Inligting

Woon tydvergelykings vir ATP-sintase?

Woon tydvergelykings vir ATP-sintase?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek het gelees dat elke 120 grade rotasie van die F1-kompleks van ATP-sintase verdeel kan word in 'n 30 grade rotasie en 'n 90 grade rotasie. Tussen hierdie twee is verblyftye, die een voor die 90 grade rotasie is die ATP-bindende verblyftyd genoem en die een daarna is die tussentydse verblyftyd genoem en dat albei hierdie eksponensieel val. Ek kan egter nie 'n afleiding vind van die waarskynlikheidsdigtheidsfunksie van hierdie verblyftye, of die presiese vorm daarvan nie. As iemand so 'n afleiding ken of waar om dit te vind, sal dit baie waardeer word.


ATP -bindingstyd

Hier is 'n baie dodgy afleiding van die bindingstyd (let wel, ek is die OP). Hiervoor het ons $$ E+S rightarrow ES $$ Waar $ E $ die ensiem is en $ S $ die substraat is (behou hierdie algemene). Ons kan ons koersvergelyking skryf as: $$rate=k[E][S]$$ Maar ons kan die koers ook skryf as: $$rate=-frac{d[E]}{dt}$$ sodat : $$ frac {d [E]} {dt} =-k [E] [S] $$ Hier is die bietjie wat ek dink 'n bietjie dodelik is, ons gaan aanneem dat $ [S] $ byna konstant. Sodat: $$ [E] = Ae^{-k [S] t} $$ Ons kan $ n = [E] V $ neem om die aantal ensieme weer te gee, waar $ V $ die volume is, en dan laat $ n_0 = VA = konstant $: $$ n = n_0e^{-k [S] t} $$ Die waarskynlikheid om binne die tyd $ t $ te wees, word dan gegee deur: $$ F (t) = 1-e^ {-k [S] t} $$ Dit is ons kommutatiewe verspreidingsfunksie. Deur dit te onderskei, gee ons die waarskynlikheidsdigtheidsfunksie: $$ f (t) = k [S] e^{-k [s] t} $$

Tussentydse verblyftyd

Die tussentydse tydsduur (ook bekend as die katalitiese woon tyd) behels twee stappe [7]: 1. Die splitsing van die ensiem gebonde ATP. 2. Die vrystelling van die gehidroliseerde produkte.

Elkeen gaan die verspreiding volg (analoog aan bogenoemde) van:

$$ p_i (t) = k_i e^{-k_i t_i} $$ Vir onderskeidelik $ i = 1,2 $. Die gesamentlike waarskynlikheidsverdeling word gevind deur die konvolusie van hierdie twee [8]: $$ p_T (t) = int^{ tau} _0 p_1 (t) p_2 ( tau-t) dt $$ Wat gee: $$ p_T (t) = frac {k_1 k_2} {k_1-k_2} (e^{-k_2 tau} -e^{-k_1 tau}) $$

Redigeer

Alhoewel hierdie metode van deterministiese vergelykings begin (wat eintlik nie regtig saak maak nie), is dit eenvoudig en eenvoudig. Die tipe reaksie word 'n pseudo-1ste orde reaksie (of 2de orde klas 2) genoem, wat my benadering vir $ [S] $ konstant verklaar. Sien [9] en [10]

Bronne vir meer inligting

  1. https://youtu.be/X_YXTWU2maY?list=PLbKSbFnKYVY3j6ubaW1zgTXj5C4443v8s
  2. http://www.nature.com/articles/srep08773
  3. http://www.ks.uiuc.edu/Research/atp_hydrolysis/
  4. http://www.pnas.org/content/85/17/6314.full.pdf
  5. https://books.google.co.uk/books?id=uIxwICNmLKEC&pg=PA199&lpg=PA199&dq=catalytic+dwell+time+distribution+%5Batp%5D&source=bl&ots=u8oBcVNCDc&sig=PKvdVAwT0WxdqTuVwMxhU3RfSwM&hl=en&sa=X&ved=0CCAQ6AEwADgKahUKEwiGhKDalufHAhXkadsKHc54ADs#v=onepage&q= katalitiese%20dwell%20time%20distribution%20%5Batp%5D&f=false
  6. http://crystal.harvard.edu/PDFs/floyd_biophysj.2010.pdf
  7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16258036
  8. http://crystal.harvard.edu/PDFs/floyd_biophysj.2010.pdf
  9. http://glutxi.umassmed.edu/grad/GradKinetics.pdf
  10. http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Kinetics/Reaction_Rates/Second-Order_Reactions/Pseudo-1st-order_reactions

Ontleding van die balkpatroon -tyd vir 'n uiteenlopende skikking van vlak frekwensies

Hui Chen, Skool vir Inligting en Kommunikasie Ingenieurswese, Universiteit van Elektroniese Wetenskap en Tegnologie van China, No.2006, Xiyuan Ave, West Hi-Tech Zone, 611731, Chengdu, Sichuan, PR China.

Skool vir Inligting en Kommunikasie Ingenieurswese, Universiteit van Elektroniese Wetenskap en Tegnologie van China, Chengdu, Sichuan, China

Skool vir Inligting en Kommunikasie Ingenieurswese, Universiteit van Elektroniese Wetenskap en Tegnologie van China, Chengdu, Sichuan, China

Skool vir Inligting en Kommunikasie Ingenieurswese, Universiteit van Elektroniese Wetenskap en Tegnologie van China, Chengdu, Sichuan, China

Presisie meting radar stelsel tegnologie sleutel laboratorium van die provinsie Sichuan, Guangyuan, Sichuan, China

Hui Chen, Skool vir Inligting en Kommunikasie Ingenieurswese, Universiteit van Elektroniese Wetenskap en Tegnologie van China, No.2006, Xiyuan Ave, West Hi-Tech Zone, 611731, Chengdu, Sichuan, PR China.

Skool vir Inligting en Kommunikasie Ingenieurswese, Universiteit van Elektroniese Wetenskap en Tegnologie van China, Chengdu, Sichuan, China

Skool vir Inligting- en Kommunikasie-ingenieurswese, Universiteit van Elektroniese Wetenskap en Tegnologie van China, Chengdu, Sichuan, China


Verblyftydvergelykings vir ATP-sitase? - Biologie

Die tyd wat 'n interaksionele Brown -molekule in 'n begrensde mikro -domein spandeer, het baie toepassings in sellulêre biologie, omdat die aantal perke 'n kwantitatiewe sein is wat 'n kaskade van chemiese reaksies kan begin en dus fisiologiese gevolge kan hê. In die huidige artikel stel ons voor om die gemiddelde tyd wat 'n Browniaanse molekule in 'n mikrodomein $ Omega $ spandeer, te skat wat klein gaatjies op die grens bevat en agonistiese molekules wat daarin geleë is. Ons het gevind dat die gemiddelde tyd afhang van verskeie parameters, soos die terugwaartse bindingsnelheid (met die agonistmolekules), die gemiddelde ontsnappingstyd uit die mikro -domein en die gemiddelde tyd dat 'n molekuul die bindingsplekke bereik (voorwaartse bindingsnelheid). Boonop skat ons die gemiddelde en die variansie van die aantal perke wat 'n molekule maak voordat dit $ Omega $ verlaat. Hierdie skattings maak staat op 'n grenslaaganalise van 'n voorwaardelike gemiddelde eerste gangtyd, oplossing van 'n enkelvoudige gedeeltelike differensiaalvergelyking. In die besonder pas ons die huidige resultate toe om 'n skatting te kry van die gemiddelde tyd wat (Brown tyd) deur 'n Brown -reseptor binne 'n sinaptiese domein spandeer word, wanneer dit vrylik beweeg deur laterale diffusie op die oppervlak van 'n neuron en plaaslik interaksie het met steiermolekules.


Barrangou, R. et al. CRISPR bied verworwe weerstand teen virusse in prokariote. Wetenskap 315, 1709–1712 (2007).

Yosef, I., Goren, M. G. & Qimron, U. Proteïene en DNA -elemente wat noodsaaklik is vir die CRISPR -aanpassingsproses in Escherichia coli. Nukleïensure Res. 40, 5569–5576 (2012).

Nuñez, J.K. et al. Cas1 – Cas2 komplekse vorming bemiddel afstandsverkryging tydens CRISPR – Cas adaptiewe immuniteit. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 21, 528–534 (2014).

Nuñez, J. K., Lee, A. S., Engelman, A. & Doudna, J. A. Integrase-gemedieerde spacer-verkryging tydens CRISPR-Cas adaptiewe immuniteit. Natuur 519, 193–198 (2015).

Makarova, KS, Grishin, NV, Shabalina, SA, Wolf, YI & amp Koonin, EV 'n Vermoedelike RNA-interferensie-gebaseerde immuunstelsel in prokariote: berekeningsanalise van die voorspelde ensiematiese masjinerie, funksionele analogieë met eukaryotiese RNAi en hipotetiese werkingsmeganismes . Biol. Direkte 1, 7 (2006).

Bolotin, A., Quinquis, B., Sorokin, A. & Ehrlich, S. D. Geklusterde kort tussenposes van herhaalde palindroom (CRISPR's) het afstandhouers van ekstrachromosomale oorsprong. Mikrobiologie 151, 2551–2561 (2005).

Mojica, F. J., García-Martínez, J. & amp; Soria, E. Tussenvolgende reekse van gereeld gespasieerde prokariotiese herhalings kom van vreemde genetiese elemente. J. Mol. Evol. 60, 174–182 (2005).

Pourcel, C., Salvignol, G. & Vergnaud, G. CRISPR elemente in Yersinia pestis nuwe herhalings verkry deur voorkeuropname van bakteriofaag -DNA, en bied bykomende hulpmiddels vir evolusionêre studies. Mikrobiologie 151, 653–663 (2005).

Marraffini, L. A. & Sontheimer, E. J. CRISPR interferensie beperk horisontale geenoordrag in stafilokokke deur DNA te teiken. Wetenskap 322, 1843–1845 (2008).

Amitai, G. & Sorek, R. CRISPR-Cas aanpassing: insigte in die meganisme van aksie. Nat. Ds Microbiol. 14, 67–76 (2016).

Jackson, S.A. et al. CRISPR-Cas: Aanpas by verandering. Wetenskap 356, eaal5056 (2017).

McGinn, J. & Marraffini, L. A. Molekulêre meganismes van CRISPR -Cas spacer -verkryging. Nat. Ds Microbiol. 17, 7–12 (2019).

Wiedenheft, B. et al. Strukturele basis vir DNase-aktiwiteit van 'n bewaarde proteïen wat betrokke is by CRISPR-gemedieerde genoomverdediging. Struktuur 17, 904–912 (2009).

Wang, J. et al. Strukturele en meganistiese basis vir die verkryging van PAM-afhanklike afstandhouers in CRISPR-Cas-stelsels. Sel 163, 840–853 (2015).

Nuñez, J. K., Harrington, L. B., Kranzusch, P. J., Engelman, A. N. & Doudna, J. A. Buitelandse DNA-vaslegging tydens CRISPR-Cas-aanpasbare immuniteit. Natuur 527, 535–538 (2015).

Díez-Villaseñor, C., Guzmán, N. M., Almendros, C., García-Martínez, J. & Mojica, F. J. CRISPR-spacer-integrasieverslaggewerplasmiede openbaar duidelike werklike verkrygingspesifisiteite onder CRISPR-Cas IE-variante van Escherichia coli. RNA Biol. 10, 792–802 (2013).

Goren, M. G. et al. Herhaal groottebepaling deur twee molekulêre liniale in die tipe IE CRISPR -skikking. Selverslae. 16, 2811–2818 (2016).

Nuñez, J. K., Bai, L., Harrington, L. B., Hinder, T. L. & Doudna, J. A. CRISPR immunologiese geheue vereis 'n gasheerfaktor vir spesifisiteit. Mol. Sel 62, 824–833 (2016).

Wright, A. V. & Doudna, J. A. Beskerming van genoomintegriteit tydens CRISPR-immuunaanpassing. Nat. Struktuur. Mol. Biol. 23, 876−883 (2016).

Heler, R. et al. Cas9 spesifiseer funksionele virale teikens tydens CRISPR -Cas -aanpassing. Natuur 519, 199–202 (2015).

Wei, Y., Terns, R. M. & Terns, M. P. Cas9 funksie en gasheer genoom monsterneming in tipe II-A CRISPR-Cas aanpassing. Gene Dev. 29, 356–361 (2015).

Ka, D. et al. Kristalstruktuur van Streptococcus pyogenes Cas1 en die interaksie daarvan met Csn2 in die tipe II CRISPR-Cas-stelsel. Struktuur 24, 70–79 (2016).

Wilkinson, M. et al. Struktuur van die DNA-gebonde afstandhouer-kompleks van 'n tipe II CRISPR-Cas-stelsel. Mol. Sel 75, 90–101.e5 (2019).

Wright, A. V. et al. Strukture van die CRISPR genoom integrasie kompleks. Wetenskap 357, 1113–1118 (2017).

Xiao, Y., Ng, S., Nam, K. H. & Ke, A. Hoe tipe II CRISPR–Cas immuniteit vestig deur Cas1–Cas2-gemedieerde spasieerintegrasie. Natuur 550, 137–141 (2017).

Kunne, T. et al. Cas3-afgeleide teiken-DNA-afbraakfragmente brandstof vir CRISPR-aanpassing. Mol. Sel 63, 852–864 (2016).

Kieper, S. N. et al. Cas4 vergemaklik PAM-versoenbare afstandhouer tydens CRISPR-aanpassing. Sel Rep. 22, 3377–3384 (2018).

Lee, H., Zhou, Y., Taylor, D. W. & amp Sashital, D. G. Cas4-afhanklike prespacer-verwerking verseker hoëgetrouheidsprogrammering van CRISPR-skikkings. Mol. Sel 70, 48–59.e5 (2018).

Shiimori, M., Garrett, S. C., Graveley, B. R. & Terns, M. P. Cas4-nukleases definieer die PAM, lengte en oriëntasie van DNA-fragmente wat by CRISPR-lokusse geïntegreer is. Mol. Sel 70, 814–824.e6 (2018).

Drabavicius, G. et al. DnaQ-eksonuklease-agtige domein van Cas2 bevorder spacer-integrasie in 'n tipe I-E CRISPR-Cas-stelsel. EMBO Rep. 19, e45543 (2018).

Rollie, C., Schneider, S., Brinkmann, A. S., Bolt, E. L. & amp; White, M. F. Intrinsieke volgorde -spesifisiteit van die Cas1 -integrase lei die verkryging van nuwe spacer. Elife 4, e08716 (2015).

Shipman, S. L., Nivala, J., Macklis, J. D. & amp Church, G. M. Molekulêre opnames deur gerigte CRISPR spacer -verkryging. Wetenskap 353, aaf1175 (2016).

Shipman, S. L., Nivala, J., Macklis, J. D. & amp, Church, G. M. CRISPR - Cas kodering van 'n digitale film in die genome van 'n populasie lewende bakterieë. Natuur 547, 345–349 (2017).

Mojica, F. J., Diez-Villaseñor, C., García-Martínez, J. & Almendros, C. Kort motiefreekse bepaal die teikens van die prokariotiese CRISPR-verdedigingstelsel. Mikrobiologie 155, 733–740 (2009).

Marraffini, L. A. & amp; Sontheimer, E. J. Self teenoor nie-selfdiskriminasie tydens CRISPR RNA-gerigte immuniteit. Natuur 463, 568–571 (2010).

Zhang, J., Kasciukovic, T. & White, M. F. Die CRISPR-geassosieerde proteïen Cas4 is 'n 5′ tot 3′ DNA-eksonuklease met 'n yster-swaelgroepering. PLOS EEN 7, e47232 (2012).

Shmakov, S. et al. Deurlopende generasie van teenoorgestelde georiënteerde afstandhouers tydens CRISPR -aanpassing. Nukleïensure Res. 42, 5907–5916 (2014).

Fossum, S., Crooke, E. & amp; Skarstad, K. Organisasie van susteroorsprong en replisome tydens multivork -DNA -replikasie in Escherichia coli. EMBO J. 26, 4514–4522 (2007).

Adebali, O., Chiou, Y. Y., Hu, J., Sancar, A. & Selby, C. P. Genoomwye transkripsie-gekoppelde herstel in Escherichia coli word bemiddel deur die Mfd translocase. Proc. Natl Acad. Wetenskaplike. VSA 114, E2116 – E2125 (2017).

Park, J. S., Marr, M. T. & Roberts, J. W. E coli transkripsie herstel koppeling faktor (Mfd proteïen) red gearresteerde komplekse deur voorwaartse translokasie te bevorder. Sel 109, 757–767 (2002).

Lee, H., Dhingra, Y. & Sashital, D. G. Die Cas4-Cas1-Cas2-kompleks bemiddel presiese prespacer-verwerking tydens CRISPR-aanpassing. Elife 8, e44248 (2019).

Dillard, K.E. et al. Montering en translokasie van 'n CRISPR-Cas-voorbereide verkrygingskompleks. Sel 175, 934–946.e15 (2018).

Redding, S. et al. Toesig en verwerking van vreemde DNA deur die Escherichia coli CRISPR-Cas-stelsel. Sel 163, 854–865 (2015).

Silas, S. et al. Direkte verkryging van CRISPR -afstandhouer van RNA deur 'n natuurlike omgekeerde transkriptase -Cas1 -fusieproteïen. Wetenskap 351, aad4234 (2016).

Silas, S. et al. Oor die oorsprong van omgekeerde transkriptase-gebruikende CRISPR-Cas-stelsels en hul hiperdiverse, raaiselagtige spacer-repertoires. Mbio 8, e00897–17 (2017).

González-Delgado, A., Mestre, M. R., Martínez-Abarca, F. en Toro, N. Vibrio vulnificus. Nukleïensure Res. 47, 10202–10211 (2019).

Mohr, G. et al. 'N Omgekeerde transkriptase-Cas1-samesmeltingsproteïen bevat 'n Cas6-domein wat nodig is vir beide CRISPR RNA-biogenese en die verkryging van RNA-spasieerder. Mol. Sel 72, 700–714.e8 (2018).

Modell, J. W., Jiang, W. & Marraffini, L. A. CRISPR-Cas-stelsels ontgin virale DNA-inspuiting om aanpasbare immuniteit te vestig en te handhaaf. Natuur 544, 101–104 (2017).

Kim, S., Loeff, L., Colombo, S., Jergic, S., Brouns, S. J. J. & amp; Joo, C. Selektiewe laai en verwerking van prespacers vir presiese CRISPR -aanpassing. Natuur 579, 141–145 (2020).

Joo, C. & Ha, T. Etiketteer proteïene vir enkelmolekule FRET. Cold Spring Harb. Protok. https://doi.org/10.1101/pdb.prot071035 (2012).

Roy, R., Hohng, S. & amp, Ha, T. 'n Praktiese gids vir enkelmolekule FRET. Nat. Metodes 5, 507–516 (2008).

Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. & amp; Wiggins, C. H. Leertempo's en state uit biofisiese tydreekse: 'n Bayesiaanse benadering tot modelkeuse en enkelmolekule FRET-data. Biofise. J. 97, 3196–3205 (2009).

Mairhofer, J., Wittwer, A., Cserjan-Puschmann, M. & Striedner, G. Voorkoming van T7 RNA-polimerase-deurleestranskripsie - 'n sintetiese terminasiesein wat bioprosesstabiliteit kan verbeter. ACS Synth. Biol. 4, 265–273 (2015).

Chen, Y.J. et al. Karakterisering van 582 natuurlike en sintetiese terminators en kwantifisering van hul ontwerpbeperkings. Nat. Metodes 10, 659–664 (2013).

Jiang, Y. et al. Redigering van meerjarige in die Escherichia coli genoom via die CRISPR-Cas9-stelsel. Appl. Omgewing. Mikrobiol. 81, 2506–2514 (2015).


Draai en subeenheid rotasie in enkele FOF1-ATP sintase

FOF1-ATP-sintases is alomteenwoordige proton- of ioon-aangedrewe membraanensieme wat ATP bied vir alle soorte sellulêre prosesse. Die meganochemie van katalise word aangedryf deur twee roterende nanomotore wat binne die ensiem gekoppel is. Hul verskillende trapproottes is waargeneem deur enkelmolekule-mikroskopie, insluitend videomikroskopie van wisselende nanokrale wat aan enkele ensieme geheg is en enkele molekule Förster resonansie-energie-oordrag. Hier hersien ons onlangse ontwikkelings van benaderings om die stapgrootte van subeenheidrotasie en die verbygaande elastiese energiebergingsmeganisme in enkel F te monitorOF1-ATP sintases.

1. Inleiding

Adenosientrifosfaat (ATP) is die universele energiegeldeenheid van die sel. Wanneer dit gehidroliseer word tot adenosien difosfaat (ADP) en anorganiese fosfaat (Pek), sy biochemiese standaard vrye energie ΔG 0 ’(ATP) van −30 kJ mol −1 [1–3] kan vir 'n verskeidenheid biochemiese reaksies gebruik word. Onder fisiologiese toestande is die vrye energie van ATP -hidrolise egter selfs hoër, ongeveer −50 tot −60 kJ mol −1 [4]. Aangesien die hoeveelheid ATP beperk is - byvoorbeeld ons menslike liggaam bevat ongeveer 50 g - moet dit voortdurend herwin word aangesien ons 1000 keer meer ATP verbruik as wat ons het [5,6]. Sowat 4,5 miljard jaar gelede het 'n klas ensieme genaamd ATP -sintases ontwikkel om ATP uit ADP en P te herwinek. Afhangende van die strukturele eienskappe van subeenhede en die primêre fisiologiese funksie in verskillende selle of sellulêre kompartemente, word drie hooftipes ensieme gediskrimineer [7,8]. FOF1-ATP -sintases word aangetref in die thylakoid membraan van chloroplaste, in die binneste mitochondriale membraan en in die bakteriële plasmamembraan. Hul funksie is die sintese van ATP. Daarenteen het VOV1-ATPases is ATP-aangedrewe protonpompe [9,10]. Archaeal A.OA1-ATP-sinteses is ATP-produserende ensieme met strukture soortgelyk aan dié van VOV1-ATPases.

ATP sintese in FOF1-ATP-sinteses word aangedryf deur 'n elektrochemiese potensiaalverskil van protone (of Na + in sommige selle), oor die onderskeie membrane [11]. Ongeveer 50 jaar gelede is die belangrikste meganisme van die ATP -sintase deur Peter Mitchell gepostuleer in sy chemiosmotiese teorie in 1961 [12]. Hy het beweer dat ATP nie gesintetiseer word deur 'n gefosforileerde intermediêre in mitochondria nie, maar deur 'n ensiem geïntegreer in die binneste mitochondriale membraan, deur die verskil in protonkonsentrasies (ΔpH) in die twee kompartemente plus die elektriese potensiaal (Δψ) oor die skeidingsmembraan [12]. Beide komponente bestaan ​​uit die proton-motorkrag, PMF. Die ΔpH word gegenereer tydens fotosintese in chloroplaste, of tydens aërobiese fosforilering in mitochondria of bakterieë. Alhoewel dit meer as 'n dekade geneem het voordat die chemiosmotiese teorie algemeen aanvaar is, is hierdie meganisme nou deel van elke biochemiese handboek. Die manier waarop enkele protone die katalitiese reaksiesiklus binne die ensiem dryf, moes egter nog op atoomvlak ontrafel word.

2. Die komponente van die twee roterende motors van FOF1-ATP sintase

Vandag is 'n magdom strukturele inligting oor die ensiem beskikbaar. FOF1-ATP sintase bestaan ​​uit twee domeine. In die bakteriese ensiem, subeenhede α3β3γδɛ bestaan ​​uit die F1 domein (ons sal die Escherichia coli nomenklatuur in die volgende) terwyl subeenhede ab2cn vorm die membraan-ingebedde FO domein. Die aantal c subeenhede wissel tussen spesies en blyk te wees afhanklik van die beskikbare proton (of Na +) dryfkrag. Die kleinste aantal c subeenhede is agt vir die mitochondriale ensiem van beeshart [13], en die grootste wat tot dusver bekend is, is 15 in ensieme van sianobakterieë [14]. Die bakteriese ensiem van E coli het 10 c subeenhede [15].

Die eerste baanbrekende kristalstruktuur van die F1 porsie uit mitochondria van die beeshart is in 1994 deur John Walker en medewerkers beskryf [16]. Die hoofkenmerke was die afwisselende rangskikking van α3β3 subeenhede, wat 'n seskantige struktuur gevorm het, en 'n sentrale steel gevorm deur subeenheid γ. Die katalitiese nukleotiedbindingsplekke was hoofsaaklik geleë op die β subeenhede, by die koppelvlak met α. Subeenhede met die naam βTP en βDP bevat AMP-PNP, onderskeidelik 'n nie-hidroliseerbare ATP-analoog, of ADP, terwyl die derde β subeenheid (βE) leeg was. Dit het gelyk asof die β subeenhede hul konformasie verander het, afhangende van die gebonde nukleotied. Drie addisionele nukleotiedbindingsplekke was by die ander koppelvlakke van αβ geleë. Hulle was egter nie-katalities, en het almal AMP-PNP bevat. Gevolglik is die kristalstruktuur geïnterpreteer as 'n stilbeeld van die aktiewe ensiem. Dit is later getoon dat dit soos die katalitiese woonplek gelyk het (sien hieronder) [17,18].

'N Ander kenmerk van subeenheid β was die aminosuurvolgorde DELSEED, wat blykbaar 'n hefboom gevorm het wat kan dien om die gepaardgaande nukleotiedbindingsplek oop te maak en toe te maak. Dit het gelyk asof dele van subeenheid γ met hierdie hefboom kan wissel en daardeur die konformasietoestand van elke katalitiese bindingsplek kan definieer, omdat γ sy oriëntasie opeenvolgend verander ten opsigte van die drie β -subeenhede in die aktiewe ensiem. Boonop het subeenheid γ bestaan ​​uit 'n bolvormige domein wat saam met ε die membraan-ingebedde FO gedeelte, en twee N- en C-terminale α-helikse wat 'n opgerolde spoel gevorm het en in die sentrale holte van die α uitgebrei het3β3 seshoek.

Onlangs het die eerste F1 struktuur van die E coli ensiem gepubliseer [19]. Met 'n hoë algehele ooreenkoms met die mitochondriale F1 strukture, is dit bevestig dat die globulêre domein van γ aan die membraankant van F geleë is1 en waarskynlik interaksie met die c subeenhede van FO (wat nie in hierdie struktuur voorkom nie). Subeenheid ε was aan γ geheg en is dus ook deel van die sentrale steel van E coli F1. Subeenheid δ was nie in hierdie struktuur teenwoordig nie, maar is aan die bokant van die ensiem geleë.

In die F.O gedeelte, 'n ring van c subeenhede is ingebed in die membraan. Die ring is in wisselwerking met subeenhede γ en ε van F1 [20,21] en met subeenhede a [22,23] en b2 van F.O [24,25]. Subeenheid a vorm die twee proton (of Na + in sommige organismes) wat halfkanale gelei wat aan weerskante van die membraan eindig. Die dimeriese subeenhede b2 vorm 'n regshandige opgerolde spoel met 'n klein oorblyfsel-afset [26,27] wat die hele proteïen van die membraan tot die bokant van die α omsluit3β3 seshoek. Die b subeenhede word beskou as die eksentrieke steel wat styf aan F gebind is1 [28,29]. Hierdie perifere verbinding van ab2 aan F.1 gekombineer met die drie moontlike oriëntasies van γ binne F1 lei tot 'n asimmetriese struktuur van die ensiem, met 'n oriëntasie van die sentrale as wat stogasties is ten opsigte van die perifere b2 subeenhede. Die strukturele model van E coli FOF1-ATP -sintase word in figuur 1 getoona. Homologiemodellering gebaseer op die mitochondriale ensiemstrukture en aannames oor lokalisering van subeenhede gebaseer op kruisverbindingsdata en enkel-molekule Förster resonansie energie-oordrag (FRET) triangulasie is gebruik.

Figuur 1. (a) Strukturele model van E coli FOF1-ATP sintase met een α (ligblou) en een β (donkerblou) subeenheid verwyder om subeenheid γ (rooi) in die middel van die α bloot te stel3β3-pseudo -seshoek. Saam met ɛ (pienk) en δ bo -op (donkergroen), vorm hulle die F1 porsie. Die membraan-ingebedde FO gedeelte bestaan ​​uit 10 c subeenhede (geel/oranje), wat 'n ringstruktuur binne die membraan vorm. Subeenheid a (liggroen) en twee b subeenhede (groen) vorm 'n eksentrieke steel om albei gedeeltes bymekaar te hou. Subeenhede γ, ε en die c10-ring bestaan ​​uit die rotor van FOF1 (rooierige kleure), wat met die kloksgewys draai (as dit vanuit die membraan gesien word) tydens ATP -sintese ten opsigte van die stator subeenhede α3β3δab2 (blou/groen kleure). ATP-sintese in β word aangedryf deur proton (of Na + ) vloei deur FO as gevolg van 'n elektrochemiese potensiaalverskil oor die membraan. Hierdie homologiemodel van FOF1 is 'n samestelling van verskeie gedeeltelike strukture (PDB-kodes 1BMF [16], 2CK3 [30], 1H8E [31] en 1YCE [32] in die Protein Data Bank, http://www.pdb.org) en is geteken met VMD v. 1.9.1 [33]. Subeenhede a, b2 en δ is ongeveer in die korrekte grootte gemodelleer en met die hand aangeheg met behulp van kruisverbindingsdata. (b) Die opstelling van die rotasiebepaling met 'n magnetiese kraal wat aan die F geheg is1 porsie. F13β3γ) word aan 'n dekglas geheg via histidien (His)-merkers in elke β-subeenheid. Die streptavidien-bedekte magnetiese kraal word gekoppel aan 'n sisteïen in subeenheid γ via biotien. Die kraal word gedoteer met fluorescerende gebiotinyleerde kwantumpunte om ATP-gedrewe rotasie van die γ-kraalkompleks te visualiseer. (c) Eindpuntverspreiding van 'n roterende aktienfilament (1 µm) gekoppel aan die c10-ring van E coli FOF1 in die rotasie -toets wat skynbare 120 ° -staprotasie toon tydens ATP -hidrolise by hoë [ATP] in die teenwoordigheid van skoonmaakmiddel (aangepas uit [34]). (d) Woon tye van trappe rotasie van E coli FOF1 in die teenwoordigheid van (i) 5 mM of (ii) 0,1 mM ATP. Die histogramme toon die gemiddelde wonings van die stapposisies van een ensiem na onderskeidelik 200 of 120 rotasies.

Die vraag bly steeds hoe proton (of Na + ) translokasie by 'n afgeleë deel in FO word gekoppel aan die sintese van ATP in die drie nukleotiedbindingsplekke in die β subeenhede van F1. 'N Konsep vir ATP -sintese is eers in 1981 deur Paul Boyer voorgestel voordat gedetailleerde strukturele inligting beskikbaar was [35,36]. Volgens sy 'bindingsveranderingsmeganisme' bind twee van die drie nukleotiedbindingsplekke ADP en Pek of ATP genereer, en hierdie reaksies word gesinchroniseer deur 'n roterende, sentrale, asimmetriese γ subeenheid. Proton-translokasie deur FO is die dryfkrag vir γ-rotasie. In hierdie konsep, FOF1-ATP -sintase bestaan ​​uit 'n dubbelmotor wat gevorm word deur die rotasie c-ring in FO en γε in F1. Die rotor word gestabiliseer deur die stator subeenhede ab2 in FO en α3β3δ in F1. In figuur 1a, die roterende subeenhede γ, ε en c word onderskeidelik in rooi, pienk en oranje uitgebeeld.

Sedert die eerste kristalstruktuur gepubliseer is wat die roterende meganisme van katalise ondersteun, het baie navorsingsgroepe probeer om die molekulêre meganismes van hierdie motoriese ensiem te openbaar, deur 'n verskeidenheid biochemiese en spektroskopiese tegnieke toe te pas om die funksie daarvan te bestudeer [37-39]. Die asimmetriese struktuur van die holoënsiem het egter die resultate beperk as gevolg van ensemblegemiddeld. FOF1-ATP sintase is 'n relatief robuuste ensiem wat maklik gemanipuleer kan word, wat dit geskik maak vir enkel-molekule mikroskopie (wat sedert 1989 ontwikkel het vanaf die eerste eksperimente met kleurstowwe in organiese kristalle by vloeibare helium temperatuur [40]). Om sekwensiële konformasieveranderinge van enkele ensieme as tydsbane, dit wil sê een ensiem op 'n slag of in die ruimte geskei, waar te neem, vereis nie 'n sinchronisasie van asimmetriese proteïene vir 'n goed gedefinieerde beginposisie of konformasie in die katalitiese siklus nie. Hier sal ons 'n paar van die enkelmolekule eksperimente aanbied wat die rotasiemeganisme van die twee gekoppelde roterende nanomotors binne F ontrafel hetOF1-ATP sintase.

3. Direkte bewyse: ATP-gedrewe rotasiebepalings los 120 ° stappe en substappe in F op1

In 1997 het die baanbrekende eksperiment wat die rotasiemeganisme in die F ondubbelsinnig bewys het1 gedeelte van FOF1-ATP -sintase is deur Noji aangemeld et al. [41]. Hulle het die α aangeheg3β3γ subkompleks van TF1 (dit wil sê F1 van die termofiele Bacillus stam PS3) na 'n Ni-nitrilotriasynsuur-bedekte glasdekstrokie via histidien-merkers in elke β-subeenheid en het 'n fluoresserende aktienfilament gekoppel aan 'n sisteïen in die globulêre domein van subeenheid γ via 'n biotien-streptavidien-biotien-skakelaar. Hulle het videomikroskopie gebruik om enkele molekules van hierdie F op te teken1-aktien kompleks. Na toevoeging van ATP word hidrolise -reaksie in F1 veroorsaak 'n eenrigting rotasie van subeenheid γ wat intyds deur die aktien filament gevisualiseer is. Hierdie rotasietoets het gedien as 'n beginpunt vir 'n reeks enkelmolekule eksperimente wat uiteindelik gelei het tot die dekripsie van die opeenvolgende reaksiestappe in F1 tydens ATP-hidrolise. Behalwe fluorescerende aktienfilamente, dien goue nanobare [42], goue nanorods [43–45], polistireen [46] of magnetiese krale [47–50], of die fluorescentie -anisotropie van enkele fluorofore [51–53] as verslaggewers van rotasie van subeenhede. in F.1 sowel as in FOF1. In laasgenoemde was die verslaggewer verbonde aan die c-ring [53–55].

Die hoofopstelling vir die rotasie-toets word in figuur 1 getoonb met 'n fluoresserende kraal as die merker van rotasie. Die helder kraal kan met nanometer akkuraatheid in hoëspoed videomikroskopie opgespoor word. Tydens die rotasie van γ subeenheid het die middelpunt van die kraalposisie slegs 'n paar nanometers in die x- en y-rigting van die mikroskopiese beelde. Alternatiewelik, met behulp van 'n fluoresserende aktienfilament as rotasiemerk, is die ATP-aangedrewe rotasie ontleed deur die ente van die aktienfilament in elke raam van die opgeneemde video op te spoor. Die veranderende eindposisie is toegeskryf aan die vrye, bewegende einde van die filament, terwyl die ander punt wat op dieselfde posisie in elke beeld gebly het, geassosieer is met die streptavidien-verbinding met die roterende γ-subeenheid in F1 (of roterende c subeenhede in FOF1 van E coli in die teenwoordigheid van wasmiddel soos hier in figuur 1 getoonc vir gemak [34]). Die plot van alle veranderende eindposisies het gelei tot drie hoofstopposisies, wat deur mikrometers in die x- en y-rigting. Daarom was die verwante draaihoeke maklik onderskeibaar. Die tydsduur vir elke toegewysde area van stopposisies is bereken en by histogramme gevoeg (figuur 1d, c-ring rotasie data van E coli FOF1 in wasmiddel as voorbeeld [34]). Verblyftydverspreidings het van die ATP-konsentrasie ([ATP]) afgehang. By 'n hoë [ATP], dit wil sê in die millimolêre reeks, is die wagtye aansienlik beïnvloed deur die viskose vertraging van die aktienfilament wat die rotasie vertraag, maar vir 'n lae [ATP], minder as 1 µM, het die woon tye ooreenstem met die biochemiese omset in oplossing [56].

Daaropvolgende videomikroskopie -eksperimente het ten doel gehad om verskillende reaksiestappe van ATP -hidrolise te verbind, dit wil sê ATP -binding, ATP -hidrolise, ADP en Pek vrystelling, na hoekopgeloste substappe van γ subeenheid rotasie [42]. Klein 40 nm goue krale is gebruik om die wrywing op die ensiem tydens rotasie te verlaag, en 'n hoëspoedkamera met 8000 rame per sekonde was nodig om 'n drie-traps rotasie by 2 mM [ATP] waar te neem. Elke stop na 'n 120 ° rotasie stap het ooreengestem met 'n ATP hidrolise reaksie in een van die drie katalitiese plekke in die β subeenhede. Deur [ATP] tot 2 µM te verlaag, is elke roterende oorgang verder opgelos in twee substappe van 80 ° en 40 °. Substraat was beperk by lae [ATP] en ​​daarom is binding van 'n ATP -molekule vertraag. Die tydsduur van die woning voor die 80 ° rotasie-sub-stap was afhanklik van [ATP], wat aandui dat (i) die 80 ° sub-stap verband hou met die bindingsproses van 'n ATP-molekule aan 'n leë nukleotiedbindingsplek, en (ii ) die blyplek voor die 80°-substap is die 'ATP-wagtoestand' van die ensiem. Die verblyf voor die roterende 40°-substap was onafhanklik van [ATP] en ​​was geassosieer met die ATP-hidrolisereaksie en produkvrystelling. Daarom is dit die 'katalitiese woonplek' genoem.

Vervolgens is rotasie van subeenheid γ en die bindingsgebeurtenis van 'n fluoresserende ATP -afgeleide na subeenheid β gelyktydig gemonitor. In hierdie rotasie-toets word polistireen of magnetiese krale aan TF geheg1 gedien as die verslaggewers om die rotasie van γ deur helderveldmikroskopie te volg [57,58]. 'N Totaal van 10 persent van die ATP-molekules is fluorescerend gemerk met die sianienkleurstof Cy3 (Cy3-ATP). Deur totale interne refleksie-fluoressensiemikroskopie (TIRFM), is 'n verdwynende golf bo die dekstrook geskep om slegs Cy3-ATP-molekules wat aan TF gebind is, waar te neem1, maar nie die diffuse molekules in die grootmaat oplossing nie. Die polarisasie van die ontwykende golf is ossilleer met 'n frekwensie van 1 Hz. Daardeur is fluoressensie van gebonde Cy3-ATP in enige van die drie β subeenhede opgespoor deur middel van hoekopgeloste fluorescentie anisotropie beelding. Fluoresentasie en helderveldlig is deur 'n dichroïese spieël geskei en gelyktydig met 'n konvensionele videokamera opgeneem. By 0.6 µM [ATP + Cy3-ATP] het subeenheid γ in 120° stappe gevorder en 'n bindingsgebeurtenis van Cy3-ATP het onmiddellik 'n rotasie van die kraal met 120° geïnduseer. Hierdie Cy3-ATP molekule (of sy gehidroliseerde afgeleide Cy3-ADP) bly gebind ten minste vir 'n 240 ° rotasie van γ. Die nukleotiedbindingsplek in β bly toe leeg totdat binding van 'n ander ATP -molekule plaasgevind het. Hierdie resultate het uitgesluit dat elke β-subeenheid op sy eie optree, maar het bevestig dat al drie katalitiese terreine - tesame met subeenheid γ - ATP in 'n gesamentlike aksie hidroliseer. Wanneer slegs Cy3-ATP sonder ongemerkte ATP gebruik is, is die hidrolisereaksie vertraag (sien dokberekeninge en omsettempo's in [59]), en die 80° en 40° sub-stappe het sigbaar geword.

Van hierdie en daaropvolgende enkelmolekule-rotasie-eksperimente met oppervlak-gehegte F1 van die termofiele Bacillus stam PS3, die volgende reaksieskema vir ATP-hidrolise in die F1 motor na vore gekom [17,60,61]. As die ATP-wag by 'n rotasiehoek van subeenheid γ gedefinieer word as 0 °, veroorsaak ATP-binding aan die leë katalitiese kant 'n 80 ° rotasiebeweging van γ. Terselfdertyd stel die nukleotiedbindingsplek by +120° (d.i. in die voorwaartse rigting van γ-rotasie) ADP vry, terwyl die plek by -120° ATP van die vorige bindingsgebeurtenis bevat. Na die eerste sub-stap van 80 ° bereik die ensiem die katalitiese woning. ATP wat tydens die vorige stap gebind is, word in ADP en P gehidroliseerek. In 'n tweede reaksie veroorsaak die vrystelling van fosfaat die volgende sub-stap van 40 °. ADP word tydens die tweede sub-stap van 80 ° vrygestel van die kant wat voorheen by -120 ° was. Die rotasiebeweging van γ in die geskeide F1 motor is [ATP]-afhanklik en vind plaas in drie of ses onderskeie roterende stappe. Terwyl die rotasie van γ teen die kloksgewys teen die membraan gekyk word, is die opeenvolging van gebeure in die β subeenhede in die teenoorgestelde rigting, dit wil sê na binding van een ATP aan 'n leë plek in een β subeenheid, die ATP in die naburige β subeenheid in die kloksgewyse rigting sal tydens die volgende katalitiese verblyf gehidroliseer word.

Die meeste enkelmolekule-studies oor die meganisme van die F1-ATPase hierbo beskryf is uitgevoer met die α3β3γ subkompleks van TF1, hoofsaaklik deur aktienfilamente of krale aan subeenheid γ te heg. Die mesofiele E coli F1 ensiem, soos bestudeer deur die groep Masamitsu Futai met goue krale van 40–60 nm, het effens vinniger gedraai by soortgelyke [ATP] en ​​temperature. Hulle proteïenbereiding het ook die tweede roterende subeenheid ε bevat, maar nie die statiese subeenheid δ van F1 in die enkelmolekule-toets. By versadiging [ATP], 'n rotasiesnelheid van γ in hierdie enkele F1 molekules van 400 rps (of 1200 ATP s -1 onderskeidelik), is aangemeld [62,63]. Die enkelmolekule katalitiese woon tye was 0,2 ms, dit wil sê ongeveer 10 keer korter as verwag van die biochemiese ensemble metings van ATP hidrolise, en die oorgangstyd vir die 120 ° stappe was 0,6 ms [64]. So kan verskillende stogastiese onderbrekingsmeganismes (ADP -remming en ε -remming met afsonderlike wonings) die oorsake wees vir die oënskynlike bewyse dat ongeveer 90 persent van die F1 molekules in die ensemble metings word gerem. In vergelyking met TF1, die E coli ensiem het 'n korter katalitiese dwelm, maar 'n effens stadiger oorgang vir die 120 ° -stap [64–66]. Aan die ander kant het Wayne Frasch en kollegas die rotasie van 75 nm lange goue nanorods waargeneem aan γ van E coli F1 onder versadig [ATP] met 'n baie hoë tydelike resolusie van 2,5 µs. Hulle het katalitiese woontye van ongeveer 8 ms in enkele EF gevind1, vergelykbaar met hul grootmaat ATP -hidrolise -metings van 7,7 ms [43]. Omdat verskille in rotasiekoerse ook vir ATP-gedrewe gerapporteer is c-ringrotasie in FOF1 van E coli (sien hieronder), moet enige vergelyking van die rotasiesnelhede van 'n enkele molekule versigtig gedoen word, en die plekke van sistienemutasies vir merkeraanhegting, merkergroottes en vorms, ander mutasies, volledigheid van subeenhede in die ensiem, of die teenwoordigheid van skoonmaakmiddels of lipiede vir FOF1 onderskei moet word. Boonop moet die tydsoplossing van die eksperimentele benadering ooreenstem met die rotasiebesonderhede wat opgelos moet word.

4. Meganies aangedrewe ATP -sintese in enkele F1 met behulp van eksterne magnetiese krag

Die F.1 kompleks is slegs in staat om ATP -hidrolise te hê omdat dit nie F bevat nieO motor. Wanneer γ in F1 in die teenoorgestelde rigting gedraai is deur 'n eksterne magnetiese krag wat inwerk op 'n magnetiese kraal wat aan γ geheg is, kan dit ook ATP sintetiseer, wat demonstreer dat meganiese energie in chemiese energie omskep kan word [47,48]. Die toegepaste eksterne magnetiese veld is gebruik om die ensiem in óf katalitiese rigting te dryf, dit wil sê om ATP -hidrolise of sintese af te dwing, of om die γ -subeenheid te stop by 'n gegewe rotasiehoek. In verseëlde pikoliter reaksiekamers was dit moontlik om die paar gesintetiseerde ATP-molekules op te spoor en te kwantifiseer deur die luciferien/luciferase luminescentiereaksies, of deur ATP-gedrewe rotasie te monitor na die vrystelling van die eksterne magnetiese krag, onderskeidelik.

5. Proton-gedrewe subeenheid rotasie kan gemonitor word deur enkel-molekule FRET

'N Ander eksperimentele benadering is ontwikkel om rotasiebewegings in die holoenziem F te monitorOF1-ATP-sintese tydens protongedrewe ATP-sintese.In die groep Gräber is enkelmolekule Förster resonansie-energie-oordrag (FRET) toegepas om die rotasie van die sentrale as in individuele E coli FOF1-ATP sintases. Twee fluorescerende kleurstowwe in die omgewing, tot 10 nm, kan energie van die een na die ander oordra deur die nie-stralende Förster-meganisme, mits die emissiespektrum van die skenkerfluorofoor oorvleuel met die absorpsiespektrum van die acceptor , en die oorgangsdipoolmomente van die kleurstowwe is nie ortogonaal op mekaar gerig nie [67]. Dan hang die resonansie-energie-oordragdoeltreffendheid af van die afstand tussen die twee kleurstowwe. Daarom kan FRET gebruik word as 'n molekulêre liniaal binne enkele proteïene vir kleurafstande tussen 3 en 8 nm. Börsch en kollegas gebruik twee fluorofore wat aan subeenheid γ of ε op die rotor en aan beide b subeenhede op die stator via geneties ingevoerde cysteines [68–72]. Spesifieke etikettering van die onderskeie cysteines is verkry deur afsonderlike etikettering van die F1 en F.O gedeeltes, en daaropvolgende hersamestelling in 'n volledig funksionele dubbel-gemerkte holoënsiem, wat in liposome hersaamgestel is. Hierdie proteoliposome het gemiddeld minder as een ensiem bevat en het ATP-hidrolise en sintesetempo's soortgelyk aan die nie-gemodifiseerde wildtipe ensieme van E coli.

Die meetbeginsel van konfokale enkelmolekule FRET met vrylik diffuse proteoliposome in oplossing word in figuur 2 getoona. Die kleurstof rodamien 110 (Rh110) op die rotorsubeenheid γ is deur 'n laser by 488 nm opgewonde en het as FRET -skenker opgetree, terwyl die tweede kleurstof sianien 5 (Cy5) op die stator subeenhede b2 gedien as die FRET -aanvaarder [73] (figuur 2b). Die fluoressensie van albei kleurstowwe is deur sensitiewe lawinefoto-diodes opgespoor en aangeteken met behulp van tydgekorreleerde elektroniese teltelektronika met 'n pikosekonde-tydresolusie. Sodra 'n proteoliposoom die konfokale eksitasie-/opsporingsvolume van femtolitergrootte betree het as gevolg van Brownse beweging, het die FRET-skenker Rh110 op FOF1 was herhaaldelik opgewonde en het in 'n sarsie fotone uitgestuur. Die fluoressensie-intensiteit het afgehang van die werklike posisie van die kleurstof binne die laserfokus, wat 'n benaderde driedimensionele Gaussiese intensiteitsverspreiding gehad het. Die gemiddelde transittyd vir die proteoliposome was ongeveer 30-50 ms, maar 'n paar proteoliposome kon tot 'n paar honderd millisekondes waargeneem word (figuur 2c, d). Om ATP -sintese aan te wakker, word die proteoliposome met 'n enkele ensiem aangevoer deur a ΔpH met behulp van buffermengsel in die teenwoordigheid van 'n elektriese potensiaalverskil wat ontstaan ​​deur 'n K + diffusiepotensiaal [11]. Vir rotasiemetings tydens ATP -hidrolise is 1 mM ATP by die buffer gevoeg in die teenwoordigheid van 2,5 mM Mg 2+. Die konsentrasie liposome wat slegs een gemerk F bevatOF1-ATP-sintase is aangepas na ongeveer 100 pM sodat op tydgemiddeld slegs een ensiem in die fokus van die konfokale mikroskoop opgespoor is. In die teenwoordigheid van AMP-PNP het elke ensiem een ​​van drie verskillende FRET-doeltreffendheid getoon wat ooreenstem met drie moontlike oriëntasies van die γ-subeenheid binne die F1 porsie. Vanuit die FRET-doeltreffendheid is die kleurstof-tot-kleurstof afstande van ongeveer 4.5, 6.5 en 8 nm vir elke γ subeenheid oriëntasie bereken. Hierdie afstande stem ooreen met die model van FOF1 van E coli.

Figuur 2. (a) Monitor rotasie van subeenheid in 'n enkele gereconstitueerde FOF1-ATP -sintase deur konfokale FRET -mikroskopie. Die proteoliposoom deurkruis arbitrêr die konfokale opwekking/detectievolume as gevolg van Brownse beweging. (b) Posisies van FRET fluorofore in FOF1-ATP sintase. FRET skenker Rh110 (blou kol) op subeenheid ɛ van die rotor wat in swart getoon is, is van die sentrale rotasie -as geheg en sou na verwagting volgens die blou pyl tydens ATP -hidrolise beweeg. Rotasie was teenoorgestelde vir ATP -sintese (groen pyltjie). FRET-aanvaarder Cy5 (rooi kol) is aan die b subeenheid dimeer van die stator in grys getoon. (c) Photon burst of a FRET-label FOF1-ATP -sintase tydens ATP -hidrolise. Die onderste paneel toon fluorescentie -intensiteitbane van die FRET -skenker Rh110 (groen spoor. ekD) en aanvaarder Cy5 (rooi spoor, ekA). Die boonste paneel toon die ooreenstemmende nabyheidsfaktor P as 'n blou spoor, met P = ekA / (ekD + ekA). FRET doeltreffendheid vlakke is met die hand toegeken en genoem 'hoë FRET' H, 'medium FRET' M, en 'lae FRET' L. Die FRET volgorde was →H → M → L → H→ (aangepas vanaf [73]). (d) Photon burst of a FRET-label FOF1-ATP -sintase tydens ATP -sintese. Die onderste paneel toon fluorescentie intensiteit trajekte en die boonste panele toon die nabyheid faktor spoor. Die FRET-volgorde is omgekeer →L → M → H → L→ (aangepas vanaf [73]).

Tydens katalise is ook drie FRET -doeltreffendhede gevind. Hulle het egter vinnig en stapsgewys verander binne fotonuitbarstings van enkele ensieme. Hul volgorde was omgekeer, afhangende van die katalitiese toestande soos gesien in figure 2c vir ATP-hidrolise en 2d vir ATP sintese. Die gemiddelde rustyd vir die FRET -vlakke is onderskeidelik tussen 12 en 20 ms vir ATP -hidrolise, of tussen 17 en 50 ms vir ATP -sintese. Hierdie blyplekke het ooreengestem met 'n enkele ensiemomset van ongeveer 70 ATP s -1 vir ATP hidrolise en tot 50 ATP s -1 vir ATP sintese. Enkelmolekulesnelhede stem goed ooreen met die biochemiese ensemblesnelhede vir dieselfde ensiempreparate wat in liposome gekonstitueer is. Die vordering van die drie FRET -vlakke was dieselfde in ongeveer 80 persent van alle FRET -vlakke, maar het omgekeer vir die teenoorgestelde biochemiese toestande. Vir ATP -hidrolise en sintese was die drie FRET -vlakke soortgelyk, wat onafhanklik is van die draairigting. Dit het nie net bewys dat γ en ε inderdaad deel uitmaak van die rotor in die holoenziem F nieOF1-ATP sintase, maar ook dat die katalitiese gebeure tydens ATP sintese en ATP hidrolise in beginsel omkeerbaar is. In die teenwoordigheid van die nie-mededingende inhibeerder aurovertin B, kan verskille in die rotasiebeweging van γ tydens ATP-sintese en ATP-hidrolise ontrafel word, wat aandui dat inhibeerders nie net as kontroles vir biochemiese aktiwiteitsmetings dien nie, maar ook gebruik kan word om bykomende meganistiese inligting. Enkelmolekule FRET-metings kan onderskei tussen 'n algemene vertraging in rotasie tydens ATP-hidrolise en gedeeltelike rotasieblokkering tydens ATP-sintese [73].

In 'n daaropvolgende enkelmolekule FRET-eksperiment, die stapgrootte van die roterende c-ring in FOF1-ATP -sintase is opgelos [74]. Verbeterde groen fluoresserende proteïen (EGFP) is saamgesmelt met die stator subeenheid a in FO en dien as 'n FRET -skenker [75], terwyl die acceptor fluorofoor Alexa568 kovalent gebind was aan 'n cysteïen van een c subeenheid. Hersaamgestelde enkelensieme is aangedryf deur 'n proton-dryfkrag om ATP te sintetiseer. Dubbel-gemerkte, roterende ensieme is opgespoor deur polsende afwisselende laser-eksitasie met 'n geoptimaliseerde werksiklus [76,77]. Tot vyf verskillende FRET-vlakke is gediskrimineer. Die FRET-doeltreffendheidsveranderinge was egter kleiner en die verblyf tye korter as voorheen, soos verwag vir 'n 10-traps rotasiebeweging met dieselfde rotasiesnelheid vir die volle rotasie as die drie-stap motor in F1. Klein en groot FRET -veranderinge is handmatig in die datastel toegeken, maar die vordering van FRET -vlakke was nie altyd duidelik en unidirectioneel nie. Die tydresolusie van die enkel-molekule FRET eksperiment was beperk tot 1 ms as gevolg van 'n verminderde helderheid en fotofisiese eienskappe van die fluorofore, sodat 'n paar kort rusplekke gemis kon word. Gesimuleerde enkel-molekule FRET-tydbane is gegenereer deur 'n Monte Carlo-benadering om die ontrafeling van die c-ringstapgrootte. Simulasies van 'n 10-trappie c-ring met vyf verskillende FRET afstande vir ring simmetrie redes is vergelyk met a c-ring wat met drie 120°-trappe roteer. Daarna kan die eksperimentele FRET-resultate die beste pas by die neem van 'n 10-traps rotasie. So is die gevolgtrekking gekom dat die roterende c-ring van die ensiem verloop inderdaad in 36 ° -stappe tydens ATP -sintese. Dit kan egter nie uitgesluit word dat die enkelmolekule FRET-vlakverdeling ook 'n kombinasie van 80 ° + 40 ° substappe ondersteun, wat gerapporteer is vir die termofiele TF1 tydens ATP-hidrolise.

Die een-stap-na-die-ander rotasie van die c-ring is ondersteun vir die ATP-hidrolisemodus met behulp van nanorods [44] of nanokrale [78]. Mutasies in die proton-translokasie-pad deur subeenheid a of 'n groter viskose weerstand was nodig om die substappe in hierdie eksperimente op te los. Soos bespreek vir die geval van γ subeenheidrotasie in F1 hierbo, is dit belangrik om die enkelmolekule rotasiesnelheid en trapproottes met omsigtigheid te vergelyk. Die gebruik van geslote liposome in die FRET-eksperimente in teenstelling met oppervlak-ondersteunde lipied-tweelaag-kolle of lipied-nanodiscs sal ATP-aangedrewe subeenheidrotasie beïnvloed en vertraag as gevolg van die opbou van 'n teenwerkende protonkonsentrasieverskil deur die gekoppelde ensiem. Daarbenewens sal die aminosuurposisies vir sisteïenmutasies nie net die aanhegting van die fluorofore of ander merkers toelaat nie, maar kan dit ook die katalitiese tempo van die mutante ensieme verander. Nietemin, omdat daar 'n wanverhouding is tussen die 10-stap rotasie in FO en die drie-stap rotasie in F1, het hierdie resultate die model versterk van twee elasties gekoppelde nanomotore wat deur Junge en medewerkers [4,79–82] ontwikkel is.

5. Verskillende trapproottes van die twee gekoppelde motors vereis interne elastisiteit

In F.OF1-ATP -sintase, twee nanomotore werk teen mekaar. Afhangende van die proton -dryfkrag, die E coli ensieme in proteoliposome kan oorskakel van ATP-sintese na ATP-hidrolise [3]. Die chemiese potensiaal van ATP -sintese of hidrolise in F1 werk teen die elektrochemiese potensiaalverskil oor die membraan wat die motor in F aandryfO. Die twee motors loop met verskillende ratte. F1 is 'n driestapmotor, terwyl FO is 'n 10-stepper motor in E. coli (of 8–15 stepper, afhangende van die organisme). Die vraag ontstaan ​​hoe die energie oorgedra word tussen hierdie twee motors, en hoe die ensiem die energiehindernisse kan oorkom vir 'n stelsel waar twee motors met verskillende ratte styf gekoppel is. Daar is voorgestel dat die motors elasties gekoppel is [4,79-82]. In plaas van 'n rigiede stelsel, is sekere dele van hierdie ensiem elasties sag en kan dit energie tydelik stoor totdat dit nodig is vir die chemiese reaksie. Daardeur kan die ensiem met 'n hoë rotasiesnelheid en kinetiese doeltreffendheid werk.

In 'n reeks enkelmolekule-eksperimente het Sielaff en medewerkers hierdie elastiese elemente bepaal [49,50]. Hulle gebruik mutante van E coli F1 of FOF1 wat twee vervaardigde sisteïene bevat, een in die rotor (subeenhede γ of c) en die ander in die stator (subeenhede β, α of a) teen die voormalige sisteïen (figuur 3a). Die sistienpare, naamlik aI223C/cL72C (blou in figuur 3a), βD380C/γA87C (groen) en αE284C/γA276C (rooi), is oor die lengte van die rotorsteel geplaas om na die verskillende elastisiteite daarvan te soek. In die rotasiebepaling is die ensiem aan die glasoppervlak geheg via histidien-etikette in elke β-subeenheid, terwyl 'n kort fluorescerend gemerkte aktienfilament (ongeveer 0,5 µm) of 'n kwantumpunt (Q-dot) gedoteerde magnetiese kraal (1 µm) wat aan die ensiem aan die ander kant gekoppel is, as verslaggewer gedien het videomikroskopie. Die verslaggewers was verplig om óf die c-ring in FOF1, of na γ in F1onderskeidelik (figuur 3a,b).

Figuur 3. (a) Rotasietoets met E coli FOF1 aan 'n omslagglas vasgemaak via histidien (His)-merkers in subeenheid β, aangedryf deur ATP-hidrolise. 'N TMR-gemerkte fluoresserende aktienfilament word in elk met strep-tags gekoppel c subeenheid via 'n streptaktien -biotien skakel. Om die interne elastisiteit van die rotor te monitor, is drie mutante elk met twee opponerende sisteïene op die rotor en die stator gemanipuleer soos aangedui. Na oksidasie het hulle gedien om 'n disulfiedbrug te vorm en om die ensiem in 'n sekere posisie te laat staan. (b) 'N Q-dot gedoteerde magnetiese deeltjie in plaas van 'n aktienfilament is gebruik om die interne elastisiteit van die stator, dit wil sê subeenhede, te monitor b2. Die magnetiese deeltjie is bedek met streptavidien of streptaktien om dit aan te koppel b2, óf direk via twee sisteïene/biotiene in die membraan integrale deel van subeenhede b, of indirek aan die c-ring, dit is gekoppel aan subeenheid a via twee cysteines soos aangedui, onderskeidelik. (c) Voldoening van die ensiem-filamentkompleks vir die drie dubbelmutante wat in (a), bepaal deur die termiese fluktuasies van die verknoopte proteïen. Die histogramme was toegerus met Gaussians en die torsiestijfheid is afgelei van hul inverse breedte, wat lei tot 450, 59 en 47 pN · nm vir die blou, groen en rooi kromme, onderskeidelik (aangepas vanaf [50]). (d) Model van FOF1 wat in rooi die plek van die hoogste elastisiteit toon, naamlik die kontakplek van c-ring met γε. Die nakoming in pN · nm -eenhede word gegee vir verskillende domeine van die ensiem (figuur verskaf deur S. Engelbrecht en W. Junge).

Na toevoeging van ATP en onder verminderde toestande, het die subeenhede begin draai soos verwag. By oksidasie het die twee sistiene 'n disulfiedbrug gevorm en die ensiem het gestop om te draai. In hierdie toestand was slegs die termiese skommelinge van die ensiem-verslaggewerstelsel sigbaar. ’n Histogram van hierdie fluktuasies het Gaussiese verdelings getoon (figuur 3c). Die breedte σ van die Gaussiërs was omgekeerd eweredig aan die wringstyfheid κ (in pN·nm) deur σ = kBT/κ, waar kB is die Boltzmann-konstante, en T die absolute temperatuur. Die opgerolde spoelas van γ het 'n medium styfheid gehad met κ = 320 pN · nm. Die gedeelte met die kleinste torsiestijfheid was tussen die onderskeie terreine van wringkragopwekking in F geleë1 en F.O—Dit is op die koppelvlak van die bolvormige gedeelte van γ en die c-ring. Met 'n wringstyfheid van minder as 70 pN·nm, kan dit tot 14 kJ mol −1 elastiese energie stoor om die samewerking van die twee motors glad te maak wanneer hulle teen mekaar werk. In die onbeperkte ensiem was die voldoening selfs laer (ongeveer 35 pN·nm soos afgelei uit die dwelposisies van die ensiem), veroorsaak deur die buigsame skarnierbeweging van die hefboom in die β-subeenhede. Boonop onthul 'n molekulêre dinamika-simulasie van die vrye en die gekoppelde stelsel 'n treffende ooreenkoms met die eksperimentele data [83].

Aan die ander kant, is gevind dat die stator minstens 10 keer so styf is as die deel wat die rotor die meeste pas. Die elastisiteit van die wilde-tipe b2 dimer is vergelyk met gemuteerde b subeenhede wat óf verleng is met 11 aminosuurreste ('lank') óf gedestabiliseer is deur drie opeenvolgende residue te vervang met glisiene ('Gly3-mutant') [49]. In die rotasie-toets het 'n Q-dot gedoteerde magnetiese kraal gekoppel aan die stator as verslaggewer gedien om die beweging van F te monitorOF1 (figuur 3b). Aangesien die stator nie vanself gedraai het nie, is die beweging kunsmatig geïnduseer deur 'n eksterne roterende magneetveld toe te pas, wat die kraal vorentoe of agtertoe gedryf het. Twee werkswyses is getoets. (i) Toe die magnetiese kraal aan die membraan -integrale einde van die b2 dimeer deur 'n cysteine ​​-biotin -streptavidin -koppeling, is die dimeer om sy as gedraai. (ii) Die fisiologiese buigbeweging van b2 is bestudeer deur die magnetiese kraal aan die c-ring wat aan subeenheid gekruis is a. In alle gevalle was die nakoming ongeveer 500 pN · nm, behalwe vir die buiging van die Gly3-mutant. Hier was die voldoening drie keer laer in vergelyking met die wildtipe ensiem. Die ATP-afhanklike H + -pompaktiwiteit van die mutante is gehalveer in vergelyking met die wilde tipe FOF1-ATP sintase. Hierdie mutante met 'n gedestabiliseerde stator was nietemin aktief, omdat die nakoming daarvan drievoudig (dit wil sê nog 'n grootte groter as die rotorvoldoening) nie die stabiliteit van die stator ernstig beïnvloed het nie. Die elastiese eienskappe word in figuur 3 opgesomd. Hierdie data het die teoretiese model vir die energietransduksie in F ondersteunOF1-ATP -sintase deur verbygaande omkeerbare vervormings in die rotor.

6. Driekleurige enkelmolekule FRET onthul rotor draai tot 120 °

Om elastiese vervormings van die rotor-subeenhede te identifiseer sonder om groot krale of filamente aan te heg en om hierdie konformasionele skommelinge tydens ATP-sintese waar te neem, is die enkelmolekule FRET-benadering met vrylik verspreide enkele FOF1-ATP sintases in liposome is onlangs uitgebrei na 'n drie fluorofoor eksperiment [77,84]. Die veelkleurige konfokale mikroskoopopstelling word in figuur 4 getoona. 'N Drie-mutant van E coli FOF1-ATP-sintase is gebruik met die fluorescerende proteïen EGFP wat aan die C-terminus van die a subeenheid as 'n primêre FRET-skenker, die ε-subeenheid gemerk met Alexa532 as sekondêre FRET-skenker by residu 56, sowel as 'n Cy5-etiket as die FRET-aanvaarder op 'n sisteïen wat by residu 2 ingebring is op een van die tien c subeenhede (figuur 4b). Die doel van hierdie spektroskopiese opset was om die interne vervormings van die rotoreenhede te korreleer met 'n algehele rotasie van die drie subeenhede γεc10 as bewys van die katalitiese aktiwiteit van die ensiem. Dus kan fotofisiese artefakte op die enkelmolekule fluoressensie vlak soos spektrale skommelinge en flikkering gediskrimineer word deur 'n verbygaande draai van ε versus c subeenhede. Aanduidings vir relatiewe bewegings tussen ε en c is ook deur Gräber en medewerkers [85] gevind.

Figuur 4. (a) Eksperimentele opstelling vir konfokale drie-kleur FRET-metings met behulp van drie afwisselende lasers in 'n geoptimaliseerde dienssiklus (aangepas vanaf [77]). (b) Posisies van die drie fluorofore op 'n enkele FOF1-ATP -sintase in 'n liposoom. EGFP (blou reghoek) is die eerste FRET-skenker op die statiese a subeenheid, wat deur die 488 nm-laser opgewek word. Alexa532 (groen kolletjie) is aan die roterende subeenheid ε gekoppel en dien as FRET -acceptor vir EGFP deur eksitasie van 488 nm, maar word later die sekondêre FRET -skenker as dit opgewonde is met die 532 nm laserpuls. Cy5 (rooi punt) op een van 10 roterende c subeenhede is die FRET -aanvaarder vir beide EGFP en Alexa532. (c) Skets van die afwisselende FRET-afstandmetings in 'n enkele ensiem tussen die statiese posisie van EGFP op a en drie stopposisies van die roterende ε subeenheid (groen kolletjies met posisies 1, 2 en 3). Draai van die rotor tussen ε en c is as gevolg van verskillende stapgroottes van beide roterende subeenhede en lei tot FRET afstandsveranderinge volgens die oranje pyle. (d) Photon burst van 'n enkele FOF1-ATP -sintase wat bestaan ​​uit twee gelyktydige FRET -metings in een ensiem. Fluoressensie -trappe onder wys FRET -skenker EGFP (blou) en gekombineerde FRET -aannemers Alexa532 plus Cy5 (groen). Relatiewe intensiteite het gedurende waarnemingstyd verander en geleidelike veranderinge in die nabyheidsfaktor opgelewer (getoon as grys spoor hierbo). Die gepaardgaande FRET -baan vir Alexa532 as FRET -skenker (siaan) en Cy5 as FRET -acceptor (rooi) is aangeteken tydens eksitasie van 532 nm. Die afstandbaan (blou/oranje) in die boonste paneel dui op 'n stapsgewyse draai tussen ε en c sowel as elastiese afstandskommelinge binne die tweede helfte van hierdie fotonuitbarsting (figuur 4b,c en d aangepas vanaf [84]).

Kortliks, die sisteïenmutant εH56C in F1 is vervaardig in E coli stam RA1. F1 is voorberei en gemerk met Alexa532-maleimid. Die gemiddelde etikettering doeltreffendheid is bepaal as 35 persent. Die dubbel-mutante FOF1-ATP -sintase met EGFP aan a en 'n sistien wat by residuposisie 2 van c is afsonderlik gesuiwer. Na substoïgiometriese etikettering van die c-ring van ongeveer 7,4 persent met Cy5-monomaleimied, is die ensiem gereconstitueer in voorafgevormde liposome, en die ongemerkte F daarvan1 is uitgeruil met die Alexa532-gemerkte F1. Suksessyfers van die F1 ruilprosedures is nie gekwantifiseer nie. Drie lasergolflengtes (488, 532 en 635 nm) is dus in dieselfde konfokale eksitasievolume oorgetrek en 'n polsreeks is toegepas vir 'n diens-siklus-geoptimaliseerde alternerende laser-eksitasieskema (DCO-ALEX, figuur 4a) om die paar F te identifiseerOF1-ATP sintases met al drie fluorofore teenwoordig [77,84].

Twee gelyktydige FRET -metings op elke enkele FOF1-ATP-sintase is gekombineer soos in figuur 4 getoonb,c. Die eerste afstandmeting tussen EGFP op die statiese subeenheid a (blou) en die twee merkers op die rotor subeenhede ε (groen) en c (rooi) het 'n aktiewe ensiem geopenbaar toe stapsgewyse FRET-skommelings opgespoor is as ɛ/c vanaf stopposisie 1 na stopposisies 2 en 3 geroteer. Vervolgens word die tweede afstandmeting oor die rotorsubeenhede ε en c, aangedui deur oranje pyle in figuur 4c, het die hoekige draai tussen hierdie twee kleurstowwe op dieselfde ensiem ontrafel. Een voorbeeld van so 'n fotonuitbarsting word in figuur 4 getoond. Gepulseerde opwekking met die 488 nm-laser het die beweging van die rotorsubeenhede met betrekking tot die stator ondersoek. In die laagste paneel het die relatiewe fluorescentie-intensiteite van die FRET-skenker EGFP en die FRET-aannemers Alexa532 plus Cy5 stapsgewys verander van lae tot medium tot hoë FRET-doeltreffendheid, soos gesien in die ooreenstemmende nabyheidsfaktorspoor hierbo (grys baan). Opwindende die fluorofoor Alexa532 op ε met 532 nm wat nou as die werklike FRET skenker optree, het FRET doeltreffendheid veranderinge aan die Cy5 aanvaarder op c deur relatiewe intensiteit veranderinge binne hierdie foton burst. Die ooreenstemmende FRET -afstandbaan in die boonste paneel van figuur 4d (blou -oranje) dui op 'n groot afstandverandering van 6 na 5 nm aan die begin van die fotonuitbarsting, gevolg deur afstandskommelinge van ongeveer 0,5-1 nm. Op grond van hierdie FRET -eksperimente het ons die relatiewe bewegings van ε en c tydens beide ATP -sintese en ATP -hidrolise [86]. Ons het 'n uitgebreide draai in hierdie gedeelte van die rotor gevind, wat die β-vat domein van ε en die c-ring, aansienlik groter as 36 ° en moontlik in die reeks tot 120 °.

Hierdie enkel-molekule FRET-data en die kral-gebaseerde hoekfluktuasiemetings bevestig die hipotese dat 'n aansienlike fraksie van die totale rotor-torsie-elastiese energie in die buigsame rotorgedeelte gestoor word, terwyl die stator baie styf is en nie bydra tot die hoë nakoming nie. van die F.OF1-ATP sintase. Die sagste gedeelte is waarskynlik geleë op die koppelvlak van die twee trap nanomotors, dit wil sê waar dit meganies nodig is om die ensiem met hoë kinetiese doeltreffendheid te bedryf.

7. Vooruitsigte

Wat het ons in 15 jaar geleer uit die enkelmolekule-rotasie-eksperimente met F1 en F.OF1-ATP sintases? Eerstens, eksperimentele bewyse van rotasie van subeenhede en diskriminasie van 120 ° -stappe by hoë [ATP] en ​​sub-stappe by lae [ATP] in F1 het ons toegelaat om die model van roterende katalise te verfyn. Die vier chemiese stappe van ATP -hidrolise, dit wil sê van binding tot bindingskeuring tot vrystelling van produkte, word nie net toegeskryf aan hul tydsberekening nie, maar ook met betrekking tot die drie gesinchroniseerde katalitiese bindingsplekke op die ensiem. Voordele van die direkte visualisering van roterende krale of filamente wat aan oppervlakgebonde ensieme geheg is, was (i) baie lang waarnemingstye van 'n enkele molekule met baie omset en goeie statistieke, en (ii) die moontlikheid om biochemiese toestande te verander en die effek daarvan te monitor. op die roterende gedrag van dieselfde ensiem. Metings van enkelmolekule-elastisiteit vereis beide voordele. Die hoek- en tydsresolusies vir stappate van die roterende nanomotore is baie hoog deur nie-bleekende helder nanodeeltjies as verslaggewers te gebruik. Deur magnetiese krale aan die rotor vas te maak, kon 'mensgemaakte ATP' uiteindelik gemaak en gemeet word deur geforseerde rotasie in klein reaksiekamers.

Ander enkel-molekule manipulasie en beeldmetodes soos atoomkragmikroskopie [87] of baie sagte optiese pincet sal die resolusie van die gedetailleerde meganochemiese katalitiese siklus in hierdie ATPase verhoog. Eksperimente is aan die gang wat meganiese stimulering van verskillende domeine van F ondersoek1 om rigtingskragte met geïnduseerde γ subeenheid rotasie te korreleer. Die buitengewone statistieke van konformasieveranderinge gebaseer op 'n enkele oppervlak-gehegte molekule maak gevorderde teoretiese ontledings soos fluktuasiestellings moontlik [88,89].

Enkelmolekule FRET-metings blyk aanvullend te wees tot hierdie benadering. Rotasierigting is gemeet deur FRET vir beide ATP-hidrolise en ATP-sintese. Die klein kleurstofmolekules het nie bygedra tot viskose drag nie. Die posisies van die sisteïenmutasies in die FOF1-ATP -sintase moes nog beheer word om verlaagde omsetkoerse te vermy. Die funksie van die remmer dicyclohexylcarbodiimide (binding aan die c subeenheid en blokkering van rotasie in FO) kan onderskei word van die remmer aurovertin B, wat rotasie vertraag het tydens ATP -hidrolise, maar blykbaar rotasie tydens ATP -sintese geblokkeer het. In teenstelling met enkelmolekule FRET-metings van die P-tipe ATPase KdpFABC, wat 'n bakteriële K + -vervoerder is met 'n enkele buigsame nukleotiedbindingsdomein [90,91], of met die ATP-aangedrewe ABC-vervoerder P-glikoproteïen [92] met twee ATP -bindingsplekke, die FOF1-ATP -sintase het 'n direkte korrelasie van ATP -binding en stapsgewys konformasionele veranderinge getoon. Omdat trappe rotasie heeltemal deur remmers geblokkeer kon word, was die diskriminasie van termiese skommelinge van die gemerkte proteïendomein van oorgange tussen konformasies tydens katalise moontlik. Soortgelyke rotasiegedrag kan verwag word vir die struktureel verwante A-tipe (insluitend die Thermus thermophilus ensiem [78,93]) en vakuolêre V-tipe ATPases [94,95]. Die tydresolusie vir konformasionele oorgange wat deur enkelmolekule FRET met F opgespoor wordOF1-ATP-sintase bereik 'n sub-millisekonde reeks [72,96], maar was afhanklik van die sein-tot-geraas-verhouding. Daarom word vinnige oorgange meer akkuraat gevolg met behulp van ligverspreidingsondernemings [43]. Aangesien die enkelmolekule FRET-benadering altyd beperk word deur die fotofisika van die kleurstowwe, word verdere verbeterings verwag deur nuwe fluorofore met hoër fotostabiliteit [97,98] of deur fluoresserende nanokristalle [99].

Monitering van vrylik verspreide proteoliposome is beperk tot minder as 'n sekonde as gevolg van die deurgangstyd deur die laserfokus. Nuwe nie-optiese deeltjie-opvangtoestelle, soos die anti-Browniaanse elektrokinetiese val [100–104] (ABEL-val) wat deur Cohen en Moerner uitgevind is, kan gebruik word om 'n enkele F te vang en aktief te stootOF1-ATP -sintase na 'n teikenposisie vir uitgebreide konfokale FRET -metings [105]. Dan is die verskillende getalle vervoerde protone wat nodig is om een ​​ATP -molekule in die F te maakOF1-ATP -sintases van chloroplaste [3,106], bakterieë [3] of mitochondria [107] (soos bereken uit ensemble -metings) kan vergelyk word met die trapproottes van die roterende c-ringe van die onderskeie enkelsnit FO motors.


Bespreking

In hierdie studie het ons die skynbare tyd van SH2 -domeine in 'n TIR -beligtingsveld naby die selmembraan gemeet. Ons het gevind dat die gemiddelde verblyftyd langer is as wat voorspel is op grond van die chemiese dissosiasietempo, en vir monomere SH2-domeine het die dissosiasiekinetika min heterogeniteit getoon. Alhoewel ander moontlikhede nie heeltemal uitgesluit kan word nie, is die eenvoudigste en mees waarskynlike verduideliking dat die interaksie tussen SH2-domeine en p-Tyr-webwerwe herhaalde herbinding behels. Ons stel voor dat die herbinding die gevolg is van mededinging tussen die baie vinnige intrinsieke chemiese kinetiese tempo van die assosiasiereaksie en die relatief stadige diffusiesnelheid van die biomolekules in vivo. 'N Deel van die rede waarom die chemiese assosiasiesnelheid hoog is, is dat daar 'n oorvloed beskikbare p-Tyr-bindingsplekke is, omdat elke reseptormolekule meer fosforyleringsplekke het en as gevolg van die groepering van die reseptore wat die plaaslike konsentrasie van bindingsplekke verder verhoog . Omdat die SH2 -molekules nie direk van die reseptore in ons model distansieer nie, het die tradisionele konsep van omsettyd in hierdie geval 'n dubbelsinnige betekenis. Daar is in werklikheid twee verskillende omsettye. Die SH2-omsettingstyd op 'n individuele p-Tyr-webwerf is redelik kort, omdat die molekule vinnig dissosieer. Die vinnige dissosiasie stem ooreen met die feit dat p-Tyr-plekke baie vinnig gedefosforileer kan word (26) en dus nie vir 'n baie lang tyd deur die SH2-binding beskerm word nie. Aan die ander kant is die SH2 -omsettingstyd met betrekking tot die reseptorkluster relatief lank, omdat die SH2 -molekuul ȁ kap ” tussen die bindingsplekke. Teorie voorspel dat groepering die binding tussen p-Tyr-plekke en die SH2-molekules stabiliseer, wat ons in eksperimente geverifieer het.

Die bevinding dat die SH2-proteïen hop tussen gegroepeerde bindingsplekke langs die selmembraan dui daarop dat 'n enkele SH2-molekule, wanneer dit na die membraan gewerf word, moontlik met veelvuldige p-Tyr-plekke wat naby mekaar is, kan interaksie hê. Hierdie soort meganisme kan ook 'n rol speel in ander intrasellulêre proteïeninteraksies. Studies oor Cdc4 -interaksie met Sic1 het byvoorbeeld aan die lig gebring dat Cdc4 met verskeie gefosforyleerde terreine op Sic1 kan wissel, alhoewel Cdc4 slegs een interaksie -webwerf bevat (27). Saam met ons bevindings, blyk dit aanneemlik dat dinamiese ewewig deur verskeie herbindingsgebeurtenisse 'n algemene tema van fosfoproteïeninteraksies is. Die herbindingsmeganisme verminder die belangrikheid van enkele bindingsplekke met hoë affiniteit. Wat RTK-sein betref, hang die SH2-woon tye af van die gemiddelde affiniteite van baie gefosforyleerde plekke, en 'n enkele hoë-affiniteitsplek het slegs 'n matige invloed op die gemiddelde bindingsduur. Daarom kan die herbindingsmeganisme verklaar waarom mutasie van RTK -fosfosiete wat voorspel word om spesifiek aan spesifieke SH2 -domeine te bind, relatief min invloed op stroomaf sein het. Dit was eers toe alle terreine uitgeskakel is en individuele fosfosiete teruggevoeg is, dat spesifieke effekte op stroomafwaartse sein waargeneem kon word (28, 29).

Laastens beklemtoon hierdie resultate die belangrikheid van reseptorklustering, aangesien kinetiese stabilisering van die SH2/p-Tyr-interaksie afhang van die hoë plaaslike digtheid van gefosforyleerde plekke. Reseptorgroepering kan die stroomaf-uitkoms van die seinproses verder beïnvloed (30). Daar is byvoorbeeld voorgestel (31) dat langdurige ligand/reseptor assosiasie in T -selle die xn2020 -lawaai onderdruk van die afwesige reseptoraktivering ('n kinetiese proefleesmeganisme). Op 'n soortgelyke wyse kan die verhoogde SH2 -proteïen -tyd naby die selmembraan, gekoppel aan hoë in vivo defosforyleringsnelhede (26), 'n bedrieglike geraas wat verband hou met die nie -spesifieke binding van SH2 -proteïene aan membraanmolekules, demp. Laastens, omdat die gewerfde SH2-proteïene nie met net een p-Tyr-plek assosieer nie, maar eerder oor baie p-Tyr-terreine “glide”, is die chemiese interaksie van so 'n SH2-proteïen met stroomaf substraat of effektormolekules by die selmembraan mag nie eenvoudige chemiese kinetiese wette volg nie. Die besonderhede van sulke interaksies behoort 'n interessante onderwerp van toekomstige navorsing te wees.


Verwysings

Yoshida, M., Muneyuki, E. & Hisabori, T. ATP synthase - 'n wonderlike roterende enjin van die sel. Nat Rev Mol Cell Biol 2, 669–77 (2001).

Junge, W., Sielaff, H. & Engelbrecht, S. Wringkraggenerering en elastiese kragoordrag in die roterende FoF1-ATPase. Nature 459, 364–70 (2009).

Weber, J. Strukturele biologie: Op pad na die ATP -sintasemeganisme. Nat Chem Biol 6, 794–5 (2010).

Dimroth, P., von Ballmoos, C. & Meier, T. Katalitiese en meganiese siklusse in F-ATP-sintases. Vierde in die Cycles Review Series. EMBO Rep 7, 276–82 (2006).

Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R. & Walker, J. E. Struktuur by 2.8 Å resolusie van F1-ATPase van beeshart mitochondria. Nature 370, 621–8 (1994).

Cingolani, G. & Duncan, T. M. Struktuur van die ATP-sintase-katalitiese kompleks (F1) van Escherichia coli in 'n outo-geïnhibeerde konformasie. Nat Struct Mol Biol 18, 701–7 (2011).

Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G. & Mueller, D. M. Nuwe eienskappe van die roterende katalitiese meganisme wat in die struktuur van gis F1 ATPase geopenbaar word. EMBO J 25, 5433–42 (2006).

Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M. & amp; Kinosita, K., Jr. Direkte waarneming van die rotasie van F1-ATPase. Nature 386, 299-302 (1997).

Sielaff, H. et al. Domeinvoldoening en elastiese kragoordrag in roterende FoF1-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 17760–5 (2008).

Spetzler, D. et al. Enkele molekuulmetings van F1-ATPase toon 'n interafhanklikheid tussen die kragslag en die tydsduur. Biochemistry 48, 7979–85 (2009).

Yasuda, R., Noji, H., Kinosita, K., Jr & amp; Yoshida, M. F1-ATPase is 'n hoogs doeltreffende molekulêre motor wat draai met diskrete stappe van 120 grade. Sel 93, 1117–24 (1998).

Cherepanov, D. A. & Junge, W. Viskoelastiese dinamika van aktienfilamente gekoppel aan roterende F-ATPase: kromming as 'n aanduiding van die wringkrag. Biophys J 81, 1234–44 (2001).

Bilyard, T. et al. Hoë-resolusie enkelmolekule karakterisering van die ensiematiese toestande in Escherichia coli F1-ATPase. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 368, 20120023 (2013).

Toyabe, S. et al. Nie-ekwilibrium-energietika van 'n enkele F1-ATPase-molekule. Phys Rev Lett 104 (2010).

Watanabe, R., Iino, R. & amp; Noji, H. Fosfaatvrystelling in F1-ATPase katalitiese siklus volg op ADP-vrystelling. Nat Chem Biol 6, 814–820 (2010).

Shimo-Kon, R. et al. Chemo-meganiese koppeling in F1-ATPase word geopenbaar deur die katalitiese besetting tydens katalise. Biophys J 98, 1227–36 (2010).

Rees, D. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. & amp; Walker, J. E. Strukturele bewyse van 'n nuwe katalitiese tussenproduk in die weg van ATP-hidrolise deur F1-ATPase uit mitochondria van beeshart. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 11139–43 (2012).

Ariga, T., Muneyuki, E. & Yoshida, M. F1-ATPase roteer deur 'n asimmetriese, opeenvolgende meganisme deur al drie katalitiese subeenhede te gebruik. Nat Struct Mol Biol 14, 841–6 (2007).

Yasuda, R., Noji, H., Yoshida, M., Kinosita, K., Jr & Itoh, H. Resolusie van afsonderlike rotasie-substappe deur submillisekondes kinetiese analise van F1-ATPase. Nature 410, 898–904 (2001).

Shimabukuro, K. et al. Katalise en rotasie van F1 motor: splitsing van ATP by die katalitiese plek vind plaas in 1 ms voor 40 grade substap rotasie. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 14731–6 (2003).

Nishizaka, T. et al. Chemomeganiese koppeling in F1-ATPase onthul deur gelyktydige waarneming van nukleotiedkinetika en rotasie. Nat Struct Mol Biol 11, 142–8 (2004).

Adachi, K. et al. Koppeling van rotasie en katalise in F1-ATPase geopenbaar deur enkel-molekule beelding en manipulasie. Sel 130, 309–21 (2007).

Martin, J. L., Ishmukhametov, R., Hornung, T., Ahmad, Z. & Frasch, W. D. Anatomie van F1-ATPase-aangedrewe rotasie. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 3715–20 (2014).

Adachi, K., Oiwa, K., Yoshida, M., Nishizaka, T. & Kinosita, K. Beheerde rotasie van die F1-ATPase openbaar differensiële en deurlopende bindingsveranderinge vir ATP-sintese. Nat Commun 3 (2012).

Watanabe, R., Iino, R., Shimabukuro, K., Yoshida, M. & Noji, H. Temperatuurgevoelige reaksiemiddel tussen F1-ATPase. EMBO Rep 9, 84–90 (2008).

Enoki, S., Watanabe, R., Iino, R. & Noji, H. Enkelmolekulestudie oor die temperatuursensitiewe reaksie van F1-ATPase met 'n hibriede F1 wat 'n enkele β dra (E190D). J Biol Chem 284, 23169–76 (2009).

Shimabukuro, K., Muneyuki, E. & amp; Yoshida, M. 'n Alternatiewe reaksiebaan van F1-ATPase voorgestel deur rotasie sonder 80 grade/40 grade substappe van 'n trae mutant by lae ATP. Biophys J 90, 1028-1032 (2006).

Ohtsubo, M. et al. In vitro-gemuteerde beta-subeenhede van die F1-ATPase van die termofiele bakterie, PS3, wat glutamien bevat in die plek van glutamiensuur in posisies 190 of 201, kom saam met die alfa- en gamma-subeenhede om onaktiewe komplekse te produseer. Biochem Biophys Res Commun 146, 705–10 (1987).

Park, MY, Omote, H., Maeda, M. & amp Futai, M. Bewaarde Glu-181 en Arg-182 residue van Escherichia coli H + -ATPase (ATP synthase) beta subeenheid is noodsaaklik vir katalise: eienskappe van 33 mutante tussen beta Glu-161 en beta Lys-201 residue. J Biochem 116, 1139-45 (1994).

Senior, A. E. & al-Shawi, M. K. Verdere ondersoek van sewentien mutasies in Escherichia coli F1-ATPase beta-subeenheid. J Biol Chem 267, 21471–8 (1992).

Watanabe, R. et al. Meganiese modulasie van katalitiese krag op F1-ATPase. Nat Chem Biol 8, 86–92 (2012).

Watanabe, R. & Noji, H. Chemomeganiese koppelingsmeganisme van F1-ATPase: katalise en wringkraggenerering. FEBS Lett 587, 1030–5 (2013).

Masaike, T., Koyama-Horibe, F., Oiwa, K., Yoshida, M. & Nishizaka, T.Koöperatiewe drie-stap bewegings in katalitiese subeenhede van F1-ATPase korreleer met 80 grade en 40 grade substap rotasies. Nat Struct Mol Biol 15, 1326–33 (2008).

Tanigawara, M. et al. Rol van die DELSEED-lus in wringkragoordrag van F1-ATPase. Biophys J 103, 970–8 (2012).

Usukura, E. et al. Wringkragopwekking en -benutting in motorensiem FoF1-ATP Synthase Half-wringkrag F1 met 'n kortstrookstangheliks en verminderde ATP-sintese deur FoF1 met 'n halfmoment. J Biol Chem 287, 1884–1891 (2012).

Okuno, D., Iino, R. & Noji, H. Styfheid van gamma-subeenheid van F1-ATPase. Eur Biophys J 39, 1589–96 (2010).


Tydsafhanklike vervaardigingsprosesse lei tot 'n nuwe klas omgekeerde probleme

Die beheer van tydafhanklike, energiestraalvervaardigingsprosesse is in die verlede bereik deur proef-en-foutbenaderings. Ons identifiseer belangrike navorsingsgapings en generiese uitdagings wat verband hou met omgekeerde probleme vir hierdie prosesse wat 'n multidissiplinêre probleemoplossingsbenadering vereis om dit aan te pak. Die algemene probleme wat ons identifiseer, het 'n wye verskeidenheid toepassings in die algoritmiese beheer van moderne vervaardigingsprosesse.

Vir duisende jare is die belangrikste manier om voorwerpe te vervaardig deur soliede gereedskap te gebruik wat ontwerp is vir 'n spesifieke taak. Die mees algemene vormbeginsel is eenvoudig: skuif 'n soliede werktuig sodat materiaal volgens die meganiese beginsels van die werkstuk verwyder word. Daar is dus 'n direkte meetkundige afhanklikheid tussen werktuigbeweging en die vorm van die voorwerp wat geskep is. Selfs gesofistikeerde, numeries beheerde werktuiggereedskap gebruik hierdie basiese beginsel.

Ander vervaardigingsprosesse wat gereedskap gebruik wat geometries nie volledig deterministies gedefinieer is nie (d.w.s. tydafhanklike gereedskap) het ook hul pad na produksielyne gemaak. In hierdie prosesse neem die instrument die vorm aan van 'n stroom energie wat uit 'n bron afkomstig is (bv. Laser, ioongeweer, vloeistofstraal), wat ons energiebundelprosesse (EBP's) sal noem. Hierdie tydsafhanklike gereedskap kan gebruik word om materiale wat nie met presisie verwerk kan word nie, met behulp van konvensionele metodes te vorm. In teenstelling met konvensionele gereedskap, hang die vorm en grootte van EBP -voetspore (materiaalverwydering/afsettingstempo en/of materiaaltransformasietempo by die kruising tussen balk en werkstuk) nie net af van die werktuigpad nie, maar ook van blootstellingstyd en energievloei. Verder hang die energievloed af van die meetkunde van die balk, wat wissel met die prosesopstelling (bv. Energieverliese tussen bron en teiken). Die beheer van tydsafhanklike gereedskap vir die opwekking van vrye vorms is dus baie moeilik in vergelyking met prosesse wat tradisionele, tydonafhanklike instrumente gebruik. Om dele te maak met behulp van EBP's, beweeg die balk langs 'n vooraf gedefinieerde pad om die energie -voetspoor met die werkstuk te draai, en enige variasies in die tyd van die voetafdruk kan lei tot foute in die geometrie van die dele. Let daarop dat die voetspoor gewoonlik nie ruimtelik eenvormig is nie en dat dit met oriëntasie na die teikenoppervlak verander.

Om 'n voorafbepaalde gereedskapspad te neem en die gevolglike oppervlak te voorspel, is die direkte probleem in EBP's, wat wyd gedokumenteer is, dit word gewoonlik gekombineer met toets en fout om die vereiste meetkunde te bereik. Die werklike uitdaging, en die korrekte benadering, is egter om die omgekeerde probleem aan te pak - dit is, vir 'n gegewe deel meetkunde, om 'n pad te bepaal wat foute in sy generering minimaliseer deur 'n optimaliseringsalgoritme te gebruik. Slegs baie beperkte navorsing is op hierdie gebied uitgevoer.

Ons doel hier is om hierdie geleentheid om 'n uitdagende nuwe stel probleme te bestudeer aan die breër wetenskaplike gemeenskap te versprei, wat 'n interdissiplinêre benadering vereis. Ons glo dat die gebrek aan navorsing oor hierdie omgekeerde probleme die gevolg is van die moeilikheid om die direkte probleem akkuraat te formuleer om die tydafhanklikheid van die energievoetspoor en die effek daarvan op die werkstukmateriaal in ag te neem en daarna die omgekeerde probleem aan te pak.

Alhoewel omgekeerde probleme in algemene ingenieurswese (bv. hitte-oordrag, akoestiek) goed ondersoek is, is dié wat verband hou met tydafhanklike vervaardigingsprosesse nuut omdat dit die optimalisering van meervoudige deurgangbewegings van die energiebron relatief tot die teikenwerkstuk behels. Daar was egter onlangse vordering. Byvoorbeeld, in skuurmikromasjien, bestudeer Lari en Papini (1) die omgekeerde probleem as die oplossing van 'n integrale vergelyking (sien ook ref. 2) om die voersnelheid te bepaal vir die opwekking van vlak periodieke en W-vormige vorms gebaseer op oorvleuelende reguit paaie vir 'n Gaussiaanse balkvoetspoor. Vir nie-Gaussiese voetspore is 'n benaderingsmetode gebruik wat gebaseer is op die modellering van die balk as 'n puntbron. In atmosferiese plasma-ets, Dai et al. (3) het die nie-lineêre afhanklikheid van materiaalverwyderingstempo op verblyftyd hanteer deur 'n geneste gepulseerde iteratiewe metode te oorweeg om die tyd-varierende nie-lineariteit van die proses te evalueer en reg te stel en die bewerking van sakgeometrieë in saamgesmelte silika moontlik te maak. In optiese oppervlaktes het Beaucamp en kollegas (4) getoon hoe selfbeplanningstrategieë met veranderlike toonhoogtes, gebaseer op 'n eenvoudige, lineêre model vir materiaalverwydering, gebruik kan word om die eenvormigheid van 'n gepoleerde oppervlak te verbeter. In ioonstraalbewerking behels 'n benaderde oplossing van die omgekeerde probleem die variasie van die verblyftyd van die bundel op elke pixel van die vereiste oppervlak (5). Dit neem egter geen rekening met nie-lineêre effekte nie, en hoewel dit 'n geloofwaardige beginstrategie is, het ons vir hierdie EBP gedemonstreer (6) hoe die oplossing van die omgekeerde probleem vir 'n meer gesofistikeerde model deur gebruik te maak van 'n steilste afdraande algoritme die akkuraatheid van vryvorm-ets met hierdie hulpmiddel.

In die afgelope paar jaar het ons 'n reeks direkte en omgekeerde probleme vir energiestraalvervaardigingsprosesse gedefinieer, wat wissel van skuur- en gewone waterstraalbewerking (2) tot lasermikrobewerking (7) en gefokusde ioonstraalbewerking (6), met 'n verenigde beskrywing gegee in ref. 8. As ons die oppervlak van die werkstuk definieer as r = R ( α , β , t ), waar α en β die oppervlak parameteriseer en t tyd is, is die evolusievergelyking vir die oppervlak onder die werking van die balk n · d R dt = ( n . k ) E , waar n ( α , β , t ) die uitwaartse eenheid loodreg op die oppervlak is, k ( t ) is 'n eenheidsvektor in die rigting van die as van die balk, E ( r ) , θ , t , R p ) is die materiaalverwyderingstempo, r en θ parameteriseer posisie binne die balk, en p is 'n vektor van parameters wat die dinamika kenmerk van hoe energie deur die balk gelewer word. Die evolusievergelyking moet opgelos word onderhewig aan r = R 0 wanneer t = 0 vir 0 < t < T .

In die direkte probleem, die beheerparameters, p ('n straalpad, oriëntasie, en moontlik energie-uitsettempo en prosestyd, T), gespesifiseer word, en die finale oppervlak, R ( α , β , T ), wat in die praktyk waargeneem sal word, word bereken.

In die omgekeerde probleem soek ons ​​parameters, p, wat ‖ R (α, β, T) - R 1 (α, β) ‖ minimaliseer, waar R 1 (α, β) die teikenoppervlak spesifiseer wat geskep moet word en ‖. ‖ Is 'n gepaste norm ('n geweegde som met T kan gebruik word vir die minimalisering van die prosesstyd). In 'n model so eenvoudig soos hierdie, word al die fisika saamgebind in die funksie vir die verwydering van materiaal, E (r, θ, t, R p).

Probleme soos hierdie lê in die breë kategorie van gedeeltelike differensiaalvergelyking-beperkte optimalisering. Alhoewel dit 'n groot navorsingsgebied is, is die gebruik van tegnieke uit hierdie veld in vervaardigingsingenieurswese nie algemeen nie. Ons bespreek nie die effek van prosesgeraas nie en formuleer die model in terme van 'n gedeeltelike differensiaalvergelyking, maar let op dat die verwydering van materiaal as 'n ewekansige proses direkte en inverse probleme meer wiskundig uitdagend maak en 'n gebied is wat baat by verdere ontwikkeling ( 9).

Boonop kan ons 'n stel nuwe probleme formuleer wat 'n wye reeks uitdagings bied, 'n interdissiplinêre benadering vereis en veel verder strek as verwyderings- en akkresieprosesse. Die volgende is 'n eenvoudige klassifikasie en 'n onuitputlike lys van vervaardigingsprosesse wat tydsafhanklike gereedskap gebruik en die gepaardgaande omgekeerde probleme moet oorweeg (Fig. 1):

• Materiaalverwydering: masjinering deur laserstraal, skuurwaterstraal/lugstraal, gefokusde ioonstraal, elektronstraal, elektrostraal, elektroontlading en ultraklank

Die beginsels vir materiaalverwydering wissel aansienlik (verdamping, meganiese skuur, deeltjie momentumoordrag, chemiese ontbinding, vonk-erosie), maar het 'n voetspoor van energiebalkverwydering in gemeen met besonderhede in vorm en gedrag (bv. as gevolg van refleksie/absorpsie).

• Materiaal-/oppervlaktemodifikasie: meganiese of laserskiet, laserpolering, gelokaliseerde/selektiewe hittebehandeling

Geen materiaal word bygevoeg of verwyder nie, maar die energiebundel verander die (gewoonlik oppervlakkige) eienskappe van die werkstuk deur meganiese of termiese middele om meganiese eienskappe (bv. Hardheid, oorblywende spanning) of mikrostruktuurbestanddele van die onderdeel te verander.

• Materiële aanwas: direkte metaalafsetting, spuitlaag, versmelting

Die energiestraal deponeer soortgelyke of verskillende materiale op die werkstuk, en die beginsels hou hoofsaaklik verband met energie-oordrag na individuele deeltjies wat in wisselwerking met die basismateriaal deur verskillende fisiese meganismes (bv. vervoer van massa, hitte en/of momentum) en resultate in afsettingsvoetspore wat geraak word deur prosesspesifieke sekondêre effekte (bv. kleefvrye deeltjies, porositeit van die neergelegde materiaal).

• Materiaalkonsolidasie: selektiewe lasersintering, elektronbundelsmelting

Dit is 'n generiese groep poeierbed -additiewe vervaardigingsprosesse waarin die energiebundel plaaslike konsolidasie van groepe deeltjies veroorsaak. Elke proses word beïnvloed deur die tydsduur en energieverdeling van die bundel en lei tot unieke mikrostruktuur- en meganiese eienskappe van die gegenereerde komponent.

• Hibriede prosesse: laser/ultraklank/plasma ondersteun

Die energiebundel word gebruik in samewerking met 'n ander proses wat nie tydsafhanklik kan wees nie (bv. Sny) of tydsafhanklik (bv. Elektrodeskuur). Die energiestraal word óf voor óf presies op die posisie geplaas waar die hoofproses plaasvind. Die doel is om die basiese verwyderingsproses te verbeter. In die geval van twee gekoppelde woon-tyd prosesse wat deur verskillende verskynsels beheer word, is die oplossing van die gepaardgaande omgekeerde probleem besonder uitdagend.

'n Verkorte klassifikasie van EBP's vir inverse modellering.

As 'n voorbeeld van 'n hibriede proses, het ons onlangs gewys (10) dat deur 'n laserstraalskandering voor 'n freeswerktuig te gebruik op 'n pad wat verkry word deur die omgekeerde probleem op te los, snykragte met ongeveer 50% verminder kan word. Dit maak 'n aansienlike toename in materiaalverwydering moontlik.

In elk van die bogenoemde voorbeelde moet die energiestraalparameters op 'n omgekeerde wyse bepaal word om die vereiste prosesuitkomste te bereik. Die bestudering van hierdie stelle omgekeerde probleme sal waarskynlik die manier waarop EBP's beplan en beheer word 'n rewolusie verander, wat die "vakmanskap"-benadering uitskakel. In die besonder is dit waarskynlik dat pakkette wat spesifiek ontwerp is vir tydsafhanklike prosesse, na vore kom om die huidige gebruik van rekenaargesteunde ontwerp-/vervaardigingstelsels te vervang, wat ontwerp is vir tradisionele masjiengereedskap en nie geskik is nie.


Ons het 'n versameling intydse gebruikersliggings vanaf ons toepassing. Elke rekord bevat lengtegraad, breedtegraad en die tyd waarop die geografiese ligging vasgelê is. Hoe kan ek die verblyf tyd op die stilstaande plek van 'n gebruiker bereken uit hierdie data?

Dinge om in ag te neem by afhaal die data:

As u 'n biblioteek gebruik, soos: react-native-mauron85-background-geolocation en die ioniese raamwerk, stel u die stilstaande Radius om 'n gebied te definieer waarbinne die toestel wat sy ligging rapporteer, as stilstaande beskou word.

Wanneer daar obstruksies en reflekterende oppervlaktes is, is meerpad-ontvangs waarskynlik. Die seine kom op effens verskillende tye by die ontvanger aan en, afhangend van watter sein die ontvanger kies om vir enige gegewe monster te glo, verskil die afstand vanaf die satelliet ook. Vermenigvuldig hierdie gedrag met verskeie satelliete en bring dit dan by tot die totale posisieberekening, en die netto resultaat is dat die ontvanger abrupte posisiesverskuiwings ondervind. Soms kan dit betekenisvol wees - sê 40 of 50 voet.

Hoër vlak sagteware in die ontvanger probeer om dit glad te maak. Oor die algemeen doen dit beter as die spoorsnyer beweeg. Dit is omdat jou ware verandering in posisie per eenheid tyd baie groter is as die ewekansige verskuiwings wat veroorsaak word deur multi-pad ontvangs.

U kan die gerapporteerde posisie oor 'n tydperk gemiddeld bereken om 'n sirkel te kry waarbinne die toestel waarskynlik sal wees. Deur sekondêre inligting soos IP-adres en WiFi-posisionering te gebruik, kan addisionele inligting verskaf word om die te beperk raai vinniger. Sien ook: Wireless Technologies.

Hier is 'n voorbeeld wat jou wys waar jy Mozilla se Geolocation API gebruik, klik op "Geolocation Live Voorbeeld" en gee toestemming om jou ligging te deel (nie met ons by SE nie, met Mozilla).

As u eers redelike akkurate gegewens het, is dit bloot 'n kwessie van die definisie van 'n radius en 'n minimum stilstandtyd (wat 'n bewegende gemiddelde sou wees).

As hulle vinnig beweeg, dan is 'n korter verblyf 'n woonplek, terwyl 'n stilstand eers 'n langer tydperk sou plaasvind.

Gevorderde wiskundige modellering is nodig om 'n beter resultaat te ontleed en nie verward te raak deur kronkeling en terugsporing nie.


Abstract

Krag-klem-spektroskopie is 'n nuwe tegniek vir die bestudering van meganochemie op die enkelbindingsvlak. Enkele disulfiedbindingsverminderingsgebeurtenisse word akkuraat opgespoor as stapsgewyse toenames in die lengte van poliproteïene wat disulfiedbindings bevat en wat met 'n konstante krag uitgerek word met die uitkrag van 'n atoomkragmikroskoop (AFM). Die kinetika van hierdie reaksie is gemeet vanaf enkel-eksponensiële pasvorme tot ensemble-gemiddeldes van die reduksiegebeurtenisse. Eksponensiële aanslae is egter berug onduidelik om te gebruik in gevalle van kinetiese data wat verskeie reaksiebane toon. Hier stel ons 'n verblyftyd-analise-tegniek bekend, van wydverspreide gebruik in die enkelioonkanaalveld, wat ons toepas op die ondersoek van die kinetika van reduksie van disulfiedbindings gemeet vanaf enkel-molekule krag-klem spektroskopie spore. In hierdie tegniek word eksponensieel verspreide verblyftyddata as 'n histogram met 'n logaritmiese tydskaal en 'n vierkantswortelordinaat geplot. Die voordeel van logaritmiese histogramme is dat eksponensieel verspreide tydsduur verskyn as goed gedefinieerde pieke in die verspreiding, wat ons vermoë om verskeie kinetiese paaie op te spoor aansienlik verbeter. Ons pas hierdie tegniek toe om die verspreiding van verblyftye van 4488 enkeldisulfiedbindingreduksiegebeurtenisse te ondersoek gemeet in die teenwoordigheid van twee baie verskillende soorte reduseermiddels: tris-(2-karboksietiel)fosfienhidrochloried (TCEP) en die ensiem tioredoksien (TRX) . 'N Ander klemkrag word vir elke reduseermiddel gebruik om die verdeling van die tye op 'n soortgelyke tydskaal te verkry. In die geval van TCEP het die logaritmiese histogram van woontye 'n enkele piek getoon, wat ooreenstem met 'n enkele reaksiemeganisme. Daarenteen het soortgelyke eksperimente wat met TRX gedoen is, twee goed geskei pieke getoon, wat twee verskillende maniere van chemiese reduksie gemerk het wat gelyktydig werk. Hierdie eksperimente demonstreer dat verblyftydanalisetegnieke 'n kragtige benadering is om chemiese reaksies op die enkelmolekulevlak te bestudeer.