Inligting

6.3: Auxotrofe en selektiewe media - Biologie

6.3: Auxotrofe en selektiewe media - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die ontmoet mutante is Met-auxotrofe, wat beteken dat hulle nie in staat is om te groei in media wat nie Met bevat nie. Byvoorbeeld, omdat die BY4742-stam mutasies in die HIS3, LEU2, LYS2 en URA3 gene, sal die stam slegs groei in media wat histidien, leusien, lisien en urasiel bevat. Die plasmiede wat vir transformasie gebruik word, dra funksionele allele van 'n geen wat gebrekkig is in die gasheerstam, wat dit moontlik maak om transformante te selekteer deur hul vermoë om te groei op media wat nie die noodsaaklike voedingstof het nie.

Sintetiese media is 'n noodsaaklike hulpmiddel vir die kweek en bestudering van auxotrofes, omdat al die komponente gedefinieer is. Gisnavorsers het 'n verskeidenheid verskillende formulerings vir sintetiese media ontwikkel. Alle sintetiese media bevat 'n koolstofbron (gewoonlik D-glukose), 'n stikstofbron en noodsaaklike vitamiene en minerale. Die vitamiene en minerale word gewoonlik aangekoop
in 'n formulering bekend as gisstikstofbasis (YNB). Die aanvullings wat by sintetiese media gevoeg word, kan aangepas word om die groei van bepaalde genotipes te ondersteun of te selekteer. In hierdie kursus sal ons Yeast Complete (YC) medium gebruik wat die groei van die meeste ondersteun S. cerevisiaestamme. Die groeitempo van wilde tipe stamme in YC is ietwat stadiger as dié in ryk media soos YPD, maar die stamme is lewensvatbaar vir lang tydperke. Die tabel op die volgende bladsy toon die samestelling van YC, wat 'n ryk voorraad aminosure en nukleotiedbasisse insluit. Benewens die volledige YC-medium, sal ons ook selektiewe media gebruik waarin sommige komponente uitgelaat is. Byvoorbeeld, in hierdie laboratorium sal ons YC-Met "uitval" media gebruik, wat al die YC komponente in die volgende tabel bevat, behalwe metionien.

*YNB is 'n komplekse mengsel van vitamiene, minerale en soute. Finale konsentrasies in YC: Vitamiene (μg/liter): biotien (2), kalsiumpantotenaat (400), foliensuur (2), inositol (2000), niasien (400), p-aminobensoësuur (200), piridoksienhidrochloried (400), riboflavien (200), tiamienhidrochloried (400) ).
Minerale (μg/liter): boorsuur (500), kopersulfaat (40), kaliumjodied (100), ferrichloried (200), mangaansulfaat (400), natriummolibdaat (200), sinksulfaat (400).
Soute (mg/liter): monobasies kaliumfosfaat (1000), magnesiumsulfaat (500), natriumchloried (100), kalsiumchloried (100).
(Bron: labs.fhcrc.org/gottschling/Ye...tocols/yc.html)


Inleiding tot Yeast Media

Giste is eukariotiese mikroörganismes wie se genome omvattend bestudeer is en sommige is in volgorde geplaas. Hulle is relatief maklik om onder laboratoriumtoestande te groei. Boonop vertoon hulle, ten spyte van hul klein genoomgrootte, sellulêre kenmerke en prosesse wat hoogs behoue ​​bly onder die meeste eukariote. Hulle het byvoorbeeld membraangebonde organelle, sitoskelet, kern-DNS en transkripsiemeganismes wat soortgelyk is aan dié wat in hoër eukariote voorkom. Verder het giste baie goed gekarakteriseerde sekretoriese proteïene en feromone. Verskeie gisgene wat betrokke is by proteaseverwerking en afskeiding is ook geïdentifiseer. Giste kan dus vir verskeie eukariotiese geen- en proteïenstudies gebruik word met behulp van geskikte molekulêre biologie-instrumente. Sommige toepassings vir giskulture sluit in sintese van proteïenuitdrukkingstelsels, die studie van spesifieke geen- of proteïenfunksies, en die ontledings van nuwe proteïeninteraksies. Hulle word ook gebruik vir baie industriële toepassings soos fermentasie, bak en bioremediëring.

Giskultuurmedia speel 'n beduidende rol in die ondersteuning van groei in beide klein- en grootskaalse doeleindes. Tipies sluit 'n giskultuurmedium peptoon, gisekstrak en dekstrose of glukose in. Selfs geringe verskille in mediasamestelling kan giste met duidelike groei-eienskappe lewer.


Cas9-gegenereerde eksotrofe van Phaeodactylum tricornutum word gekenmerk deur klein en groot delesies wat deur plasmied-gebaseerde gene aangevul kan word

Die model diatoom Phaeodactylum tricornutum is 'n aantreklike kandidaat vir sintetiese biologie toepassings. Ontwikkeling van auxotrophic stamme van P. tricornutum sal alternatiewe selektiewe merkers vir algemeen gebruikte antibiotika-weerstandsgene verskaf. Hier, met behulp van CRISPR/Cas9, toon ons suksesvolle redigering van gene in die uracil-, histidien- en triptofaan-biosintetiese weë. Redigeringsgebeurtenisse word gekenmerk deur verlies aan heterosigositeit en deur die voorkoms van groot delesies van tot

2.7-kb gesentreer op die redigeringswerf. Die urasiel en histidien-benodigde fenotipes kan aangevul word deur plasmied-gebaseerde kopieë van die ongeskonde gene na genesing van die Cas9-redigeerplasmied. Groei van uracil-auxotrofe op media aangevul met 5-FOA en uracil lei tot verlies van die komplementerende plasmied, wat 'n maklike metode bied vir plasmied-genesing met potensiële toepassings in stam-ingenieurswese en CRISPR-redigering. Metabolomiese karakterisering van uracil-auxotrofe het veranderinge in sellulêre orotaatkonsentrasies geopenbaar wat ooreenstem met gedeeltelike of volledige verlies van orotaatfosforibosieltransferase-aktiwiteit in uitklop-stamme. Ons resultate brei die reeks uit P. tricornutum ouksotrofiese stamme en demonstreer dat ouksotrofiese komplementasiemerkers 'n lewensvatbare alternatief vir tradisioneel gebruikte antibiotika seleksiemerkers bied. Plasmied-gebaseerde eksotrofiese merkers behoort die reeks genoomingenieurstoepassings uit te brei en 'n manier te bied vir bio-insluiting van gemanipuleerde P. tricornutum stamme.


Resultate

Identifikasie van Cas9-teikens in biosintetiese padgene

Ons het die KEGG-voorspellings 23,24 ondersoek gebaseer op die genoomvolgorde van P. tricornutum om gene in die uracil- en histidien-biosintetiese weë vir Cas9-redigering te identifiseer. Ons het gefokus op hierdie twee weë as urasiel- en histidien-uksotrofie, en teen-seleksiestrategieë word algemeen in ander model-organismes gebruik. Hierdie benadering het die voorheen beskryfde bi-funksionele PtUMPS-geen geïdentifiseer wat voorspel word om twee stappe in die uracil-baan te kataliseer - omskakeling van orotaat na orotidienmonofosfaat (OMP), en omskakeling van OMP na uridienmonofosfaat (UMP) (Fig. 1A, Aanvullende Fig. S1) 22 . Proteïene wat ortoloë is van gekarakteriseerde ensieme wat by histidienbiosintese betrokke is, is ook geïdentifiseer (Fig. 2A, Aanvullende Fig. S2). Die PHATR_3140-geen, hierna genoem PtPRA-PH/CH, kodeer 'n voorspelde bifunksionele proteïen wat volgorde-ooreenkoms met die bakteriële proteïen HisIE, en sy plant-eweknie HISN2 25,26 deel. Hierdie proteïene beskik oor twee funksionele domeine wat onderskeidelik homoloog is aan die fosforibosiel-ATP pirofosfohidrolase (PRA-PH) en fosforibosiel-AMP siklohidrolase (PRA-CH) ensieme. PRA-PH en PRA-CH, alleen of as 'n bifunksionele proteïen, word voorspel om twee opeenvolgende stappe te kataliseer wat vroeg in die histidien-biosintese-weg voorkom (Fig. 2A, Aanvullende Fig. S2). Daar is gevind dat die PtIGPS-geen wat kodeer vir imidasool gliserol fosfaat sintase ('n HIS3 homoloog) 'n gedupliseerde geen in die P. tricornutum genoomsamestelling en dus nie as 'n Cas9-teiken geprioritiseer nie.

Ons het ook die PtI3GPS-PRAI-geen as 'n potensiële teiken geïdentifiseer aangesien dit 'n voorspelde bi-funksionele ensiem kodeer wat 'n samesmelting van indool-3-gliserol-fosfaat sintase (I3GPS) en fosforibosilantranilaat-isomerase (PRAI) is, en twee opeenvolgende stappe sal kataliseer. in die triptofaan-biosintese-weg (Aanvullende Fig. S3).

CRISPR-gegenereerde uitklophoue in die voorspelde P. tricornutum uracil biosintese pad. (A) ’n Gedeelte van die voorspelde P. tricornutum biosintese-weg vir die omskakeling van koolsuur na urasiel en uridientrifosfaat, met die PtUMPS-ensiem in blou uitgelig. Die mededingende inhibeerder, 5-fluoroorotiese suur (5-FOA), word in 'n gestreepte blokkie gewys op die posisie waar dit die pad binnegaan. Verkorte name vir molekules en ensieme word tussen hakies aangedui, en die voorspelde ooreenstemmende P. tricornutum geenname word tussen vierkantige hakies aangedui. (B) Voorbeeldbeeld van T7EI-redigeertoets om ekskonjugante te skerm vir potensiële redigeergebeurtenisse in die PtUMPS-geen. Substraat dui op PtUMPS-geenfragmente wat deur die PCR geamplifiseer word, terwyl T7-produk ekskonjugante aandui met bewyse van Cas9-redigering. WT, wild-tipe P. tricornutum genomiese DNA wat in die T7EI-redigeertoets gebruik word. M, 100 bp leer met groottes aangedui in basispare (bp). Hierdie beeld is uit 'n groter beeld gesny (Aanvullende Fig. S10). (C) Voorbeeld van fenotipiese sifting van een PtUMPS-uitklop-stam ((Delta) UMPS2) geplaat op L1 alleen of L1 aangevul met uracil by die aangeduide verdunning van aanvanklike konsentrasie. (D) Voorbeeld van sifting vir verlies van die zeosien-weerstandige Cas9-redigeerplasmied in 'n (Delta) UMPS2-uitklop-stam deur plating op L1 aangevul met uracil of L1 aangevul met uracil en zeocin. (E) Sanger-volgorde-spore van gekarakteriseerde PtUMPS-uitkloppe met die posisie (onder spoor) en tipe invoeging of skrapping (bo spoor) wat vir elke alleel van die drie stamme aangedui is. (F) Grafiese kaart van die posisie en omvang van indels vir elk van die drie PtUMPS-uitklophoue relatief tot die wildtipe UMPS-geen (boaan gewys). Rooi reghoeke dui nukleotieddelesies aan, groen driehoeke dui nukleotiedinsersies aan, die geel en blou reghoeke op die WT-geen dui die posisie van die PtUMPS aktiewe plekke aan (orotaat fosforibosieltransferase en orotidine-5'-fosfaatdekarboksilase), en die wit reghoeke met stippellyne introne verteenwoordig.

Om die genomiese teikenplekke te bevestig, het ons die PtUMPS- en PtPRA-PH/CH-gene van die PtUMPS- en PtPRA-PH/CH-gene van die P. tricornutum CCAP 1055/1-stam wat in ons laboratorium gebruik word. Twee afsonderlike allele vir beide die PtUMPS en PtPRA-PH/CH gene is geïdentifiseer. Sewe enkelnukleotied polimorfismes (SNPs) in die PtUMPS allele lei tot aminosuursubstitusies wat die twee allele van mekaar en van die gepubliseerde P. tricornutum genoom (Aanvullende Tabel S1). Alle substitusies is geleë in nie-gekonserveerde streke van die PtUMPS-proteïen (Aanvullende Fig. S4). Net so is 'n A tot G mutasie by basisposisie 1205 in alleel 2 van die PtPRA-PH/CH geen geïdentifiseer (Aanvullende Tabel S1). Hierdie transversie skakel 'n hoogs bewaarde glutamaat om na 'n glisien in die katalitiese terrein van die PRA-PH-domein. Die impak van hierdie substitusies op PtUMPS en PtPRA-PH/CH funksie is onbekend.

CRISPR-gegenereerde uitklophoue in die voorspelde P. tricornutum histidien biosintese pad. (A) ’n Gedeelte van die voorspelde biosintese-weg vir omskakeling van ribose-5-fosfaat na l-histidien, met die bi-funksionele PtPRA-PH/CH ensiem uitgelig in blou. Verkorte name vir elke ensiem word tussen hakies aangedui, en die voorspelde ooreenstemmende P. tricornutum geenname word tussen vierkantige hakies aangedui. (B) Voorbeeldbeeld van T7EI-redigeertoets om ekskonjugante te skerm vir potensiële redigeergebeurtenisse in die PtPRA-PH/CH-geen. Substraat dui op PtPRA-PH/CH geenfragmente wat deur die PCR geamplifiseer word, terwyl T7 produk ekskonjugante aandui met bewyse van Cas9 redigering. WT, wild-tipe P. tricornutum genomiese DNA wat in die T7EI-redigeertoets gebruik word. M, 1 kb leer met groottes aangedui in basispare (bp). Hierdie beeld is uit 'n groter beeld gesny (Aanvullende Fig. S11). (C) Voorbeeld van fenotipiese sifting van een PtPRA-PH/CH uitklop-stam ((Delta) PtPRAPHCH1) getransformeer met of sonder die komplementerende PRA-PH/CH plasmied (pPtPRAPHCH) op L1 vaste media alleen of L1 aangevul met histidien by die dui verdunning van aanvanklike konsentrasie aan. WT, wild-tipe P. tricornutum druk. (D) Sanger-volgorde-spore van gekarakteriseerde PtPRA-PH/CH-uitkloppunte met die posisie (onder spoor) en tipe invoeging of skrapping (bo spoor) wat vir elke alleel aangedui is. (E) Grafiese kaart van die posisie en omvang van indels vir PtPRA-PH/CH-uitklophou relatief tot die wildtipe PtPRA-PH/CH-geen (boaan getoon). Rooi reghoeke dui op nukleotieddelesies, terwyl die geel en blou reghoeke op die WT-geen die posisie van die PRA-PH en PRA-CH aktiewe plekke aangedui het.

Cas9 en TevCas9 redigering van ouksotrofiese gene word gekenmerk deur verlies aan heterosigositeit

Om uitslae in urasiel- en histidien-biosintetiese gene te genereer, het ons Cas9- en TevCas9-enkelgids-RNA's (sgRNA's) ontwerp en individueel gekloon teen verskillende plekke in die PtUMPS-, PtPRA-PH/CH- en PtI3GPS-PRAI-gene (Tabel 1, Aanvullende Fig. S5) –S7). Die TevCas9 nuklease is 'n dubbele nuklease wat 'n 33-38 basispaar delesie genereer tussen die I-TevI ​​(Tev) en Cas9 gesnyde plekke 27 . Die teikenvereistes vir 'n TevCas9-nuklease is 'n I-TevI ​​5 (^prime) -CNNNG-3 (^prime) splitsingsmotief geposisioneer (sim) 15–18 basispare stroomop van die 5 (^prime) einde van die sgRNA-bindingsplek. Die Cas9- of TevCas9-redigeerplasmiede is in geskuif P. tricornutum deur bakteriese konjugasie en ekskonjugante wat op zeosienbevattende media geselekteer is.

Ons het eers redigering deur sifting beoordeel P. tricornutum ekskonjugante deur T7 endonuklease I (T7EI) wanpassplitsingstoetse op PCR-produkte wat vanaf elke teikengeen geamplifiseer is (Fig. 1B, 2B, Tabel 1). Hierdie toets het 6 sgRNA's geïdentifiseer met waarneembare redigeertempo's gebaseer op sifting van ekskonjugante. Kolonies wat wysiging getoon het, is verdun, uitgeplat om subklone te verkry, en daarna gekeur vir die ooreenstemmende auxotrophic fenotipe op soliede media met en sonder auxotrophic supplement (uracil of histidine) (Fig. 1C, 2C). Om die Cas9-redigeerplasmiede te genees, is uitklop-stamme vir 1 week sonder zeosienseleksie gekweek, en verdunnings is uitgeplaat om enkelkolonies te verkry. Kolonies is op L1-plate gestreep met en sonder zeosien om vir plasmiedverlies te skerm. 'n Verteenwoordigende beeld wat zeosien sensitiwiteit demonstreer as gevolg van verlies van die Cas9-redigeerplasmied word in Fig. 1D getoon. Vir uitklop van die PtUMPS-geen het ons verder 3 subklone gekarakteriseer met 'n urasiel-benodigde fenotipe om te bepaal of die uitkloppe monoallelies of biallelies was. Omdat die twee PtUMPS-allele van P. tricornutum SNPs relatief tot mekaar besit het, was ons in staat om alleelspesifieke redigeringsgebeurtenisse te karteer (Fig. 1E,F). Twee van die stamme, (Delta) UMPS1 en (Delta) UMPS2, was biallelies en het verlies aan heterosigositeit getoon met een alleel wat 'n klein delesie (< 20 bps) en die ander alleel het 'n groot delesie (>) 610 bp). Die derde gekarakteriseerde subkloon, (Delta) UMPS3, was monoallelies en het 'n homosigotiese 1-bp invoeging gehad. Vir die PtPRA-PH/CH uitklophoue wat 'n histidien-vereisende fenotipe gegenereer het (Fig. 2B, C), het geteikende volgordebepaling van een subkloon 'n biallele genotipe geopenbaar met 'n 11-bp delesie in een alleel en 'n 6-bp delesie in die tweede alleel (Fig. 2D,E).

Groot skrappings in geredigeer P. tricornutum metaboliese gene vasgevang deur Nanopore amplikonvolgordebepaling. Vir elke (AE), word die naam van die teikengeen sowel as die redigeringsensiem aangedui. Die heel links plot toon genormaliseerde lees dekking gemiddeld oor 'n 5-bp venster vir die geredigeerde monster (swart kolletjies) en die wild-tipe monster (oranje kolletjies) relatief tot die posisie in PCR amplikon. Nommering op die x-as is relatief tot die ATG-beginkodon vir elke geen, met volgorde stroomop aangedui deur 'n minus (−) simbool en volgorde stroomaf aangedui deur 'n plus (+) simbool. Die groen vertikale lyn dui die Cas9- of TevCas9-splitsingsplek aan, terwyl die geskakeerde reghoek die ORF aandui. Die middel plot is 'n digtheid plot van skrappings > 50-bp. Die heel regs plot toon die lengte en posisie van delesies > 50-bp relatief tot hul posisie in die PCR amplikon, met nommering van die x-as soos in die heel links paneel. Elke horisontale lyn dui 'n gekarteerde skrapgebeurtenis aan. Skrapings word gerangskik van die langste na die kleinste. Die groen lyn dui die Cas9- of TevCas9-splitsingsplek aan.

Die tipe delesies wat in die uracil- en histidine-auxotrofe waargeneem word, stem ooreen met heterogene redigeringsgebeurtenisse wat lei tot verlies aan heterosigositeit 28,29,30. Om hierdie waarnemings uit te brei, het ons Nanopore-volgordebepaling gebruik om die spektrum van groot skrappings wat dikwels in Cas9-redigeringstudies oor die hoof gesien word, beter te assesseer. Benewens die twee sgRNA's wat robuuste redigering op die PtUMPS-geen getoon het, het ons deletie-gebeure in ekskonjugante ondersoek met sgRNA's gerig op die PtUREASE-geen 6 en die PtI3GPS-PRAI-geen. Vir elke eksperiment is (sim) 1 000 ekskonjugante saamgevoeg en 'n (sim) 6 kb PCR-produk gegenereer vir elk van die teikengene met die voorspelde Cas9- of TevCas9-teikenplekke in die middel van die amplikon. Ons het ons aandag gevestig op skrappings > 50 bp aangesien hierdie skrappings tipies ondergerapporteer word in geteikende amplikon-volgordebepaling. Ons het 'n daling in Nanopore-leesdekking opgemerk wat gesentreer is rondom die voorspelde sgRNA-teikenwebwerwe vir produkte wat deur Cas9- en TevCas9-redigeereksperimente (swart kolletjies) versterk is, in vergelyking met leesdekking vir kontrole-eksperimente (oranje kolletjies), in ooreenstemming met redigering op daardie terreine (Fig. 3, links panele). Die kartering van die uitvee begin- en eindpunte het aan die lig gebring dat die meeste skrappings op die Cas9- of TevCas9-teikenwerf gesentreer was (Fig. 3, reg panele), met skrappings wat strek tot 2700 bp (Fig. 3, sentrum paneel). Die gemiddelde skraplengte vir die redigering van gebeure wat deur Nanopore-volgordebepaling en > 50 bp ondersoek is, was 1735±719 bp vir Cas9 en 2006±633 bp vir TevCas9.

Gesamentlik toon hierdie data dat Cas9- of TevCas9-redigering van biosintetiese gene maklik kan genereer P. tricornutum eksotrofe wat deur fenotipiese of genetiese skerms geïdentifiseer kan word. Boonop stem ons data ooreen met 'n groeiende hoeveelheid bewyse wat onthul dat Cas9-redigering (en TevCas9-redigering hier) groot skrappings genereer wat tipies gemis sou word, tensy siftingstrategieë uitdruklik ontwerp is om na verlies aan heterosigositeit te kyk.

Fenotipiese en metabolomiese karakterisering van PtUMPS uitklophoue. (A) Vlekplaattoetse van wilde tipe (WT), (Delta) UMPS1 en (Delta) UMPS2 stamme op L1 vaste media alleen, L1 aangevul met uracil, L1 aangevul met 5-FOA, of L1 aangevul met beide uracil en 5-FOA. Aangewese verdunnings is relatief tot die aanvanklike konsentrasie. (B) Vloeistofgroeikurwes van wilde tipe (WT), (Delta) UMPS1 en (Delta) UMPS2 stamme in L1 vloeibare media alleen, of aangevul met uracil of 5-FOA of albei. Datapunte is die gemiddelde van drie onafhanklike herhalings, met foutstawe wat die standaardfout van die gemiddelde verteenwoordig. (C) Orotaatkonsentrasies is gemeet deur LC-MS van kulture wat met en sonder urasilaanvulling gekweek is. Stawe verteenwoordig gemiddelde waardes en foutstawe verteenwoordig standaardafwyking vir drie biologiese herhalings. Individuele datapunte word as gekleurde kolletjies voorgestel. Statistiese vertrouensvlak is deur eensydige t-toets bereken. p < 0,001 word deur 'n asterisk aangedui. (D) Staafgrafiek wat persentasie plasmied-retensie in die (Delta) UMPS1- en (Delta) UMPS2-stamme toon wat verskeie PtUMPS-konstrukte huisves na 14 dae van uitgroei. Stawe verteenwoordig die gemiddelde verhouding van kolonies op selektiewe L1 + nourseothricin teenoor nie-selektiewe L1 plate van drie onafhanklike replikate, met foutstawe wat die standaardfout van die gemiddelde verteenwoordig.

Fenotipiese en metabolomiese karakterisering van die PtUMPS uitklophoue

Twee uracil-benodigde auxotrophs ((Delta) UMPS1 en (Delta) UMPS2) is gekies vir verdere karakterisering deur eerste kol-platering op L1 media met en sonder uracil en 5-FOA (Fig. 4A). Die PtUMPS-uitklop-stamme kon slegs oorleef in die teenwoordigheid van urasielaanvulling. Daarbenewens het die uitklophoue oorleef op 5-FOA-konsentrasies wat die groei van wildtipe ten volle geïnhibeer het P. tricornutum (Fig. 4A). Dit stem ooreen met fenotipes wat voorheen waargeneem is P. tricornutum UMPS uitklophoue 7,22 . Daar was 'n geringe groeivoordeel van (Delta) UMPS1 bo (Delta) UMPS2 op media aangevul met beide 5-FOA en uracil, maar nie op media wat uracil alleen bevat nie. Om te vergelyk of die waargenome fenotipes konsekwent oor vaste en vloeibare media was, het ons die groei van hierdie stamme oor 10 dae in vloeibare media (Fig. 4B) gemonitor en gevind dat die groeitempo's ooreenstem met dié wat op vaste media waargeneem is, met een noemenswaardige verskil (Aanvullende Fig. S8, S9, Aanvullende Tabel S3). Die groeivoordeel van (Delta) UMPS1 bo (Delta) UMPS2 waargeneem op soliede media aangevul met beide 5-FOA en uracil is nie in vloeibare media gerepliseer nie aangesien die generasietye vir (Delta) UMPS1 en (Delta) UMPS2 was baie soortgelyk ( (sim) 24 en (sim) 22 h, onderskeidelik).

Om die impak van PtUMPS uitklophoue op uracil metabolisme te ondersoek, het ons geteikende metabolomika op die UMPS substraat orotaat uitgevoer met behulp van LC-MS in wild-tipe en uitklop stamme (Fig. 4C). Ons het gefokus op die karakterisering van die orotaat-intermediêre in die uracil-baan (Fig. 2A, 4C) en voorspel dat daar 'n toename van orotaat in uitklop-stamme behoort te wees relatief tot wilde tipe. Ons was nie in staat om orotaat in die (Delta) UMPS1-stam op te spoor in die afwesigheid van uracil-aanvulling (-uracil), of in die (Delta) UMPS2-stam in óf die -uracil- of +uracil-toestand nie. 'n (sim) sesvoudige toename van sellulêre orotaatvlakke is waargeneem in die wild-tipe stam wanneer L1 media aangevul is met uracil (+uracil) in vergelyking met minimale L1 media (-uracil) (Fig. 4C). Interessant genoeg, toe die (Delta) UMPS1-stam met urasielaanvulling gekweek is, het ons orotaat opgespoor teen vlakke soortgelyk aan dié wat waargeneem is in die wilde-tipe stam wat met uracil gekweek is. Hierdie resultaat dui daarop dat alleel 1 in die (Delta) UMPS1 uitklop-stam (met 'n 18-bp in-raam uitwissing) UMPS aktiwiteit behou wat soortgelyk optree as die wilde-tipe stam. Daarteenoor het die (Delta) UMPS2-stam twee buite-raam skrappings wat waarskynlik ODC- en OPRT-aktiwiteit afskaf. Ons spekuleer dat onopspoorbare vlakke van orotaat in die (Delta) UMPS2-stam kan wees omdat dit na 'n ander biosintetiese pad herlei word.

Plasmiedkomplementering van die uracil- en histidien-uksotrofe

Plasmied-gebaseerde aanvulling van P. tricornutum auxotrofes sal bevestig dat die Cas9-redigeergebeurtenis die oorsaak van die auxotrofic fenotipe was, sowel as om alternatiewe vir antibiotika-gebaseerde seleksiemetodes te verskaf om episomale vektore in stand te hou. Ons het eers die komplementering van die urasiel-benodigde fenotipe ondersoek deur beide gDNA- en cDNA-weergawes van elke PtUMPS-alleel te kloneer met die inheemse promotor en terminator in die nourseothricin-weerstandige pPtGE31-uitdrukkingsplasmied 6. Hierdie plasmiede is aangewys as pPtUMPSA1, pPtUMPSA2, pPtUMPScA1 en pPtUMPScA2 (Aanvullende Tabel S3) en het deur vervoeging na die (Delta) UMPS1 en (Delta) UMPS2 stamme verskuif. Ekskonjugante is gevlek op soliede L1 media met en sonder uracil en 5-FOA aanvulling (Fig. 4A). Alle gekomplementeerde stamme het op minimale L1-media gegroei, terwyl die ongekomplementeerde uitkloppe dit nie gedoen het nie, wat uitdrukking van die UMPS-geen vanaf die pPtGE31-plasmied bevestig. Geen stam het op 5-FOA alleen gegroei nie. Onverwags het sommige van die gekomplementeerde stamme oorleef op plate aangevul met beide 5-FOA en uracil. Byvoorbeeld, wanneer (Delta) UMPS2 getransformeer is met enige van die alleel 1 komplementasie plasmiede (pPtUMPSA1 en pPtUMPScA1), is duidelike weerstand teen 5-FOA in die teenwoordigheid van uracil waargeneem. Die fenotipes wat op vaste media waargeneem is, was in ooreenstemming met dié wat waargeneem is wanneer die stamme in vloeibare media met soortgelyke media-aanvulling gekweek is (Aanvullende Fig. S8, S9).

Die groeifenotipe van die (Delta) UMPS1- en (Delta) UMPS2-stamme in media aangevul met uracil en 5-FOA kan verklaar word deur teen-seleksie teen die plasmied wat 'n ongeskonde PtUMPS-geen dra wat 5- FOA tot 'n giftige tussenproduk. Ons het dus getoets vir plasmiedverlies in die gekomplementeerde stamme deur die (Delta) UMPS1- en (Delta) UMPS2-stamme wat verskillende uitdrukkingsplasmiede dra op vaste L1 met en sonder nourseothricin na 14 dae van groei te plateer. Soos getoon in Fig. 4D, is plasmied-retensie, soos gemeet deur die verhouding van kolonies op L1 plus nourseothricin versus L1 plate, ernstig verminder in alle stamme, wat wissel van (sim) 1 tot (sim) 33% . Hierdie waarneming kan verduidelik waarom kolonies geredelik verskyn het op L1-media aangevul met 5-FOA en uracil en stel voor dat genesing van plasmiede wat die PtUMPS-geen van PtUMPS-uitklop-stamme dra, 'n eenvoudige saak van groei op die toepaslike media is.

Net so was ons in staat om die histidien-vereiste fenotipe te komplementeer deur 'n wildtipe kopie van die PtPRA-PH/CH geen in 'n uitdrukkingsvektor te kloneer, en die plasmied te transformeer in die (Delta) PRAPHCH1 stam deur konjugasie. Die (Delta) PRAPHCH1-stam met die komplementerende plasmied het op beide vaste L1-media met en sonder histidienaanvulling gegroei, terwyl die (Delta) PRAPHCH1-stam sonder die komplementerende plasmied slegs op L1-media met histidienaanvulling gegroei het (Fig. 2C).


Protokol

1. Berei 'n veilige en steriele werkspasie voor

Wees vertroud met alle laboratoriumreëls en veiligheidsmaatreëls wat getref moet word wanneer met mikroörganismes gewerk word. Ongeag die klassifikasie van biogevaar, word alle materiaal wat met mikroörganismes in aanraking kom, as aansteeklike afval beskou en moet dit gedekontamineer word voordat dit weggedoen word. Volg veiligheidsriglyne in ooreenstemming met dié wat deur institusionele departemente vir omgewingsgesondheid en -veiligheid verskaf word, en stel toepaslike afvalhouers op vir onmiddellike en behoorlike wegdoening van potensieel besmette materiale (biogevare).

Steriliseer alle instrumente, oplossings en media voordat dit vir plateringsprosedures gebruik word.

Maak alle materiaal wat jou werkarea op die laboratoriumbank deurmekaar lê, weg.

Maak werkarea skoon met ontsmettingsmiddel om moontlike kontaminasie te minimaliseer.

Stel 'n Bunsen-brander op en werk stadig, versigtig en doelbewus binne die steriele veldarea wat geskep word deur die optrek van die vlam.

As jy met BSL-2-organismes werk, stel jou werkspasie in 'n Bioveiligheidskas op. 'n Bunsenbrander kan nie binne die kas gebruik word nie, want die hitte van die vlam ontwrig lugvloei wat noodsaaklik is vir die funksionaliteit daarvan.

Rangskik al die voorrade wat nodig is vir die prosedure op die laboratoriumbank naby die steriele veld. Maak seker dat al die materiaal behoorlik gemerk is. Deur die werkarea te organiseer om werksdoeltreffendheid te maksimeer en onnodige bewegings te vermy, sal die blootstellingstyd van eksperimentele materiale aan lugbesoedeling verminder word.

Plaas die Bunsen-brander aan jou regterkant op die bank.

Plaas agarborde of Petri-skottels aan jou linkerkant.

Rangskik selkulture, buise, flesse en bottels in die middel van die bank.

Maak die doppe van buise, flesse en bottels los sodat hulle maklik met een hand oopgemaak kan word tydens daaropvolgende manipulasies.

Was hande deeglik met antiseptiese seep en warm water voordat mikroörganismes hanteer word.

2. Streepplaatprosedure: isolasie van bakteriese kolonies deur gebruik te maak van die kwadrantmetode

Die streepplaatprosedure is ontwerp om suiwer kulture van bakterieë, of kolonies, van gemengde bevolkings te isoleer deur eenvoudige meganiese skeiding. Enkelkolonies bestaan ​​uit miljoene selle wat in 'n groep groei op of binne 'n agarplaat (Figuur 1). ’n Kolonie, anders as ’n enkele sel, is met die blote oog sigbaar. In teorie is al die selle in 'n kolonie afkomstig van 'n enkele bakterie wat aanvanklik op die plaat neergelê is en word dus na verwys as 'n kloon, of 'n groep van geneties identiese selle.

Bakterieë bestaan ​​in 'n verskeidenheid van vorms en groottes. Byvoorbeeld, individu Escherichia coli selle is staafvormig met 'n gemiddelde lengte van 2 μm en breedte van 0,5 μm terwyl Streptokokke selle is bolvormig met 'n gemiddelde deursnee van 1 μm. Sommige bakterieë (soos E coli) bestaan ​​as enkelselle terwyl ander verskillende assosiasiepatrone vorm. Streptokokkegroei byvoorbeeld in pare of vorm kettings of groepe selle. Daar word algemeen aanvaar dat 'n enkele kolonie ontstaan ​​uit 'n enkele sel wat binêre splitsing ondergaan, maar hierdie aanname is nie waar vir daardie bakterieë wat natuurlik bestaan ​​as pare, kettings of trosse of wat deur ander meganismes verdeel nie. Alternatiewelik, as te veel bakterieë uitgeplaat word, kan oorvleueling van selle voorkom en die waarskynlikheid verhoog dat twee of meer bakterieë aanleiding sal gee tot wat blykbaar 'n enkele kolonie is. Om hierdie komplikasies te vermy wanneer bakteriese kulture wat op 'n vaste medium groei beskryf of opgesom word, word na kolonies verwys as kolonievormende eenhede (cfu).

Met die streepplaatprosedure word 'n mengsel van selle oor die oppervlak van 'n semi-vaste, agar-gebaseerde voedingsmedium in 'n Petri-bak versprei sodat al hoe minder bakteriese selle op wyd geskeide punte op die oppervlak van die medium neergelê word. en ontwikkel na inkubasie tot kolonies. Die kwadrantmetode vir die isolering van enkelkolonies uit 'n mengsel van selle sal hier beskryf word.

Streepplating kan met 'n aantal verskillende instrumente bewerkstellig word (Figuur 2). 'n Metaallus kan verskeie kere hergebruik word en word gebruik vir streepplatering van roetine-laboratoriumstamme. Weggooibare plastieklusse is kommersieel beskikbaar en word meer algemeen gebruik wanneer daar met BSL-2-stamme in 'n Biosafety-kas gewerk word. Baie navorsingswetenskaplikes verkies om weggooibare, vooraf gesteriliseerde houtstokke of plat tandestokkies te gebruik vir streepplatering. Dit is 'n goedkoop alternatief vir weggooibare plastieklusse en kan veral nuttig wees wanneer daar met 'n omgewingsmonster gewerk word soos grond wat waarskynlik spoorvormende bakterieë bevat.

Weggooibare vooraf gesteriliseerde stokkies en tandestokkies hoef nie met die Bunsen-brander gevlam te word nie en sodoende word onnodige aërosolisering van spoorvormende bakterieë en kruiskontaminasie van laboratoriumoppervlakke of agarplate met spore voorkom.

Merk om die rand van die onderkant (nie die deksel nie) van 'n agarplaat met ten minste jou naam, die datum, die tipe groeimedium en die tipe organisme wat op die medium uitgeplaat moet word.

Die plate moet heeltemal droog wees sonder kondensasie op die deksel en voorverhit tot kamertemperatuur voor streep-plating. As die borde by 4 ଌ gestoor word, verwyder hulle 'n paar uur of selfs die vorige dag. Sprei hulle uit in klein, verspringende stapels van nie meer as 2-3 borde nie en laat hulle droog word.

Die monster waaruit die streepplaat geënt sal word, kan óf 'n suspensie van selle in sous óf 'n bestaande kolonie van 'n ander agarplaat wees. Om mee te begin, word aanbeveel dat slegs een monster gebruik word om 'n enkele plaat te ent. Om tyd en materiaal te bespaar, kan 'n enkele plaat vir veelvuldige monsters gebruik word, maar net sodra jy vaardig word om een ​​monster op 'n bord te streep.

Vir die eerste kwadrant word die monster opgetel en oor ongeveer 'n kwart van die oppervlak van die medium versprei deur 'n vinnige, gladde, heen-en-weer beweging (paneel A van Figuur 3). Lig die onderste helfte van 'n omgekeerde bord van die bank af. Beweeg die lus, stok of tandestokkie baie keer heen en weer oor die agaroppervlak van die rand na die middel van die bord.

As die inokulum 'n selsuspensie is, kry 'n lusvol met 'n metaallus of 5 tot 10 μl met 'n mikropipet. Maak seker dat jy die selsuspensie swaai of vortex voordat 'n aliquot vir plating verwyder word. Gebruik aseptiese tegniek terwyl jy hierdie stap uitvoer, en vlam nie net die lus nie, maar ook die rand van die bottel of buis voor en na die verwydering van die inokulum. Moet ook nie aan die kante van die buis of bottel met die lus of loop van die mikropipet raak nie. As die inokulum gepipetteer word, versprei die selsuspensie op die toepaslike plek op die plaat en gebruik dan 'n lus, stok of tandestokkie om dit oor die eerste kwadrant van die plaat te versprei.

As die inokulum 'n kolonie van 'n ander plaat is, raak die kolonie liggies aan met die lus, stok of tandestokkie en versprei dit dan oor die eerste kwadrant van die plaat. Maak seker dat die metaallus afgekoel is voordat jy aan die kolonie raak. Om te verseker dat die lus nie te warm is nie, raak dit liggies aan die agarplaat in 'n aangewese area waar geen strepe sal voorkom nie. Slegs 'n paar selle word van die kolonie benodig, nie die hele kolonie nie.

As 'n metaallus gebruik word, vlam dit met 'n Bunsenbrander voordat die inokulum vir die plaat verkry word (paneel B van Figuur 3). Begin ongeveer 3-4 duim van die lus af, met die draad in die punt van die blou keël, die warmste deel van die vlam. Die metaal moet rooiwarm word. Beweeg die draad sodat die vlam die lus nader. Hierdie manipulasie verhoed aërosolisering van bakterieë wat op die lus gelaat is van die vorige gebruik.

Vlam maak die bakterieë dood (hoewel nie spore nie) en konveksiestrome uit die verhitte lug verhoed dat ander lugbesoedeling tydens daaropvolgende manipulasies op die metaaldraad neerslaan.

As jy 'n steriele plat tandestokkie gebruik, hou die smal punt liggies tussen jou duim en ringvinger teen 'n hoek van 10 tot 20° met die medium, en gebruik die wye punt om die kwadrante te streep. As jy 'n lus of houtstok gebruik, hou dit soos 'n potlood teen dieselfde hoek. Moenie so hard druk dat die lus, stok of tandestokkie in die agar grawe nie.

Nadat jy die eerste kwadrant voltooi het, keer om en sit die plaat terug in deksel op die bank. Gooi die stok of tandestokkie weg of vuur die metaallus weer aan soos beskryf in stap #4.

Draai die Petri-bak 90 ° om die tweede kwadrant te streep. Lig die onderste helfte van 'n omgekeerde bord van die bank af en raak dan die lus, stok of tandestokkie na die eerste kwadrant naby die einde van die laaste streep. Gebruik die heen-en-weer patroon, kruis oor die laaste helfte van die strepe in die eerste kwadrant en beweeg dan na die leë tweede kwadrant. Keer om en sit die bord terug in deksel op die bank sodra die tweede kwadrant gevul is.

Die lus, stok of tandestokkie moet nooit teruggaan in die eerste helfte van die strepe in die eerste kwadrant waar die meeste van die oorspronklike inokulum neergelê is nie.

'n Nuwe plastieklus, houtstok of tandestokkie moet vir elke kwadrant gebruik word.

Herhaal stap #6 twee keer vir die derde en vierde kwadrante.

Maak seker dat jy die stok of tandestokkie weggooi of die metaallus tussen elke kwadrant weer opvlam.

Vermy om in die eerste kwadrant in te gaan wanneer die vierde kwadrant gestreep word.

Inkubeer die plaat onderstebo sodat kondensasie wat op die deksel ophoop nie op die kolonies drup nie.

3. Gooiplaatprosedure: Opsomming van bakterieselle in 'n gemengde monster

Hierdie metode word dikwels gebruik om die aantal mikroörganismes in 'n gemengde monster te tel, wat by 'n gesmelte agarmedium gevoeg word voordat dit stol. Die proses lei tot kolonies wat eenvormig deur die vaste medium versprei word wanneer die toepaslike monsterverdunning uitgeplaat word. Hierdie tegniek word gebruik om lewensvatbare plaattellings uit te voer, waarin die totale aantal kolonievormende eenhede binne die agar en op die oppervlak van die agar op 'n enkele plaat opgesom word. Lewensvatbare plaattellings bied wetenskaplikes 'n gestandaardiseerde manier om groeikurwes te genereer, om die konsentrasie selle in die buis waaruit die monster geplaat is, te bereken en om die effek van verskeie omgewings of groeitoestande op bakteriese seloorlewing of groeitempo te ondersoek.

Benoem om die rand van die bodem (nie die deksel nie) van 'n steriele maar leë Petri-bak met ten minste jou naam, die datum, die tipe groeimedium en die tipe organisme wat by die gesmelte agarmedium gevoeg moet word.

Sluit die verdunningsfaktor in as dit geplateer word reeksverdunnings, of 'n reeks herhaalde verdunnings, wat lei tot 'n sistematiese vermindering in die konsentrasie van selle in die monster. Die voorbereiding van reeksverdunnings is nodig as die aantal selle in die monster die kapasiteit van die agarplaat oorskry, waarin die statisties beduidende reeks 30 tot 300 cfu is. As daar meer as 300 cfu op 'n bord is, sal die kolonies oorvol wees en oorvleuel.

Verkry 'n buis wat 18 ml gesmelte agarmedium bevat.

Die agarmedium moet in proefbuise versprei word en vooraf in 'n outoklaaf gesteriliseer word. Op dieselfde dag wat dit vir 'n eksperiment benodig word, moet die agar vir 30 minute in 'n stoomboot gesmelt word en dan na 'n 55 ଌ waterbad oorgeplaas word. Slegs soveel agar as wat nodig is vir die eksperiment moet gesmelt word aangesien dit nie hergebruik kan word nie.

Tien minute voordat plate gegooi word, moet die buise gesmelte agar van die 55 ଌ waterbad oorgeplaas word na 'n hitteblok op die laboratoriumbank wat op 48 ଌ gestel is. Sodra die agar hierdie temperatuur bereik, is dit gereed om te giet. As die agar te warm is, kan die bakterieë in die monster doodgemaak word. As die agar te koel is, kan die medium klonterig wees sodra dit gestol is.

Kry jou monster, wat óf 'n souskultuur óf 'n suspensie van selle moet wees wat geproduseer word deur selle van 'n kolonie in buffer of sout te meng.

Die monsters kan verkry word uit 'n verdunningsreeks van 'n enkele monster.

Monstervolume wat uitgeplaat moet word, moet tussen 0,1 en 1,0 ml wees.

Maak die deksel van die leë Petri-bak oop en gee jou monster in die middel van die bord (paneel A van Figuur 4). Maak die deksel toe.

Gebruik aseptiese tegniek regdeur hierdie prosedure.

Gebruik of 'n serologiese pipet of mikropipet om jou monster na die bord oor te dra. Beheer die vloei van die monster sodat dit nie uit die plaat spat nie.

Verwyder die doppie van die buis van die gesmelte agar, en steek die rand van die oop buis deur die vlam van die Bunsen-brander.

Maak die deksel van die Petri-bak wat jou monster bevat oop en gooi die agar versigtig in (paneel B van Figuur 4).Maak die deksel toe en meng dan die monster met die agar deur die plaat liggies te draai.

Laat die agar deeglik stol voordat die plaat omgekeer word vir inkubasie.

4. Spreiplaatprosedure: Vorming van afsonderlike bakteriese kolonies vir plaattellings, verryking, seleksie of sifting

Hierdie tegniek word tipies gebruik om mikroörganismes te skei wat in 'n klein monstervolume voorkom, wat oor die oppervlak van 'n agarplaat versprei word, wat lei tot die vorming van afsonderlike kolonies wat eweredig oor die agaroppervlak versprei word wanneer die toepaslike konsentrasie selle uitgeplaat word. Benewens die gebruik van hierdie tegniek vir lewensvatbare plaattellings, waarin die totale aantal kolonievormende eenhede op 'n enkele plaat opgetel word en gebruik word om die konsentrasie selle in die buis waaruit die monster geplateer is te bereken, word spreidplatering gereeld gebruik in verrykings-, seleksie- en siftingseksperimente. Die gewenste resultaat vir hierdie drie eksperimente is gewoonlik dieselfde as vir plaattellings, waarin 'n verspreiding van diskrete kolonies oor die oppervlak van die agar vorm. Die doel is egter nie om te verseker nie almal lewensvatbare selle vorm kolonies. In plaas daarvan moet slegs daardie selle binne 'n bevolking wat 'n spesifieke genotipe het, groei. Die strooiplaatprosedure kan oor die gietplaat-tegniek gebruik word vir 'n opsommingseksperiment as die einddoel is om kolonies te isoleer vir verdere ontleding, want kolonies groei toeganklik op die agar-oppervlak terwyl hulle in die agar ingebed raak met die gietplaatprosedure.

Daar is twee strategieë wat hier beskryf word vir die strooiplaatprosedure. Die eerste (Metode A) behels die gebruik van 'n draaitafel en glas- of metaalstaaf wat soos 'n hokkiestok gevorm is. Die tweede (metode B), waarna verwys word as die "Copacabana-metode", behels die skud van vooraf gesteriliseerde glaskrale. Beide fasiliteer eweredige verspreiding van selle oor die agaroppervlak.

Metode A: Sprei-platering met 'n draaitafel en glas- of metaalstaaf

Merk om die rand van die onderkant (nie die deksel nie) van 'n agarplaat met ten minste jou naam, die datum, die tipe groeimedium en die tipe organisme wat op die medium uitgeplaat moet word.

Sluit die verdunningsfaktor in as dit geplateer word reeksverdunnings.

Die plate moet heeltemal droog wees sonder kondensasie op die deksel en voorverhit tot kamertemperatuur voor smeerplaat. As die borde by 4 ଌ gestoor word, verwyder hulle 'n paar uur of selfs die vorige dag. Sprei hulle uit in klein, verspringende stapels van nie meer as 2-3 borde nie en laat hulle droog word.

Sentreer die plaat op die draaitafel (Figuur 5).

Kry jou monster, wat 'n souskultuur of 'n suspensie van selle moet wees wat geproduseer word deur selle van 'n kolonie in buffer of sout te meng.

Die monsters kan verkry word uit 'n verdunningsreeks van 'n enkele monster.

Monstervolume wat uitgeplaat moet word, moet tussen 0,1 en 0,2 ml wees.

Maak die deksel van die Petri-bak oop en plaas jou monster op die middel van die agar. Maak die deksel toe.

Gebruik aseptiese tegniek regdeur hierdie prosedure.

Gebruik 'n mikropipet om jou monster na die bord oor te dra. Beheer die vloei van die monster sodat dit nie uit die plaat spat nie.

Doop die glasstaaf of metaalstaaf (ook 'n strooier genoem) in 'n beker van 70% (v/v) etanol.

WAARSKUWING: Moet nooit 'n warm strooier in 'n beker alkohol doop nie.

Die etanol moet net aan die onderste gedeelte van die strooier en die eerste duim van die stam raak.

Dreineer en steek oortollige etanol aan deur dit deur die vlam van 'n Bunsen-brander te laat gaan.

Die vlam moet die lengte van die strooier en stingel beweeg wat met die etanol in aanraking gekom het en dan vinnig blus.

Indien die beker etanol vlam vat, moenie paniekerig raak nie! Plaas 'n glasdeksel oor die beker, wat die vuur vinnig sal blus.

Maak die deksel van die agarplaat oop, hou die deksel in jou linkerhand met jou duim en wysvinger. Verkoel die strooier deur dit aan die agar langs die rand naby die rand te raak.

Moenie aan die agar raak waar die selle bygevoeg is nie. Die warm strooier sal die selle doodmaak.

Met jou linkerhand (terwyl jy steeds die deksel van die agarplaat vashou), draai die draaitafel stadig.

Alhoewel dit die beste vermy word, as jy die deksel moet neersit, plaas dit met die gesig na onder op 'n ontsmette oppervlak binne die steriele veld van die Bunsen-brander. Met 'n deksel wat na bo wys, is daar 'n groter kans op kontaminasie deur bewegings van voorwerpe of hande, wat lugstrome skep wat veroorsaak dat mikroörganismes en stofdeeltjies na die binneoppervlak van die deksel afsak.

Met jou regterhand, hou die strooier liggies op die oppervlak van die agar en versprei die monster geleidelik eweredig oor die hele plaat. Beweeg die strooier heen en weer oor die plaat terwyl die draaitafel draai.

Laat die monster deeglik absorbeer (ten minste 5 minute) voordat die plaat omgekeer word vir inkubasie.

Metode B: Sprei-platering met glaskrale: die "Copacabana Metode"

Merk om die rand van die onderkant (nie die deksel nie) van 'n agarplaat met ten minste jou naam, die datum, die tipe groeimedium en die tipe organisme wat op die medium uitgeplaat moet word.

Sluit die verdunningsfaktor in as dit geplateer word reeksverdunnings.

Maak die deksel van die agarplaat oop, hou die deksel in jou linkerhand met jou duim en wysvinger. Maak dan die glasbuis of bottel oop wat vooraf gesteriliseerde glaskrale bevat. Met jou regterhand, vlam die rand van die buis of bottel aan en gooi dan 10-12 steriele glaskrale versigtig op 'n agarplaat (Figuur 6). Maak die deksel van die bord toe en vlam die rand van die buis of bottel weer aan voordat jy die doppie terugsit en dit eenkant sit.

Gooi die krale liggies uit die buis of bottel 'n paar sentimeter bokant die agar sodat die krale nie uit die Petri-bak bons nie.

Gebruik glaskrale wat 4 mm in deursnee is. Steriliseer dit in glasbottels of proefbuise in die outoklaaf by 121 ଌ op die droë siklus (swaartekrag-instelling) vir 30 minute.

Een voordeel van die gebruik van krale in plaas van 'n strooier is dat geen oop houers etanol nodig is vir herhaalde vlam nie.

Maak die deksel van die agarplaat oop en plaas jou monster op die middel van die agar. Maak die deksel toe.

Gebruik aseptiese tegniek regdeur hierdie prosedure.

Deel 100 tot 150 μl monster per bord. Hierdie volume sal eweredige verspreiding van selle vergemaklik. Gebruik 'n mikropipet om jou monster na die bord oor te dra. Beheer die vloei van die monster sodat dit nie uit die plaat spat nie.

Versprei die monster deur die krale liggies oor die oppervlak van die agar 6 tot 7 keer te skud. Gebruik 'n horisontale skudbeweging om te verseker dat selle eweredig versprei word.

Moenie die krale draai nie, anders beland al die selle by die plaatrand.

WENK: As dit behoorlik gedoen word, klink die prosedure soos "skud maracas".

Draai die plaat 60° en skud dan weer 6 tot 7 keer horisontaal.

Draai die plaat 'n tweede keer 60° en skud weer horisontaal. Teen hierdie tyd behoort jy eweredige verspreiding van selle oor die agaroppervlak te verkry.

Wanneer die smeerplaat voltooi is, moet die monster geabsorbeer word en die oppervlak van die agar moet droog wees. Gooi die gekontamineerde krale af in 'n gemerkte versamelbeker wat 10% chloorbleikmiddel bevat.

Moenie die krale in die asblik weggooi nie! Die gebruikte krale sal afgespoel en geoutoklaveer word, wat hulle hersteriliseer vir herhaalde gebruik.

LET WEL: As die agaroppervlak nog nat is nadat dit drie keer geskud is, laat die plaat vir 'n paar minute sit sodat die vloeistof deur die agar geabsorbeer kan word, herhaal dan stappe #4-6 totdat die plaatoppervlak droog lyk.

Keer die plaat om vir inkubasie.

5. Sagte agar-oorlegprosedure: Vorming van gedenkplate vir isolasie en telling van fage (plaketoets)

Hierdie tegniek word algemeen gebruik om bakteriofaag (faag), of bakteriële virusse wat in grootte wissel van 100 tot 200 nm, op te spoor en te kwantifiseer. 'n Elektronmikroskoop is nodig om individuele faagdeeltjies te sien. Die teenwoordigheid van aansteeklike faagdeeltjies kan egter opgespoor word as gedenkplate op 'n agar bord (Figuur 7A). Fage kan nie buite hul gasheer bakteriële selle repliseer nie, so voortplanting en opsporing vereis dat fage en gasheerselle saam gemeng word voor platering. Vir die sagte agar-oorlegprosedure word 'n klein volume, gewoonlik in die reeks van 50 μl tot 200 μl, van 'n faagsuspensie in 'n buis gedispenseer wat ongeveer 10 8 bakterieë (gasheerselle) bevat wat eweredig in 2.5 versprei is. -3,0 ml sagte (0,5 tot 0,7% [w/v]), gesmelte voedingsagar. Die resulterende mengsel word oor die oppervlak van 'n harde (1,5 tot 1,9% [w/v]) voedingsagarplaat gegooi. Die plaat word genoeg geskud om te verseker dat die sagte agar die hele oppervlak van die harde agar bedek. Dan word die plaat op 'n gelyk oppervlak geplaas totdat die boonste agarlaag tyd gehad het om te stol en kan daarna in die broeikas geplaas word.

Met verloop van tyd, 'n troebel suspensie van bakteriese selle, waarna verwys word as 'n grasperk, word deur die sagte agarmedium sigbaar (Figuur 7B). Gedenkplate vorm as 'n fage een van die bakteriële selle infekteer, in die sel repliseer, en dan die sel liseer en soveel as 100 nageslagfage vrystel (a.k.a. die bars grootte). Die nuwe faagdeeltjies diffundeer na die sagte agar, wat bakterieë in die area rondom die geliseerde bakteriese sel besmet. Na veelvuldige siklusse van infeksie en lise verdwyn die troebel bakteriële selsuspensie in die sagte agar, wat 'n sone van opruiming verlaat wat 'n gedenkplaat genoem word. Elke gedenkplaat bevat meer as 109 faagdeeltjies, almal geneties identies aan die oorspronklike aansteeklike faagdeeltjie. Omdat 'n gedenkplaat uit 'n enkele faagdeeltjie ontstaan, word die gevolglike aantal plaakvormende eenhede (pfu) kan getel word en die oorspronklike konsentrasie, of titer, van die faagsuspensie kan bereken word. Hierdie tipe eksperiment, wat 'n plaaktoets genoem word, bied wetenskaplikes ook 'n gestandaardiseerde manier om eenstap-groeikurwes te genereer, gasheerreeksspesifisiteit te ondersoek en bakteriële selle vir genetiese eksperimente te transduseer.

Berei die aanwyser bakterieë voor: 'n Eksponensieel groeiende kultuur van die bakteriese gasheerstam moet voorberei word vir die sagte agar-oorleg-eksperiment. Elke gasheer het sy eie groeivereistes. Tussen 0,3 ml en 0,5 ml van 'n suspensie van indikatorbakterieë word vir elke bord benodig. As 'n fles met indikatorbakterieë voorberei word (bv. 25 ml), moet die kultuur in kleiner hoeveelhede verdeel word (bv. 5 ml aliquots verdeel in steriele skroefdop buise) om die moontlikheid van kruiskontaminasie te minimaliseer. Die buise kan op ys gehou word (by 4 ଌ) totdat dit gereed is om in die eksperiment te gebruik. Gebruik aseptiese tegniek om steriele voedingsbouillon in te ent en inkubeer dan volgens spesifikasies van die bakteriese stam. Oorskietkulture moet aan die einde van die dag weggegooi word.

Berei adsorpsiebuise voor: Plaas twee steriele mikrosentrifugeerbuise in 'n rek. Benoem die deksel van die eerste buis "Phage" en die deksel van die tweede buis "Control".

Tipies reeksverdunnings van faag-lisate word voorberei en uitgeplaat in welke geval bykomende mikrosentrifugeerbuise by die rek gevoeg sal word en met die verdunningsfaktor gemerk word.

Faagvoorraad moet vars gemaak word van enkelplate en by 4 ଌ gestoor word. Om faagdeeltjies te ontbind, moet die voorraad opgewarm word tot omgewingstemperatuur voordat 'n eksperiment uitgevoer word.

Faagvoorraad moet versigtig hanteer word - moenie kragtig vortex of pipetteer nie.

Voeg 50 μl van jou faagmonster by die eerste buis en voeg dan 50 μl faagbuffer by die tweede buis, wat sal dien as 'n negatiewe kontrole vir die plaaktoets.

Gebruik aseptiese tegniek deur alle manipulasies van fage en bakterieë.

Voeg dan 500 μl indikatorbakterieë by elke adsorpsiebuis.

Bakteriese selle sal aan die onderkant van 'n buis vestig as hulle vir lang tye op ys of die bank sit. As die kultuur nie gemeng word voordat 'n aliquot vir die eksperiment verwyder word nie, sal nie genoeg bakteriese selle na die adsorpsiebuis oorgedra word nie. Daar moet voldoende aantal bakteriese kolonies in die sagte agar (d.w.s. 'n grasperk) gevorm word vir die opsporing van gedenkplate. Gebruik 'n draaikolkmenger om die indikatorbakterieë sagkens in 'n homogene suspensie te hersuspendeer voordat hoeveelhede na die adsorpsiebuise oorgedra word.

Meng die bakteriële selle en fage deur die buise saggies te knip.

Inkubeer die fage/bakterie-mengsel vir 15-20 minute (nie langer as 30 minute nie) by 'n temperatuur wat geskik is vir die indikatorstam.

Berei voedingstof sagte agar en harde agar plate: Terwyl adsorpsie plaasvind, plaas twee sagte agarbuise (voorheen gesmelt en gestoor by 55 ଌ) in 'n verwarmingsblok by jou laboratoriumbank wat op 46-48 ଌ gestel is.

Die gesmelte sagte agar moet vir 10-15 minute met die temperatuur van die verhittingsblok geëquilibreer word. As die gesmelte sagte agar langer as 15 minute sit, sal dit begin stol en sal dit klonte vorm wanneer dit op die harde agar gegooi word. As die gesmelte sagte agar minder as 10 minute sit, sal dit te warm wees wanneer dit by die fage/bakterie-mengsel gevoeg word, wat gasheerselle doodmaak voordat dit geplateer word. Gevolglik kan 'n grasperk nie vorm nie en min of geen plae kan opgespoor word nie.

Berei addisionele sagte agarbuise voor as u reeksverdunnings van die faag-lisaat uitplat.

Etiket om die rand van die onderkant (nie die deksel nie) van twee voedingstowwe harde agarplate met ten minste jou naam, die datum, die tipe groeimedium en "Phage" of "Control" wat ooreenstem met die adsorpsiebuise.

Sluit bykomende plate in wat met die verdunningsfaktor gemerk is indien reeksverdunnings geplateer word.

Die harde agarplate moet heeltemal droog wees sonder kondensasie op die deksel en vooraf verhit tot kamertemperatuur voordat die sagte agar bygevoeg word. As die borde by 4 ଌ gestoor word, verwyder hulle 'n paar uur of selfs die vorige dag. Sprei hulle uit in klein, verspringende stapels van nie meer as 2-3 borde nie en laat hulle droog word. Oormatige vog in die harde agarlaag sal verdunning van die sagte agar veroorsaak, wat toelaat dat faag makliker deur die sagte agar diffundeer tydens plaakvorming. Gevolglik sal plaakgrootte toeneem.

Plaat adsorpsiebuise een op 'n slag soos volg: Gebruik 'n P1000 mikropipet om die fage/bakterie-mengsel (behoort ongeveer 550 μl te wees) asepties oor te dra na 'n sagte agarbuis en draai dit dan vinnig tussen die palms van jou hande om die inhoud te meng. MOENIE die buis skud sodat lugborrels ingebring word nie. Hou die buis in jou linkerhand, maak die deksel van 'n harde agarplaat met jou regterhand oop en onmiddellik gooi die hele inhoud van die buis op die oppervlak van 'n harde agarplaat. Voordat jy die deksel toemaak, wieg die plaat liggies maar vinnig om die gesmelte sagte agar oor die hele oppervlak van die plaat te versprei voordat dit tyd het om te stol. Vermy om die gesmelte sagte agar op die kante van die Petri-bak te spat. Maak die deksel toe.

Herhaal stap #9 vir alle adsorpsiebuise, een buis op 'n slag.

Plaas die borde op 'n gelyk oppervlak en laat dit ongestoord staan ​​totdat die sagte agar gestol is.

Gewoonlik is 30 minute voldoende.

Keer die plate om vir inkubasie.

Veelvuldige plate kan gestapel en saamgeplak word en dan omgekeer word vir inkubasie.

Na inkubasie kan die plate vir gedenkplate geïnspekteer word. Die negatiewe beheer moet slegs 'n grasperk van bakterieë hê (geen gate wat op plae aandui nie). Gedenkplate verskil in terme van grootte, vorm en algehele voorkoms. 'n Gegewe faagtipe kan uit 'n heterogene mengsel van gedenkplate geïsoleer word deur die middel van een plaak versigtig met 'n steriele tandestokkie te pons en die inokulum oor te dra na 'n steriele mikrosentrifugeerbuis wat 100 tot 1000 μl sous of faagbuffer bevat. Hierdie lysaat kan met dieselfde prosedure soos hierbo beskryf geplaat word. Minstens 3 tot 6 opeenvolgende enkelplaat isolasies is nodig om te verseker dat 'n suiwer faag verkry is. Dikwels moet die lysaat oor 'n groot reeks (10 -1 tot 10 -10 ) verdun word om 'n titer te vind wat nie-oorvleuelende plate op 'n bord produseer. Die aantal wissel na gelang van die grootte van die gedenkplaat.

6. Replikaplaatprosedure: Oordrag van selle vir sifting van mutante en ouxotrofe

Hierdie tegniek laat vergelyking van selgroei op 'n primêre plaat met sekondêre plate toe, wat 'n manier genereer om selle vir 'n selekteerbare fenotipe te skerm. Eers word 'n primêre, of meester, plaat met selle geënt, hetsy deur 'n verdunning te versprei wat enkelkolonies produseer, of deur dit na 'n plaat oor te dra in 'n ruimtelike patroon wat deur roostermerke gespesifiseer word. Sekondêre plate wat media bevat met groei-inhibeerders of media wat nie 'n spesifieke voedingstof het nie, word geënt met selle van kolonies op die primêre plaat. Die ruimtelike patroon van kolonies word eers weergegee deur 'n stukkie fluweel op die primêre plaat te druk. Bakteriese selle kleef aan die fluweel omdat hulle groter affiniteit vir die fluweel as vir die agar het. Die afdruk van selle op die fluweel word dan oorgedra na veelvuldige sekondêre plate met selgroei wat dieselfde koloniepatroon as dié van die primêre plaat weerspieël. Met ander woorde, dit is soos om 'n rubberstempel te hê, wat die groeipatroon van een plaat na 'n ander herhaal. Hierdie tegniek is voordelig omdat dit toelaat dat 'n relatief groot aantal kolonies gelyktydig vir baie fenotipes in 'n enkele eksperiment gekeur word.

Berei primêre plaat voor: Etiket om die rand van die bodem (nie die deksel nie) van 'n agarbord met ten minste jou naam, die datum en die tipe groeimedium.

Merk 'n rooster aan die onderkant van die plaat af met ten minste twee eweredige vertikale lyne en ten minste twee ewe gespasieerde horisontale lyne. Nommer die gevolglike vierkante.

Gebruik 'n vooraf gesteriliseerde tandestokkie om elke vierkant met 'n selmonster in te ent. Dep die middel van die vierkant vir elke monster. Moenie die hele vierkant met selle bedek nie (Figuur 8) anders sal die monster oorgroei wanneer dit geïnkubeer word en omliggende vierkante besoedel.

Elke vierkant sal geënt word met 'n ander monster, afkomstig van óf souskulture óf kolonies op 'n ander bord.

Keer om en inkubeer die primêre plaat, wat gebruik sal word om verskeie sekondêre media te ent.

Ent sekondêre plate: Stapel die primêre plaat en al die sekondêre plate. Met 'n merker, maak 'n oriëntasiemerk aan die kant van die plate. Maak seker dat die merk aan die onderkant van elke bord is, nie die deksel nie.

Kry 'n steriele fluweeldoek en plaas dit op die silindriese blok (Figuur 9). Sluit die fluweeldoek in plek met die houer. Let op die oriëntasiemerk op die blok.

Die blok moet dieselfde grootte wees as die onderkant van 'n Petri-bak (10,2 cm deursnee). Dit moet met 'n sluitring kom wat die fluweeldoek aan die blok vasklem terwyl jy replika-plateer.

Die fluweeldoek (15,2 x 15,2 cm vierkant) moet vooraf gesteriliseer word. Stapel 10 of 12 skoon blokkies en draai dit dan in aluminiumfoelie toe en plaas dit dan in die outoklaaf by 121 ଌ op die droë siklus (swaartekrag-instelling) vir 30 minute. Voordat jy dit in 'n replika-plateringseksperiment gebruik, maak seker dat hulle heeltemal droog is deur dit vir 'n paar uur in 'n warm oond te plaas. Let daarop dat fluweelblokkies moontlik met maskeerband verwyder moet word voor sterilisasie.

Velveteen blokkies kan hergebruik word. Nadat gebruikte fluweelblokkies in die outoklaaf gedekontamineer is, moet hulle in gewone water afgespoel en weer gesteriliseer word soos hierbo beskryf.

Die silindriese blok en klem moet ontsmet word tussen gebruike met 'n kort spoel in 70% (v/v) etanol of 10% chloor bleikmiddel.

Verwyder die deksel en keer die primêre plaat om. Pas die oriëntasiemerk op die bord met die merk op die blok in lyn. Laat sak die plaat sodat die oppervlak van die agar in kontak is met die fluweeldoek op die silindriese blok. Druk liggies maar eweredig met jou vingerpunte op die agterkant van die primêre plaat af en lig dan die primêre plaat versigtig weg van die blok. Plaas die deksel op die bord terug.

Die fluweelafdruk van selle van die primêre plaat kan gebruik word om ongeveer 7-8 sekondêre plate in te ent voordat 'n afdruk met 'n nuwe fluweel gemaak moet word.

Herhaal stap #7 met elk van die sekondêre plate.

As 'n positiewe kontrole moet die laaste plaat in die reeks 'n agarmedium wees waarin alle getoetste stamme moet groei. Op hierdie manier kan jy bevestig dat selle na alle sekondêre plate in die reeks oorgedra is. Andersins kan gebrek aan groei op 'n spesifieke toetsmedium toegeskryf word aan onvoldoende seloordrag eerder as 'n fenotipe van die stam.

Om vals positiewe te vermy, moet die sekondêre plate van die minste tot die mees gunstige substraat bestel word. Andersins kan voedingstowwe tussen plate oorgedra word sodat selle op 'n ongunstige medium kan groei.

Keer die plate om en broei.

Let wel: Wanneer jy die sekondêre plate vir groei inspekteer, maak seker dat jy tussen groei en 'n afdruk onderskei. Laasgenoemde is 'n negatiewe resultaat.

7. Skoonmaak van die Werkspasie

Skakel die Bunsen-brander af en sit dan alle voorrade weg, insluitend kulture op plate of in buise, ekstra media en ander reagense.

Moenie toelaat dat ou kulture, hetsy op plate of in buise, op die laboratoriumbank of in stoorareas ophoop nie. Hierdie monsters, wat berugte bronne van kontaminasie soos skimmels en ongewenste bakteriese spesies is, moet weggegooi word sodra dit nie meer nodig is nie.

Plaas besmette laboratoriumware (handskoene, pipetpunte, kimwipes), glasware (buise, flesse, bottels) en gevaarlike afval (bakteriekulture of faagoplossings, gebruikte plate) in die regte wegdoenhouer. Wanneer werk met 'n nie-patogene E coli stam (BSL-1), word slegs nie-aansteeklike gevaarlike afval gegenereer. Wanneer dieselfde prosedures met patogeniese organismes (BSL-2 of hoër) uitgevoer word, word aansteeklike gevaarlike afval gegenereer. Ongeag die klassifikasie van biogevaar, moet gevaarlike afval geoutoklaveer of ontsmet word voordat dit weggegooi word. Volg die riglyne wat in die BMBL (5 de Uitg.) beskryf word, asook dié wat deur jou institusionele Omgewingsgesondheid en Veiligheidsdepartement verskaf word vir die onmiddellike en behoorlike wegdoening van biogevare wat tydens 'n eksperiment gegenereer word.

Maak die werkarea skoon met ontsmettingsmiddel.

Was hande deeglik met antiseptiese seep en warm water voordat jy die laboratorium verlaat.

8. Verteenwoordigende resultate

Streepplaat-tegniek. 'n Voorbeeldtoepassing vir streepplatering word in Figuur 1. Hierdie prosedure word gebruik om bakteriese kolonies uit gemengde selkulture te isoleer en is verreweg een van die belangrikste tegnieke om te bemeester in mikrobiologie en molekulêre genetika. Elke kolonie verteenwoordig 'n populasie van selle wat geneties identies is. Vir baie stroomaf toepassings is dit noodsaaklik om te begin met óf 'n enkele kolonie óf 'n suiwer bakteriese kultuur wat gegenereer word deur media in te ent met selle van 'n enkele kolonie. Die morfologie van individuele selle binne 'n kolonie kan byvoorbeeld met 'n ligmikroskoop geïnspekteer word. Genetiese identiteit kan toegeken word deur die klein subeenheid ribosomale RNA-geen op volgorde te bepaal vanaf genomiese DNA wat geïsoleer is uit 'n selkultuur wat met 'n enkele kolonie begin is. En metaboliese eienskappe kan beskryf word deur selle aan verskeie biochemiese en fisiologiese toetse te onderwerp. Slegs deur sulke eksperimente met suiwer kulture uit te voer, kan 'n mens seker wees van die eienskappe wat aan 'n bepaalde mikro-organisme toegeskryf word. Die resultate word nie verbloem deur die moontlikheid dat die kultuur besmet is nie. Tegniese foute kan voorkom as die steriliteit van die instrument wat gebruik word om die selle oor die plaat te streep nie regdeur die prosedure gehandhaaf word nie. Vergeet om 'n lus te vlam of 'n vars tandestokkie tussen kwadrante te haal, maak dit moeilik om enkelkolonies te verkry. Sommige bakteriese spesies kan nie in suiwer kultuur geïsoleer word nie, aangesien hulle afhanklik is van 'n samewerkende assosiasie met 'n ander bakteriese spesie vir sekere groeivereistes. Na verwys as sintrofe, mag hierdie organismes slegs onder mede-kultuur toestande gekweek word, dus sal kolonies (indien gevorm) altyd uit twee of meer spesies bestaan. Nog 'n uitdaging wat in die laboratorium ondervind word wanneer die streepplaatprosedure uitgevoer word met bakterieë afkomstig van omgewingsmonsters, is dat selle groei-eienskappe vertoon wat afwyk van tradisionele laboratoriumstamme soos bv. E coli. Sulke bakteriese stamme kan kolonies produseer wat filamentagtig is (in teenstelling met stywe trosse selle) met takke wat oor 'n groot gedeelte van 'n agarplaat versprei, verkalk en dus onweerstaanbaar is vir penetrasie deur 'n streepplaatinstrument, of omring deur 'n taai kapsule sodat individuele kolonies nie onderskei kan word nie. Hierdie eienskappe maak dit moeilik om enkelkolonies deur die streepplaattegniek te suiwer.

Gooi-plaat Tegniek. Met die gietplaat-tegniek vorm die kolonies binne die agar sowel as op die oppervlak van die agarmedium en bied dus 'n gerieflike manier om die aantal lewensvatbare selle in 'n monster te tel. Hierdie prosedure word in 'n verskeidenheid industriële toepassings gebruik. Dit is byvoorbeeld van kritieke belang vir 'n afvalwatersuiweringsaanleg, wat verantwoordelik is vir die skoonmaak van vloeibare afval (bv. riool, afloop van stormdreine) wat deur huishoudelike, kommersiële en industriële eiendomme sowel as landboupraktyke gegenereer word, om water te ontleed monsters na die uitgebreide suiweringsproses. Behandelde afvalwater (nie-drinkbare water) word op 'n verskeidenheid maniere hergebruik - vir besproeiing van nie-voedselgewasse in die landbou, vir sanitêre spoel in koshuise, en in industriële koeltorings - dus moet dit vry wees van chemiese en mikrobiese kontaminasie. Drinkwater (drinkbare water) moet volgens EPA-standaarde gesuiwer word en word getoets met mikrobiologiese plateringsmetodes wat die opsomming van spesifieke menslike patogene moontlik maak. Getoon in Figuur 10 is bakteriese kolonies wat voortspruit uit bakterieselle teenwoordig in 'n watermonster wat van 'n openbare drinkfontein versamel is. Dit is onwaarskynlik dat bakteriële patogene hierdie kolonies geproduseer het, gegewe die suiweringsmaatreëls vir drinkbare water, maar mikrobes is oral en besoedeling deur selfs nie-patogene stamme kan slegs tot die minimum beperk word, nie heeltemal uitgeskakel word nie. As nog 'n voorbeeld, 'n farmaseutiese maatskappy moet die mate van mikrobiese kontaminasie, of biolas, van 'n nuwe geneesmiddel tydens produksie, berging en vervoer bepaal. Deur die middel tydens verskeie fases van die proses te neem en monsters te plateer deur die gietplaatprosedure te gebruik, kan die mikrobiese lading, of aantal kontaminerende bakterieë, geredelik bepaal word. Voorsorgmaatreëls kan dan uitgedink word om mikrobiese kontaminasie te minimaliseer of uit te skakel. Een van die mees algemene tegniese foute wat voorkom wanneer die gietplaat-tegniek uitgevoer word, is onvoldoende vermenging van die monster met die gesmelte agar wat veroorsaak dat kolonies saamklonter en sodoende plaattellings onakkuraat maak. Nog 'n gereelde fout is om die gesmelte agar te gooi wanneer dit te warm is, wat baie van die bakteriese selle in die monster doodmaak. Hierdie fout sal ook die akkuraatheid van plaattellings beïnvloed wat getalle gee wat die totale aantal kolonievormende eenhede in die monster onderverteenwoordig.

Spreiplaat-tegniek. Die spreiplaattegniek is analoog aan die gietplaatprosedure in sy nut as 'n manier om lewensvatbare plaattellings uit te voer. Omdat die kolonies wat met behulp van die verspreidingsplaattegniek gevorm word eweredig oor die oppervlak van die agarmedium versprei is, kan selle van individuele kolonies egter geïsoleer word en in daaropvolgende eksperimentele manipulasies gebruik word (bv. as die inokulum vir 'n streepplaat of 'n sous kultuur). Drie algemene toepassings waarin die strooiplaattegniek 'n belangrike komponent is, is verrykings-, seleksie- en siftingseksperimente. In al drie toepassings kan die gewenste seltipe van die mengsel geskei word en later aan enige aantal biochemiese, fisiologiese of genetiese toetse onderwerp word.

An verrykingseksperiment behels die platering van 'n gemengde kultuur op 'n medium of inkubasie van plate in omgewingstoestande wat die groei van daardie mikroörganismes binne die monster bevoordeel wat die verlangde metaboliese eienskappe, groei-eienskappe of gedrag demonstreer. Hierdie strategie inhibeer nie die groei van ander organismes nie, maar lei tot 'n toename in die aantal verlangde mikroörganismes relatief tot ander in die kultuur. Dus, die kolonies wat op 'n verrykingsplaat vorm, vertoon waarskynlik fenotipiese eienskappe wat die verlangde genotipe weerspieël. Byvoorbeeld, as jou doel is om stikstofbindende bakterieë te kweek uit 'n omgewingsmonster wat 'n mengsel van meer as 1000 verskillende bakteriese spesies bevat, dan sal die plaat van die monster op 'n stikstof-tekort medium verryk vir daardie bakterieë wat hierdie verbinding kan produseer uit die atmosfeer met behulp van metaboliese vermoëns wat verskaf word deur 'n reeks gene wat benodig word vir die vasstelling van stikstof.

A seleksie eksperiment behels die plating van 'n gemengde kultuur op 'n medium wat slegs daardie selle wat 'n spesifieke geen of stel gene bevat, toelaat om te groei. Hierdie tipe eksperiment is algemeen in molekulêre biologie laboratoriums wanneer bakteriële stamme getransformeer word met plasmiede wat antibiotika-weerstandsgene bevat. As jou doel is om slegs rekombinante selle te kweek, of dié wat die plasmied suksesvol opgeneem het, sal die plaat van die monster op 'n medium wat aangevul is met 'n toepaslike konsentrasie van die antibiotika selekteer vir daardie selle wat weerstand teen hierdie spesifieke middel toon.

A siftingseksperiment behels die platering van 'n gemengde kultuur op 'n medium wat alle lewensvatbare selle toelaat om te groei, maar die selle met die verlangde genotipe kan op grond van hul fenotipe van ander selle onderskei word. Weereens, hierdie tipe eksperiment is algemeen in molekulêre biologie laboratoriums wanneer mutagenese-toetse uitgevoer word of gene in plasmiede gekloon word. 'n Klassieke voorbeeld, soos getoon in Figuur 11, maak gebruik van die lacZ geen kodeer vir β-galaktosidase hierdie ensiem laat selle toe om X-Gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galaktopiranoside), 'n substraat-analoog van sy natuurlike substraat, laktose, te metaboliseer. Splyting van X-Gal deur β-galaktosidase lei tot 'n onoplosbare blou produk. Dus, as 'n medium X-gal bevat, en 'n monster wat selle bevat met óf 'n wildtipe (funksionele) of mutant (nie-funksioneel) lacZ gene word op hierdie medium uitgeplaat, dan na inkubasie van wilde-tipe selle wat 'n funksionele lacZ geen sal verskyn as blou-gepigmenteerde kolonies terwyl mutante selle met 'n nie-funksionele lacZ geen sal verskyn as ongepigmenteerde ("wit") kolonies.

'n Tegniese probleem wat die meeste teëgekom word wanneer die eerste keer geleer word hoe om die spreiplaat-tegniek uit te voer, is ongelyke verspreiding van selle oor die agar-oppervlak. Wanneer 'n draaitafel en glasstaaf gebruik word, kan die monster te vinnig geabsorbeer word sodat die kolonies slegs naby die middel van die plaat vorm. Wanneer die "Copacabana-metode" gedoen word, word die glaskrale eerder as geskud oor die agar-oppervlak gedraai. Gevolglik groei baie kolonies langs die buitenste rand van die plaat. In beide gevalle trek die gevolglike verspreiding van kolonies nie voordeel uit die volledige beskikbare oppervlakte nie, so selle kan saamklonter en groei tot oorvleuelende kolonies wat plaattellings onakkuraat maak of onderskeid van seltipes onuitvoerbaar maak.

Sagte Agar Overlay Tegniek. 'n Prosedure soortgelyk aan die verspreidingsplaattegniek wat gebruik word om bakteriese kolonies te tel, kan gebruik word om die aantal fage te tel. Terwyl tussen 30 en 300 bakteriese selle oor die agaroppervlak versprei word vir plaattellings (cfu/ml), word tussen 100 en 400 aansteeklike faagdeeltjies met 10 8 tot 10 9 gasheerselle gemeng vir plaaktellings (pfu/ml) binne 'n laag van sagte agar versprei oor die oppervlak van harde voedingsagar. Tensy anders gedemonstreer, word daar algemeen aanvaar dat 'n enkele bakteriese sel verdeel en groot getalle geneties identiese selle ophoop in 'n enkele groep wat 'n kolonie genoem word. Soos voorheen bespreek, is hierdie aanname nie geldig wanneer selle in trosse groei (d.i. pare, tetrads, kettings of trosse) of groei-eienskappe vertoon soos kapsules wat enkelkolonievorming verhinder nie. 'n Soortgelyke aanname word gemaak vir plaakvorming, deurdat elke plaak aktiwiteit van 'n enkele faag verteenwoordig. Hierdie stelling is slegs waar as een faag een bakterie besmet. Wat gebeur as verskeie faagdeeltjies 'n enkele bakterie besmet? Hierdie probleem hou verband met 'n belangrike statistiese parameter wat in ag geneem moet word wanneer eksperimente met faag uitgevoer word - veelvuldigheid van infeksie (MOI) - wat die verhouding van aansteeklike faagdeeltjies tot die aantal gasheerselle in 'n monster beskryf. Omdat sommige selle meer as een fage adsorbeer terwyl ander selle slegs een of geen faag adsorbeer nie, behoort 'n populasie gasheerselle teen 'n lae MOI (𢙁) geïnfekteer te word om die waarskynlikheid te verminder dat 'n sel deur meer as een fage geïnfekteer sal word deeltjie. Die gebruik van die plaakvormende eenheid (pfu) as 'n funksionele definisie vermy hierdie komplikasies wanneer plaaktellings uitgevoer word om die titer van 'n faagvoorraad te bereken.

Soos getoon in Figuur 12, plaakmorfologie verskil vir verskillende fage. Sommige fage genereer klein plate (paneel A) terwyl ander aanleiding gee tot groot plate (paneel B). 'n Aantal veranderlikes beïnvloed plaakgrootte. Daar is tegniese redes wat bydra tot hierdie veranderlikheid. Volledige media en dik harde agar ondersteun byvoorbeeld die ontwikkeling van groter plate omdat gasheerselle faaggroei vir 'n langer tydperk kan onderhou. 'n Hoë plateringsdigtheid van gasheerselle (㸐 9 cfu per plaat) sal 'n vermindering in plaakgrootte veroorsaak. Die gebruik van laer konsentrasies sagte agar sal die tempo van faagdeeltjie-diffusie in die sagte agar verhoog en daardeur die grootte van plate vergroot. Onthou dat hierdie verhoogde diffusietempo onbedoeld kan voorkom as die harde agarplate nie heeltemal droog is nie sodat kondensasie of oortollige vog in die skottel die sagte agar in die oortreksel verdun. Hierdie tegniese toesig sal inkonsekwente resultate lewer met betrekking tot plaakgrootte vir 'n spesifieke faag.

Plaakgrootte hou ook verband met 'n aantal gasheerselgebeurtenisse, insluitend die doeltreffendheid van adsorpsie, die duur van die latente periode (die tydsduur vanaf fagadsorpsie tot lisis van die gasheersel), en die barsgrootte (die aantal nageslag wat vrygestel word deur 'n enkele infeksie). 'n Heterogene mengsel van plaakgroottes kan waargeneem word as faagdeeltjies gasheerselle by verskillende fases van bakteriese groei infekteer. Die wat byvoorbeeld tydens die vroeë eksponensiële fase adsorbeer, maak groter plate met meer nageslagfaag as dié wat in die laat eksponensiële fase adsorbeer. As 'n algemene reël produseer lytiese faag duidelike plate, terwyl lisogeniese faag troebel plate vorm. Sommige litiese fage produseer egter interessante patrone soos die "bull's eye"-gedenkplaat wat in getoon word Figuur 12B. Hierdie duidelike gedenkplate word omring deur 'n troebel stralekrans omdat daardie selle aan die rand van die gedenkplaat nie ten volle gelys is nie of weerstand teen faaginfeksie kan wees. 'n "Bull's eye"-patroon wat met gematigde fage waargeneem word, is 'n gedenkplaat met 'n troebel middel omring deur 'n duidelike ring. Hierdie morfologie weerspieël die MOI en die fisiologie van die gasheersel met betrekking tot die lisis-lisogenie besluit. Wanneer selle die eerste keer met fage besmet word, is die MOI laag en selle groei vinnig omdat voedingstowwe saam volop is, dit vergemaklik litiese groei. Soos meer en meer selle gelys word, neem die MOI toe en 'n duidelike gedenkplaat vorm. Lysogene in die middel van die plaak bly egter groei omdat hulle immuun is teen lise wat aanleiding gee tot 'n duidelike gedenkplaat met 'n troebel sentrum.

Die oorlegtegniek kan aangepas word vir plaaktoetse met eukariotiese virusse. Op dieselfde manier vorm bakteriofage gedenkplate op 'n grasperk van bakteriese selle in sagte agar, vorm eukariotiese virusse plate op 'n monolaag van selle wat deur 'n jel bedek is. 'n Monolaag is 'n samevloeiende vel selle wat langs mekaar op die oppervlak van 'n kultuurskottel groei, wat aan mekaar raak, maar nie bo-op mekaar groei nie. Om hierdie tipe plaaktoets uit te voer, word porsies virus by vatbare monolae van eukariotiese selle gevoeg. Dan word die monolaag bedek met 'n agarose-gebaseerde voedingsmedium - hierdie jel beperk die verspreiding van nageslagvirusse wat vrygestel word van besmette selle na aangrensende selle in die monolaag. Gevolglik word 'n sferiese area, of gedenkplaat, geproduseer wat selle bevat wat beskadig is deur die vrystelling van virions. Om die visualisering van die gedenkplate te help, kan kleurstowwe wat lewende selle vlek, op die selkultuur toegedien word wat kontras tussen besmette en onbesmette selle bied.

Die sagte-agar-oorlegtegniek word gebruik vir eksperimente anders as plaaktoetse. Eerstens is dit belangrik om te onthou dat die harde voedingsagar 'n ondersteuningsmatriks is wat die groei van bakterieë moontlik maak. Tweedens kan die sagte-agar wat vir die oorleg gebruik word, 'n ander voedingstofsamestelling hê as die harde agar. Op hierdie manier kan die sagte-agar dien as 'n middel om bakteriese stamme vir verskeie groei-eienskappe of metaboliese eienskappe te toets. Die oorlegtegniek word byvoorbeeld gebruik om bakterieë te sif vir die vermoë om sellulose af te breek (Teather en Wood 1982). Enkelkolonies word op 'n nie-selektiewe harde agarmedium gekweek, dan word sagte-agar wat 0.1% (w/v) karboksimetielsellulose (CMC) bevat, oor die oppervlak van die harde agar versprei. Na inkubasie word die plate oorstroom met vlek wat visualisering van sones van opruiming rondom die kolonies in die sagte agar moontlik maak. Die opheldering word veroorsaak deur hidrolitiese ensieme wat deur die bakterieë afgeskei word wat die sellulose in die medium afbreek. Meer onlangs is die oorlegtegniek gebruik om bakterieë op te spoor wat die groei van metanogene Archaea in die rumen van vee inhibeer (Gilbert) et al. 2010). Bakteriese isolate van omgewingsmonsters word op 'n harde agar-voedingsmedium gekweek, dan word kolonies bedek met sagte-agar wat 'n kultuur van metanogene bevat. Na inkubasie word die plate geïnspekteer vir sones van groeiinhibisie rondom die kolonies. Hierdie metode identifiseer bakteriese stamme wat inhibeerders van die metanogene in die sagte agar produseer.

Die mees algemene tegniese foute wat met die sagte-agar-oorlegtegniek voorkom, is om die gesmelte sagte-agar te gooi of wanneer dit te warm of te koel is. As dit te warm is, sal die bakteriese selle wat in die medium gemeng is, doodgemaak word voordat dit geplateer word. As dit te koel is, sal die sagte-agar klonte vorm wanneer dit op die harde agar gegooi word. In beide gevalle sal die resultate op sy beste dubbelsinnig of onleesbaar wees.

Replika-plaat prosedure. Die oordrag van kulture van een tipe voedingsmedium na 'n ander om groeivereistes te toets, word taamlik moeisaam as daar meer as net 'n paar stamme is.Replika-platering is 'n metode wat gelyktydige sifting van 'n groot aantal mikroörganismes toelaat. Byvoorbeeld, na mutagenisering van 'n kultuur van wilde-tipe selle, kan 'n mens plaatverdunnings van die kultuur versprei om plate met enkelkolonies te verkry. Die primêre plate bevat 'n medium wat groei van alle selle ondersteun, insluitend wilde-tipe prototrofe, wat alle verbindings sintetiseer wat benodig word vir groei, en mutante-auxotrofe, wat 'n genetiese mutasie in 'n biosintetiese pad dra wat hulle nie in staat maak om spesifieke verbindings wat noodsaaklik is vir groei te sintetiseer nie. Deur die mengsel van selle op 'n volledige medium te plaas, kan die ontbrekende voedingstowwe uit die omgewing opgeneem word. Om tussen prototrofe en auxotrofe te onderskei, kan die kolonies op 'n minimale medium gerepliseer word. Slegs prototrofe sal kan groei. Omdat die ruimtelike patroon van die primêre plaat behoue ​​bly, laat vergelyking van die sekondêre plaat met die primêre plaat identifikasie van mutantkolonies toe. Om te bepaal watter verbinding die mutante nie meer in staat is om te sintetiseer nie, kan die kolonies gerepliseer word op minimale media aangevul met spesifieke verbindings (bv. aminosure, koolstofbronne, vitamiene, ens.). Op hierdie manier kan honderde kolonies gelyktydig gekeur word deur die replika-plaatprosedure te gebruik. Een tegniese fout wat kan voorkom, is die gebruik van agarplate wat te nat is, wat veroorsaak dat kolonies saamsmeer wat al die kulture op die plaat besoedel. Dit lewer resultate wat heeltemal onbetroubaar is. Nog 'n tegniese fout is om te veel druk toe te pas wanneer selle van die fluweel na die sekondêre plate oorgedra word. Weereens, na die inkubasie van die sekondêre plate, kan die resulterende kolonies oorvleuel wat groeifenotipes produseer wat toegeskryf word aan kontaminasie eerder as eksotrofie.

Nie alle wildtipe mikrobiese spesies is prototrofe nie, so die replika-plaat prosedure kan gebruik word om gelyktydig verskillende wildtipe stamme te sift vir kenmerkende groeivereistes. Soos getoon in Figuur 13, "dabs" van selle van vier verskillende Pseudomonas bakteriële stamme is in duplikaat uitgeplaat op 'n rooster-gemerkte plaat wat volledige media genoem YTA (paneel A) bevat het. Die stamme is toe gerepliseer op drie sekondêre plate (panele B, C en D) wat saamgestel is uit minimale medium (MSA) aangevul met 'n ander koolstofbron (asetamied, laktose en glisien, onderskeidelik). Die resultate toon dat twee van die vier Pseudomonas stamme (P. aeruginosa en P. stutzeri) is nie in staat om op hierdie drie koolstofbronne te groei nie. As 'n kontrole is die stamme op 'n vierde plaat met YTA-medium gerepliseer om te bevestig dat selle regdeur die prosedure oorgedra is. Aangesien al vier stamme op die YTA-kontroleplaat groei, is die groeitekorte wat op die vorige drie plate in die reeks vertoon is, betroubaar. Die resultate van die replika-platering word in tabelvorm getoon Tabel 1. Een fout wat algemeen gemaak word, is om 'n afdruk van groei op 'n sekondêre plaat as 'n positiewe resultaat te interpreteer. Vergelyk byvoorbeeld die fenotipe van P. aeruginosa aan dié van P. stutzeri op MSA+asetamied (paneel B). Laasgenoemde vertoon 'n afdruk van groei, wat 'n negatiewe resultaat is, en kan voorkom as voedingstowwe van die vorige plaat met die ouerselle oorgedra word. Geen nuwe selgroei vind plaas nie omdat die ontbrekende voedingstowwe nie vir nageslagselle beskikbaar is nie. Dit is maklik om 'n afdruk met werklike groei te verwar. As daar twyfel is, moet die eksperiment herhaal word deur 'n alternatiewe metode te gebruik, soos om selle van die primêre plaat af op sekondêre media te streep.

Figuur 1. Voorbeeld van enkelkolonies op 'n bord. Die pienk sfere naby die middel van die plaat is kolonies van Serratia marcescens, 'n Gram-negatiewe, staafvormige Proteobacterium in die familie Enterobacteriaceae. As gevolg van sy voorkeur vir klam omgewings, word hierdie mikro-organisme algemeen aangetref wat in die hoeke van baddens, in wasbakke, in teëlvoeg en op stortgordyne groei. S. marcescens is maklik om te herken aangesien dit 'n rooierige pigment genaamd prodigiosin produseer. Die kolonies op hierdie plaat is gegenereer deur gebruik te maak van die streepplaat-tegniek, met enkelkolonies wat in die vierde kwadrant verskyn het na inkubasie by 30 ଌ vir 24 uur. Die ander drie kwadrante toon samevloeiende groei waarin selle wat op die agaroppervlak neergelê is, ontwikkel het tot oorvleuelende kolonies.

Figuur 2. Instrumente wat gebruik word vir streep-plaat tegniek. Van bo na onder word tandestokkies (geplat, nie rond nie), 'n draadlus, 'n weggooibare plastieklus en houtstokkies gewys. Tandestokkies word tipies na 'n klein glasbeker oorgeplaas met die wye punt na onder en dan bedek met foelie wanneer dit in die outoklavasie uitgevoer word om te steriliseer voor gebruik. Houtstokkies word na 18 mm proefbuise oorgeplaas en dan in outoklavasie gemanipuleer om voor gebruik te steriliseer.

Figuur 3. (A) Streepplaattegniek deur die kwadrantmetode te gebruik. 'n Vooraf gesteriliseerde lus, stok of tandestokkie word gebruik om die monster oor 'n kwart van die agaroppervlak te versprei met 'n vinnige, gladde, terug-en-vierde beweging vanaf die rand na die middel van die plaat. Hierdie aksie word herhaal vir elk van die vier kwadrante van die plaat. Na inkubasie verskyn selgroei langs die pad van die instrument wat gebruik word om die selle op die plaat te deponeer. Meganiese skeiding van selle in 'n gemengde monster wat hierdie tegniek gebruik, behoort enkelkolonies in die vierde kwadrant tot gevolg te hê (sien Figuur 1 vir 'n voorbeeld). Daar word na enkelkolonies verwys as kolonievormende eenhede (cfu). (B) Wanneer 'n metaallus vir streepplatering gebruik word, moet dit met die vlam van 'n Bunsenbrander gesteriliseer word voordat dit met die inokulum of die agarmedium in aanraking kom. Onthou dat die warmste deel van die vlam die punt van die blou keël is. Hou die handvatsel van die instrument vas en plaas die draad in die vlam ongeveer 3-4 duim van die lus af. Laat dit lank genoeg dat die draad rooi warm word. Beweeg die draad sodat die vlam die lus nader. Maak seker dat die metaallus afgekoel is voordat jy aan die inokulum raak.

Figuur 4. Skinkbord-tegniek. (A) 'n Klein volume monster (tussen 0.1 tot 1.0 ml) word asepties in 'n leë maar steriele Petri-bak gegooi met behulp van 'n 5.0 ml serologiese pipet. (B) Gesmelte agar wat tot 'n temperatuur van ongeveer 48 ଌ gebalanseer is, word dan saam met die monster in die Petri-bak gegooi. Nadat die deksel toegemaak is, word die plaat liggies gedraai om die monster en gesmelte agar te meng. Die agar word toegelaat om vir ongeveer 30 minute te stol en dan word plate omgekeer vir inkubasie.

Figuur 5. Spreiplaattegniek met 'n draaitafel en glasstrooier. Nadat die agarplaat op 'n draaitafel geplaas is, word 'n klein volume monster (0.1 tot 0.2 ml) asepties op die middel van die plaat uitgegee deur 'n mikropipet te gebruik. Die strooier word gesteriliseer deur dit in 'n beker etanol te doop en dit dan deur die vlam van die Bunsen-brander te stuur om oortollige etanol aan die brand te steek. Voordat kontak gemaak word met die monster, moet die strooier afgekoel word deur dit aan die agar naby die rand van die plaat te raak. Die strooier word liggies heen en weer deur die monster oor die plaat beweeg terwyl die draaitafel stadig draai. Hierdie aksie laat geleidelike maar eweredige verspreiding van die monster oor die agar-oppervlakte toe. Nadat die deksel toegemaak is, moet die plaat vir ten minste 5 minute ongestoord op die bankblad geplaas word om die monster heeltemal in die agar te laat absorbeer voordat die plaat omgekeer word vir inkubasie.

Figuur 6. Spreiplaat-tegniek met glaskrale (Copacabana-metode). Glaskrale wat vooraf in 'n outoklaaf gesteriliseer is, word op die oppervlak van 'n agarplaat gegooi wat op die bankblad sit. 'n Klein volume monster (100 tot 150 μl) word asepties op die middel van die agar uitgegee deur 'n mikropipet te gebruik. Met die deksel van die plaat toe, word 'n horisontale skudbeweging gebruik om die krale 6 tot 7 keer saggies heen en weer oor die plaat te beweeg, en die monster te versprei. Hierdie aksie word herhaal nadat die plaat 60° gedraai is. Die skudbeweging word 'n derde keer herhaal na nog 'n 60° rotasie. Sodra die monster heeltemal in die agarmedium geabsorbeer het, word die krale in 'n beker gegooi wat 10% bleikmiddel bevat. Die plate word dan omgekeer vir inkubasie.

Figuur 7. Sagte-agar-oorlegtegniek wat gebruik word om fage te isoleer en op te som gebaseer op die vorming van gedenkplate (ook genoem 'n plaaktoets). (A) Die teenwoordigheid van fage kan opgespoor word as sone van skoonmaak, of gedenkplate, op 'n samevloeiende suspensie van bakteriese kolonies wat in die sagte agar groei. Faag T4 is 'n virulente, dubbelstring-DNS-faag wat sy gasheer besmet, Escherichia coli, wat veroorsaak dat die gasheerselle liseer en nageslagfaag vrystel. Na verskeie rondtes van infeksie en lysis, die naburige E coli selle in die onmiddellike omgewing rondom die oorspronklike besmette gasheersel verdwyn en laat 'n gedenkplaat wat miljarde T4-faagdeeltjies bevat. Faag T4 produseer plate wat ongeveer 1 mm in deursnee is. In hierdie eksperiment is 200 μl van 'n 10 -5 verdunning van 'n 2 x 10 8 pfu/ml voorraad van Phage T4 gemeng met ongeveer 300 μl van E coli aanwyserselle voorberei as 'n eksponensieel groeiende, deurlugte kultuur by 37 ଌ. Beide die fage en bakterieë is by 'n EHA sagte agar buis gevoeg, gemeng en dan op die oppervlak van 'n EHA harde agar plaat gegooi. Let daarop dat dit nie nodig was om fage en bakterieë toe te laat om te adsorbeer voor platering in hierdie geval nie. Nadat die sagte agar vir 20 minute ongestoord laat stol het, is die plate omgekeer en vir 24 uur by 37 ଌ geïnkubeer. (B) In die afwesigheid van infekterende faagdeeltjies, lei bakteriese groei tot 'n troebele suspensie van selle in die sagte agar waarin diskrete kolonies nie sigbaar is nie. In plaas daarvan, 'n egalige grasperk van bakteriese selle, in hierdie geval E coli, vorm regdeur die hele sagte agarlaag.

Figuur 8. Voorbereiding van primêre plaat (meester) met bakteriese monsters. Om monsters georganiseer te hou, kan die onderkant van die bord in 'n rooster gemerk word en die gevolglike vierkante genommer word. Elke monster kan 'n vierkant op die rooster toegeken word. Getoon is voorbeelde van korrekte versus verkeerde inentingspatrone. Ideaal gesproke word 'n klein aantal selle na die middel van die vierkant oorgeplaas met 'n steriele inentingsinstrument soos 'n tandestokkie om die monster te "dep" (sel #4). Algemene inentingsfoute, soos dié wat in sel #5 ("pleister") en sel #6 ("vul") uitgebeeld word, lei tot oorgroei van bakteriese monsters na inkubasie, wat gevolglik aangrensende vierkante besoedel.

Figuur 9. Replika-plaat tegniek wat gebruik word om selle van primêre na sekondêre plate oor te dra vir fenotipe skerms. Die merk op die primêre plaat is in lyn met die merk op die fluweel bedekte blok en dan laat sak sodat die agar-oppervlak met die lap kontak maak. Selle word van die plaat na die fluweel oorgedra deur liggies maar eweredig op die primêre plaat met vingerpunte af te druk. Hierdie aksie sal 'n afdruk van die selmonsters op die fluweel laat in dieselfde ruimtelike patroon as die primêre plaat. Dieselfde prosedure word gebruik om selle van die fluweel na 'n sekondêre plaat oor te dra. Soveel as 7-8 sekondêre plate kan met dieselfde primêre plaatafdruk op die fluweel geënt word. Die laaste plaat wat van die fluweel ingeënt is, moet as 'n positiewe kontrole dien. Dit moet 'n medium wees wat groei van alle getoetsde stamme ondersteun, wat verseker dat voldoende seloordrag deur die hele reeks plate plaasgevind het. Na inkubasie kan sekondêre plate geïnspekteer word en gepunt word vir groei teenoor geen groei. Dus kan verskeie bakteriese stamme gelyktydig op verskeie groeimediums in 'n enkele eksperiment gekeur word.

Figuur 10. Voorbeeldresultaat met gebruik van skinkbord-tegniek. 'n 1.0 ml monster water wat uit 'n openbare drinkfontein versamel is, is in 'n steriele leë Petri-bak gegooi. Toe gesmelte maar afgekoelde YTA is in die skottel met die monster gegooi. Die agar het ook 100 μg/ml sikloheksimied bevat om die groei van giste en skimmels wat moontlik in die watermonster aanwesig was, te voorkom. Nadat die plaat saggies gedraai is om te meng, is die plaat op 'n plat oppervlak geplaas en die agar is toegelaat om heeltemal te stol. Die plaat is vir 48 uur by 37 ଌ geïnkubeer. Getoon is die resultaat van hierdie eksperiment. Let op die verskil in voorkoms van oppervlakkolonies, wat groot en sirkelvormig van vorm is, teenoor ondergrondse kolonies, wat baie klein en onreëlmatig van vorm is omdat die gestolde medium die verspreiding van kolonies in die ondergrond inhibeer.

Figuur 11. Voorbeeldresultaat deur gebruik te maak van spreiplaattegniek. Die "Copacabana-metode" is gebruik om 'n mengsel van E. coli-selle te plaat vir 'n siftingseksperiment. In hierdie geval bevat die groeimedium (LB) X-Gal, so daardie selle wat 'n funksionele β-galaktosidase-ensiem uitdruk, vorm blou kolonies terwyl daardie selle met 'n mutasie in die lacZ geen en dus nie in staat is om 'n funksionele β-galaktosidase ensiem vorm wit kolonies uit te druk nie. Daar word dikwels na verwys as 'n "blou/wit skerm", die twee tipes kolonies kan maklik van mekaar op dieselfde plaat onderskei word.

Figuur 12. Voorbeeldresultaat van plaaktoets met sagte-agar-oorlegtegniek. Getoon is plate wat op die gasheerstam gevorm is Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (ATCC 700084) deur twee verskillende fage: (A) Mycobacteriophage Destroyers en (B) Mycobacteriophage MSSS. Hierdie fage is in die lente van 2010 deur studente in die UCLA-laboratoriumkursus MIMG 103L geïsoleer. M. smegmatis is 'n nie-patogeniese Actinobacterium en behoort aan 'n familie van mikobakterieë wat 'n paar patogene insluit wat bekend is om ernstige siektes soos tuberkulose (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) en melaatsheid (M. leprae). Ongeveer 50 μl van 'n 10 -2 verdunning van Destroyers en 'n 10 -3 verdunning van MSSS elk is geïnkubeer met 500 μl van M. smegmatis vir 20 minute by 37 ଌ dan gemeng met MBTA (sagte agar) en op MHA (harde agar) plate gegooi. Nadat die sagte agar vir 20 minute ongestoord laat stol het, is die plate omgekeer en by 37 ଌ vir 48 uur geïnkubeer. Let op die afsonderlike plaakmorfologieë wat deur elke fage geproduseer word. Vernietigers (A) vorm klein (gemiddelde deursnee van ongeveer 1 mm), duidelike gedenkplate kenmerkend van 'n litiese faag, terwyl MSSS (B) groot "bull's eye" plate ontwikkel met duidelike middelpunte omring deur 'n troebel halo (gemiddelde deursnee van ongeveer 3,2 mm) . Die wasige ring kan bestaan ​​uit bakterieë wat bestand is teen fage-infeksie. Hierdie patroon verskil van dié wat gevorm word deur lisogeniese fage, wat troebel gedenkplate produseer.

Figuur 13. Voorbeeld resultaat met behulp van replika-plaat prosedure. Vier Pseudomonas stamme (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens en P. stutzeri) is in duplikaat getoets vir groei op drie verskillende koolstofbronne: asetamied, laktose en glisien. (A) Die primêre plaat is 'n volledige medium (YTA) geïnokuleer met die vier stamme soos aangedui. Na inkubasie by 30 ଌ vir 24 uur, groei al vier stamme op YTA. Die primêre plaat is gebruik om plaat te replikeer op minimale medium (MSA) aangevul met 'n enkele koolstofbron: asetamied (B), laktose (C) en glisien (D). Die laaste plaat in die reeks was 'n positiewe kontrole YTA plaat (E). Soos getoon, toon die stamme veranderlike groeipatrone na inkubasie op die sekondêre plate. Let daarop dat dit soms moeilik is om te onderskei tussen groei en 'n afdruk van selle. Vergelyk byvoorbeeld die afdruk wat gegenereer word deur P. stutzeri op die drie MSA plate tot geen groei op dieselfde drie plate deur P. aeruginosa. Albei is negatiewe resultate in vergelyking met die groeipatrone wat deur P. putida en P. fluorescens. Alle stamme groei egter op die positiewe kontroleplaat wat bevestig dat selle na alle sekondêre plate in die reeks oorgedra is. Die resultate van hierdie eksperiment word in tabelvorm uiteengesit Tabel 1.

 YTA (primêr)MSA + asetamiedMSA + laktoseMSA + glisienYTA (beheer)
P. aeruginosa+---+
P. putida+++++
P. fluorescens+++++
P. stutzeri+---+

Tabel 1. Opsomming van replika-plateringsresultate. Groei aangedui as plusteken (+) en geen groei voorgestel as minusteken (-). YTA is 'n volledige medium (gis-triptoon-agar) en MSA is 'n minimale medium (minimale soute-agar). Die MSA-plate is aangevul met 'n enkele koolstofbron soos aangedui.


Bespreking

Metaboliese uitruilinteraksies kom gereeld voor tussen selle wat naby mekaar groei, aangesien metaboliete voortdurend uit selle vrygestel word vir verskillende redes, soos oorloopmetabolisme, metabolietherstel, sowel as uitvoer to਀metabolisme. . By bakterieë is 'n subset van sulke metaboliet-uitruilings van 'n samewerkende aard in die sin dat alle uitruilvennote voordeel trek uit hierdie situasie (Oliveira et al., 2014), terwyl metaboliet-uitruilstrategieë vir die meerderheid eukariotiese organismes onduidelik bly. Ten spyte van die feit dat gis-auxotrofe lewensvatbaar is in aangevulde en ryk media (Mülleder et al., 2012), in die afwesigheid van aminosuuraanvulling, versuim hulle om metaboliese tekorte in verskeie pare of hoër orde ko-kultuur eksperimente aan te vul (Figuur 1A, B , [Müller et al., 2014 Shou et al., 2007]), 'n duidelike verskil met bakteriese studies, waar soortgelyke eksperimente effektief was (Foster en Bell, 2012 Freilich et al., 2011 Harcombe, 2010 Pande et al. ., 2014 Ramsey et al., 2011 Vetsigian et al., 2011). Dit het gelei tot bespiegelings dat gis, in teenstelling met baie bakteriese spesies, nie die vereiste uitvoervermoëns kan hê om groeirelevante uitruiling van intermediêre metaboliete soos aminosure en nukleobasisse moontlik te maak nie (Shou et al., 2007). Deur die intra-kolonie-eksometaboloom te ontleed, kon ons egter die vereiste metaboliete opspoor, ons het gevind dat selle binne 'n kolonie omring word deur 'n ryk eksometaboloom. Ons het ook gevind dat gis die voedingstowwe doeltreffend sal ontgin wanneer dit beskikbaar is, in die mate dat hulle uitsluitlik op hierdie ekstrasellulêre metaboliete staatmaak. Hierdie resultaat het geïmpliseer dat metaboliet-uitruiling onder mede-groeiende gisselle gereeld van nature voorkom, die gebrek aan komplementering in die mede-kultuur eksperimente kan dus 'n limiet van die eksperiment self weerspieël, en nie die metaboliet-uitruilvermoë van gisselle verteenwoordig nie.

Om die kombinasie van twee of meer kulture te omseil, het ons 'n benadering van sintetiese biologie gekies en die stogastiese verlies van plasmiede uitgebuit om die metaboliese tekortkominge in ewekansige kombinasie van 'n aanvanklike enkelsel progressief in te voer. Die progressiewe verlies aan prototrofie het selle in staat gestel om selgroei te handhaaf op grond van metabolietuitruiling, wat gelei het tot 'n gemeenskap met 73% auxotrophy, wat tot 97% toegeneem het na aanvulling met die mees beperkende metaboliet, uracil. Ten spyte van sy dominante outotrofiese samestelling, kan die SeMeCo-gemeenskap 'n wildtipe soos eksometaboloom, metaboliese doeltreffendheid, sowel as sellewensvatbaarheid handhaaf, wat impliseer dat hierdie tipe samewerking 'n robuuste fisiologiese eienskap is. Gevolglik is gis se natuurlike metaboliet-uitvoer- en invoervermoë heeltemal voldoende om medegroei te ondersteun op grond van metaboliet-uitruiling.

Die vestiging van SeMeCos is ook nie vergemaklik deur die vermenging van die auxotrofes in 'n  hoër orde kombinasie nie. Dit stem ooreen met die idee dat die verlies van meer metaboliese gene biochemiese vermoëns verminder en nie nuwes byvoeg nie. Die sleutel van die SeMeCo-stelsel is eerder om die progressiewe selfvestiging van die gemeenskap toe te laat vanaf die enkelsel (Figuur 2). Metaboliese terugvoer regulatoriese stelsels inhibeer dus nie metabolietuitvoer in die algemeen nie, maar voorkom koöperatiewe mede-groei wanneer reeds vooraf-gevestigde ko-kulture gemeng word (Müller et al., 2014 Shou et al., 2007). 'n Moontlike rol van hierdie meganismes kan dalk die verspreiding van vreemde, potensieel bedrogselle, wat van 'n mededingende giskolonie afkomstig is, voorkom. Ons kan gedrag repliseer wat ten gunste van so 'n aanname is Deur 'n selkultuur in SeMeCo in te voeg wat dieselfde genotipe besit as 'n gereelde (HIS3 LEU2 ura3Δ MET15) en skaars (his3Δ leu2Δ URA3 MET15) genotipe (Figuur 5A), het ons waargeneem dat beide genotipes vinnig uitgeput was van die vooraf-gevestigde SeMeCo, ongeag die frekwensie van die onderskeie genotipe in SeMeCo (Figuur 5𠅏iguur aanvulling 1).

Die bestudering van die genotipiese samestelling van SeMeCo het geïmpliseer dat daar 'n gedefinieerde stel interaksies is wat onderliggend is aan die eienskappe van die samewerkende gemeenskap, wat 'n soortgelyke bevolkingsamestelling gehandhaaf het wat agt reproduseerbaar gekonsentreerde metabotipes behels wanneer dit onafhanklik gevestig is. Dit dui daarop dat hierdie kwantitatief gedefinieerde gemeenskapsamestelling die doeltreffendste was in metaboliese samewerking. Hierdie bevinding kan 'n belangrike leemte in die begrip van die evolusie van meerselligheid sluit As 'n gedefinieerde samestelling die doeltreffendste is in koöperatiewe groei, kan 'n seleksievoordeel verskaf word deur enige soort fisiese binding wat samewerkingsvennote in die gedefinieerde ewewigte kan handhaaf, en sal bied boonop bykomende beskerming teen die inval van bedrieglike seltipes. Inderdaad, die eksometaboloom-data impliseer dat die aantal metaboliet-uitruilinteraksies tussen medegroeiende selle beduidend kan wees. Die kolonie-eksometaboloom het 'n groot verskeidenheid biomolekules bevat, insluitend die meerderheid aminosure (Figuur 1C) (Castrillo et al., 2007 Paczia et al., 2012 Silva en Northen, 2015). Die bevinding dat gisselle opname verkies bo sintese van aminosure en urasiel, selfs wanneer hulle geneties prototrofies is, toon dat uitruilinteraksies geredelik sal vestig sodra die sellulêre omgewing 'n kritieke konsentrasie van metaboliete verkry het. Dit het implikasies vir die interpretasie van metagenomiese studies en bedrog/weldoener-eksperimente, aangesien dit om hierdie rede nie afgelei kan word uit die genetiese teenwoordigheid of afwesigheid van 'n enkele metaboliese pad, of uit die sintese van 'n enkele metaboliet, hoeveel ander metaboliete nie. word ook uitgeruil.

Selfs sonder selektiewe druk het beide wildtipe giste   en SeMeCo  'n aminosuurryke eksometaboloom op minimale media (Figuur 1C) gevestig en betrokke by metabolietopname 1 was wanneer nutriën beskikbaar was. Dit impliseer dat hierdie kenmerke 'n natuurlike eienskap van gis is en laat die vraag ontstaan ​​waarom natuurlike gisgemeenskappe nie saamgestel is uit medegroeiende, genetiese, auxotrofes nie. Om hierdie vraag te beantwoord, moet 'n mens in gedagte hou dat die besit van metaboliese gene in die genoom nie gelyk is aan die pad wat voortdurend aktief is nie. Trouens, prototrofe kan buigsaam van selfsintese na aminosuuropname oorskakel (Figuur 1). Om geneties prototroof te wees, gee dus 'n hoër vlak van metaboliese buigsaamheid, aangesien prototrofiese selle 'n sintetiese pad kan heraktiveer wanneer dit nodig is. Anders as in SeMeCo, weerspieël die genotipe van 'n sel in 'n natuurlike gemeenskap nie in wese sy metabotipe of sy metaboliese rol in਍ie gemeenskap. Daarbenewens behels die natuurlike lewensiklus van gis die vorming van endospore, wat belangrik is om hongersnood te verduur, en om tussen habitatte te versprei. Sonder 'n prototrofiese genotipe kan 'n enkele spoor nie meer 'n kolonie op sy eie vestig nie aangesien genetiese auxotrofie die gis lewensiklus sou onderbreek. Tweedens vind slegs 'n fraksie van die natuurlike gis-lewensiklus plaas onder eksponensiële groei wat oorvloedige koolhidraat- en stikstofvoorsiening vereis. Die instandhouding van 'n prototrofiese genotipe beide in S. pombe en in S. cerevisiae wilde isolate (Jeffares et al., 2015 Liti et al., 2009) is dus ten volle versoenbaar met die teenwoordigheid van uitgebreide aminosuur- en nukleotieduitruilmeganismes.

Die bevinding dat hierdie selle ten volle verskuif van selfsintese na opname vir histidien, leusien, metionien en urasiel, sodra hierdie metaboliete verskaf is, het direkte implikasies op navorsing met gebruik van gis, 'n primêre eukariotiese model organisme in genoomskaal studies. Die meerderheid van gis genetiese eksperimente word uitgevoer in ouksotrofiese stamme, wat aminosuur aangevul of ryk media samestellings vereis. Belangrike dele van biosintetiese metabolisme (aminosuurbiosintese kan tot 50% van metaboliese vloei na biomassa uitmaak) kan dus stil gebly het in 'n aansienlike hoeveelheid funksionele genomika-eksperimente. Die uitwerking van metaboliese genetiese interaksies op sellulêre fisiologie kan dus ons huidige kennis wesenlik oorskry en kan ontdek word wanneer oorgeskakel word na minimale voedingsaanvullings. In hierdie konteks is SeMeCo's eenvoudig om te hanteer, vinnig te vestig en maklik om te ontleed, en verteenwoordig dus 'n effektiewe en breed toepaslike eukariotiese modelstelsel om beide koöperasie en effekte van metabolisme in die laboratorium te bestudeer.

Samevattend, met behulp van histidien, leucine, metionien en uracil as model metaboliese weë vir uitruilbare metaboliete, het ons gevind dat S. cerevisiae selle verkies hierdie voedingstowwe se opname bo hul selfsintese en handhaaf 'n aminosuurryke eksometaboloom in die ekstrasellulêre kolonieruimte,ꂪnwysers van voortdurende inter-sellulêre metaboliet metaboliet. Alhoewel dit bekend is dat gis misluk in die kompensasie vir auxotrofie in paarsgewyse en hoër-orde ko-kultuur eksperimente, het die  selle   suksesvol ingegaanਊ staat  staat  van ʼn enkele koöperatiewe groei van ʼn enkele koöperatiewe groei. kan progressief ontwikkel tot 'n komplekse heterogene gemeenskap. Samegestel uit ouksotrofiese seltipes wat op hul eie nie-lewensvatbaar is, was SeMCo-gemeenskappe in staat om metaboliese tekorte te oorkom en metabolietkonsentrasies en robuustheid soortgelyk aan wilde-tipe selle te handhaaf. Boonop het samewerking verskillende metaboliese rolle op bydraende selle opgelê. Progressiewe gemeenskapsvorming toon dus dat gis volle kapasiteit besit om anaboliese metaboliete teen groei-relevante hoeveelhede uit te ruil en geredelikਊ nie-sel-outonome metabolisme binne komplekse maar gedefinieerde gemeenskapstrukture vestig.


  • Media Resepte bestanddele (sien die Media Resepte bladsy)
  • steriele, polistireen Petri-skottels. 100 x 15 mm is die algemeenste grootte, maar 60 en 35 mm groottes werk ook
  • glashouer wat minstens twee keer die volume van jou media sal hou
  • aluminiumfoelie om jou mediahouer te bedek, of kleefplastiek as jy 'n mikrogolfoond gebruik
  • outoklaaf, drukkoker, mikrogolf, of warm plaat vir die sterilisering van jou media (sien die Sterilizing Liquids-bladsy)
  • hittebestande handskoene, hothands of pothouers vir die hantering van warm houers
  • 70% etiel of isopropyl (vryf) alkohol
  • huishoudelike skoonmaker, 10% bleikmiddel of ontsmettingsdoeke om jou werkarea skoon te maak
  • gegradueerde silinder vir die meet van water
  • balans vir die weeg van vaste bestanddele
  • gereedskap vir die hantering van vaste bestanddele (soos weegbote en scoopulas, of papierborde en -lepels)

Biologie-aantekeninge oor omgekeerde mutasies | Genetika

Die onderstaande artikel verskaf aantekeninge oor omgekeerde mutasie.

Wanneer 'n mutasie die wilde tipe normale genotipe verander na 'n mutant tipe, soos meer dikwels die geval is, word die gebeurtenis 'n voorwaartse mutasie genoem. Dit is in teenstelling met omgekeerde mutasies waarin die mutante genotipe verander na die oorspronklike wilde tipe. By mikro-organismes word ouksotrofe wat na prototrofe terugkeer maklik opgespoor deur selle van die oorspronklike ouksotrofe stam op minimale medium te plateer.

In bakteriofaag T4 keer die rll-mutante (stamme wat vinnige lisis van gasheerselle veroorsaak) gereeld terug na die wildetipe rll +-stam. In Drosophila is dit bekend dat 'n aantal resessiewe mutante gene terugkeer na die wilde tipe, maar met 'n minder frekwensie as die voorwaartse mutasies. Die vermoë van mutante gene om terug te keer, dui daarop dat mutasie ten minste in sommige gevalle nie 'n permanente, onomkeerbare proses is nie.

Omgekeerde mutasies kan op verskillende maniere voorkom. In 'n ware omgekeerde mutasie kan die oorspronklike basispaarvolgorde van die wilde tipe herstel word. As 'n GC-paar van die wildtipe volgorde dus vervang word deur 'n AT-paar om 'n voorwaartse mutasie te produseer, kan 'n ware omgekeerde mutasie weer 'n GC-paar in daardie posisie vervang.

Soms kan 'n ander basispaar ingevoeg word by die plek van die veranderde paar wat die voorwaartse mutasie veroorsaak het. Dus, wanneer GC deur AT vervang word, kan die terugkeer as gevolg van vervanging deur CG in plaas van GC wees. Dit produseer 'n omgekeerde fenotipe al verskil sy volgorde van die wilde tipe in 'n enkele basispaar.

Soms is 'n skynbaar omgekeerde mutasie te wyte aan 'n tweede onderdrukkermutasie wat die effek van die primêre mutasie onderdruk sodat die fenotipe soos die wilde tipe voorkom. Daar kan intrageniese onderdrukking wees wanneer die tweede mutasie plaasvind binne die geen wat die eerste mutasie dra, maar op 'n ander plek. Of onderdrukking kan intergeen (ekstrageen) wees wanneer die tweede mutasie in 'n ander geen lê.

In beide tipes onderdrukking produseer die tweede onderdrukkermutasie funksionele produkte van die geen wat die eerste of primêre mutasie dra. Gestel byvoorbeeld geen A is nie in staat om A-proteïen te produseer as gevolg van 'n mutasie nie. 'n Onderdrukkermutasie in dieselfde of in 'n ander geen kan lei tot die produksie van A-proteïen, en sodoende die mutasie in geen A omkeer.

In die geval van intergeniese onderdrukking, dui die term onderdrukkergeen die geen aan wat die tweede mutasie het wat die primêre mutasie in 'n ander geen onderdruk. Die produkte van onderdrukkergene is gewoonlik komponente van die translasiestelsel, die onderdrukkermolekules is dikwels tRNA-molekules.

In intrageniese onderdrukking kan terugkeer na die normale fenotipe veroorsaak word deur delesie en invoeging van enkele nukleotiede in dieselfde geen. As die leesraam van drieling dus verskuif word as gevolg van 'n enkele delesie wat primêre mutasie veroorsaak, sal die raam herstel word as 'n enkele invoeging by die plek van die tweede mutasie plaasvind.

Slegs die drieling tussen die delesie en invoeging sal verkeerde aminosure byvoeg, die res van die ketting sal normaal wees. As die plek van die tweede mutasie naby die eerste is, sal die aantal verkeerde aminosure klein wees, en 'n vollengte funksionele proteïen sal geproduseer word.

Intergeniese onderdrukking deur onderdrukkergene is as gevolg van veranderinge in die proses van translasie. Die meeste van die onderdrukkergene spruit uit mutasies in die tRNA-gene en hul produkte is mutante tRNA-molekules. Daar is onderdrukkergene vir mutasies in elk van die drie kettingterminerende kodons, naamlik amber (UAG), oker (UAA) en opaal (UGA).

Normaalweg is amber, oker en opaal nonsensmutasies wat op plekke in 'n boodskap geleë is en lei tot fragmente van polipeptiedkettings. Die onderdrukkergeen vir elke nonsensmutasie laat invoeging van 'n aminosuur by die plek van die nonsenskodon toe en die ketting word nie beëindig nie. Die onderdrukking van kettingterminerende mutante word bewerkstellig deur die lees van die nonsenskodon asof dit 'n sinskodon is.

Byvoorbeeld, een soort amber-onderdrukker plaas die aminosuur tyrosine teen die nonsens-kodon UAG in. Die onderdrukkergeen produseer 'n mutante tyrosien-spesifieke tRNA. Die normale tyrosien-tRNA het die antikodon GUA en herken die drieling UAC en UAU in mRNA. Die antikodon in die mutante tRNA word verander na CUA wat saam met UAG en tirosien word ingevoeg in plaas daarvan dat die ketting vroegtydig eindig.

Nog 'n voorbeeld illustreer intergeniese onderdrukking in E. coli. 'n Primêre amber-mutasie in E. coli het 'n basisdrieling in 'n nonsens-kodon UAG verander. Sommige ander selle van E. coli wat dieselfde mutasie dra, het 'n intergeniese amberonderdrukkermutasie gehad in 'n geen wat vir serien-tRNA kodeer.

Die onderdrukkergeen het mutante tRNA-molekules geproduseer met 'n veranderde antikodon wat AUG kon herken. Die onderdrukkergeen kon dus serien by die plek van die nonsens-drieling AUG invoeg en volle lengte polipeptiedkettings kon gevorm word. Beide UAG en UGA onderdrukkers tree op deur die antikodon in 'n spesifieke tRNA te verander en mutante onderdrukkers tRNA's te produseer. Die meganisme van UAA-onderdrukking is nie ten volle bekend nie.

Die amberdempergeen het ook die voorkoms van voorwaardelike mutante in T4-bakteriofaag verduidelik. Daar is gevind dat die amber-mutante van T4 op een stam van E. coli (genoem permissiewe gasheer) groei, maar nie in 'n ander stam nie (genoem beperkende gasheer).

Dit was omdat die permissiewe stam van E. coli die amberonderdrukkergeen gedra het wat die effek van die ambermutasie omgekeer het. Selle van E. coli wat nie die amber-onderdrukkergeen het nie, toon ook die amber-mutasie.


Hoe word die Auxotrophs geïdentifiseer in 'n replika-plateringseksperiment?

Klik om die volledige antwoord te lees. Dan, hoe doen jy replika plating?

Die tegniek behels die druk van 'n fluweelbedekte skyf, en dan afdruk van sekondêre plate met selle in kolonies wat van die oorspronklike verwyder is. bord deur die materiaal. Oor die algemeen is groot getalle kolonies (ongeveer 30-300). replika geplateer as gevolg van die moeilikheid om elkeen individueel op 'n aparte uit te streep bord.

Weet ook wat 'n ouksotrofiese merker is? An ouksotrofiese merker word dan gedefinieer as 'n wildtipe alleel van 'n geen wat kodeer vir 'n sleutelensiem vir die produksie van 'n noodsaaklike monomeer wat in biosintese gebruik word. Enkele voorbeelde van die algemeen gebruik ouksotrofiese merkers in S. cerevisiae is URA3, LYS2, LEU2, TRI1, HIS3, MET15 en ADE2 (1).

Gevolglik, wat is Auxotroof en Prototroof?

&xiά&nu&omega "om te verhoog" &tau&rho&omicron&phiή "voeding") is die onvermoë van 'n organisme om 'n bepaalde organiese verbinding te sintetiseer wat nodig is vir sy groei (soos gedefinieer deur IUPAC). An eksotroof is 'n organisme wat hierdie eienskap vertoon eksotroof is die ooreenstemmende byvoeglike naamwoord.

Hoe sal jy tussen Auxotrophs en Prototrophs in 'n bakteriese populasie onderskei?

An eksotroof vereis 'n organiese groeifaktor, maar a prototroof nie omdat dit al die organiese groeifaktore wat dit nodig het, kan sintetiseer.


Kyk die video: Auxotrofie in gist Auxotrofe complementatietechniek (Oktober 2022).