Inligting

Word die affiniteit van 'n ensiem of vervoerder vir sy substraat of opgeloste stof beïnvloed deur die aminosure by die bindingsplek?

Word die affiniteit van 'n ensiem of vervoerder vir sy substraat of opgeloste stof beïnvloed deur die aminosure by die bindingsplek?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die affiniteit van 'n ensiem of 'n proteïenvervoerder dui op die sterkte van die binding van substraat/opgeloste stof. 'n Ensiem met hoër affiniteit bind sy substraat sterker as 'n eweknie met 'n laer affiniteit. Is affiniteit altyd 'n funksie van die proteïenstruktuur van ensiem? As dieselfde ensiem in twee verskillende spesies verskillende affiniteite vir substraat het, sou dit aandui dat daar verskille in aminosure by die bindingsplekke van die ensiem in die twee spesies was?


In 'n reaksie wat 'n versadigingkinetika volg, KM is basies die konsentrasie van substraat/ligand waarteen die tempo van die reaksie die helfte van die maksimum tempo is (of die bindingsplekke half versadig is).

Die biofisiese betekenis van KM sal afhang van die onderliggende model. Byvoorbeeld, in die ewewigbenadering van Michaelis-Menten-model, KM is dieselfde as dissosiasiekonstante (van ensiem en substraat). In die Briggs-Haldane-model (kwasi-bestendige toestandbenadering) is dit effens kompleks: KM = (kr + kkat)/kf.

Oor die algemeen is die duimreël dat die K verlaag wordM vinniger sal die reaksie versadig word.

Is affiniteit altyd 'n funksie van die proteïenstruktuur van ensiem? As iemand dieselfde ensiem in twee verskillende spesies bestudeer en waarneem dat die ensiem verskillende affiniteite in twee spesies het, dui dit dan daarop dat daar 'n geringe verskil in sleutelaminosuurkomponent by die bindingsplekke van die ensiem tussen hierdie twee spesies kan wees?

Byna elke eienskap van die proteïen (nie net affiniteit vir 'n ligand nie) is as gevolg van die chemiese samestelling en struktuur daarvan. Alhoewel hulle direk by binding betrokke is, is die aminosure by bindingsplek nie die enigste bydraers tot die affiniteit nie. Die ander aminosure wat krities is vir die algehele struktuur van die proteïen is ook belangrik om die funksie te bewaar.


Ek sal by die antwoord deur @WYSIWYG voeg deur jou vraag om te draai: "As jy die aminosure by die bindingsplek verander het, sou dit die affiniteit van 'n proteïen vir 'n ligand* beïnvloed?"

Die antwoord hierop is ja, en vir 'n ensiem kan jy die substraat spesifisiteit heeltemal verander, soos 'n mens kan ontdek uit die lees van hierdie resensie deur Wilson en Agard.

'n Mens moet egter ook bewus wees dat die verandering van residue by dele van 'n proteïen buite die ligand-bindingsplek ook die affiniteit van binding kan beïnvloed - sien byvoorbeeld hierdie artikel deur Oue et al.

[*Dit maak die vraag meer algemeen om ander proteïene in te sluit wat ligande bind soos membraanreseptore en vervoerproteïene soos hemoglobien.]


Word die affiniteit van 'n ensiem of vervoerder vir sy substraat of opgeloste stof beïnvloed deur die aminosure by die bindingsplek? - Biologie

Glutamien is 'n aminosuur met 'n oorvloed van funksies in fisiologie en kanker.

Tumorselle is verslaaf aan glutamien.

Daar is verskeie glutamien-vervoerders in die plasmamembraan van soogdierselle.

Tumorselle veroorsaak selektiewe vervoerders om aan hul hoë vereistes vir glutamien te voldoen.

Sommige van die glutamien-vervoerders het potensiaal as geneesmiddelteikens in kankerterapie.


Inhoud

ABC-vervoerders gebruik die energie van ATP-binding en hidrolise om verskeie substrate oor sellulêre membrane te vervoer. Hulle word in drie hoof funksionele kategorieë verdeel. In prokariote, invoerders bemiddel die opname van voedingstowwe in die sel. Die substrate wat vervoer kan word sluit ione, aminosure, peptiede, suikers en ander molekules in wat meestal hidrofiel is. Die membraan-oortrekgebied van die ABC-vervoerder beskerm hidrofiele substrate teen die lipiede van die membraan-dubbellaag en verskaf dus 'n pad oor die selmembraan. Eukariote besit geen invoerders nie. Uitvoerders of uitvloeiers, wat in beide prokariote en eukariote teenwoordig is, funksioneer as pompe wat gifstowwe en dwelms uit die sel druk. In gram-negatiewe bakterieë vervoer uitvoerders lipiede en sommige polisakkariede van die sitoplasma na die periplasma. Die derde subgroep van ABC-proteïene funksioneer nie as vervoerders nie, maar is eerder betrokke by translasie- en DNA-herstelprosesse. [4]

Prokariotiese wysiging

Bakteriese ABC-vervoerders is noodsaaklik in sellewensvatbaarheid, virulensie en patogenisiteit. [1] [4] Yster-ABC-opnamestelsels is byvoorbeeld belangrike effektore van virulensie. [11] Patogene gebruik siderofore, soos Enterobactin, om yster op te vang wat in kompleks is met hoë-affiniteit-ysterbindende proteïene of eritrosiete. Dit is hoë-affiniteit yster-chelerende molekules wat deur bakterieë afgeskei word en yster herabsorbeer in yster-siderofore komplekse. Die chvE-gguAB geen in Agrobacterium tumefaciens kodeer glukose- en galaktose-invoerders wat ook met virulensie geassosieer word. [12] [13] Vervoerders is uiters noodsaaklik in seloorlewing sodat hulle funksioneer as proteïenstelsels wat enige ongewenste verandering wat in die sel voorkom, teëwerk. Byvoorbeeld, 'n potensiële dodelike toename in osmotiese sterkte word teengewerk deur aktivering van osmossenserende ABC-vervoerders wat die opname van opgeloste stowwe bemiddel. [14] Behalwe om in vervoer te funksioneer, is sommige bakteriese ABC-proteïene ook betrokke by die regulering van verskeie fisiologiese prosesse. [4]

In bakteriese uitvloeistelsels sluit sekere stowwe uit wat uit die sel geëkstrueer moet word oppervlakkomponente van die bakteriële sel (bv. kapsulêre polisakkariede, lipopolisakkariede en teichoïensuur), proteïene wat betrokke is by bakteriële patogenese (bv. hemolise, heembindende proteïen en alkalies) protease), heem, hidrolitiese ensieme, S-laag proteïene, bevoegdheidsfaktore, toksiene, antibiotika, bakteriosiene, peptied antibiotika, geneesmiddels en siderofore. [15] Hulle speel ook belangrike rolle in biosintetiese weë, insluitend ekstrasellulêre polisakkariedbiosintese [16] en sitochroombiogenese. [17]

Eukariotiese wysiging

Alhoewel die meeste eukariotiese ABC-vervoerders uitvloeistowwe is, is sommige nie direk betrokke by die vervoer van substrate nie. In die sistiese fibrose transmembraanreguleerder (CFTR) en in die sulfonielureumreseptor (SUR), word ATP-hidrolise geassosieer met die regulering van die oopmaak en sluiting van ioonkanale wat deur die ABC-proteïen self of ander proteïene gedra word. [5]

Menslike ABC-vervoerders is betrokke by verskeie siektes wat voortspruit uit polimorfismes in ABC-gene en selde as gevolg van volledige verlies aan funksie van enkele ABC-proteïene. [18] Sulke siektes sluit in Mendeliese siektes en komplekse genetiese afwykings soos sistiese fibrose, adrenoleukodistrofie, Stargardt-siekte, Tangier-siekte, immuungebreke, progressiewe familiële intraheptiese cholestase, Dubin-Johnson-sindroom, Pseudoxanthoma elasticum, aanhoudende hiperinsuline-sindroom van hipoglisemiese tot fokale bloedvate. hiperplasie, X-gekoppelde sideroblastose en bloedarmoede, ouderdomsverwante makulêre degenerasie, familiële hipo-apoproteïnemie, Retinitis pigmentosum, kegelstaafdistrofie, en ander. [5] Die menslike ABCB (MDR/TAP) familie is verantwoordelik vir veelvuldige middelweerstand (MDR) teen 'n verskeidenheid van struktureel onverwante middels. ABCB1 of MDR1 P-glikoproteïen is ook betrokke by ander biologiese prosesse waarvoor lipiedvervoer die hooffunksie is. Daar word gevind dat dit die afskeiding van die steroïed-aldosteroon deur die byniere bemiddel, en die inhibisie daarvan het die migrasie van dendritiese immuunselle geblokkeer, [19] wat moontlik verband hou met die uitwaartse vervoer van die lipiedplaatjieaktiverende faktor (PAF). Daar is ook gerapporteer dat ABCB1 die vervoer van kortisol en deksametasoon bemiddel, maar nie van progesteroon in ABCB1-getransfekteerde selle nie. MDR1 kan ook cholesterol, kortketting- en langkettinganaloë van fosfatidielcholien (PC), fosfatidieletanolamien (PE), fosfatidielserien (PS), sfingomielen (SM) en glukosielseramied (GlcCer) vervoer. Multispesifieke vervoer van diverse endogene lipiede deur die MDR1-vervoerder kan moontlik die transtweelaagverspreiding van lipiede beïnvloed, in die besonder van spesies wat normaalweg oorheersend is op die binneste plasmamembraanblad soos PS en PE. [18]

Daar is meer onlangs getoon dat ABC-vervoerders binne die plasenta bestaan, wat aandui dat hulle 'n beskermende rol vir die ontwikkelende fetus teen xenobiotika kan speel. [20]

Alle ABC-vervoerproteïene deel 'n strukturele organisasie wat uit vier kerndomeine bestaan ​​[21]. Hierdie domeine bestaan ​​uit twee trans-membraan (T) domeine en twee sitosoliese (A) domeine. Die twee T-domeine wissel af tussen 'n inwaartse en uitwaartse oriëntasie, en die afwisseling word aangedryf deur die hidrolise van adenosientrifosfaat of ATP. ATP bind aan die A-subeenhede en dit word dan gehidroliseer om die afwisseling aan te dryf, maar die presiese proses waardeur dit gebeur is nie bekend nie. Die vier domeine kan teenwoordig wees in vier afsonderlike polipeptiede, wat meestal in bakterieë voorkom, of teenwoordig in een of twee multi-domein polipeptiede. [10] Wanneer die polipeptiede een domein is, kan daar na hulle verwys word as 'n volle domein, en wanneer hulle twee multi-domeine is, kan daar na hulle verwys word as 'n halwe domein. [9] Die T-domeine is elk gebou uit tipies 10 membraan-oorspan alfa-helikse, waardeur die vervoerde stof deur die plasmamembraan kan kruis. Die struktuur van die T-domeine bepaal ook die spesifisiteit van elke ABC-proteïen. In die konformasie wat na binne gerig is, is die bindingsplek op die A-domein direk oop vir die omliggende waterige oplossings. Dit laat hidrofiliese molekules toe om die bindingsplek direk vanaf die binneste pamflet van die fosfolipieddubbellaag binne te gaan. Daarbenewens is 'n gaping in die proteïen direk toeganklik vanaf die hidrofobiese kern van die binneste pamflet van die membraan dubbellaag. Dit laat hidrofobiese molekules toe om die bindingsplek direk vanaf die binneste pamflet van die fosfolipieddubbellaag binne te gaan. Nadat die ATP-aangedrewe na die uitwaartse konformasie beweeg het, word molekules van die bindingsplek vrygestel en toegelaat om in die eksoplasmiese pamflet of direk in die ekstrasellulêre medium te ontsnap. [10]

Die algemene kenmerk van alle ABC-vervoerders is dat hulle uit twee afsonderlike domeine bestaan, die transmembraandomein (TMD) en die nukleotied-bindende domein (NBD). Die TMD, ook bekend as membraan-omspannende domein (MSD) of integrale membraan (IM) domein, bestaan ​​uit alfa-helikse, ingebed in die membraan dubbellaag. Dit herken 'n verskeidenheid substrate en ondergaan konformasieveranderinge om die substraat oor die membraan te vervoer. Die volgorde en argitektuur van TMD's is veranderlik, wat die chemiese diversiteit van substrate wat getranslokeer kan word, weerspieël. Die NBD of ATP-bindende kasset (ABC) domein, aan die ander kant, is in die sitoplasma geleë en het 'n hoogs gekonserveerde volgorde. Die NBD is die plek vir ATP-binding. [22] In die meeste uitvoerders is die N-terminale transmembraandomein en die C-terminale ABC-domeine saamgesmelt as 'n enkele polipeptiedketting, gerangskik as TMD-NBD-TMD-NBD. 'n Voorbeeld is die E coli hemolisien uitvoerder HlyB. Invoerders het 'n omgekeerde organisasie, dit wil sê NBD-TMD-NBD-TMD, waar die ABC-domein N-terminaal is terwyl die TMD C-terminaal is, soos in die E coli MacB-proteïen verantwoordelik vir makroliedweerstand. [4] [5]

Die strukturele argitektuur van ABC-vervoerders bestaan ​​minimaal uit twee TMD's en twee NBD's. Vier individuele polipeptiedkettings insluitend twee TMD- en twee NBD-subeenhede, kan kombineer om 'n volle vervoerder soos in die E coli BtuCD [23] [24] invoerder betrokke by die opname van vitamien B12. Die meeste uitvoerders, soos in die multidwelm uitvoerder Sav1866 [25] van Staphylococcus aureus, bestaan ​​uit 'n homodimeer wat uit twee bestaan halwe vervoerders of monomere van 'n TMD wat aan 'n nukleotiedbindende domein (NBD) saamgesmelt is. 'n Volle vervoerder word dikwels benodig om funksionaliteit te verkry. Sommige ABC-vervoerders het bykomende elemente wat bydra tot die regulatoriese funksie van hierdie klas proteïene. Veral invoerders het 'n hoë affiniteit bindende proteïen (BP) wat spesifiek met die substraat in die periplasma assosieer vir aflewering aan die toepaslike ABC-vervoerder. Uitvoerders het nie die bindende proteïen nie, maar het 'n intrasellulêre domein (ICD) wat by die membraan-oorspanhelikse en die ABC-domein aansluit. Die OKD is glo verantwoordelik vir kommunikasie tussen die TMD en NBD. [22]

Transmembraandomein (TMD) Wysig

Die meeste vervoerders het transmembraandomeine wat bestaan ​​uit 'n totaal van 12 α-helikse met 6 α-helikse per monomeer. Aangesien TMD's struktureel uiteenlopend is, het sommige vervoerders 'n wisselende aantal helikse (tussen ses en elf). Die TM-domeine word in drie afsonderlike stelle voue gekategoriseer: tipe I ABC invoerder, tipe II ABC invoerder en ABC uitvoerder voue. Die klassifikasie van invoerdervoue is gebaseer op gedetailleerde karakterisering van die rye. [22]

Die tipe I ABC invoerdervou is oorspronklik waargeneem in die ModB TM subeenheid van die molibdaat vervoerder. [26] Hierdie diagnostiese vou kan ook gevind word in die MalF en MalG TM subeenhede van MalFGK2 [27] en die Met-vervoerder MetI. [28] In die MetI-vervoerder vorm 'n minimale stel van 5 transmembraanhelikse hierdie vou terwyl 'n bykomende heliks teenwoordig is vir beide ModB en MalG. Die algemene organisasie van die vou is die "op-af"-topologie van die TM2-5-helikse wat die translokasiebaan belyn en die TM1-heliks wat om die buitenste, membraan-gerigte oppervlak toegedraai is en met die ander TM-helikse in aanraking kom.

Die tipe II ABC invoerdervou word waargeneem in die twintig TM helix-domein van BtuCD [23] en in Hi1471, [29] 'n homoloë vervoerder van Haemophilus influenzae. In BtuCD is die verpakking van die helikse kompleks. Die merkbare patroon is dat die TM2-heliks deur die middel van die subeenheid geposisioneer is waar dit in die nabyheid deur die ander helikse omring word. Intussen is die TM5- en TM10-helikse in die TMD-koppelvlak geposisioneer. Die membraanstrekkende gebied van ABC-uitvoerders is georganiseer in twee "vlerke" wat saamgestel is uit helikse TM1 en TM2 van een subeenheid en TM3-6 van die ander, in 'n domein-omgeruilde rangskikking. 'n Prominente patroon is dat helices TM1-3 verwant is aan TM4-6 deur 'n benaderde tweevoudige rotasie om 'n as in die vlak van die membraan. [22]

Die uitvoerdervou word oorspronklik in die Sav1866-struktuur waargeneem. Dit bevat 12 TM-helikse, 6 per monomeer. [22]

Nukleotied-bindende domein (NBD) Edit

Die ABC-domein bestaan ​​uit twee domeine, die katalitiese kerndomein soortgelyk aan RecA-agtige motoriese ATPases en 'n kleiner, struktureel diverse α-heliese subdomein wat uniek is aan ABC-vervoerders. Die groter domein bestaan ​​tipies uit twee β-velle en ses α-helikse, waar die katalitiese Walker 'n Motief (GXXGXGKS/T waar X enige aminosuur is) of P-lus en Walker B-motief (ΦΦΦΦD, waarvan Φ 'n hidrofobiese oorblyfsel is) geleë is. Die heliese domein bestaan ​​uit drie of vier helikse en die ABC handtekening motief, ook bekend as LSGGQ-motief, koppelpeptied of C-motief. Die ABC-domein het ook 'n glutamienresidu wat in 'n buigsame lus geleë is Q lus, deksel of γ-fosfaatskakelaar, wat die TMD en ABC verbind. Daar word vermoed dat die Q-lus betrokke is by die interaksie van die NBD en TMD, veral in die koppeling van nukleotiedhidrolise aan die konformasieveranderinge van die TMD tydens substraattranslokasie. Die H-motief of skakelgebied bevat 'n hoogs gekonserveerde histidienresidu wat ook belangrik is in die interaksie van die ABC-domein met ATP. Die naam ATP-bindende kasset is afgelei van die diagnostiese rangskikking van die voue of motiewe van hierdie klas proteïene by vorming van die ATP-toebroodjie en ATP-hidrolise. [4] [15] [22]

ATP binding en hidrolise Edit

Dimervorming van die twee ABC-domeine van vervoerders vereis ATP-binding. [30] Daar word algemeen waargeneem dat die ATP-gebonde toestand geassosieer word met die mees uitgebreide koppelvlak tussen ABC-domeine, terwyl die strukture van nukleotiedvrye vervoerders konformasies vertoon met groter skeidings tussen die ABC-domeine. [22] Strukture van die ATP-gebonde toestand van geïsoleerde NBD's is aangemeld vir invoerders insluitend HisP, [31] GlcV, [32] MJ1267, [33] E coli MalK (E.c.MalK), [34] T. litoralis MalK (TlMalK), [35] en uitvoerders soos TAP, [36] HlyB, [37] MJ0796, [38] [39] Sav1866, [25] en MsbA. [40] In hierdie vervoerders is ATP aan die ABC-domein gebind. Twee molekules van ATP is geposisioneer by die koppelvlak van die dimeer, ingeklem tussen die Walker A-motief van een subeenheid en die LSGGQ-motief van die ander. [22] Dit is die eerste keer in Rad50 [41] waargeneem en gerapporteer in strukture van MJ0796, die NBD-subeenheid van die LolD-vervoerder vanaf Methanococcus jannaschii [39] en E.c.MalK van 'n maltose-vervoerder. [34] Hierdie strukture was ook in ooreenstemming met resultate van biochemiese studies wat aan die lig gebring het dat ATP in noue kontak is met residue in die P-lus en LSGGQ motief tydens katalise. [42]

Nukleotiedbinding word vereis om die elektrostatiese en/of strukturele integriteit van die aktiewe plek te verseker en by te dra tot die vorming van 'n aktiewe NBD-dimeer. [43] Binding van ATP word gestabiliseer deur die volgende interaksies: (1) ringstapeling-interaksie van 'n bewaarde aromatiese oorblyfsel wat die Walker A-motief en die adenosienring van ATP voorafgaan, [44] [45] (2) waterstofbindings tussen 'n bewaarde lisienresidu in die Walker A-motief en die suurstofatome van die β- en γ-fosfate van ATP en koördinasie van hierdie fosfate en sommige residue in die Walker A-motief met Mg 2+ ioon, [32] [36] en ( 3) γ-fosfaat-koördinasie met syketting van serien- en ruggraatamiedgroepe van glisienreste in die LSGGQ-motief. [46] Daarbenewens is 'n oorblyfsel wat die stywe koppeling van ATP-binding en dimerisasie voorstel, die bewaarde histidien in die H-lus. Hierdie histidien kontak residue oor die dimeer-koppelvlak in die Walker A-motief en die D-lus, 'n gekonserveerde volgorde wat die Walker B-motief volg. [34] [39] [41] [47]

Die ensiematiese hidrolise van ATP vereis behoorlike binding van die fosfate en posisionering van die γ-fosfaat aan die aanvallende water. [22] In die nukleotiedbindingsplek word die suurstofatome van die β- en γ-fosfate van ATP gestabiliseer deur residue in die Walker A-motief [48] [49] en koördineer met Mg 2+ . [22] Hierdie Mg 2+ ioon koördineer ook met die terminale aspartaatresidu in die Walker B-motief deur die aanvallende H2O.[32] [33] [38] 'n Algemene basis, wat die glutamaatresidu langs die Walker B-motief kan wees, [30] [39] [45] glutamien in die Q-lus, [29] [35] [39 ] of 'n histidien in die skakelarea wat 'n waterstofbinding met die γ-fosfaat van ATP vorm, word gevind om die tempo van ATP-hidrolise te kataliseer deur die aanvallende H te bevorder2O. [34] [35] [39] [47] Die presiese molekulêre meganisme van ATP-hidrolise is steeds omstrede. [4]

ABC-vervoerders is aktiewe vervoerders, dit wil sê, hulle gebruik energie in die vorm van adenosientrifosfaat (ATP) om substrate oor selmembrane te translokeer. Hierdie proteïene benut die energie van ATP-binding en/of hidrolise om konformasieveranderinge in die transmembraandomein (TMD) en gevolglik molekules vervoer. [50] ABC-invoerders en -uitvoerders het 'n gemeenskaplike meganisme vir die vervoer van substrate. Hulle is soortgelyk in hul strukture. Die model wat die konformasieveranderinge wat verband hou met die binding van die substraat beskryf, is die afwisselende-toegangsmodel. In hierdie model wissel die substraatbindingsplek af uiterlike- en inwaartse konformasies. Die relatiewe bindingsaffiniteite van die twee konformasies vir die substraat bepaal grootliks die netto rigting van vervoer. Vir invoerders, aangesien translokasie vanaf die periplasma na die sitoplasma gerig word, het die uitwaartse konformasie hoër bindingsaffiniteit vir die substraat. Daarteenoor is die substraatbindingsaffiniteit by uitvoerders groter in die inwaartse konformasie. [22] 'n Model wat die konformasieveranderinge in die nukleotied-bindende domein (NBD) as gevolg van ATP-binding en hidrolise is die ATP-skakelaar model. Hierdie model bied twee hoofkonformasies van die NBD's: vorming van 'n geslote dimeer by binding van twee ATP-molekules en dissosiasie na 'n oop dimeer wat deur ATP-hidrolise en vrystelling van anorganiese fosfaat gefasiliteer word (Pi) en adenosiendifosfaat (ADP). Omskakeling tussen die oop en geslote dimeer konformasies veroorsaak konformasie veranderinge in die TMD wat lei tot substraat translokasie. [51]

Die algemene meganisme vir die vervoersiklus van ABC-vervoerders is nie volledig toegelig nie, maar aansienlike strukturele en biochemiese data het opgehoop om 'n model te ondersteun waarin ATP-binding en hidrolise gekoppel is aan konformasieveranderinge in die vervoerder. Die rustende toestand van alle ABC-vervoerders het die NBD's in 'n oop dimeer-konfigurasie, met 'n lae affiniteit vir ATP. Hierdie oop bouvorm beskik oor 'n kamer wat toeganklik is vir die binnekant van die vervoerder. Die vervoersiklus word geïnisieer deur binding van substraat aan die hoë-affiniteitsplek op die TMD's, wat konformasieveranderinge in die NBD's induseer en die binding van ATP verhoog. Twee molekules ATP bind saam om die geslote dimeer-konfigurasie te vorm. Die geslote NBD-dimeer veroorsaak 'n konformasieverandering in die TMD's sodat die TMD oopmaak en 'n kamer vorm met 'n opening teenoor dié van die aanvanklike toestand. Die affiniteit van die substraat tot die TMD word verminder, waardeur die substraat vrygestel word. Hidrolise van ATP volg en dan opeenvolgende vrystelling van Pi en dan herstel ADP die vervoerder na sy basale konfigurasie. Alhoewel 'n algemene meganisme voorgestel is, word die volgorde van substraatbinding, nukleotiedbinding en hidrolise, en konformasieveranderinge, sowel as interaksies tussen die domeine steeds gedebatteer. [4] [15] [18] [22] [40] [43] [50] [51] [52] [53] [54]

Verskeie groepe wat ABC-vervoerders bestudeer, het verskillende aannames oor die dryfkrag van vervoerderfunksie. Daar word algemeen aanvaar dat ATP-hidrolise die belangrikste energie-inset of "kragslag" vir vervoer verskaf en dat die NBD's afwisselend werk en moontlik by verskillende stappe in die vervoersiklus betrokke is. [55] Onlangse strukturele en biochemiese data toon egter dat ATP-binding, eerder as ATP-hidrolise, die "kragslag" verskaf. [56] Dit kan ook wees dat aangesien ATP-binding NBD-dimerisasie veroorsaak, die vorming van die dimeer die "kragslag" kan verteenwoordig. Daarbenewens het sommige vervoerders NBD's wat nie soortgelyke vermoëns het om ATP te bind en te hidroliseer nie en dat die koppelvlak van die NBD-dimeer uit twee ATP-bindingsvakke bestaan, dui op 'n samelopende funksie van die twee NBD's in die vervoersiklus. [51]

Sommige bewyse om te wys dat ATP-binding inderdaad die kragslag van die vervoersiklus is, is aangemeld. [51] Daar is getoon dat ATP-binding veranderinge in die substraatbindende eienskappe van die TMD's veroorsaak. Die affiniteit van ABC-vervoerders vir substrate was moeilik om direk te meet, en indirekte metings, byvoorbeeld deur stimulering van ATPase-aktiwiteit, weerspieël dikwels ander tempo-beperkende stappe. Onlangs het direkte meting van vinblastienbinding aan permease-glikoproteïen (P-glikoproteïen) in die teenwoordigheid van niehidroliseerbare ATP-analoë, bv. 5'-adenieliel-β-γ-imidodifosfaat (AMP-PNP), het getoon dat ATP-binding, in die afwesigheid van hidrolise, voldoende is om substraatbindingsaffiniteit te verminder. [57] ATP-binding veroorsaak ook aansienlike konformasieveranderinge in die TMD's. Spektroskopiese, protease-toeganklikheid- en kruisbindingstudies het getoon dat ATP-binding aan die NBD's konformasieveranderinge in multigeneesmiddelweerstand-geassosieerde proteïen-1 (MRP1), [58] HisPMQ, [59] LmrA, [60] en Pgp veroorsaak. [61] Tweedimensionele kristalstrukture van AMP-PNP-gebonde Pgp het getoon dat die groot konformasieverandering tydens die vervoersiklus plaasvind met ATP-binding en dat daaropvolgende ATP-hidrolise meer beperkte veranderinge inbring. [62] Rotasie en kanteling van transmembraan α-helikse kan beide bydra tot hierdie konformasie veranderinge. Ander studies het daarop gefokus om te bevestig dat ATP-binding NBD geslote dimeer vorming induseer. Biochemiese studies van ongeskonde vervoerkomplekse dui daarop dat die konformasieveranderinge in die NBD's relatief klein is. In die afwesigheid van ATP kan die NBD'e relatief buigsaam wees, maar dit behels nie 'n groot heroriëntasie van die NBD's met betrekking tot die ander domeine nie. ATP-binding veroorsaak 'n rigiede liggaamsrotasie van die twee ABC-subdomeine met betrekking tot mekaar, wat die behoorlike belyning van die nukleotied in die aktiewe plek en interaksie met die aangewese motiewe moontlik maak. Daar is sterk biochemiese bewyse dat binding van twee ATP-molekules saamwerk kan wees, dit wil sê, ATP moet aan die twee aktiewe plek-sakke bind voordat die NBD's kan dimeriseer en die geslote, katalities aktiewe konformasie vorm. [51]

Die meeste ABC-vervoerders wat die opname van voedingstowwe en ander molekules in bakterieë bemiddel, maak staat op 'n hoë-affiniteit opgeloste bindingsproteïen (BP). BP's is oplosbare proteïene geleë in die periplasmiese ruimte tussen die binne- en buitenste membrane van gram-negatiewe bakterieë. Gram-positiewe mikroörganismes het nie 'n periplasma sodanig dat hul bindende proteïen dikwels 'n lipoproteïen is wat aan die buitekant van die selmembraan gebind is. Sommige gram-positiewe bakterieë het BP's wat saamgesmelt is met die transmembraandomein van die vervoerder self. [4] Die eerste suksesvolle x-straal kristalstruktuur van 'n ongeskonde ABC invoerder is die molibdeen vervoerder (ModBC-A) van Archaeoglobus fulgidus. [26] Atoomresolusiestrukture van drie ander bakteriese invoerders, E coli BtuCD, [23] E coli maltose vervoerder (MalFGK2-E), [27] en die vermeende metaal-chelaat vervoerder van Haemophilus influenzae, HI1470/1, [29] is ook bepaal. Die strukture het gedetailleerde beelde verskaf van die interaksie van die transmembraan- en ABC-domeine, asook twee verskillende konformasies met 'n opening in twee teenoorgestelde rigtings geopenbaar. Nog 'n algemene kenmerk van invoerders is dat elke NBD aan een TMD gebind is hoofsaaklik deur 'n kort sitoplasmiese heliks van die TMD, die "koppelingsheliks". Hierdie gedeelte van die EAA-lus dok in 'n oppervlakspleet wat tussen die RecA-agtige en heliese ABC-subdomeine gevorm word en lê ongeveer parallel aan die membraan-dubbellaag. [53]

Groot ABC invoerders Wysig

Die BtuCD en HI1470/1 word as groot (Tipe II) ABC-invoerders geklassifiseer. Die transmembraan subeenheid van die vitamien B12 invoerder, BtuCD, bevat 10 TM-helikse en die funksionele eenheid bestaan ​​uit twee kopieë elk van die nukleotiedbindingsdomein (NBD) en transmembraandomein (TMD). Die TMD en NBD interaksie met mekaar via die sitoplasmiese lus tussen twee TM-helikse en die Q-lus in die ABC. In die afwesigheid van nukleotied word die twee ABC-domeine gevou en die dimeer-koppelvlak is oop. 'n Vergelyking van die strukture met (BtuCDF) en sonder (BtuCD) bindende proteïen toon dat BtuCD 'n opening het wat na die periplasma kyk, terwyl in BtuCDF die uitwaartse konformasie aan beide kante van die membraan gesluit is. Die strukture van BtuCD en die BtuCD homoloog, HI1470/1, verteenwoordig twee verskillende konformasietoestande van 'n ABC-vervoerder. Die voorspelde translokasiepad in BtuCD is oop vir die periplasma en gesluit aan die sitoplasmiese kant van die membraan terwyl dié van HI1470/1 die teenoorgestelde rigting wys en slegs oop is vir die sitoplasma. Die verskil in die strukture is 'n 9°-draai van een TM-subeenheid relatief tot die ander. [4] [22] [53]

Klein ABC invoerders Wysig

Strukture van die ModBC-A en MalFGK2-E, wat in kompleks is met hul bindende proteïen, stem ooreen met klein (Tipe I) ABC invoerders. Die TMD's van ModBC-A en MalFGK2-E het slegs ses helikse per subeenheid. Die homodimeer van ModBC-A is in 'n konformasie waarin die TM subeenhede (ModB) oriënteer in 'n omgekeerde V-vorm met 'n holte wat toeganklik is vir die sitoplasma. Die ABC-subeenhede (ModC), aan die ander kant, is gerangskik in 'n oop, nukleotiedvrye konformasie, waarin die P-lus van een subeenheid na die ander subeenheid kyk, maar los is van die LSGGQ-motief van die ander. Die bindende proteïen ModA is in 'n geslote konformasie met substraat gebind in 'n spleet tussen sy twee lobbe en geheg aan die ekstrasellulêre lusse van ModB, waarin die substraat direk bo die geslote ingang van die vervoerder sit. Die MalFGK2-E-struktuur lyk soos die katalitiese oorgangstoestand vir ATP-hidrolise. Dit is in 'n geslote konformasie waar dit twee ATP-molekules bevat, ingeklem tussen die Walker A- en B-motiewe van een subeenheid en die LSGGQ-motief van die ander subeenheid. Die maltose-bindende proteïen (MBP of MalE) is vasgemaak aan die periplasmiese kant van die TM subeenhede (MalF en MalG) en 'n groot, afgeslote holte kan gevind word by die koppelvlak van MalF en MalG. Die rangskikking van die TM-helikse is in 'n konformasie wat gesluit is na die sitoplasma, maar met 'n opening wat na buite kyk. Die struktuur dui op 'n moontlikheid dat MBP die ATPase-aktiwiteit van die vervoerder kan stimuleer by binding. [4] [22] [53]

Meganisme van vervoer vir invoerders Edit

Die vervoermeganisme vir invoerders ondersteun die afwisselende toegangsmodel. Die rustoestand van invoerders is na binne gerig, waar die nukleotiedbindingsdomein (NBD) dimeer-koppelvlak deur die TMD's oopgehou word en na buite kyk, maar van die sitoplasma afgesluit word. Wanneer die geslote, substraat-gelaaide bindingsproteïen na die periplasmiese kant van die transmembraandomeine vasgemaak word, bind ATP en sluit die NBD-dimeer. Dit skakel die rustende toestand van vervoerder oor na 'n uitwaartse konformasie, waarin die TMD's heroriënteer het om substraat van die bindende proteïen te ontvang. Na hidrolise van ATP gaan die NBD-dimeer oop en substraat word in die sitoplasma vrygestel. Vrystelling van ADP en Pi bring die vervoerder terug in sy rustende toestand. Die enigste inkonsekwentheid van hierdie meganisme met die ATP-skakelaarmodel is dat die konformasie in sy rustende, nukleotiedvrye toestand verskil van die verwagte uitwaartse konformasie. Alhoewel dit die geval is, is die sleutelpunt dat die NBD nie dimeriseer nie, tensy ATP en bindende proteïen aan die vervoerder gebind is. [4] [15] [22] [51] [53]

Prokariotiese ABC-uitvoerders is volop en het noue homoloë in eukariote. Hierdie klas vervoerders word bestudeer op grond van die tipe substraat wat vervoer word. Een klas is betrokke by die proteïen (bv. toksiene, hidrolitiese ensieme, S-laag proteïene, lantibiotika, bakteriosiene en bevoegdheidsfaktore) uitvoer en die ander by dwelm uitvloei. ABC-vervoerders het uitgebreide aandag gekry omdat hulle bydra tot die weerstand van selle teen antibiotika en kankermiddels deur middels uit die selle te pomp. [1] [63] [4] 'n Algemene meganisme is die ooruitdrukking van ABC-uitvoerders soos P-glikoproteïen (P-gp/ABCB1), multigeneesmiddelweerstand-geassosieerde proteïen 1 (MRP1/ABCC1), en borskankerweerstandproteïen (BCRP/ ABCG2) in kankerselle wat die blootstelling aan antikankermiddels beperk. [64]

In gram-negatiewe organismes bemiddel ABC-vervoerders afskeiding van proteïensubstrate oor binne- en buitemembrane gelyktydig sonder om deur die periplasma te gaan. Hierdie tipe afskeiding word na verwys as tipe I afskeiding, wat drie komponente behels wat saam funksioneer: an ABC uitvoerder, a membraanfusieproteïen (MFP), en 'n buitenste membraanfaktor (OMF). 'n Voorbeeld is die afskeiding van hemolisien (HlyA) vanaf E coli waar die binnemembraan-ABC-vervoerder HlyB interaksie het met 'n binnemembraanfusieproteïen HlyD en 'n buitenste membraanfasiliteerder TolC. TolC laat hemolisien toe om oor die twee membrane te vervoer, wat die periplasma omseil. [1] [63] [15]

Bakteriese middelweerstand het 'n toenemend groot gesondheidsprobleem geword. Een van die meganismes vir geneesmiddelweerstand word geassosieer met 'n toename in antibiotika-uitvloei uit die bakteriese sel. Geneesmiddelweerstand geassosieer met geneesmiddeluitvloei, bemiddel deur P-glikoproteïen, is oorspronklik in soogdierselle aangemeld. In bakterieë het Levy en kollegas die eerste bewyse gelewer dat antibiotika weerstand veroorsaak is deur aktiewe uitvloei van 'n geneesmiddel. [65] P-glikoproteïen is die beste bestudeerde uitvloeipomp en het as sodanig belangrike insigte in die meganisme van bakteriese pompe gebied. [4] Alhoewel sommige uitvoerders 'n spesifieke tipe substraat vervoer, ekstrudeer die meeste vervoerders 'n diverse klas dwelms met verskillende struktuur. [18] Hierdie vervoerders word algemeen genoem multi-dwelm weerstandige (MDR) ABC vervoerders en soms na verwys as "hidrofobiese stofsuiers". [54]

Menslike ABCB1/MDR1 P-glikoproteïen Edit

P-glikoproteïen (3.A.1.201.1) is 'n goed bestudeerde proteïen wat geassosieer word met multi-geneesmiddel weerstand. Dit behoort aan die mens ABCB (MDR/TAP) familie en staan ​​ook bekend as ABCB1 of MDR1 Bl. MDR1 bestaan ​​uit 'n funksionele monomeer met twee transmembraandomeine (TMD) en twee nukleotiedbindende domeine (NBD). Hierdie proteïen kan hoofsaaklik kationiese of elektries neutrale substrate vervoer asook 'n breë spektrum van amfifiele substrate. Die struktuur van die volgrootte ABCB1-monomeer is verkry in die teenwoordigheid en afwesigheid van nukleotied met behulp van elektronkriokristallografie. Sonder die nukleotied is die TMD's ongeveer parallel en vorm 'n loop wat 'n sentrale porie omring, met die opening wat na die ekstrasellulêre kant van die membraan wys en by die intrasellulêre gesig toegemaak is. In die teenwoordigheid van die niehidroliseerbare ATP-analoog, AMP-PNP, het die TMD's 'n aansienlike herorganisasie met drie duidelik gesegregeerde domeine. 'n Sentrale porie, wat tussen die TMD's ingesluit is, is effens oop na die intrasellulêre gesig met 'n gaping tussen twee domeine wat toegang tot substraat vanaf die lipiedfase moontlik maak. Aansienlike herverpakking en moontlike rotasie van die TM-helikse na nukleotiedbinding dui op 'n heliksrotasiemodel vir die vervoermeganisme. [18]

Plantvervoerders Edit

Die genoom van die modelplant Arabidopsis thaliana is in staat om 120 ABC-proteïene te kodeer in vergelyking met 50-70 ABC-proteïene wat deur die menslike genoom en vrugtevlieë gekodeer word (Drosophila melanogaster). Plant-ABC-proteïene word in 13 subfamilies gekategoriseer op grond van grootte (vol, half of kwart), oriëntasie en algehele aminosuurvolgorde-ooreenkoms. [66] Multigeneesmiddelweerstandige (MDR) homoloë, ook bekend as P-glikoproteïene, verteenwoordig die grootste subfamilie in plante met 22 lede en die tweede grootste algehele ABC subfamilie. Die B-subfamilie van plant-ABC-vervoerders (ABCB's) word gekenmerk deur hul lokalisering na die plasmamembraan. [67] Plant ABCB vervoerders word gekenmerk deur hulle heteroloog uit te druk in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe (splytingsgis), en HeLa-selle om substraatspesifisiteit te bepaal. Plant ABCB-vervoerders het getoon dat hulle die fitohormoon indool-3-asynsuur (IAA), [68] ook bekend as ouksien, die noodsaaklike reguleerder vir plantgroei en -ontwikkeling, vervoer. [69] [70] Die rigtinggewende polêre vervoer van ouksien bemiddel plantomgewingsreaksies deur prosesse soos fototropisme en gravitropisme. [71] Twee van die beste bestudeerde ouksienvervoerders, ABCB1 en ABCB19, is gekenmerk as primêre ouksienuitvoerders [69] Ander ABCB-vervoerders soos ABCB4 neem deel aan beide die uitvoer en invoer van ouksien [69] By lae intrasellulêre ouksienkonsentrasies ABCB4 voer ouksien in totdat dit 'n sekere drempel bereik wat dan funksie omkeer om slegs ouksien uit te voer. [69] [72]

Sav1866 Wysig

Die eerste hoë-resolusiestruktuur wat vir 'n ABC-uitvoerder aangemeld is, was dié van Sav1866 (3.A.1.106.2) vanaf Staphylococcus aureus. [18] [73] Sav1866 is 'n homoloog van multigeneesmiddel ABC-vervoerders. Dit toon beduidende volgorde-ooreenkoms met menslike ABC-vervoerders van subfamilie B wat MDR1 en TAP1/TAP2 insluit. Dit is bekend dat die ATPase-aktiwiteit van Sav1866 gestimuleer word deur kankermedisyne soos doksorubisien, vinblastien en ander, [74] wat soortgelyke substraatspesifisiteit as P-glikoproteïen voorstel en dus 'n moontlike algemene meganisme van substraattranslokasie. Sav1866 is 'n homodimeer van halwe vervoerders, en elke subeenheid bevat 'n N-terminale TMD met ses helikse en 'n C-terminale NBD. Die NBD's is soortgelyk in struktuur aan dié van ander ABC-vervoerders, waarin die twee ATP-bindingsplekke by die dimeer-koppelvlak tussen die Walker A-motief van een NBD en die LSGGQ-motief van die ander gevorm word. Die ADP-gebonde struktuur van Sav1866 toon die NBD's in 'n geslote dimeer en die TM-helikse verdeel in twee "vlerke" wat na die periplasma georiënteer is, wat die uitwaartse konformasie vorm. Elke vlerk bestaan ​​uit helikse TM1-2 van een subeenheid en TM3-6 van die ander subeenheid. Dit bevat lang intrasellulêre lusse (ICL's of ICD) wat die TMD's verbind wat verby die lipieddubbellaag in die sitoplasma strek en in wisselwerking met die 8=D is. Terwyl die invoerders 'n kort koppelingsheliks bevat wat 'n enkele NBD kontak, het Sav1866 twee intrasellulêre koppelingsheliks, een (ICL1) wat die NBD's van beide subeenhede kontak en die ander (ICL2) wat slegs met die teenoorgestelde NBD-subeenheid in wisselwerking tree. [22] [25] [53]

MsbA wysig

MsbA (3.A.1.106.1) is 'n multi-middel-weerstandige (MDR) ABC-vervoerder en moontlik 'n lipied flippase.Dit is 'n ATPase wat lipied A vervoer, die hidrofobiese deel van lipopolisakkaried (LPS), 'n glukosamien-gebaseerde sakkarolipied wat die buitenste monolaag van die buitenste membrane van die meeste gram-negatiewe bakterieë uitmaak. Lipied A is 'n endotoksien en dus lei verlies van MsbA vanaf die selmembraan of mutasies wat vervoer versteur tot die ophoping van lipied A in die binneste selmembraan wat lei tot seldood. Dit is 'n noue bakteriële homoloog van P-glikoproteïen (Pgp) deur proteïenvolgorde homologie en het oorvleuelende substraat spesifisiteite met die MDR-ABC vervoerder LmrA vanaf Lactococcus lactis. [75] MsbA van E coli is 36% identies aan die NH2-terminale helfte van menslike MDR1, wat 'n algemene meganisme vir vervoer van amfifatiese en hidrofobiese substrate voorstel. Die MsbA-geen kodeer vir 'n halwe vervoerder wat 'n transmembraandomein (TMD) bevat wat met 'n nukleotiedbindende domein (NBD) saamgesmelt is. Dit word saamgestel as 'n homodimeer met 'n totale molekulêre massa van 129,2 kD. MsbA bevat 6 TMD's aan die periplasmiese kant, 'n NBD geleë aan die sitoplasmiese kant van die selmembraan, en 'n intrasellulêre domein (ICD), wat die TMD en NBD oorbrug. Hierdie bewaarde heliks wat strek vanaf die TMD-segmente in of naby die aktiewe plek van die NBD is grootliks verantwoordelik vir oorspraak tussen TMD en NBD. In die besonder dien ICD1 as 'n bewaarde spilpunt waaroor die NBD kan roteer, wat dus die NBD toelaat om te disassosieer en te dimeriseer tydens ATP-binding en hidrolise. [4] [15] [18] [22] [43] [53] [54] [76]

Voorheen gepubliseerde (en nou teruggetrek) X-straalstrukture van MsbA was nie in ooreenstemming met die bakteriese homoloog Sav1866 nie. [77] [78] Die strukture is herondersoek en gevind dat daar 'n fout was in die toewysing van die hand wat lei tot verkeerde modelle van MsbA. Onlangs is die foute reggestel en nuwe strukture is aangemeld. [40] Die rustende toestand van E coli MsbA vertoon 'n omgekeerde "V"-vorm met 'n kamer wat toeganklik is vir die binnekant van die vervoerder wat 'n oop, na binne gerigte bouvorm. Die dimeer kontakte is gekonsentreer tussen die ekstrasellulêre lusse en terwyl die NBD's ≈50Å uitmekaar is, is die subeenhede na mekaar toe. Die afstand tussen die oorblyfsels in die terrein van die dimeer-koppelvlak is geverifieer deur kruiskoppelingseksperimente [79] en EPR-spektroskopiestudies. [80] Die relatief groot kamer laat dit toe om groot kopgroepe te akkommodeer soos dié wat in lipied A voorkom. Beduidende konformasieveranderinge is nodig om die groot suikerkopgroepe oor die membraan te beweeg. Die verskil tussen die twee nukleotiedvrye (apo) strukture is die ≈30° spilpunt van TM4/TM5-helikse relatief tot die TM3/TM6-helikse. In die geslote apo-staat (vanaf V. cholerae MsbA), is die NBD's in lyn en alhoewel nader, het dit nie 'n ATP-toebroodjie gevorm nie, en die P-lusse van opponerende monomere is langs mekaar geplaas. In vergelyking met die oop konformasie, is die dimeer-koppelvlak van die TMD's in die geslote, na binne gerigte bouvorm het uitgebreide kontakte. Vir beide apo-konformasies van MsbA wys die kameropening na binne. Die struktuur van MsbA-AMP-PNP (5'-adenieliel-β-γ-imidodifosfaat), verkry vanaf S. typhimurium, is soortgelyk aan Sav1866. Die NBD's hierin nukleotiedgebonde, na buite gerigte konformasie, kom bymekaar om 'n kanoniese ATP dimeer toebroodjie te vorm, dit wil sê, die nukleotied is tussen die P-lus en LSGGQ motief geleë. Die konformasie-oorgang van MsbA-geslote-apo na MsbA-AMP-PNP behels twee stappe, wat meer waarskynlik saamgestel is: 'n ≈10° spilpunt van TM4/TM5-helikse na TM3/TM6, wat die NBD's nader bring, maar nie in belyning nie, gevolg deur kanteling van TM4/TM5-helikse ≈20° uit die vlak. Die draaibeweging lei tot die skeiding van TM3/TM6-helikse weg van TM1/TM2 wat lei tot 'n verandering van 'n inwaartse na 'n uitwaartse konformasie. Dus, veranderinge in beide die oriëntasie en spasiëring van die NBD's herrangskik die pakking van transmembraanhelikse dramaties en skakel effektief toegang tot die kamer van die binneste na die buitenste pamflet van die membraan oor. [40] Die strukture wat vir MsbA bepaal is, is basis vir die kantelmodel van vervoer. [18] Die strukture wat beskryf word beklemtoon ook die dinamiese aard van ABC-uitvoerders soos ook voorgestel deur fluoressensie- en EPR-studies. [53] [80] [81] Onlangse werk het gelei tot die ontdekking van MsbA-inhibeerders. [82] [83]

Meganisme van vervoer vir uitvoerders Edit

ABC-uitvoerders het 'n vervoermeganisme wat ooreenstem met beide die alternatiewe-toegangsmodel en ATP-skakelaarmodel. In die apo-state van uitvoerders is die bouvorm na binne gerig en die TMD's en NBD's is relatief ver uitmekaar om amfifiliese of hidrofobiese substrate te akkommodeer. Vir MsbA, veral, is die grootte van die kamer groot genoeg om die suikergroepe van lipopolisakkariede (LPS) te akkommodeer. Soos deur verskeie groepe voorgestel is, begin binding van substraat die vervoersiklus. Die "kragslag", dit wil sê ATP-binding wat NBD-dimerisasie en vorming van die ATP-toebroodjie veroorsaak, dryf die konformasieveranderinge in die TMD's aan. In MsbA word die suikerkopgroepe tydens die "kragslag" binne die kamer gesekwestreer. Die holte is uitgevoer met gelaaide en polêre residue wat waarskynlik gesolvateer is, wat 'n energeties ongunstige omgewing skep vir hidrofobiese substrate en energeties gunstig is vir polêre dele in amfifiliese verbindings of suikergroepe van LPS. Aangesien die lipied nie vir 'n lang tyd in die kameromgewing stabiel kan wees nie, kan lipied A en ander hidrofobiese molekules in 'n energeties gunstiger posisie binne die buitenste membraanblad "omdraai". Die "flipping" kan ook gedryf word deur die rigiede-liggaamskeer van die TMD's terwyl die hidrofobiese sterte van die LPS deur die lipied-dubbellaag gesleep word. Herverpakking van die helikse skakel die konformasie oor na 'n uitwaartse toestand. ATP-hidrolise kan die periplasmiese opening verbreed en die substraat na die buitenste blaar van die lipieddubbellaag stoot. Hidrolise van die tweede ATP-molekule en vrystelling van Pi skei die NBD's gevolg deur herstel van die rustende toestand, wat die kamer na die sitoplasma oopmaak vir nog 'n siklus. [40] [43] [51] [54] [77] [78] [80] [84]

Dit is bekend dat ABC-vervoerders 'n deurslaggewende rol speel in die ontwikkeling van multigeneesmiddelweerstand (MDR). In MDR ontwikkel pasiënte wat medikasie neem uiteindelik weerstand teen nie net die middel wat hulle neem nie, maar ook teen verskeie verskillende soorte medisyne. Dit word veroorsaak deur verskeie faktore, waarvan een verhoogde uitsetting van die middel uit die sel deur ABC-vervoerders is. Byvoorbeeld, die ABCB1-proteïen (P-glikoproteïen) funksioneer in die pomp van gewasonderdrukkingsmiddels uit die sel. Pgp ook genoem MDR1, ABCB1, is die prototipe van ABC-vervoerders en ook die geen wat die meeste bestudeer is. Dit is bekend dat Pgp organiese kationiese of neutrale verbindings vervoer. Daar is ook bewys dat 'n paar ABCC-familielede, ook bekend as MRP, MDR aan organiese anioonverbindings verleen. Die lid wat die meeste bestudeer is in die ABCG-familie is ABCG2, ook bekend as BCRP (borskankerweerstandsproteïen) wat weerstand bied teen die meeste van Topoisomerase I of II inhibeerders soos topotecan, irinotecan en doxorubicin.

Dit is onduidelik presies hoe hierdie proteïene so 'n wye verskeidenheid geneesmiddels kan translokeer, maar een model (die hidrofobiese stofsuiermodel) sê dat, in P-glikoproteïen, die middels onoordeelkundig vanaf die lipiedfase gebind word op grond van hul hidrofobisiteit.

Die ontdekking van die eerste eukariotiese ABC-vervoerderproteïen het gekom uit studies oor tumorselle en gekweekte selle wat weerstand teen verskeie middels met onverwante chemiese strukture getoon het. Daar is getoon dat hierdie selle verhoogde vlakke van multigeneesmiddelweerstandigheid (MDR) vervoerproteïen uitdruk wat oorspronklik P-glikoproteïen (P-gp) genoem is, maar dit word ook na verwys as multigeneesmiddelweerstandproteïen 1 (MDR1) of ABCB1. Hierdie proteïen gebruik ATP-hidrolise, net soos die ander ABC-vervoerders, om 'n groot verskeidenheid geneesmiddels vanaf die sitosol na die ekstrasellulêre medium uit te voer. In multimiddel-weerstandige selle word die MDR1-geen gereeld geamplifiseer. Dit lei tot 'n groot oorproduksie van die MDR1-proteïen. Die substrate van soogdier ABCB1 is hoofsaaklik planêre, lipiedoplosbare molekules met een of meer positiewe ladings. Al hierdie substrate kompeteer met mekaar vir vervoer, wat daarop dui dat hulle aan dieselfde of oorvleuelende plekke op die proteïen bind. Baie van die middels wat deur ABCB1 vervoer word, is klein, nie-polêre middels wat oor die ekstrasellulêre medium in die sitosol diffundeer, waar hulle verskeie sellulêre funksies blokkeer. Middels soos kolgisien en vinblastien, wat die samestelling van mikrotubuli blokkeer, gaan vrylik deur die membraan in die sitosol, maar die uitvoer van hierdie middels deur ABCB1 verminder hul konsentrasie in die sel. Daarom neem dit 'n hoër konsentrasie van die middels wat nodig is om die selle dood te maak wat ABCB1 uitdruk as dié wat nie die geen uitdruk nie. [10]

Ander ABC-vervoerders wat bydra tot multigeneesmiddelweerstand is ABCC1 (MRP1) en ABCG2 (borskankerweerstandproteïen). [85]

Om die probleme wat verband hou met multidwelmweerstand deur MDR1 op te los, kan verskillende tipes middels gebruik word of die ABC-vervoerders self moet geïnhibeer word. Vir ander soorte medisyne om te werk, moet hulle die weerstandsmeganisme, wat die ABC-vervoerder is, omseil. Om dit te doen kan ander teenkankermiddels gebruik word soos alkielerende middels (siklofosfamied), antimetaboliete (5-fluorouracil), en die antrasiklien-gemodifiseerde middels (annamisien en doksorubisien-peptied). Hierdie middels sal nie as 'n substraat van ABC-vervoerders funksioneer nie, en sal dus nie vervoer word nie. Die ander opsie is om 'n kombinasie van ABC-remmende middels en die antikankermiddels terselfdertyd te gebruik. Dit sou die weerstand teen die antikankermiddels omkeer sodat dit kan funksioneer soos bedoel. Die substrate wat die weerstand teen kankermiddels omkeer, word chemosensitiseerders genoem. [8]

Geneesmiddelweerstand is 'n algemene kliniese probleem wat voorkom by pasiënte wat aan aansteeklike siektes ly en by pasiënte wat aan kanker ly. Daar word dikwels gevind dat prokariotiese en eukariotiese mikroörganismes sowel as neoplastiese selle bestand is teen middels. MDR word dikwels geassosieer met ooruitdrukking van ABC-vervoerders. Inhibisie van ABC-vervoerders deur lae-molekulêre gewig verbindings is omvattend ondersoek in kankerpasiënte, maar die kliniese resultate was teleurstellend. Onlangs is verskeie RNAi-strategieë toegepas om MDR in verskillende tumormodelle om te keer en hierdie tegnologie is effektief om ABC-vervoerder-gemedieerde MDR in kankerselle om te keer en is dus 'n belowende strategie om MDR deur geenterapeutiese toepassings te oorkom. RNAi-tegnologie kan ook oorweeg word om MDR te oorkom in aansteeklike siektes wat deur mikrobiese patogene veroorsaak word. [86]

Benewens die toekenning van MDR in tumorselle, word ABC-vervoerders ook uitgedruk in die membrane van gesonde selle, waar dit die vervoer van verskeie endogene stowwe, sowel as van stowwe wat vreemd is aan die liggaam, fasiliteer. Byvoorbeeld, ABC-vervoerders soos Pgp, die MRP's en BCRP beperk die absorpsie van baie middels uit die ingewande, en pomp dwelms vanaf die lewerselle na die gal [87] as 'n manier om vreemde stowwe uit die liggaam te verwyder. 'n Groot aantal dwelms word óf deur ABC-vervoerders self vervoer óf beïnvloed die vervoer van ander dwelms. Laasgenoemde scenario kan lei tot dwelm-middel-interaksies, [88] wat soms lei tot veranderde effekte van die middels. [89]

Daar is 'n aantal toetstipes wat die opsporing van ABC-vervoerderinteraksies met endogene en xenobiotiese verbindings moontlik maak. [90] Die kompleksiteit van die toets wissel van relatief eenvoudige membraantoetse. [91] soos vesikulêre vervoertoets, ATPase-toets tot meer komplekse selgebaseerde toetse tot ingewikkelde in vivo Jeffrey P, Summerfield SG (2007). "Uitdagings vir bloed-breinversperring (BBB) ​​sifting". Xenobiotika. 37 (10–11): 1135–51. doi:10.1080/00498250701570285. PMID 17968740. S2CID 25944548. opsporingsmetodologieë. [92]

Membraantoetse Edit

Die vesikulêre vervoertoets bespeur die translokasie van molekules deur ABC-vervoerders. [93] Membrane wat onder geskikte toestande voorberei is, bevat binne-buite-georiënteerde vesikels met die ATP-bindingsplek en substraatbindingsplek van die vervoerder wat na die buffer na buite kyk. Substrate van die vervoerder word op 'n ATP-afhanklike wyse in die vesikels opgeneem. Vinnige filtrasie met behulp van glasveselfilters of nitrosellulosemembrane word gebruik om die vesikels van die inkubasieoplossing te skei en die toetsverbinding wat binne-in die vesikels vasgevang is, word op die filter behou. Die hoeveelheid vervoerde ongemerkte molekules word bepaal deur HPLC, LC/MS, LC/MS/MS. Alternatiewelik is die verbindings radio-gemerk, fluoresserend of het 'n fluoresserende merker sodat die radioaktiwiteit of fluoressensie wat op die filter behoue ​​bly, gekwantifiseer kan word.

Verskeie tipes membrane van verskillende bronne (bv. insekselle, getransfekteerde of geselekteerde soogdiersellyne) word in vesikulêre vervoerstudies gebruik. Membrane is kommersieel beskikbaar of kan van verskeie selle of selfs weefsels voorberei word bv. lewer kanalikulêre membrane. Hierdie tipe toets het die voordeel dat dit die werklike ligging van die substraat oor die selmembraan meet. Die nadeel daarvan is dat verbindings met medium-tot-hoë passiewe deurlaatbaarheid nie binne die vesikels behoue ​​bly nie, wat direkte vervoermetings met hierdie klas verbindings moeilik maak om uit te voer.

Die vesikulêre vervoertoets kan uitgevoer word in 'n "indirekte" omgewing, waar interaksie toetsmedisyne die vervoertempo van 'n verslaggewerverbinding moduleer. Hierdie toetstipe is veral geskik vir die opsporing van moontlike geneesmiddel-middel-interaksies en geneesmiddel-endogene substraat-interaksies. Dit is nie sensitief vir die passiewe deurlaatbaarheid van die verbindings nie en bespeur dus alle interaksieverbindings. Tog verskaf dit nie inligting oor of die verbinding wat getoets is 'n inhibeerder van die vervoerder is, of 'n substraat van die vervoerder wat sy funksie op 'n mededingende wyse inhibeer nie. 'n Tipiese voorbeeld van 'n indirekte vesikulêre vervoertoets is die opsporing van die inhibisie van taurocholaat-vervoer deur ABCB11 (BSEP).

Heelselgebaseerde toetse Wysig

Selle wat uitvloeisel vervoerder uitdruk, pomp aktief substrate uit die sel, wat lei tot 'n laer tempo van substraat-akkumulasie, laer intrasellulêre konsentrasie by bestendige toestand, of 'n vinniger tempo van substraat eliminasie van selle wat met die substraat gelaai is. Vervoerde radioaktiewe substrate of gemerkte fluoresserende kleurstowwe kan direk gemeet word, of in 'n indirekte opstelling kan die modulasie van die ophoping van 'n sondesubstraat (bv. fluoresserende kleurstowwe soos rhodamine 123, of kalseïen) in die teenwoordigheid van 'n toetsmiddel bepaal word. [88]

Calcein-AM, 'n Hoogs deurlaatbare afgeleide van kalseïen dring maklik deur tot ongeskonde selle, waar die endogene esterases dit vinnig hidroliseer na die fluoresserende kalseïen. In teenstelling met kalseïen-AM, het kalseïen lae deurlaatbaarheid en word dus in die sel vasgevang en versamel. Aangesien kalseïen-AM 'n uitstekende substraat van die MDR1- en MRP1-uitvloeivervoerders is, pomp selle wat MDR1- en/of MRP1-vervoerders uitdruk die kalseïen-AM uit die sel voordat esterase dit kan hidroliseer. Dit lei tot 'n laer sellulêre akkumulasietempo van kalseïen. Hoe hoër die MDR-aktiwiteit in die selmembraan is, hoe minder kalseïen word in die sitoplasma opgehoop. In MDR-uitdrukkingselle verhoog die byvoeging van 'n MDR-inhibeerder of 'n MDR-substraat in oormaat die tempo van Kalseïen-akkumulasie dramaties. Aktiwiteit van multigeneesmiddelvervoerder word weerspieël deur die verskil tussen die hoeveelhede kleurstof wat in die teenwoordigheid en die afwesigheid van inhibeerder opgehoop word. Deur selektiewe inhibeerders te gebruik, kan vervoeraktiwiteit van MDR1 en MRP1 maklik onderskei word. Hierdie toets kan gebruik word om middels vir vervoerder-interaksies te skerm, en ook om die MDR-aktiwiteit van selle te kwantifiseer. Die kalseïentoets is die eie toets van SOLVO Biotegnologie.

Soogdier subfamilies Edit

Daar is 49 bekende ABC-vervoerders in mense teenwoordig, wat deur die Human Genome Organisation in sewe families geklassifiseer word.

Familie Lede Funksie Voorbeelde
ABCA Hierdie familie bevat van die grootste vervoerders (meer as 2 100 aminosure lank). Vyf van hulle is in 'n tros in die 17q24-chromosoom geleë. Verantwoordelik vir die vervoer van onder meer cholesterol en lipiede. ABCA12 ABCA1
ABCB Bestaan ​​uit 4 vol en 7 halwe vervoerders. Sommige is geleë in die bloed-brein versperring, lewer, mitochondria, vervoer peptiede en gal, byvoorbeeld. ABCB5
ABCC Bestaan ​​uit 12 volle vervoerders. Gebruik in ioonvervoer, sel-oppervlak reseptore, toksienafskeiding. Sluit die CFTR-proteïen in, wat sistiese fibrose veroorsaak wanneer dit tekort is. ABCC6
ABCD Bestaan ​​uit 4 halwe vervoerders Word almal in peroksisome gebruik. ABCD1
ABCE/ABCF Bestaan ​​uit 1 ABCE en 3 ABCF proteïene. Dit is nie eintlik vervoerders nie, maar bloot ATP-bindende domeine wat van die ABC-familie afgelei is, maar sonder die transmembraandomeine. Hierdie proteïene reguleer hoofsaaklik proteïensintese of uitdrukking. ABCE1, ABCF1, ABCF2
ABCG Bestaan ​​uit 6 "omgekeerde" halfvervoerders, met die NBF by die NH3 + einde en die TM aan die COO- einde. Vervoer lipiede, diverse geneesmiddelsubstrate, gal, cholesterol en ander steroïede. ABCG2 ABCG1

'n Volledige lys van menslike ABC-vervoerders kan gevind word by. [94]

ABCA wysig

Die ABCA-subfamilie bestaan ​​uit 12 volle vervoerders wat in twee subgroepe verdeel is. Die eerste subgroep bestaan ​​uit sewe gene wat na ses verskillende chromosome karteer. Dit is ABCA1, ABCA2, ABCA3 en ABCA4, ABCA7, ABCA12 en ABCA13. Die ander subgroep bestaan ​​uit ABCA5 en ABCA6 en ABCA8, ABCA9 en ABCA10. A8-10. Die hele subgroep 2 is georganiseer in 'n kop-tot-stert-groep chromosome op chromosoom 17q24. Gene in hierdie tweede subgroep word van ABCA1-agtige gene onderskei deur 37-38 eksone te hê in teenstelling met die 50 eksone in ABCA1. Die ABCA1-subgroep is betrokke by die ontwikkeling van genetiese siektes. In die resessiewe Tangier se siekte word die ABCA1-proteïen gemuteer. Die ABCA4 karteer ook na 'n streek van chromosoom 1p21 wat die geen vir Stargardt se siekte bevat. Daar word gevind dat hierdie geen hoogs uitgedruk word in staaffotoreseptore en is gemuteer in Stargardt se siekte, resessiewe retinitispigmentisme en die meeste resessiewe keëlstaafdistrofie. [9]

ABCB wysig

Die ABCB-subfamilie bestaan ​​uit vier volle vervoerders en twee halwe vervoerders. Dit is die enigste menslike subfamilie wat beide halwe en vol tipes vervoerders het. ABCB1 is ontdek as 'n proteïen wat in sekere geneesmiddelweerstandige tumorselle ooruitgedruk word. Dit word hoofsaaklik uitgedruk in die bloed-breinversperring en lewer en word vermoedelik betrokke by die beskerming van selle teen gifstowwe.Selle wat hierdie proteïen ooruitdruk, toon multi-middel weerstand. [9]

ABCC wysig

Subfamilie ABCC bevat dertien lede en nege van hierdie vervoerders word na verwys as die Multidrug Resistance Proteins (MRP's). Die MRP-proteïene word deur die natuur aangetref en hulle bemiddel baie belangrike funksies. [95] Dit is bekend dat hulle betrokke is by ioonvervoer, toksienafskeiding en seintransduksie. [9] Van die nege MRP-proteïene het vier daarvan, MRP4, 5, 8, 9, (ABCC4, 5, 11 en 12), 'n tipiese ABC-struktuur met vier domeine, bestaande uit twee membraan-omspannende domeine, met elkeen wat strek domein gevolg deur 'n nukleotiedbindingsdomein. Dit word na verwys as kort MRP's. Die oorblywende 5 MRP's (MRP1, 2, 6, 7 (ABCC1, 2, 3, 6 en 10) staan ​​bekend as lang MRP's en het 'n bykomende vyfde domein by hul N-terminus. [95]

CFTR, die vervoerder betrokke by die siekte sistiese fibrose, word ook as deel van hierdie subfamilie beskou. Sistiese fibrose vind plaas by mutasie en verlies van funksie van CFTR. [9]

Die sulfonielureumreseptore (SUR), betrokke by insulienafskeiding, neuronale funksie en spierfunksie, is ook deel van hierdie familie van proteïene. Mutasies in SUR-proteïene is 'n potensiële oorsaak van neonatale diabetes mellitus. SUR is ook die bindingsplek vir middels soos sulfonielureums en kaliumkanaalopenersaktiveerders soos diasoksied.

ABCD wysig

Die ABCD-subfamilie bestaan ​​uit vier gene wat kodeer vir halwe vervoerders wat uitsluitlik in die peroksisoom uitgedruk word. ABCD1 is verantwoordelik vir die X-gekoppelde vorm van Adrenoleukodystrofie (ALD) wat 'n siekte is wat gekenmerk word deur neurodegenerasie en bynierekort wat tipies in die laat kinderjare begin word. Die selle van ALD-pasiënte het ophoping van onvertakte versadigde vetsure, maar die presiese rol van ABCD1 in die proses is nog onbepaald. Daarbenewens moet die funksie van ander ABCD-gene nog bepaal word, maar daar is gedink dat dit verwante funksies in vetsuurmetabolisme uitoefen. [9]

ABCE en ABCF wysig

Beide hierdie subgroepe is saamgestel uit gene wat ATP-bindende domeine het wat nou verwant is aan ander ABC-vervoerders, maar hierdie gene kodeer nie vir transmembraandomeine nie. ABCE bestaan ​​uit slegs een lid, OABP of ABCE1, wat bekend is om sekere oligodendrosiete te herken wat geproduseer word in reaksie op sekere virusinfeksies. Elke lid van die ABCF-subgroep bestaan ​​uit 'n paar ATP-bindende domeine. [9]

ABCG wysig

Ses halwe vervoerders met ATP-bindingsplekke op die N-terminus en transmembraandomeine by die C-terminus vorm die ABCG-subfamilie. Hierdie oriëntasie is die teenoorgestelde van alle ander ABC-gene. Daar is net 5 ABCG-gene in die menslike genoom, maar daar is 15 in die Drosophila-genoom en 10 in gis. Die ABCG2-geen is ontdek in sellyne wat geselekteer is vir hoë vlak weerstand vir mitoksantron en geen uitdrukking van ABCB1 of ABCC1 nie. ABCG2 kan antrosiklien-antikankermiddels, sowel as topotecan, mitoxantrone, of doxorubicin as substrate uitvoer. Daar is gevind dat chromosomale translokasies die ABCG2-amplifikasie of herrangskikking wat in weerstandbiedende sellyne gevind word, veroorsaak. Die normale funksie van ABCG2 is nie bekend nie. [9]

Kruis-spesie subfamilies Wysig

Die volgende klassifikasiestelsel vir transmembraan opgeloste stof vervoerders is in die TCDB gekonstrueer. [96]

Drie families van ABC-uitvoerders word gedefinieer deur hul evolusionêre oorsprong. [6] ABC1-uitvoerders het ontwikkel deur intragene triplisering van 'n 2 TMS-voorloper (TMS = transmembraansegment. 'n "2 TMS"-proteïen het 2 transmembraansegmente) om 6 TMS-proteïene te gee. ABC2-uitvoerders het ontwikkel deur intrageniese duplisering van 'n 3 TMS-voorloper, en ABC3-uitvoerders het ontwikkel uit 'n 4 TMS-voorloper wat óf ekstragenies gedupliseer het om twee 4 TMS-proteïene te gee, beide nodig vir vervoerfunksie, óf intragenies om 8 of 10 TMS-proteïene te gee. Die 10 TMS-proteïene het blykbaar twee ekstra TMS'e tussen die twee 4 TMS-herhalingseenhede. [97] Die meeste opnamestelsels (almal behalwe 3.A.1.21) is van die ABC2-tipe, verdeel in tipe I en tipe II deur die manier waarop hulle nukleotiede hanteer. 'n Spesiale subfamilie van ABC2-invoerders genaamd ECF gebruik 'n aparte subeenheid vir substraatherkenning. [98]

  • 3.A.1.106 Die Lipied Uitvoerder (LipidE) Familie
  • 3.A.1.108 Die β-Glukan Uitvoerder (GlucanE) Familie
  • 3.A.1.109 Die Proteïen-1 Uitvoerder (Prot1E) Familie
  • 3.A.1.110 Die Proteïen-2 Uitvoerder (Prot2E) Familie
  • 3.A.1.111 Die Peptied-1 Uitvoerder (Pep1E) Familie
  • 3.A.1.112 Die Peptied-2 Uitvoerder (Pep2E) Familie
  • 3.A.1.113 Die Peptide-3 Uitvoerder (Pep3E) Familie
  • 3.A.1.117 Die Dwelmuitvoerder-2 (DrugE2) Familie
  • 3.A.1.118 Die Microcin J25 Uitvoerder (McjD) Familie
  • 3.A.1.119 The Drug/Siderophore Exporter-3 (DrugE3) Family
  • 3.A.1.123 Die Peptide-4 Uitvoerder (Pep4E) Familie
  • 3.A.1.127 Die AmfS Peptide Uitvoerder (AmfS-E) Familie
  • 3.A.1.129 Die CydDC Cysteine ​​Exporter (CydDC-E) Familie
  • 3.A.1.135 Die Dwelmuitvoerder-4 (DrugE4) Familie
  • 3.A.1.139 Die UDP-glukose-uitvoerder (U-GlcE)-familie (UPF0014-familie)
  • 3.A.1.201 Die Multidrug Weerstand Uitvoerder (MDR) Familie (ABCB)
  • 3.A.1.202 Die Sistiese Fibrose Transmembraan Geleiding Uitvoerder (CFTR) Familie (ABCC)
  • 3.A.1.203 Die Peroksisomale Vet Acyl CoA Transporter (P-FAT) Familie (ABCD)
  • 3.A.1.206 Die a-Factor Seks Feromoon Uitvoerder (STE) Familie (ABCB)
  • 3.A.1.208 The Drug Conjugate Transporter (DCT) Family (ABCC) (Dębska et al., 2011)
  • 3.A.1.209 Die MHC Peptide Transporter (TAP) Familie (ABCB)
  • 3.A.1.210 Die Heavy Metal Transporter (HMT) Familie (ABCB)
  • 3.A.1.212 Die Mitochondriale Peptied Uitvoerder (MPE) Familie (ABCB)
  • 3.A.1.21 Die Siderophore-Fe3+ Opname Vervoerder (SIUT) Familie
  • 3.A.1.101 Die Kapsulêre Polisakkaried Uitvoerder (CPSE) Familie
  • 3.A.1.102 Die Lipooligosakkaried-uitvoerder (LOSE) Familie
  • 3.A.1.103 Die Lipopolisakkaried Uitvoerder (LPSE) Familie
  • 3.A.1.104 Die Teichoic Acid Exporter (TAE) Familie
  • 3.A.1.105 Die Dwelmuitvoerder-1 (DrugE1) Familie
  • 3.A.1.107 Die Vermeende Heme Uitvoerder (HemeE) Familie
  • 3.A.1.115 Die Na+ Uitvoerder (NatE) Familie
  • 3.A.1.116 Die Microcin B17 Uitvoerder (McbE) Familie
  • 3.A.1.124 Die 3-komponent Peptied-5 Uitvoerder (Pep5E) Familie
  • 3.A.1.126 Die β-Eksotoksien I Uitvoerder (βETE) Familie
  • 3.A.1.128 Die SkfA Peptide Uitvoerder (SkfA-E) Familie
  • 3.A.1.130 Die multidwelm/hemolisien uitvoerder (MHE) familie
  • 3.A.1.131 Die Bacitracin Resistance (Bcr) Familie
  • 3.A.1.132 Die Sweefbeweging ABC Transporter (Gld) Familie
  • 3.A.1.133 Die Peptide-6 Uitvoerder (Pep6E) Familie
  • 3.A.1.138 Die Onbekende ABC-2-tipe (ABC2-1) Familie
  • 3.A.1.141 The Ethyl Viologen Exporter (EVE) Family (DUF990 Family InterPro: IPR010390)
  • 3.A.1.142 Die Glycolipid Flippase (G.L.Flippase) Familie
  • 3.A.1.143 Die eksoproteïenafskeidingstelsel (EcsAB(C))
  • 3.A.1.144: Funksioneel ongekarakteriseerde ABC2-1 (ABC2-1) Familie
  • 3.A.1.145: Peptidase saamgesmelte funksioneel ongekarakteriseerde ABC2-2 (ABC2-2) familie
  • 3.A.1.146: Die aktinorhodin (ACT) en undecylprodigiosin (RED) uitvoerder (ARE) familie
  • 3.A.1.147: Funksioneel ongekarakteriseerde ABC2-2 (ABC2-2) Familie
  • 3.A.1.148: Funksioneel ongekarakteriseerde ABC2-3 (ABC2-3) Familie
  • 3.A.1.149: Funksioneel ongekarakteriseerde ABC2-4 (ABC2-4) Familie
  • 3.A.1.150: Funksioneel ongekarakteriseerde ABC2-5 (ABC2-5) Familie
  • 3.A.1.151: Funksioneel ongekarakteriseerde ABC2-6 (ABC2-6) Familie
  • 3.A.1.152: Die lipopolisakkaried-uitvoer (LptBFG) Familie (InterPro: IPR005495)
  • 3.A.1.204 The Eye Pigment Precursor Transporter (EPP) Family (ABCG)
  • 3.A.1.205 Die Pleiotropiese Dwelmweerstand (PDR) Familie (ABCG)
  • 3.A.1.211 Die cholesterol/fosfolipied/retinale (KPR) flippase-familie (ABCA)
  • 9.B.74 Die Faag Infeksie Proteïen (PIP) Familie
  • alle opnamestelsels (3.A.1.1 - 3.A.1.34 behalwe 3.A.1.21)
    • 3.A.1.1 Koolhidraatopname Transporter-1 (CUT1)
    • 3.A.1.2 Koolhidraatopname Transporter-2 (CUT2)
    • 3.A.1.3 Polêre Aminosuur Opname Transporter (PAAT)
    • 3.A.1.4 Hidrofobiese Aminosuur Opname Transporter (HAAT)
    • 3.A.1.5 Peptied/Opien/Nikkel Opname Transporter (PepT)
    • 3.A.1.6 Sulfaat/wolstaatopname-vervoerder (SulT)
    • 3.A.1.7 Fosfaatopname-vervoerder (PhoT)
    • 3.A.1.8 Molibdaatopname-vervoerder (MolT)
    • 3.A.1.9 Fosfonaatopname-vervoerder (PhnT)
    • 3.A.1.10 Ferri-ysteropname-vervoerder (FeT)
    • 3.A.1.11 Poliamien/Opien/Fosfonaat Opname Transporter (POPT)
    • 3.A.1.12 Kwaternêre Amien Opname Transporter (QAT)
    • 3.A.1.13 Vitamien B12 Opneem vervoerder (B12T)
    • 3.A.1.14 Ysterchelaatopname-vervoerder (FeCT)
    • 3.A.1.15 Mangaan/sink/ysterchelaatopname-vervoerder (MZT)
    • 3.A.1.16 Nitraat/nitriet/sianaatopname-vervoerder (NitT)
    • 3.A.1.17 Taurine Opname Transporter (TauT)
    • 3.A.1.19 Tiamienopname vervoerder (ThiT)
    • 3.A.1.20 Brachyspira Iron Transporter (BIT)
    • 3.A.1.21 Siderophore-Fe3+ Opname Transporter (SIUT)
    • 3.A.1.24 Die metionienopname-vervoerder (MUT)-familie (soortgelyk aan 3.A.1.3 en 3.A.1.12)
    • 3.A.1.27 Die γ-Heksachlorosikloheksaan (HCH) Familie (Soortgelyk aan 3.A.1.24 en 3.A.1.12)
    • 3.A.1.34 Die Tryptofaan (TrpXYZ) Familie
    • ECF-opnamestelsels
      • 3.A.1.18 Die Cobalt Opname Transporter (CoT) Familie
      • 3.A.1.22 Die Nickel Opname Transporter (NiT) Familie
      • 3.A.1.23 Die Nikkel/Kobalt Opname Transporter (NiCoT) Familie
      • 3.A.1.25 Die Biotien Opname Transporter (BioMNY) Familie
      • 3.A.1.26 Die Vermeende Tiamien Opname Transporter (ThiW) Familie
      • 3.A.1.28 Die Queuosine (Queuosine) Familie
      • 3.A.1.29 Die Metionien Voorloper (Met-P) Familie
      • 3.A.1.30 Die Thiamin Precursor (Thi-P) Familie
      • 3.A.1.31 Die Onbekende-ABC1 (U-ABC1) Familie
      • 3.A.1.32 Die Kobalamien Voorloper (B12-P) Familie
      • 3.A.1.33 Die Metieltioadenosien (MTA) Familie
      • 3.A.1.114 Die waarskynlike glikolipieduitvoerder (DevE) familie
      • 3.A.1.122 Die Makrolide Uitvoerder (MacB) Familie
      • 3.A.1.125 Die Lipoproteïen Translokase (LPT) Familie
      • 3.A.1.134 Die Peptide-7 Uitvoerder (Pep7E) Familie
      • 3.A.1.136 Die Ongekarakteriseerde ABC-3-tipe (U-ABC3-1) Familie
      • 3.A.1.137 Die Ongekarakteriseerde ABC-3-tipe (U-ABC3-2) Familie
      • 3.A.1.140 Die FtsX/FtsE Septation (FtsX/FtsE) Familie
      • 3.A.1.207 Die Eukariotiese ABC3 (E-ABC3) Familie

      Kyk na proteïene wat aan ABC Superfamilie behoort: hier

      Baie strukture van wateroplosbare domeine van ABC-proteïene is in onlangse jare geproduseer. [2]


      E. Strukture betrokke by Na + vervoer

      Om as 'n selektiewe Na + pomp te kan funksioneer, moet Na + -NQR strukture bevat wat 1) Na + toelaat om deur die hidrofobiese kern van die membraan te gaan en 2) katioonspesifisiteit aan die translokasiestelsel verskaf. In ander Na +-vervoerende proteïene bevat die strukture wat hierdie rolle dikwels aspartaat- en glutamaatreste [83]. Die negatiewe lading van hierdie aminosure fasiliteer binding van die positief gelaaide Na +. Om residue te identifiseer wat by hierdie funksie betrokke kan wees, het ons die data van ons topologiese analise gebruik om bewaarde suurresidue in die transmembraansegmente van die ensiem op te spoor. Sewentien van hierdie reste is gevind, almal van hulle in subeenhede NqrB, D en E. Interessant genoeg is al die suurreste wat in transmembraanhelikse geleë is naby óf die sitoplasmiese óf periplasmiese kant van die membraan. Daar is min aanduiding van 'n pad van bindingsplekke om Na + deur die middel van die membraan te vervoer. Om die rolle van hierdie suurgroepe te ondersoek, het ons mutante gekonstrueer waarin hierdie residue individueel deur alifatiese groepe vervang is, wat swak met Na + behoort te reageer. Van die sewentien mutante het sewe beduidende inhibisie van hul katalitiese aktiwiteit getoon [64]. Hierdie sewe mutante kan in twee groepe verdeel word, afhangende van die funksionele veranderinge wat voortspruit uit die mutasie. Hierdie groepering korreleer met die kant van die membraan waarop die gemuteerde residu geleë is.

      Vir een groep residue, geleë naby die sitosol (NqrB-E144, NqrB-D397, NqrD-D133 en NqrE-E95), lei die vervanging van enige van die suurgroepe deur 'n alifatiese een tot 'n afname van 10 keer of meer in die skynbare affiniteit vir Na + in bestendige toestande. Op hierdie basis is voorgestel dat hierdie residens deel van die katioonbindingsplek(ke) is.

      NqrB-D397 is waarskynlik die belangrikste ligand, aangesien die omsettempo van die NqrB-D397A mutant geen versadigingsgedrag met betrekking tot Na + toon nie. Dit dui óf aan dat die mutant 'n uiters lae affiniteit vir Na + het, óf dat natriumopname so erg belemmer word dat dit altyd tempo beperkend is.

      Vir die tweede groep residue, geleë naby die periplasma (positiewe kant van die membraan) (NqrB-E28, NqrB-D346 en NqrD-D88) het vervanging deur 'n alifatiese aminosuur 'n groot afname in die kinoonreduktase-aktiwiteit van die ensiem en sy Na + sensitiwiteit, maar byna geen effek op die oënskynlike Na + affiniteit nie. Dit stem ooreen met 'n rol vir hierdie residue in 'n uittreepad deur die membraan vir Na +.

      Die eienskappe van hierdie mutante dui daarop dat Na + translokasie en die elektronoordragreaksies styf verbind is.

      F. Koppelmeganisme

      F.1. Modelle van Na + pomp gebaseer op direkte koppeling

      Rich, Dimroth en Bogachev [56, 84, 85] het almal modelle voorgestel waarin die vermindering van 'n enkele kofaktor (onderskeidelik die 2Fe-2S-sentrum, ubiquinone of 'n flavin-kofaktor) direk gekoppel is aan die opname van natrium uit die sitoplasma , en die oksidasie van die kofaktor is gekoppel aan uitwerping van Na + na die periplasma. Hierdie skemas is afgelei van modelle van redoks-gedrewe H + pompe waar die plek van H + binding tipies deel is van die redoks kofaktor self. Hul werkingsbeginsel is beskryf as die behoud van ȁselelektroneutraliteit” in die omgewing van die redokskofaktor—in effek, dat koppeling ontstaan ​​uit 'n coulombiese interaksie tussen die elektron en die H +, of in die geval van Na + -NQR , tussen die elektron en die Na + ioon.

      Die 𠇍irek gekoppelde pompmeganismes van hierdie modelle kan beskryf word as ȁklokaal” in die sin dat die verband tussen die redoksgebeure en die opname en vrystelling van Na + oor kort afstande deur in wese chemiese interaksies werk, eerder as deur konformasieveranderinge van die proteïen. Daar sal ook verwag word dat meganismes soos hierdie 'n hoë mate van “termodinamiese koppeling sal hê, wat beteken dat die affiniteit van die bindingsplek vir Na + beheer word deur die redokstoestand van die kofaktor.

      Die belangrikste eksperimentele ondersteuning vir termodinamiese koppeling in Na + -NQR kom van KMR-studies waarin Bogachev et al [86] die lynwydte van die 23 Na-band van Na+ in oplossing gemeet het, in die teenwoordigheid van gereduseerde en geoksideerde vorms van Na + -NQR . As Na + in oplossing in vinnige uitruiling is met Na + gebind aan 'n ensiem, sal die 23 Na resonansie verbreed word, met die mate van lynverbreding 'n funksie van die bindingsaffiniteit. Die skrywers het gerapporteer dat die 23 Na-resonansies van beide die gereduseerde en geoksideerde ensiemmonsters verbreed is in vergelyking met die sein van 'n monster sonder ensiem, maar dat die lynwydte in die verminderde ensiemmonster aansienlik groter was as in die geoksideerde een. Hulle het bereken dat die bindingsaffiniteit van die ensiem vir natrium 24 mM is in die geoksideerde vorm en so hoog as 30 μM in die gereduseerde vorm.[

      'n Interaksie van hierdie soort moet wederkerig wees as reduksie van een van die kofaktore affiniteit vir Na + laat toeneem, sal die binding van Na + die verminderde vorm van die kofaktor stabiliseer. In die geval van die sterk koppeling, wat verwag word vir direk gekoppelde sisteme, sal die redoks-middelpunt-potensiaal van die kofaktor met 60 mV toeneem vir elke 10-voudige toename in Na + konsentrasie. Bogachev en medewerkers het egter ook redokstitrasies van Na + -NQR by verskillende Na + -konsentrasies uitgevoer, en geen oënskynlike afhanklikheid gevind nie [80]. Meer onlangs het direkte ewewigsmetings van die binding van Na + aan Na + -NQR, gemaak in ons laboratorium, met behulp van 22 Na + geen redoksafhanklike veranderinge gevind in óf die aantal Na + gebind aan Na + -NQR óf die affiniteit van hierdie interaksie [48]. Dit is belangrik om daarop te let dat die KMR-metode afhang van vinnige uitruiling van Na + tussen oplossing en die bindingsplek [86], 'n vereiste wat moontlik nie nagekom is onder die eksperimentele toestande wat getoets is nie. Dit is dus moontlik dat die veranderinge in die lynwydte van die KMR-spektra 'n verandering in die kinetika van Na + binding weerspieël, en nie verandering affiniteit nie.

      Dit is ook duidelik dat dryfkrag redelik eweredig langs die trappe van die ensiem se elektronoordragpad versprei word en dat daar geen kofaktor is waarvan die reduksie en oksidasie hoogs eksergonies is nie, soos verwag kan word vir 'n meganisme van die soort wat deur die vroeëre modelle voorsien is. .

      Hierdie mislukking, tot dusver, om bewyse van termodinamiese koppeling tussen die redoks- en Na +-reaksies van Na + -NQR te vind, argumenteer teen direk gekoppelde modelle soos dié hierbo aangehaal. 'n Alternatief is indirekte koppeling waarin die redoksreaksies en die vaslegging van Na + by geskeide plekke plaasvind en slegs verbind word deur konformasieveranderinge van die proteïen. In so 'n skema kan die redoksreaksie versnel word, nie deur modifikasie van die termodinamiese eienskappe van die redokssentrums nie, maar deur 'n afname in aktiveringsversperrings gekoppel aan stappe in Na + translokasie.

      F.2. Funksionele studies om gekoppelde reaksie stappe te identifiseer

      'n Belangrike punt om die meganisme van Na + -NQR te verstaan, is om die redoksstappe te bepaal wat gekoppel is aan die pomp van Na + oor die membraan. Ons groep het hierdie vraag aangespreek deur die elektronoordragkinetika te analiseer in sommige van die suurgroepmutante wat hierbo beskryf is wat nie Na + [81] kan vervoer nie. Ons het voorheen getoon dat NqrB-D397 deel vorm van 'n natrium-opname/bindingsplek en dat NqrB-D346 waarskynlik betrokke is by 'n natrium-uitgangsweg [64]. In die geval van NqrB-D397A, die 2Fe-2S𡤯MNC stap is ernstig benadeel dit is ook die hoof Na + afhanklike stap in die reaksie [49]. Dit dui op die vermindering van FMNC is direk betrokke by die opvang van natrium uit oplossing. In die geval van die mutant NqrB-D346A word die elektronvloei by die FMN geïnhibeerB → Riboflavin-stap, wat aandui dat hierdie stap betrokke is by die vrystelling van natrium na die periplasma. Dit is gestaaf deur “senkelomset ΔΨ” metings. In hierdie eksperimente is 'n spanningsensitiewe kleurstof gebruik om die generering van membraanpotensiaal te volg tydens die reduksie van die ensiem deur NADH. Eerstens is die reaksie uitgevoer deur NADH by te voeg in die teenwoordigheid van ubiquinone, wat gelei het tot bestendige omset, gepaardgaande met 'n duidelike vorming van ΔΨ. Vervolgens is die eksperiment sonder ubikinoon herhaal, sodat die reaksie geëindig het nadat alle kofaktore verminder is. Hierdie reaksie het 'n kleiner ΔΨ geproduseer, maar die amplitude daarvan was betekenisvol, wat toon dat vermindering van die ensiem alleen, sonder oksidasie deur kinoon, voldoende is om ΔΨ te genereer. Daar is getoon dat inkubasie van die ensiem met ubiquinol slegs Riboflavin verminder, wat die stroomop-kofaktore laat oksideer. Wanneer dit gedoen word voor byvoeging van NADH, het dit die effek om die elektronoordrag vanaf FMN te voorkomB na Riboflavin.Hierdie afgekapte redoksreaksie het in wese geen ΔΨ geproduseer nie. Saam met die vorige resultate dui dit daarop dat elektronoordrag vanaf FMNB aan Riboflavin is gekoppel aan Na + pomp. Hierdie metings is ook uitgevoer op sommige van die Na + -NQR mutante wat nie spesifieke kofaktore het nie. In alle gevalle het die afkap van die reduksiereaksie op 'n vroeëre punt enige generasie van ΔΨ afgeskaf. Die algehele prentjie wat uit hierdie resultate na vore kom, is dat Na + -NQR nie deur 'n enkele sykoppelingsmeganisme werk nie. Na + word tydens die 2Fe-2S 𡤯MN uit oplossing opgeneemC stap en word daarna oor die membraan diëlektrikum vervoer en in oplossing vrygestel wanneer FMNB dra elektrone oor na Riboflavin (Fig.4). Saam argumenteer hierdie resultate teen enige belangrike rol van direkte koppeling in die meganisme van Na + -NQR.

      Hirst [87] het daarop gewys dat plaaslik gekoppelde meganismes nie ooreenstem met die verstaan ​​vereistes van Na + -binding aan proteïene nie. Veral die interaksie tussen die reduksieproses en ioonbinding sal waarskynlik nie sterk genoeg wees om ioontranslokasie te ondersteun nie. Direkte koppeling kan nie verduidelik hoe die ensiem verhoed dat protone aan die 𠇌oupling cofactor” -semikinoonradikaal- met ander woorde, hoe die ensiem selektief is vir natrium, nie. Verder kan die toestande van 'n lae diëlektriese omgewing, wat nodig is vir die elektroneneutrale vaslegging van natrium, dalk nie in biologiese natriumbindende strukture gevind word nie. Terwyl protone maklik deur 'n enkele elektronegatiewe atoom geneem kan word, wat 'n intermediêre met geen netto lading produseer nie, vind die binding van natrium tipies plaas in hoogs hidrofiliese omgewings, by multi-dentate bindingsplekke wat uit ses polêre residue bestaan ​​[88]. Dit stem ooreen met ons bevinding dat in Na + -NQR ten minste drie suurreste belangrike rolle in die Na + -bindingsplek(te) speel. Die gebrek aan pH-afhanklikheid van die kofaktormiddelpuntpotensiale dui ook sterk daarop dat die kofaktore nie toeganklik is vir die waterige omgewing en gevolglik vir natrium nie. Ons ontleding van katioon-selektiwiteit het getoon dat die ensiem dieselfde affiniteit vir natrium en litium het, maar by versadigende konsentrasies stimuleer litium die aktiwiteit slegs 1/3 soveel as natrium. Gelokaliseerde koppeling kan nie die katioon-selektiwiteit van die ensiem verantwoord nie, want onder hierdie meganisme behoort enige katioon wat toegang tot die ȁkoppelkofaktor” het, dieselfde effek as die natuurlike koppelingsioon, in hierdie geval natrium, te produseer.

      Daar is dus toenemende bewyse dat die direkte koppelingsmeganisme nie versoenbaar is met die fisiese eienskappe van natrium nie. Dit alles dui daarop dat Na + -NQR 'n nuwe meganisme het wat volgens ander beginsels werk as dié wat gewoonlik gebruik word om H + pompe te verduidelik, en dit is moontlik dat hierdie ensiem meer in gemeen het met ander, nie-redoksgedrewe Na + vervoerders as met sy mede-respiratoriese komplekse.

      F.3. Indirekte meganisme van koppeling

      Ons stel voor dat die meganisme van Na + -NQR verskeie nuwe kenmerke vir 'n redoks-gedrewe ensiem het. 1) Eerder as om by 'n enkele plek plaas te vind, behels koppeling tussen die redoksreaksies en Na + translokasie ten minste twee duidelike elektronoordragstappe, wat geen gemeenskaplike kofaktor deel nie: Na + opname vind plaas tydens die 2Fe-2S → FMNC redoksstap, terwyl beweging van Na + oor die membraan, dit waarskynlik die vrystelling daarvan in die periplasma, plaasvind tydens die FMNB → Riboflavin redoks stap 2) Koppeling tussen die redoksreaksies en Na + pomping is indirek, en sal waarskynlik bemiddel word deur konformasie veranderinge van die ensiem. In die FMNB → Riboflavin-stap, waartydens generering van membraanpotensiaal plaasvind, is die suurreste wat Na +-beweging fasiliteer naby die periplasmiese kant van die membraan geleë, terwyl die kofaktore waar die redoksreaksie plaasvind aan die sitoplasmiese kant van die membraan is , 'n te groot skeiding vir 'n direkte interaksie. Dit stem ooreen met die geval, hierbo beskryf, dat die chemie van Na + -proteïen interaksies genoegsaam verskil van dié van H + -proteïen interaksies om direkte koppeling onwaarskynlik te maak. Die gebrek aan bewyse vir interaksies tussen die redoksreaksies en Na + in ewewigstoestande, argumenteer teen die termodinamiese koppeling wat verwag kan word vir 'n direk gekoppelde pompmeganisme, dit is egter moontlik dat termodinamiese koppeling plaasvind, maar slegs manifesteer in kinetiese tussenprodukte wat nie toeganklik in ewewigstoestande nie. 3) Soos in ander Na + translokerende ensieme, sal beweging van die Na + deur die hidrofobiese membraan waarskynlik gefasiliteer word deur konformasie veranderinge van die proteïen (wat reeds blyk te wees nodig vir koppeling) sowel as interne waterholtes. 'n Skema wat hierdie kenmerke insluit, word in Figuur 6 getoon. Hierdie nuwe idees oor die meganisme van Na + -NQR is die onderwerp van huidige ondersoeke in ons groep.

      Skematiese voorstelling van konformasie veranderinge betrokke by Na + translokasie tydens die katalitiese meganisme van Na + -NQR. Natriumopvang: elektronoordrag vanaf 2Fe-2S-sentrum na FMNC beheer Na + opname vanaf die sitosol. Natriumvrystelling: elektronoordrag vanaf FMNB na Riboflavin beheer Na + vervoer en vrystelling na die periplasma.

      Hoogtepunte:

      Die Na + -pompende NADH:kinoonoksidoreduktase (Na + -NQR) is 'n respiratoriese ensiem wat noodsaaklik is in die metabolisme van baie mariene en patogene bakterieë wat Na + in plaas van H + uniek translokeer. Die meganisme van Na + pomp in Na + -NQR is nuwe onlangse resultate toon dat koppeling van Na + vervoer aan redoksreaksies indirek is en dus waarskynlik deur konformasie veranderinge bemiddel word.


      Bespreking

      In hierdie studie het ons verskille tussen mens en rot URAT1 ontgin om molekulêre interaksies met die substraat uraat en met klinies relevante URAT1 inhibeerders te openbaar, verbindings wat sUA vlakke vir die behandeling van jig verminder. Met behulp van hURAT1 en rURAT1 chimeras kon ons hURAT1-residue identifiseer wat hoë affiniteitsinteraksie met URAT1-inhibeerders verleen. Residu wat verantwoordelik is vir die hoë affiniteit van hURAT1 tot inhibeerders sluit Ser-35 in TM1, Phe-365 in TM7 en Ile-481 in TM11 in, wat onderskeidelik ooreenstem met Asn, Tyr en Met in rURAT1. Vir urate, hURAT1 Ser-35 en Phe-365 bemiddel hoë affiniteit interaksie. Uraat en inhibeerders is in wisselwerking met 'n gemeenskaplike bindingsplek op URAT1 omdat almal soortgelyke URAT1-reste vir hoë affiniteit-interaksie benodig. Die puntmutante in rURAT1 wat die individuele hURAT1-residue Ser-35, Phe-365 en Ile-481 dra, verhoog almal die sterkte van die inhibeerders. Hierdie 'wins of function' fenotipes verskaf die sterkste bewyse dat hierdie menslike URAT1-residue belangrik is vir interaksies met beide inhibeerders en substraat.

      Menslike URAT1 Ser-35, Phe-365 en Ile-481 is geïdentifiseer in 'n onbevooroordeelde skerm vir URAT1 aminosure betrokke by affiniteit vir inhibeerders. Hierdie drie aminosure ko-lokaliseer in die sentrale kanaal van 'n rekenaarmodel van menslike OAT1 33, 'n homoloog van hURAT1 wat ook urate 38 vervoer en deur probenecid 41 geïnhibeer word. Verder het chimeriese punt mutant kombinasies van hierdie residue additiewe fenotipes vir affiniteit vir inhibeerders en uraat geproduseer, wat daarop dui dat hulle 'n gemeenskaplike bindingsplek vir URAT1 substrate en inhibeerders binne die vervoerder kanaal vorm. Hierdie idee word ondersteun deur onlangse bevindinge van die kristalstrukture van die GLUT glukose vervoerders 42,43,44, SLC familielede wat swak volgorde homologie het maar struktureel verwant is aan URAT1 deur die MFS vou 45. Hierdie studies toon dat aminosuur-sykettings in TM1, TM7 en TM11 (asook residue in ander TM-segmente) direk kontak maak met substrate vir die GLUTs. Verder, in die inwaarts-oop konformasie van GLUT1 en GLUT5, kontak die ekstrasellulêre kante van TM1 en TM7 mekaar 42, in ooreenstemming met die voorspelde nabyheid van URAT1 Ser-35 en Phe-365 in die OAT1 rekenaarmodel, wat in die dieselfde bouvorm. In 'n ander rekenaarmodel van OAT1 is gesimuleerde konformasieveranderinge in die ekstrasellulêre kante van TM1 en TM7 46 waargeneem, wat 'n moontlike rol vir substraatvervoer vir residue binne hierdie domeine voorstel. Die presiese posisionering van hierdie URAT1-reste binne die proteïen is spekulatief en wag op verheldering deur die bepaling van 'n URAT1-kristalstruktuur.

      Ons voorspel dat hierdie URAT1-reste direk met beide substrate en inhibeerders kontak maak. Ter ondersteuning van hierdie hipotese het ons 'n nuwe en spesifieke menslike URAT1-bindingstoets ontwikkel. Alle inhibeerders het binding van die radio-gemerkte sonde verplaas, wat daarop dui dat ons funksionele karteringsdata 'n spesifieke bindingsplek binne URAT1 ontbloot het. Hierdie bindingstoets bied 'n nuwe hulpmiddel om die molekulêre interaksies van verbindings en substrate met URAT1 verder te karakteriseer. Alle urikosuriese middels wat ons tot dusver getoets het, werk in wisselwerking met hierdie aminosure binne URAT1. Die inhibeerders self is nie geïdentifiseer en ontwikkel deur standaard medisinale chemie benaderings nie en is dus struktureel baie divers. Ons glo die gemeenskaplikheid van binding kan te wyte wees aan die unieke eienskappe van die residue in hierdie streek wat inhibeerderinteraksies fasiliteer.

      Alhoewel die presiese aard van hierdie interaksies onbekend is, kan rURAT1 'n laer affiniteit vir uraat en die inhibeerders hê omdat die residue op posisies 35, 365 en 481 groter as die ooreenstemmende hURAT1-residue is, daarom kan steriese hindering die affiniteit van interaksies met die rot vervoerder. Residu 365 kom voor in 'n groep aromatiese residue in TM7 wat hoogs gekonserveer is in die SLC22 vervoerder familie, 'n domein wat getoon is om belangrik te wees in substraat interaksies vir OAT1 en OAT3 29,30. Anders as URAT1 waarin beide Phe-365 en Tyr-365 vervoeraktiwiteit ondersteun, word die ooreenstemmende residue in menslike OAT1 en rot OAT3, Tyr-354 en Tyr-352 egter streng vereis vir substraatherkenning. Mutasies na fenielalanien is onaktief 29,30, wat wys dat substraatherkenning plaasvind deur hidrofiliese kontakte met die tirosienhidroksielgroepe. Dit blyk dus dat herkenning van uraat en URAT1 inhibeerders deur residu 365 meganisties verskil, wat moontlik plaasvind deur hidrofobiese interaksies tussen aromatiese dele. Die hidroksielgroep van Tyr-365 van rURAT1 kan hierdie hidrofobiese interaksie steries belemmer om affiniteit te verminder.

      Voorheen het ons berig dat Phe-365 en Met-25 verkry is tydens die evolusie van ape (mense, ape, Ouwêreldse ape en Nuwewêreldape), en dat hierdie reste hoër uraataffiniteit in aap URAT1 bevorder, relatief tot nie- simian URAT1, wat Tyr-365 en Val-25 40 dra (Aanvullende Tabel 4). Residu 35 en 481 het duidelike filogenetiese verspreidings (Aanvullende Tabel 4) maar verskil ook tussen mens, rot en muis, en is dus ook geïdentifiseer in ontledings van mens-tot-rat URAT1 chimere. Ons verwag dat ander residue ook betrokke is by uraat en inhibeerder affiniteit. Omdat hURAT1 en rURAT1 'n 74% aminosuur-identiteit deel, sal chimeras van hierdie ortoloë nie alle residue wat betrokke is by inhibeerderbinding identifiseer nie. Gebaseer op struktuur/funksie-analise van URAT1 homoloë 31,33,45,46,47,48,49 sowel as van onlangse bevindinge van GLUT kristalstrukture 41,44, verwag ons dat gekonserveerde residue in baie TM segmente ook 'n rol speel in binding aan URAT1 substrate en inhibeerders. Die identiteit van residue wat ooreenstem met menslike URAT1-residue 35, 365 en 481 in ander URAT1-spesies (ortoloë) en in SLC22A subfamilie homoloë word in Aanvullende Tabel 4 getoon. Interessant genoeg kom 'n tirosienresidu in die meeste homoloë voor op die posisie wat ooreenstem met hURAT1-residu 365, sodat Phe-365 byna uniek aan hURAT1 is. Daarom kan hierdie fenielalanien belangrik wees in die hoë sterkte en spesifisiteit van bensbromaroon en verinurad vir hURAT1 (Tan) et al., manuskripte ingedien). Probenesied is egter meer nie-spesifiek en het 'n soortgelyke krag as hURAT1, hOAT4, hOAT1 en hOAT3 24 in ooreenstemming met 'n bevinding dat URAT1-residue 35, 365 en 481 almal voorkom binne volgordemotiewe wat algemeen is vir alle SLC22A-familielede 49 .

      Samevattend het ons verskeie aminosure in hURAT1 geïdentifiseer wat die hoë affiniteit interaksie met URAT1 inhibeerders bemiddel. Sommige van hierdie residue neem ook deel aan die herkenning en affiniteit vir die URAT1-substraat uriensuur. Dit verskaf 'n maklike meganisme vir inhibisie van URAT1: inhibeerders verhinder steries die interaksie van uraat met sleutelaminosure binne die sentrale kanaal van URAT1 om uriensuurvervoer te voorkom. Natuurlike polimorfismes in hierdie aminosure kan in beginsel die doeltreffendheid van URAT1-inhibeerders beïnvloed, alhoewel geeneen tot dusver geïdentifiseer is nie. Hierdie resultate kan ook help met die ontdekking van nuwe hoë affiniteit en spesifieke inhibeerders van URAT1, wat ook kan dien as veiliger en doeltreffender uraatverlagende terapieë vir hiperurikemie en jig.


      Biologie van okulêre vervoerders: uitvloei en invloei vervoerders in die oog

      Dhananjay Pal,. Ashim K. Mitra, in Ocular Transporters and Receptors, 2013

      2.2.1 Peptied-vervoerders

      Peptiedtransporters is belangrike plasmamembraanproteïene wat die sellulêre translokasie van dipeptiede en tripeptiede fasiliteer bykomend tot 'n verskeidenheid peptidomimetiese molekules soos angiotensien-omskakelende ensiem-inhibeerders, rennien-inhibeerders, β-laktam antibiotika en kefalosporiene. Die suur pH gegenereer deur Na + /H + wisselaar dien as die dinamiese krag vir die absorpsie van peptiede. Tot dusver is twee peptiedvervoerders geïdentifiseer: peptiedtransporter 1 (PEPT1, SLC15A1) en peptiedtransporter 2 (PEPT2, SLC15A2) [6-10]. Hierdie vervoerders deel soortgelyke topologie en bevat 12 voorspelde membraan-omspannende domeine (transmembraandomeine TMD's) met N- en C-termini wat na die sitosol gerig is (Figuur 2.1). Die proteïen PEPT1 kodeer vir 708 aminosuurreste terwyl PEPT2 vir 729 aminosuurreste kodeer. Hierdie vervoerstelsels beskik oor die unieke vermoë om dipeptiede en tripeptiede (onafhanklik van volgorde), insluitend verskillend gelaaide spesies, te vervoer. Hierdie vervoerders is stereospesifiek en omvat hoë affiniteit vir L-enantiomere van aminosuurreste relatief tot peptiede met een of meer D-enantiomere. Peptied-vervoerders word beskou as die eerste soogdier-voedingstofmembraan-vervoerders om 'n elektrochemiese protongradiënt as hul dryfkrag te gebruik [11].

      Figuur 2.1 . Membraantopologie van peptiedvervoerder 1 (PEPT1). (a) Die proteïen bevat 12 transmembraandomeine, met die N-terminale en C-terminale eindes in die sitosol. (b) Gebaseer op die ontleding van chimeriese vervoerders afgelei van PEPT1 en PEPT2, vorm transmembraandomeine in groen deel van die substraatbindende domein. Gekleurde oorblyfsels is van kardinale belang om te funksioneer. Soos aangetoon deur mutasie-analise, blyk histidienresidu, in geel, betrokke te wees by protonbinding en substraatherkenning. Residu wat in rooi getoon word, moduleer substraat en protonbinding. Die geïdentifiseerde streke kan 'n porieagtige struktuur vorm wat baie substrate bind en translokeer.

      Gereproduseer met toestemming [7]

      'n Plek-gerigte mutagenese-benadering het die struktuur-funksie-verwantskappe van PEPT1 en PEPT2 toegelig. Die N-terminale streek van die proteïen tot nege TMD's is voorspel om verantwoordelik te wees vir al die fenotipiese eienskappe [12]. Die eerste ses TMD's skets die grootste deel van die substraatbindende sak en hierdie streke word beskou as verantwoordelik vir die bepaling van die pH-afhanklikheid, terwyl die sewende tot negende TMD's substraataffiniteit bepaal [13, 14]. Al hierdie bevindings toon dat die N-terminale TMD's 'n porieagtige struktuur vorm en dat TMD's 7-9 die substraatbindende sak vorm. In die latere domein meng 'n stuk aminosuurreste (1-59) in met die sykettings van dipeptiede, en ander residue (60-91) dra aansienlik by tot die pH-afhanklike vervoer [15]. Verder het 'n plek-gerigte mutagenese benadering verskeie residue geïdentifiseer wat noodsaaklik is vir die funksie daarvan. Die rol van die Histamien (His 57)-residu (in TMD 2) is bestudeer en blyk geassosieer te word met protonbinding, deur twee nabygeleë tirosienresidu (Y 56 en Y 64 ) wat die lading stabiliseer. Sy 121 fasiliteer die neutralisering van die lading van suur peptiede deur protonasie en is verantwoordelik vir die herkenning van die substraat [16]. Ander residue in TMD's 1, 3, 5 en 7 blyk moduleerders van substraatbinding te wees. Alhoewel die onlangse struktuur-funksie-ontledings daartoe gelei het dat navorsers die biologie van peptied-vervoerders verstaan ​​en die substraatbindingseienskappe voorspel het, bly daar steeds 'n vraag oor hoe die peptied-vervoerders (PEPT1 en PEPT2) nie net peptiede en peptied kan vervoer nie. analoë soos β-laktam antibiotika, maar ook baie groter peptied-gekonjugeerde middels [17].

      Onlangs het die kristalstruktuur van PepTDus, 'n funksioneel soortgelyke prokariotiese homoloog van die soogdierpeptiedtransporters PEPT1 en PEPT2 vanaf Shewanella oneidensis is gerapporteer [6, 18]. Hierdie struktuur openbaar 'n ligandgebonde verstopte toestand vir hierdie vervoerderfamilie en verskaf nuwe insigte in 'n algemene vervoermeganisme. Newstead en kollegas [6, 18] het die peptiedbindingsplek in 'n sentrale hidrofiliese holte geïdentifiseer, wat 'n gebonde ligand van beide die ekstrasellulêre en intrasellulêre kante van die membraan afsluit. Aminosuurreste word beskou as betrokke by die koppeling van protone, wat naby die ekstrasellulêre hek van die sentrale holte gelokaliseer is. 'n Moontlike meganisme vir peptied-proton simport is ook voorgestel met behulp van drie verskillende stadiums: (A) uitwaartse konformasie, (B) afgeslote toestand en (C) inwaartse konformasie (Figuur 2.2). In stadium A kon peptied (Pep) en proton (H + ) toegang verkry tot onderskeie bindingsplekke via die uitwaartse holte, wat na die ekstrasellulêre kant van die membraan oopmaak. Die peptied-bindende gebied word gemaak van die oppervlaktes van beide die N- en C-terminale heliks bundels (verteenwoordig deur + en - simbole), terwyl die proton-bindende gebied geleë is in die area naby die ekstrasellulêre hek tydens uitwaartse konformasie . In die verstopte toestand sluit Pep in die sentrale holte af deur beide kante van die sentrale holte toe te maak. Maar die protonbindende gebied word steeds deur die ekstrasellulêre holte aan die ekstrasellulêre kant blootgestel. Tydens die inwaarts-gerigte stadium word beide Pep en H + vrygestel na die intrasellulêre kant van die membraan deur die inwaartse holte met die proton-bindende gebied blootgestel aan die intrasellulêre kant in hierdie konformasie.

      Figuur 2.2 . Implikasies vir proton-gedrewe peptied simport.

      Gereproduseer met toestemming [18]

      In die afwesigheid van 'n kristalstruktuur van menslike peptied-vervoerder, kan rekenaar-/homologie-modelleringsbenaderings wat deur funksionele eksperimente gerugsteun word, 'n geldige benadering bly om die driedimensionele struktuur van PEPT [19] toe te lig. Aansienlik breër begrip van strukturele biologie het 'n paar insigte verskaf in die konformasie buigsaamheid van die peptied-vervoerders, maar biofisiese en funksionele ontledings van ligandbinding moet verder bestudeer word om die molekulêre meganisme van geneesmiddelvervoer moontlik te maak.


      EKSPERIMENTELE PROSEDURES

      Volgorde-belyning en -analise

      Generasie van mutante konstrukte

      Om die bepaling van membraanlokalisering te vergemaklik, is mutante gekonstrueer deur gebruik te maak van geel fluoressensieproteïen (YFP)-gemerkte wilde tipe (WT) menslike PMAT as templaat. YFP is gemerk by die N-termini van die WT en mutante PMAT vervoerders, en ons vorige studies het getoon dat die YFP tagging geen effek gehad het op substraat selektiwiteit en kinetiese gedrag van die vervoerder (16). Die WT menslike PMAT is voorheen gesubkloon in die YFP vektor pEYFP-C1 (Clontech, Palo Alto, CA) (5). Mutante is gegenereer deur plekgerigte mutagenese met behulp van die QuickChange-stel (Stratagene, La Jolla, CA) volgens die vervaardiger se protokol. Die volgorde van elke mutant is bevestig deur direkte DNA-volgordebepaling in die Departement Biochemie aan die Universiteit van Washington.

      Stabiele uitdrukking in MDCK-selle

      YFP-gemerkte mutantkonstrukte is in MDCK-selle getransfekteer met behulp van Lipofectamine 2000 transfekteringsreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stabiel getransfekteerde sellyne is verkry deur selle te kweek in minimaal essensiële medium wat 10% fetale bees serum en G418 (1000 μg/ml) bevat. Leë pEYFP-C1 vektor is in MDCK selle getransfekteer om die kontrole sellyn te verkry. Na 2𠄳 weke se geneesmiddelseleksie, is fluoressensie-positiewe selle gesuiwer deur 'n FACS Vantage SE-sorteerder (BD Biosciences, San Jose, CA) by die Selanalisesentrum by die Universiteit van Washington, Gesondheidswetenskappesentrum. Die gesorteerde selle is gekweek en onderhou in minimale noodsaaklike medium wat G418 (200 μg/ml) bevat.

      Konfokale fluoressensiemikroskopie

      Om die sellulêre lokalisering van YFP-gemerkte mutante vervoerders te bepaal,

      2휐 5 selle is gegroei bo-op mikroskoop dekglas in 6-put plate (Falcon) vir 2𠄳 dae tot samevloeiend. Selle is op mikroskoopglasskyfies met Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) gemonteer en gevisualiseer met 'n Leica SP1 konfokale mikroskoop toegerus met 'n argonlaser as die ligbron by die Keck Mikroskopiefasiliteit by die Universiteit van Washington. Beelde is vasgevang deur opwekking by 488 nm en emissie by 515 nm.

      Funksionele karakterisering in MDCK-selle

      Stabiel getransfekteerde MDCK-selle is in 24-put plate uitgeplaat en toegelaat om vir 2𠄳 dae te groei totdat dit konfluent is. Groeimedium is geaspireer en elke put is een keer met Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) buffer (5,6 mM glukose, 125 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH) gespoel2PO4, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 25 mM HEPES, pH 7.4) en vooraf geïnkubeer in dieselfde buffer vir 15 min by 37ଌ. Vervoertoetse is uitgevoer by 37ଌ deur selle te inkubeer in KRH buffer wat 'n 3 H-gemerkte ligand bevat. [3 H] MPP + (85 Ci/mmol) en [3 H] uridien (30 Ci/mmol) is verkry van American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO). [3 H] 5-HT (5-hidroksi-[1,2- 3 H] triptamien kreatiniensulfaat, 28.1 Ci/mmol) en [3 H] dopamien (3,4-dihidroksie-[2,5,6- 3 H] fenieletielamien, 51.3 Ci/mmol) was van PerkinElmer Life Sciences, Inc. Alle ander chemikalieë is van Sigma (St. Louis, MO) verkry. Vir vervoerstudies wat 3 H-gemerkte nukleosied uridien gebruik, is 0.5 μM NBMPR by die vervoerbuffer gevoeg om endogene nukleosied opname aktiwiteite te onderdruk. Vir uridien inhibisie studies is selle geïnkubeer met 3 H-gemerkte ligande in die teenwoordigheid van 1 mM uridien en vervoer toetse is uitgevoer by 37ଌ. Opname is beëindig deur die selle drie keer met yskoue KRH buffer te was. Selle is dan opgelos met 0,5 ml 1N NaOH en geneutraliseer met 0,5 ml 1N HCl. Radioaktiwiteit in die sellysaat is gekwantifiseer deur vloeistofscintillasietelling. Proteïenkonsentrasie in elke put is gemeet met behulp van BCA-proteïentoetsstel (Pierce) en die opname in elke put is genormaliseer na sy proteïeninhoud. In alle studies is selle wat met 'n leë vektor getransfekteer is, as agtergrondkontrole gedien. Vervoerder-spesifieke opname is bereken deur die agtergrond opname in vektor-getransfekteerde selle af te trek.

      Isolasie van Plasma Membraan Proteïene deur Sel Oppervlak Biotinilering

      Stabiel getransfekteerde MDCK-selle is op 60 mm-plate uitgeplaat en gekweek tot konfluent. Selle is twee keer gewas met 3 ml yskoue PBS/CM (138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 8,0). Biotinylering is op ys uitgevoer deur inkubasie met 1 ml yskoue PBS/CM wat 'n membraan-ondeurdringbare biotinyleringsreagens Sulfo-NHS-SS-biotien (0.5 mg/ml) bevat (Pierce, Rockford, IL). Na twee opeenvolgende 20 min inkubasies by 4ଌ met vars voorbereide NHS-SS-biotien en sagte skud, is selle kortliks gespoel met 3 ml PBS/CM wat 100 mM glisien bevat. Selle is verder geïnkubeer by 4ଌ met dieselfde oplossing vir 20 min om volledige blus van die ongereageerde NHS-SS-biotien te verseker. Selle is dan op ys gesolubiliseer deur in 1 ml lysisbuffer wat 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM fenielmetiel-sulfonielfluoried en Protease-inhibeerders Cocktail (Roche) bevat het, vir 1 uur te inkubeer met af en toe vortexing. Proteïenkonsentrasies is gemeet vanaf die supernatant-lisaat en vyftig mikroliter UltraLink Immobilized NeutrAvidin-proteïen (Pierce) is dan by die supernatant gevoeg vir die isolasie van membraanproteïene. Membraanproteïene is onderworpe aan Western klad met behulp van 'n muis monoklonale anti-geel fluoresserende proteïen teenliggaam (JL-8) (BD Biosciences) teen 1:1000 verdunning, gevolg deur peperwortelperoksidase-gekonjugeerde bok anti-muis IgG (1:20,000 verdunning). Die chemiluminescerende seine in die Western-vlekke is opgespoor deur SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) te gebruik, gevolg deur blootstelling van die vlekke aan x-straalfilms. Bandintensiteit is gekwantifiseer deur densitometrie met behulp van die ImageQuant sagteware (Molecular Dynamics). Soos voorheen gerapporteer (16), dubbele of veelvuldige proteïenbande rondom die verwagte molekulêre grootte (

      75 kDa) is waargeneem vir die YFP-gemerkte PMAT-proteïene, wat te wyte kan wees aan differensiële glikosilering van PMAT.

      Heliese wielanalise

      Die heliese wiele is gegenereer met behulp van die Helix Wheel-program op die EXPASY molekulêre biologie bediener en daarna getransponeer op 'n heliese wiel sjabloon. Daar word aanvaar dat die transmembraandomein 'n standaard α–heliks (3.6 residue/heliese draai) is. Elke oorblyfsel in TM word elke 100° om die middel van 'n sirkel geplot. Die projeksie van die posisies van die residue is getoon op 'n vlak loodreg op die heliese as. Hidrofobisiteit en hidrofilisiteit word volgens die konsensusskaal van Eisenberg et al. (21).

      Data-analise

      Vir alle opname eksperimente is data uitgedruk as die gemiddelde ± S.D. van drie onafhanklike eksperimente (n=3) met verskillende selgange. Vir elke eksperiment is opname in drievoude in drie verskillende putte op dieselfde plaat uitgevoer. Waar van toepassing, bl waardes is verkry deur Student’s t-toets. Vir Michaelis-Menten-studies is data by die vergelyking V= gepas Vmaks [S]/(Km+[S]) met behulp van Kaleidagraph Weergawe 3.6 (Synergy Software, Reading, PA), waar V die vervoertempo is en [S] die substraatkonsentrasie is. Kinetiese parameters is bepaal deur nie-lineêre kleinste-kwadrate-regressiepassing soos voorheen beskryf (5, 6).


      Word die affiniteit van 'n ensiem of vervoerder vir sy substraat of opgeloste stof beïnvloed deur die aminosure by die bindingsplek? - Biologie

      Ektoïen en sy afgeleide 5-hidroksiektoïen is versoenbare opgeloste stowwe wat wyd deur bakterieë gesintetiseer word om fisiologies osmotiese stres te hanteer. Hulle dien ook as chemiese chaperone en handhaaf die funksionaliteit van makromolekules. 5-hidroksiektoïen word uit ektoïen geproduseer deur 'n stereo-spesifieke hidroksilering, 'n ensiematiese reaksie wat deur die ektoïenhidroksilase (EctD) gekataliseer word. Die EctD-proteïen is 'n lid van die nie-heem-bevattende yster(II)- en 2-oksoglutaraat-afhanklike dioksigenase-superfamilie en is evolusionêr goed bewaar. Ons het die ektoïenhidroksilase van die koue-aangepaste mariene ultra-mikrobakterie bestudeer Sfingopyxis alaskensis (Sa) en gevind dat die gesuiwerde SaEctD-proteïen is 'n homodimeer in oplossing. Ons het bepaal die SaEctD kristalstruktuur in sy apo-vorm, gekomplekseer met die yster katalisator, en in 'n vorm wat yster bevat, die mede-substraat 2-oksoglutaraat, en die reaksieproduk van EctD, 5-hidroksiektoïen. Die yster- en 2-oksoglutaraatligande word binne die EctD-aktiewe plek gebind op 'n wyse soortgelyk aan dié wat gevind word in ander lede van die dioksigenase-superfamilie. 5-Hydroksiektoïen word egter deur EctD gekoördineer op 'n manier anders as wat gevind word in 'n hoë affiniteit opgeloste stof reseptor proteïene wat in samewerking met mikrobiese invoerstelsels vir ektoïne werk. Ons kristallografiese analise bied 'n gedetailleerde oorsig oor die aktiewe plek van die ektoienhidroksilase en ontbloot 'n ingewikkelde netwerk van interaksies tussen die ensiem en sy ligande wat gesamentlik die hidroksilasie van die ektoiensubstraat op 'n posisie- en stereospesifieke wyse verseker.

      Hierdie werk is gedeeltelik ondersteun deur Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant SFB 987, die LOEWE-program van die staat Hessen (via die Sentrum vir Sintetiese Mikrobiologie, Marburg), die Max-Planck Instituut vir Terrestriële Mikrobiologie (Marburg) deur die Emeritus Groep van RK Thauer , 'n bydrae deur die Fonds der Chemischen Industrie, deur die Heinrich-Heine-Universiteit Düsseldorf en sy Instituut vir Biochemie, en deur die inisiatief "Fit for Excellence" van die Heinrich-Heine-Universiteit.


      Ensieme: Hoe hulle werk en wat hulle doen

      Ensieme help om chemiese reaksies in die menslike liggaam te versnel. Hulle bind aan molekules en verander hulle op spesifieke maniere. Hulle is noodsaaklik vir asemhaling, die vertering van voedsel, spier- en senuweefunksie, onder duisende ander rolle.

      In hierdie artikel sal ons verduidelik wat 'n ensiem is, hoe dit werk, en 'n paar algemene voorbeelde van ensieme in die menslike liggaam gee.

      Deel op Pinterest Die ensiem amilase (foto), breek stysel in suikers af.

      Ensieme is gebou van proteïene wat in ingewikkelde vorms gevou is, dit is regdeur die liggaam teenwoordig.

      Die chemiese reaksies wat ons aan die lewe hou – ons metabolisme – maak staat op die werk wat ensieme verrig.

      Ensieme versnel (kataliseer) chemiese reaksies in sommige gevalle kan ensieme ’n chemiese reaksie miljoene kere vinniger maak as wat dit daarsonder sou gewees het.

      A substraat bind aan die aktiewe webwerf van 'n ensiem en word omgeskakel in produkte. Sodra die produkte die aktiewe plek verlaat, is die ensiem gereed om aan 'n nuwe substraat te heg en die proses te herhaal.

      Die spysverteringstelsel – ensieme help die liggaam om groter komplekse molekules in kleiner molekules, soos glukose, af te breek sodat die liggaam dit as brandstof kan gebruik.

      DNA replikasie – elke sel in jou liggaam bevat DNS. Elke keer as 'n sel verdeel, moet daardie DNA gekopieer word. Ensieme help in hierdie proses deur die DNS-spoele af te wikkel en die inligting te kopieer.

      Lewer ensieme – die lewer breek gifstowwe in die liggaam af. Om dit te doen, gebruik dit 'n reeks ensieme.

      Die "slot en sleutel" model is die eerste keer voorgestel in 1894. In hierdie model is 'n ensiem se aktiewe plek 'n spesifieke vorm, en net die substraat sal daarin pas, soos 'n slot en grendel.

      Hierdie model is nou opgedateer en word die genoem geïnduseerde-pas model.

      In hierdie model verander die aktiewe terrein van vorm soos dit met die substraat in wisselwerking tree. Sodra die substraat heeltemal ingesluit is en in die presiese posisie is, kan die katalise begin.

      Ensieme kan slegs in sekere toestande werk. Die meeste ensieme in die menslike liggaam werk die beste by ongeveer 37°C – liggaamstemperatuur. By laer temperature sal hulle steeds werk, maar baie stadiger.

      Net so kan ensieme slegs in 'n sekere pH-reeks (suur/alkalies) funksioneer. Hul voorkeur hang af van waar hulle in die liggaam gevind word. Byvoorbeeld, ensieme in die ingewande werk die beste by 7,5 pH, terwyl ensieme in die maag die beste werk by pH 2 omdat die maag baie suurder is.

      As die temperatuur te hoog is of as die omgewing te suur of alkalies is, verander die ensiem van vorm dit verander die vorm van die aktiewe plek sodat substrate nie daaraan kan bind nie – die ensiem het gedenatureer.

      Sommige ensieme kan nie funksioneer tensy hulle 'n spesifieke nie-proteïenmolekule aan hulle het nie. Dit word kofaktore genoem. Byvoorbeeld, koolstofanhidrase, 'n ensiem wat help om die pH van die liggaam te handhaaf, kan nie funksioneer tensy dit aan 'n sinkioon geheg is nie.

      Om te verseker dat die liggaam se stelsels reg werk, moet ensieme soms vertraag word. Byvoorbeeld, as 'n ensiem te veel van 'n produk maak, moet daar 'n manier wees om produksie te verminder of te stop.

      Ensieme se aktiwiteit kan op verskeie maniere geïnhibeer word:

      Mededingende inhibeerders – 'n molekule blokkeer die aktiewe plek sodat die substraat met die inhibeerder moet kompeteer om aan die ensiem te heg.

      Nie-mededingende inhibeerders – 'n molekule bind aan 'n ensiem iewers anders as die aktiewe plek en verminder hoe effektief dit werk.

      Onmededingende inhibeerders – die inhibeerder bind aan die ensiem en substraat nadat hulle aan mekaar gebind het. Die produkte verlaat die aktiewe plek minder maklik, en die reaksie word vertraag.

      Onomkeerbare inhibeerders – ’n onomkeerbare inhibeerder bind aan ’n ensiem en deaktiveer dit permanent.

      Daar is duisende ensieme in die menslike liggaam, hier is net 'n paar voorbeelde:

      • Lipases – 'n groep ensieme wat help om vette in die ingewande te verteer.
      • Amilase – help om stysels in suikers te verander. Amilase word in speeksel aangetref.
      • Maltase – ook gevind in speeksel breek die suiker maltose in glukose. Maltose word in voedsel soos aartappels, pasta en bier aangetref.
      • Tripsien – gevind in die dunderm, breek proteïene af in aminosure.
      • Laktase – gevind ook in die dunderm, breek laktose, die suiker in melk, in glukose en galaktose.
      • Asetielcholienesterase – breek die neuro-oordragstof asetielcholien in senuwees en spiere af.
      • Helicase – ontrafel DNA.
      • DNA-polimerase – sintetiseer DNA vanaf deoksiribonukleotiede.

      Ensieme speel 'n groot rol in die daaglikse bestuur van die menslike liggaam. Deur verbindings te bind en te verander, is hulle noodsaaklik vir die behoorlike funksionering van die spysverteringstelsel, die senuweestelsel, spiere en nog baie meer.


      Verskil tussen draer- en kanaalproteïene

      Dit is nodig om stowwe oor die selmembraan te vervoer om die selle aktief en lewendig te hou. Hierdie stowwe word basies deur membraantransportproteïene in die plasmamembraan van selle vervoer. Daar is twee tipes membraanvervoerproteïene draproteïene en kanaalproteïene, wat betrokke is by die vervoer van wateroplosbare en onoplosbare stowwe oor die selmembraan. Hierdie proteïene laat basies toe dat polêre molekules soos ione, suikers, aminosure, nukleotiede en metaboliete oor die plasmamembraan beweeg.

      Wat is draerproteïene?

      Draerproteïene is die integrale proteïene wat in die lipieddubbellaag van selmembraan strek, en dien as kanale vir wateroplosbare stowwe soos glukose en elektroliete. Wanneer die opgeloste stowwe vervoer word, bind draerproteïene opgeloste stowwe aan die een kant van 'n membraan, ondergaan konformasieveranderinge en stel dit aan die ander kant van die membraan vry. Hierdie proteïene kan beide aktiewe en passiewe vervoer bemiddel. Tydens die passiewe vervoer diffundeer molekules langs die konsentrasiegradiënt sonder om energie te verbruik. Aktiewe vervoer is die beweging van opgeloste stofdeeltjies teen die konsentrasiegradiënt, en dit benodig energie. Draerproteïene tree soos ensieme op. Hulle bind slegs spesifieke molekules, en die wyse van aanhegting is soortgelyk aan dié tussen die aktiewe plek van 'n ensiem en sy substraat. Voorbeelde vir sommige draerproteïene sluit in Glucose Transporter 4 (GLUT-4), Na + -K + ATPase, Ca 2+ ATPase ens.

      Wat is kanaalproteïene?

      Kanaalproteïene is ioon-selektief en bevat 'n porie waarin opgeloste stof teen hoë vloedtempo's deurgaan wanneer die kanaal oop is. Die hoofkenmerke van kanaalproteïene sluit in opgeloste stof selektiwiteit, 'n vinnige tempo van deurdringing van opgeloste stof, en poortmeganismes wat deurdringing van opgeloste stof reguleer. Sommige belangrike kanaalproteïene sluit in dihidropiridienreseptor, Ca 2+ kanaalproteïen, stadige Na + kanaalproteïen, vinnige Na + kanaalproteïene, nikotien asetielcholien (nACh) reseptor, N-metiel-D-asparaat ens.

      Wat is die verskil tussen Draer- en Kanaalproteïene?

      • Opgeloste stowwe diffundeer deur die porie van kanaalproteïene, terwyl beroepsproteïene opgeloste stowwe aan die een kant van die membraan bind en dit aan die ander kant vrystel.

      • In vergelyking met kanaalproteïene, het draerproteïene baie stadige vervoertempo's (sowat 1000 opgeloste stofmolekules per sekonde).

      • Anders as draerproteïene, bevat kanaalproteïene 'n porie, wat die vervoer van opgeloste stowwe vergemaklik.

      • Anders as kanaalproteïene, het draerproteïene alternatiewe opgeloste stof-gebonde konformasies.

      • Kanaalproteïene is lipoproteïene, terwyl draerproteïene glikoproteïene is.

      • Draerproteïene kan beide aktiewe en passiewe vervoer bemiddel, terwyl kanaalproteïene slegs passiewe vervoer kan bemiddel.

      • Kanaalproteïene word gesintetiseer op ribosome wat aan endoplasmiese retikulum gebind is, terwyl draerproteïene gesintetiseer word op vrye ribosome in die sitoplasma.

      • Draerproteïene kan molekules of ione teen die konsentrasiegradiënt vervoer, terwyl kanaalproteïene nie kan nie.

      • Draerproteïene beweeg oor die membraan, terwyl kanaalproteïene nie beweeg terwyl molekules of ione vervoer word nie.

      • Kanaalproteïene slaag slegs deur wateroplosbare molekules, terwyl draerproteïene beide wateroplosbare en onoplosbare stowwe vervoer.


      Kyk die video: DR NESTOROVIĆ OTKRIO SVE O KARCINOMU:OVO VOĆE UNIŠTAVA ĆELIJE TUMORA MOZGA,JAJNIKA, PLUĆA I CREVA (September 2022).