 'n proteïen geen netto lading dra nie en nie in 'n elektriese veld migreer nie.

    'n Kondisioneringstap word toegepas op proteïene wat deur IEF geskei word voor die tweede-dimensie-lopie. Hierdie proses verminder disulfiedbindings en alkyleer die resulterende sulfhidrielgroepe van die sistienresidue. Terselfdertyd word proteïene met SDS bedek vir skeiding op grond van molekulêre gewig.

    Hierdie deel word deur SDS-PAGE uitgevoer. Die keuse vir die gel hang af van die proteïenmolekulêre gewigsbereik wat geskei moet word. Die vermoë om baie gels op dieselfde tyd en onder dieselfde omstandighede te laat loop, is belangrik vir die doel van gel-tot-gel-vergelyking.

    Om proteïene in gels te visualiseer, moet dit op een of ander manier gekleur word. Die keuse van kleurmetode word bepaal deur verskeie faktore, insluitend gewenste sensitiwiteit, lineêre omvang, gebruiksgemak, koste en die tipe beeldtoerusting wat beskikbaar is. Tans is daar geen ideale universele vlek nie. Soms word proteïene opgespoor na oordrag na 'n membraanondersteuning deur Western blotting, wat hieronder in meer besonderhede beskryf word.

    Die vermoë om data in digitale vorm in te samel is een van die belangrikste faktore wat 2-DE-gels in staat stel om 'n praktiese manier te wees om proteoom-inligting in te samel. Dit laat onbevooroordeelde vergelyking van gels en katalogisering van enorme hoeveelhede data toe. Baie soorte beeldtoestelle koppel aan sagteware wat spesifiek ontwerp is om proteomika -data te versamel, te interpreteer en te vergelyk. Een van die grootste probleme in 2-DE is die ontleding en vergelyking van komplekse mengsels van proteïene. Tans is daar databasisse wat tweedimensionele jelpatrone kan vergelyk. Hierdie stelsels maak outomatiese vergelyking van plekke moontlik vir die presiese identifisering van die wat nodig is in die kwantitatiewe analise.

    Sodra interessante proteïene geselekteer is deur differensiële analise of ander kriteria, kan die proteïene uit gels gesny word, gekleur en verteer word om hul identifikasie deur massaspektrometrie voor te berei. Hierdie tegniek staan ​​bekend as peptied massa vingerafdrukke. Die vermoë om presies te bepaal molekulêre gewig deur matriks-gesteunde laser desorpsie/ionisasie-tyd van vlug massaspektrometrie (MALDI-TOF MS) en om databasisse te soek vir peptied massa passings het hoë-deurset proteïen identifikasie moontlik gemaak. Proteïene wat nie deur MALDI-TOF geïdentifiseer word nie, kan geïdentifiseer word deur volgordemerking of de novo volgordebepaling deur gebruik te maak van die Q-TOF elektrosproei LC-MS-MS.

    Fig. 3.14 Tweedimensionele gelelektroforese. Proteïene van Chlamydomonas reinhardtii opgelos deur 2-DE uit voorbereidende gels gekleur met MALDI-MS-versoenbare silwerreagens vir peptiedmassa-vingerafdruk-analise. Eerste dimensie: iso-elektriese fokus in 'n 3-11 pH-gradiënt. Tweede dimensie: SDS-PAGE in 'n 12% akrielamied (2.6% kruisbinding) jel (1.0 mm dik). Genommerde kolle gemerk met sirkel stem ooreen met proteïene in vergelyking om daarna deur MALDI-TOF MS geïdentifiseer te word. Die MALDI-TOF MS-analise van proteïenvolgordes word in meer besonderhede in afdeling 3.3 hieronder bespreek.

    Terug na bo

    Teenliggaamstruktuur en -produksie

    An teenliggaam, ook bekend as 'n immunoglobulien (Ig), is 'n proteïen wat deur plasmaselle geproduseer word na stimulasie deur 'n antigeen. Teenliggaampies is die funksionele basis van humorale immuniteit. Teenliggaampies kom in die bloed, in maag- en slymafskeidings en in borsmelk voor. Teenliggaampies in hierdie liggaamsvloeistowwe kan patogene bind en dit merk vir vernietiging deur fagosiete voordat hulle selle kan besmet. Die molekule wat deur 'n teenliggaam gebind word, word die genoem antigeen. Teenliggaampies is hoogs spesifiek vir 'n enkele antigeen of 'n groep antigene wat sterk bewaarde strukturele kenmerke deel. Proteïene kan optree as antigene wat deur teenliggaampies herken word. Op die gebied van biochemie en molekulêre biologie word teenliggaampies dus as belangrike hulpmiddels gebruik wat ons help om die funksie en uitdrukkingspatroon van proteïene te bepaal. Hulle kan ook terapeuties gebruik word in die behandeling van siektes soos kanker.

    Teenliggaam struktuur

    Die mees algemene tipe teenliggaam wat in biochemiese metodologieë gebruik word, staan ​​bekend as immunoglobulien G (IgG) en sal die fokus van hierdie afdeling wees. 'N IgG -teenliggaammolekule bestaan ​​uit vier polipeptiede: twee identiese swaar kettings (groot peptied -eenhede) wat gedeeltelik aan mekaar gebind is in 'n formasie, wat deur twee identiese ligte kettings (klein peptiedeenhede) geflankeer word, soos geïllustreer in figuur 3.15 . Bindings tussen die sisteïen-aminosure in die teenliggaammolekule heg die polipeptiede aan mekaar. Die gebiede waar die antigeen op die teenliggaam herken word, is veranderlike domeine en die teenliggaambasis bestaan ​​uit konstante domeine.

    Figuur 3.15 Immunoglobulien G (IgG) struktuur (a) Namate 'n kiemlyn B-sel ryp word, sny 'n ensiem genaamd DNA-rekombinase V- en J-segmente lukraak uit die ligkettinggeen. Splitsing op die mRNA-vlak lei tot verdere geenherrangskikking. As gevolg hiervan, (b) produseer elke volwasse B-sel 'n enkele teenliggaam wat 'n unieke veranderlike gebied het wat in staat is om 'n ander antigeen te bind.

    In kiemlyn B-selle het die veranderlike gebied van die ligkettinggeen 40 veranderlike (V) en vyf verbindende (J) segmente. 'n Ensiem genaamd DNA-rekombinase sny die meeste van hierdie segmente lukraak uit die geen tydens B-sel rypwording, en splits een V-segment aan een J-segment. Tydens RNA -verwerking word alles behalwe een V- en J -segment uitgesluit. Herkombinasie en splitsing kan lei tot meer as 10 6 moontlike VJ-kombinasies! As gevolg hiervan het elke gedifferensieerde B-sel in die menslike liggaam tipies 'n unieke veranderlike ketting wat 'n unieke antigeen sal herken. Die konstante domein, wat nie teenliggaampies bind nie, is dieselfde vir alle teenliggaampies.

    Vervaardiging van poliklonale teenliggaampies

    Teenliggaampies wat vir navorsings- en diagnostiese doeleindes gebruik word, word dikwels verkry deur 'n laboratoriumdier soos 'n konyn of 'n bok met 'n spesifieke antigeen. Binne 'n paar weke produseer die dier se immuunstelsel hoë vlakke van teenliggaampies spesifiek vir die antigeen. Hierdie teenliggaampies kan in 'n antiserum, wat heel serum is wat uit 'n dier versamel word na blootstelling aan 'n antigeen. Omdat die meeste antigene komplekse strukture met veelvuldige epitope is, lei dit tot die produksie van veelvuldige teenliggaampies in die proefdier. Hierdie sogenaamde poliklonale teenliggaam reaksie is ook tipies van die reaksie op infeksie deur die menslike immuunstelsel. Antiserum wat van 'n dier afkomstig is, bevat dus teenliggaampies van verskeie klone B -selle, elke B -sel reageer op 'n spesifieke epitoop op die antigeen (Figuur 3.16).

    Figuur 3.16. Poliklonale teenliggaamproduksie. Hierdie diagram illustreer die proses vir die oes van poliklonale teenliggaampies wat in reaksie op 'n antigeen geproduseer word.

    Labdiere word gewoonlik ten minste twee keer met antigeen ingespuit wanneer dit gebruik word om antiserum te produseer. Die tweede inspuiting aktiveer geheueselle wat klas maak IgG teenliggaampies teen die antigeen. Die geheueselle ondergaan ook affiniteit rypwording, lei tot 'n poel van teenliggaampies met hoër gemiddelde affiniteit. Affiniteit rypwording vind plaas as gevolg van mutasies in die immunoglobulien geen veranderlike streke, wat lei tot B-selle met effens veranderde antigeen-bindingsplekke. By herblootstelling aan die antigeen, sal daardie B-selle wat in staat is om teenliggaampies te produseer met 'n hoër affiniteit antigeen-bindingsplekke gestimuleer word om te prolifereer en meer teenliggaampies te produseer as hul laer-affiniteit eweknieë. An byvoegmiddel, Dit is 'n chemiese middel wat 'n algemene aktivering van die immuunstelsel veroorsaak wat 'n groter teenliggaamproduksie stimuleer, en word dikwels met die antigeen gemeng voor inspuiting.

    Antiserum wat van diere verkry word, bevat nie net teenliggaampies teen die antigeen wat kunsmatig in die laboratorium bekendgestel word nie, maar dit bevat ook teenliggaampies teen ander antigene waaraan die dier tydens sy leeftyd blootgestel is. Om hierdie rede moet antisera eers gekeur word en ander teenliggaampies verwyder word voordat die teenliggaampies vir navorsing of diagnostiese toetse gebruik word.

    Produksie van monoklonale teenliggaampies

    Sommige tipes toetse vereis beter teenliggaamspesifisiteit en affiniteit as wat verkry kan word met 'n poliklonale antiserum. Om hierdie hoë spesifisiteit te bereik, moet al die teenliggaampies met hoë affiniteit aan 'n enkele epitoop bind. Hierdie hoë spesifisiteit kan verskaf word deur monoklonale teenliggaampies (mAbs). Tabel 3.4 vergelyk sommige van die belangrike kenmerke van monoklonale en poliklonale teenliggaampies.

    Tabel 3.4 Vergelyking van monoklonale en poliklonale teenliggaampies

    Anders as poliklonale teenliggaampies, wat in lewende diere geproduseer word, word monoklonale teenliggaampies geproduseer in vitro weefselkultuurtegnieke te gebruik. mAbs word geproduseer deur 'n dier, dikwels 'n muis, verskeie kere met 'n spesifieke antigeen te immuniseer. B -selle uit die milt van die geïmmuniseerde dier word dan verwyder. Aangesien normale B -selle nie vir ewig kan vermeerder nie, word hulle versmelt met onsterflike, kankeragtige B -selle wat myeloomselle genoem word, om op te lewer hybridoom selle. Al die selle word dan in 'n selektiewe medium geplaas wat net die hibridomas toelaat om ongefuseerde myeloomselle te laat groei, kan nie groei nie, en enige ongefuseerde B-selle sterf af. Die hybridome, wat in staat is om voortdurend in kultuur te groei terwyl antiliggame vervaardig word, word dan vir die gewenste mAb gesif. Diegene wat die gewenste mAb produseer, word gekweek in weefselkweek, die kweekmedium word gereeld geoes en mAbs word uit die medium gesuiwer. Dit is 'n baie duur en tydrowende proses. Dit kan weke se verbouing en baie liters media neem om genoeg mAbs te verskaf vir 'n eksperiment of om 'n enkele pasiënt te behandel. mAbs is duur (Figuur 3.17).

    Figuur 3.17. Monoklonale teenliggaampies (mAbs) word geproduseer deur 'n antigeen aan 'n muis in te voer en dan poliklonale B-selle van die muis se milt na myeloomselle te smelt. Die resulterende hybridomaselle word gekweek en produseer steeds teenliggaampies teen die antigeen. Hybridome wat die gewenste mAb produseer, word dan in groot getalle verbou op 'n selektiewe medium wat periodiek geoes word om die gewenste mAb te verkry.

    Terug na bo

    Ensiem-gekoppelde immunosorbente toets (ELISA) en mikroskikkings

    Sedert die heel eerste gebruik van teenliggaampies vir die opsporing van antigene, is baie verskillende tegnologieë ontwikkel wat gebruik maak van die teenliggaampies se vermoë om aan ander molekules te bind. Gedurende die 1950's het die wetenskaplikes Yalow en Berson 'n metode ontwikkel waar radioaktiwiteit gebruik word om die hoeveelheid analiet in 'n oplossing te bepaal. Hierdie sogenaamde 'radioimmunoassay' (RIA), waarvoor Yarlow in 1977 die Nobelprys ontvang het, was 'n baie sensitiewe metode vir die opsporing van hormone, maar die gebruik van radioaktiwiteit vir die opsporing van antigeen is nie veilig en geskik vir algemene gebruik nie. Daarom is 'n alternatiewe prosedure ontwikkel deur ensieme aan teenliggaampies te koppel in plaas van 'n radioaktiewe molekule, en deur molekules aan oppervlaktes te kleef. In een van die deesdae mees algemene toepassings vandag is die meting van die hoeveelheid van 'n biomolekule in 'n monster deur "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA). Hierdie term verwys oorspronklik na die gebruik van 'n ensiem om 'n interaksie tussen 'n teenliggaam en sy bindingsvennoot aan te meld (Gan & amp Patel, 2013). Die grondslag vir Perlmann en Engvall in Swede (Engvall & Perlmann, 1971) asook Schuurs en van Weemen van Nederland (Van Weemen & Schuurs, 1971), wat in die vroeë 1970's toetse met geïmmobiliseerde en ensiem-gemodifiseerde reagense gebou het. Vandag gebruik wetenskaplikes ook gekleurde molekules (sogenaamde fluorofore) wat weer lig uitstraal by opwekking om teenliggaam-antigeen-interaksies te visualiseer. Baie variante van eksperimentele prosedures is ontwikkel, en dit is algemeen om toetse te bou deur meer as een teenliggaam te gebruik om 'n teiken van belang op te spoor (sien Figuur 3.xx C-D). Om die moontlikhede van die immunoassay -formaat verder te versterk, is toepassings gebaseer op mikroskikkings ontwikkel wat meer as een molekule in 'n enkele reaksiekamer kan meet (sien hieronder).

    ELISA Assay Ontwerp

    Deur die gebruik van teenliggaampies kan eksperimente op verskillende maniere ontwerp word vir die beoogde analise. Om die beste moontlike resultate van die eksperiment te behaal, moet verskillende reagense, bymiddels en oplossings getoets word vir hul optimale kombinasie en konsentrasie, inkubasietye en die aantal wassiklusse wat geëvalueer en aangepas moet word. Dit is om ongewenste interaksies te vermy, wat die ontleding versteur deur die doelwit van belang op te spoor. Boonop kan die manier waarop 'n teiken geïdentifiseer word en opsporing op 'n aantal maniere uitgevoer word, soos beskryf in Figuur 3.18

    Figuur 3.18. Verskillende opstellings vir ELISA en ander immunotoetse. In ELISA -toetse kan die teenliggaampies (A) 'n geïmmobiliseerde antigeen opspoor, (B) 'n gemerkte antigeen opneem, (C) 'n ongemerkte antigeen opneem en 'n tweede, gemerkte teenliggaam gebruik om die vasgevangde antigeen op te spoor, of (D) 'n derde gebruik teenliggaampies vir opsporing, of gebruik selfs twee teenliggaampies vir opsporing (E). Direkte etikettering van die teenliggaam of antigeen soos in (A), (B) en (C) is die eenvoudigste en vinnigste opsporingsmetode. Die gebruik van 'n sekondêre teenliggaam as opsporingsmetode, soos aangetoon in (D) en (E), verhoog die sensitiwiteit en selektiwiteit van die analise verder. Die metode wat in (D) gebruik word, bied ook groter buigsaamheid, terwyl metode (E) die spesifisiteit verder verhoog, aangesien drie teenliggaampies die antigeen moet bind om 'n verslaggewermolekule te produseer. Uit die voorgestelde toetse word die mees gebruikte konsepte in (C) en (D) getoon.

    Veelvoudig

    'N Nuwe era in immuno -toetse het begin met die ontwikkeling van 'n tegnologie genaamd microarrays. Die term mikroskikking beskryf meestal die geordende organisasie van klein volume druppels wat op 'n klein oppervlak gedroog het. Die reaksiedimensies word geminiaturiseer sodat baie toetse in meerdere monsters parallel uitgevoer kan word, en duisende verskillende funksies kan aan die omliggende oplossing voorgestel word. Dit beteken dat wetenskaplikes 'n groot aantal molekules met een enkele eksperiment kan meet. Daar is 'n moontlikheid om mikroskoopglasskyfies en gespesialiseerde robotika te gebruik wat baie klein druppels vloeistof (1 nl = 0,000000001 liter) op 'n geordende manier op die glasoppervlak plaas. Dit laat kolle agter met minder as een millimeter in deursnee (0,15 mm). Nog 'n algemene tegniek vir multipleksing is om selfs kleiner en kleurgekodeerde deeltjies (deursnee van 0,005 mm) te gebruik. Hierdie deeltjies kan met teenliggaampies bedek word om die analiet uit die oplossing uit te vis.

    Sensitiwiteit

    In baie toepassings is dit belangrik om baie klein hoeveelhede (soms net spore) van 'n molekule in 'n gegewe monster te meet. Om die vereiste sensitiwiteit te bereik, moet die voorwaardes van die eksperiment aangepas word om aan te pas by die teenliggaampies, die opsporingstelsel en die tipe monsters. Daarbenewens word vordering gemaak met die gebruik van beter kleure, gespesialiseerde lasers en filters vir seinversterking, sowel as miniaturisering (Ekins & Edwards, 1997).

    Spesifieke voorbeelde

    Daar is baie voorbeelde van hoe ELISA-toetse in basiese navorsing en in kliniese diagnostiek gebruik kan word. Een spesifieke voorbeeld is die sensitiewe toebroodjie-tipe ensiem-gekoppelde immuno-toets wat gebruik word om die hoeveelheid proteïen-prostaat-spesifieke antigeen (PSA) te bepaal, wat 'n biomerker is wat gebruik word om prostaatkanker op te spoor (Kuriyama et al., 1980).

    Microarray -toetse, aan die ander kant, het voorheen baie aandag gekry vir die gebruik daarvan in parallelle analise van DNA- en RNA -molekules. Om hul voordele te vertaal na toetse vir die ontleding van proteïene met teenliggaampies, moes nuwe protokolle en roetines ontwikkel en vasgestel word. Deesdae is daar vermenigvuldigde tegnieke om die hoeveelheid proteïene in verskillende monstertipes te meet (bv. selle, bloedserum, urine), om te bepaal hoe proteïene in biologiese prosesse gemodifiseer word (bv. fosforilering), of om spesifieke proteïen-proteïen-interaksies te beskryf. 'N Ander voorbeeld is die ontleding van teenliggaampies wat in die bloed van pasiënte sirkuleer. Mikro-array-toepassings is ook gebou vir gesuiwerde teenliggaampies en om die teenliggaambindingseienskappe te bestudeer, en 'n belangrike aspek by die gebruik van bindingsreagense as navorsingsreagense. Sulke proteïenmikroarrays kan bestaan ​​uit proteïene, proteïenfragmente of klein peptiede om die spesifisiteit van die bindingsreagens te toets. Proteïenmikro -skikkings kan die interaksies met hele proteïene of groter proteïenfragmente openbaar, terwyl peptiedmikro -rigtings toon aan watter spesifieke dele (epitope) van die proteïene die teenliggaampies bind. 'n Tipiese epitoopkarteringresultaat word in Figuur 3.19 getoon (Edfors et al., 2014). Deur miljoene oorvleuelende peptiede met slegs een aminosuurresidu -verskuiwing op sulke skikkings te sintetiseer, kan die teenliggaambindingsgebiede met hoë resolusie gekarteer word. Dit gee baie gedetailleerde inligting oor die lineêre (deurlopende) epitope wat deur 'n teenliggaam herken word. Net soos met proteïene, proteïenfragmente of ander antigene, kan die samestelling van peptiede op skikkings ook gebruik word vir die ondersoek van teenliggaamreaktiwiteit in plasmamonsters van pasiënte met aansteeklike en outo -immuun siektes.

    Figuur 3.19. Epitoopkartering van poliklonale teenliggaampies. Poliklonale teenliggaampies bind aan 'n peptiedskikking waar die resultaat vier duidelike lineêre epitope vertoon en die opeenvolgende oorvleuelende peptiede wat gebind is. X-as: peptiede, Y-as: gemiddelde fluoressensie-intensiteit (MFI). (Edfors et al., 2014)

    Terug na bo

    Western Blot

    Western Blot (WB) is 'n algemene metode om proteïene op te spoor en te ontleed.Dit is gebou op 'n tegniek wat behels die oordrag van, ook bekend as klad, proteïene wat deur elektroforese geskei word van die jel na 'n membraan waar hulle spesifiek gevisualiseer kan word. Die prosedure is die eerste keer beskryf deur H. Towbin et al in 1979 (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979) en twee jaar later het dit sy naam gekry deur W. Neal Burnette (Burnette, 1981). Towbin et al beskryf elektroforetiese oordrag van proteïene van poliakrylamied gels na nitrocellulose velle waar die oorspronklike gelpatroon akkuraat verkry is. Die opstelling bestaan ​​uit 'n standaardstel van sewe stappe, Figuur 3.20.

    Figuur 3.20. Die standaardstappe in Western Blotting. Die standaardstappe behels monstervoorbereiding (1), gelelektroforese (2), blotting na membraan (3), antilichaam -ondersoek (4), opsporing (5), beeldvorming (6) en analise (7).

    Monsters word voorberei en op 'n gel gelaai en tydens die elektroforese beweeg die negatief gelaaide proteïene na die positief gelaaide anode. Ten einde die proteïene verder te ontleed, word dit na 'n membraan oorgedra in 'n prosedure wat blotting genoem word. Na die oordrag word die membraan geblokkeer om ongewenste membraan-proteïeninteraksie in die volgende stappe te voorkom. Om die proteïen van belang te visualiseer, word die membraan gewoonlik eers ondersoek met 'n primêre proteïenspesifieke teenliggaam, gevolg deur 'n gemerkte sekondêre teenliggaam wat gebruik word vir opsporing. 'N Beeld word van die membraan geneem en die resultaat word ontleed.

    Deur 'n aparte merkeroplossing by een van die putte in die jel te voeg, is dit moontlik om die grootte van die proteïen te skat bykomend tot die teenliggaaminteraksies wat gebruik word om die spesifieke proteïen te verifieer. Die skeiding op die gel is nie net te wyte aan grootte nie, maar ook tot 'n mate afhanklik van die molekulêre lading, hidrofobiese streke en graad van denaturasie. Die opset van die eksperiment kan op baie maniere gevarieer word om die beste by die spesifieke ondersoek te pas. Wanneer die resultate ontleed word, moet variasies tussen bane met betrekking tot laai en oordragtempo tussen vlekke in ag geneem word. Daarbenewens is die nie-lineêre verband van die gegenereerde sein oor die konsentrasiereeks van die monsters ook 'n aspek van oorweging wanneer die resultate geïnterpreteer word. Die uitslag van 'n WB -eksperiment hang af van drie belangrike faktore, die vermoë van die teenliggaam om 'n spesifieke proteïen te bind, die sterkte van die interaksie en die konsentrasie van die proteïen van belang self. Boonop is die spesifisiteit van die binding aan die teiken en 'n lae kruisreaktiwiteit ook belangrike kenmerke. Die resultaat van die WB is nie altyd maklik om te interpreteer nie, aangesien die grootte van die proteïen kan verskil van die teoretiese gewig as gevolg van posttranslasionele veranderinge, soos glikosilering, of interaksies met ander proteïene. WB is egter 'n baie algemene metode en byna alle beskikbare kommersiële teenliggaampies is met hierdie metode bekragtig.

    Monster voorbereiding

    Die eerste stap van 'n WB is om die monster voor te berei, bv. weefsel, selle of ander oplossing wat ontleed gaan word. Gewoonlik moet die weefsel afgebreek word deur vermenging, homogenisering of sonikasie. Buffers word bygevoeg om die selle te lys en die proteïene op te los en dikwels word 'n remmer bygevoeg om denaturasie of agteruitgang te voorkom. Verskillende tipes filtrasie- en sentrifugeringmetodes word toegepas om die monsters verder voor te berei. Dit is belangrik om die totale proteïenkonsentrasie van die gegenereerde ekstrak te bepaal om 'n spesifieke hoeveelheid op die jel te kan laai om vergelyking tussen monsters moontlik te maak. Gewoonlik word 'n biochemiese toets gebruik om die proteïenkonsentrasie te bepaal. Die uittreksel word dan verdun met 'n laaibuffer bestaande uit gliserol en 'n kleurstof (bv. Broomfenolblou). Die gliserol word gebruik om die laai te vereenvoudig deur die digtheid van die ekstrak te verhoog en die kleurstof word bygevoeg om die monster te visualiseer. Hitte word op die monsters toegedien om die proteïenstrukture te breek, wat sal help om die negatiewe lading te neutraliseer (Mahmood & Yang, 2012). Positiewe en negatiewe kontroles word verkieslik by die opstelling ingesluit om die identiteit van die proteïen sowel as die aktiwiteit van die teenliggaam te bevestig.

    Gel elektroforese

    Na voorbereiding van die monster is die uittreksel gereed om gelaai te word om die proteïene volgens gel met elektroforese volgens grootte te skei. 'N Elektriese veld word toegepas oor die gel wat veroorsaak dat die gelaaide molekules beweeg. In WB word poliakrylamied gels gebruik vir proteïenskeiding en die metode word dus poli -akrylamied gelelektroforese (PAGE) genoem by gebruik van inheemse toestand. Vir denaturerende toestande word natriumdodecylsulfaat (SDS) by die stelsel gevoeg en die metode word dus SDS-PAGE genoem. Die SDS bind aan die proteïen en vorm 'n negatief gelaaide miel om die proteïen, ongeag die inherente lading. Die denaturerende toestand los die driedimensionele struktuur van die proteïene op en die lading van die proteïen word relatief tot sy grootte, wat lei tot skeiding van die proteïene slegs volgens grootte. Wanneer inheemse toestande gebruik word, is die mobiliteit afhanklik van beide lading en hidrodinamiese grootte, wat die opsporing van veranderinge in lading moontlik maak as gevolg van chemiese agteruitgang, konformasie veranderinge as gevolg van vou of ontvouing, aggregasie, of ander bindingsgebeure.

    Die jel bestaan ​​tipies uit twee afdelings met verskillende digthede: (i) 'n stapelgel, en (ii) 'n skeigel, (Figuur 3.21). Die verskille tussen die twee afdelings is in pH en gelkonsentrasie. Met 'n ietwat suur pH en 'n laer konsentrasie akrylamied skei die stapelgel die proteïene swak, maar laat hulle sterk gedefinieerde skerp bande vorm voordat hulle die skeidingsgel binnedring. Met meer basiese toestande en hoër jelkonsentrasie laat die skeidingsgel die proteïene volgens grootte onderskei, aangesien kleiner proteïene vinniger in die jel beweeg as groteres. Voorgemaakte gels is egter handig, maar dit is moontlik om dit met die hand te giet. Die jel word in buffer gedompel en die proteïenmonsters en merkers word na die putte in die jel gelaai. 'N Spanning word op die gel aangelê en die proteïene sal deur die gel begin beweeg as gevolg van hul negatiewe elektriese lading. Dit is belangrik om die regte spanning te kies, aangesien te hoë spanning die gel oorverhit en die bande kan vervorm.

    Figuur 3.21. 'N Tipiese vertikale poliakrylamiedgel in buffer

    Vlek na membraan

    Na gelelektroforese word die proteïene oorgedra na 'n vaste ondersteuningsmembraan, wat die derde stap van Western Blot is. In die oordragproses word spanning toegepas om die proteïene van die gel na die membraan oor te dra. Die opstelling bevat sponse, filterpapiere, die gel en die membraan wat tussen die gel en die positiewe elektrode geplaas word (Figuur 3.22). Dit verseker die migrasie van die negatief gelaaide proteïene van die gel na die membraan. Daar is drie soorte membrane: nitrocellulose, polivinieliedendifluoried (PVDF) en nylon. Selfs al is nylonmembrane beter in verskeie aspekte, maak die hoë agtergrondbinding en onomkeerbare kleuring van sommige kleurstowwe hierdie tipe membraan minder algemeen as die ander twee alternatiewe. Die grootste voordeel van nitrocellulosemembrane is die lae agtergrond, ongeag die opsporingsmetode. As gevolg van 'n relatief groot gemiddelde poriegrootte, moet nitrosellulose membrane nie gebruik word vir die oordrag van proteïene met 'n lae molekulêre gewig nie. Boonop word die membraan bros, as dit droog is, wat dit moeilik maak om te hanteer. Die meer stabiele PVDF-membraan laat heretikettering toe en is geriefliker om te stoor. Die hidrofobiese aard van PVDF lei tot 'n hoë proteïenbindingskapasiteit, maar die agtergrond is gevolglik ook hoër.

    Figuur 3.22. Oordragprosedure vir Western Blotting. Die proteïene in die jel word na 'n membraan oorgedra en die monster word gevisualiseer deur blokkering, byvoeging van teenliggaampies en was volgens 'n sekere skedule.

    Daar is twee metodes om nat te maak, wat nat en halfdroog genoem word. Die nat toestande word verkies wanneer die oordrag doeltreffend moet wees en hoë kwaliteit moet bied ten opsigte van duidelike en skerp bande. Boonop is dit die beter keuse vir die oordrag van groter proteïenkompleks. Die gel, membraan en filterpapiere word heeltemal in buffer gedompel tydens die oordrag en daar is geen risiko dat die gel uitdroog nie. Half-droë blotting is vinniger en minder volume buffer is nodig. Hierdie oordragmetode is egter gewoonlik minder doeltreffend, veral vir groter proteïene, en daar is 'n risiko dat die jel oorverhit en droog word wanneer verlengde oordragtye gebruik word.

    Teenliggaam ondersoek

    Die vierde stap van die WB is die ondersoek van teenliggaampies. Om 'n onspesifieke binding van die teenliggaampies aan die membraan te voorkom, eerder as om spesifiek te bind aan die proteïen van belang, word 'n stof gebruik om die oorblywende plekke op die membraan te blokkeer. Algemene stowwe wat gebruik word, is gedroogde nie-vet melk, 5% Bees Serum Albumin (BSA) verdun in Tris Buffered Saline Tween (TBST), normale bok serum, kaseïen of vis gelatien (Mahmood & Yang, 2012). Melk is maklik om in die hande te kry en goedkoop, maar nie geskik vir alle opsporingsetikette nie. Visgelatien gee 'n laer agtergrond, maar kan sommige proteïene masker sowel as 'n relatief duur blokkeerbuffer. BSA is goedkoop, terwyl serum immunoglobuliene kan bevat wat aanleiding gee tot kruisreaktiwiteit. 'N Sorgvuldige keuse van die blokkeermiddel is van kardinale belang, aangesien nie een van die blokkerende buffers ideaal is vir alle verskillende antigeen-teenliggaam-interaksies nie. Die blokkeerprosedure bestaan ​​uit die inkubasie van die membraan in die toepaslike blokkeerbuffer vir 'n uur of langer. Wanneer lang inkubasietye gebruik word, moet die blokkering by +4&°C uitgevoer word om die risiko van kleuring van artefakte of agtergrond uit te sluit. Blokkering is 'n delikate balans tussen die vermindering van die agtergrond sonder om die sein van die proteïen van belang te verminder.

    Die geblokkeerde membraan word daarna met die primêre teenliggaam geïnkubeer. Die teenliggaam word tot 'n geskikte konsentrasie verdun in TBST, fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS), of wasbuffer. Dit word verkies om die teenliggaam met BSA te inkubeer indien die teenliggaam hergebruik gaan word. Nadat die membraan gewas is, word die membraan geïnkubeer met die sekondêre teenliggaam wat aan die primêre teenliggaam bind. Die sekondêre teenliggaam word met 'n verslaggewer gemerk. Wanneer 'n poliklonale teenliggaam as sekondêre teenliggaam gebruik word, kan dit aanleiding gee tot 'n mate van agtergrond. In die geval van agtergrondkleuring, kan die sekondêre teenliggaam vooraf geblokkeer word met nie-immuunserum van die gasheer waarin dit gegenereer is. Optimalisering van die konsentrasie van die sekondêre teenliggaam word aanbeveel as gevolg van redelik uitgebreide variasies tussen teenliggaampies sowel as opsporingstelsel gebruik.

    Opsporing

    In die vyfde stap van 'n WB word die proteïen-teenliggaam-teenliggaamkompleks op die membraan opgespoor. Daar is verskillende soorte etikettering van die sekondêre teenliggaam, bv. ensieme, fluorofore, biotinilering, goudvervoeging en radio-isotope, soos getoon in Figuur 3.23. Onder ensieme is die algemeenste HRP wat saam met chemiluminescerende, chemifluorescerende of chromogene stowwe gebruik word. HRP het 'n hoë substraatspesifisiteit wat lae agtergrond gee, is stabiel en goedkoop. In chemiluminescense kataliseer die HRP -ensiem die oksidasie van luminol uit die luminolperoksied -opsporingsreagens. Die multi-stap reaksie genereer liguitstraling. Sekere chemikalieë, soos fenole, kan die uitgestraalde lig versterk. 'n Direkte metode is die gebruik van fluoressensie die fluorofore straal lig uit nadat dit opgewonde is en geen opsporingsmiddel is nodig nie. Dit is goed geskik vir kwantitatiewe Westerse en aangesien verskillende fluorofore lig van verskillende golflengtes uitstraal, is dit moontlik om multipleksing en spesifieke opsporing van meer as een proteïen op dieselfde tyd uit te voer. Die gebruik van 'n chemikalie en/of 'n ensiem om die generering van 'n aktiewe fluorofoor vanaf 'n fluorogeniese substraat te veroorsaak, word chemifluoressensie genoem. Om die seinintensiteit verder te verbeter, kan 'n twee-stap biotien streptavidien-gebaseerde stelsel gebruik word. Goudvervoeging is ook 'n metode waar proteïene donkerrooi vlek as gevolg van ophoping van goud. Dit is ook moontlik om radio -isotope te gebruik, maar dit verg spesiale hantering en is redelik duur.

    Figuur 3.23. Verskillende verslaggewerstelsels.

    Beeldvorming

    Beeldvorming is die sesde stap van WB en die opname kan analoog wees met behulp van 'n film, of digitaal vooraf gevorm word met 'n CCD -kamera of skandeerder wat die verskillende soorte uitgestuurde seine vaslê. Die CCD-beeldtoestel maak kwantifisering moontlik met 'n hoë opsporingsensitiwiteit en 'n breë lineêre reeks sonder chemiese vermorsing of behoefte aan 'n donker kamer. Dit kan gebruik word om membrane, bevlekte gels op te spoor, of vir toepassings met ultraviolet lig.

    Ontleding

    Die laaste stap van 'n WB is om die resultate te ontleed. In 'n tipiese kwalitatiewe toepassing word die teenwoordigheid van 'n proteïen van belang bevestig, die hoeveelheid word benader deur visuele inspeksie en die grootte word bepaal deur vergelyking met 'n merker. Verbeterings en ontwikkelings, veral ten opsigte van hoogs sensitiewe opsporingsreagense en gevorderde beeldtegnieke, maak van WB 'n potensiële hulpmiddel vir kwantitatiewe analise. Die kwantitatiewe toepassings behels 'n definisie van die hoeveelheid proteïen in relatiewe of absolute terme. Sommige faktore moet in ag geneem word, soos sensitiwiteit, seinstabiliteit, lineêre dinamiese omvang, normalisering en die sein-ruisverhouding. Die minimum proteïen wat in 'n gegewe toets gesien kan word, gee die opsporingsgrense (LOD), en die limiet van seinintensiteit wat betroubaar gebruik kan word vir presiese kwantifisering, is die limiet van kwantifisering (LOQ). Faktore wat hierdie terme beïnvloed, is die teenliggaamp kwaliteit en konsentrasies, sowel as blootstellingstye wanneer die minimum hoeveelheid proteïen wat opgespoor word, in ag geneem word. 'n Stabiele seinstelsel brei die tydvenster uit vir die bereiking van hoë sensitiwiteit, veelvuldige blootstelling en moontlikheid om swak bande op te spoor. Die reeks wat 'n eweredige en presiese kwantifisering moontlik maak waar die seinintensiteit steeds eweredig is aan die hoeveelheid proteïen, word die lineêre dinamiese reeks genoem. Dit is belangrik om seinversadiging te vermy as gevolg van oormatige hoeveelhede proteïene of hoë konsentrasies teenliggaampies. 'N Lae LOD en kwantifisering van beide swak en sterk seine gee 'n breë lineêre dinamiese omvang. Die proteïen van belang moet genormaliseer word na 'n interne verwysing wat skommelinge in die hoeveelheid proteïene wat op elke put of verskillende konsentrasies gelaai word, toelaat. Dit kan bereik word met huishouding of proteïen met spykers. Die verhouding tussen die sein en geraas is belangrik om die proteïen behoorlik te kwantifiseer. Dit is uiters belangrik wanneer swak bande opgespoor word waar 'n hoër agtergrond verwag word. 'n Tipiese Western Blot word in Figuur 3.24 gesien.

    Figuur 3.24. Tipiese Western Blot-resultaat met behulp van HRP-gekonjugeerde teenliggaampies en 'n CCD-kamera.

    Terug na bo

    Immunhistochemie

    Immunohistochemie (IHC) is 'n kragtige mikroskopie-gebaseerde tegniek vir die visualisering van sellulêre komponente, byvoorbeeld proteïene of ander makromolekules in weefselmonsters. Die sterkte van IHC is die intuïtiewe visuele uitset wat die bestaan ​​en lokalisering van die teikenproteïen in die konteks van verskillende seltipes, biologiese toestande en/of subsellulêre lokalisering binne komplekse weefsels openbaar.

    Die IHC-tegniek is gedurende die 1940's uitgevind (Coons, Creech, & Jones, 1941) en word gereeld gebruik as 'n belangrike hulpmiddel in gesondheidsorg en patologie vir bv. diagnostiese doeleindes of om pasiënte te stratifiseer vir geoptimaliseerde behandelingsregimes. IHC word ook wyd gebruik in navorsing waar molekules van belang ontleed word om hul rolle in gesonde en siek selle en weefsels op molekulêre, sellulêre of weefselvlak te bestudeer. Daar is baie verskillende maniere om die doelwitte in weefsels te visualiseer met behulp van IHC- of IHC-gebaseerde metodes, en daar bestaan ​​talle protokolle vir verskillende toepassings en toetse. Alhoewel IHC oor die algemeen 'n robuuste en gevestigde metode is, benodig nuwe toetse dikwels noukeurige optimalisering, afhangende van die weefsel of die eienskappe van die teikenproteïen, bindmolekule en/of verslaggewerstelsel. Baie jare van tegniese ontwikkeling en die baie groter beskikbaarheid van spesifieke bindingsmolekules het die bruikbaarheid en toepassingsgebiede van IHC aansienlik verbeter. Die vordering op die gebied van IHC-gebaseerde tegnieke en reagense het wetenskaplikes en gesondheidsorgverskaffers in staat gestel met meer presiese gereedskap, toetse en biomerkers. Boonop het tegniese vooruitgang bv. hoogs sensitiewe gelyktydige opsporing van veelvuldige proteïene in dieselfde monster, en die opsporing van proteïen-proteïen interaksies.

    Die klassieke IHC-toets word in Figuur 3.25 geïllustreer en behels die opsporing van epitope wat uitgedruk word deur 'n enkele proteïen-teiken binne 'n weefselmonster met behulp van 'n "primêre teenliggaam" wat in staat is om daardie epitope met hoë spesifisiteit te bind. Na die epitoop-teenliggaam-bindingsgebeurtenis word 'n & kwotsekondêre teenliggaam bygevoeg wat die primêre teenliggaam met 'n hoë spesifisiteit kan bind. Die sekondêre teenliggaam word aan 'n verslaggewermolekule gekoppel en na die teenliggaam-teenliggaam bindingsgebeurtenis word 'n chemiese substraat bygevoeg wat met die verslaggewermolekule reageer om 'n gekleurde neerslag op die plek van die hele epitoop-teenliggaamkompleks te produseer.

    Figuur 3.25. Die basiese beginsel van immunohistochemie. In die skematiese illustrasie word 'n formalien-vaste paraffien ingebedde weefselgedeelte gekleur met 'n primêre teenliggaam wat op 'n spesifieke proteïen teiken gerig is. 'N Oplossing wat die primêre teenliggaam bevat, word by die weefselafdeling gevoeg en die teenliggaampies kan 'n geruime tyd kry om aan hul teiken te vind en te bind. Na hierdie stap word ongebonde en oortollige teenliggaampies weggespoel en die sekondêre teenliggaam word bygevoeg. Die sekondêre teenliggaam, wat 'n koppelmolekule met peperwortelperoksidase (HRP) ensieme dra, word ook geruime tyd toegelaat om aan die primêre teenliggaam te bind, gevolg deur nog 'n wasstap. Hierna word 3,3' Diaminobenzidien (DAB) bygevoeg. Die HRP-ensiem transformeer die DAB-substraat in 'n bruinerige neerslag wat in die weefsel gedeponeer word op die plek van die reaksie, wat dus 'n visuele voorstelling produseer van waar die primêre teenliggaam die eerste keer sy teiken gebind het.

    Weefsel voorbereiding

    Die weefsel speel 'n sentrale rol in die eksperiment en dit is belangrik dat dit verwerk word sodat epitope en behoorlike morfologie behoue ​​bly. Die mees algemene verwerking vir IHC is om formalien-vaste paraffien-ingebedde (FFPE) weefselblokke voor te berei. Die doel van formalienfiksasie is om chemiese verknoping van proteïene binne die weefsel te produseer. Dit beëindig alle sellulêre prosesse en bevries die sellulêre komponente op die plek en in die konformasie waarin hulle was tydens die fiksasie, en voorkom ook agteruitgang. Na voldoende fiksasie word die weefsel verder verwerk en uiteindelik in paraffienblokke ingebed, wat dan in dun skywe (gewoonlik 4-10&mikrom) met 'n mikrotoom gesny word. Die gedeeltes word na glasskyfies oorgeplaas en toegelaat om te kleef voor verdere verwerking.

    Soms word ander fikseringsmetodes behalwe formalien gebruik. Dit sluit in ander tipes aldehiede of die gebruik van verskillende alkoholoplossings. Die beste keuse van fixeermiddel hang baie af van die toets. 'N Algemene alternatief vir FFPE is om bevrore weefselmonsters voor te berei.In hierdie geval word die weefsel in 'n kryobeskermingsmedium ingebed en gevries, en na die snit word fiksasie uitgevoer. Bevrore weefsels word in kristostate gesny en het die voordeel van kort verwerkingstye en beter bewaring van sensitiewe epitope, maar kan dikwels minderwaardig wees as FFPE -weefsels ten opsigte van die behoud van histologiese morfologie.

    Antigeen (epitoop) herwinning

    'N Kommer wat verband hou met kruisbindende fixeermiddels soos formalien, of te lang tyd in fixeermedium spandeer, is die maskering van epitope, wat die primêre teenliggaam kan belemmer om aan die doelwit te bind. Veral met FFPE -monsters, is daar dikwels 'n behoefte om 'n paar van die chemiese verknopings en 'epitope' terug te keer voordat u na die werklike IHC gaan. Daar is verskeie antigeen -herwinningsprotokolle beskikbaar, en die belangrikste strategieë sluit in die behandeling van die weefselskyfie met hitte, verteringsensieme, skoonmaakmiddels of kombinasies daarvan. Die mees algemene metode vir die herwinning van antigeen in FFPE-monsters is om die weefselslyne in 'n suur sitraatbuffer vir ongeveer 15-20 minute onder druk te kook.

    Teenliggaam binding

    Die kwaliteit en spesifisiteit van die bindingsmolekule is van kardinale belang vir enige op IHC gebaseerde tegniek, en die keuse van bindmiddel kan die uitkoms, betroubaarheid en moontlik ook die interpretasie van die toets direk beïnvloed. Teenliggaampies is verreweg die algemeenste tipe bindingsmolekule wat vir IHC gebruik word, en hoewel die meeste teenliggaampies die korrekte molekule van belang voldoende kan opspoor, kan dit ook baie verskil in hul spesifisiteit vir die beoogde doelwit. Teenliggaampies met 'n hoë spesifisiteit is dus betroubaarder by die interpretasie van & quot-target & quot binding, aangesien dit min of geen & quotoff-target & quot binding of & quotbackground & quot. Teenliggaampies wat minder spesifiek is, kan meer bindings buite die teiken produseer, en die agtergrond wat dit veroorsaak, sal moontlik die korrekte interpretasie van die ware seine op die teiken belemmer. Daar is twee hooftipes teenliggaampies poliklonale teenliggaampies wat 'n heterogene mengsel is van teenliggaampies wat verskillende epitope op die teiken bind en monoklonale teenliggaampies wat almal dieselfde epitoop bind. Poliklonale teenliggaampies is dikwels baie kragtig as gevolg van hul vermoë om verskeie epitope op dieselfde teiken op te spoor en te bind. Die epitope wat hulle bind, is egter dikwels swak gedefinieer, en met veelvuldige en variërende epitoopspesifisiteite kom die groter kans op bindingsgebeure buite die teiken en agtergrondgeraas voor. Die sterkte van poliklonale teenliggaampies kan egter voordelig wees, aangesien die konsentrasie van bindingsgebeurtenisse rondom die op-teikenmolekule gewoonlik swaarder weeg as moontlike agtergrondgeraas. 'n Nadeel is dat poliklonale teenliggaampies gewoonlik beperkte hulpbronne is aangesien dit van dieresera afkomstig is. Monoklonale teenliggaampies, daarenteen, het meer kontinuïteit, aangesien dit in hybridoma -sellyne geproduseer kan word. Monoklonale teenliggaampies word ook dikwels goed gedefinieer in terme van epitoopbinding, maar kan steeds resultate genereer wat moeilik is om te interpreteer as die spesifisiteit laag is of as die teikenepitoop in 'n lae oorvloed teenwoordig is.

    Sorgvuldige optimalisering en titrering van die teenliggaamponsentrasie vir elke toets is nodig, aangesien die resultaat nie net afhang van die spesifiekheid en affiniteit van die teenliggaam vir die doel nie, maar ook van die konsentrasie en beskikbaarheid van epitope op die teiken en moontlike buite die teiken in die monster. Die byvoeging van te veel teenliggaampies by die monster sal die aantal moontlike lae-affiniteit buite-teiken-bindingsgebeurtenisse verhoog sodra die op-teiken-epitope(s) versadig is met bindmiddels. Deur die teenliggaamponsentrasie te verlaag, word bindingsgebeure buite die teiken skaarser, aangesien dit gewoonlik 'n laer affiniteit het as bindingsgebeurtenisse op die teiken. Die risiko wanneer 'n poging om agtergrond te verminder terwyl 'n lae-affiniteit teenliggaam gebruik word, is dat die op-teiken seine gelyktydig verswak word tot die punt om 'n vals negatiewe resultaat te lewer.

    Ander tipes bindmolekules wat soms in IHC-gebaseerde tegnieke gebruik word, sluit affikotiewe, peptiede, teenliggaamfragmente of ander klein molekules in.

    Opsporingstelsels

    Die hele doel met die uitvoer van IHC is om 'n visuele voorstelling te verkry van waar die teiken binne die eksperimentele weefsel gevind kan word, en verkieslik ook inligting te verkry oor die uitdrukkingspatroon van die teiken onder heterogene selpopulasies en/of sub -sellulêre lokalisasies. Dit word geïllustreer in Figuur 3.26, wat illustreer hoe verskillende teenliggaampies gebruik word om verskillende sellulêre of weefselkompartemente binne 'n komplekse weefsel te visualiseer. Om die teiken-teenliggaam-interaksie te visualiseer, is 'n soort opsporingstelsel nodig wat 'n waarneembare vlek of sein produseer. Die mees algemene metode om 'n opsporingstelsel by die eksperiment in te voer, is om 'n sekondêre teenliggaam te gebruik wat 'n voorafgebonde verslaggewermolekule, d.w.s. ensiem of fluorofoor, dra. Sekondêre teenliggaampies is gewoonlik spesifiek gerig op teenliggaammolekules van 'n ander diersoort. Byvoorbeeld, as die primêre teenliggaam in 'n haas opgewek word, moet die sekondêre teenliggaam in 'n ander dier opgewek word en spesifiek op konynteenliggaampies gerig word.

    Figuur 3.26. Visualisering van verskillende proteïendoelwitte in komplekse weefsels. Die regterkolom toon 'n vergroting van die ooreenstemmende beelde in die linkerkolom. In die IHC -beeld kan opeenvolgende dele van die menslike slukderm wat met vier verskillende teenliggaampies gevlek is, 'n direkte vergelyking van verskillende proteïenuitdrukkingspatrone binne die weefsel en binne die subcellulêre kompartemente moontlik maak. Die boonste beelde word slegs teen hematoxylien teen 'n vergelyking gekleur. Die p63-teenliggaam kleur selkerne in 'n populasie selle wat in die basale deel van die slukderm-epiteel woon. Die EGFR (Epidermale groeifaktor reseptor) teenliggaam vlek dieselfde selpopulasie as p63, maar vlek selmembrane in plaas van kerne. Die G6PD (Glucose-6-fosfaat dehidrogenase) teenliggaam vlek die sitoplasma van 'n breër repertoire van esofageale epiteelselle en ook selle wat in die bindweefsel woon. Die Laminin (LAMB2) teenliggaam kleur slegs selle en strukture in die bindweefsel onderliggend aan die slukderm.

    Vir FFPE -weefselmonsters is die mees algemene opsporingsmetode om ensiematiese reaksies te gebruik om 'n gekleurde neerslag op die plek van teenliggaambinding te genereer. Die sekondêre teenliggaampies dra dan 'n ensiem, bv. peperwortelperoksidase (HRP) of alkaliese fosfatase (AP), wat chromogene soos 3,3 'Diaminobenzidine (DAB) of 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat/ p-nitroblue tetrazoliumchloried (BCIP/ NBT) kan omskakel ) in bruin of blouerige neerslae wat in die weefsel neergelê word op die plek van die reaksie. Chromogeniese vlekke is waarneembaar in ligmikroskopie en is gewoonlik baie stabiel oor lang tydperke, wat voordelig is as die eksperiment op 'n later tydstip geargiveer of hersien moet word.

    Vir bevrore weefselafdelings is dit meer algemeen om fluorofoor-gekoppelde sekondêre teenliggaampies te gebruik wat 'n spesifieke kleur uitstraal (gewoonlik groen, rooi of blou) wanneer dit deur die korrekte golflengtes van lig opgewek word. Daarbenewens is fluorofore gewoonlik nie stabiel vir lang tydperke nie. Die voordeel van die gebruik van fluorofore is egter dat dit 'n maklike metode bied om dubbele etiketteringseksperimente uit te voer, waar verskeie teenliggaampies teenoor verskeie teikens in dieselfde monster getoets word. Die sekondêre teenliggaampies moet gerig wees op verskillende primêre teenliggaampies en ook gekoppel word aan verskillende fluorofore. Die verskillende sekondêre teenliggaampies word dan afsonderlik waargeneem deur dit opeenvolgend met verskillende golflengtes lig op te wek. Hierdie verskillende opwekkingsresultate word as aparte beelde (of kleurkanale) gestoor en kan later oorgelê word om proteïen-ko-lokalisasies af te lei, ens.

    Die gebruik van verslaggewerdraende sekondêre teenliggaampies vir opsporing is op sigself 'n amplifikasiestap aangesien verskeie sekondêre teenliggaampies in staat is om 'n enkele primêre teenliggaam te bind, maar soms word verdere amplifikasiestappe verlang om die sein en sensitiwiteit van die eksperiment te verhoog. In sulke gevalle kan die sekondêre teenliggaam eerder "linker molekules" dra, byvoorbeeld biotien polimere, wat in staat is om 'n groter aantal verslaggewermolekules te werf in daaropvolgende stappe. Hierdie strategie vir die versterking van seine is nuttig vir beide ensimatiese en fluorescerende opsporingsmetodes.

    Teenvlek

    Immunohistochemiese kleuring met behulp van chromogene baat dikwels daarby om 'n teenkleuring aan te bring wat die kontras verhoog en die waarneming van histologiese kenmerke vergemaklik. Die mees algemene tipe teenvlek wat vir FFPE -monsters gebruik word, is hematoksielien wat sellulêre sitoplasma met 'n bleek blouerige kleur vlek en selkerne in 'n donkerder blouerige nuanse vlek, soos getoon in figuur 3.26. Fluoresserende vlekke word gewoonlik nie met hematoksielien gekleur nie, aangesien die opsporingsmetode nie op ligmikroskopie gebaseer is nie. In plaas daarvan is die mees algemene manier om teenkleuring vir fluoressensie te verkry om selkerne te merk deur fluoresserende kleurstowwe by te voeg wat nukleïensure bind, soos in Figuur 3.27 getoon. Na die werklike immunohistochemiese reaksie, is die enigste oorblywende stappe om die deksel te dek en die monster te verseël vir beskerming en langdurige berging. Die mees algemene manier is om die dekstrook aan die monster te " gom" deur gebruik te maak van kommersieel beskikbare doelgemaakte harse.

    Figuur 3.27 Endoteelselle onder die mikroskoop. Kerne word blou gekleur met DAPI, mikrobuisies word groen gemerk deur 'n teenliggaam wat aan FITC gebind is en aktienfilamente word rooi gemerk met falloïdien gebind aan TRITC. Bees pulmonêre arterie endoteel selle

    Beeld van NIH ImageJ-Programmpaket

    Spesifieke voorbeelde

    IHC word wyd gebruik in navorsing en kliniese praktyk. Die Human Protein Atlas (HPA) -projek is 'n uitstekende voorbeeld van hoe hoë deurset-IHC gebruik word om grootskaalse kartering van die menslike proteoom in 'n menigte weefsels, kankers en selle te bewerkstellig. In die HPA-projek vergemaklik 'n vaartbelynde grootskaalse teenliggaamproduksieketting die opwekking van spesifieke teenliggaampies, wat, nadat hulle basiese karakteriserings- en valideringstelsels geslaag het, gebruik word om stelselmatige weefselmikro-skikkings wat honderde weefselkerne in 'n enkele eksperiment bevat, te vlek. Die stelsel vir IHC wat deur HPA gebruik word, maak sterk staat op standaardisering van protokolle en outomatisering deur gebruik te maak van masjiene, maar die evaluering van die optimale titrasie vir elke teenliggaam word handmatig uitgevoer voordat die teenliggaam goedgekeur word vir kleuring op die volle stel weefsels. Elke gekleurde weefselkern word geannoteer met betrekking tot immunohistochemiese kleuring in weefsels en seltipes, en word daarna gepubliseer as 'n hoëresolusie -beeld op die webportaal om deur almal vrylik bekyk te word.

    In die kliniese praktyk word IHC hoofsaaklik binne patologie gebruik om dokters te help om weefselmonsters te evalueer met betrekking tot gesonde en of siek toestande, diagnoses te stel en die molekulêre subtipe van verskillende soorte kanker te definieer. 'N Spesifieke voorbeeld waar IHC diagnosties gebruik word, is wanneer patoloë 'n metastatiese gewasmonster ontvang en die weefsel oorsprong van die primêre gewas onbekend is. In hierdie gevalle gebruik patoloë 'n paneel van verskillende teenliggaampies wat weefselspesifieke proteïene teiken, soos prostaatspesifieke antigeen vir prostaatkanker, of estrogeenreseptor vir ginekologiese kankers, of sitokeratien 20 vir gastroïntestinale kankers (Gremel et al., 2014). Sodra 'n breë indeling gemaak is, word addisionele weefselspesifieke teenliggaampies gebruik om die oorsprong van die primêre tumor verder te bepaal. Hierdie inligting is nuttig om die beste of mees geskikte metode vir geneesmiddelterapie te kies en/of om die primêre tumor vir bestralingsterapie en/of chirurgie op te spoor.

    Terug na bo

    3.3 Proteïensintese en -volgordebepaling

    Vastefase-proteïensintese

    Peptiede word chemies gesintetiseer deur die kondensasiereaksie van die karboksielgroep van een aminosuur na die aminogroep van 'n ander. Beskermende groepstrategieë is gewoonlik nodig om ongewenste newe-reaksies met die verskillende aminosuur-sykettings te voorkom. Chemiese peptiedsintese begin meestal by die karboksiel-einde van die peptied (C-terminus) en gaan na die aminoterminus (N-terminus). Proteïenbiosintese (lang peptiede) in lewende organismes vind in die teenoorgestelde rigting plaas. Chemiese sintese fasiliteer die produksie van peptiede wat moeilik is om uit te druk in bakterieë, die inkorporering van onnatuurlike aminosure, peptied/proteïen ruggraatmodifikasie, en die sintese van D-proteïene, wat uit D-aminosure bestaan.

    Die gevestigde metode vir die vervaardiging van sintetiese peptiede in die laboratorium staan ​​bekend as vaste fase peptied sintese (SPPS). SPPS, wat deur Robert Bruce Merrifield begin is, laat die vinnige samestelling van 'n peptiedketting toe deur opeenvolgende reaksies van aminosuurderivate op 'n onoplosbare poreuse ondersteuning.

    Die soliede steun bestaan ​​uit klein, polimeriese harskrale wat gefunksionaliseer is met reaktiewe groepe (soos amien- of hidroksielgroepe) wat skakel met die ontluikende peptiedketting. Aangesien die peptied tydens die sintese kovalent aan die steun bly, kan oortollige reagense en byprodukte verwyder word deur te was en te filtreer. Hierdie benadering omseil die betreklik tydrowende isolasie van die produkpeptied uit oplossing na elke reaksiestap, wat nodig sou wees wanneer konvensionele oplossing-fase sintese gebruik word.

    Elke aminosuur wat met die peptiedketting N-terminus gekoppel moet word, moet beskerm word op sy N-terminus en syketting met behulp van gepaste beskermingsgroepe soos Boc (suur-labiel) of Fmoc (basis-labiel), afhangende van die syketting en die beskermingstrategie wat gebruik word (sien hieronder).

    Die algemene SPPS-prosedure is een van herhaalde siklusse van alternatiewe N-terminale deproteksie- en koppelingsreaksies. Die hars kan tussen elke stap gewas word. Eers word 'n aminosuur aan die hars gekoppel. Vervolgens word die amien ontbeskerm en dan gekoppel aan die vrye suur van die tweede aminosuur. Hierdie siklus herhaal totdat die verlangde volgorde gesintetiseer is. SPPS-siklusse kan ook afsluitingstappe insluit wat die punte van ongereageerde aminosure verhoed om te reageer. Aan die einde van die sintese word die ruwe peptied van die vaste steun geskei terwyl alle beskermende groepe gelyktydig verwyder word deur 'n reagens sterk sure soos trifluorazynsuur of 'n nukleofiel te gebruik. Die ru-peptied kan uit 'n nie-polêre oplosmiddel soos diëtieleter presipiteer word om organiese oplosbare byprodukte te verwyder. Die ru-peptied kan gesuiwer word deur gebruik te maak van omgekeerde-fase HPLC. Die suiweringsproses, veral van langer peptiede, kan uitdagend wees, omdat klein hoeveelhede van verskeie neweprodukte, wat baie soortgelyk aan die produk is, verwyder moet word. Om hierdie rede word sogenaamde deurlopende chromatografiese prosesse soos MCSGP toenemend in kommersiële omgewings gebruik om die opbrengs te maksimeer sonder om op suiwerheidsvlakke in te boet.

    SPPS word beperk deur reaksie opbrengste, en tipies peptiede en proteïene in die reeks van 70 aminosure verskuif die grense van sintetiese toeganklikheid. Sintetiese probleme is ook volgordeafhanklik, tipies is aggregasiegevoelige rye soos amyloïede moeilik om te maak. Langere lengtes kan verkry word deur ligeringsbenaderings soos inheemse chemiese ligasie te gebruik, waar twee korter volledig beskermde sintetiese peptiede in oplossing saamgevoeg kan word.

    Figuur 3.28 Vastefase sintese van 'n dipeptied met behulp van 'n (amien-gefunksionaliseerde) amiedhars. Die N-terminale beskermingsgroep (PG) kan Fmoc of Boc wees, afhangende van die beskermingsgroepskema wat gebruik word. Die aminosuur-sykettings (R1, R.2 ens.) word ortogonaal beskerm.

    Proteïenvolgordebepaling met behulp van Edman Degradation

    Edman agteruitgang, ontwikkel deur Pehr Edman, is 'n metode om aminosure in 'n peptied opeenvolging te bepaal. In hierdie metode word die aminoterminale residu gemerk en geskei van die peptied sonder om die peptiedbindings tussen ander aminosuurreste te versteur.

    Figuur 3.29 Edman Degradation Scheme. In hierdie metode word fenielisothiocyanaat met 'n ongelaaide N-terminale aminogroep onder ligte alkaliese toestande gereageer om 'n sikliese vorm te vorm. fenielthiocarbamoyl afgeleide. Onder suur toestande word hierdie afgeleide van die terminale aminosuur as 'n tiazolinon -afgeleide gesplit. Die tiazolinoon-aminosuur word dan selektief in 'n organiese oplosmiddel onttrek en met suur behandel om die meer stabiele fenieltiohidantoïen (PTH)-aminosuurderivaat te vorm wat geïdentifiseer kan word deur gebruik te maak van chromatografie of elektroforese. Hierdie prosedure kan dan weer herhaal word om die volgende aminosuur te identifiseer.

    'N Groot nadeel van Edman -agteruitgang is dat die peptiede wat op hierdie manier opeenvolg word, nie meer as 50 tot 60 residue kan hê nie (en in die praktyk minder as 30). Die peptiedlengte is beperk as gevolg van die sikliese derivatisering wat nie altyd voltooi gaan nie. Die derivatiseringsprobleem kan opgelos word deur groot peptiede in kleiner peptiede te skei voordat die reaksie voortgaan. Dit kan tot 30 aminosure akkuraat rangskik met moderne masjiene wat meer as 99% doeltreffendheid per aminosuur kan lewer. 'N Voordeel van die Edman -agteruitgang is dat dit slegs 10 - 100 pico -mol peptied vir die opeenvolgingsproses gebruik. Die Edman-afbraakreaksie is in 1967 deur Edman en Beggs geoutomatiseer om die proses te bespoedig en 100 outomatiese toestelle was teen 1973 wêreldwyd in gebruik.

    Omdat die Edman-agteruitgang vanaf die N-terminus van die proteïen verloop, sal dit nie werk as die N-terminus chemies gemodifiseer is nie (bv. Deur asetilering of vorming van pyroglutamiensuur). Opeenvolging sal stop as 'n nie- & alfa-aminosuur voorkom (bv. Edman -agteruitgang is oor die algemeen nie nuttig om die posisies van disulfiedbrue te bepaal nie. Dit vereis ook peptied hoeveelhede van 1 picomole of meer vir waarneembare resultate.

    Na 2D SDS -BLADSY kan die proteïene oorgedra word na 'n polivinieliedendifluoried (PVDF) vlekmembraan vir verdere analise. Edman -agteruitgang kan direk vanaf 'n PVDF -membraan uitgevoer word. N-terminale residu-volgordebepaling wat lei tot vyf tot tien aminosure kan voldoende wees om 'n proteïen van belang (POI) te identifiseer.

    Volgorde-analise deur matriksgesteunde laser-desorpsie/ionisasie-tyd van vlug (MALDI-TOF) massaspektrometrie.

    Massaspektrometrie is 'n tegniek om met 'n hoë akkuraatheid die samestelling van verskillende chemiese elemente en atoomisotope te analiseer wat hul atoomkerne volgens hul massa-ladingverhouding (m/z) verdeel. Dit kan gebruik word om verskillende chemiese elemente wat 'n verbinding vorm, te identifiseer of om die isotopiese inhoud van verskillende elemente in dieselfde verbinding te bepaal.

    Proteïen massaspektrometrieverwys na die toepassing van massaspektrometrie op die studie van proteïene. Massaspektrometrie is 'n belangrike metode vir die akkurate massabepaling en karakterisering van proteïene, en 'n verskeidenheid metodes en instrumente is ontwikkel vir die vele gebruike daarvan.Die toepassings daarvan sluit in die identifisering van proteïene en hul post-translationele modifikasies, die toeligting van proteïenkomplekse, hul subeenhede en funksionele interaksies, sowel as die globale meting van proteïene in proteomika. Dit kan ook gebruik word om proteïene na die verskillende organelle te lokaliseer, en die interaksies tussen verskillende proteïene sowel as met membraanlipiede te bepaal.

    Twee tegnieke word gereeld gebruik vir vloeibare en vaste biologiese monsters: elektro-spuitionisasie en laser-matriks-ondersteunde laser-desorpsie/ionisasie (MALDI). In die MALDI word ionisasie analiete wat saamgekristalliseer is met 'n geskikte matriks in ione omgeskakel deur die werking van 'n laser. Hierdie bron van ionisasie word gewoonlik geassosieer met 'n tydvluganaliseerder (TOF) waarin die ione volgens hul massa-lading geskei word nadat dit in 'n elektriese veld versnel is. Uiteindelik teken 'n massaspektrometerdetektor die lading wat geïnduseer of stroom geproduseer word aan wanneer 'n ioon verbygaan of 'n oppervlak tref. 'n Massaspektrum word vir elke proteïen aangeteken (Figuur 3.30).

    Figuur 3.30. Proteïenidentifikasie deur MALDI-TOF MS. Werkvloei van proteïen-identifikasie wat MALDI-TOF MS-toets (A) ontwikkel, gevolg deur MS/MS-fragmentasie van peptiede (B) en ontleding van spektrale data met die MASCOT-databasissoekalgoritme (C).

    In die algemeen word proteïene ontleed óf in 'n & quottop-down & quot -benadering waarin proteïene ongeskonde ontleed word, óf 'n 'bottom-up' benadering waarin proteïene eers in fragmente verteer word. 'n Intermediêre "middel-af" benadering waarin groter peptiedfragmente ontleed word, kan ook soms gebruik word. Die top-down benadering is egter meestal beperk tot lae-deurset enkelproteïen studies as gevolg van kwessies betrokke by die hantering van heel proteïene, hul heterogeniteit en die kompleksiteit van hul ontledings.

    In die tweede benadering, waarna verwys word as die "bottom-up" MS, word proteïene ensiematies tot kleiner peptiede verteer deur gebruik te maak van 'n protease soos bv. tripsien. Trypis 'n serienprotease van die PA-stam-superfamilie, wat in die spysverteringstelsel van baie gewerwelde diere voorkom, waar dit proteïene hidroliseer. Trypsien kloof peptiedkettings hoofsaaklik aan die karboksielkant van die aminosure lysien of arginien, behalwe as dit deur prolien gevolg word. Dit word gebruik vir talle biotegnologiese prosesse. Daar word algemeen na die proses verwys as trypsienproteolise of trypsinisering, en daar word gesê dat proteïene wat verteer/behandel is met trypsien, getripsineer is.

    Vervolgens word hierdie peptiede in die massaspektrometer ingebring en deur peptiedmassa-vingerafdrukke of tandem-massaspektrometrie geïdentifiseer. Daarom gebruik hierdie benadering identifikasie op die peptiedvlak om die bestaan ​​van proteïene af te lei De novo herhaal opsporing. Die kleiner en meer eenvormige fragmente is makliker om te ontleed as ongeskonde proteïene en kan ook met 'n hoë akkuraatheid bepaal word. 'n Verdere benadering wat bruikbaar begin wees, is die intermediêre "middle-down" benadering waarin proteolitiese peptiede groter as die tipiese triptiese peptiede ontleed word.

    Interessante proteïene is gewoonlik deel van 'n komplekse mengsel van veelvuldige proteïene en molekules, wat saam in die biologiese medium bestaan. Dit bied twee belangrike probleme. Eerstens werk die twee ionisasie tegnieke wat vir groot molekules gebruik word slegs goed as die mengsel ongeveer gelyke hoeveelhede bestanddele bevat, terwyl verskillende proteïene in biologiese monsters in baie verskillende hoeveelhede voorkom. As so 'n mengsel geïoniseer word met behulp van elektrobespuiting of MALDI, het die meer volop spesies die neiging om seine van minder volopes te "verdrink" of te onderdruk. Tweedens is die massaspektrum van 'n komplekse mengsel baie moeilik om te interpreteer as gevolg van die oorweldigende aantal mengselkomponente. Dit word vererger deur die feit dat ensiematiese vertering van 'n proteïen aanleiding gee tot 'n groot aantal peptiedprodukte.

    In die lig van hierdie probleme word die metodes van een- en tweedimensionele gelelektroforese en hoëprestasie vloeistofchromatografie wyd gebruik vir die skeiding van proteïene. Die eerste metode fraksioneer hele proteïene via tweedimensionele gelelektroforese (Figuur 3.31). Die eerste dimensie van 2D-gel is iso-elektriese fokusering (IEF). In hierdie dimensie word die proteïen geskei deur sy isoelektriese punt (pI) en die tweede dimensie is SDS-poliakrylamiedgelelektroforese (SDS-PAGE). Hierdie dimensie skei die proteïen volgens sy molekulêre gewig. Sodra hierdie stap voltooi is, vind die vertering van die gel plaas.

    In sommige situasies kan dit nodig wees om albei hierdie tegnieke te kombineer. Gelvlekke wat op 'n 2D -gel geïdentifiseer word, word gewoonlik aan een proteïen toegeskryf. As die identiteit van die proteïen verlang word, word die metode van in-gel-vertering gewoonlik toegepas, waar die proteïenpunt van belang uitgesny word en proteolities verteer word. Die peptiedmassas as gevolg van die vertering kan bepaal word deur massaspektrometrie met behulp van peptiedmassa vingerafdrukke. As hierdie inligting nie onomwonde die identifikasie van die proteïen toelaat nie, kan die peptiede daarvan tandem -massaspektrometrie ondergaan De novo volgorde. Klein veranderinge in massa en lading kan met 2D-PAGE opgespoor word. Die nadele met hierdie tegniek is sy klein dinamiese omvang in vergelyking met ander metodes, sommige proteïene is steeds moeilik om te skei as gevolg van hul suurheid, basiteit, hidrofobisiteit en grootte (te groot of te klein).

    Die tweede metode, hoë werkverrigting vloeistofchromatografie word gebruik om peptiede te fraksioneer na ensiematiese vertering. Karakterisering van proteïenmengsels deur gebruik te maak van HPLC/MS word ook haelgeweerproteomika en MuDPIT (Multi-Dimensional Protein Identification Technology) genoem. 'n Peptiedmengsel wat voortspruit uit vertering van 'n proteïenmengsel word deur een of twee stappe van vloeistofchromatografie gefraksioneer. Die eluent uit die chromatografie -stadium kan óf direk aan die massaspektrometer ingebring word deur middel van elektrosproei -ionisasie, óf op 'n reeks klein kolletjies neergelê word vir latere massa -analise met behulp van MALDI.

    Figuur 3.31 Skematiese proteïenvingerafdrukke deur massaspektrometrie. Proteïenmengsels word uit selkweek- of tussie -monsters berei en met gelelektroforese geskei. Enkele proteïene word geïsoleer en verteer met behulp van tripsien om 'n peptiedmengsel te produseer. Peptiede word deur vloeistofchromatografie geskei en deur massaspektrometrie ontleed

    Terug na bo

    3.4 Proteïenstruktuur Toeligting

    X-straal kristallografie

    Proteïen X-straal kristallografie is 'n tegniek wat gebruik word om die driedimensionele struktuur van 'n bepaalde proteïen te verkry deur X-straaldiffraksie van sy gekristalliseerde vorm. Hierdie driedimensionele struktuur is deurslaggewend vir die bepaling van 'n proteïen se funksionaliteit. Die maak van kristalle skep 'n rooster waarin hierdie tegniek miljoene proteïenmolekules in lyn bring om die data-insameling meer sensitief te maak. Dit is soos om 'n stapel papier te kry, die breedte te meet met 'n liniaal en die lengte te deel met die aantal bladsye om die breedte van een stuk papier te bepaal. Deur hierdie gemiddelde tegniek word die geraasvlak verminder en die sein tot geraas -verhouding neem toe. Die spesifisiteit van die proteïen se aktiewe plekke en bindingsplekke hang heeltemal af van die presiese bouvorm van die proteïen. Benewens die proteïenstruktuur, kan ander biologiese molekules ondersoek word met behulp van röntgenkristallografie. Dit was die X-straal-kristallografie deur Rosalind E.Franklin, wat dit vir J.D. Watson en F.H.C. Kriek om die dubbelheliksstruktuur van DNA uit te vind.

    Röntgenkristallografie kan die gedetailleerde driedimensionele strukture van duisende proteïene onthul. Die drie komponente in 'n X-straal kristallografiese analise is 'n proteïenkristal, 'n bron van X-strale en 'n detektor.

    X-straalkristallografie word gebruik om molekulêre strukture te ondersoek deur die groei van soliede kristalle van die molekules wat hulle bestudeer. Kristallograwe rig kragtige X-strale op 'n klein kristal wat triljoene identiese molekules bevat. Die kristal versprei die X-strale na 'n elektroniese detektor. Die elektroniese detektor is dieselfde tipe wat gebruik word om beelde in 'n digitale kamera op te neem. Na elke ontploffing van X-strale, wat van 'n paar sekondes tot 'n paar uur duur, draai die navorsers die kristal presies deur die gewenste oriëntasie in die rekenaar in te voer wat die X-straalapparaat beheer. Dit stel die wetenskaplikes in staat om in drie dimensies vas te stel hoe die kristal X-strale versprei of afbreek. Die intensiteit van elke verstrooide straal word in 'n rekenaar ingevoer, wat 'n wiskundige vergelyking gebruik om die posisie van elke atoom in die gekristalliseerde molekule te bereken. Die resultaat is 'n driedimensionele digitale beeld van die molekule (Figuur 3.32).

    Kristallograwe meet die afstande tussen atome in angstrom. Die perfekte &ldquorulers&rdquo om angstromafstande te meet, is X-strale. Die X-strale wat kristallograwe gebruik, is ongeveer 0,5 tot 1,5 angstrom lank, wat net die regte grootte is om die afstand tussen atome in 'n molekule te meet. As die straling 'n golflengte wat baie groter of baie kleiner as die bindingslengte van 'n kovalente binding gehad het, sou die lig nie diffraksie hê nie en geen nuwe kennis van die struktuur sou verkry word nie. Daarom word X-strale gebruik.

    Figuur 3.32 Werkstroom vir die oplossing van die struktuur van 'n molekule deur röntgenkristallografie

    Beeld van Thomas Splettstoesser

    Die proses begin deur 'n proteïen van belang te kristalliseer. Kristallisasie van proteïen veroorsaak dat al die proteïenatome op 'n vaste manier ten opsigte van mekaar georiënteer word terwyl hulle steeds hul biologies aktiewe konformasies behou - 'n vereiste vir X-straaldiffraksie. 'N Proteïen moet uitgesak word of uit 'n oplossing onttrek word. Die duimreël is om so 'n suiwer proteïen as moontlik te kry om baie kristalle te laat groei (dit laat die kristalle gelaaide eienskappe hê en die oppervlakte gelaaide verspreiding vir beter verstrooiingsresultate). 4 kritieke stappe word geneem om proteïenkristallisasie te bewerkstellig, dit is:

    1. Suiwer die proteïen. Bepaal die suiwerheid van die proteïen, en as dit nie suiwer is nie (gewoonlik 99%), moet dit verder gesuiwer word.
    2. Moet proteïen presipiteer. Dit word gewoonlik gedoen deur die proteïen op te los in 'n geskikte oplosmiddel (waterbufferoplossing met organiese sout, soos 2-metiel-2,4-pentaandiol). As proteïen onoplosbaar is in waterbuffer of waterorganiese buffer, moet 'n skoonmaakmiddel soos natriumlaurylsulfaat bygevoeg word.
    3. Die oplossing moet tot oorversadiging gebring word (kondensasie van die proteïen uit die res van die oplosmiddel wat kondensasiekerne vorm). Dit word gedoen deur 'n sout by die gekonsentreerde oplossing van die proteïen te voeg, die oplosbaarheid daarvan te verminder en die proteïen in staat te stel om 'n hoogs georganiseerde kristal te vorm (daar word na hierdie proses verwys as uitsouting). Ander metodes sluit in batchkristallisasie, vloeistof-vloeistofkristallisasie, dampdiffusie en dialise.
    4. Laat die werklike kristalle groei. Aangesien kerne -kristalle gevorm word, sal dit daartoe lei dat werklike kristalgroei verkry word.

    Die kristalle word dan met X-strale gebombardeer, die diffraksiepatrone word aangeteken, en die struktuur word herkonfigureer vanaf die diffraksiepatroon deur gebruik te maak van Fourier Transformasie. Deur die Fourier -transformasie word die elektrondigtheidverdeling geïllustreer as 'n reeks parallelle vorms en lyne wat op mekaar gestapel is (kontoerlyne), soos 'n terreinkaart. Die kartering gee 'n driedimensionele voorstelling van die elektrondigthede wat deur die x-straalkristallografie waargeneem word. Wanneer die elektrondigtheidkaart geïnterpreteer word, moet resolusie in ag geneem word. 'N Resolusie van 5 & Aring - 10 & Aring kan die struktuur van polipeptiedkettings, 3 & Aring - 4 & Aring van groepe atome, en 1 & Aring - 1.5 & Aring van individuele atome onthul. Die resolusie word beperk deur die struktuur van die kristal en vir proteïene is ongeveer 2 & Aring.

    Baie vooruitgang in die ontdekking van medisyne en medisyne is grootliks te danke aan X-straalkristallografie deur die identifisering van geneesmiddeldoelwitte by baie siektes wat vandag floreer. Aan die einde van die 80's het wetenskaplikes byvoorbeeld 'n deurbraak gemaak met die gebruik van röntgenkristallografie om die struktuur van HIV Protease te produseer, 'n ensiem wat noodsaaklik was vir die retrovirus en die lewensiklus. Die ensiem sny virale proteïenstringe wat hoofkomponente van onvolwasse virale selle is in afsonderlike, volwasse proteïene wat kan voortgaan om meer volwasse en aansteeklike virale deeltjies te vorm. Deur noukeurig na die struktuur daarvan te kyk, spesifiek sy simmetrie, het navorsers begin om verbindings te maak wat in wisselwerking tree met die aktiewe plek van die ensiem, wat in die middel van sy simmetriese helftes is, om die ensiem af te sluit en te verhoed dat dit behoorlik funksioneer. Verbasend genoeg was daar teen die middel van die negentigerjare drie middels wat HIV -protease -remmers op die mark bring, wat die sterftesyfer van die VIGS -virus drasties verminder (Figuur 3.33)

    Figuur 3.33. Kristalstruktuur van die D-enantiomeer van die ruggraat vervaardigde HIV-1 PR wat in totaal opgestel ischemiese sintese gekomplekseer aan D-MVT101 inhibeerder. (a) Kokristalle is verkry uit 50% ammoniumsulfaat, pH 5.4, in die ruimtegroep P212121a = 67.5, b = 92.8, c = 29.4 Å. Daar was twee monomere van proteïen en een inhibeerder in die kristallografiese asimmetriekunit. (b) Stereo-aansig van C&alfa-nasporing van D MIV-1 PR. Gebind D MVT-101-remmer word as groen stokkies getoon. Koördinate is in MIV-strukturele databasis48-toetredingskode:NCI2009 gedeponeer

    Terug na bo

    Kernmagnetiese resonansie (KMR) beelding

    Kernmagnetiese resonansiespektroskopie van proteïene (gewoonlik afgekort proteïen KMR) is 'n veld van strukturele biologie waarin NMR -spektroskopie gebruik word om inligting te verkry oor die struktuur en dinamika van proteïene, en ook nukleïensure, en hul komplekse. Die veld is baanbrekerswerk deur Richard R. Ernst en Kurt W & uumlthrich aan die ETH, en onder andere deur Ad Bax, Marius Clore en Angela Gronenborn aan die NIH. Struktuurbepaling deur KMR-spektroskopie bestaan ​​gewoonlik uit verskeie fases, wat elk 'n aparte stel hoogs gespesialiseerde tegnieke gebruik. Die monster word voorberei, metings word gedoen, interpretatiewe benaderings word toegepas en 'n struktuur word bereken en gevalideer.

    KMR behels die kwantummeganiese eienskappe van die sentrale kern ("nucleus") van die atoom. Hierdie eienskappe is afhanklik van die plaaslike molekulêre omgewing, en die meting daarvan gee 'n kaart van hoe die atome chemies verbind is, hoe naby hulle in die ruimte is en hoe vinnig hulle beweeg ten opsigte van mekaar. Hierdie eienskappe is fundamenteel dieselfde as dié wat in die meer bekende magnetiese resonansbeelding (MRI) gebruik word, maar die molekulêre toepassings gebruik 'n ietwat ander benadering, geskik vir die verandering van skaal van millimeters (van belang vir radioloë) na nanometers (gebonde atome is gewoonlik 'n breukdeel van 'n nanometer uitmekaar). Hierdie verandering van skaal vereis baie hoër sensitiwiteit van opsporing en stabiliteit vir langtermynmeting. In teenstelling met MRI, genereer strukturele biologie-studies nie direk 'n beeld nie, maar maak hulle staat op komplekse rekenaarberekeninge om driedimensionele molekulêre modelle te genereer.

    Tans word die meeste monsters in 'n oplossing in water ondersoek, maar metodes word ontwikkel om ook met vaste monsters te werk. Data-insameling berus daarop om die monster binne 'n kragtige magneet te plaas, radiofrekwensieseine deur die monster te stuur en die absorpsie van daardie seine te meet. Afhangende van die omgewing van atome binne die proteïen, sal die kerne van individuele atome verskillende frekwensies van radioseine absorbeer. Verder kan die absorpsie seine van verskillende kerne deur aangrensende kerne versteur word. Hierdie inligting kan gebruik word om die afstand tussen kerne te bepaal. Hierdie afstande kan weer gebruik word om die algehele struktuur van die proteïen te bepaal.

    'N Tipiese studie kan behels hoe twee proteïene met mekaar in wisselwerking tree, moontlik met die oog op die ontwikkeling van klein molekules wat gebruik kan word om die normale biologie van die interaksie te ondersoek (& quotchemiese biologie & quot) of om moontlike leidrade vir farmaseutiese gebruik (geneesmiddelontwikkeling) te verskaf. Dikwels is die interaksie -paar proteïene geïdentifiseer deur studies oor menslike genetika, wat daarop dui dat die interaksie deur ongunstige mutasies ontwrig kan word, of dat dit 'n sleutelrol kan speel in die normale biologie van 'n "model" soos die vrugtevlieg, gis, wurm C. elegans, of muise.

    Kernmagnetiese resonansie van proteïene word uitgevoer op waterige monsters van hoogs gesuiwerde proteïene. Gewoonlik bestaan ​​die monster uit tussen 300 en 600 mikroliter met 'n proteïenkonsentrasie tussen 0,1 en 3 millimolar. Die bron van die proteïen kan natuurlik of in 'n produksiestelsel geproduseer word deur rekombinante DNA -tegnieke deur middel van genetiese manipulasie. Gewoonlik word rekombinant uitgedrukte proteïene in voldoende hoeveelheid vervaardig, en hierdie metode maak isotopiese etikettering moontlik.

    Die gesuiwerde proteïen word gewoonlik in 'n bufferoplossing opgelos en by die verlangde oplosmiddeltoestande aangepas. Die KMR-monster word in 'n dunwandige glasbuis voorberei. (Figuur 3.34)

    Figuur 3.34 Die NMR-monster word in 'n dunwandige glasbuis voorberei

    Met ongemerkte proteïene is die gewone prosedure om 'n stel tweedimensionele homonukleêre kernmagnetiese resonanseksperimente op te neem deur middel van korrelasiespektroskopie (COZY), waarvan verskeie tipes konvensionele korrelasiespektroskopie insluit, totale korrelasie spektroskopie (TOCSY) en kern Overhauser effek spektroskopie (NOESY). 'n Tweedimensionele kernmagnetiese resonansie-eksperiment produseer 'n tweedimensionele spektrum. Die eenhede van beide asse is chemiese verskuiwings. Die COSY en TOCSY dra magnetisasie oor deur die chemiese bindings tussen aangrensende protone (Figuur 3.35). Die konvensionele korrelasiespektroskopie-eksperiment is slegs in staat om magnetisasie tussen protone op aangrensende atome oor te dra, terwyl die protone in die totale korrelasiespektroskopie-eksperiment in staat is om die magnetisering oor te dra, dus word dit oorgedra tussen al die protone wat deur aangrensende atome verbind is. Dus, in 'n konvensionele korrelasiespektroskopie, dra 'n alfa -proton magnetisering oor na die beta -protone, die beta -protone word oorgedra na die alfa- en gamma -protone, indien enige, is die gamma -proton na die beta- en delta -protone oorgedra, en die proses gaan voort . In totale korrelasiespektroskopie kan die alfa en al die ander protone magnetisering na die beta, gamma, delta, epsilon oordra as hulle verbind word deur 'n deurlopende ketting van protone. Die deurlopende ketting van protone is die syketting van die individuele aminosure.

    Hierdie twee eksperimente word dus gebruik om sogenaamde spin -stelsels te bou, dit wil sê 'n lys van resonansies van die chemiese verskuiwing van die peptiedproton, die alfa -protone en al die protone uit elke residu en rsquos -syketting. Watter chemiese verskuiwings stem ooreen met watter kerne in die spinstelsel bepaal word deur die konvensionele verbindings met korrelasiespektroskopie en die feit dat verskillende tipes protone kenmerkende chemiese verskuiwings het.Om die verskillende spinsisteme in 'n opeenvolgende volgorde te verbind, moet die kern-Overhauser-effekspektroskopie-eksperiment gebruik word. Omdat hierdie eksperiment magnetisering deur die ruimte oordra, sal dit kruispieke toon vir alle protone wat naby in die ruimte is, ongeag of hulle in dieselfde spinstelsel is of nie. Die naburige residue is inherent naby aan die ruimte, sodat die toewysings deur die pieke in die NOESY met ander draaistelsels gemaak kan word.

    Figuur 3.35: Vergelyking van 'n COSY- en TOCSY 2D-spektra vir 'n aminosuur soos glutamaat of metionien. Die TOCSY wys diagonale kruispieke tussen alle protone in die spektrum, maar die COSY het net kruispieke tussen bure.

    Een belangrike probleem met behulp van homonukleêre kernmagnetiese resonansie is oorvleueling tussen pieke. Dit vind plaas wanneer verskillende protone dieselfde of baie soortgelyke chemiese verskuiwings het. Hierdie probleem word groter namate die proteïen groter word, so homonukleêre kernmagnetiese resonansie is gewoonlik beperk tot klein proteïene of peptiede.

    As rekombinante proteïene geproduseer kan word, kan die resulterende proteïen gemerk word met stikstof-15 of met koolstof-13 om meer gedetailleerde eksperimentering moontlik te maak, soos heteronukleêre enkel-kwantum-koherensiespektroskopie (HSQC). Die mees algemeen uitgevoer 15N eksperiment is die 1 H-15 N HSQC. Die eksperiment is hoogs sensitief en kan dus relatief vinnig uitgevoer word. Dit word gereeld gebruik om die geskiktheid van 'n proteïen vir die bepaling van die struktuur met behulp van NMR te kontroleer, sowel as om die monstertoestande te optimaliseer. Dit is een van die standaard reeks eksperimente wat gebruik word vir die bepaling van die oplossingstruktuur van proteïen. Die HSQC kan verder uitgebrei word na drie- en vierdimensionele NMR-eksperimente, soos 15 N-TOCSY-HSQC en 15 N-NOESY-HSQC (Figuur 3.36).

    1 H&ndash 15 N HSQC-spektrum van 'n fragment van 'n isotopies-gemerkte proteïen NleG3-2. Elke piek in die spektrum verteenwoordig 'n gebinde N-H-paar, met sy twee koördinate wat ooreenstem met die chemiese verskuiwings van elk van die H- en N-atome. 1 H & ndash 15 N HSQC spektrum van 'n fragment van 'n isotopies gemerkte proteïen NleG3-2. Elke piek in die spektrum verteenwoordig 'n gebonde N-H-paar, met sy twee koördinate wat ooreenstem met die chemiese verskuiwings van elk van die H- en N-atome.

    Figuur 3.36 1 H&ndash 15 N HSQC-spektrum van 'n fragment van 'n isotopies-gemerkte proteïen NleG3-2. Elke piek in die spektrum verteenwoordig 'n gebinde N-H-paar, met sy twee koördinate wat ooreenstem met die chemiese verskuiwings van elk van die H- en N-atome.

    Beeld van: Wu, B., et. al. (2010) PLoS Patogene 6(6):e1000960.

    Kryo-elektronmikroskopie

    Kriogeniese-elektronmikroskopie (cryo-EM) het onlangs na vore gekom as 'n kragtige tegniek in strukturele biologie wat in staat is om hoë-resolusie digtheid kaarte van makromolekulêre strukture te lewer (Fig. 3.37). Resolusies wat 1.5 Å nader, is nou moontlik en kaarte in die 1&ndash4-Å-reeks lig die konstruksie van atomistiese modelle met 'n hoë mate van vertroue in. Hierdie nuwe vermoë vir ondersoekers om makromolekulêre strukture met hoë resolusie en sonder die behoefte aan kristallogenese te bepaal, het gelei tot 'n ontploffing van belangstelling in die aanvaarding van cryo-EM.

    Proteïensuspensies word gevries op 'n 3 mm-deursnee-transmissie-elektronmikroskoop (TEM) ondersteuningsroosters gemaak van 'n geleidende materiaal (bv. Cu of Au) wat bedek is met 'n koolstoffilm met 'n gereelde reeks perforasies 1 & ndash2 & mamma in deursnee. 'N Totaal van drie en vyf monsters word op die rooster gelaai, wat dan onmiddellik met filterpapier gestroop word met die doel om 'n film buffer/proteïen op die rooster te skep wat, wanneer dit gevries is, dun genoeg is sodat die elektronbundel kan binnedring. Die optimalisering van die ysdikte is 'n belangrike stap in die voorbereiding van monsters, aangesien dikker lae ys die waarskynlikheid vergroot dat die invallende elektron verskeie verstrooiings sal ondergaan en sodoende die beeldkwaliteit sal verminder. In die geval van uiterste ysdikte, dring die elektronbundel glad nie deur nie. Na klad word die rooster vinnig in 'n bad van vloeibare etaan gedompel en baie effektiewe kriogeen wat water met genoegsame snelheid vries om die vorming van yskristalle te voorkom. Die vorming van 'n glasagtige yslaag is die fundamentele stap in cryo-EM en behou die teiken in 'n byna inheemse toestand. Die resulterende glasagtige yslaag met gesuspendeerde proteïenmolekules moet dan naby aan vloeibare stikstoftemperatuur (&minus&thinsp196 °C) bly tydens berging en beeldvorming in die TEM om faseveranderinge na ander soorte ys te voorkom wat nie vatbaar is vir hoë kwaliteit beelding en bewaring van proteïen struktuur.

    Beeldvorming in cryo-EM is hoofsaaklik deur fase-kontras, hoewel tussen 7 en 10% van die beeldkontras afkomstig is van amplitude-kontras. Amplitudekontras, waar 'n elektron in so 'n mate verstrooi word dat dit deur 'n apertuur of energiefilter langs die pad van die TEM-kolom verwyder word, word oor die algemeen nie oorweeg nie, aangesien die inligting wat verkry word gewoonlik 'n lae resolusie is in vergelyking met fasekontras.

    Figuur 3.37 Kryo-elektronmikroskopie. (a) die Skotse Centrel for Macromolecular Imaging JEOL CryoARM 300. (b) Hoë-resolusie 2.2-Å resolusie struktuur van lumasien sintase.

    Voordele en nadele van struktuuropklaring

    Die verkryging van 'n suiwer, hoogs gekonsentreerde (mM) proteïenmonster is 'n belangrike knelpunt vir beide röntgenkristallografie en NMR. Die hoë konsentrasie word vereis omdat beide tegnieke onsensitief is vir enkelmolekule-analise, en 'n groot populasie van 'n spesifieke proteïen is nodig om die sein-tot-geraas versperring te oorkom. Op 'n soortgelyke noot moet die monster baie homogeen wees, dus is proteïensuiwering op 'n sekere punt nodig. Cryo-EM benodig aansienlik minder proteïene as vir die ander twee metodes, maar steeds 'baie' volgens enige standaard. Tipies benodig Cryo-EM preparate teen 'n konsentrasie van 1 mg/ml in 'n volume van ten minste 50 &mul, terwyl kristallogenese 500 &mul proteïen teen 'n konsentrasie van 5 -10 mg/ml kan vereis. Cryo-Em vereis ook dat die proteïen in 'n lae-soutbuffer voorberei word, met minimale bymiddels, om goeie vriesing en beeldkontras te verseker.

    Rekombinante proteïenproduksie met behulp van E coli is die gekose metode wanneer groot hoeveelhede proteïen benodig word. Hierdie proses behels die neem van die geen (dikwels cDNA) van die proteïen van belang, die splitsing daarvan in 'n geskikte induseerbare vektor, die transformasie van die vektor in 'n E coli gasheer, en die kultuur in 'n ryk medium laat groei. Die bakteriële gasheer sal vermeerder tydens 'n groeifase, waarna dit veroorsaak word om die proteïen van belang uit te druk. As alles goed gaan, sal die proteïen oplosbaar en in hoë getalle uitgedruk word. Ongelukkig is hierdie proses makliker gesê as gedaan. Baie eukariotiese proteïene kom nie goed tot uiting in prokaryotiese gashere nie, en daar moet gereeld veranderings aangebring word om die bakteriële gasheer, kodongebruik, media, ens. Te optimaliseer om 'n behoorlike opbrengs van rekombinante proteïene te verkry. Boonop word proteïene dikwels onoplosbaar as opnemingsliggame uitgedruk en benodig hoë konsentrasies (2M tot 8M) denaturante, soos ureum of guanidienhidrochloried, om dit op te los, en dan stapsgewys in dialise in 'n geskikte buffer om dit weer op te vou. Alternatiewelik kan eukariotiese organismes soos S. cerevisiae (gis), insek- en soogdiersellyne kan gebruik word, veral wanneer post-translasie modifikasies vereis word, alhoewel 'n afname in opbrengs en toename in algehele koste algemeen is met hierdie organismes.

    Die moeilikheidsgraad van proteïenproduksie word vererger vir NMR deur die feit dat alle proteïene 15 N en/of 13 C gemerk moet wees, aangesien slegs hierdie isotope kerne het met + & frac12 en - & frac12 spin toestande wat die energietransisies moontlik maak vir 'n radiofrekwensie NMR -sein let op dat 1 H ook 'n frac12 -spin -toestand het, maar baie volop is.

    Proteïenstabiliteit is 'n probleem vir beide kristallografie en NMR. Sodra 'n proteïen uitgedruk, gesuiwer en gekonsentreer is, moet dit sy strukturele integriteit behou vir die duur van die eksperimente. Vir kristallografie behels dit die kristallisasieproses, waar die proteïenmonster in 'n verskeidenheid oplossings (wat meestal hoë konsentrasies poliëtileenglikol behels) geplaas word wat kristallisasie veroorsaak. Dikwels na verwys as 'n voodoo-tegniek, word kristallisasietoestande in 'n hoë deursetmetode getoets deur 96-put siftingsplate te gebruik, en enige treffers word verder geoptimaliseer deur 'n groter volume van die spesifieke oplossing te gebruik. Terwyl 'n kristallisasietoestand uiteindelik gevind kan word, kan die proses enige plek van 'n paar dae tot selfs 'n jaar of twee neem om te gebeur, wat die kristallisasieproses die tempo-beperkende stap vir proteïenkristallograwe maak. Gedurende hierdie tyd moet die proteïen in oplossing bly en sy struktuur behou om 'n kristal van hoë gehalte te produseer, 'n toestand wat nie gereeld die geval is nie.

    Net so word 'n stabiele, hoogs gekonsentreerde proteïenmonster benodig om baie van die meer gevorderde KMR-eksperimente uit te voer. Dit is omdat baie van hierdie eksperimente dae en selfs weke neem om te loop, waartydens die homogeniteit van die oplossing die sleutel is tot die verkryging van kwaliteitspektra. As die proteïen tydens 'n eksperiment ontvou of uit die oplossing neerslaan, sal die gevolglike chemiese verandering óf geen sein lewer nie, óf een wat nie gebruik kan word vir die bepaling van struktuur/dinamika nie.

    Vir Cryo-EM bring die werk met bevrore-gehidreerde monsters 'n aantal uitdagings vir beide manipulasies en beelding. By die hantering van cryo-EM roosters om dit in die mikroskoop te laai, lei blootstelling aan atmosferiese waterdamp vinnig tot rypopbou op die rooster. Onder die TEM verskyn hierdie yskristalle op die roosteroppervlak as groot rotsblokke wat die elektronbundel heeltemal blokkeer. Daarom word roosters soveel as moontlik onder vloeibare stikstof gehou om rypbesmetting te verminder. Probleme met ystoestande kom algemeen voor, en onvoldoende vinnige vries lei tot die vorming van seshoekige ys, terwyl devitrifikasie plaasvind wanneer monsters opwarm, wat lei tot die vorming van kubieke ys. Verskeie grade van besmetting kan voorkom, en ryp by atmosferiese druk veroorsaak die bogenoemde yskristalafsetting, terwyl besmetting binne die kolom of onder lae-vakuumomstandighede 'n meer subtiele artefak tot gevolg het.

    Een van die kenmerke van proteïenkristallografie is dat grootte nie saak maak nie. Of dit nou met 'n 25 kDa monomere proteïen of 'n 900 kDa multimere kompleks werk, as dit gekristalliseer kan word en 'n hoë resolusie diffraksiepatroon kan produseer, kan die struktuur daarvan bepaal word. Dit is te wyte aan die feit dat 'n proteïen in kristalvorm 'n min of meer statiese konformasie het, wat 'n enkele strukturele model kan produseer nadat dit deur die x-straalstraal in verskillende hoeke gelei is. Cryo-EM is soortgelyk in hierdie verband. Baie groot strukture, insluitend massiewe nukleoproteïenkomplekse, soos die ribosoom, kan met behulp van Cryo-EM toegelig word. Dieselfde kan nie vir KMR gesê word nie.

    In KMR is die proteïen in 'n oplosbare toestand en dus in konstante beweging. Die belangrikste beweging wat die spektrale kwaliteit beheer, is dié van die molekulêre tuimeltempo. Vir proteïene groter as ongeveer 40 kDa neem die tuimeltempo aansienlik af, wat op sy beurt die transversale ontspanningstempo verhoog (T)2). In wese lei dit tot 'n swakker en vinnig vervalle KMR-sein, wat hom manifesteer in piekverbreding en spektrale oorvleueling.

    Een van die groot voordele van KMR is sy vermoë om klein en grootskaalse proteïendinamika aan te teken, 'n verskynsel wat oor die algemeen onderdruk word wanneer 'n proteïen gekristalliseer word. Alhoewel 'n gekristalliseerde proteïen 'n sekere mate van beweging binne die rooster kan vertoon, manifesteer die bewegings hulself as statiese of dinamiese versteuring, waarvan eersgenoemde twee verskillende konformasies van 'n spesifieke streek tot gevolg kan hê, en laasgenoemde in gemiddelde elektrondigtheid. Oor die algemeen kan kristallisasie 'n proteïen se natuurlike buigsaamheid en bewegings beperk. Cryo-EM het dieselfde beperking, aangesien monsters gevries en onbeweeglik is. Cryo-EM is egter in staat om 'n kiekie van die inheemse struktuur te neem, aangesien bevriesing onmiddellik is en nie die vorming van 'n kristalrooster vereis nie.

    Kristallografie word egter nie in die koue gelaat wanneer dit by dinamiese struktuurontleding kom nie. Tyd-opgeloste kristallografie kan gebruik word om veranderinge in die proteïenstruktuur te monitor na toevoeging van een of ander ligand, of verandering in die omgewing. Omdat alle proteïenkristalle hoogs gehidreer is, kan hulle as smeltkroes vir sommige biochemiese reaksies dien. Die kristal word tipies geweek in 'n oplossing wat die ligand van belang bevat om die biochemiese reaksie te begin, waarna die kristal vinnig in die straallyn geplaas word en diffraksiepatroon verkry word. Dit kan verskeie kere uitgevoer word indien nodig om 'n verskeidenheid strukturele tussenprodukte te verkry. Die proses vereis egter dat baie dinge reg verloop: die proteïen kan nie wanordelik raak nie, en die kristal moet ook nie krake raak tydens die week nie, en 'n hoëkrag-sinchrotron is nodig om diffraksiedata van hoë gehalte oor kort blootstellingstye te versamel.

    Op die ou end is proteïen x-straal kristallografie, krio-EM en KMR spektroskopie nie wedersyds uitsluitende tegnieke wat mens maklik kan optel waar die ander te kort skiet nie. By die analise van NMR-dinamika-eksperimente, byvoorbeeld, kan 'n mens baie baat vind by bestaande kristalstruktuurdata, of cryo-EM-data waarop die NMR-struktuurdata bo-op gelê kan word. Net so kan NMR-struktuurdata gebruik word om 'n cryo-EM- of kristalstruktuur aan te vul met meer inligting oor die dinamika van die proteïen, bindingsinligting en konformasieveranderinge in oplossing.

    Terug na bo

    3.5 Proteoomanalise

    Die proteoom is die hele stel proteïene wat deur 'n organisme of stelsel geproduseer of verander word. Proteomics het die identifisering van 'n toenemende aantal proteïene moontlik gemaak. Dit wissel met tyd en afsonderlike vereistes, of spanning, wat 'n sel of organisme ondergaan. Proteomics is 'n interdissiplinêre domein wat baie baat gevind het by die genetiese inligting van verskillende genoomprojekte, insluitend die Human Genome Project. Dit dek die verkenning van proteome vanaf die algehele vlak van proteïensamestelling, struktuur en aktiwiteit. Dit is 'n belangrike komponent van funksionele genomika.

    Na genomika en transkriptomika is proteomika die volgende stap in die studie van biologiese stelsels. Dit is meer ingewikkeld as genomika omdat die genoom van 'n organisme min of meer konstant is, terwyl proteome van sel tot sel en van tyd tot tyd verskil. Afsonderlike gene word in verskillende seltipes uitgedruk, wat beteken dat selfs die basiese stel proteïene wat in 'n sel geproduseer word, geïdentifiseer moet word.

    In die verlede is hierdie verskynsel beoordeel deur middel van RNA -analise, maar daar was geen korrelasie met proteïeninhoud nie. Nou is dit bekend dat mRNA nie altyd in proteïen vertaal word nie, en die hoeveelheid proteïen wat vir 'n gegewe hoeveelheid mRNA geproduseer word, hang af van die geen waaruit dit getranskribeer word en van die huidige fisiologiese toestand van die sel. Proteomika bevestig die teenwoordigheid van die proteïen en verskaf 'n direkte maatstaf van die hoeveelheid teenwoordig.

    'n Sel kan verskillende stelle proteïene op verskillende tye of onder verskillende toestande maak, byvoorbeeld tydens ontwikkeling, sellulêre differensiasie, selsiklus of karsinogenese. Verdere toenemende proteoomkompleksiteit, soos genoem, is die meeste proteïene in staat om 'n wye reeks post-translasionele modifikasies te ondergaan.

    Daarom kan 'n proteomika -studie baie vinnig kompleks word, selfs al is die onderwerp van studie beperk. In meer ambisieuse omgewings, soos wanneer 'n biomerker vir 'n spesifieke kankersubtipe gesoek word, kan die proteomika-wetenskaplike kies om verskeie bloedserummonsters van verskeie kankerpasiënte te bestudeer om verwarrende faktore te minimaliseer en vir eksperimentele geraas rekening te hou. Verder ondergaan baie proteïene post -translasionele modifikasies soos fosforoëlering. Baie van hierdie post-translasionele veranderinge is van kritieke belang vir die funksie van die proteïen. Dus, ingewikkelde eksperimentele ontwerpe is soms nodig om die dinamiese kompleksiteit van die proteoom te verantwoord.

    3.6 Verwysings

    Molnar, C. en Gair, J. (2013) Antilichamen. Chapter in Concepts in Biology, uitgegee deur B.C. Maak Handboekprojek oop. Beskikbaar by: https://opentextbc.ca/biology/chapter/23-3-antibodies/

    Die Menslike Atlas-projek. (2019) Metodes. Beskikbaar by: https://www.proteinatlas.org/learn/method

    Uhlén M et al, 2015. Weefselgebaseerde kaart van die menslike proteoom. Wetenskap
    PubMed: 25613900 DOI: 10.1126/science.1260419


    Affiniteitskromatografie (AC)

    Affiniteitschromatografie is 'n multi-stap proses (binding, was, eluering) wat gekenmerk word deur spesifieke binding van die doelmolekules aan die kolom materiaal. Daarom moet die ligand van die stilstaande fase by die teikenmolekules aangepas word. In 'n wasstap word alle nie-spesifiek gebonde gedeeltes van die monster verwyder. Die daaropvolgende elueringsstap stel die doelmolekules vry.


    Resultate

    FliC in proteïenvoorbereidings vanaf UPEC CFT073 en MC4100

    Ons het aanvanklik die opbrengs en relatiewe suiwerheid van FliC in ekstrakte van heelsel-lisate en flagella-verrykte proteïenpreparate gegenereer deur fisiese skeer, filtrasie en ultrasentrifugering beoordeel. Western blot-analise van heelsellysate wat gemaak is uit UPEC CFT073 en MC4100 (verbou in vloeibare media) met behulp van anti-flagellien antisera, toon geen duidelike bande vir CFT073 of MC4100 (wat nie werk nie flhDC) (Barembruch en Hengge, 2007). Bekendstelling van pMG600 (wat die flhDC gene van Serratia) in MC4100 het gelei tot 'n band vir FliC (繀 kDa) wat rekonstituering van flagella -uitdrukking in hierdie stam demonstreer (Figuur 2A).

    Figuur 2. Opsporing van FliC in heelsel-lisaat van UPEC CFT073 en MC4100 E coli. (A) Western blot vir FliC met volledige sellysaat van CFT073 Wt (baan 1), MC4100 (baan 2) en MC4100 +pflhDC (baan 3 -band 繀 kDa). Sellisate is afkomstig van bakteriële vloeistofkulture en het gereageer met anti-flagellienpoel H-tipe antisera. Flagella -ooruitdrukking in MC4100 +pflhDC lei tot FliC-opsporing. (B) Western blot vir FliC deur gebruik te maak van proteïenpreparate wat verryk is vir flagella met behulp van fisiese skeermetodes, filtrasie en ultrasentrifugering. Getoon: flagella-verrykte preparate van CFT073 Wt (baan 1 𠄲 1.0, en 2.5 μg proteïen, onderskeidelik, bands 繠 kDa), MC4100 (baan 3 geen band), MC4100 +pflhDC (4 bande 繀, 繠 kDa), CFT073ΔfliC (5 geen band), en MC4100 +pflhDC heelsellysaat berei uit 0,25% sagte agar kulture (6 band 繀 kDa). (C) Coomassie het SDS-PAGE gel van die proteïenmonsters wat vir Western blot gebruik word, gekleur. M, merker.

    Daaropvolgende ontleding van proteïenpreparate wat deur fisiese metodes vir flagella verryk is, toon 'n band vir CFT073 (繠 kDa) en 'n soortgelyke rekonstituering van flagella -uitdrukking in MC4100 deur die bekendstelling van pflhDC in trans bykomend tot 'n FliC-band van verwagte grootte (繀 kDa) in MC4100 pflhDC flagella-verryking onthul 'n band van gelyke grootte in vergelyking met CFT073 (繠 kDa) saam met geringe bande (Figuur 2B). Geen bande is opgespoor in proteïenpreparate wat verryk is vir flagella afkomstig van CFT073 ΔfliC (Figuur 2B).

    Heelsel-lisate wat met 0.25% sagte agar voorberei is, het die uitdrukking van flagella verhoog en 'n sterk band vir FliC maar noemenswaardige proteïenbesoedeling geopenbaar (Figure 2B,C). Die byvoeging van protease-inhibeerder het weglaatbare effekte in terme van proteolise gehad, soos in 'n vorige studie waargeneem (Lu et al., 2013). Die roerproses in mikrosentrifugebuise wat kogellagers bevat, het geen waarneembare effek op die lewensvatbaarheid van E coli, met 3 onafhanklike eksperimente wat “pre-” en “post-𠇚gitation kulture vergelyk wat ekwivalente getalle van c.f.u. (gemiddelde waardes ± SEM “pre-” = 2.28 ± 0.1 × 10 8 cfu ml 𢄡 vs. ȁPost-” 2.24 ± 0.1 × 10 8 mL 𢄡). Gesamentlik toon hierdie data (i) dat FliC -uitdrukking aan MC4100 verleen word deur flhDC verskaf in trans, (ii) flagella-verryking produseer 'n oorheersende populasie van 繠 kDa (CFT073/pflhDC) en 繀 kDa (MC4100/pflhDC), en (iii) vloeibare kultuur is beter as sagte agar-kultuur om FliC te verryk as gevolg van hoër suiwerheid, maar bied laer algehele opbrengs as gevolg van minder flagella-uitdrukking (selfs onder kultuurtoestande wat IPTG inkorporeer om te induseer flhDC uitdrukking in CFT073/pflhDC).

    Suiwering van FliC vanaf CFT073 㥄 en Identifikasie van gesuiwerde proteïene

    Die metodes wat hierbo beskryf is, bereik 'n maksimum relatiewe suiwerheid van FliC van ongeveer 85% gebaseer op densitometriese intensiteite van die groot band (FliC) in vergelyking met geringe besmettingsbande wat waargeneem word in Coomassie-gekleurde SDS-PAGE gels en Western blots (data word nie getoon nie). Vir FliC om geskik te wees vir immunologiese toetse het ons gepoog om 'n hoër graad van suiwerheid te bereik en 'n genetiese benadering onderneem om vreemde proteïenbesoedeling verder te verminder. Om dit te bereik, het ons 'n veelvuldige mutantstam van CFT073 gebruik, aangedui CFT073Δ4 (Wurpel et al., 2014), wat verwyderings bevat in gene wat kodeer vir groot oppervlakte fimbriae, insluitend tipe 1, F1C en P fimbriae, dit is gebruik vir FliC -ekstraksie langs sy afgeleide CFT073 Δ4ΔfliC draerbeheer vir verdere toetse te genereer.

    Fisiese ekstraksie van flagella uit CFT073 Δ4 het die relatiewe suiwerheid van die FliC-ekstrakte tot 纕% verbeter volgens densitometriese analise van SDS-PAGE-gels (Figuur 3A). Dit was noodsaaklik in hierdie toetse om groter hoeveelhede proteïene in die gels (tot 12.5 μg) te ontleed as wat tipies ontleed sou word om 'n hoër vlak van sensitiwiteit vir die opsporing van spoorproteïenkontaminasie te bereik. Ons het die oorblywende besmettingsbande met gel gesuiwer en hierdie proteïene geïdentifiseer met massaspektrometrie (MS) om hul potensiële belangrikheid by die aanpassing van gasheer-patogeen-interaksies in stroomaf-toetse te bepaal. MS-analise het hierdie proteïene geïdentifiseer as hoof buitenste membraanproteïene OmpA en OmpC, en oppervlak-gelokaliseerde fimbrillien en fimbriale proteïene (Tabel 4) hierdie proteïene het prominente rolle in gasheer-patogeen-interaksies, insluitend binding aan fagosietafvanger-reseptore en dien as hoofimmunogene (Jeannin) et al., 2005 Liu et al., 2012). Vergelyk met die protokol vir suiwering van bakteriële flagellien beskryf deur Smith et al. (2003) het ons 'n hoër opbrengs van proteïene en besmetting met fimbrillien, maar minder vreemde spesies met 'n hoër molekulêre gewig waargeneem met behulp van ons protokol (Figuur 3B). Daarom het ons addisionele metodes gesoek om dit van FliC, na suiwering, te skei.

    Figuur 3. Proteïen profiele van fliC-verrykte uittreksels uit CFT073Δ4fim Δfoc Δpap1 Δpap2) en sy fliek-gebrekkige afgeleide. (A) Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gel van FliC-proteïenpreparate (5 μg) verryk vir flagella vanaf CFT073/pflhDC (1), CFT073ΔfliC/pflhDC (2), CFT073Δ4/pflhDC (3), en CFT073 Δ4ΔfliC/pflhDC (4) bande gemerk a-e is gel-ekstraheer en daarna deur massaspektrofotometrie ontleed om proteïene te identifiseer en word in Tabel 3 gelys. (B) Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gel van proteïenmonsters (10 μg) voorberei met behulp van die protokol vir die suiwering van bakteriële flagellien beskryf deur (Smith et al., 2003) (1) in vergelyking met die protokol wat in die huidige studie gebruik is (2). Verskille in relatiewe hoeveelhede fimbrillien en vreemde spesies met hoër molekulêre gewig word in die jel getoon. M, merker.

    Tabel 4. Identiteite van mede-gesuiwerde proteïene geïsoleer met FliC vanaf CFT073Δ4 en sy fliC-deficient afgeleide met behulp van fisiese prosesse van skeer, filtrasie en ultrasentrifugasie.

    Na-suiwering van FliC tot Homogeniteit Met behulp van FPLC en Endotoxin Verwydering

    Om hoogs suiwer FliC te genereer, is proteïeneekstrakte wat soos hierbo gesuiwer is met behulp van fisiese prosesse van skeer, filtrasie en ultrasentrifugering, geskei deur grootte -uitsluitingschromatografie met behulp van 'n ÄKTA Pure proteïensuiweringsisteem met 'n Superdex 200 -verhoging 10/300 GL -kolom. Die breuke is ontleed deur UV-absorpsie by 215 en 280 nm tydens eluering, en is versamel en proteïenbevattende fraksie (s) is daarna gekonsentreer met behulp van Ultra Spin-kolomme en geanaliseer deur SDS-PAGE. FliC elueer in breuk 13 met 'n enkele piek, soos geïllustreer in figuur 4A. Standaard UV -absorpsie -instellings van 280 nm (gebruik vir die monitering van proteïene in geëlueerde breuke) het FliC nie opgespoor nie as gevolg van die afwesigheid van tryptofaan (en min tyrosienreste) in die proteïen, wat die toepassing van die alternatiewe golflengte van 215 nm nodig het om FliC te monitor.

    Figuur 4. Proteïenprofiel van FliC-verrykte uittreksel uit CFT073 Δ4fim Δfoc Δpap1 Δpap2). (A) Chromatogram van FliC uit uittreksel van CFT073Δ4. (B) SDS-PAGE jel van proteïen (5 μg) in fraksie 13 gegenereer uit CFT073Δ4/pflhDC (1) en CFT073 Δ4ΔfliC/pflhDC (2) volg proteïenkonsentrasie deur middel van sentrifugale filters. M, merker.

    Dit is belangrik dat hierdie eksperimente getoon het dat FLPC in wese die volledige verwydering van alle vreemde proteïenkontaminante uit die CFT073 behaal het.4 FliC uittreksels (Figuur 4B). Die na-suiweringsproses is afgehandel deur die FliC-preparate toe te pas op endotoksien-verwyderingskolomme, wat gelei het tot gemiddelde vlakke van endotoksien in die finale voorbereidings van 0.005 ± 0.002 EU. immuunstimulasiestudies van gesuiwerde FliC (maks. 0.125 EU. μg 𢄡 Braga et al., 2008, 0.025 EU. μg 𢄡 Metcalfe et al., 2010) en FliA (0.011 EU. μg 𢄡 Schulke et al., 2010). Sonder om hierdie endotoksien -verwyderingsstap uit te voer, vertoon die FliC -preparate gereeld konsentrasies van besmettende endotoksien bo 1 EU. μg 𢄡. Hierdie data, tesame met ons bevindings oor fisiese ekstraksiemetodes, vestig FLPC-gebaseerde na-suiwering en endotoksien verwydering as 'n uitstekende metode vir die nasuiwering van nie-gedenatureerde UPEC FliC tot homogeniteit, ideaal geskik vir stroomafwaartse immunologiese toetse.

    Karakterisering van die hittebestendigheid van FliC -homopolimere

    Die flagellêre filament bestaan ​​uit 11 protofilamente wat elk bestaan ​​uit FliC -monomere wat as homopolimere gestabiliseer is deur subeenheid hidrofobiese interaksies (Yonekura et al., 2003). Variasie in die stabiliteit van flagella-filamente tussen spesies (Yoon en Mekalanos, 2008) het ons aangespoor om die hitte-stabiliteit van CFT073 FliC-homopolimere te kenmerk met die doel om FliC-monomere te genereer, terwyl proteïen denaturasie geminimaliseer word sodat die gesuiwerde proteïene ideaal geskik is vir gasheer-patogeen interaksietoetse. Eksperimente wat met temperatuurgradiënte uitgevoer is, het getoon dat 'n behandeling van 60ଌ vir 10 minute FliC monomere gegenereer het teen 'n doeltreffendheid wat 90% nader (Figuur 5). Temperature bo 60 ଌ het gelei tot geringe toenames in die doeltreffendheid van monomerisering, terwyl daar by temperature onder 50 ଌ minimale monomerisering was. Daarom is 60 ଌ gekies as optimaal om 'n doeltreffende opwekking van FliC -monomere moontlik te maak, maar die gevolge van hitte denaturasie te beperk. Daarna het ons die neiging ondersoek na gemonomeerde FliC om selfpolymeriseer na hierdie hittebehandeling hiervoor, flagellêre filamente is by kamertemperatuur (RT), 60 ଌ of 90 ଌ geïnkubeer en die proteïene word dan by 4 ଌ, RT of gestoor 37 ଌ vir 2, 24 of 48 uur. Inheemse gelanalise van proteïene wat op hierdie wyse behandel is, het geen noemenswaardige herpolimerisasie van FliC-monomere in filamente getoon nadat monomere geïnkubeer en by 4 ଌ gestoor is nie. In teenstelling hiermee het FliC wat vir 24 uur of langer by RT of 37ଌ gestoor is, 'n mate van herpolimerisasie getoon (Figuur 6). Uit hierdie data kom ons tot die gevolgtrekking dat UPEC FliC-monomere ten minste 2 uur relatief stabiel is as monomere na de-polimerisasie by 60 ଌ vir 10 minute, maar inkubasie van monomere by hoër temperature en/of vir langer tydperke lei tot 'n mate van self-herpolymerisasie.

    Figuur 5. Hitte-geïnduseerde momerisering van gesuiwerde FliC. Inheemse PAGE-gel wat dissosiasie van FliC van polimeriese filamente na FliC-monomere toon (A) en relatiewe densitometriese kwantifisering van monomere by elke temperatuur wat getoets word (B).

    Figuur 6. Stabiliteit van FliC monomere. Ongeveer 5 μg FliC (10 μl), verdun in inheemse gelbuffer, is by kamertemperatuur (RT), 60 ଌ of 90 ଌ, die proteïene dan gestoor by 4 ଌ, RT of 37 ଌ vir 2 uur (A), 24 uur (B) en 48 uur (C) en daarna opgelos in inheemse gels. Die beelde toon geen noemenswaardige herpolymerisasie in flagella-filamente van FliC wat by 4 ଌ gestoor en gestoor is nie. In teenstelling hiermee het FliC wat 24 uur of langer by RT of 37 ଌ gestoor is, 'n mate van herpolimerisasie vertoon as twee groot bande (in plaas van 'n enkele band) in die beelde (B) en (C).

    Sitokienreaksie van makrofage op hoogs gesuiwerde FliC

    Om die immunologiese aktiwiteit van FliC tot homogeniteit gesuiwer te bepaal, het ons suiwer FliC vervolgens op makrofage -stimulasietoetse toegepas in vitro. Blootstelling van muriene J774A.1-makrofage aan 1 μg FliC vir 5 uur het gelei tot aansienlik verhoogde produksie van TNF-α, IL-1 β, IL-6, KC, IL-12 (p40) en IL- 12(p70) (Figuur 7), Ons het 'n geskikte draerkontrole vir hierdie eksperimente gegenereer deur ekstrakte van 'n fliC afgeleide van CFT073 Δ4 (GU2642), wat op dieselfde manier verwerk is as die FliC -preparaat hierbo. In vergelyking met stimulasie met FliC, was daar geen beduidende vlakke van enige van hierdie sitokiene in kulture van makrofage wat blootgestel is aan óf die draerkontrole (d.i. ekstrakte van GU2642) óf slegs kultuurmedia-kontrole (Figuur 7). Ons het nie beduidende vlakke van ander sitokiene waargeneem wat nie voorheen met flagella geassosieer is nie, soos G-CSF en GM-CSF (data nie getoon nie) en ook nie beduidende vlakke van IFN-γ opgespoor wat voorheen geassosieer is nie met sellulêre reaksies op flagella (Wyant et al., 1999). Ondersoek na die effek van endotoksienverwydering op makrofaagreaksies het hoër vlakke van verskeie sitokiene in kulture getoon wat gestimuleer is met gesuiwerde FliC wat nie vir endotoksienverwydering behandel is nie (“pre-”) in vergelyking met FliC wat vir endotoksienverwydering behandel is ( ȁPost-”) (Figuur 8). Vergelyking van die reaksies van makrofage op verskillende hoeveelhede FliC het getoon dat hoeveelhede FliC ρ μg ook beduidende produksie van verskeie sitokiene veroorsaak het, byvoorbeeld, 0.05 μg FliC het beduidende produksie van TNF-α geïnduseer in vergelyking met kontrolekulture wat met draer alleen behandel is (Figuur 8). In afsonderlike toetse wat menslike U937 monosiete en 5 637 epiteelselle gebruik het, het ons soortgelyke beduidende response vir TNF-α, IL-1β en IL-6 waargeneem, maar geen betekenisvolle response vir IL-8 of IL-12(p70) (data) nie gewys nie). Gesamentlik toon hierdie bevindinge dat makrofage -pro -inflammatoriese sitokienreaksies soos waargeneem in hierdie studie direk aan FliC toegeskryf kan word en in ooreenstemming is met vorige verslae oor immuunstimulasie -eienskappe van flagella.

    Figuur 7. Sitokienreaksie van makrofage op FliC gesuiwer tot homogeniteit van UPEC CFT073Δ4. J774A.1 makrofage is gestimuleer met 1 μg FliC vir 5 uur en supernatante is gebruik om die vlakke van TNF te meet-α, IL-1 β, IL-6, KC (gekies as 'n funksionele ekwivalent van menslike IL-8), IL-12 (p40) en IL-12 (p70). FliC veroorsaak hoër konsentrasies van hierdie sitokiene in vergelyking met draerbeheer (berei vanaf GU2642 met behulp van identiese suiweringsprosedures) of slegs media -beheer.

    Figuur 8. Sitokienreaksie van makrofage op FliC word gesuiwer in die stadiums van die protokol wat pre- en post-endotoksien verwyder word. J774A.1-makrofage is gestimuleer met 0,05-1 μg FliC wat nie vir 5 uur vir endotoksien verwydering (“pre-“) behandel is nie, behandel vir endotoksien verwydering (ȁPost-“) en supernatante is gebruik om die vlakke van TNF-α en IL-6 te meet. *P < 0.05 ****P < 0,0001.


    Monster konsentrasie

    Dit kan 'n voordeel wees om 'n monster te konsentreer voor gelfiltrering om die monstervolume te verminder en 'n vinnige, hoë resolusie grootte skeiding te vergemaklik. HiTrap -kolomme bied 'n gerieflike oplossing wat gereed is vir die konsentrasie van monsters. Tabel 7 gee voorbeelde van die hoë konsentrasiefaktore wat behaal is wanneer proteïene gekonsentreer word uit baie verdunde uitgangsmateriaal met behulp van HiTrap -kolomme wat vooraf met Sepharose HP -medium verpak is. Soortgelyke resultate kan bereik word met HiTrap-kolomme wat vooraf verpak is met Sepharose Fast Flow of Sepharose XL media


    Aanvullende lêers

    'N Lab-on-a-chip vir vinnige bloedskeiding en kwantifisering van hematokrit- en serumanaliete

    As u nie die outeur van hierdie artikel is nie en u materiaal daaruit wil weergee in 'n derdeparty-publikasie wat nie RSC is nie, moet u formeel toestemming versoek deur gebruik te maak van die Copyright Clearance Center. Gaan na ons Instruksies vir die gebruik van Kopieregklaringsentrum-bladsy vir besonderhede.

    Skrywers wat bydra tot RSC-publikasies (joernaalartikels, boeke of boekhoofstukke) hoef nie formeel toestemming te versoek om materiaal in hierdie artikel te reproduseer nie, mits die korrekte erkenning gegee word met die gereproduseerde materiaal.

    Gegoten materiaal moet soos volg toegeskryf word:

    • Vir reproduksie van materiaal van NJC:
      Gereproduseer uit Ref. XX met toestemming van die Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) en The Royal Society of Chemistry.
    • Vir reproduksie van materiaal vanaf PCCP:
      Gereproduseer uit Ref. XX met toestemming van die PCCP -eienaarsverenigings.
    • Vir reproduksie van materiaal vanaf PPS:
      Gereproduseer uit Ref. XX met toestemming van die European Society for Photobiology, die European Photochemistry Association en The Royal Society of Chemistry.
    • Vir die reproduksie van materiaal uit alle ander RSC -tydskrifte en -boeke:
      Gereproduseer uit Ref. XX met toestemming van The Royal Society of Chemistry.

    As die materiaal aangepas is in plaas van gereproduseer vanaf die oorspronklike RSC-publikasie, kan "Reproduseer vanaf" vervang word met "Aangepas vanaf".

    In alle gevalle het die Verw. XX is die XXste verwysing in die lys met verwysings.

    As u die outeur van hierdie artikel is, hoef u nie formeel toestemming te vra om syfers, diagramme, ensovoorts in hierdie artikel in derdepartypublikasies of in 'n proefskrif of proefskrif te reproduseer nie, op voorwaarde dat die korrekte erkenning van die weergegee materiaal gegee word.

    Gegoten materiaal moet soos volg toegeskryf word:

    • Vir reproduksie van materiaal van NJC:
      [Oorspronklike aanhaling] - Gereproduseer met toestemming van The Royal Society of Chemistry (RSC) namens die Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) en die RSC
    • Vir reproduksie van materiaal vanaf PCCP:
      [Oorspronklike aanhaling] - weergegee met toestemming van die PCCP -eienaarsverenigings
    • Vir reproduksie van materiaal vanaf PPS:
      [Oorspronklike aanhaling] - weergegee met toestemming van The Royal Society of Chemistry (RSC) namens die European Society for Photobiology, die European Photochemistry Association en RSC
    • Vir reproduksie van materiaal uit alle ander RSC-joernale:
      [Oorspronklike aanhaling] - weergegee met toestemming van The Royal Society of Chemistry

    As u die outeur van hierdie artikel is, moet u steeds toestemming verkry om die hele artikel in 'n derdeparty -publikasie te reproduseer, met die uitsondering van die reproduksie van die hele artikel in 'n proefskrif of proefskrif.

    Inligting oor die weergee van materiaal uit RSC -artikels met verskillende lisensies is beskikbaar op ons blad Toestemmingsversoeke.


    Metodes

    Gepoelde perde akute fase serum is in die studie gebruik, gebaseer op individuele monsters van perde wat deur kliënte besit is wat oorgebly het na diagnostiese ontledings by die Sentrale Laboratorium, Departement Veeartsenykundige Kliniese en Dierewetenskappe, Universiteit van Kopenhagen, Denemarke. Die insluiting van monsters in die huidige studie is goedgekeur deur die plaaslike etiese komitee by die Departement Veeartsenykundige Kliniese en Veekundige Wetenskappe, Universiteit van Kopenhagen, Denemarke. Die konsentrasie van SAA in die serumpoel is gemeet tot 1600 mg/L, met behulp van 'n kommersiële beskikbare turbidimetriese immunotoets wat voorheen vir diagnostiese metings van perde-SAA deur lede van ons groep bekragtig is [24]. Vyftig milliliter van die serumpoel is gevriesdroog van 𠄴ଌ tot kamertemperatuur by 10 mbar. 'n Oorsig van die analitiese en voorbereidende prosedures word in Figuur  1 gegee. Die teenwoordigheid en samestelling van SAL is in serum en preparate opgespoor deur IEF, elektroblotting (Amersham Pharmacia Biotech) en immunokleuring met anti-SAA teenliggaampies (Tri-delta Development Ltd), soos voorheen gedoen in verskeie studies van SAL uitgevoer deur ons groep [ 6,30,31].

    Oorsig van die prosedures wat in die studie ingesluit is. Toegepaste metodes (omsingel) en verkry produkte wat ontleed is vir SAA-inhoud en onsuiwerhede (in kassies uiteengesit) in die poging om perdeserum-amyloïed A (SAA) te suiwer.Isoforme van SAA is opgespoor in supernatante, breuke en neerslag met behulp van iso -elektriese fokus, elektroblotting en immunokleuring. Suiwerheid van opgespoorde SAA is beoordeel deur natriumdodecielsulfaat-poliakrielamiedgelelektroforese (SDS-PAGE), gevolg deur kleuring van serumproteïene met silwernitraat. SFE: Superkritiese vloeistofekstraksie met CO2. FPLC-SEC: Vinnige polimeer vloeistofchromatografie grootte-eksklusiewe chromatografie. IEF: Iso -elektriese fokus.

    Gevriesdroog serum is gesuspendeer in 70% 2-propanol, 8 M ureum en Milli-Q water, onderskeidelik, in 'n konsentrasie van 10 mg gevriesdroogde serum per milliliter oplosmiddel. Supernatante is ontleed op die teenwoordigheid van opgeloste SAA -isoforme.

    Superkritiese vloeistofekstraksie (SFE) is uitgevoer met behulp van 600 mg gevriesdroogde serum in 'n Speed ​​SFE-stelsel (Applied Separations). Die ekstraksie is uitgevoer by 50 mPa met 'n vloei van 4 L CO2 per minuut by 40 ଌ vir 30 minute. Uittreksels is in glasflessies versamel en die ekstraksie is herhaal met 96% etanol as wysiger (1,0 ml/min). Uittreksels en oorblyfsels is in die lug gedroog, verdun in 8 M ureum en ontleed op die teenwoordigheid van SAL.

    SEC is uitgevoer deur vinnige polimeer vloeistofchromatografie (FPLC-SEC) met behulp van 'n Superdex � 10/300 GL-kolom (GE Healthcare) en 'n buffer wat 20 mM natriumdihidrofosfaat en 50 mM natriumchloried, pH 6,9, bevat. 'n Jelfiltrasiestandaard wat tiroglobulien (660 kDa), gammaglobien (158 kDa), ovalbumien (44 kDa), mioglobien (17 kDa), en sianokobalamien (1,35 kDa) (Bio-Rad) bevat, is gebruik om 'n standaardkromme vir die skatting van molekulêre gewigte van verskillende FPLC-breuke. Tweehonderd mikroliter van die gefiltreerde supernatant wat voortspruit uit die suspensie van gevriesdroogde serum in Milli-Q water (hierbo beskryf) is in die kolom ingespuit en teen 'n vloei van 1 ml/min geskei wat 'n druk van 1.5 mPa oplewer. Die molekulêre gewig van perde-SAA is geverifieer deur natriumdodecielsulfaat – poliakrylamiedgelelektroforese (SDS-PAGE) in Phast Gel System (Amersham Pharmacia Biotech), gevolg deur elektroblotting en immunokleuring soos hierbo beskryf. 'n Molekulêre gewig merker (Bio Rad) is geskei voor klad en gekleur met silwernitraat (Pharmacia LKB Biotegnologie) [32] en as standaard gebruik.

    Voorbereidende IEF is uitgevoer in Hoefer IsoPrime IEF Suiweringseenheid, (Amersham Pharmacia Biotech) [33,34]. Sewe gebufferde polimembrane met pH 5, 6, 7, 7.5, 8, 8.5 en 9 is voorberei met akrylamidobuffers (Fluka BioChemika en GE Healthcare Biosciences), in gels bestaande uit 30% akrylamied/bis-akrylamied (Sigma Aldrich), tetrametieletileendiamien ( Pharmacia Biothech) en 40% ammoniumpersulfaat (Bio-Rad). Whatman -glasfiberfilters GF/D 47 mm is in die membrane omhul. Die kamers is gevul met Milli-Q water volgens die aanbevelings van die vervaardiger, en 5 ml van die supernatant as gevolg van die suspensie van gevriesdroogde serum in 8 M ureum (hierbo beskryf) is in skeidingskamer 2 (tussen die gels met pH 5 toegedien) en 6). Skeiding is uitgevoer oor 24 uur met 'n konstante krag van 4 W. Voorbereidings is in die lug gedroog en opgelos in 8 M ureum voor die opsporing van die SAL. Sigbare presipitate is oornag by kamertemperatuur in 8 M ureum opgelos, en die opgeloste stof is ondersoek vir teenwoordigheid van SAA.

    Serumproteïene in supernatante, fraksies en neerslag is met silvernitraat [32] bevlek na SDS-PAGE in Phast Gel System (Amersham Pharmacia Biotech) om die suiwerheid van die preparate te bepaal, en 'n molekulêre gewig merker is standaard gebruik (Bio Rad).


    Vinnige proteïen vloeistofchromatografie suiwering van hidrofobiese fraksie van beesmelk proteose-peptoon en karakterisering deur bidimensionele elektroforese

    Beesmelk Hidrofobe fraksie van proteose-peptoon is berei deur hidrofobiese interaksie vinnige proteïen vloeistofchromatografie. Hierdie metode het verskeie voordele soos hoë snelheid, eenvoudige goeie reproduceerbaarheid en minder denaturasie. Die proteose-peptoon is geëlueer uit 'n TSK-Feniel-5PW kolom met 'n 1 M-0 M ioniese sterkte gradiënt van NaH 2 PO 4, pH 6·8, met 'n 6 ml/min vloeitempo vir 56 min. Die hoeveelheid proteïen wat ingespuit is was 62·5 mg, maar dit kon verhoog word tot 100 mg. Die elueringsorde was β -CN-4P < BSA (1·6% van totale N) < β -CN-5P < β -CN-1P. Die hidrofobiese fraksie is verkry in suiwer water aan die einde van die gradiënt (17·3% van totale N). 'N Proteose-peptoon kartograaf is verkry deur tweedimensionele elektroforese. Hierdie hidrofobiese fraksie verteenwoordig drie hoofsones van M r 30000–28000, 19000 en 11000, wat onderskeidelik bestaan ​​het uit 13, 4 en 2 hoofvlekke versprei tussen 4 · 9 en 6 · 1 isoelektriese punte (IP). Hierdie kolle stem ooreen met glikoproteïene. · 7, 5 · 0 en 5 · 1 IP wat migreer na M r 18000 terwyl β -CN -1P geïdentifiseer is as M r 9000 op twee plekke van 5 · 1 en 5 · 3 IP.


    Skrywer inligting

    Affiliasies

    Departement Patologie, Albert Einstein College of Medicine, New York, VSA

    Maya Tanase, Valerio Zolla, Cristina C Clement, Francesco Borghi, Aleksandra M Urbanska & Laura Santambrogio

    Departement Chemie, Universiteit van Bologna, Bologna, Italië

    Maya Tanase, Francesco Borghi, Barbara Roda, Andrea Zattoni en Pierluigi Reschiglian

    Departement Ontwikkelingsmolekulêre Biologie, Albert Einstein College of Medicine, New York, VSA


    Kyk die video: FPLC QUAWEWSA RASTGSDRFGSFD GHSDRHGDFSRh (Augustus 2022).