Inligting

4.7: Vertaling van RNA na Proteïen - Biologie

4.7: Vertaling van RNA na Proteïen - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

RNA na proteïene. Hoe?

Jy moet vertaal. Om van een taal na 'n ander te gaan. Spaans na Engels, Frans na Duits, of nukleotiede na aminosure. Watter tipe is die vertaling van molekulêre biologie? Die tipe vertaling wat hier bespreek word, vertaal duidelik van die taal van nukleotiede na die taal van aminosure.

Vertaling

Vertaling is die tweede deel van die sentrale dogma van molekulêre biologie: RNA → Proteïen. Dit is die proses waarin die genetiese kode in mRNA gelees word, een kodon op 'n slag, om 'n proteïen te maak. Figuur hieronder toon hoe dit gebeur. Nadat mRNA die kern verlaat, beweeg dit na a ribosoom, wat bestaan ​​uit rRNA en proteïene. Die ribosoom lees die volgorde van kodone in mRNA. Molekules van tRNA bring aminosure in die korrekte volgorde na die ribosoom.

Vertaling van die kodone in mRNA na 'n ketting van aminosure vind plaas by 'n ribosoom. Let op die groeiende aminosuurketting wat aan die tRNA's en ribosome geheg is. Vind die verskillende tipes RNA in die diagram. Wat is hul rol in vertaling?

Om die rol van tRNA te verstaan, moet u meer weet oor die struktuur daarvan. Elke tRNA-molekule het 'n anticodon vir die aminosuur wat dit dra. 'n Antikodon is 'n volgorde van 3 basisse, en is komplementêr tot die kodon vir 'n aminosuur. Die aminosuur lysien het byvoorbeeld die kodon AAG, dus die antikodon is UUC. Daarom sal lysien deur 'n tRNA -molekule saam met die anticodon UUC gedra word. Waar die kodon AAG ook in mRNA voorkom, bind 'n UUC antikodon op 'n tRNA tydelik aan die kodon. Terwyl dit gebind is aan die mRNA, gee die tRNA sy aminosuur prys. Bindings vorm tussen aangrensende aminosure terwyl hulle een vir een na die ribosoom gebring word, wat 'n polipeptied ketting. Die ketting van aminosure groei steeds totdat 'n stopkodon bereik word. Om te sien hoe dit gebeur, gaan na die skakel hieronder.http://www.youtube.com/watch?v=B6O6uRb1D38 (1:29)

Die tRNA -struktuur is 'n baie belangrike aspek in sy rol. Alhoewel die molekule in 'n vou 3-blaar klawer struktuur, let op die antikodonarm in die onderste segment van die molekule, met die aminosuur aan die teenoorgestelde kant van die molekule (akseptorstam) geheg. Dit is die antikodon wat bepaal aan watter kodon in die mRNA die tRNA sal bind.

Nadat 'n polipeptiedketting gesintetiseer is, kan dit bykomende prosesse ondergaan. Dit kan byvoorbeeld 'n gevoude vorm aanneem as gevolg van interaksies tussen sy aminosure. Dit kan ook met ander polipeptiede of met verskillende tipes molekules bind, soos lipiede of koolhidrate. Baie proteïene reis na die Golgi -apparaat om aangepas te word vir die spesifieke taak wat hulle sal verrig. U kan sien hoe dit gebeur deur na die animasie te kyk op hierdie skakel: http: //vcell.ndsu.edu/animations/proteinmodification/movie-flash.htm.

Opsomming

  • Vertaling is die RNA → Proteïen deel van die sentrale dogma.
  • Vertaling vind plaas by 'n ribosoom.
  • Tydens translasie word 'n proteïen gesintetiseer met behulp van die kodons in mRNA as 'n riglyn.
  • Al drie tipes RNA speel 'n rol in translasie.

Verken Meer

Verken meer I

Gebruik hierdie hulpbron om die daaropvolgende vrae te beantwoord.

  • http://www.hippocampus.org/Biologie → Nie-hoofvakke Biologie → Soek: Vertaling
  1. Benewens die mRNA, benodig vertaling watter drie komponente?
  2. Beskryf die struktuur van 'n ribosoom.
  3. Beskryf die struktuur en rol van 'n tRNA -molekule.
  4. Definieer kodon en antikodon.
  5. Hoe vind beëindiging plaas?

Resensie

  1. Beskryf die stappe van vertaling.
  2. Bespreek die struktuur van 'n tRNA -molekule en die rol daarvan in translasie.
  3. Hoe hou transkripsie en vertaling verband met die sentrale dogma van molekulêre biologie?

4.7: Vertaling van RNA na Proteïen - Biologie

Ons het ons programmering aangepas om skole, tuisskoolgroepe, opvoedkundige peule en die publiek op soek na virtuele en ter plaatse opsies te akkommodeer.

Met Klas

Vir skole, tuisskoolgroepe, opvoedingspeule

Tuis

Individue, gesinne, openbare groepe

By 'n DNALC

Individue, gesinne, openbare groepe

Persoonlike kampe [Gaan na die DNALC -kampwebwerf, die somerregistrasie is oop]


Vertaling (gevorderd)

Die geel molekule is messenger RNA (mRNA) dit verlaat die kern by die ribosoom, ribosomale RNA (rRNA) bind aan mRNA -oordrag RNA of tRNA (in groen) kan die drie letterkode op mRNA of kodon lees, elke kodon kodeer vir een animosuur (rooi molekule geheg aan tRNA) die volgorde van kodons op die mRNA bepaal die volgorde van aminosure in die proteïen, wat weer die struktuur en funksie van die proteïen bepaal.

Tydsduur: 3 minute, 3 sekondes

Die taak van hierdie mRNA is om die gene -boodskap van die DNA uit die nuceus na 'n ribosoom te vervoer vir die produksie van die spesifieke proteïen waarvoor hierdie geen kodeer. Daar kan etlike miljoene ribosome in 'n tipiese eukariotiese sel wees, hierdie komplekse katalitiese masjiene gebruik die mrna-kopie van die genetiese inligting om aminosuurboublokke saam te stel in die driedimensionele proteïene wat noodsaaklik is vir lewe. Kom ons kyk hoe dit werk. Die ribosoom bestaan ​​uit een groot en een klein sub-eenheid wat rondom die boodskapper-RNA saamstel, wat dan soos 'n rekenaarband deur die ribosoom beweeg. Die aminosuurboublokke (dit is die klein gloeiende rooi molekules) word na die ribosoom gedra wat aan spesifieke oordrag-RNA's geheg is. Dit is die groter groen molekules wat ook tRNA genoem word. Die klein sub-eenheid van die ribosoom posisioneer die mRNA sodat dit gelees kan word in groepe van drie letters bekend as 'n kodon. Elke kodon op die mRNA pas by 'n ooreenstemmende anti-kodon op die basis van 'n oordrag-RNA-molekule. Die groter sub-eenheid van die ribosoom verwyder elke aminosuur en voeg dit by die groeiende proteïenketting. Aangesien die mRNA deur die ribosoom gehardloop word, word die mRNA -volgorde in 'n aminosuurvolgorde vertaal. Daar is drie plekke binne die ribosoom, aangedui as die A-plek, die P-plek en die E-plek. Die byvoeging van elke aminosuur is 'n driestap-siklus: Eerstens gaan die tRNA die ribosoom by die A-plek binne en word getoets vir 'n kodon/anti-kodon-passing met die mRNA. Vervolgens, mits daar 'n korrekte passing is, word die tRNA na die P-plek verskuif en die aminosuur wat dit dra word aan die einde van die aminosuurketting gevoeg. Die mRNA word ook op drie nukleotiede of een kodon ratel. Derdens word die gebruikte tRNA na die E-webwerf verskuif en dan uit die ribosoom gestoot om herwin te word. Namate die proteïensintese vorder, kom die voltooide ketting uit die ribosoom. Dit vou in 'n presiese vorm, bepaal deur die presiese volgorde van aminosure. So verduidelik die Sentrale Dogma hoe die vier -letter -DNS -kode letterlik in vlees en bloed verander word.

messanger rna, proteïenvertaling, ribosomale rna, volgorde van aminosure, kodons, trna, rrna, struktuur en funksie, molekule


DMCA klagte

As jy glo dat inhoud wat deur middel van die webwerf beskikbaar is (soos omskryf in ons diensbepalings) een of meer van jou kopiereg skend, stel ons asseblief in kennis deur 'n skriftelike kennisgewing ("oortredingskennisgewing") te verskaf wat die inligting wat hieronder beskryf word bevat aan die aangewese agent hieronder gelys. Indien Varsity Tutors aksie neem in reaksie op 'n Oortredingskennisgewing, sal dit 'n goeie trou poging aanwend om die party te kontak wat sodanige inhoud beskikbaar gestel het deur middel van die mees onlangse e-posadres, indien enige, wat deur sodanige party aan Varsity Tutors verskaf is.

U oortredingskennisgewing kan gestuur word aan die party wat die inhoud beskikbaar gestel het, of aan derde partye soos ChillingEffects.org.

Neem asseblief kennis dat jy aanspreeklik sal wees vir skadevergoeding (insluitend koste en prokureursfooie) as jy wesenlik verkeerd voorstel dat 'n produk of aktiwiteit jou kopiereg skend. As u dus nie seker is dat inhoud wat op die webwerf geleë is of 'n skakel daaraan het, u kopiereg skend nie, moet u eers oorweeg om 'n prokureur te kontak.

Volg asseblief hierdie stappe om 'n kennisgewing in te dien:

Jy moet die volgende insluit:

'N Fisiese of elektroniese handtekening van die eienaar van die outeursreg of 'n persoon wat gemagtig is om namens hulle op te tree. detail sodat Varsity Tutors die inhoud kan vind en positief kan identifiseer. Ons benodig byvoorbeeld 'n skakel na die spesifieke vraag (nie net die naam van die vraag nie) wat die inhoud bevat en 'n beskrywing van watter spesifieke gedeelte van die vraag - 'n beeld, skakel, die teks, ens. - u klagte verwys na u naam, adres, telefoonnommer en e -posadres en 'n verklaring deur u: (a) dat u te goeder trou glo dat die gebruik van die inhoud wat u beweer dat u u kopiereg skend, nie deur die wet gemagtig is nie, of deur die outeursregteienaar of sodanige eienaar se agent (b) dat al die inligting in u inbreukberig akkuraat is, en (c) onder straf van meineed, dat u óf die eienaar van die outeursreg of 'n persoon wat gemagtig is om namens hulle op te tree.

Stuur u klagte aan ons aangewese agent by:

Charles Cohn Varsity Tutors LLC
101 S. Hanley Rd, Suite 300
St. Louis, MO 63105


Oorsig van die konferensie

Vertaalbeheer is 'n belangrike fokuspunt wat op baie terreine strek, insluitend ontwikkelingsbiologie, neurobiologie, selfisiologie, siektes, sintetiese en stelselbiologie. Benewens boodskapper-RNA-vertaling, sal die konferensie ook vordering bied op die gebied van epitranscriptomika en nie-koderende RNA's wat die vertaalproses beïnvloed. Gegewensvolle data-deurvoertegnologieë en strukturele vooruitgang sal ook sentraal staan, aangesien dit die veld vorentoe dryf op maniere wat slegs 'n paar jaar gelede ondenkbaar was, en dit help om 'n gesonde stelsel van vertaling te skep.

Met die toenemende waardering vir die integrasie tussen verskillende stappe van geenuitdrukking, sal die konferensie die verbande tussen vertaling, mRNA-omset, nonsens-gemedieerde verval, RNA-lokalisering, splitsing, ens. Die konsep word ontrafel, wat die potensiaal vir regulering vergroot. Hierdie alternatiewe word aangebied, asook die rol van translasieregulering by siektes so uiteenlopend soos kanker, neurologiese afwykings of aansteeklike siektes.


Rol van RNA in proteïensintese

In alle lewende selle word die proses om genetiese inligting van DNA te vertaal na die proteïene wat die meeste werk in 'n sel doen, uitgevoer deur molekulêre masjiene wat bestaan ​​uit 'n kombinasie van RNA en proteïen. Verbasend genoeg is dit die RNA, en nie die proteïen nie, wat die kritiese werk in hierdie masjien vir die maak van proteïene doen, wat die ribosoom genoem word. Die basiese vorm en funksionele kern van die ribosoom word gevorm deur RNA. Die RNA is in stand gehou deur meer as 'n miljard jaar van evolusie: ribosomale RNA in bakterieë en mense is merkwaardig soortgelyk. 'N Tweede soort RNA, genaamd messenger RNA of mRNA, beweeg genetiese inligting van die DNA na die ribosoom. Messenger RNA voorsien die ribosoom van die bloudrukke vir die bou van proteïene. Aminosure is die boustene van proteïene. Elke aminosuur in 'n proteïen word deur nog 'n ander tipe RNA aan die ribosoom gelewer: oordrag -RNA (tRNA). Die ribosoom gebruik die inligting in boodskapper-RNA om die oordrag-RNA-gebonde aminosure in die regte volgorde aan mekaar te koppel om elke verskillende tipe proteïen in die sel te maak: menslike selle maak byna 100 000 verskillende soorte proteïene, elk met sy eie unieke boodskapper-RNA volgorde.

Die sentrale rol van RNA in proteïensintese word geïllustreer deur die feit dat baie antibiotika wat gebruik word om infeksies te beveg, aan die ribosomale RNA van bakterieë bind en die produksie van sellulêre proteïen blokkeer. Dit verhoed dat die bakterieë groei. Foute in die produksie of volgorde van die RNA-komponente van die proteïensintese-masjinerie kan ook siektes by mense veroorsaak, insluitend Diamond Blackfan-anemie, wat veroorsaak word deur 'n defek in die produksie van ribosoom, Dyskeratosis congenita, veroorsaak deur 'n defek in ribosomale RNA-struktuur, en sommige vorme van diabetes, miopatieë en enkefalopatieë as gevolg van mutasies in oordrag-RNA.

Dit is 'n amptelike bladsy van die Universiteit van Massachusetts Mediese Skool

RNA Therapeutics Institute (RTI) & bull 368 Plantation St Worcester, Massachusetts 01605


RNA-sentriese metodes

Proteïen-sentriese metodes is van beperkte nut vir die identifisering van nuwe RBP's wat met 'n spesifieke RNA interaksie het of vir die karakterisering van nuwe klasse van ncRNAs waarvoor die identiteite van die RNA-bindende proteïene nog onbekend is. 'N Alternatiewe benadering is om 'n RNA-sentriese proteïenidentifiseringstrategie te gebruik. Die algemene idee is eenvoudig: eerder as om 'n teenliggaam te gebruik om 'n interessante proteïen vas te vang en die gepaardgaande RNA te volg, suiwer hierdie metodes 'n RNA van belang en identifiseer die gepaardgaande proteïenkomplekse met behulp van metodes soos MS. Ons sal die verskillende variante van hierdie metodes hieronder ondersoek, met die fokus op dié wat ontwerp is om nuwe RNA-proteïeninteraksies volledig te identifiseer.

RNA -affiniteitsmetodes

Een algemene benadering om RNA vas te lê, is om natuurlike interaksies tussen RNA en proteïen te benut - soos die bakteriofaag MS2 virale jas proteïen, wat styf bind aan 'n RNA stamlusstruktuur [83]. In hierdie benadering word herhalings van die MS2-bindende RNA-stamlus by 'n RNA van belang geheg en word die gemerkte RNA-kompleks gesuiwer deur die MS2-proteïen aan 'n vaste drager of hars [84-86] te koppel. Hierdie dubbele komponent interaksies kan geoptimaliseer word om verhoogde affiniteit en stabiliteit moontlik te maak [44, 87]. Byvoorbeeld, in 'n onlangse benadering word gebruik gemaak van 'n vervaardigde Csy4 -proteïen, 'n komponent van die bakteriële groepe wat gereeld met 'n kort palindromiese herhalingstelsel (CRISPR) geplaas word, om 'n etiket met 'n hoër affiniteit te genereer as wat met tradisionele RNA -etikette, insluitend MS2 en PP7 [87]. Alternatiewelik kan kunsmatig ontwerpte RNA aptamers ontwikkel en gekies word vir binding aan algemeen gebruikte hars-gekonjugeerde proteïene [43, 88]. 'N Voorbeeld hiervan is die S1 aptamer wat bind aan streptavidien [89, 90].

Die verskille tussen hierdie metodes kan benut word wanneer hulle hul onderskeie RNA-proteïenkomplekse probeer elueer. Oor die algemeen word proteïenkomplekse uit 'n ondersteuningshars elueer deur in SDS [87] te kook. Hierdie benadering sal gebonde materiaal van die hars dissosieer, insluitend komplekse wat spesifiek deur die etiket gebind is en dié wat nie-spesifiek direk aan die hars gebind is. Vir verskeie van hierdie affiniteitsmerkers kan komplekse meer spesifiek geëlueer word. Byvoorbeeld, in die geval van die S1 aptamer, kan die swakker affiniteit van die S1-streptavidien-interaksie in vergelyking met die biotien-streptavidien-interaksie ontgin word om spesifieke eluering van die RNA moontlik te maak deur 'n mededingende benadering met behulp van hoë konsentrasies biotien [91]. In die CRISPR-stelsel, as gevolg van die aard van die Csy4-mutant wat gebruik word, kan 'n mens die kompleks spesifiek deur die byvoeging van imidasool splits. Die spesifisiteit van eluering verhoog inderdaad die spesifisiteit van die gesuiwerde komplekse dramaties en kan die opsporingsgevoeligheid verbeter [87].

Suiwering van RNA en gepaardgaande proteïenkomplekse

RNA-sentriese benaderings kan in een van twee hoofklasse gegroepeer word: in vitro en in vivo suiweringsmetodes (Figuur 2a). Die in vitro benaderings gebruik oor die algemeen 'n sintetiese RNA -aas om proteïene uit sellulêre ekstrakte op te vang en te identifiseer [43, 88, 90]. Daarteenoor is die in vivo benaderings vang die RNA-proteïenkomplekse wat in die sel voorkom [45, 46, 85, 92]. Terwyl die in vivo metodes bewaar die konteks van ware RNA-proteïen-interaksies, dit is tegnies meer uitdagend, veral as die teiken-RNA 'n lae oorvloed in die sel is.

RNS-sentriese metodes vir die suiwering en identifisering van RNA-bindende proteïene. (a) Voorbeelde van suiweringskemas vir RNA-bindende proteïene wat gebruik word in vitro en in vivo benaderings. Vir in vitro benaderings, word 'n gemerkte RNA-konstruk gegenereer en aan 'n soliede ondersteuning gebind. In hierdie voorbeeld word die MS2 proteïen-RNA interaksiemerkingsmetode getoon met die teiken-RNA (rooi), MS2-bindende motief (pers) en MS2 proteïen (grys). Sellisaat word voorberei en proteïene uit lisaat word vasgelê met behulp van die gemerkte RNA in vitro. Vir in vivo benaderings, word die teiken-RNA verknoop aan spesifieke interaksie-RNA-bindende proteïene in lewende selle met behulp van UV, formaldehied of ander verknopers. Selle word gelyseer en die RNA-proteïenkomplekse word uit oplossing gevang. In beide scenario's word die kompleks gewas om nie-spesifieke interaksies (groen proteïene) te verwyder. Uiteindelik word die gebonde proteïene uitgeskakel. (b) MS word algemeen gebruik om die RBP's in 'n gesuiwerde monster te identifiseer. In nie-kwantitatiewe MS-benaderings word RBP's gesuiwer van ongemerkte selmateriaal deur óf 'n RNA van belang óf 'n kontrolekonstruksie te gebruik. Na skeiding deur eendimensionele gelelektroforese, word spesifieke proteïenbande uit die monster geselekteer, uitgesny en deur MS-analise geïdentifiseer. In kwantitatiewe MS-benaderings word proteïene differensieel gemerk op grond van hul aanvanklike selpopulasies. Eksperimentele en kontrolesuiwerings word op hierdie gemerkte populasies uitgevoer en die gesuiwerde RBP's word saamgevoeg om 'n enkele monster te skep. MS-analise laat direkte vergelyking van gemerkte peptiede toe, wat dan gekwantifiseer kan word om spesifieke proteïene in die monster te bepaal in vergelyking met die kontrole. SILAC, stabiele isotoop-etikettering deur aminosure in selkultuur.

Soortgelyk aan die proteïen-sentriese metodes, kan suiwering van RNA onder inheemse toestande lei tot herassosiasie of vorming van nie-spesifieke RNA-proteïen interaksies in oplossing. Studies met behulp van in vitro benaderings of suiwerings in inheemse toestande het oor die algemeen verband gevind tussen die RNA van belang en hoogs volop proteïene in die sel, soos hnRNPs [85, 91, 92]. Of dit werklike biologiese interaksies of nie-spesifieke assosiasies verteenwoordig, is onduidelik omdat slegs 'n handjievol RNA's tot dusver gesuiwer is. Om dit aan te spreek, het 'n onlangse studie gebruik gemaak van UV -verknoping en gesuiwerde RNA -komplekse onder volledig denaturerende toestande (met behulp van 8 M ureum), wat slegs vang in vivo verknoopte komplekse [85]. Deur hierdie benadering te gebruik, was daar duidelike verskille in die proteïene wat geïdentifiseer is na suiwerings uitgevoer in inheemse en denaturerende toestande. DNA-bindende proteïene en ander oorvloedige nukleïensuur-bindende proteïene was slegs teenwoordig in die inheemse suiwering, maar nie in die denaturerende suiwering nie, wat daarop dui dat ten minste sommige van hierdie gesuiwerde proteïene te wyte kan wees aan nie-spesifieke assosiasie in oplossing. Ander benaderings gebruik streng, hoë-sout was toestande om nie-spesifieke interaksies tydens RNA-proteïen kompleks suiwering te verminder [45, 93, 94].

Die uitdaging met denaturerende benaderings is dat dit vereis dat komplekse in die sel gekruis word, wat nie doeltreffend is nie. Daarbenewens kan verskeie verknopingsstrategieë, soos formaldehiedverknoping, addisionele tegniese uitdagings hê wat verband hou met die identifisering van verknoopte peptiede deur MS [95].

Definieer die proteïene wat met 'n RNA assosieer

Ons sal fokus op MS-metodes vir identifikasie van RNA-bindende proteïene. Daar is twee belangrikste maniere waarop hierdie proteïenkomplekse deur MS volledig geïdentifiseer is: nie-kwantitatiewe en kwantitatiewe MS (figuur 2b).

In die nie-kwantitatiewe metodes word gesuiwerde proteïene van die RNA-monster van belang en 'n kontrole geskei deur gelelektroforese en gekleur vir totale proteïen. Proteïenbande wat slegs in die monster van belang is, maar nie die kontrole nie, word onttrek en die proteïene word geïdentifiseer deur MS [84]. Alternatiewelik kan die totale proteoom deur MS geanaliseer word om alle proteïene wat in 'n monster gesuiwer is, op te spoor [87, 96]. Die voordeel van laasgenoemde benadering is dat alle proteïene in die monster geïdentifiseer kan word, insluitend dié wat nie op die jel sigbaar is nie. In hierdie benadering kan die kontrole ook geanaliseer word om nie-spesifieke proteïene vir uitsluiting te identifiseer. Dit is egter moeilik om die hoeveelhede proteïene wat in die monster en kontrole geïdentifiseer is, direk te vergelyk as gevolg van variasies in die relatiewe intensiteit van geïdentifiseerde peptiede in onafhanklike lopies [53].

Om hierdie beperking te oorkom, kan 'n mens kwantitatiewe MS gebruik om die proteïene in die monster en kontrole gelyktydig te vergelyk. Daar is verskillende maniere om dit te doen (hersien in [53]). In een gewilde metode wat vir RNA-proteïenanalise gebruik word, word selle metabolies gemerk om differensieel gemerkte proteïenpoele vir MS-analise te genereer, waarin die isotope van die proteïene vergelyk word om direkte kwantifisering te verskaf [97]. Die voordeel van hierdie benadering is dat die verhoudings van peptiede van die eksperimentele en kontrolemonsters direk vergelyk kan word om diskriminasie van ware bindingsvennote van nie-spesifieke interaksies moontlik te maak. Hierdie metode is verantwoordelik vir sommige van die probleme wat verband hou met 'n oorvloed proteïenvereniging. As 'n voorbeeld, in kwantitatiewe MS-eksperimente, toon die meeste van die oorvloedige proteïene, soos hnRNP's, gelyke oorvloed in beide eksperimentele en kontrolemonsters, wat daarop dui dat hierdie interaksies nie spesifiek is vir die RNA van belang nie [91].

Die keuse van watter MS-benadering om te gebruik vir die identifikasie van RBP's hang af van die aard van die stroomop suiwering. As u 'n protokol gebruik waar die gevolglike proteïensuiwering min agtergrond in die kontrolemonster oplewer, kan 'n nie-kwantitatiewe benadering goed werk. Die CRISPR-Csy4-stelsel, byvoorbeeld, is voorheen getoon om baie hoë strengheid en spesifieke eluering moontlik te maak, en as gevolg hiervan het 'n nie-kwantitatiewe benadering betroubare resultate gelewer [87]. Net so kan nie-kwantitatiewe MS 'n goeie benadering bied wanneer kruisverbinding gevolg word deur 'n denaturerende suiweringstrategie, gevolg deur 'n denaturerende suiweringstrategie. In teenstelling hiermee, kan 'n kwantitatiewe MS-benadering 'n groter vermoë bied om te onderskei tussen spesifieke en nie-spesifieke binders as 'n stelsel met 'n hoër agtergrond gebruik word.

Analitiese uitdagings met RBP MS -analise

Daar is verskeie analitiese uitdagings vir die identifisering van proteïene wat met 'n RNA deur MS geassosieer word. Soortgelyk aan die proteïengesentreerde metodes, moet groot sorg geneem word om insiggewende negatiewe kontroles vir die RNA-sentriese metodes te kies. Beheer wat gereeld gebruik word, sluit in 'n ander sellulêre RNA [92], rye sonder bekende proteïenbindende strukture [85–91], slegs-kontroles [44], antisense RNA [71, 98] of nie-spesifieke RNA-rye [99 ]. In hierdie gevalle moet enige nie-spesifieke proteïeninteraksies as gevolg van oorvloed, nukleïensuurbinding of die etiket self identies wees vir die teiken-RNA en kontroles. Die ideale negatiewe beheer is egter nie duidelik vasgestel nie, omdat daar spesifieke kenmerke van die RNA van belang kan wees wat nie-spesifiek aan sekere proteïene bind. In gevalle waar proteïen-RNA-verknoping gebruik word, sou die ideale kontrole 'n nie-verknoopte monster wees omdat dit die identiese suiwering van dieselfde RNA verteenwoordig, maar sonder enige in vivo verknoopte komplekse [96]. Hierdie benadering vereis egter die gebruik van in vivo verknoping gevolg deur 'n denaturerende suiwering en is dus nie van toepassing op alle suiweringsmetodes nie. In die afwesigheid hiervan moet verskeie verskillende negatiewe kontroles ingesluit word om robuustheid van die geïdentifiseerde resultate te verseker.

'N Beduidende uitdaging by die identifisering van onbekende RBP's is die opwekking van voldoende materiaal vir MS, veral vir lae oorvloed RNA-proteïenkomplekse. Anders as opeenvolgingsmetodes wat nukleïensuurversterking moontlik maak, kan die hoeveelheid proteïen wat in hierdie eksperimente gesuiwer word, nie versterk word nie. Om hierdie rede is RNA-sentriese metodes meestal toegepas op hoogs volop RNA's, soos 7SK [44], snRNP's [100], Let-7 [99] en IRES [85]. Meer onlangs is hierdie benaderings gebruik om proteïene wat met alle mRNA geassosieer word, te definieer deur UV-verknopende RNA-proteïenkomplekse, die vaslegging van gepolyadenileerde transkripsies met behulp van oligo-dT-gekoppelde magnetiese krale en die opsporing van geassosieerde proteïene deur kwantitatiewe MS [45, 46, 94]. Tog is die toepassing van hierdie benadering om bindende vennote van individuele mRNA's, lncRNA's of ander lae oorvloed RNA's te identifiseer steeds 'n belangrike uitdaging.


Vertaling / proteïensintese

Proteïensintese is die proses waar selle proteïene skep.

Verduideliking:

Daar is twee stappe in proteïensintese. Dit is transkripsie en vertaling.

Tydens transkripsie word mRNA (Messenger RNA) in die kern van die sel gevorm. Nadat mRNA gemaak is, verlaat dit die kern en gaan na die ribosome in die sitoplasma, waar translasie plaasvind. (DNS verlaat nooit die kern nie.)

Tydens translasie heg mRNA homself aan die ribosoom. Dan lees tRNA (Transfer RNA) die mRNA-kodons ('n kodon is 'n volgorde van drie nukleotiede wat vir 'n proteïen kodeer) en heg aminosure dienooreenkomstig aan. Dit duur voort totdat tRNA 'n stopkodon bereik.

Antwoord:

Kodons is drieletter genetiese woorde: en die taal van gene gebruik 4 letters (=stikstofbasisse). Daarom is daar 64 woorde in die genetiese woordeboek, wat 20 aminosure verteenwoordig wat die biologiese organismes gebruik.

Verduideliking:

En jy moet daarop let meer as een kodon kan vir dieselfde aminosuur kodeer. Hierna word verwys as agteruitgang van die kode.

Byvoorbeeld, drie aminosure word deur enige van ses verskillende kodons gekodeer, en dit alleen gebruik 18 van die 64 kombinasies.

Drie van die kodons is stop kodons.

Hulle kodeer nie vir enige aminosuur nie.

In plaas daarvan dien hulle as seine om die genetiese boodskap wat deur boodskapper RNA gedra word, te beëindig.

Die aantal aminosure wat deur kodons gekodeer word, is

#1 "codon" × kleur (wit) (l) 2 "aminosure" = kleur (wit) (ll) 2 "codons"#
#2 "kodons" × 9 "aminosure" = 18 "kodons"#
#3 "kodons" × 1 "aminosuur" = kleur(wit)(X)3 "kodons"#
#4 "kodons" × 5 "aminosure" = 20 "kodons"#
#6 "kodons" × 3 "aminosure" = 18 "kodons"#
#kleur (wit) (XXXXXXXXXXXXXXXX) 3 "stopkodons"#
#stackrel (—————————————————————————) (kleur (wit) (XXXXXXXXXl) "TOTAL" = 64 "kodons")#

Hier is 'n grafiek wat die kodonopdragte vir die aminosure gee.

Antwoord:

Vertaling vind plaas wanneer ribosome inligting van RNA gebruik om proteïene te bou.

Verduideliking:

Translasie is die tweede fase van proteïensintese. Dit volg op transkripsie, waarin die inligting in DNA in hRR "herskryf" word. Tydens translasie word die mRNA geheg aan 'n ribosoom. Dra RNA (tRNA) molekules oor, "lees" dan die mRNA kode en vertaal die boodskap in 'n reeks aminosure. Elke drie nukleotiede in die mRNA vorm een ​​kodon, wat ooreenstem met een aminosuur in die resulterende proteïen. Die ribosoom volg langs die mRNA totdat dit 'n stopkodon bereik, wat die samestelling van mRNA en ribosoom aandui om uitmekaar te breek.

Hieronder is 'n stop-motion Vine-video wat die stappe van vertaling opsom.

Die video hieronder verskaf 'n opsomming van hoe die prosesse van transkripsie en vertaling plaasvind met behulp van die Shockwave-tutoriaal DNA-werkswinkel van PBS.


4.7: Vertaling van RNA na Proteïen - Biologie

RNA -vertaling: RNA maak proteïene

In prinsiep:
Vertaling van boodskapper RNA ( mRNA ) vind plaas op ribosome ,
wat insluit ribosomale RNA ( rRNA ) ,
met die hulp van oordra RNA ( tRNA )

Struktuur van rRNA en amp tRNA

ribosomaal RNA (rRNA)
rRNA + ribosomale proteïen ribosome [iG1 6.09]
Struktuur van rRNA: stingels en lusse [iG1 6.05]
stamme: dubbelstrengs (dsRNA)
lusse : enkelstrengig (ssRNA)

Struktuur van eukariotiese ribosome [ iGen3 06-13 ] [iG1 6.04] [iG1 6.14b ]
Groot subeenheid (GVE) = 60S = 28S rRNA + 5S rRNA + 50 proteïene
Klein subeenheid (SSU) = 40S = 18S rRNA + 33 proteïene
= 80S monosoom

A werf (Aminoasiel), P webwerf (Peptidiel), & E webwerf (Verlaat) [iGen3 06-14]

oordra RNA (tRNA)
die adapter molekule:

30 tRNA tipes
2-dimensioneel 'klawerblaar' -model [iG1 6.10 ]
klein: 75

90 nukse
stamme & lusse
D-lus & TC-lus ( = pseudo-uridielsuur)
tRNA wat gekenmerk word deur 2 o gemodifiseerde basisse [iG1 6.19 ]
amino-aanvaarerstam
3' einde is CACCA - 3 '
5' einde is G - 5'
anticodon lus
spesifisiteit van tRNA vasgestel deur 3-ribonukleotiedvolgorde

3-dimensionele struktuur is 'n "L" [iG1 6.12 ]
D- & T C-lusse vou terug op mekaar

Gelaaide tRNA: aminosuur sintetase(x) vorm esterkoppeling tussen
3'-A van amino-acceptor stam van tRNA(x) & COOH van aminosuur(x) [iGen3 06-10, -11]

20 sintetasetipes 'herken' die korrekte anticodon -lus
iso-aanvaarding :
een-tot-een korrespondensie tussen sintetase en aminosuur
'N' Tweede genetiese kode '?

RNA-vertaling: Proteïensintese

'n Drie-stap proses (Hersien )
Ribosome "lees" mRNA & monteer polipeptied volgens die genetiese kode
(aanlyn MGA2-animasie)

(1) Inleiding by begin met die kodon ( AUG ) [iGen3 06-15]
SSU bind by Shine- Delgarno volgorde (-6 nucs) [iGen3 06-16]
Aanvangskompleks bestaan ​​uit mRNA, ribosoom, & amp tRNA
Meervoudige komplekse vorm op 'n enkele mRNA: polisoom ( polibribosoom )

tRNA fmet altyd eerste bygevoeg [N -formiel -metionien in prokariote]

In vereenvoudigde vorm,

5'-AUG-3 ' kodon in mRNA
|||
3'-UAC-5 ' antikodon in tRNA

5'-CAU-3 ' as anticodon 5 '3' geskryf is

(2) Verlenging : byvoeging van aminosure [ iGen3 06-17, vereenvoudig ] volgens Genetiese kode

Aminosure word via verbind peptiedbindings (sien volgende afdeling)
Dink aan mRNA soos vasgestel: ribosoom beweeg daarlangs 5'3'
peptidiel (P) webwerf op 5' einde,
aminosuur (A) webwerf op 3' einde

eerste AUG kodon [vir ontmoet ] is in P webwerf
tweede UUC kodon binnekom 'n webwerf
ooreenstemmend tRNAphe betree A werf

peptidiel transferase vorm peptiedbinding tussen fmet & phe
P-aminosuur oorgedra na A-aminosuur [iGen3 06-18]
tRNAfmet esterbinding verbreek, peptiedbinding aan tRNAphe gevorm
onbetaal tRNA vrygestel van P webwerf (gaan deur na E werf)
amino -einde van fmet bly onveranderd

en so aan . [aanlyn MGA-animasie] [iGen3 06-19]
groeiende polipeptied in P -plek sluit by enkele aminosuur in A -werf aan
aanvanklike fmet bly altyd onveranderd

"Wubbel" : paring van codon / anticodon gaan 5 '3' op codon
laaste posisie kan mis-paar
Minder tRNA benodigde spesies:
Bv.: drie tRNAser spesies vir ses kodons

tRNA
Anti-kodon
Alternatiewe Serine
mRNA -kodons
3'- AG G -5' 5'- UC C / U -3'
3'- AG U -5' 5'- UC A / G -3'
3'- UC G -5' 5'- AG C / U -3'

(3) Beëindiging : vrystelling van polipeptied [iGen3 06-20]

hier: mRNA + tRNA (lys-pro-gly-phe-fmet )

stop kodon (UAG, UAA of UGA) betree A werf
geen ooreenstemmende tRNA:
vrylating faktor skei polipeptied van terminale af tRNAn
Polipeptied produk is: lys - pro - gly - phe - fmet

5'- G U A A. U C C U C - 3 'mRNA

Hierdie is 'n logies, nie a biochemies, verhouding:
Want mRNA word getranskribeer vanaf die sjabloonstreng,
Dit "lyk soos"die sinstreng (behalwe 'U').
Die inligtinginhoud van die DNA -sinstreng en mRNA is identies

Proteïenvolgorde kan direk gelees word van DNA:
Lees die sin strand in die 5'3' rigting,
Plaasvervanger 'T'vir'U' in die kodetabel [of in jou kop]
Rekenaarprogramme (Chromas, Sequencher, ens.) Doen dit outomaties

Daar is ses moontlike maniere van die lees van 'n stuk dsDNA
twee 5 '3' drade X drie leesrame in elke string
Oop leesrame stel proteïenvolgordes voor

Die afleiding van proteïenvolgordes uit ewekansige DNS-volgordes is 'n belangrike navorsingsaktiwiteit
Bioinformatika: onttrekking van inligting uit groot makromolekulêre datastelle

Die volgende leidrade is nuttig:
Onthou dat alle prokariotiese koderingsvolgorde:
word slegs gelees in die 5'3' rigting
begin met 'n "begin" (AUG) kodon
eindig met 'n "stop" (UAG, UAA, of UGA) kodon.
Bv.: 'n tipiese eksamenprobleem is om 'n polipeptied van ses aminosure uit 'n dsDNA-molekule te identifiseer

Maar: in die werklike lewe, jou gekloonde eukariotiese DNA-fragment
het dalk nie begin- of stopkodon vir 'n volledige proteïen nie,
[en nie alle AUG-kodons is 'begin'-kodons nie]
en kan gedeeltelik of heeltemal 'n intron wees met een of meer 'stop'-reekse.

Onttrekking van inligting van willekeur DNA rye is 'n belangrike aktiwiteit van genomika

Moenie aanneem nie dat 'n dsDNA molekule word van links na regs op die boonste string gelees

Voorgestelde probleme vir hersiening


MGA2, pp. 86-87
Probleem 1 opgelos
Probleem # 1, 2, 3


4.7: Vertaling van RNA na Proteïen - Biologie

Figuur 1: Elektronmikroskopiebeeld van gelyktydige transkripsie en translasie. Die beeld toon bakteriële DNA en die gepaardgaande mRNA -transkripsies, wat elkeen deur ribosome beset word. (Aangepas uit O.L. Miller et al., Science 169:392, 1970.)

Transkripsie, die sintese van mRNA uit DNA en translasie, die sintese van proteïen uit mRNA, is die belangrikste pilare van die sentrale dogma van molekulêre biologie. Hoe vergelyk die snelhede van hierdie twee prosesse? Hierdie vraag word des te meer interessant as gevolg van waarnemings soos in Figuur 1, naamlik die bestaan ​​van die pragtige "kersboom" -strukture wat in E. coli waargeneem word met behulp van elektronmikroskopie. Hierdie gestereotipeerde strukture weerspieël die gelyktydige transkripsie en translasie van dieselfde geen en laat die vraag ontstaan ​​hoe die relatiewe snelhede van die twee prosesse vergelyk, sodat sodanige sinchronisasie van hierdie twee uiteenlopende prosesse moontlik is.

Figuur 2: Agterkant van die koevert berekening wat die tempo van transkripsie en vertaling vergelyk wat wys dat hulle effektief baie soortgelyk is. nt dui nukleotiede aan, dit wil sê basisse.

Transkripsie van RNA in E. coli van beide mRNA en die stabiele rRNA en tRNA word uitgevoer deur ≈1000-10,000 RNA polimerase molekules (BNID 101440) met 'n maksimum spoed van ongeveer 40-80 nt/sek soos getoon in tabel 1 (BNID 104900, 104902, 108488). Translasie van proteïene in E. coli word uitgevoer deur ≈10,000-100,000 ribosome (BNID 101441) en verloop teen 'n maksimum spoed van ongeveer 20 aa/sek soos getoon in Tabel 2 (BNID 100059, 105067, 108490). Interessant genoeg, aangesien elke 3 basispare vir een aminosuur kodeer, is die tempo van die twee prosesse amper ooreenstem soos skematies getoon in Figuur 2 (sien ook BNID 108487). As translasie vinniger as transkripsie was, sou dit veroorsaak dat die ribosoom met die RNA -polimerase in 'n prokariote 'bots' waar die twee prosesse gelyktydig kan plaasvind. Sulke ko-transkripsie-vertaling het handboekmateriaal geword deur beelde soos Figuur 1. Maar onlangse enkelmolekule-mikroskopie toon dat dit relatief selde plaasvind en die meeste vertaling is nie gepaard met transkripsie in E. coli nie (S. Bakshi et al., Mol Microbiol. 85:21, 2012). Rather, most translation takes place on mRNA that has already diffused away from the DNA rich nucleoid region to ribosome-rich cytoplasmic regions. The distribution of ribosomes in the cells is further shown in the vignette on “How many ribosomes are in a cell?”. In another twist and turn of the central dogma, it was shown that ribosomes can be important for fast transcription in bacteria (S. Proshkin et al., Science 328:504, 2010). The ribosomes seem to keep RNA polymerase from backtracking and pauses, which can otherwise be quite common for these machines, thus creating a striking reverse coupling between translation and transcription.

Table 1. Transcription rate measured across organisms and conditions. All values measured at 37°C except D. melanogaster measured at 22°C.

Table 2: Translation rate measured across organisms and conditions. All values measured at 37°C except for S. cerevisiae and N. crassa measured at 30°C.

What do the relative rates of transcription and translation mean for the overall time taken from transcription initiation to synthesized protein for a given gene? In bacteria, a one kb gene should take at maximal transcription rate about 1000 nt/80 nt/s ≈ 10s and translation elongation at maximal speed roughly the same. We note that the total time scale is the sum of an elongation time as above and the initiation time, which can be longer in some cases. Recently it was observed that increasing the translation rate, by replacing wobble codons with perfect matching codons, results in errors in folding (P. S. Spencer et al, J. Mol. Biol., 422:328, 2012). This suggests a tradeoff where translation rate is limited by the time needed to allow proper folding of domains in the nascent protein.

Figure 3: Effect of rifampin on transcription initiation. Electron micrographs of E. coli rRNA operons: (A) before adding rifampin, (B) 40 s after addition of rifampin, and (C) 70 s after exposure. After drug treatment, no new transcripts are initiated, but those already initiated are carrying on elongation. In parts (A) and (B) the arrow indicates the site where RNaseIII cleaves the nascent RNA molecule producing 16S and 23S ribosomal subunits. RNA polymerase molecules that have not been affected by the antibiotic are marked by the arrows in part (C). (Adapted from L. S. Gotta et al., J. Bacteriol. 20:6647, 1991.)

How are the rates of these key processes of the central dogma measured? This is an interesting challenge even with today’s advanced technologies. Let’s consider how we might attack this problem. One vague idea might be: “let’s express a GFP and measure the time until it appears”. To see the flaws in such an approach, check out the vignette on “What is the maturation time for fluorescent proteins?” (short answer – minutes to an hour), which demonstrates a mismatch of time scales between the processes of interest and those of the putative readout. The experimental arsenal available in the 1970’s when the answers were first convincingly obtained was much more limited. Yet, in a series of clever experiments, using electron microscopy and radioactive labeling these rates were precisely determined (Miller et al., Science 169:392, 1970 R. Y. Young & H. Bremer, Biochem. J., 152:243, 1975). As will be shown below, they relied on a subtle quantitative analysis in order to tease out the rates.

Measurements on transcription rates were based upon a trick in which transcription initiation was shut down by using the drug rifampin. Though no new transcription events can begin, those that are already under way continue unabated, i.e. rifampin inhibits the initiation of transcription, but not the elongation of RNA transcripts. As a result, this drug treatment effectively begins the running of a stopwatch which times how long since the last transcription process began. By fixing the cells and stopping the transcription process at different times after the drug treatment and then performing electron microscopy, resulting in images like that shown in Figure 3, it was possible to measure the length of RNA polymerase-free DNA. By taking into account the elapsed time since drug treatment the rate at which these polymerases are moving is inferred.

Figure 4: Dynamics of transcription in the fly embryo. (A) Schematic of the experiment showing how a loop in the nascent RNA molecule serves as a binding site for a viral protein that has been fused to GFP. (B) Depending upon whether the RNA loops are placed on the 5’ or 3’ end of the mRNA molecule, the time it takes to begin seeing GFP puncta will be different. The delay time is equal to the length of the transcribed region divided by the speed of the polymerase. (C) Microscopy images showing the appearance of puncta associated with the transcription process for both constructs shown in (B). (D) Distribution of times of first appearance for the two constructs yielding a delay time of 2.2 minutes, from which a transcription rate of 25 nt/s is inferred. Measurements performed at room temperature of 22OC. (adapted from H. G. Garcia, et al., Current Biology, 23, 2140–2145, 2013.)

The measurement of translation rates similarly depended upon finding an appropriate stopwatch, but this time for the protein synthesis process. The crux of the method is the following: start adding labeled amino acid at time zero and follow (“chase” as it is often called) the fraction of labeled protein of mass m as defined by looking at a specific band on a gel. Immediately after the pulse of labeled amino acids one starts to see proteins of mass m with radioactive labeled amino acids on their ends. With time, the fraction of a given protein mass that is labeled will increase as the chains have a larger proportion of their length labeled. After a time τm, depending on the transcript length, the whole chain will be labeled, as these are proteins that began their translation at time zero when the label was added. At this time one observes a change in the accumulation dynamics (when appropriately normalized to the overall labeling in the cell). From the time that elapsed, τm, and by knowing how many amino acids are in a polypeptide chain of mass m it is possible to derive an estimate for the translation rate. There are uncertainties associated with doing this that are minimized by performing this for different protein masses, m, and calculating a regression line over all the values obtained. For a full understanding of the method, the reader will benefit from the original study by Young & Bremer, Biochem. J., 160:185, 1976. It remains as a reliable value for E. coli translation rate to this day. We are not aware of newer methods that give better results.

Figure 5: Distribution of measured transcription elongation rates inferred from relieving transcription inhibition and sequencing all transcripts at later time points. (Adapted from G. Fuchs et al., Genome Bio., 15:5, 2014.)

What are the corresponding rates in eukaryotes? As shown in Tables 1 and 2, transcription in mammalian cells consists of elongation at rates similar to those measured in E. coli (50-100 nt/sec, BNID 105566, 105113, 100662). It is suggested that these stretches of rapid transcription are interspersed with pauses leading to an average rate that is about an order of magnitude slower (≈6 nt/sec, 100661), but some reports do not observe such slowing down (BNID 105565). Recent in-vivo measurements in fly embryos have provided a beautiful real-time picture of the transcription process by using fluorescence to watch the first appearance of mRNA as shown in Figure 4. Recently another approach utilizing the power of sequencing inferred the distribution of transcription elongation rates in a HeLa cell line as shown in Figure 5, showing a range of 30-100 nts/s with a median rate of 60 nts/s (BNID 111027). Remember that in eukaryotes, transcription and translation are spatially segregated, with transcription taking place in the nucleus and translation in the cytoplasm. Introns are excised from transcripts prior to translation taking about 5-10 minutes on average for this process of mRNA splicing (BNID 105568). Though our focus here was on transcript elongation, in some cases the rate limiting process seems to be the initiation of transcription. This is the process in which the RNA polymerase complex is assembled, and the two DNA strands are separated to form a bubble that enables transcription.

Figure 6: Inferring the rate of translation by the ribosome in mouse embryonic stem cells using ribosome profiling. (A) Inhibiting translation initiation followed by inhibition of elongation creates a pattern of ribosome stalling dependent on the time differences and rates of translation. Using modern sequencing techniques this can be quantified genome wide and the translation rate accurately measured for each transcript. (B) Measurement of the translation rate using the methodology indicated schematically in part (A). (Adapted from N. Ingolia et al., Cell, 146:789, 2011.

What about the rates of translation in eukaryotes? In budding yeast the rate is about 2 fold slower than that in bacteria (3-10 aa/s, BNID 107871), but one should note that the “physiological” temperature at which it is measured is 30ºC whereas for E. coli, measurements are at 37ºC. As discussed in the vignette on “How does temperature affect rates and affinities?”, the slower rate is what one would expect based on the general dependence of a factor of 2-3 per 10ºC (Q10 value, BNID 100919). Using the method of ribosome profiling based on high-throughput sequencing and schematically depicted in Figure 6, the translation rate in mouse embryonic stem cells was surveyed for many different transcripts. It was found that the rate is quite constant across proteins and is about 6 amino acids per second (BNID 107952). After several decades of intense investigation and ever more elaborate techniques at our disposal we seem to have arrived at the point where the quantitative description of the different steps of the central dogma can be integrated to reveal its intricate temporal dependencies.


Kyk die video: Translation mRNA to protein. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (Junie 2022).


Kommentaar:

  1. Goltira

    Today I was specially registered at a forum to participate in discussion of this question.

  2. Hamoelet

    En dit kan geparafraseer word?

  3. Twain

    Dit het my verstom.

  4. Motega

    Ek sal nie toelaat dat dit nie met u saamstem nie

  5. Aberto

    Ek sal seker niks sê nie

  6. Claudius

    Dit is nie die punt nie.



Skryf 'n boodskap