Inligting

Watter DNA -volgorde sal 'n hoër smelttemperatuur hê: CCCCCC ... of GCGCGC ...?

Watter DNA -volgorde sal 'n hoër smelttemperatuur hê: CCCCCC ... of GCGCGC ...?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek het hierdie diens probeer om temperature te bereken. Die naaste buurmetode gee deurgaans groter resultate vir rye soosGCGCGCoor rye soosCCCCCofGGGGG, terwyl ander metodes nie 'n verskil gee nie. Is dit naaste buurman se kenmerk of is daar wel 'n verskil in smelttemperature?


Die afhanklikheid van smelttemperatuur op verskillende dinukleotiedpare is eksperimenteel gemeet; die meet temperatuur sakrekenaar is gebaseer op die resultate. Op grond van hierdie resultate sal jy sien dat aGCdinukleotiedpaar sou verskil vanGGenCCpare. Dit is moontlik as gevolg van steriese effekte en stapelkonformasies.

SantaLucia (1998; skrywer van die naaste buurmodel) het in die tabel 1 van die referaat verwys na verskillende eksperimentele studies waaruit die waardes verkry is.


Beperkingsensieme met veelvuldige herkenningsreekse

In 'n bioinformatika programmeringskursus wat ek tans onderrig (met behulp van Python, en benader uit 'n hoofsaaklik CS eerder as 'n biologiese agtergrond) het ek 'n projek opgedra wat behels die vind van plekke waar beperkingsensieme aan 'n DNA -volgorde bind. Die projek word sterk beïnvloed deur Hoofstuk 9 van die nou klassieke teks "Beginning Perl for Bioinformatics" deur James Tisdall. Ek gebruik die REBASE -databasis, veral REBASE -formaat #9. In hierdie formaat het elke beperkingsensiem 'n herkenningsvolgorde wat lyk soos bv. C^YCGRG waar ^ inligting gee oor die presiese snypunt en hoofletters soos Y en R anders as ACGT is dubbelsinnigheidskodes. Die doel van die projek is om dit in gewone uitdrukkings te omskep waar splytingsinligting weggegooi word en die onduidelikheidskodes na karakterklasse uitgebrei word, en dan hierdie gereelde uitdrukkings gebruik om na treffers te soek.

Alles redelik eenvoudig, maar een baie oplettende student het opgemerk dat sommige ensieme veelvuldige volgordes het, byvoorbeeld M.BssHIII het 'n totaal van 5 rye: ACGCGT,CCGCGG,RGCGCY,RCCGGY,GCGCGC. Dit is maklik om te sien dat dit ooreenstem met 'n totaal van 11 rye (nadat die R'e en Y's uitgebrei is), baie minder as die 144 rye wat by VSSSSB sou pas (wat die minste dubbelsinnige enkele ry is wat in staat is om bogenoemde te pas).

My vraag is, wat gaan hier aan? Is ek veilig om bloot te vervang deur | (vir "of") in die gewone uitdrukking, of is daar iets meer subtiel aan die gang? Slegs 8 van die byna 5000 ensieme het sulke veelvuldige rye, en nóg die Tisdall -boek nóg selfs die beskrywing van die formaat (wat blykbaar enkele rye aanneem) werp geen lig op die situasie nie.


DNA-stabiliteit in die gas versus oplossingsfases: 'n Sistematiese studie van een-en-dertig duplekse met wisselende lengte, volgorde en ladingsvlak

Ons rapporteer hier 'n sistematiese massaspektrometriese studie van 'n reeks van een-en-dertig nie-self-komplementêre DNA-duplekse wat ooreenstem met die grootte van 5 tot 12 meter. Die doel van hierdie werk is drievoudig: (1) om die lewensvatbaarheid vas te stel om massaspektrometrie te gebruik as 'n instrument om die oplossingsfase-stabiliteit van DNA-duplekse (2) te ondersoek om stelselmatig gasfasestabiliteite van DNA-duplekse te ondersoek en (3) om gas te vergelyk en stabiliteitsoplossingsfase in 'n poging om te verstaan ​​hoe media DNA -stabiliteit beïnvloed. Hierdie fundamentele kwessies is van belang beide op hul eie, en ook vir die benutting van die potensiaal van massaspektrometrie vir biologiese toepassings. Ons het gevind dat ioonoorvloede nie altyd volg met oplossingsfasestabiliteit nie. GC-inhoud moet in ag geneem word. Twee dupleks met dieselfde Tm, maar met 'n verskillende GC -inhoud, kan verskillende ioonopbrengste lewer. Dit wil sê, as twee dupleks presies dieselfde smelttemperatuur het, maar een het 'n hoër GC -inhoud, lewer die dupleks met die hoër GC -inhoud 'n hoër ioonoorvloed. Dit blyk dus dat 'n GC -basepaar nie net sterker is as 'n AT -basepaar nie, maar dat die relatiewe sterkte van elkeen verskil in die gasfase teenoor in oplossing, sodat die elektrosproei -proses tussen hulle kan onderskei. Ons kenmerk ook die gasfase-stabiliteit van die dupleks, met behulp van botsings-geïnduseerde dissosiasie (CID) as 'n metode om stabiliteit te bepaal. Ons fokus op twee aspekte van hierdie CID-eksperiment. Eerstens ondersoek ons ​​watter faktore blyk te bepaal of die dupleks in enkele stringe dissosieer of kovalent fragmenteer, wat ons in staat is om 'n ladingstoestand normalisering te gebruik wat ons met munt- en ldquocharge -vlak en rdquo gebruik om ons resultate met ander te vergelyk en om algemene aspekte te vestig oor dissosiasie versus fragmentasiepatrone. Twee, ons ondersoek die dupleks wat hoofsaaklik dissidensieer en CID gebruik om die gasfase-stabiliteit te bepaal. Ons vind dat die korrelasie van gasfase tot oplossingfase-stabiliteit meer geneig is om te voorkom wanneer duplekse van wisselende GC-inhoud ondersoek word. Dubbelplekke met dieselfde GC -inhoud het geneig om stabiliteite te hê wat nie ooreenstem met dié in oplossing nie. Ons bespreek hierdie resultate in die lig van die verskillende rolle wat waterstofbinding en basisstapeling speel in oplossing teenoor die gasfase. Uiteindelik pas ons wat ons leer toe om insig te gee in die biologiese probleem van hoe die kankerverwekkende, beskadigde nucleobase O6-methylguanine mutasies veroorsaak.

Joernaal

Journal of The American Society for Mass Spectrometry & ndash Springer Journals


Module 2 Eksamen

Wat sou die volgorde van 'n RNA wees wat geproduseer word deur die DNA -volgorde wat as 'n sjabloon aangedui word, te gebruik?

Nukleotiedbasisse is aan die buitekant van die DNA-molekule.

Suikerfosfaatgroepe is aan die binnekant van die DNA-molekule.

Basisse op komplementêre stringe word bymekaar gehou deur waterstofbindings.

Sitosien pare met adenien.

a) Die suiker gedeelte van RNA en DNA verskil

b) DNA word getranskribeer in RNA wat in proteïen vertaal word

c) DNA is permanent in 'n sel, RNA is tydelik

a) genetiese materiaal moet uit baie verskillende eenhede saamgestel word om rekening te hou met die veranderlikheid wat in die natuur gesien word.

b) genetiese materiaal moet die fenotipe kodeer.

c) genetiese materiaal moet komplekse kode -inligting bevat

b) Genomiese DNA van proteïene

c) RNA van 'n DNA -sjabloon

a) Die tRNA wat in die P -terrein was, beweeg na die A -plek.

b) Die tRNA wat in die A-plek was, beweeg na die E-plek en word vrygestel.

c) Die tRNA wat in die A-plek was, beweeg in die P-plek in.

a) 'n Volgorde van DNA wat vir 'n proteïen kodeer

b) 'n Volgorde van aminosure wat 'n reaksie kataliseer

c) 'n Volgorde van RNA wat uitdrukking reguleer

a) DNA bevat puriene, terwyl proteïen pirimidiene insluit.

b) DNA bevat swael, terwyl proteïen nie.

c) DNA bevat fosfor, maar proteïen nie

Dit blokkeer toegang van RNA-polimerase tot die promotor, totdat dit deur algemene transkripsiefaktore verwyder word.

Dit is die subeenheid van prokariotiese RNA -polimerase wat nodig is om promotors te herken.

Dit verander histone sodat nukleosome uit transkripsie uit DNA verwyder kan word.

transkripsie van rRNA-gene

transkripsie van mRNA gene

transkripsie van tRNA gene

A) Dit dra dikwels gene wat voordelig is vir die bakteriese gasheer.

B) Dit repliseer onafhanklik van die genomiese DNA.

C) Dit is altyd groter as die genomiese DNA.

a) die aantal waterstofbindings tussen die deelnemende basisse is altyd konstant

b) 'n purien koppel altyd met 'n pirimidien

c) disulfiedbrue word gevorm tussen die twee DNA -stringe

d) A pare met G, en T pare met C

a) Verbeteraars kan duisende nukleotiede stroomopwaarts van die geen wat hulle beïnvloed, geleë wees.

b) Verbeteraars bevat rye wat herken word deur transkripsiefaktore.

c) Versterkers kan vir elke geen in 'n eukariotiese sel verskil (hoewel oorvleueling moontlik is).

d) Verbeteraars verteenwoordig beheerelemente wat ver van die promotor af geleë is.


Inleiding

Deoksiribonukleïensuur, meer algemeen bekend as DNA, is 'n ontwikkelde molekule wat die genetiese kode van organismes bevat. Elke lewende wese het DNA in hul selle. Dit is belangrik vir oorerwing, kodering vir proteïene en die genetiese instruksiegids vir lewe en sy prosesse. DNA bevat die instruksies vir 'n organisme of elke sel ontwikkelingsprosesse, voortplanting en uiteindelik dood. Oor die afgelope dekades is empiriese besprekings voorgestel om die gene in die DNS te wysig. Hierdie veranderinge is in die mediese veld baie bespreek deur gebruik te maak van toepassings soos behandeling, die voorkoming van die ontwikkeling van kanker of 'n uitbarsting van 'n orgaan (byvoorbeeld 'n tand). Aan die ander kant moet daarop gelet word dat slegs 3% van die DNA -kapasiteit op mediese gebiede oorweeg word. In die afgelope twee dekades is 'n onderwerp genaamd "golfgenoom" deur Russiese wetenskaplikes aan die orde gestel, wat beweer dat 97% van ander DNA nie net van toepassing is nie, maar ook 'n meer belangrike rol speel omdat DNA deur akoestiese, elektromagnetiese en skalaar golwe. Onder die invloed van hierdie golwe kan die genetiese kode gelees of herskryf word. Nog 'n bewering van Russiese wetenskaplikes is dat DNS 'n biologiese netwerk is wat alle mense bind. Oor die beïndrukbaarheid van DNS vanaf die golffrekwensie, is baie eksperimentele navorsingstudies uitgevoer wat 'n nuwe tak in die wetenskap geopen het, genaamd golfgenoom. Konstantin Meyl het die skalaargolwe wat deur Nicola Tesla beskryf is, aangepas by die biologie en het die verband tussen die skalaargolwe en DNA 1 voorgestel. Greg Braddon en kollegas het in 3 eksperimente die beïndrukbaarheid van DNA van menslike emosies ondersoek 2 . Rein en Mccraty het die impak van musiek op die DNA 3,4,5 bestudeer. 'N Ander studie is uitgevoer oor die effek van klankgolwe op die sintese en gene van krisant 6. Peter Garjajev en sy navorsingsgroep het bewys dat DNA deur woorde herprogrammeer kan word en die korrekte resonante frekwensies van DNA 7,8 gebruik kan word. Die Russiese kwantumbioloog Poponin het probeer om te bewys dat menslike DNA 'n direkte uitwerking op die fisiese wêreld het met behulp van sommige eksperimente 9 . Hy het ook uitgevind dat ons DNS ontstellende patrone in die vakuum kan veroorsaak en sodoende gemagnetiseerde mikroskopiese wurmgate 10 kan produseer. Nobelprys-bekroonde wetenskaplike Luc Montagnier, bekend vir sy studie oor MIV en vigs, beweer dat hy gedemonstreer het dat DNS deur teleportasie deur middel van kwantumafdruk gegenereer kan word en het ook gewys dat DNS elektromagnetiese seine uitstuur wat die DNS na ander plekke teleporteer, soos watermolekules 11,12.

Oor Wiskundige Modellering van DNS is drie vooraanstaande wiskundige modelle voorgestel vir die beskrywing van DNS. Die bekendste model wat aangebied word, is die PBD (Peyrard-Bishop-Dauxois) model 13, hoewel hierdie model deur verskeie navorsers opgedateer is 14,15,16,17,18, het die modelle wat in hierdie studies aangebied word, gewoonlik ten minste drie beduidende swakpunte soos om diskreet te wees, nie buite die vliegtuig te wees nie, nie spiraalvormig te wees nie en nie die posisie van nukleobasisse in ag te neem nie. Voorbeelde van die PBD -model word in Figuur 1 vertoon. sowel as die oorweging van DNA met een string (Fig. 2). Daar is 'n ander model genaamd SIDD (stres-geïnduseerde DNA-dupleks-destabilisering) wat volledig wiskundig is en toegepas word op die gebied van molekulêre dinamika 22,23. Hierdie genoemde modelle is meestal ontwerp om die vibrasie van DNA te ondersoek, en daar is verskeie modelle op ander terreine beskikbaar, soos die entropiese elastisiteit van DNA 24 en buiging van 'n DNA 25,26. 'n Balk is 'n strukturele element wat hoofsaaklik belasting weerstaan ​​wat sywaarts op die balk-as toegepas word. Sy manier van afbuiging is hoofsaaklik deur te buig. Die Timoshenko -balkteorie neem die skuifvervorming en rotasie -buig -effekte in ag by die beskrywing van die gedrag van dik balke. Aan die ander kant fokus alle vorige studies met betrekking tot geboë straalvibrasies op die vibrasie uit die vlak van geboë balke (met inlynkoördinate) en bestudeer dit nie uit die vlak vibrasie van die geboë balke nie. A.Y.T. Leung is die enigste verwysing wat afgelei word uit die regeringsvergelykings vir 'n heliese balk met reghoekige deursnee met voordraai 27.

Skema van die PBD -model (a) en die opdaterings daarvan (b – d). Hierdie beelde is met Adobe Photoshop CC 2018 geteken.


DNA, nie proteïen nie, word aan die nageslag oorgedra

Hershey en Chase (1952) het besef dat hulle twee nuwe ontwikkelings (destyds) kon gebruik om die idee dat DNS die genetiese materiaal is, streng te toets. Bakteriofage (of fage, of virusse wat bakterieë besmet) is geïsoleer wat bakterieë sou besmet en dit sou lyseer, wat nageslagfage produseer. Deur verskillende radioaktiewe elemente in die proteïen en die DNA van die faag in te voer, kon hulle bepaal watter van hierdie komponente aan die nageslag oorgedra is. Slegs genetiese, oorerflike materiaal behoort hierdie eienskap te hê. (Dit was een van die vroegste gebruike van radioaktiewe etikette in biologie.)

Soos gediagram in Fig. 2.1, is die proteïene van T2-faag gemerk met 35 S (bv. in metionien en sisteïen) en die DNA is gemerk met 32 ​​P (in die suiker-fosfaat-ruggraat, soos in die volgende afdeling aangebied sal word). Die bakterie E coli is daarna met die rabiool -gemerkte faag besmet. Kort na die infeksie het Hershey en Chase die faagjasse van die bakterieë afgestamp deur meganiese ontwrigting in die Waring Blender, en gemonitor waar die radioaktiwiteit gegaan het. Die meeste van die 35 S (80%) het by die faagjasse gebly, en die meeste van die 32 P (70%) het by die besmette bakterieë gebly. Nadat die bakterieë van die infeksie gelys is, is gevind dat die nageslagfaag ongeveer 30% van die inset 32P dra, maar byna geen (<1%) van die 35 S. DNA ( 32 P) gedra soos die genetiese materia l - dit het in die besmette sel ingegaan en is in die nageslagfaag gevind. Die proteïen (35 S) het grootliks agtergebly met die leë faagjasse, en byna niks het in die nageslag verskyn nie.

Figuur 2.1. Genetiese materiaal van faag T2 is DNA.


RESULTATE

Oorsig

Figuur 1 vertoon temperatuurafhanklike CD-spektra van ses verteenwoordigende REP-oligonukleotiede, wat oor die algemeen die verskillende spektrale tipes wat ons waarneem, weerspieël. Die ooreenstemmende temperatuurafhanklike CD-spektra en UV-smeltkurwes vir al 23 REP-oligonukleotiede word in Tabel SI van die Ondersteunende Materiaal verskaf. Breë strukturele eienskappe wat uit die eksperimentele data verkry is, word saamgevat in Ondersteunende inligtingstabel SII. Tabel 3 beklemtoon opvallende algemene volgorde kenmerke van 'n stel van 203 REP's wat ons geïdentifiseer het uit die hele genoom soektogte, 'n meer gedetailleerde weergawe van die tabel kan gevind word in Ondersteunende Inligting Tabel SIII.

Segment van die Palindroom Mononukleotidesa a Die totale aantal mono-, di- en tetranukleotiede in die monster van 203 REP-rye.
Gb b Gemerk frekwensies van individuele rye.
Cb b Gemerk frekwensies van individuele rye.
Ab b Gemerk frekwensies van individuele rye.
Tb b Waargenome frekwensies van individuele rye.
dinucleotidesa a Die totale aantal mono-, di- en tetranukleotiede in die monster van 203 REP-volgordes.
GGb b Gemerk frekwensies van individuele rye.
CCb b Waargenome frekwensies van individuele rye.
tetranucleotidea a Die totale aantal mono-, di- en tetranukleotiede in die monster van 203 REP-rye.
GGGGb b Gemerk frekwensies van individuele rye.
CCCCb b Gemerk frekwensies van individuele rye.
CGCGb b Gemerk frekwensies van individuele rye.
GCGCb b Gemerk frekwensies van individuele rye.
GAGG + GGAGb b Waargenome frekwensies van individuele rye.
AAAA + TTTTb b Gemerk frekwensies van individuele rye.
5' 1970 909 458 308 295 1767 319 98 1361 11 4 8 25 10 4
3' 1963 543 864 362 194 1649 97 317 1354 5 11 30 30 1 2
  • Sekwensies wat aansienlik meer dikwels voorkom as wat verwag is in DNS wat saamgestel is uit 'n ekwimolêre mengsel van G-, A-, C- en T-nukleotiede word getoon in vetgedruk, diegene wat minder gereeld voorkom, is in kursief. Statistiese ontleding van REP-volgordes word in Ondersteunende Inligting Tabel SIII uiteengesit.
  • a Die totale aantal mono-, di- en tetranukleotiede in die monster van 203 REP-rye.
  • b Gemerk frekwensies van individuele rye.

Die rye van die natuurlike, "wilde tipe", genomiese REP DNA's is gedeeltelik geïdentifiseer op grond van 'n onvolmaakte palindroom wat naby 'n RAYT -geen geleë is. 'N Eenvoudige ontleding van die rye wat in tabel 2 gelys word, dui daarop dat die ooreenstemmende oligonukleotiede in haarspelde kan vou wat stamme bevat wat uitsluitlik gevorm word deur kanonieke Watson-Crick (W-C) pare. Ons spektrale data toon egter dat die konformasiegedrag van hierdie oligonukleotiede baie meer kompleks is, met slegs 'n minderheid van hierdie molekules wat eienskappe toon wat uitsluitlik ooreenstem met stamluslusstrukture. Ons eksperimentele data dui daarop dat die meerderheid van die oligonukleotiede in oplossing 'n mengsel van mededingende sekondêre konformasies vorm. Selfs oligonukleotiede wat na verwagting hoofsaaklik in haarnaaldstrukture vou, vertoon CD -spektra, wat nie in ooreenstemming is met die teenwoordigheid van 'n enkele, homogene oplossingstruktuur nie. Ons data toon die mees duidelike gedrag vir REP's C. hominis, veral Chom-22. CD -spektra van Chom-22 en verwante oligonukleotiedvariante wat in Figuur 2 getoon word, toon unieke eksperimentele waarneembare wat waarskynlik oplossingvorming weerspieël van strukture met 'n tetraplekskern. Hieronder bespreek ons ​​die samestelling en volgordevooroordele in REP -elemente, en die komplekse oplossingsgedrag wat ons waarneem vir geselekteerde REP -oligonukleotiede.

Vergelyking van CD-spektra van die REP-verwante oligonukleotiede Chom-22, Chom-38, Chom-12, Chom-3T, Chom-3A, en Chom-3A/T van Cardiobacterium hominis by 25°C (linkerpaneel) en 95°C (regterpaneel). Die spektra gemeet by 25°C toon beduidende verskille, terwyl die spektra van gedenatureerde oligonukleotiede gemeet by 95°C baie soortgelyk is. Sekwensies van alle oligonukleotiede word in Tabel 2 gelys.

G-kanale en afwisselende GC-dinukleotiedstappe word statisties oorverteenwoordig in die 5′-helfte van REP-pseudo-palindrome

Ons het 203 REP-volgordes van 105 bakteriese spesies geïdentifiseer op grond van die algemene volgordekriteria wat in Tabel 1 gelys is. Hierdie subset wat uit die genetiese databasisse onttrek is, is in groter detail ontleed ten opsigte van die basissamestelling van elke lid, met hierdie resultate wat in Tabel 3 opgesom is. Vir meer inligting oor hierdie verspreidings, insluitend 'n statistiek Z telling -analise, word die leser in die ondersteuningsmateriaal na die ondersteunende inligtingstabel SIII verwys. Ons het die 5'- en 3'-segmente van die palindromiese domeine afsonderlik ontleed, en die algemeen kort sentrale deel van die palindroom het 'n haarnaaldlus gevorm. Die universeel bewaarde herkenningstetranukleotied GTAG (of GTGG) is uitgesluit van die analise om nie die resultate deur sy konstantheid te bevooroordeel nie.

Ons ontleding van volgordepatrone het 'n interessante gemeenskaplikheid onder die saamgestelde genomiese data geïdentifiseer wat verder gaan as die onvolmaakte palindroomkriteria wat aanvanklik gebruik is om die relevante rye te identifiseer. Hierdie rye het naamlik die neiging om guanienryke 5'-segmente en ooreenstemmende komplimentêre sitosienryke 3'-segmente te hê, met adenosiene en timiene wat baie skaarser is in beide segmente. Daarteenoor het die vermeende lusgebied, wat ongeveer 20% van die totale aantal nukleotiede in die geanaliseerde REP -rye verteenwoordig, ongeveer dieselfde aantal van al vier die nukleotiede. Sekere dinukleotiede, trinukleotiede en tetranukleotiede kom meer gereeld in die vermeende stamdomeine voor as wat verwag is vir 'n DNA met ekwimolêre G: A: C: T -nukleotiedsamestelling. Die opvallendste volgordekenmerk is die hoë frekwensie van GG-, GGG- en GRRG-strek in die 5'-segment van die stam, met die komplementêre pirimidienvolgordes in die palindromiese 3'-segment. Nog 'n tipiese kenmerk van die stamdomeine is herhaling van gemengde G/C-stappe. GCGC kom gereeld voor in beide 5'- en 3'-segmente van die stam, terwyl CGCG slegs in die 3'-segment oorbevolk is. Ons verwag dat die laaste twee kenmerke- G- en C-traktate en/of herhaalde afwisselende GC-dinukleotiede in die voorspelde stamdomein- REP-rye konformasioneel kompleks maak. Meer spesifiek dui die gereelde voorkoms van verskeie guanines in 'n ry in die 5'-segment en van verskeie sitosiene in die 3'-segment op moontlike vorming van gevoude DNA-strukture soos G-tetraplekses of i-motiewe.

Konformasie -eienskappe van die REP -oligonukleotiede

In die volgende afdelings bespreek ons ​​konformasievoorkeure van geselekteerde REP-oligonukleotiede in terme van hul oplossingsgedrag soos geopenbaar deur ons spektroskopiese en kalorimetriese metings. Meer gedetailleerde beskrywings van die waargenome spektrale kenmerke word in die ondersteunende inligtingsteks en in Tabel SI gegee.

REP -rye wat hoofsaaklik stam -lusstrukture vorm

CD -spektra van REP -oligonukleotiede van E coli en S. maltophilia kenmerke openbaar wat kenmerkend is van DNA in B-vorm. 22 Verder vertoon hul UV-denaturasiekrommes oënskynlike twee-toestand, konsentrasie-onafhanklike, samewerkende smeltoorgange. Hierdie waarnemings, tesame met ons SVD -analise wat twee belangrike spektrale komponente onthul, stem gesamentlik ooreen met 'n monomolekulêre stamlus -argitektuur as die oplossingstruktuur vir hierdie oligonukleotiede. Verder, vir die Ecoli-TT, Ecoli-TC, en SM4-A/T oligonukleotiede, vind ons ooreenstemming tussen die van't Hoff denaturasie entalpie verandering bereken uit die optiese smeltkurwes en die entalpie verandering wat direk gemeet word deur mikrokalorimetrie, 'n ekwivalensie wat weerspieël 'n oorgang van twee state. Gesamentlik strook ons ​​data met die teenwoordigheid in 'n oplossing van 'n enkele monomolekulêre spesie teen lae temperature, met 'n B-vorm komponent wat die CD-spektrum oorheers. Die oënskynlike haarnaaldargitektuur van die drie gemeet E coli rye wat hier bestudeer word (almal wat natuurlik voorkom in E coli) stem ooreen met die stam -lusstruktuur van Ecoli-kristal waargeneem in die kristalstruktuur van PDB -kode 4er8. 14

Die SM1, SM4, SM8, Hpar2, Hpar2-A/T, Hpar2-T/A, Chom-3AT, Chom-3A oligonukleotiede vertoon CD-spektrale kenmerke wat versoenbaar is met die bestaan ​​van een of ander B-vorm DNA in oplossing, naamlik twee maksima naby 220 en 275 nm, en 'n negatiewe piek naby 245 nm (Ondersteunende Inligting Tabel SI). Verder, vir die meeste, maar nie almal nie, is hul smeltemperature onafhanklik van konsentrasie, in ooreenstemming met 'n monomolekulêre struktuur. SVD-analise van hul temperatuurafhanklike CD-spektra en inspeksie van hul UV-smeltkurwes onthul egter die teenwoordigheid van addisionele konformasies behalwe die verwagte haarspeld, 'n afleiding wat ooreenstem met 'n meer heterogene populasie van conformers vir hierdie REP-verwante oligonukleotiede.

Die temperatuurafhanklike veranderinge in die CD-spektra van die oligonukleotiede SM1, SM4, SM8, en Hpar2 'n meer heterogene populasie van oplossingstrukture voorstel. Die waargenome komposisievooroordeel kan bydra tot die komplekse oplossingsgedrag van hierdie groep REP's. Om hierdie moontlikheid te toets, het ons stelselmatig die eienskappe van Hpar2 deur sy GGG- en CCC-drieling te vervang deur GAG en CTC-drieling in Hpar2-A/T en deur GTG/CAC drieling in Hpar2-T/A. Hierdie mutasies maak die stamvolgorde ewekansig en ontwrig G/C-kanale. In beginsel moet hierdie veranderinge die waarskynlikheid verhoog dat die Hpar2 -variante 'n haarspeld aanneem. In teenstelling met hierdie verwagting, meet ons egter feitlik identiese spektrale eienskappe en smeltkrommes vir hierdie drie Hpar2 oligonukleotied variante. Ons veronderstel dat hierdie resultate daarop dui dat die volgorde-isomere bestaan ​​as verskeie konformers in oplossing.

REP-reekse met komplekse spektrale kenmerke

Xanthomonas Campestris

CD-spektra en UV-smeltkurwes van die REP-verwante oligonukleotiede van X. campestris komplekse konformasiegedrag openbaar. Kenmerke van die CD-spektra van die natuurlike volgorde Xcam weerspieël die teenwoordigheid van 'n regshandige heliese struktuur, maar soos onthul deur die SVD -analise, weerspieël hierdie funksie nie 'n unieke konformasie nie. Die Zuker voorspel 23 mees stabiele haarnaald vorm van die Xcam oligonukleotied sal gestabiliseer word deur 'n W-C-stam wat deur die heksanukleotied GCGCGC gevorm word. Die oënskynlike bydrae van ander stam-lusvorme tot die CD-spektra van Xcam kan verklaar word deur gly van G-C pare van die heksanukleotied wat lei tot mededinging van veelvuldige konformasies in oplossing, en daardeur die waargenome spektra rasionaliseer. Om die gereelde herhaling van die hexanukleotied van GC te ontwrig en unieke stamlus -argitektuur te veroorsaak, is die inheemse X. campestris volgorde is gemuteer na Xcam-mod deur GC te vervang deur TA. Om die vorming van haarnaald verder te bevorder, het ons ook die sentrale TT tot TTTT verleng Xcam-4T en Xcam-4T-minus om die voorspelde lusdomein te stabiliseer. In laasgenoemde oligonukleotied het ons ook probeer om die stamlus te stabiliseer deur die 3'-terminale purienryke tetranukleotied te verwyder sodat dit nie inmeng met die interaksie van die basis binne die vermeende haarspeldomein nie. Soos in die geval van die reeds bespreekde rye wat verband hou met die Hpar2 oligonukleotied, het nie een van hierdie wysigings van die natuurlike volgorde tot beduidende veranderinge in die ongewone gelei nie Xcam CD -spektra. Terwyl 'n onomwonde interpretasie van oplossingsgedrag van Xcam en die volgordevariante daarvan is nie moontlik op grond van ons spektrale data alleen nie, dit is duidelik dat hierdie oligonukleotiede veelvuldige toestande/konforme vorm in oplossing buite die eenvoudige stamlus -haarspelde.

Sulfurovum sp

Die REP SNBC-37-1 volgorde moontlik 'n haarnaald vorm met 'n uitgebreide stam wat bestaan ​​uit nege W -C basispare en 'n lus wat gevorm word deur vier ongepaarde sitosiene (of timiene in die gewysigde volgorde van SNBC-T4). Soos in verskeie vorige gevalle wat bespreek is, stem die CD-spektra egter ooreen met meer komplekse ewewigte in oplossing. Die SNBC-37-1 oligonukleotied vertoon 'n kombinasie van spektrale kenmerke wat dui op die teenwoordigheid van beide B-vormvorming en 'n parallelle guanien-kwadrupleks in oplossing.

REP-reekse wat guanienryke tetraplekse vorm

Oligonukleotiede wat verband hou met REP elemente van Cardiobacterium hominis toon die mees interessante gedrag. Die natuurlike volgorde Chom-22 bestaan ​​uit 'n palindroom wat voorspel word om 'n stamlus -struktuur te vorm met 'n agt W -C basispaarstam verbind deur twee timiene in 'n vermeende haarnaaldlus (skema 1a). Die 5'-segment van die palindroom bevat egter ook twee opeenvolgende G-stukke geskei deur 'n enkele T. Die eerste van hierdie stukke is 'n onvolmaakte G-kanaal wat 'n 5 'A bevat, gevolg deur drie opeenvolgende G's. Die tweede is 'n perfekte G4-kanaal. Soortgelyke patrone van twee opeenvolgende tri- of tetranukleotied G-traktate geskei deur een of twee ander nukleotiede word ook gesien in ander G-ryk REP-rye, insluitend Hpar1. Die lae temperatuur CD spektrum van Chom-22 is hoogs ongewoon en vorm twee positiewe pieke by 289 en 259 nm, 'n positiewe saal by 272 nm en 'n negatiewe piek by 236 nm (Figuur 1). 'N CD-spektrum met twee positiewe pieke rondom 290 en 260 nm dui op 'n antiparallelle G-tetrapleks. 24, 25 Die spektrum wat ons waarneem, stem egter nie ten volle ooreen met CD-spektra van die "klassieke" intramolekulêre anti-parallelle tetraplekse nie. Die mees waarskynlike rede is die teenwoordigheid van die sitosienryke 3'-deel van die ry, wat op onbekende maniere tot die CD-spektra sal bydra. Die CD -spektra van natuurlik voorkomende REP Hpar1 van H. parasuis (word nie verder bespreek nie) toon ook CD-spektrale kenmerke wat dui op 'n antiparallelle G-tetrapleks-konformasie (Ondersteunende inligtingstabel SI).

Op grond van hierdie waarnemings stel ons voor dat die ongewone CD -spektra van Chom-22 ontstaan ​​hoofsaaklik uit die interaksies tussen die guaninespore. Om hierdie moontlikheid te toets, het ons afgekap Chom-22 in Chom-12, behou slegs die purienryke 5'-deel van die ry, en verminder sodoende moontlike W-C-baseparing. CD -spektra van Chom-12 onthul funksies wat anders is as dié van Chom-22 (Figuur 2), met ooreenkomste met spektra wat gerapporteer is vir poly (dG) • poly (dC) 26 en vir G-ryk oligonukleotiede wat DNA-draadborstelstrukture vorm. Omdat poly (dG) • poly (dC) polimere en DNA -draadborstels dikwels 'n hoë persentasie poly (dG) tetraplex bevat met 'n parallelle rangskikking van die stringe, postuleer ons dat Chom-12 vorm ook 'n intermolekulêre parallel gestrande tetrapleks. Alhoewel die strukture aangeneem deur Chom-12 en Chom-22 verskil, is hulle albei in ooreenstemming met die moontlikheid van struktuurvorming gebaseer op G-kwartetbasisparing.

Om ons voorspelling verder te toets dat die waargenome oplossingsgedrag van Chom-22 word oorheers deur die vorming van 'n antiparallelle G-tetrapleks eerder as 'n stamlus-haarspeld, het ons stelselmatig die Chom-22 volgorde om die waarskynlikheid van tetrapleksvorming te versterk of te ontwrig. Om langer dupleks DNA-segmente na te boots, waarin Chom-22 REP-plekke is ingebed in die natuurlike DNA, ons het kort self-komplementêre stertreekse van 6 nukleotiede by beide die 5'- en die 3'-punte van die oorspronklike Chom22-volgorde (Skema 1a) gevoeg om Chom 38 (Skema 1b) te vorm. Die nukleotiedreekse wat vir die stertsegmente gekies is, is willekeurig, aangesien geen konsensus tydens sekwensanalise buite die C. hominis REP-domein. 'N Tetranukleotied T4 is bygevoeg as 'n buigsame skarnier tussen die Chom−22 ouervolgorde en die stertdomein aan die 3'-kant om rekening te hou met die herkenningsvolgorde GTAG aan die 5'-kant (Skema 1a,b). Om die waarskynlikheid van tetrapleksvorming in Chom-38, het ons 3 T's strategies in die plek van C's in die 3' -helfte van die palindroom ingevoeg om die komplementariteit van Watson -Crick tot 'n minimum te beperk en daardeur gevorm Chom-3T. As 'n verdere toets van ons hipotese, om die waarskynlikheid van tetraplekvorming te ontwrig, het ons 3 G's vervang in die G-kanale van die purienryke 5' helfte van die Chom-38 palindroom met 3 A's te vorm Chom-3A, Ons het ook G's gelyktydig gemuteer na A's sowel as die komplementêre C's na T's om te vorm Chom-3AT.

Soos in figuur 2 getoon, word die CD -spektra van Chom-38 stem ooreen met die molekule wat 'n soortgelyke antiparallelle tetrapleks as die ouer aanneem Chom-22 molekule, alhoewel die spektrale eienskappe daarvan subtiel verander word, weerspieël dit waarskynlik bydraes van die addisionele basisse en die strukturele beperkings wat dit inhou. Dit is belangrik dat die mutant Chom-3T, ontwerp om die waarskynlikheid van tetrapleksvorming te verhoog, vertoon CD -spektra soortgelyk aan die spektrum van die Chom-22 ouer, insluitend 'n positiewe band naby 290 nm. Chom-3T toon wel 'n koöperatiewe temperatuuroorgang by 'n baie laer smelttemperatuur (51°C) as Chom-22 en Chom-38, wat daarop dui dat, benewens die G-traktate, die C4-trek in Chom-22 en Chom-38 dra by tot die stabiliteit van die gevoude bouvorm in oplossing. Daarteenoor, en in ooreenstemming met ons ontwerpbeginsels, is die CD -spektra en sigmoïdale smeltkurwes van die Chom-3A en Chom-3AT mutante het nie kenmerke tipies van antiparallelle G-tetraplekse nie. Trouens, hul CD-spektra stem meer ooreen met konvensionele B-DNA-agtige spektra, met 'n voorkoms van W-C-basisparing, alhoewel die spektra effens verwring is relatief tot dié van generiese B-DNA, wat dalk die basissamestelling-effekte weerspieël.

Gesamentlik dui hierdie waarnemings daarop dat die dominante konformasie wat deur die Chom-22 oligonukleotied in oplossing is nie 'n stam-lus-haarnaald nie, maar eerder 'n pseudoknot-agtige rangskikking wat om 'n sentrale bimolekulêre G-tetraplekskern gevorm word, soos voorgestel in Skema 1c. Such a bimolecular pseudoknot-like arrangement leaves the pyrimidine-rich segment nominally unpaired. However, cytosine tracks can also adopt secondary two- and four-stranded structures in solution, especially at low pH. 28-30 Formation of an ordered cytosine-based structure might further contribute stabilizing interactions to the central tetraplex structure. Importantly, the significant differences observed between the CD spectra of the Chom mutants (Figure 2) at low temperatures are largely absent in spectra of the denatured species measured at 95°C. The low temperature spectral differences therefore predominantly reveal differences in conformation of the native state rather than differences in the base composition.


RESULTATE

Length-dependent RNA oligonucleotide-induced ribosomal frameshifting

Although antisense oligonucleotides were found to induce ribosomal frameshifting ( 27, 28), the optimal number of base pairs has not been addressed yet. To investigate this we designed antisense RNA oligonucleotides that are 6, 9, 12, 15 and 18 bases complementary to the region downstream of an UUUAAAC slippery sequence in our reporter plasmid SF468 ( Figure 1). First, titration with RNA6 and RNA9 oligonucleotides revealed that a 625-fold molar excess of oligonucleotides over mRNA resulted in the highest level of frameshifting ( Figure 2a) this ratio was used in the following experiments. The shortest oligonucleotide, RNA6, was not capable of inducing significant levels of frameshifting ( Figure 2b), whereas RNA9 induced ∼3.5% of frameshifting. Maximum levels were obtained with RNA12, RNA15 and RNA18 all three induced ∼12% of frameshifting. In the following experiments oligonucleotides between 12 and 18 nt in length were used.

Schematic representation of frameshift reporter constructs. ORF1 (19 kD) is in the 0 frame and ORF2 (46 kD) is in the −1 translational frame with respect to ORF1. The appearance of the 65 kD fusion protein represents the occurrence of −1 frameshifting. The UUUAAAC slippery sequence is indicated in italics. The 0-reading frame and −1 reading frames codons are indicated above and below the sequences, respectively. RNA18, 12, 15, 9 and 6 are antisense RNA oligonucleotides complementary to the indicated region downstream of the slippery sequence in SF468 mRNA.

Schematic representation of frameshift reporter constructs. ORF1 (19 kD) is in the 0 frame and ORF2 (46 kD) is in the −1 translational frame with respect to ORF1. The appearance of the 65 kD fusion protein represents the occurrence of −1 frameshifting. The UUUAAAC slippery sequence is indicated in italics. The 0-reading frame and −1 reading frames codons are indicated above and below the sequences, respectively. RNA18, 12, 15, 9 and 6 are antisense RNA oligonucleotides complementary to the indicated region downstream of the slippery sequence in SF468 mRNA.

Optimizing the ratio and lengths of frameshift-inducing RNA oligonucleotides. (a) An amount of 0.05 pmol of SF468 mRNA were mixed with 0.05, 0.25, 1.25, 6.25 and 31.25 pmol of RNA6 and RNA9 oligonucleotides, respectively. Mixtures were subsequently translated in the presence of 35 S-methionine and the labeled proteins were examined by 13% SDS–PAGE. Frameshift efficiencies [FS (%)] were calculated after quantification and correction of in-frame and frameshifted product. (b) A total of 625 M excess of different lengths of RNA oligos (RNA6, 9, 12, 15, 18, respectively) and control without added oligonucleotide were mixed with 0.05 pmol of SF468 mRNA. Mixtures were translated and examined by 13% SDS–PAGE. In-frame and frameshifted protein products are indicated by NFS and FS, respectively. Frameshifting efficiency [FS (%)] and standard deviation (SD) of three independent duplicate assays are indicated below each lane.

Optimizing the ratio and lengths of frameshift-inducing RNA oligonucleotides. (a) An amount of 0.05 pmol of SF468 mRNA were mixed with 0.05, 0.25, 1.25, 6.25 and 31.25 pmol of RNA6 and RNA9 oligonucleotides, respectively. Mixtures were subsequently translated in the presence of 35 S-methionine and the labeled proteins were examined by 13% SDS–PAGE. Frameshift efficiencies [FS (%)] were calculated after quantification and correction of in-frame and frameshifted product. (b) A total of 625 M excess of different lengths of RNA oligos (RNA6, 9, 12, 15, 18, respectively) and control without added oligonucleotide were mixed with 0.05 pmol of SF468 mRNA. Mixtures were translated and examined by 13% SDS–PAGE. In-frame and frameshifted protein products are indicated by NFS and FS, respectively. Frameshifting efficiency [FS (%)] and standard deviation (SD) of three independent duplicate assays are indicated below each lane.

LNA/DNA mix-mers induced-ribosomal frameshifting

Since we have absent knowledge about the efficacy of LNA-induced ribosomal frameshifting, LNA/DNA mix-mers of 18 nt in length were designed to investigate this ( Figure 3). A DNA oligonucleotide, as expected, was less capable (3.5%) of inducing frameshift due to the lower thermodynamic stability of RNA–DNA duplexes, see also below. Surprisingly, substituting the 3′-cytosine and guanosine in this DNA oligonucleotide by their LNA analogs enhanced its frameshift inducing capacity to 8.7%, i.e. as high as an RNA oligonucleotide (8.8%). Increasing the LNA content of this oligonucleotide further did not lead to higher frameshifting. On the contrary, the efficiency of LNA4 was with 7.7% lower than that of LNA2 and that of LNA6 was a mere 1.1%. Since the overall translation efficiency seemed not affected by LNA6 we suspected an effect of the oligonucleotide itself (see below).

Effect of LNA substitutions on oligonucleotide-induced frameshifting. SF468 mRNA was translated in the presence of a 625-fold molar excess of DNA, RNA or LNA substituted DNA oligonucleotides in rabbit reticulocyte lysate. DNA and RNA oligonucleotides are indicated in capital and LNA substitutions are denoted by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Effect of LNA substitutions on oligonucleotide-induced frameshifting. SF468 mRNA was translated in the presence of a 625-fold molar excess of DNA, RNA or LNA substituted DNA oligonucleotides in rabbit reticulocyte lysate. DNA and RNA oligonucleotides are indicated in capital and LNA substitutions are denoted by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

The effectiveness of LNA/DNA mix-mers is universal

To demonstrate that the enhanced effect of LNA oligonucleotides is a general feature we designed another construct (SF462) in which the target sequence was replaced by an unrelated sequence ( Figure 4). LNA/DNA mix-mers were designed in which nucleotides starting from the 3′-end were gradually replaced by LNA ( Figure 4). Increasing the number of LNAs from one to two and four in these DNA oligonucleotides improved their frameshift inducing ability, reaching an apparent optimum of 7.0% with four LNA substitutions. Further increase of the LNA content to 6 nt (LD6) did not improve frameshift efficiency, but, on the other hand, LD6 also did not lead to the dramatic decrease as observed above for the LNA6 oligonucleotide applied in the SF468 construct. We suspected that (partial) self-complementarity may be limiting the effective concentration of free LNA/DNA oligonucleotides. To check this possibility, we ran all the oligonucleotides on a non-denaturing polyacrylamide gel. Figure 5 showes that the LNA6 oligonucleotide indeed migrated more slowly indicative of partial dimer formation, presumably by intermolecular base pairing of the palindromic GCGCGC sequences in each oligonucleotide (compare the migration to that of the full dimer formed by annealing of oligonucleotides DNA18 and 18DNA). The LD series, as predicted, migrated as monomers. We noted that LD2, though loaded in equal amount, based on its UV absorbance, showed a higher affinity to ethidium bromide than its counterparts. At present we have no explanation for this unexpected behavior of LD2, since its migration and therefore its conformation was identical to the other LNA/DNA mix-mers.

Frameshift enhancing activity of LNA-substituted deoxy-oligonucleotides. mRNA SF462 was translated in the absence or presence of 625-fold molar excess of DNA, RNA or LNA substituted DNA oligonucleotides, in rabbit reticulocyte lysate. LNA modifications are indicated by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Frameshift enhancing activity of LNA-substituted deoxy-oligonucleotides. mRNA SF462 was translated in the absence or presence of 625-fold molar excess of DNA, RNA or LNA substituted DNA oligonucleotides, in rabbit reticulocyte lysate. LNA modifications are indicated by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Self-dimerization of frameshift-inducing oligonucleotides. An amount of 31.25 pmol of the indicated oligonucleotides were left at room temperature for 10 min. and then loaded on a 15% non-denaturing polyacrylamide gel. After electrophoresis, the gel was stained by EtBr and photographed under UV-light.

Self-dimerization of frameshift-inducing oligonucleotides. An amount of 31.25 pmol of the indicated oligonucleotides were left at room temperature for 10 min. and then loaded on a 15% non-denaturing polyacrylamide gel. After electrophoresis, the gel was stained by EtBr and photographed under UV-light.

These results demonstrate that LNA modifications indeed enhance the antisense-induced frameshifting efficiency probably due to higher thermodynamic stability and RNA-like structural properties. This phenomenon appears to be general, at least in our experiments.

Position effect of LNA substitutions

To investigate which positions in a DNA oligonucleotide would exert the largest effect when substituted by an LNA analog, we designed LNA/DNA mix-mer mutants based on LNA2, which is the most efficient LNA/DNA mix-mer in our experiments and would give a good read-out. When the two LNA substitutions were moved two positions more inward (L2-1), compared to LNA2, frameshift efficiency decreased to 6.7% ( Figure 6). However, when the LNA modifications were moved another two positions more inward (L2-2), activity dropped to 2.7% ( Figure 6) which is comparable to an unmodified DNA oligonucleotide. Similarly, when the LNA groups were introduced at the other end of the oligonucleotide, activity was as low as DNA18 ( Figure 6). Finally, L2-4, in which the first and fourth position were LNA, was only half as efficient as LNA2. These results indicate that the choice of the location of the LNA modifications is crucial for the frameshift-inducing efficiency of an oligonucleotide.

Position effect of LNA substitutions on their frameshift-inducing activity. LNA substitutions are indicated by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Position effect of LNA substitutions on their frameshift-inducing activity. LNA substitutions are indicated by lowercase characters. See legend to Figure 2 for more details.

Thermodynamic stability of frameshift-inducing oligonucleotides

Theoretically the position effect of the LNA substitutions could simply be explained by differences in thermodynamic stability of the resulting mRNA/oligonucleotide duplexes. To investigate this possibility we carried out UV-melting studies of the 18-nt LNA oligonucleotides in a 1:1 complex with an 18-nt RNA (18RNA) representing the mRNA. The melting temperatures (Tm) are shown in Table 1. The Tm of the 18RNA/RNA18 duplex was the highest with 82°C in agreement with its high frameshifting efficiency. The 18RNA/DNA18 duplex had a much lower Tm of 72°C, which is expected for an RNA/DNA hybrid, and also agreed with the lower frameshifting efficiency. The LNA substituted oligonucleotides, all had higher Tms (+4 to +9°C) than DNA18. Die Tm of L2-2 was with 81°C almost as high as that of RNA18. Remarkably there was no correlation between the Tm of the LNA oligonucleotides and their frameshifting inducing capacity. Byvoorbeeld, die Tm of LNA2 was rather low with 76°C but it had the highest frameshifting activity, and L2-2, which had the highest Tm, actually had the lowest frameshifting activity. Tms of L2-3 and L2-4 were identical but their frameshifting activities were 2.3 and 4.6%, respectively. We also noted that both L2-2 and L2-3 were comparable to DNA18 in frameshifting activity but formed far more stable duplexes. These data suggest that the position effect of the LNA substitutions is related to the mechanism of frameshifting and not op sigself to their thermodynamic stability.

Tm measurements of frameshift-inducing oligos hybridized to complementary RNA

Tm measurements of frameshift-inducing oligos hybridized to complementary RNA


Which DNA sequence will have higher melting temperature: CCCCCC… or GCGCGC… ? - Biologie

Genomic human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA consists of two identical RNA molecules joined noncovalently near their 5′ ends in a region called the dimer linkage structure (DLS). Previous work has shown that the putative DLS is localized in a 113-nucleotide domain encompassing the 5′ end of the gag geen. This region contains conserved purine tracks that are thought to mediate dimerization through purine quartets. However, recently, an HIV-1Ma1 RNA dimerization model was proposed as the HIV-1Ma1 RNA dimerization initiation site, involving another region upstream from the splice donor site and possibly confined within a stem-loop. In the present study, we have investigated the dimerization of HIV-1Lai RNA, using in vitro dimerization assays under conditions of low ionic strength, predictive RNA secondary structures determined by computer folding, and antisense DNA oligonucleotides in order to discriminate between these two models. Our results suggest that purine quartets are not involved in the dimer structure of HIV-1Lai RNA and have led to the identification of a region upstream from the splice donor site. This region, comprising an autocomplementary sequence in a possible stem-loop structure, is responsible for the formation of dimeric HIV-1Lai RNA.

This work is dedicated to the memory of Claude Paoletti.

∗ This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche sur le SIDA (ANRS). The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore by hereby marked “advertensie” in ooreenstemming met 18 U.S.C. Artikel 1734 slegs om hierdie feit aan te dui.

Student of the Institut de Formation Supérieure Biomédicale (IFSBM) and supported by a Synthelabo fellowship.


DNA intercalation and inhibition of topoisomerase II : Structure-activity relationships for a series of amiloride analogs

Among its many properties, amiloride is a DNA intercalator and topoisomerase II inhibitor. Previous work has indicated that the most stable conformation for amiloride is a planar, hydrogen-bonded, tricyclic structure. To determine whether the ability of amiloride to intercalate into DNA and to inhibit DNA topoisomerase II was dependent on the ability to assume a cyclized conformation, we studied the structure-activity relationship for 12 amiloride analogs. These analogs contained structural modifications which could be expected to allow or impede formation of a cyclized conformation. Empirical assays consisting of biophysical, biochemical, and cell biological approaches, as well as computational molecular modeling approaches, were used to determine conformational properties for these molecules, and to determine whether they intercalated into DNA and inhibited topoisomerase II. Specifically, we measured the ability of these compounds to 1) alter the thermal denaturation profile of DNA, 2) modify the hydrodynamic behavior of DNA, 3) inhibit the catalytic activity of purified DNA topoisomerase II in vitro, 4) promote the topoisomerase II-dependent cleavage of DNA, and 5) inhibit functions associated with DNA topoisomerase II in intact cells. Results indicated that only those analogs capable of cyclization could intercalate into DNA and inhibit topoisomerase II. Thus, the ability of amiloride and the 12 analogs studied to intercalate into DNA and to inhibit topoisomerase II appears dependent on the ability to exist in a planar, hydrogen-bonded, tricyclic conformation.