Inligting

Hoe kan prokariote dubbelstrengbreuke herstel deur homoloë rekombinasie as hulle haploïede is?

Hoe kan prokariote dubbelstrengbreuke herstel deur homoloë rekombinasie as hulle haploïede is?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die titel sê alles, ek is seker besig om mal te word.


Verskeie antwoorde op hierdie vraag:

  1. Baie van die tyd wat bakterieë doen om DSB's te herstel, is eintlik nie-homologe eindverbindings, wat nie streng homologie vereis nie. Dit is die meer waarskynlike meganisme vroeër in die selsiklus wanneer kopiegetal meer waarskynlik ~1 sal wees.

  2. As selle DNA-replikasie voltooi het (later in die selsiklus), is daar ten minste 2 kopieë van alle DNA's teenwoordig in die sel. Dit kan gebruik word vir homoloë rekombinasie.

  3. Bakteriële chromosoomkopiegetal kan in sommige situasies oorgerepliseer word, sodat DNA-replikasie nie met die selsiklus gesinchroniseer word nie en meer as normaal vir 'n sel is. In hierdie situasies kan die kopienommer >2 wees.


Hoe kan prokariote dubbelstrengbreuke herstel deur homoloë rekombinasie as hulle haploïede is? - Biologie

Geteikende genoomredigering is 'n voortdurend ontwikkelende tegnologie wat programmeerbare nukleases gebruik om spesifiek 'n genomiese volgorde van belang te verander, in te voeg of te verwyder. Hierdie gevorderde molekulêre gereedskap sluit in meganukleases, sinkvingernukleases, transkripsie-aktiveerder-agtige effektor-nukleases en RNA-geleide gemanipuleerde nukleases (RGENs), wat dubbelstring-breuke by spesifieke teikenplekke in die genoom skep, en DNA herstel deur homoloë rekombinasie in die teenwoordigheid van skenker-DNS of via die foutgevoelige nie-homologe eindverbindingsmeganisme. 'n Onlangs ontdekte groep RGENs bekend as CRISPR/Cas9-geenredigeringstelsels het presiese genoommanipulasie moontlik gemaak wat 'n oorsaaklike verband tussen siektegenotipe en -fenotipe aan die lig gebring het, sonder dat die herontwerp van die spesifieke ensiem nodig was wanneer verskillende volgordes gemik is. CRISPR/Cas9 is suksesvol in diens geneem as 'n ex vivo geen-redigeringsinstrument in embrioniese stamselle en pasiënt-afgeleide stamselle om pankreas beta-sel ontwikkeling en funksie te verstaan. RNS-geleide nukleases maak ook die weg oop vir die generering van nuwe diermodelle vir diabetes en laat die doeltreffendheid van verskeie terapeutiese benaderings in diabetes toets, soos opgesom en geïllustreer in hierdie manuskrip.

Kernwenk: In hierdie oorsig word CRISPR/Cas9 nuklease ontplooi in die generering van sellulêre en diermodelle van diabetes, wat geskik is vir die toetsing van die behandelingsdoeltreffendheid van nuwe insulien geenterapie-benaderings.

  • Aanhaling: Eksi YE, Sanlioglu AD, Akkaya B, Ozturk BE, Sanlioglu S. Genoomingenieurswese en siektemodellering via programmeerbare nukleases vir insulien geenterapie beloof van CRISPR/Cas9 tegnologie. Wêreld J Stamselle 2021 13(6): 485-502
  • URL:https://www.wjgnet.com/1948-0210/full/v13/i6/485.htm
  • DOI:https://dx.doi.org/10.4252/wjsc.v13.i6.485

Ongeveer 25 000 proteïenkoderende en 25 000 nie-koderende RNA-gene wat tot 50 000 gene in totaal bestaan, word geraam oor 'n meter lineêre DNS in die menslike genoom[1]. In onlangse jare het die dekodering van die funksie van individuele gene die hoofdoel van menslike genoomnavorsing geword. Omvattende genetiese analise was nodig om korrelasies tussen genetiese variante en menslike siektes te openbaar. Die ontwikkeling van effektiewe terapeutiese middels teen menslike genetiese siektes hang af van die begrip van die funksie van gene. Alhoewel die verband tussen genetiese veranderinge en menslike siektes al jare lank bekend is, kan die mutasies wat die opkoms van sommige siektefenotipes veroorsaak slegs deur genetiese modifikasie behandel word[2,3]. As gevolg van die kompleksiteit van die menslike genoom, was modifikasie van genetiese inligting 'n uitdaging wat tegnologies gevorderde molekulêre gereedskap vereis [4,5]. Verder bly die doeltreffende en veilige aflewering van hierdie genoomingenieursinstrumente aan geteikende weefsels van belang 'n bekommernis vir die kliniese toepassing van hierdie tegnologieë [6].

Die idee van genoommodifikasie is vir die eerste keer deur Rudin en Haber [7] in 1988 bekendgestel, waar hulle doeltreffende herstel van homotalliese skakelende endonuklease-ensiem-geaktiveerde chromosomale breuke in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) deur homoloë rekombinasie (HR). Hulle het getoon dat die doeltreffendheid van geen-teikening verhoog word via die skepping van dubbelstreng-DNS-breek (DSB's) in giste[7]. Verder is die belangrikheid van HR in die herstel van DSBs die eerste keer in soogdierselle gedemonstreer deur Jasin se navorsingsgroep[8]. Voorheen is gedink dat dodelike chromosomale DSB'e in soogdierselle herstel is deur 'n meganisme wat nie homologie met die breekplek vereis nie. Dit was nogal 'n kontras met S. cerevisiae waar die belangrikste DSB-herstelroete HR is. Om te bepaal of soogdierselle rekombinasionale herstel op 'n noemenswaardige vlak gebruik het, is die DNA-splytingsplekke vir die seldsame snyende endonuklease I-SceI vanaf S. cerevisiae is geïntegreer in die soogdier (muis) genoom. Spesifieke DSB's kon dus in die muisgenoom ingebring word by die ensiem se splitsingsplekke via 'n uitdrukkingstelsel vir die I-SceI. Die gebruik van 'n homoloë DNA het gelei tot geteikende genetiese modifikasie van soogdierselle hoofsaaklik deur HR of in 'n mindere mate via fout-geneigde nie-homologous end joining (NHEJ) meganisme. Hierdie twee studies het nie net die belangrikheid van HR in die herstel van DSB's in soogdierselle getoon nie, maar het ook die grondslag gelê vir geteikende genoommodifikasie. Tog is dit werklik 'n uitdaging om die lang DNA-bindende herkenningstreke van die meganukleases te herprogrammeer vir genomiese modifikasie. Op hierdie stadium, genoom redigering via programmeerbare nukleases vorm 'n baie doeltreffende alternatiewe benadering om enige gewenste streek in die genoom te wysig.

Gene teiken via HR is nie prakties in hoër eukariotiese selle nie as gevolg van lae doeltreffendheid, wat hul roetinegebruik belemmer. Aan die ander kant is gevind dat programmeerbare nukleases wat plekspesifieke DSB's genereer HR-doeltreffendheid met ten minste 100-voudig verhoog en/of die fout-geneigde NHEJ-meganisme geaktiveer het[9]. Na aanleiding van genoom redigering benaderings via sinkvingernukleases (ZFNs) wat vir 'n rukkie as die primêre modifikasie-opsie vir navorsers gebly het, transkripsie-aktiveerder-agtige effektor-nukleases (TALENs) is ontwikkel as nuwe instrumente vir genoomredigering, gevolg deur die ontwikkeling van 'n nuwe klas genoomredigeringsnukleases. genaamd RNA-geleide gemanipuleerde nukleases (RGENs). RGENs wat hul spesifisiteit vertoon het via klein gids-RNA's, het opwinding na die veld gebring omdat dit makliker is om geteikende nukleasestelsels te verander. Terwyl elke programmeerbare nuklease sy eksklusiewe eienskappe het, klief hulle almal die kern-DNS by spesifieke teikenplekke as 'n soortgelyke meganisme van werking, wat endogene DNA-herstelstelsels aktiveer wat lei tot geteikende genoommodifikasie. In hierdie oorsig wil ons eers die algemene kenmerke van programmeerbare nukleases beskryf en dan spesifiek fokus op RGENs vir genoommodifikasie.

In die vroeë 1990's het 'n biochemikus genaamd Srinivasan Chandrasegaran van die Johns Hopkins Universiteit bespiegel en getoon dat die tipe IIS-beperkingsensiem Fok1 twee afsonderlike proteïendomeine het, naamlik die DNA-bindende domein en die domein wat die endonuklease-aktiwiteit uitgeoefen het, wat geskei kon word. van mekaar met behulp van 'n protease, sonder om funksie te verloor[10]. Dit het die weg oopgemaak vir die idee om die Fok1-nuklease-plek met DNA-bindingsdomeine van ander proteïene te kombineer om volgorde-spesifieke nukleases te skep, soos in die generering van ZFN'e deur die Fok1-endonuklease aan sinkvingerproteïene te bind[11]. Geïnspireer deur Chandra segaran se werk, Bibikova et al[12] aan die Universiteit van Utah daarin geslaag in vivo genoom redigering vir die eerste keer in 'n lewende organisme deur die generering van pasgemaakte Drosophila mutante deur geteikende splitsing met behulp van ZFN's. Alhoewel ZFN's die nie-spesifieke splitsingsdomein van die tipe II-restrictie-endonuklease FokI as die splitsingsdomein gebruik, is dimerisering van FokI-domeine nodig vir splitsing wat 'n paar ZFN's noodsaak wat nie-palindromiese DNA-plekke teiken (Figuur 1) [13]. Boonop is gerigte evolusie gebruik om 'n FokI-stam met verbeterde splitsingsaktiwiteit te produseer[14]. Die splitsingspesifisiteit van FokI is ook verbeter deur die dimerisasie-koppelvlak te wysig deur gebruik te maak van 'n struktuur-gebaseerde ontwerp[15].

ZFN'e is baie nuttig om die genome van plante, diere en mense te manipuleer. Hulle is suksesvol gebruik om siekteveroorsakende allele in drievoudige herhalingsafwykings reg te stel, wat teenwoordig is in meer as 'n dosyn oorgeërfde neurologiese afwykings, insluitend maar nie beperk nie tot Huntington se siekte, miotoniese distrofie en verskeie spinocerebellêre ataksies [16]. Geteikende lewering van die terapeutiese gene na 'n voorafgeselekteerde chromosomale lokus kan bereik word deur gebruik te maak van plasmiede wat ZFNs kodeer via die generering van DSB'e in 'n spesifieke geen in menslike selle. Dit sal al die komplikasies wat verband hou met die virale aflewering van terapeutiese gene voorkom [17]. Verder kan pasiënte se stamselle gemodifiseer word met behulp van ZFNs ex vivo nadat hulle in kultuur uitgebrei is, kan geneties gemodifiseerde stamselle in die pasiënt teruggesit word om gedifferensieerde selle met gekorrigeerde funksies te genereer[18].

Ongelukkig is daar getoon dat baie ZFN's sitotoksiese effekte het as gevolg van nie-teiken DSB's [19]. Buite-teiken-splytingsaktiwiteit van ZFN'e word gerapporteer wanneer die sinkvingerdomeine nie spesifiek genoeg is vir hul teikenplek nie of homologie met ander onbedoelde terreine dra. Generering van buitensporige hoeveelhede DSB's kan die herstelmasjinerie oorweldig wat lei tot ewekansige integrasie van skenker-DNS en uiteindelike seldood. Om buite-teiken-splyting van 3-vinger ZFN's wat twee aangrensende 9-basispaar-terreine teiken, te verminder, word die gebruik van ZFN's met 4, 5 of 6 sinkvingers wat langer en skaars terreine teiken voorgestel [20,21]. Interessant genoeg verteenwoordig die mededinging tussen HR- en NHEJ-herstelpaaie 'n handicap vir ZFN-gemedieerde geenmodifikasies. Inaktivering van die katalitiese aktiwiteit van een ZFN-monomeer in die ZFN-dimeer lei tot die generering van sink-vinger-nickases (ZFNickases) wat getoon het om 'n vooroordeel vir HR-gemedieerde geenmodifikasie te verskaf[22]. ZFNickases beskik oor 'n verminderde spektrum van veranderinge wat nie teiken is nie as gevolg van die vermindering in NHEJ-herstelwerk. Ongelukkig was die toepassing van ZFN'e om endogene gene te manipuleer 'n uitdagende taak as gevolg van probleme om sinkvingerdomeine te genereer wat die gekose volgorde met voldoende volgorde spesifisiteit teiken.

Die oplossing vir die sitotoksisiteitsprobleem van ZFN'e het in 2009 gekom van natuurlik voorkomende transkripsiefaktore van 'n Gram-negatiewe bakteriële plantpatogeen Xanthomonas. Twee navorsingsgroepe, een gelei deur Bogdanove et al[23] by Iowa State University en die ander deur Boch en Bonas[24] by Martin Luther Universiteit, het die interaksiemeganismes tussen Xanthomonas-oorsprong van transkripsie-aktiveerder-agtige effektore (TALEs) en DNA, en dit het gelei tot die ontdekking dat hierdie proteïene ook vir genoomredigering gebruik kan word met hul eenvoudige DNA-bindende kode en relatiewe gemak van ingenieurswese. TALEs is proteïene wat deur afgeskei word Xanthomonas bakterieë by wyse van tipe III afskeidingstelsel na infeksie van plante. Die DNA-bindende domein van 'n TALE dra 'n herhalende hoogs gekonserveerde 33-34 aminosuurvolgorde met uiteenlopende 12de en 13de aminosure waarna verwys word as die herhalende veranderlike Di-residu[25]. Hierdie oorblyfsels is hoogs buigsaam en word gebruik in spesifieke nukleotiedherkenning. TALENs word gegenereer deur 'n TAL-effektor-DNA-bindende domein saam te smelt met 'n DNA-splytingsdomein Fok1, wat gemanipuleer kan word om spesifieke volgordes van DNA te splits (Figuur 1)[26]. Alhoewel ZFN'e en TALEN's dieselfde Fok1-nukleasedomein by hul C-terminale punte bevat, verskil hul DNA-bindingsplekke van mekaar (Figuur 1). Anders as sinkvingerproteïene, herken elke herhaling van TALE's 'n enkele basis.

TALENs is gebruik om menslike embrioniese stamsel (hESC) en geïnduseerde pluripotente stamsel (iPSC) klone en menslike eritroïedsellyne [27,28] doeltreffend te verander om uitklopmuise en rotte te genereer [29,30]. TALENs is ook eksperimenteel ontplooi om die genetiese foute onderliggende siektes reg te stel[31]. Die genetiese defekte wat afwykings veroorsaak soos sekelselsiekte[28,32], xeroderma pigmentosum en epidermolysis bullosa[33] was almal vatbaar vir regstelling in vitro met behulp van TALENs. Boonop kan T-selle geneties deur TALENs gemodifiseer word om weerstand teen chemoterapeutiese middels te word en antitumoraktiwiteit te vertoon [34,35].

Ongelukkig het die gebrek aan 'n doeltreffende afleweringsmeganisme, immunogenisiteit en die nie-spesifieke TALEN-binding aan onbedoelde plekke die in situ toepassing van TALENs vir die behandeling van menslike siektes[31]. Verder is die generering van die DNA-segment wat die TALE-herhalingsvolgorde bevat baie moeilik en tydrowend. Dit is tegnies baie moeilik om hierdie reekse te genereer, aangesien hulle waarskynlik met mekaar in selle sal herkombineer. Alhoewel dit nogal merkwaardig is dat TALENs minimale toksisiteit en buite-teikenaktiwiteit in menslike selle getoon het, het die opkoms van die CRISPR/Cas9-stelsel baie van die aandag van die gemeenskap na hierdie nuwe klas nukleases afgelei.

Die studies wat gelei het tot die ontdekking van gegroepeerde DNA-herhalings, het onafhanklik van drie verskillende wêrelddele gekom. Ishino et al[36] en sy kollegas van die Osaka-universiteit het per ongeluk 'n deel van 'n geklusterde gereelde interspasiërende kort palindromiese herhalings (CRISPR)-volgorde saam met hul geen van belang, die isosiemomskakeling van alkaliese fosfatase-geen, in 1987 gekloon sonder om die funksie van die onderbroke gegroepeerde herhalings te ken . In 1993, Groenen et al[37] het 'n groep onderbroke direkte herhalings (DR's) ontdek terwyl hulle aan DNS-polimorfisme in die DR-kluster van Mycobacterium tuberculosis in Nederland. Later, Mojica et al[38] aan die Universiteit van Alicante in Spanje was besig om die herhalingsreekse en hul relevante funksie in die argaeale te bestudeer Haloferax en Haloarcula spesie toe hy die transkripsie van onderbroke herhalings vir die eerste keer in 2000 waargeneem het. In 2001, terwyl hy aan moontlike bykomende onderbroke herhalings gewerk het, het Mojica en Montoliu[39] die gebruik van die akroniem CRISPR voorgestel om te verhoed dat die misverstand beperk word deur die talle afkortings wat gebruik word om die rye in die verwante literatuur te definieer. Die bewyse wat getoon het dat sommige CRISPR-spasieers afgelei is van faag-DNA en ekstrachromosomale DNA, soos plasmiede, het in 2005 van drie afsonderlike navorsingsgroepe gekom[40 - 42]. CRISPR, wat in die genome van prokariotiese organismes soos bakterieë en archaea ontdek is, is 'n familie van DNS-volgordes wat afgelei is van DNS-segmente van sekere bakteriofage wat voorheen die prokariote geïnfekteer het[43]. CRISPR-geassosieerde proteïen 9 (Cas9) is 'n ensiem wat helikase- en nuklease-motiewe manifesteer wat CRISPR-volgordes gebruik as 'n gids om spesifieke DNA-stringe te identifiseer en te sny wat aanvullend tot die CRISPR-volgorde is. CRISPR-volgordes saam met Cas9-ensieme het die grondslag gevestig van 'n nuwe tegnologie bekend as CRISPR/Cas9 wat ontplooi word om gene binne organismes te verander[44].

CRISPR/Cas-stelsels met verskillende eienskappe wat uit baie bakterieë en archaea-spesies geïdentifiseer word, kan in verskillende groepe gekategoriseer word. Klas 1-stelsels gebruik 'n kompleks van veelvuldige Cas-proteïene om die teikennukleïensure te ontwrig, terwyl die Klas 2-stelsel dieselfde funksie uitoefen via 'n enkele groot Cas-proteïen. Onder hierdie, die tipe II CRISPR/Cas9 stelsel, wat behoort aan Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) is die bekendste en mees gebruikte tegnologie soos vandag. Hierdie stelsel funksioneer as 'n immuunstelsel teen virusse of vreemde nukleïensure in bakterieë[45]. As die bakterieë met 'n faag besmet is, veroorsaak die faag-DNS wat die bakterieë binnedring die bakteriese verdedigingsmeganismes geaktiveer word. Baie Cas-proteïene word gesintetiseer vanaf die bakteriële CRISPR-lokus en neem 'n stuk (protospasieerder) van die faag-DNS in 'n onbekende meganisme, en voeg dit saam met 'n herhalende volgorde by die streek geskei deur palindromiese herhalingsvolgorde. Vervolgens vind transkripsie van die CRISPR-lokus plaas wat die pre-CRISPR RNA (crRNA), transaktivator crRNA (tracrRNA) en Cas9 ensieme bevat [46]. Die pre-crRNA word verwerk om die 20 nukleotied-lange crRNA te vorm wat aanvullend tot die virale DNA is. Baie Cas-proteïene is by hierdie proses betrokke. crRNA-tracrRNA en die Cas9-proteïen bind aan die virale DNA deur 'n kompleks te vorm. Om aan virale DNA te bind, herken Cas-ensieme spesifiek die protospacer-aangrensende motief (PAM)-volgordes wat in die teiken-DNS teenwoordig moet wees. Hierdie spesie-spesifieke gekonserveerde volgordes wat naby protospasieers geleë is, wat ooreenstem met die spasieervolgorde in CRISPR lokusse, is ontdek via rekenaarontledings. Vir die S. pyogenes Cas9 ensiem, hierdie volgorde is of "NAG" of "NGG", laasgenoemde is die mees gebruikte PAM-volgorde in pasgemaakte splitsingstelsels.

Die Cas9-ensiem bevat twee nuklease-aktiwiteitsdomeine. Dit is die HNH-domein (skep 'n breuk in die komplementêre ketting) en die RuvC-domein (skep 'n breuk in die nie-komplementêre ketting). In die teenwoordigheid van die PAM-volgorde bind die crRNA-tracrRNA-Cas9-kompleks aan die virale DNA en skep dubbelstring-breuke, en voorkom dus virale infeksie[47].

Na hierdie ontdekking is crRNA en tracrRNAs gekombineer sonder om 'n afname in Cas9-aktiwiteit te veroorsaak, dus is die chimeriese-hibriede gids-RNA (sgRNA) gevorm, wat ook deur die Nobelprys in Chemie in 2020 erken is as 'n baie betekenisvolle bevinding[48]. Genoomredigering in menslike selkulture met behulp van CRISPR/Cas9 is vir die eerste keer gelyktydig deur Hsu aangemeld et al[49], Kong et al[50] en Mali et al[51]. Later is verskeie CRISPR/Cas9 en sgRNA uitdrukkingsplasmiede gerapporteer. In hierdie nuwe stelsel kon die gewenste teikengeen met die Cas9 uitdrukkingsvektor gemodifiseer word deur 'n teikenspesifieke oligonukleotied van 20 nukleotiede lank te ontwerp en dit na die sgRNA uitdrukkingsplasmied oor te dra.

Potensiële buite-teiken-effekte van die Cas-ensieme, alhoewel die spesifisiteit daarvan onder streng beheer is van die 20 nt-gidsvolgorde en die PAM-gebied aangrensend aan die teikenvolgorde wat geklief moet word, is veral vir terapeutiese toepassings van groot belang. Strategieë om hierdie nadeel te oorkom, sluit byvoorbeeld verandering van die sgRNA-volgorde in via afkapping van die 3'-volgorde, die vermindering van die hoeveelheid van die getransfekteerde DNA, of modifikasies in die Cas9-ensiem. In hierdie konteks is 'n mutasie aan die 10de aminosuur van die Cas9-ensiem bekendgestel, wat asparaginsuur na Alanien (D10A) omskakel. Hierdie mutasie het die verlies van RuvC nuklease-aktiwiteit van die Cas9-ensiem veroorsaak en het die skepping van die nickase Cas9 (Cas9_D10A)-mutant moontlik gemaak (Figuur 2)[52].Nickase-aktiwiteit stel slegs enkelstring-DNS-breek in, wat herstel word deur 'n "basis-uitsnyding"-herstelmeganisme wat nie mutasies in die DNA-volgorde veroorsaak nie. Verder is twee verskillende gRNA's nodig om dubbelstreng-DNS-breuke met nickase Cas9[53] te skep. Aangesien dit baie onwaarskynlik is dat twee verskillende volgordes van 20 nukleotiede op dieselfde manier in die genoom bestaan, maak dit Cas9_D10A-gemedieerde DNA-modifikasies veiliger[51].

Na die nickase Cas9-proteïen, is die 'defektiewe of dooie Cas9' (dCas9) proteïen gegenereer deur mutasies in beide die HNH- en RuvC-domeine van die ensiem (onderskeidelik D10A en H840A) stil te maak, met geïnaktiveerde endonuklease-aktiwiteit wat dus slegs die spesifieke DNA behou -teikenfunksie wanneer gelei deur die sgRNA[52]. Die dCas9-proteïen word met baie verskillende proteïene saamgesmelt en word vir verskeie doeleindes soos transkripsiebeheer sowel as DNA-modifikasies gebruik (Figuur 2). Samesmelting van die Fok1-nuklease-domein met die dCas9-proteïen het buite-teiken-effekte verminder. Navorsers het dCas9 met 'n reeks tandem-herhalings (soos VP48, VP64, VP160) van die Herpes simplex virale proteïen 16 (VP16) transaktiveringsdomein saamgesmelt, tesame met sgRNA's wat ontwerp is om die boonste deel van die transkripsiebeginplek te teiken en sodoende te aktiveer transkripsie in die teikengeen (Figuur 2)[54,55]. Net so blokkeer die samesmelting van 'n transkripsie-inhiberende proteïen die teikengeen. Die beste gedefinieerde en gereelde gebruik van hierdie onderdrukkers is die Krüppel-geassosieerde boksdomein, 'n onderdrukkende chromatien-modifiseerderdomein, wat 'n 90%-99% afbreek van die teikengeen verskaf deur heterochromatienverspreiding met minimale buite-teiken-effekte [56,57] . Boonop maak die samesmelting van die dCas9 met epigenetiese ensiematiese domeine (soos p300, SID4x, PRDM9, DOT1L, Tet1) spesifieke epigenetiese veranderinge moontlik, terwyl basisredigering in spesifieke DNA-volgordes geïnisieer kan word via samesmelting van dCas9 met basis redigering ensieme (Figuur 2) [56 - 59]. Nog 'n CRISPR/Cas9-tegnologie genaamd CRISPR-genoomorganisasie bied 'n programmeerbare 3D-platform om die verband tussen die kernstruktuur en geenregulering en -funksie te bestudeer (Figuur 2)[60].

Van al die programmeerbare nukleases wat beskikbaar is met unieke eienskappe wat vir verskeie doeleindes gebruik word, word die CRISPR/Cas9-stelsel vandag as die beste keuse vir genoomredigering beskou as 'n maklik om toe te pas, koste-effektiewe en veelsydige stelsel. Boonop is effektiewe geenwysigings in menslike tripronukleêre sigote wat die CRISPR/Cas9-stelsel gebruik, die eerste keer beskryf deur Chinese wetenskaplikes Liang et al[61] in 2015. 'n Suksesvolle splitsing van mutante Beta-hemoglobien in 28 uit 54 embrio's is bereik met behulp van die CRISPR/Cas9-stelsel.

In 2015 is 'n ander tipe nuklease, Cas12a (voorheen bekend as Cpf1), van die bakterie ontdek Francisella novicida[62]. Verskeie sleutelverskille vanaf Cas9 is in Cas12a waargeneem, soos om slegs 'n crRNA te benodig vir suksesvolle teiken, staatmaak op 'n T-ryke PAM, en 'n verspringende sny in dubbelstring-DNS te veroorsaak. Hierdie kenmerke het Cas12a ideaal gemaak vir vermenigvuldigde genoomredigering. Cas12a klief ook DNA 18-23 basispare stroomaf van die PAM-plek sonder om die herkenningsvolgorde na herstel te ontwrig.

In 2016 is 'n nuwe RNA-geleide RNA-endonuklease, die nuklease Cas13a, uit die bakterie gekenmerk. Leptotrichia shahii[63]. Cas13a word deur sy crRNA na 'n ssRNA-teiken gerig en klief dan ander ssRNA-molekules sonder onderskeid. Hierdie splitsingspatroon van Cas13a genoem kollaterale splitsing is uitgebuit vir die ontwikkeling van verskeie diagnostiese tegnologieë [64 - 66].

Nietemin, die CRISPR/Cas9-stelsel, wat as 'n bakteriële verdedigingstelsel in die natuur funksioneer, is in baie gebiede van biotegnologie ontplooi as een van die mees onlangse geenmodifikasiemetodes vandag[67].

Die meganismes van beta-selfunksie in gesondheids- en siektetoestande kan eksperimenteel ontleed word met behulp van CRISPR/Cas9-tegnologie via manipulasie van die genoom in pankreas beta-selle [68,69]. Boonop is die generering van nuwe geneties gemodifiseerde diermodelle vir die toetsing van beta-selfunksie nou haalbaar met behulp van CRISPR/Cas9 tegnologie. Verlies van pankreas eilandjies is een van die noodsaaklike onderliggende oorsake van diabetes[70]. As 'n oplossing vir hierdie probleem, is drie verskillende strategieë aangewend vir die herstel van pankreas beta-selle oor die jare. Hierdie drie benaderings is stimulering van die proliferasie van bestaande beta-selle, herprogrammering van verskeie tipes selle in beta-selle, en die indusering van differensiasie van beta-selle vanaf PSC's. Pankreas-eiland-sel proliferasie kan ook geïnduseer word in vivo gebruik van geenterapie-benaderings soos voorheen getoon [71 - 73]. In hierdie konteks van die gebruik van pluripotente stamselle, het pankreas-beta-sel-agtige insulien-produserende selle (IPC's) gedifferensieer van ESC's, wat die eerste keer geïsoleer is van menslike embrio's in 1989 en iPSC's, wat eers verkry is deur herprogrammering van gedifferensieerde selle, opwinding geskep as nuwe potensiële bronne van beta-selle[74 - 76]. Etiese bekommernisse, sowel as die noodsaaklikheid van immuunonderdrukking, het na vore gekom in studies/potensiële behandelingsbenaderings wat verband hou met ESC's gelei studies in hierdie veld fokus meestal op iPSC-gemedieerde benaderings. Behalwe om etiese bekommernisse uit te skakel, fasiliteer hierdie benadering ook siektemodellering, geneesmiddelontwikkeling en begrip van die patogenese van diabetes, wat die weg baan vir die ontwikkeling van nuwe generasie behandelingstrategieë. Programmeerbare nukleases (ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9) het ons gehelp om die ontwikkeling, regenerasie, insulienproduksie en afskeidingspatrone van pankreas beta-selle in alle aspekte te verstaan.

CRISPR/Cas9-stelsel het spesie-spesifieke verskille in geenfunksie geopenbaar. Byvoorbeeld, McGrath et al[77] het getoon dat die gebrek aan Neurogenin3 (NEUROG3), 'n basiese heliks-lus-heliks-transkripsiefaktor wat noodsaaklik is vir endokriene pankreasvorming by muise, nie die groei van die menslike endokriene pankreas inmeng nie. hESC-lyne wat NEUROG3-uitklopmutasies dra, het endoderm en pankreas-voorlopers doeltreffend gevorm, maar nie die endokriene selle nie in vitro. Verder, 'n 75% – 90% knou van NEUROG3 uitdrukking via lentivirus-gemedieerde korthaarnaald-RNA-benadering het net die pankreas-endokriene selontwikkeling verminder, maar nie verhoed nie, wat daarop dui dat hoewel NEUROG3 fundamenteel is vir menslike endokriene pankreasontwikkeling, baie min hoeveelhede voldoende is vir pankreas-endokriene selvorming.

Daar is getoon dat STAT3 die aktivering van Neurog3 in acinêre selle bemiddel wat hulle herprogrammeer in beta-selle in diabetiese muismodelle [78]. Boonop is aktivering van kiemlynmutasies in STAT3 onlangs gerapporteer as 'n oorsaak van neonatale diabetes mellitus wat verband hou met beta-sel outo-immuniteit [79]. Die ondersoek van die aktiverende mutasie, STAT3 K392R , op pankreas ontwikkeling deur gebruik te maak van iPSCs afkomstig van 'n pasiënt met neonatale diabetes en pankreas hipoplasie het voorgestel dat die STAT3 K392R mutasie voortydige endokriene differensiasie veroorsaak het deur direkte induksie van NEUROG3 uitdrukking. Gelukkig is die siekte fenotipe heeltemal omgekeer met behulp van CRISPR/Cas9 tegnologie om STAT3 mutasie reg te stel.

'n Doeltreffende genoomredigeringsplatform in menslike PSC's (hPSC's) (iCRISPR) is onlangs gevestig deur die gebruik van TALEN's en die CRISPR/Cas-stelsel[80]. Hierdie benadering het die krag van genoomredigering en stamselbiologie gekombineer om transkripsiebeheer van pankreasontwikkeling en die ontwikkelingsdefekte wat verband hou met permanente neonatale diabetes mellitus metodies te manipuleer [81]. In hierdie studie het Zhu et al[82] het agt van die transkripsiefaktore stilgemaak (PDX1, RFX6, PTF1A, GLIS3, MNX1, NGN3, HES1 en ARX) wat effektief is in beta-selontwikkeling in hESC's met behulp van CRISPR/Cas9 en TALEN's. Benewens die definisie van die spesifieke ontwikkelingstappe wat deur hierdie mutasies geraak word, het hierdie benadering nuwe insigte in siektemeganismes ontbloot, rakende die rol van RFX6 in die beheer van die aantal pankreasvoorlopers, 'n voorvereiste vir PDX1 in pankreas endokriene ontwikkeling, en 'n potensieel verskillende rol van NGN3 in mense en muise. Die ontplooiing van programmeerbare nukleases het die identifisering moontlik gemaak van transkripsiefaktore wat pankreasontwikkeling reguleer, wat hPSC-gebaseerde beta-selvervangingsterapieë vir die behandeling van diabetes bevorder het. Alhoewel eksperimentele diermodelle nodig is vir die voortplanting van menslike siektes, kan genetiese en metaboliese verskille tussen die spesies soms veroorsaak dat nie die menslike siekte behoorlik naboots nie, wat die ontwikkeling van 'n doeltreffende behandeling verhoed.

Die CRISPR/Cas9-stelsel het ook aansienlik bygedra tot die evaluering van die resultate wat van genoomwye assosiasiestudies (GWAS) ingesamel is. Alhoewel 'n groot aantal gene wat met tipe 2-diabetes (T2D) geassosieer word, geïdentifiseer is wat enkelnukleotiedpolimorfismes bevat, bevat invoegings, delesies en kopiegetalvariasies in GWAS-studies, wat die verband maak tussen die patofisiologie van die siekte en enige moontlike gebruik van die inligting in dwelmontdekking is uitdagend[83 - 86]. Gebruik CRISPR/Cas9, Zeng et al[87] het drie gene (CDKAL1, KCN111, KCNQ1) stilgemaak in hESC-afgeleide glukose-responsiewe selle, wat deur GWAS-studies as vatbaarheidsgene vir T2D geïdentifiseer is, en waargeneem dat hoewel die stilswye van hierdie gene nie die generering van insulien+ beïnvloed het nie. selle, is geen verandering in die beta-sel differensiasie potensiaal opgespoor nie. Insulien+ beta-selle was egter hipersensitief vir glukolipotoksisiteit in die afwesigheid van die CDKAL1 geenuitdrukking. Hierdie voorlopige studies het getoon dat funksionele eienskappe van geen lokusse geïdentifiseer deur GWAS met moontlike rolle in die patogenese van siektes beter geassesseer kan word deur die gebruik van CRISPR/Cas9 tegnologie.

Aangesien geïsoleerde menslike eilandjies skaars en waardevolle materiale vir diabetesnavorsing is, verteenwoordig hPSC's 'n goeie alternatief vir pankreas-eilandselskenkers. iPSC's kan uit volwasse somatiese selle gevestig word via direkte herprogrammering en gedifferensieer in beta-selagtige insulienproduserende selle [88]. Alhoewel volle rypwording van hierdie selle in IPC's wat insulien afskei in reaksie op veranderinge in bloedglukosekonsentrasie nie maklik bereik kan word nie, kan hierdie benadering gebruik word om ontwikkelingsdefekte van genetiese siektes soos diabetes te modelleer [68]. Genoomredigering bemiddel deur CRISPR/Cas9-tegnologie bied sterk geleenthede om die effekte van spesifieke genotipes te ondersoek en om siektemodelle te ontwikkel met genetiese veranderinge wat diabetiese sindrome veroorsaak, en waarskynlik die moontlikhede vir die bestudering van beta-selfisiologie vinnig sal verhoog [89].

Tipe 1-diabetes (T1D) is die gevolg van die vernietiging van die pankreas beta-selle deur die outo-immuunstelsel as gevolg van die verswakking van veelvuldige immuunverdraagsaamheidsmeganismes [90]. T1D in mense word sterk geassosieer met 'n allele variant van proteïen tyrosine fosfatase niereseptor tipe 22 (PTPN22), PTPN22 R620W, waarvan die bestaan ​​die risiko van diabetes met twee- tot viervoudig verhoog[91]. Aangesien die NOD-muis 'n spontane T1D-model is wat baie diabetesverwante genetiese weë met mense deel, is verwag dat die bekendstelling van die muriene ortoloë PTPN R619W-mutasie aan die NOD-genoom die spontane ontwikkeling van T1D sou verbeter. Mikro-inspuiting van CRISPR/Cas9 en 'n homologie-gerigte herstel sjabloon in NOD enkelsel sigote het gelei tot muise met PTPN R619W mutasie wat verhoogde insulien outo-teenliggaampies en vroeër aanvang en hoër penetrasie van T1D [92] toon.

Leptienreseptor (Lepr) funksioneer as 'n reseptor vir die vetselspesifieke hormoon leptien (ob), wat energiehomeostase reguleer, die balans tussen voedselinname en energieverbruik [93]. Die Lepr-defekte muise (db/db) is tans die mees gebruikte muismodel van T2D, wat ernstige vetsug, hiperfagie, polydipsie en poliurie vertoon [94]. Die rotekwivalent van die db/db-muis is die Zucker-rot (fa/fa), wat 'n spontane outosomale mutasie in die Lepr-geen het en 'n vergelykbare fenotipe van hiperfagie toon wat lei tot glukose-intoleransie, insulienweerstandigheid en morbiede vetsug [95] . Interessant genoeg toon die Zucker-rot nie hiperglukemie nie. Om dit op te los, is die Lepr-uitkloprotte gegenereer met behulp van die CRISPR/Cas9-stelsel [96]. Hierdie Lepr CRISPR/Cas9 uitkloprotte het al die diabetesverwante fenotipes uitgestal wat diermodelle uitbrei vir biomediese en farmakologiese navorsing oor vetsug en T2D. Boonop is sommige probleme waargeneem in leptienreseptor-tekorte db/db muis- en Zucker-rotdiermodelle met betrekking tot aanhoudende hiperglukemie en laat voorkoms van glukose-intoleransie met behulp van CRISPR/Cas9-gegenereerde Lepr-uitkloprotte.

Alhoewel knaagdiermodelle nuttig is om diabetes te bestudeer, is die gebruik van diermodelle metabolies nader aan mense 'n meer effektiewe manier om die ontwikkeling en patogenese van menslike siektes te verstaan ​​deur die CRISPR/Cas9-stelsel te gebruik. Ten spyte van diabetesnavorsing kan baat by die gebruik van varke as 'n model as gevolg van die deel van soortgelyke fisiologie en metaboliese weë met mense, verteenwoordig die skaarsheid van varkmodelle wat diabetes simptome toon 'n duidelike handicap. Vir hierdie doel het Cho et al[97] het eers die insuliengeen in somatiese selle gewysig deur die CRISPR/Cas9-stelsel te gebruik. Dan het somatiese selkernoordrag wat die gemodifiseerde insuliengeen dra, gelei tot die generering van varkembrio's met insulien (INS) uitklopfenotipe. INS uitklopvarkies het hiperglukemie en glukosurie gemanifesteer wat die doeltreffendheid van CRISPR/Cas9-gemedieerde generasie van nuwe varkmodelle demonstreer, wat meer geskik kan wees vir geneesmiddelontwikkeling en eilandoorplantingsstudies in vergelyking met knaagdiere.

Die CRISPR/Cas9-stelsel kan ook 'n effektiewe manier wees om siektemodelle van monogene diabetes te ontwikkel, soos Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) wat verwys na enige van die verskeie oorerflike vorme van diabetes mellitus wat veroorsaak word deur mutasies wat insulienproduksie onderbreek [98] . Ten spyte van MODY is 'n outosomale dominante siekte, wat slegs een abnormale geen vereis om die siekte simptome te manifesteer, die erns van die siekte word gereguleer deur die teenwoordigheid van 'n tweede alleel. Terwyl MODY 2 en MODY 3 die algemeenste vorme is, veroorsaak mutasies in die insuliengeen MODY10, wat dikwels met T2D verwar word as gevolg van die ooreenkomste in die kliniese simptome [99]. Alhoewel die verloop van die siekte sag is, benodig mense met hierdie genetiese afwyking insuliengebruik in die volgende jare. Sulke enkelgeenafwykings, wat nie met huidige behandelingsmetodes behandel kan word nie, kan effektief met geenterapie behandel word. Hier kan lentivirus-gemedieerde insulien geenterapie 'n permanente oplossing wees vir MODY10 behandeling soos voorheen getoon vir T1D [72,100].

Alhoewel 'n sekere vermindering in die pankreas-beta-selmassa bereik word in streptozotocin (STZ)-geïnduseerde eksperimentele diabetiese diermodelle, kan beta-selle wat lewendig bly en in staat is om insulien te sintetiseer en af ​​te skei, inmeng met die toetsing van insulien geenterapie-strategieë. Om die doeltreffendheid van insulien geenterapie-vektore ten volle te toets, is pankreas beta-selle nodig wat nie insulien sintetiseer nie. Aangesien hierdie selle nie kommersieel beskikbaar is nie, bied CRISPR/Cas9-stelsel 'n geskikte metode om pankreas beta-selle sonder insuliensintese te genereer. Die insuliengeen kan op die DNS-vlak stilgemaak word met behulp van die CRISPR/Cas9 deur spesifieke gids-RNA's te gebruik wat die insuliengeen teiken. Aangesien hierdie selle alle beta-sel eienskappe sal hê behalwe vir insuliensintese, sal dit 'n geskikte model vir beide wees ex vivo en in vivo toetsing van die doeltreffendheid van insulien geenoordragvektore. Om hierdie model te skep, word pankreas beta-selle getransfekteer met 'n stilmaakplasmied wat kodeer vir die CRISPR Cas9-proteïen, spesifieke gids-RNA en 'n HR-plasmied wat die homoloë streke met die insuliengeen bevat (Figuur 3). In hierdie strategie skep die stilmaakplasmied 'n dubbelstring-breuk in die insuliengeen, terwyl die HR-plasmied 'n antibiotikaweerstandsgeen lewer om suksesvolle transformante selektief te suiwer, en 'n fluoresserende proteïenkoderende geen (bv. RFP) om suksesvolle herkombinasie te bevestig in die streek waar die DSB voorkom. Dus, 'n pankreas beta-sellyn word gegenereer met stabiele fluoresserende proteïen uitdrukking, wat visueel ondersoek kan word onder 'n fluoresserende mikroskoop na transfeksie. Hierdie selle kan gesuiwer word deur vloeisitometrie as gevolg van die stabiele fluoresserende proteïenuitdrukking wat hulle bevat, of deur antibiotika seleksie met die oorgedra antibiotika weerstand geen (Figuur 3). Dan word die selle gekloon deur die beperkte verdunningsmetode te gebruik. Laastens kan die insulienafskeidingstatus van enkelselkolonies bevestig word deur insulien ELISA, deur western klad of immunositochemie metodes. Na bevestiging kan die insuliengeen afgelewer word in situ deur geenterapie-vektore om te bepaal of insulienafskeiding herstel word na die transduksie van INS uitkloppankreas beta-selle. Dan kan INS-uitklop-beta-selle wat deur CRISPR/Cas9-tegnologie met of sonder insuliengeenlewering gegenereer word onder die nierkapsule van STZ-geïnduseerde diabetiese diere oorgeplant word (Figuur 4). Deur dit te doen, kan 'n pankreas beta-sellyn wat 'n gebrek aan insulien geen sintese het, gegenereer word en kan dit gebruik word vir in vivo toetsing van die doeltreffendheid van insulien geenterapie-vektore.

Samevattend, die CRISPR/Cas9-stelsel is 'n unieke tegnologie wat 'n baie kragtige en veelsydige platform bied vir genoomredigering, met gemak van ontwerp en implementering, hoë doeltreffendheid en lae koste[67]. Beskryf as 'n spelwisselaar in genetiese ingenieurswese, is een van die hoofdoele van die gebruik van die CRISPR/Cas9-tegnologie om geskikte modelle vir dwelmtoetsing te ontwikkel en om die molekulêre en fisiologiese meganismes onderliggend aan die ontwikkeling van menslike siektes te verstaan[18]. Onder die siektes waarvoor suksesvolle selgebaseerde CRISPR/Cas9-gemedieerde siektemodelle gegenereer is, is sistiese fibrose, Barth-sindroom, β-talassemie, Duchenne-spierdistrofie en hemofilie A[101 - 106]. Muismodelle vir tyrosinemie en longkanker, en rot- en primaatmodelle vir spierdistrofie is ook suksesvol geskep met die CRISPR/Cas9-tegnologie, met nog vele meer waaraan gewerk word en ontwikkel moet word[107 - 110]. As 'n bykomende benadering, soos beskryf in hierdie publikasie, 'n nuwe in vivo diabetessiektemodel kan ontwikkel word deur allogeniese oordrag van 'n INS uitkloppankreas beta-sellyn wat geskep word deur CRISPR/Cas9 tegnologie onder die nierkapsule van STZ-geïnduseerde diabetiese diere. Om die terapeutiese doeltreffendheid van insuliengeenterapie te bepaal, moet dieselfde prosedure herhaal word met insulien-tekorte pankreas beta-selle eers na die insuliengeen aflewering. Met die huidige vooruitgang in die kragtige CRISPR/Cas9-tegnologie, is daar 'n beter kans om die uitdaging te oorkom om die mees akkurate, spesifieke en voorspellende siektemodelle te genereer en te implementeer om 'n beter begrip en behandeling van menslike siektes te bied.

Manuskripbron: Genooide manuskrip

Ooreenstemmende outeur se lidmaatskap in professionele verenigings: American Society of Gene and Sel Therapy en European Society of Gene and Sel Therapy

Spesialiteitstipe: Medisyne, navorsing en eksperimenteel

Land/Gebied van oorsprong: Turkye

Portuurbeoordelingsverslag se wetenskaplike kwaliteitklassifikasie

P-resensent: Duan W, Kurniawan A S-redakteur: Liu M L-redakteur: A P-redakteur: Xing YX


Opsomming

Die veld van sintetiese biologie ontwikkel teen 'n vinnige pas. Dit vorder verby enkelgeenveranderings in enkelgashere tot die logiese ontwerp van komplekse stroombane en die ontwikkeling van geïntegreerde sintetiese genome. Onlangse deurbrake in diep leer, wat toenemend gebruik word in De novo samestelling van DNA-komponente met voorspelbare effekte, help ook die dissipline. Ten spyte van vooruitgang in rekenaar, is die veld steeds afhanklik van die beskikbaarheid van voorafgekarakteriseerde DNA-dele, hetsy natuurlik of sinteties, om geenuitdrukking in bakterieë te reguleer en waardevolle verbindings te maak. In hierdie oorsig bespreek ons ​​die verskillende bakteriese sintetiese biologie-metodologieë wat gebruik word in die skepping van 5'-regulerende streke - promotors, onvertaalde streke en 5'-einde van koderingsreekse. Ons som metodologieë op en bespreek die betekenis daarvan vir elk van die funksionele DNS-komponente, en beklemtoon die sleutelvooruitgang wat in bakteriese ingenieurswese gemaak is deur op hul gebreke en sterkpunte te konsentreer. Ons eindig die hersiening deur die kwessies wat die dissipline in die nabye toekoms in die gesig staar, uiteen te sit.


Jongste REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. Patente:

Hierdie aansoek is 'n voortsetting van die Amerikaanse patentaansoek Ser. No. 16/575,506, ingedien op 19 September 2019, wat 'n voortsetting is van die Amerikaanse patentaansoek Ser. No. 15/783,525, ingedien op 13 Oktober 2017, nou laat vaar, wat 'n voortsetting is van die Amerikaanse patentaansoek Ser. No. 14/919,300, ingedien op 21 Oktober 2015, nou U.S. Pat. No. 9,816,110, wat aanspraak maak op die voordeel van prioriteit van die Amerikaanse voorlopige aansoek nr. 62/067,774 wat op 23 Oktober 2014 ingedien is, waarvan die hele inhoud deur verwysing hierin ingesluit is.

INKORPORASIE PER VERWYSING VAN VOLGORDELYS

Die volgordelys in 'n ASCII-tekslêer, genaamd 32353_T0045US01_SequenceListing.txt van 28 KB, geskep op 20 Oktober 2015, en ingedien by die Verenigde State se Patent- en Handelsmerkkantoor via EFS-Web, word hierin ingesluit deur verwysing.

AGTERGROND Gebied van die uitvinding

Die uitvinding maak voorsiening vir stabiele integrasie en/of uitdrukking van rekombinante proteïene in eukariotiese selle. Die uitvinding sluit veral metodes en samestellings in vir verbeterde uitdrukking van proteïene in eukariotiese selle, veral Chinese hamster (Cricetulus griseus) sellyne, deur uitdrukkingsversterkende nukleotiedvolgordes te gebruik. Die uitvinding sluit polinukleotiede en gemodifiseerde selle in wat rekombinasie-gemedieerde kassetuitruiling (RMCE) fasiliteer. Die metodes van die uitvinding integreer eksogene nukleïensure by spesifieke chromosomale lokusse in die Chinese hamster sellulêre genoom ten einde verbeterde en stabiele uitdrukking van rekombinante proteïene deur die gemodifiseerde selle te fasiliteer.

Beskrywing van Verwante Kuns

Sellulêre uitdrukkingstelsels het ten doel om 'n betroubare en doeltreffende bron te verskaf vir die vervaardiging van 'n gegewe proteïen, hetsy vir navorsing of terapeutiese gebruik. Rekombinante proteïenuitdrukking in soogdierselle is 'n voorkeurmetode vir die vervaardiging van terapeutiese proteïene as gevolg van, byvoorbeeld, die vermoë van soogdieruitdrukkingstelsels om rekombinante proteïene toepaslik post-translasie te modifiseer.

Verskeie sellulêre sisteme is beskikbaar vir uitdrukking van proteïene, wat elk verskeie kombinasies van cis- en, in sommige gevalle, trans-regulatoriese elemente bevat om hoë vlakke van rekombinante proteïen met kort inkubasietye te bereik. Ten spyte van die beskikbaarheid van talle sisteme, bestaan ​​die uitdaging van doeltreffende geenoordrag en stabiliteit van die geïntegreerde geen vir uitdrukking van 'n rekombinante proteïen steeds. Veelvuldige plaaslike genetiese faktore sal nie net bepaal wanneer die teikengeen van belang uitgedruk moet word nie, maar of die sel die transkripsie van die geen funksioneel na 'n produktiewe uitset kan dryf, en of die uitdrukking selfs langtermyn volgehou sal word. Chromosomale integrasieterreine, bv. Chinese hamster-ovariumsel (CHO)-integrasieplekke en lokusbeheerstreke binne of aangrensend aan spesifieke gene is in die kuns gekarakteriseer (WO2012/138887A1 U, Q. et al., 2002 Bloed. 100:3077-3086). As sodanig word geteikende regulatoriese streke tipies geïdentifiseer in 'n streek wat vir endogene proteïene kodeer. Vir langtermyn uitdrukking van 'n teiken transgeen, is 'n sleuteloorweging egter minimale ontwrigting van sellulêre gene om veranderinge in die fenotipe van die sellyn te vermy.

Ingenieursstabiele sellyne om addisionele gene vir uitdrukking te akkommodeer, soos bykomende teenliggaampettings soos in multispesifieke teenliggaampies, is besonder uitdagend. Wye variasies in uitdrukkingsvlakke van geïntegreerde gene kan voorkom. Die integrasie van bykomende gene kan lei tot groter variasie in uitdrukking en onstabiliteit as gevolg van die plaaslike genetiese omgewing (d.w.s. posisie-effekte). Gevolglik is daar 'n behoefte in die kuns aan verbeterde soogdieruitdrukkingstelsels.

KORT OPSOMMING

In een aspek verskaf die uitvinding 'n sel wat 'n eksogene nukleïensuurvolgorde bevat wat by 'n spesifieke plek binne 'n lokus geïntegreer is, waarin die lokus 'n nukleotiedvolgorde bevat wat ten minste 90% identies is aan SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO: 4 In sommige belichamings bestaan ​​die lokus uit 'n nukleotiedvolgorde wat ten minste 90% identies is aan SEQ ID NO:1. In sommige belichamings bestaan ​​die lokus uit 'n nukleotiedvolgorde wat ten minste 90% identies is aan SEQ ID NO:4.

In 'n ander aspek verskaf die uitvinding 'n polinukleotied wat 'n eerste nukleïensuurvolgorde bevat wat geïntegreer is in 'n spesifieke plek binne 'n tweede nukleïensuurvolgorde (bv. 'n lokus van die uitvinding). In een belichaming bestaan ​​die tweede nukleïensuurvolgorde uit die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1. In 'n ander belichaming bestaan ​​die tweede nukleïensuurvolgorde uit die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:4.

In een belichaming is die tweede nukleïensuurvolgorde 'n uitdrukking-verbeterende volgorde gekies uit 'n nukleotiedvolgorde met ten minste 90% nukleïensuuridentiteit met SEQ ID NO:1, of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan. In een belichaming is die tweede nukleïensuurvolgorde 'n uitdrukking-verbeterende volgorde gekies uit 'n nukleotiedvolgorde met ten minste 90% nukleïensuuridentiteit met SEQ ID NO:4, of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan. In 'n ander belichaming is die uitdrukking-verbeterende volgorde in staat om uitdrukking van 'n proteïen wat deur 'n eksogene nukleïensuurvolgorde gekodeer word, te verbeter. In 'n ander belichaming is die uitdrukking-verbeterende volgorde in staat om uitdrukking van 'n proteïen wat deur 'n eksogene nukleïensuurvolgorde gekodeer word, te verbeter ten minste ongeveer 1,5-voudige tot ten minste ongeveer 3-voudige verbetering in uitdrukking in vergelyking met uitdrukking wat tipies waargeneem word deur ewekansige integrasie in 'n genoom.

In 'n ander belichaming word die eksogene nukleïensuurvolgorde geïntegreer in 'n spesifieke plek op enige posisie binne SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4.

In sommige belichamings word die spesifieke plek by 'n posisie binne SEQ ID NO:1 of aangrensend aan 'n posisie binne SEQ ID NO:1 gekies uit die groep bestaande uit nukleotiede wat oor posisies nommer 10-4,000 100-3,900 200-3,800 300-3,700 400-3,600 500-3,500 600-3,400 700-3,300 800-3,200 900-3,100 1,000-3,000 1,100-2,900 1,200-2,800 1,300-2,700 1,200-2,600 1,300-2,500 1,400-2,400 1,500-2,300 1,600-2,200 1,700-2100 1,800- 2050 1850-2050, 1,900-2040 1950-2,025, 1990-2021, 2002-2021 en 2,010-2,015 van SEQ ID NO:1. In sekere belichamings word die spesifieke perseel by 'n posisie binne SEQ ID NO:1 of aangrensend aan 'n posisie binne SEQ ID NO:1 gekies uit die groep wat bestaan ​​uit nukleotiede wat oor posisies nommer 1990-1991, 1991-1992, 1992-1993, 1993-1994, 1995-1996, 1996-1997, 1997-1998, 1999-2000, 2001-2002, 2002-2003; 2009, 2009-2010, 2010-2011, 2011-2012, 2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016; van SEQ ID NO:1.

In 'n ander belichaming word die spesifieke terrein by 'n posisie binne SEQ ID NO:1 of aangrensend aan 'n posisie binne SEQ ID NO: gekies uit die groep wat bestaan ​​uit nukleotiede wat oor posisies nommer 10-500 500-1,000 500-2,100 1,000-1,500 1,000 -2 100 1 500-2 000 1 500-2 500 2 000-2 500 2 500-3 000 2 500-3 500 3 000-3 500 3 000-4 000 en 4, 500 van SEQ NO: In sekere belichamings word die eksogene nukleïensuurvolgorde geïntegreer by, binne of naby enige een of meer van die spesifieke plekke hierbo beskryf.

In 'n ander belichaming bestaan ​​die eksogene nukleïensuurvolgorde uit 'n herkenningsplek wat binne 'n uitdrukking-verbeterende volgorde geposisioneer is soos hierbo beskryf, met dien verstande dat die uitdrukking-verbeterende volgorde 'n volgorde bevat wat ten minste ongeveer 90% identies is, ten minste ongeveer 91% identies, ten minste ongeveer 92% identies, ten minste ongeveer 93% identies, ten minste ongeveer 94% identies, ten minste ongeveer 95% identies, ten minste ongeveer 96% identies, ten minste ongeveer 97% identies, ten minste ongeveer 98% identies, of ten minste ongeveer 99% identies aan die uitdrukking-verbeterende volgorde van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4, 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan.

In een belichaming bestaan ​​die eksogene nukleïensuurvolgorde uit 'n rekombinase-herkenningsplek. In sommige belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuurvolgorde verder uit ten minste een rekombinase-herkenningsplek wat bestaan ​​uit 'n volgorde wat onafhanklik gekies is uit 'n LoxP-plek, 'n Lox511-plek, 'n Lox2272-plek, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, Lox66 en 'n LoxFas-plek . In een belichaming is die rekombinase-herkenningsplek binne die uitdrukking-verbeterende volgorde geïntegreer. In 'n ander belichaming is die rekombinase-herkenningsplek onmiddellik aangrensend in die 5'-rigting aan die terminale nukleotied van die 5'-kant van 'n geenkasset, of onmiddellik aangrensend in die 3'-rigting aan die terminale nukleotied van die 3'-kant van 'n geen kasset. In sommige belichamings is die ten minste een rekombinase-herkenningsplek en geenkasset geïntegreer binne die uitdrukking-verbeterende volgorde.

In een belichaming is ten minste twee rekombinase-herkenningsplekke teenwoordig binne die uitdrukking-verbeterende volgorde. In 'n ander belichaming word twee rekombinase-herkenningsplekke van teenoorgestelde oriëntasie binne die uitdrukking-verbeterende volgorde geïntegreer. In 'n ander belichaming is drie rekombinase-herkenningsplekke binne die uitdrukking-verbeterende volgorde geïntegreer.

In een aspek word 'n geïsoleerde Chinese hamster-ovarium (CHO) sel voorsien wat 'n gemanipuleerde uitdrukking-verbeterende volgorde van SEQ ID NO:1 of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan bevat. In een belichaming is die uitdrukking-verbeterende volgorde wat die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4, of 'n stabiele variant daarvan, gemanipuleer om 'n eksogene nukleïensuurvolgorde te integreer soos hierbo beskryf. In ander belichamings verskaf die uitvinding 'n geïsoleerde CHO-sel wat 'n eksogene nukleïensuurvolgorde bevat wat in 'n lokus ingevoeg is wat 'n uitdrukking-verbeterende volgorde van SEQ ID NO:1, of SEQ ID NO:4, of 'n stabiele variant daarvan bevat.

In een belichaming bevat die CHO-sel verder ten minste een rekombinase-herkenningsvolgorde binne die uitdrukking-verbeterende volgorde. In 'n ander belichaming word die ten minste een rekombinase-herkenningsvolgorde onafhanklik gekies uit 'n LoxP-plek, 'n Lox511-plek, 'n Lox2272-plek, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, Lox66 LoxFas en 'n frt-plek. In 'n ander belichaming is die rekombinase-herkenningsplek onmiddellik aangrensend in die 5'-rigting aan die terminale nukleotied van die 5'-kant van 'n geenkasset, of onmiddellik aangrensend in die 3'-rigting aan die terminale nukleotied van die 3'-kant van 'n geen kasset. In sommige belichamings is die ten minste een rekombinase-herkenningsplek en geenkasset geïntegreer binne die uitdrukking-verbeterende volgorde van die CHO-selgenoom wat hierin beskryf word.

In 'n ander belichaming is die ten minste een rekombinasie-herkenningsplek geposisioneer soos hierbo beskryf, met die voorbehoud dat die geenkasset 'n uitdrukking-verbeterende volgorde bevat wat ten minste 90% identiteit, ten minste ongeveer 91% identiteit, ten minste ongeveer 92% identiteit bevat , ten minste ongeveer 93% identiteit, ten minste ongeveer 94% identiteit, ten minste ongeveer 95% identiteit, ten minste ongeveer 96% identiteit, ten minste ongeveer 97% identiteit, ten minste ongeveer 98% identiteit, of ten minste ongeveer 99% identiteit na nukleotiede 1001 tot 2001 van SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:2) of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan. In 'n ander belichaming is die ten minste een rekombinasie-herkenningsplek geposisioneer soos hierbo beskryf, met die voorbehoud dat die geenkasset 'n uitdrukking-verbeterende volgorde bevat wat ten minste 90% identiteit, ten minste ongeveer 91% identiteit, ten minste ongeveer 92% identiteit bevat , ten minste ongeveer 93% identiteit, ten minste ongeveer 94% identiteit, ten minste ongeveer 95% identiteit, ten minste ongeveer 96% identiteit, ten minste ongeveer 97% identiteit, ten minste ongeveer 98% identiteit, of ten minste ongeveer 99% identiteit na nukleotiede 2022 tot 3022 van SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:3) of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan.

In nog 'n ander belichaming word die ten minste een rekombinase-herkenningsplek in die CHO-selgenoom by of binne nukleotiede 1990-1991, 1991-1992, 1992-1993, 1993-1994, 1995-1996, 996, 1996, -1996, -1996, 9 , 1999-2000, 2001-2002, 2002-2003, 2003-2004, 2004-2005, 2005-2006, 2006-2007, 2007-2008, 2008-102, 2008-102, 2008-102, 2008-201 -2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016, 2016-2017, 2017-2018, 2018-2019, 2019-2020, 2020-2020, 2020-2011 of 2- ID NO: 2022

In 'n ander belichaming word die eksogene nukleïensuur in die CHO-genoom by of binne nukleotiede 1990-1991, 1991-1992, 1992-1993, 1993-1994, 1995-1996, 1996-19, 1996-19, 1996-19, 1996-199, 1996-19, 1996-199 2001-2002, 2002-2003, 2003-2004, 2004-2005, 2005-2006; 2014, 2014-2015, 2015-2016, 2016-2017, 2017-2018, 2018-2019, 2019-2020, 2020-2021 of 2021-2022 van SEQ ID NO:.

In 'n ander belichaming word die eksogene nukleïensuur in die CHO-genoom by of binne nukleotiede 2001-2022 van SEQ ID NO:1 ingevoeg. In sommige belichamings word die eksogene nukleïensuur by of binne nukleotiede 2001-2002 of nukleotiede 2021-2022 van SEQ ID NO:1 ingevoeg en nukleotiede 2002-2021 van SEQ ID NO:1 word geskrap, as gevolg van die invoeging. Net so word die eksogene nukleïensuur in die CHO-genoom by of binne nukleotiede 9302-9321 van SEQ ID NO:4 ingevoeg. In sommige belichamings word die eksogene nukleïensuur by of binne nukleotiede 9301-9302 of nukleotiede 9321-9322 van SEQ ID NO:4 ingevoeg en nukleotiede 9302-9321 van SEQ ID NO:4 word geskrap, as gevolg van die invoeging.

In sommige belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuurvolgorde geïntegreer by 'n spesifieke plek binne 'n lokus, soos die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4, uit 'n geen van belang (GOI) (bv. 'n nukleotiedvolgorde enkodeer 'n proteïen van belang of "P"). In sekere belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuurvolgorde uit een of meer gene van belang. In sommige belichamings word die een of meer gene van belang gekies uit die groep wat bestaan ​​uit 'n eerste GOI, 'n tweede GOI en 'n derde GOI.

In sommige belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuurvolgorde geïntegreer by 'n spesifieke plek binne 'n lokus, soos die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4, 'n GOI en ten minste een rekombinase-herkenningsplek. In een belichaming word 'n eerste GOI binne die uitdrukking-verbeterende volgorde van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 ingevoeg, of die uitdrukking-verbeterende volgorde wat ten minste 90% nukleotiedidentiteit met SEQ ID NO:1 of SEQ ID het NO:4, of die uitdrukking-verbeterende fragment daarvan, soos hierbo beskryf, en die eerste GOI is opsioneel operasioneel gekoppel aan 'n promotor, waarin die promotor-gekoppelde GOI (of die GOI) 5' geflankeer word deur 'n eerste rekombinase-herkenningsplek en 3′ deur 'n tweede rekombinase-herkenningsplek. In 'n ander belichaming word 'n tweede GOI 3' van die tweede rekombinase-herkenningsplek ingevoeg, en die tweede GOI word 3' geflankeer deur 'n derde rekombinase-herkenningsplek.

In nog 'n ander belichaming is die GOI operasioneel gekoppel aan 'n promotor wat in staat is om uitdrukking van die GOI aan te dryf, waarin die promotor bestaan ​​uit 'n eukariotiese promotor wat deur 'n aktiveerder of inhibeerder gereguleer kan word. In ander belichamings is die eukariotiese promotor operasioneel gekoppel aan 'n prokariotiese operateur, en die eukariotiese sel bestaan ​​opsioneel verder uit 'n prokariotiese onderdrukkerproteïen.

In 'n ander belichaming word een of meer selekteerbare merkers ingesluit tussen die eerste en die tweede en/of die tweede en die derde rekombinase-herkenningsplekke. In sommige belichamings is die eerste en/of die tweede gene van belang en/of die een of meer selekteerbare merkers operasioneel gekoppel aan 'n promotor, waarin die promotor dieselfde of verskillend kan wees. In 'n ander belichaming bestaan ​​die promotor uit 'n eukariotiese promotor (soos byvoorbeeld 'n CMV-promotor of 'n SV40 laat promotor), opsioneel beheer deur 'n prokariotiese operateur (soos byvoorbeeld 'n tet-operateur). In ander belichamings bestaan ​​die sel verder uit 'n geen wat kodeer vir 'n prokariotiese onderdrukker (soos byvoorbeeld 'n tet-onderdrukker).

In 'n ander belichaming bestaan ​​die sel verder uit 'n geen wat in staat is om 'n rekombinase uit te druk. In sommige belichamings is die rekombinase 'n Cre-rekombinase.

In een aspek word 'n CHO-gasheersel verskaf, wat 'n uitdrukking-verbeterende volgorde uit SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 bevat, of 'n uitdrukking-verbeterende volgorde wat ten minste 90% nukleotiedidentiteit met SEQ ID NO:1 het of SEQ ID NO:4, of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan, wat 'n eerste rekombinase-herkenningsplek bevat gevolg deur 'n eerste eukariotiese promotor, 'n eerste selekteerbare merkergeen, 'n tweede eukariotiese promotor, 'n tweede selekteerbare merkergeen en 'n tweede rekombinase-herkenning werf. In meer belichamings verskaf die CHO-gasheersel verder 'n derde eukariotiese promotor, 'n derde merkergeen en 'n derde rekombinase-herkenningsplek. In een belichaming is die uitdrukking-verbeterende volgorde binne SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 soos hierbo beskryf.

In een belichaming verskil die eerste, tweede en derde rekombinase-herkenningsplekke van mekaar. In sommige belichamings word die rekombinase-herkenningsplekke gekies uit 'n LoxP-plek, 'n Lox511-plek, 'n Lox2272-plek, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, Lox66, LoxFas en 'n frt-plek.

In een belichaming is die eerste selekteerbare merkergeen 'n geneesmiddelweerstandsgeen. In 'n ander belichaming is die geneesmiddelweerstandsgeen 'n neomisienweerstandsgeen of 'n higromisienweerstandsgeen. In 'n ander belichaming kodeer die tweede en derde selekteerbare merkergene twee verskillende fluoresserende proteïene.In een belichaming word die twee verskillende fluoresserende proteïene gekies uit die groep wat bestaan ​​uit Discosoma koraal (DsRed), groen fluoresserende proteïen (GFP), verbeterde groen fluoresserende proteïen (eGFP), siano fluoresserende proteïen (CFP), verbeterde siano fluoresserende proteïen (eCFP). ), geel fluoresserende proteïen (YFP), verbeterde geel fluoresserende proteïen (eYFP) en verrooi fluoresserende proteïen (bv. mKate, mKate2, mPlum, mRaspberry of E2-crimson).

In een belichaming is die eerste, tweede en derde promotors dieselfde. In 'n ander beliggaming verskil die eerste, tweede en derde promotors van mekaar. In 'n ander belichaming is die eerste promotor verskillend van die tweede en derde promotors, en die tweede en derde promotors is dieselfde. In meer belichamings is die eerste promotor 'n SV40 laat promotor, en die tweede en derde promotors is elk 'n menslike CMV promotor. In ander belichamings is die eerste en tweede promotors operasioneel gekoppel aan 'n prokariotiese operateur.

In een belichaming het die gasheersellyn 'n eksogeen bygevoegde geen wat kodeer vir 'n rekombinase geïntegreer in sy genoom, werksaam gekoppel aan 'n promotor. In 'n ander beliggaming is die rekombinase Cre rekombinase. In 'n ander belichaming het die gasheersel 'n geen wat kodeer vir 'n regulatoriese proteïen geïntegreer in sy genoom, werksaam gekoppel aan 'n promotor. In meer belichamings is die regulatoriese proteïen 'n tet-onderdrukkerproteïen.

In een belichaming kodeer die eerste GOI en die tweede GOI vir 'n ligte ketting, of fragment daarvan, van 'n teenliggaam of 'n swaar ketting, of fragment daarvan, van 'n teenliggaam. In 'n ander belichaming kodeer die eerste GOI 'n ligte ketting van 'n teenliggaam en die tweede GOI kodeer 'n swaar ketting van 'n teenliggaam.

In sekere belichamings kodeer die eerste, tweede en derde GOI 'n polipeptied gekies uit die groep wat bestaan ​​uit 'n eerste ligte ketting, of fragment daarvan, 'n tweede ligte ketting, of fragment daarvan en 'n swaar ketting, of fragment daarvan. In nog 'n ander belichaming kodeer die eerste, tweede en derde GOI 'n polipeptied gekies uit die groep wat bestaan ​​uit 'n ligte ketting, of fragment daarvan, 'n eerste swaar ketting, of fragment daarvan en 'n tweede swaar ketting, of fragment daarvan.

In een aspek word 'n metode verskaf vir die maak van 'n proteïen van belang, wat behels (a) die invoering van 'n geen van belang (GOI) in 'n CHO-gasheersel, waarin die GOI integreer in 'n spesifieke lokus wat 'n nukleotiedvolgorde bevat wat ten minste 90 is % identies aan SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 (b) die kweek van die sel van (a) onder toestande wat uitdrukking van die GOI toelaat en (c) die herwinning van die proteïen van belang. In een belichaming word die proteïen van belang gekies uit die groep wat bestaan ​​uit 'n subeenheid van 'n immunoglobulien, of fragment daarvan, en 'n reseptor, of ligand-bindende fragment daarvan. In sekere belichamings word die proteïen van belang gekies uit die groep wat bestaan ​​uit 'n teenliggaam ligte ketting, of antigeen-bindende fragment daarvan, en 'n teenliggaam swaar ketting, of antigeen-bindende fragment daarvan.

In sommige belichamings word die GOI in die sel ingebring deur gebruik te maak van 'n teikenvektor vir rekombinase-gemedieerde kassetuitruiling (RMCE) en die CHO-gasheerselgenoom bestaan ​​uit ten minste een eksogene herkenningsvolgorde binne die spesifieke lokus. In ander belichamings bestaan ​​die CHO-gasheerselgenoom uit ten minste een eksogene herkenningsvolgorde en 'n selekteerbare merker, opsioneel gekoppel aan 'n promotor, IRES en/of poliadenilasie (polyA) volgorde, binne die spesifieke lokus.

In sekere belichamings bestaan ​​die CHO-gasheerselgenoom uit een of meer rekombinase-herkenningsplekke soos hierbo beskryf, en die GOI word in die spesifieke lokus ingevoer deur die werking van 'n rekombinase wat die rekombinase-herkenningsplek herken.

In 'n ander belichaming word die GOI in die sel ingebring deur 'n teikenvektor vir homoloë rekombinasie te gebruik, en waarin die teikenvektor 'n 5'-homologie-arm bestaan ​​wat homoloog is aan 'n volgorde teenwoordig in die spesifieke lokus, 'n GOI en 'n 3'-homologie-arm homoloog na 'n volgorde teenwoordig in die spesifieke lokus. In 'n ander belichaming bestaan ​​die teikenvektor verder uit twee, drie, vier of vyf of meer gene van belang. In 'n ander beliggaming is een of meer van die gene van belang operasioneel gekoppel aan 'n promotor.

In 'n ander aspek word 'n teikenvektor verskaf waarin die teikenvektor 'n 5' homologie-arm bestaan ​​wat homoloog is aan 'n volgorde teenwoordig in 'n lokus wat 'n nukleotiedvolgorde bevat wat ten minste 90% identies is aan SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 , 'n GOI, en 'n 3'-homologie-arm wat homoloog is aan 'n volgorde teenwoordig in 'n lokus wat 'n nukleotiedvolgorde bevat wat ten minste 90% identies is aan SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4. In 'n ander belichaming bestaan ​​die teikenvektor verder uit twee, drie, vier of vyf of meer gene van belang.

In 'n ander aspek word 'n metode verskaf vir die wysiging van 'n CHO-selgenoom om 'n eksogene nukleïensuurvolgorde te integreer, wat die stap behels om 'n voertuig wat 'n vektor insluit in die sel in te voer, waarin die vektor 'n eksogene nukleïensuurvolgorde bevat waarin die eksogene nukleïensuur suur integreer binne 'n lokus van die genoom wat 'n nukleotiedvolgorde bevat wat minstens 90% identies is aan SEQ ID NO: 1 of SEQ ID NO: 4.

In sommige belichamings bestaan ​​die vektor uit 'n 5'-homologie-arm wat homoloog is aan 'n volgorde teenwoordig in 'n lokus van die genoom wat 'n nukleotiedvolgorde bevat wat minstens 90% identies is aan SEQ ID NO: 1 of SEQ ID NO: 4, 'n eksogene nukleïensuurvolgorde , en 'n 3'-homologie-arm wat homoloog is aan 'n volgorde teenwoordig in 'n lokus van die genoom wat 'n nukleotiedvolgorde bevat wat minstens 90% identies is aan SEQ ID NO: 1 of SEQ ID NO: 4.

In sommige belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuurvolgorde in die vektor uit een of meer herkenningsvolgordes. In ander belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuur uit een of meer GOI's, soos 'n selekteerbare merker of 'n nukleïensuur wat 'n POI kodeer. In nog ander belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuur uit een of meer GOI's en een of meer herkenningsvolgorde.

In een belichaming bestaan ​​die voertuig ten minste een bykomende vektor of mRNA. In 'n ander belichaming word die bykomende vektor gekies uit die groep wat bestaan ​​uit 'n adenovirus, 'n lentivirus, 'n retrovirus, 'n adeno-geassosieerde virus, 'n integrerende faagvektor, 'n nie-virale vektor, 'n transposon en/of transposase, 'n integrase substraat en 'n plasmied. In sommige belichamings bestaan ​​die addisionele vektor uit 'n nukleotiedvolgorde wat 'n plekspesifieke nuklease kodeer vir die integrasie van die eksogene nukleïensuurvolgorde.

In sekere belichamings bestaan ​​die plekspesifieke nuklease uit 'n sinkvingernuklease (ZFN), 'n ZFN-dimeer, 'n transkripsie-aktiveerder-agtige effektor-nuklease (TALEN), 'n TAL-effektor-domeinfusieproteïen, of 'n RNA-geleide DNA-endonuklease.

In 'n ander aspek word 'n voertuig voorsien vir die wysiging van 'n CHO-sel genoom om 'n eksogene nukleïensuurvolgorde te integreer, waarin die voertuig 'n vektor insluit, waarin die vektor 'n 5' homologie arm bestaan ​​wat homoloog is aan 'n volgorde teenwoordig in 'n lokus van die genoom wat bestaan ​​uit 'n nukleotiedvolgorde ten minste 90% identies aan SEQ ID NO: 1 of SEQ ID NO: 4, 'n eksogene nukleïensuurvolgorde, en 'n 3' homologie-arm homoloog aan 'n volgorde teenwoordig in 'n lokus van die genoom wat 'n nukleotiedvolgorde ten minste bevat 90% identies aan SEQ ID NO: 1 of SEQ ID NO: 4.

In sommige belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuurvolgorde uit een of meer herkenningsvolgorde. In ander belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuur uit een of meer GOI's, soos 'n selekteerbare merker of 'n nukleïensuur wat 'n POI kodeer. In nog ander belichamings bestaan ​​die eksogene nukleïensuur uit een of meer GOI's en een of meer herkenningsvolgorde.

In nog 'n ander aspek word 'n metode verskaf vir die wysiging van 'n CHO-selgenoom om 'n terapeutiese middel uit te druk wat 'n voertuig bevat vir die invoering, in die genoom, van 'n eksogene nukleïensuur wat 'n volgorde vir uitdrukking van die terapeutiese middel bevat, waarin die voertuig 'n 5 ′ homologie-arm homoloog aan 'n volgorde teenwoordig in die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1, 'n nukleïensuur wat vir die terapeutiese middel kodeer, en 'n 3' homologie-arm wat homoloog is aan 'n volgorde teenwoordig in die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4.

In nog een aspek verskaf die uitvinding 'n gemodifiseerde CHO-gasheersel wat 'n gemodifiseerde CHO-genoom bevat waarin die CHO-genoom gemodifiseer word deur die invoeging van 'n eksogene herkenningsvolgorde binne 'n lokus van die genoom met 'n nukleotiedvolgorde wat ten minste 90% identies is aan SEQ ID NO : 1.

In 'n ander aspek verskaf die uitvinding 'n gemodifiseerde eukariotiese gasheersel wat 'n gemodifiseerde eukariotiese genoom bevat waarin die eukariotiese genoom gemodifiseer word by 'n teikenintegrasieplek in 'n nie-koderende gebied van die genoom om 'n eksogene nukleïensuur in te voeg. In sommige belichamings is die eksogene nukleïensuur 'n herkenningsvolgorde. In ander belichamings is die gasheersel 'n soogdiergasheersel, soos 'n CHO-sel. In ander belichamings bestaan ​​die teikenintegrasieplek uit 'n uitdrukking-verbeterende volgorde soos SEQ ID NO:1, mits die volgorde nie vir enige endogene proteïene kodeer nie. Die uitvinding verskaf ook metodes om so 'n gemodifiseerde eukariotiese gasheersel te maak.

In enige van die aspekte en belichamings hierbo beskryf, kan die uitdrukking-verbeterende volgorde in die aangeduide oriëntasie geplaas word soos in SEQ ID NO:1, of in die omgekeerde van die oriëntasie van SEQ ID NO:1.

Enige van die aspekte en beliggamings van die uitvinding kan saam met enige ander aspek of beliggaming van die uitvinding gebruik word, tensy anders gespesifiseer of uit die konteks blyk.

Ander oogmerke en voordele sal duidelik word uit 'n hersiening van die daaropvolgende gedetailleerde beskrywing.

KORT BESKRYWING VAN DIE SYFERS

FIGURE. 1A en 1B. FIG. 1A: Skematiese diagram van 'n operasionele konstruk wat gebruik maak van ewekansige invoering van 'n nukleïensuurmolekule wat 'n GOI uitdruk (byvoorbeeld 'n multi-ketting teenliggaam) en veelvuldige kopieë van 'n seleksiemerker in 'n sel genoom, byvoorbeeld 'n CHO genoom vir die identifisering van 'n teiken lokus. Die voorbeeldkonstruksie sluit in: Swaar ketting (HC) Eerste kopie seleksie merker, soos: higromisien weerstand geen (Hig) Eerste kopie Ligte Ketting (LC) Tweede kopie seleksie merker (bv. Hyg), Tweede kopie Ligte Ketting (LC) Derde kopie seleksie merker (bv. Hyg). FIG. 1B : Voorbeeld skenker vektor vir integrasie via homoloë rekombinasie in die inheemse lokus geïdentifiseer as SEQ ID NO:1. 5' en 3' homologie arms is afgelei van SEQ ID NO:1.

FIGURE. 2A tot 2C illustreer dat die lokus van SEQ ID NO: (LOCUS 1), operasioneel gekoppel aan 'n geen van belang (GOI), verbeterde mRNA-uitdrukking van die GOI vertoon in vergelyking met dieselfde GOI wat nie operasioneel aan LOCUS 1 gekoppel is nie, in plaas daarvan gekoppel aan 'n beheerlokus. FIG. Fig. 2B : mRNA vlakke is hoër vir GOI uitgedruk in LOCUS 1 in vergelyking met Kontrole Lokus mRNA. FIG. 2C: Proteïentiter is 3-voudig hoër vir selle wat die GOI in LOCUS 1 uitdruk in vergelyking met proteïentiter wat geproduseer word van die selle wat dieselfde GOI in die Kontrolelokus uitdruk.

FIGURE. 3A en 3B illustreer 'n voorbeeldkasset wat bestaan ​​uit 'n fluoresserende merker en 'n GOI geïntegreer by LOCUS 1 (bv. mKate geflankeer deur lox-plekke wat met eYFP en 'n GOI uitgeruil moet word) in vergelyking met dieselfde kasset geïntegreer by 'n kontrolelokus (uitgeruil met 'n ander fluoresserend) merker, bv dsRed2, omring deur lox-plekke), waarin sodanige integrasie Cre-rekombinase en rekombinase-gemedieerde kassetuitruiling (RMCE) gebruik. Sulke kassette is in eksperimente gebruik om rekombinasiedoeltreffendheid en transkripsie van die GOI te meet.

FIG. 4 toon 'n hoër mRNA-vlak van 'n geen van belang (GOI) soos gemeet in 'n CHO-selpoel wat die GOI in LOCUS 1 (SEQ ID NO:1) uitdruk in vergelyking met mRNA van 'n CHO-selpoel wat dieselfde GOI uitdruk, onder dieselfde regulatoriese voorwaardes, maar geïntegreer binne die beheerlokus, dws EESYR.

GEDETAILLEERDE BESKRYWING

Voordat die huidige metodes beskryf word, moet dit verstaan ​​word dat hierdie uitvinding nie beperk is tot spesifieke metodes en eksperimentele toestande wat beskryf word nie, aangesien sulke metodes en toestande kan verskil. Dit moet ook verstaan ​​word dat die terminologie wat hierin gebruik word slegs vir die doel is om spesifieke belichamings te beskryf, en nie bedoel is om beperkend te wees nie, aangesien die omvang van die huidige uitvinding slegs deur die aangehegte eise beperk sal word.

Soos gebruik in hierdie spesifikasie en die aangehegte eise, sluit die enkelvoudsvorme "a", "an" en "die" meervoudsverwysings in, tensy die konteks duidelik anders bepaal. So byvoorbeeld, 'n verwysing na "'n metode" sluit een of meer metodes, en/of stappe van die tipe wat hierin beskryf word en/of wat duidelik sal word aan daardie persone wat in die kuns in die kuns by die lees van hierdie openbaarmaking duidelik sal word.

Tensy anders omskryf, of anders gespesifiseer, het alle tegniese en wetenskaplike terme wat hierin gebruik word, dieselfde betekenis as wat algemeen verstaan ​​word deur een van gewone vaardighede in die kuns waartoe hierdie uitvinding behoort.

Alhoewel enige metodes en materiale soortgelyk aan of ekwivalent aan dié wat hierin beskryf word gebruik kan word in die praktyk of toetsing van die huidige uitvinding, word spesifieke metodes en materiale nou beskryf. Alle publikasies wat hierin genoem word, word in hul geheel hierin ingesluit deur verwysing.

Definisies

DNS-streke is operasioneel gekoppel wanneer hulle funksioneel aan mekaar verwant is. Byvoorbeeld, 'n promotor is operasioneel gekoppel aan 'n koderende volgorde indien die promotor in staat is om deel te neem aan die transkripsie van die volgorde 'n ribosoom-bindingsplek is operasioneel gekoppel aan 'n koderende volgorde indien dit so geposisioneer is om translasie toe te laat. Oor die algemeen kan operasioneel gekoppelde aaneenskakeling insluit, maar dit vereis nie. In die geval van sekwense soos sekretoriese leiers, is aaneenskakeling en behoorlike plasing in 'n leesraam tipiese kenmerke. 'n Uitdrukking-verbeterende volgorde van die lokus van belang is operasioneel gekoppel aan 'n geen van belang (GOI) waar dit funksioneel verwant is aan die GOI, byvoorbeeld, waar die teenwoordigheid daarvan lei tot verbeterde uitdrukking en/of stabiele integrasie van die GOI.

Die term "verbeter" wanneer dit gebruik word om verbeterde uitdrukking te beskryf, sluit 'n verbetering van ten minste ongeveer 1,5-voudige tot ten minste ongeveer 3-voudige verbetering in uitdrukking in oor wat tipies waargeneem word deur ewekansige integrasie van 'n eksogene volgorde in 'n genoom of deur integrasie by 'n ander lokus, byvoorbeeld, in vergelyking met 'n poel ewekansige integrante van 'n enkele kopie van dieselfde uitdrukkingskonstruksie. Versterking van vou-uitdrukking wat waargeneem word deur gebruik te maak van die volgordes van die uitvinding is in vergelyking met 'n uitdrukkingsvlak van dieselfde geen, gemeet onder wesenlik dieselfde toestande, in die afwesigheid van 'n volgorde van die uitvinding, byvoorbeeld in vergelyking met integrasie by 'n ander lokus in dieselfde spesie genoom. Verbeterde rekombinasiedoeltreffendheid sluit 'n verbetering in van die vermoë van 'n lokus om te herkombineer (byvoorbeeld deur gebruik te maak van rekombinase-herkenningsplekke). Verbetering verwys na 'n doeltreffendheid van rekombinasie oor ewekansige rekombinasie, byvoorbeeld, sonder om rekombinase-herkenningsplekke of dies meer te gebruik, wat tipies 0.1% is. 'n Verbeterde rekombinasiedoeltreffendheid van voorkeur is ongeveer 10-voudig oor ewekansig, of ongeveer 1%. Tensy gespesifiseer, is die geëisde uitvinding nie beperk tot 'n spesifieke rekombinasiedoeltreffendheid nie.

Waar die frase "eksogeen bygevoegde geen" of "eksogeen bygevoegde nukleïensuur" gebruik word met verwysing na 'n lokus van belang, verwys die frase na enige DNS-volgorde of geen wat nie in die lokus van belang teenwoordig is nie, aangesien die lokus in die natuur gevind word. Byvoorbeeld, 'n "eksogeen bygevoegde geen" binne 'n CHO-lokus (bv. 'n lokus wat 'n volgorde van SEQ ID NO:1 bevat), kan 'n hamstergeen wees wat nie binne die spesifieke CHO-lokus in die natuur gevind word nie (dws 'n hamstergeen van 'n ander lokus in die hamstergenoom), 'n geen van enige ander spesie (bv. 'n menslike geen), 'n chimeriese geen (bv. mens/muis), of enige ander geen wat nie in die natuur gevind word om binne die CHO-lokus van belang te bestaan ​​nie.

Persentasie identiteit, wanneer 'n lokus van belang beskryf word, soos SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4, of 'n fragment daarvan, is bedoel om homoloë rye in te sluit wat die voorgeskrewe identiteit langs streke van aaneenlopende homologie vertoon, maar die teenwoordigheid van gapings, delesies of invoegings wat geen homoloog in die vergelykende volgorde het nie, word nie in ag geneem by die berekening van persentasie identiteit nie.

Soos hierin gebruik, sal 'n "persentasie identiteit" bepaling tussen, bv. SEQ ID NO:1, of fragment daarvan, met 'n spesie homoloog nie 'n vergelyking van rye insluit waar die spesie homoloog geen homoloë volgorde het om in 'n belyning te vergelyk nie (bv. , SEQ ID NO:1 of die fragment daarvan het 'n invoeging op daardie punt, of die spesie homoloog het 'n gaping of delesie, na gelang van die geval). Dus, "persentasie identiteit" sluit nie strawwe vir gapings, skrappings en invoegings in nie.

'n "Homoloë volgorde" in die konteks van nukleïensuurvolgordes verwys na 'n volgorde wat wesenlik homoloog is aan 'n verwysingsnukleïensuurvolgorde. In sommige belichamings word twee rye as wesenlik homoloog beskou as ten minste 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% of meer van hul ooreenstemmende nukleotiede is identies oor 'n relevante stuk residue. In sommige belichamings is die betrokke strek 'n volledige (d.i. volle) volgorde.

"Teikende invoeging" verwys na geen-teikenmetodes wat gebruik word om invoeging of integrasie van die geen of nukleïensuurvolgorde na 'n spesifieke plek op die genoom te rig, dit wil sê om die DNS na 'n spesifieke plek tussen twee nukleotiede in 'n aaneenlopende polinukleotiedketting te rig. Geteikende invoeging kan ook vir 'n spesifieke geenkasset gedoen word, wat veelvuldige gene, regulatoriese elemente en/of nukleïensuurvolgordes insluit. "Invoeging" en "integrasie" word uitruilbaar gebruik. Dit word verstaan ​​dat die invoeging van 'n geen of nukleïensuurvolgorde (byvoorbeeld 'n nukleïensuurvolgorde wat 'n ekspressiekasset bevat) kan lei tot (of gemanipuleer kan word vir) die vervanging of uitwissing van een of meer nukleïensure, afhangende van die geenredigeringstegniek benut word.

"Herkenningsplek" of "herkenningsvolgorde" is 'n spesifieke DNS-volgorde wat deur 'n nuklease of ander ensiem herken word om plekspesifieke splitsing van die DNS-ruggraat te bind en te rig. Endonukleases klief DNA binne 'n DNA-molekule. Herkenningswebwerwe word ook in die kuns na verwys as herkenningsteikenwebwerwe.

"Rekombinase-herkenningsplek" is die spesifieke DNS-volgorde wat deur 'n rekombinase herken word, soos Cre-rekombinase (Cre) of flippase (flp). Plekspesifieke rekombinases kan DNA-herrangskikkings uitvoer, insluitend delesies, inversies en translokasies wanneer een of meer van hul teikenherkenningsvolgorde strategies in die genoom van 'n organisme geplaas word.In een voorbeeld bemiddel Cre spesifiek rekombinasiegebeurtenisse by sy DNA-teikenherkenningsplek loxP, wat saamgestel is uit twee 13-bp omgekeerde herhalings geskei deur 'n 8-bp spasieerder. Meer as een rekombinase-herkenningsplek kan gebruik word, byvoorbeeld, om 'n rekombinasie-gemedieerde uitruiling van DNA te fasiliteer. Variante of mutante van rekombinase-herkenningsplekke, byvoorbeeld lox-plekke, kan ook gebruik word (Araki, N. et al., 2002), Nukleïensure Navorsing, 30:19, e103).

"Rekombinase-gemedieerde kassetuitruiling" hou verband met 'n proses om 'n genomiese teikenkasset presies met 'n skenkerkasset te vervang. Die molekulêre samestellings wat tipies verskaf word om hierdie proses uit te voer, sluit in 1) 'n genomiese teikenkasset wat beide 5' en 3' geflankeer word deur herkenningsteikenplekke spesifiek vir 'n spesifieke rekombinase, 2) 'n skenkerkasset geflankeer deur bypassende herkenningsteikenplekke, en 3) die plek-spesifieke rekombinase. Rekombinase-proteïene is welbekend in die vakgebied (Turan, S. en Bode J., 2011. FASEB J., 25, pp. 4088-4107) en maak presiese splitsing van DNA binne 'n spesifieke herkenningsteikenplek (volgorde van DNA) moontlik sonder toename of verlies van nukleotiede. Algemene rekombinase/plek kombinasies sluit in, maar is nie beperk nie tot, Cre/ox en Flp/frt.

'n "Voertuig" is 'n samestelling wat bestaan ​​uit enige polinukleotied of stel polinukleotiede wat 'n eksogene nukleïensuur dra vir inleiding in 'n sel. 'n Voertuig sluit vektore, plasmiede en mRNA-molekules in wat deur bekende transfeksiemetodes aan die sel afgelewer word. In een voorbeeld kan 'n mRNA wat in die selle ingebring word verbygaande wees en nie in die genoom integreer nie, maar die mRNA kan eksogene nukleïensuur dra wat nodig is vir die integrasieproses om plaas te vind.

ALGEMENE BESKRYWING

Die uitvinding is ten minste gedeeltelik gebaseer op die ontdekking van unieke volgordes, dit wil sê lokusse, in 'n genoom wat meer doeltreffende rekombinasie, invoegingsstabiliteit en hoër vlak uitdrukking as ander streke of volgordes in die genoom vertoon. Die uitvinding is ook ten minste gedeeltelik gebaseer op die bevinding dat wanneer sulke uitdrukking-verbeterende volgordes geïdentifiseer word, 'n geskikte geen of konstruk eksogeen in of naby die rye bygevoeg kan word en dat die eksogene bygevoegde geen voordelig uitgedruk of benut kan word vir verdere genomiese modifikasies. Sulke volgordes, genoem uitdrukking-verbeterende volgordes word as stabiel beskou en is nie binne 'n koderende gebied van die genoom geleë nie. Hierdie uitdrukking-verbeterende en stabiliteitstreke kan ontwerp word vir toekomstige kloning of genoom redigering gebeure. Dus word 'n betroubare uitdrukkingstelsel in die genomiese ruggraat van die sel ingebou.

Die uitvinding is ook gebaseer op die spesifieke teiken van 'n eksogene geen na die integrasieplek. Die metodes van die uitvinding laat doeltreffende "omskakeling" van die selgenoom in 'n bruikbare kloningskasset toe, byvoorbeeld deur rekombinase-gemedieerde kassetuitruiling (RMCE) te gebruik. Vir hierdie doel gebruik die metodes van die uitvinding sellulêre genoom-rekombinase-herkenningsplekke vir die plasing van gene van belang om hoogs produktiewe sellyne vir rekombinante proteïenproduksie te skep.

Die samestellings van die uitvinding kan ook ingesluit word in uitdrukkingskonstrukte, byvoorbeeld in uitdrukkingsvektore vir kloning en ingenieurswese van nuwe sellyne. Uitdrukkingsvektore wat die polinukleotiede van die uitvinding bevat kan gebruik word om proteïene kortstondig uit te druk, of kan geïntegreer word in 'n genoom deur ewekansige of geteikende rekombinasie soos byvoorbeeld homoloë rekombinasie of rekombinasie bemiddel deur rekombinases wat spesifieke rekombinasieplekke herken (bv. Cre -lox-gemedieerde rekombinasie). Uitdrukkingsvektore wat die polinukleotiede van die uitvinding bevat, kan ook gebruik word om doeltreffendheid van ander DNA-volgordes te bepaal, byvoorbeeld, cis-werkende regulatoriese volgordes.

Integrasieterreine word tipies geïdentifiseer deur óf ewekansige integrasie óf analise van retrovirale integrasiegebeurtenisse. Die CHO-integrasieplek wat hierin in detail beskryf word, is geïdentifiseer deur ewekansige integrasie van DNA wat vir 'n multi-ketting teenliggaam kodeer en daar is gevind dat die uitgedrukte proteïen verbeterde uitdrukking toon.

Die voorbeeld multi-ketting teenliggaampie wat een swaar ketting (HC) en twee kopieë van 'n ligte ketting (LC) bestaan, is ewekansig in die genoom geïntegreer in 'n uitdrukkingskasset wat afwisselende higromisienweerstandsgene bevat (sien bv. drie identiese Hyg-gene soos uitgebeeld in FIG. 1A). Een stabiele en hoë uitdrukking kloon het voortgespruit uit die integrasie van die uitdrukking kasset binne die lokusse geïdentifiseer as SEQ ID NO:1.

In vergelyking met integrasie in 'n ander streek van die CHO-genoom (kontrole-integrasie-plek), vertoon die voorbeeld multi-ketting teenliggaampie hoër uitdrukkingsvlakke wanneer geïntegreer binne die lokus van SEQ ID NO:1. Interessant genoeg is geenkopiegetal vergelykbaar vir die teenliggaam-uitdrukking polinukleotiede geïntegreer binne SEQ ID NO: teenoor die kontrole integrasie werf, maar proteïen titers is 3-voudig hoër vir teenliggaam-uitdrukking polinukleotiede geïntegreer binne SEQ ID NO:1.

Geteikende rekombinasie metodes is gebruik om die CHO sel genoom om te skakel in 'n kloningskonstruksie wat rekombinase herkenningsplekke bevat (sien, bv. FIGURE 3A-B).

In wese, na die identifikasie van die integrasieplek van SEQ ID NO:1, is rekombinase-herkenningsplekke (bv. lox-plekke) in die lokus gebruik vir die bekendstelling van uitdrukkingskassette wat 'n uitdrukbare GOI bevat, soos 'n selekteerbare merker (sien bv. FIGUUR). 3A-B ), tesame met enige ander gewenste elemente soos bv. promotors, versterkers, merkers, operateurs, ribosoombindingsplekke (bv. interne ribosoomintreeplekke), ens.

'n Illustrasie van 'n voorbeeld skenkerkonstruksie wat gebruik word vir geteikende integrasie van lox-terreine binne SEQ ID NO:1, word in FIG. 1B. Die skenkerkonstruk bestaan ​​uit 'n uitdrukkingskasset wat aangedryf word deur 'n neomisien (neo) weerstandsgeen en 'n interne ribosoomintreeplek (IRES), waarin die kasset 'n fluoresserende merker (mKate) bevat en op die 5'- en 3'-punte met rekombinase-herkenning omring word. terreine en 5'- en 3'-homologie-arms (homologus aan SEQ ID NO:1). Invoeging binne die lokus van SEQ ID NO: word getoon, waarin die invoeging tot gevolg het dat die skenker neo/mKate konstruk die uitdrukkingskasset vervang wat die higromisienweerstandmerker bevat, waarin die uitdrukkingskasset binne die SEQ ID NO:1 lokus geflankeer word op sy 5 ′ en 3′ eindig deur rekombinase-herkenningsplekke gekoppel aan 5′ en 3′ homologie-arms (homologus aan SEQ ID NO:1) (sien FIG. 1B).

Samestellings en metodes word verskaf vir die stabiele integrering van 'n nukleïensuurvolgorde in 'n eukariotiese sel, waarin die nukleïensuurvolgorde in staat is tot verbeterde uitdrukking deurdat dit geïntegreer is in SEQ ID NO:1 of 'n uitdrukkingsversterkende fragment daarvan. Selle word voorsien wat 'n rekombinase-herkenningsvolgorde binne SEQ ID NO:1 bevat wat gerieflik is vir die invoeging van 'n GOI, ten einde uitdrukking van 'n proteïen van belang vanaf die GOI te verkry. Samestellings en metodes word ook verskaf vir die teiken van die integrasieterreine in verband met uitdrukkingskonstrukte, byvoorbeeld uitdrukkingsvektore, en vir die byvoeging van 'n eksogene nukleïensuur(s) in 'n CHO-sel van belang.

Fisiese en funksionele karakterisering van 'n CHO-integrasieterrein

Die nukleïensuurvolgorde van SEQ ID NO:1 (en breër nukleïensuurvolgorde van SEQ ID NO:4) is empiries geïdentifiseer deur volgordes stroomop en stroomaf van die integrasieplek van 'n nukleïensuurkonstruksie (wat uit 'n uitdrukkingskasset bestaan) van 'n sellyn om 'n proteïen op 'n hoë vlak uit te druk. Die nukleïensuurvolgordes van die uitvinding verskaf reekse met 'n nuwe funksionaliteit wat verband hou met verbeterde uitdrukking en stabiliteit van 'n nukleïensuur (byvoorbeeld 'n eksogene nukleïensuur wat 'n GOI bevat) en sonder om deur enige een teorie gebind te wees, kan dieselfde of anders funksioneer van wat voorheen beskryf is vir cis-werkende elemente soos promotors, versterkers, lokusbeheerstreke, steieraanhegtingstreke of matriksaanhegtingstreke. SEQ ID NO:1 blyk nie enige oop leesrame (ORF's) te hê nie, wat dit onwaarskynlik maak dat die lokus nuwe trans-aktivatorproteïene kodeer. 'n Vermeende sinkvingerproteïen is in die genomiese lokus 3' (stroomaf) van SEQ ID NO:4 geïdentifiseer.

Uitdrukking-versterkende aktiwiteit is geïdentifiseer met betrekking tot integrasie van 'n uitdrukkingskasset wat 'n eerste higromisien (Hyg) geen, 'n eerste GOI, 'n tweede Hyg geen, 'n tweede GOI, 'n derde Hyg geen en 'n derde GOI enkoderende volgorde binne 'n unieke plek bevat van 'n nie-koderende gebied van CHO genomiese DNA. Uitdrukkingsvektore wat byvoorbeeld 'n 5'-geïsoleerde 1 kb-streek en 'n 3'-geïsoleerde 1 kb-streek bevat wat geïdentifiseer is vanaf die nie-koderende gebied van CHO genomiese DNA met betrekking tot 'n uitdrukkingskasset wat 'n GOI uitdruk, kon oordra aan CHO-selle wat getransfekteer is met hulle hoë vlakke van uitdrukking van rekombinante proteïene.

Die uitvinding sluit uitdrukkingsvektore in wat omgekeerde georiënteerde SEQ ID NO:1-fragmente of SEQ ID NO:4-fragmente bevat. Ander kombinasies van die fragmente wat hierin beskryf word, kan ook ontwikkel word. Voorbeelde van ander kombinasies van die fragmente wat hierin beskryf word wat ook ontwikkel kan word, sluit reekse in wat veelvuldige kopieë van die uitdrukking-verbeterende reekse hierin geopenbaar insluit, of reekse wat afgelei is deur die geopenbaarde SEQ ID NO:1 fragmente of SEQ ID NO:4 fragmente te kombineer met ander nukleotiedvolgordes om optimale kombinasies van regulatoriese elemente te bereik. Sulke kombinasies kan aaneenlopend gekoppel of gerangskik word om optimale spasiëring van die SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 fragmente te verskaf (bv. deur die inbring van spasieernukleotiede tussen die fragmente). Regulerende elemente kan ook gerangskik word om optimale spasiëring van 'n SEQ ID NO:1 fragment met betrekking tot die regulatoriese elemente te verskaf.

SEQ ID NO:1 en SEQ ID NO: 4 wat hierin geopenbaar is, is uit CHO-selle geïsoleer. Daar is gevind dat ander soogdierspesies (soos byvoorbeeld mense of muise) beperkte homologie het met die geïdentifiseerde uitdrukkingsversterkende streek, maar homoloë volgordes kan gevind word in sellyne wat van ander weefseltipes afkomstig is van Cricetulus griseus, of ander homoloë spesies, en kan geïsoleer word deur tegnieke wat in die kuns bekend is. Byvoorbeeld, 'n mens kan ander homoloë volgordes identifiseer deur kruis-spesie hibridisasie of PCR-gebaseerde tegnieke. Daarbenewens kan veranderinge gemaak word in die nukleotiedvolgorde uiteengesit in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4, of fragmente daarvan, deur plekgerigte of ewekansige mutagenese tegnieke wat in die kuns bekend is. Die gevolglike volgorde variante kan dan getoets word vir uitdrukking-verbeterende aktiwiteit soos hierin beskryf. DNA's wat ten minste ongeveer 90% identies is in nukleïensuur-identiteit aan SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4, of fragmente daarvan, met uitdrukkingsversterkende aktiwiteit is isoleerbaar deur roetine-eksperimentering, en word verwag om uitdrukkingsversterkende aktiwiteit te toon . Vir fragmente van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO: 4, verwys persentasie identiteit na daardie gedeelte van die verwysing inheemse volgorde wat gevind word in die SEQ ID NO:1 fragment of SEQ ID NO: 4 fragment. Gevolglik word homoloë van SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4, of fragmente daarvan, en variante daarvan, ook deur belichamings van die uitvinding ingesluit.

In sekere belichamings word die fragment van SEQ ID NO:1 gekies uit die groep bestaande uit nukleotiede wat oor posisies nommer 10-4,000 100-3,900 200-3,800 300-3,700 400-3,600 500-3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 3,02 900-3,100 1,000-3,000 1,100-2,900 1,200-2,800 1,300-2,700 1,200-2,600 1,300-2,500 1,400-2,400 1,500-2,300 1,600-2,200 1,700-2100 1,800-2050 1850-2050, 1,900-2040 1950-2,025, 1990-2021 , 2002-2021 en 2,010-2,015 van SEQ ID NO:1. In 'n ander belichaming word die fragment van SEQ ID NO:1 gekies uit die groep bestaande uit nukleotiede wat oor posisies nommer 10-500 500-1,000 500-2,100 1,000-1,500 1,000-2,100 1,500-2,5000 1,500 2,5000 1,500 2,500 2,5000 1,500 2,500 2 500-3 500 3 000-3 500 3 000-4 000 en 3 500-4 000 van SEQ ID NO:1. In sekere belichamings integreer die eksogene nukleïensuurvolgorde by of naby spesifieke plekke binne die fragment hierbo beskryf.

In 'n ander belichaming is die eksogene nukleïensuurvolgorde geposisioneer binne SEQ ID NO:1 of fragmente daarvan soos hierbo beskryf, of binne 'n volgorde wat ten minste ongeveer 90% identies, ten minste ongeveer 91% identies, ten minste ongeveer 92% identies is , ten minste ongeveer 93% identies, ten minste ongeveer 94% identies, ten minste ongeveer 95% identies, ten minste ongeveer 96% identies, ten minste ongeveer 97% identies, ten minste ongeveer 98% identies, of ten minste ongeveer 99% identies na die uitdrukking-verbeterende volgorde van SEQ ID NO:1 of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan.

Selpopulasies wat verhoogde vlakke van 'n proteïen van belang uitdruk, kan ontwikkel word deur die metodes wat hierin verskaf word, te gebruik. Die absolute vlak van uitdrukking sal wissel met die spesifieke proteïen, afhangende van hoe doeltreffend die proteïen deur die sel verwerk word. Selpoele wat ontwikkel is met eksogene volgorde(s) geïntegreer binne die uitdrukking-verbeterende volgordes van die uitvinding is stabiel oor tyd, en kan as stabiele sellyne vir die meeste doeleindes hanteer word. Rekombinasiestappe kan ook vertraag word tot later in die proses van ontwikkeling van die sellyne van die uitvinding.

CHO-uitdrukking-verbeterende lokus en fragmente daarvan

Die uitvinding omvat 'n uitdrukking-verbeterende fragment van 'n nukleotiedvolgorde wat ten minste ongeveer 90% identies is, ten minste ongeveer 91% identies, ten minste ongeveer 92% identies, ten minste ongeveer 93% identies, ten minste ongeveer 94% identies, by ten minste ongeveer 95% identies, ten minste ongeveer 96% identies, ten minste ongeveer 97% identies, ten minste ongeveer 98% identies, of ten minste ongeveer 99% identies aan die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO: 4 Die uitvinding sluit vektore in wat uit 'n fragment bestaan, insluitend vir verbygaande of stabiele transfeksie, wat oor posisies nommer 10-4,000 100-3,900 200-3,800 300-3,700 400-3,600 500-3,500 300-3000 300-3000 300-3000 300-3000 300-3000 300-3,800 400-3,600 500-3,500 300-7000 300-300, 01, 300 300-3000 300-3000 300-3000 500-3 500 500-3,500 300-3000 300-300, 300, 300-300, -3.000 1,100-2,900 1,200-2,800 1,300-2,700 1,200-2.600 1,300-2.500 1,400-2.400 1,500-2.300 1,600-2,200 1,700-2100 1,800-2050 1850-2050, 1,900-2040 1950-2,025, 1990-2021, 2002-2021 en 2,010-2,015 van SEQ ID NO:1. Die uitvinding sluit ook 'n eukariotiese sel in wat so 'n fragment bevat waarin die fragment eksogeen aan die sel is en in die selgenoom geïntegreer is, en selle wat so 'n fragment bevat met ten minste een rekombinase-herkenningsplek wat binne, onmiddellik 5′ of onmiddellik is. 3′ na die fragment.

In een belichaming is die uitdrukking-verbeterende fragment van SEQ ID NO:1 geleë op 'n posisie binne SEQ ID NO:1 wat strek oor posisies genommer 10-500 500-1,000 500-2,100 1,000-1,500 1,000-2,100 1,000-1,5002-5,000 1,5002, 5000. 2 000-2 500 2 500-3 000 2 500-3 500 3 000-3 500 3 000-4 000 of 3 500-4 000 van SEQ ID NO:1.

Waar stabiele integrasie en/of verbeterde transkripsie van 'n geïntegreerde polinukleotied ondersteun word, is die presiese ligging van die lokus-invoeging (d.w.s. integrasie) plek met betrekking tot die geïllustreerde plekke nie noodsaaklik nie. Die integrasieperseel kan eerder op enige posisie wees wat binne of aangrensend is aan SEQ ID NO:1 of 'n fragment van SEQ ID NO:1, of SEQ ID NO: 4 of 'n fragment van SEQ ID NO: 4, soos hierin beskryf. . Of 'n spesifieke chromosomale ligging binne of langs die lokus van belang stabiele integrasie en doeltreffende transkripsie van 'n geïntegreerde eksogene geen ondersteun, kan bepaal word in ooreenstemming met standaardprosedures wat in die kuns bekend is of metodes wat hierin geïllustreer word.

Die integrasieplekke wat hierin oorweeg word, is geleë binne 'n lokus wat die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 bevat, of binne naby die lokus van belang, bv. minder as ongeveer 1 kb, 500 basispare (bp) ), 250 bp, 100 bp, 50 bp, 25 bp, 10 bp, of minder as ongeveer 5 bp stroomop (5′) of stroomaf (3′) met betrekking tot die ligging van SEQ ID NO:1 op die chromosomale DNA. In nog 'n paar ander belichamings is die aangewende integrasieperseel geleë op ongeveer 1000, 2500, 5000 of meer basispare stroomop (5′) of stroomaf (3′) met betrekking tot die ligging van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO: 4 op die chromosomale DNA.

Dit word verstaan ​​in die kuns dat groot genomiese streke, soos steier/matriks-aanhegtingstreke, aangewend word vir doeltreffende replikasie en transkripsie van chromosomale DNA. 'n Steier-/matriksaanhegtingsgebied (S/MAR), ook bekend as steieraanhegtingsgebied (SAR), of matriksgeassosieerde of matriksaanhegtingsgebied (MAR), is 'n eukariotiese genomiese DNA-gebied waar die kernmatriks heg. Sonder om deur enige teorie gebind te wees, karteer S/MAR's tipies na nie-koderende streke, skei 'n gegewe transkripsiegebied (bv. chromatiendomein) van sy bure, en verskaf ook platforms vir die masjinerie en/of binding van faktore wat transkripsie moontlik maak, soos herkenningsplekke vir DNAse of polimerases. Sommige S/MAR's is gekenmerk teen ongeveer 14-20 kb lank (Klar, et al. 2005), Gene 364:79-89). As sodanig word verwag dat integrasie van gene by LOCUS 1 (binne of naby SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4) verbeterde uitdrukking sal verleen.

Diegene in die kuns sal erken dat verskeie elemente geoptimaliseer kan word vir hoë transkripsionele aktiwiteit by die onderwerp lokus, wat lei tot hoë uitdrukking van 'n ingevoegde geen wat kodeer vir 'n proteïen van belang. Elemente om te oorweeg sluit in 'n sterk promotor om transkripsie aan te dryf, voldoende transkripsionele masjinerie en DNA met 'n oop en toeganklike konfigurasie. Invoeging by die vaklokus kan geoptimaliseer word binne die vaardigheid van die persoon in die kuns deur 'n integrasieterrein te rig wat binne SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 gekies is.

In een belichaming word die uitdrukking-verbeterende volgorde van SEQ ID NO:1 aangewend om die uitdrukking van 'n GOI te verbeter. FIG. 2A toon resultate van 'n GOI wat operasioneel gekoppel is aan SEQ ID NO:1 (LOCUS 1) in vergelyking met dieselfde GOI geïntegreer in 'n ander lokus in die CHO-selgenoom (Control Locus). Die geenkopiegetal gemeet vir elke sellyn is ekwivalent, dog eksperimente toon dat die mRNA-vlak en die proteïentiter van selle wat die GOI uitdruk, drie keer hoër is vir GOI wat operasioneel gekoppel is aan LOCUS 1.

In verskeie belichamings kan uitdrukking van 'n GOI verbeter word deur die GOI binne SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO: 4 te plaas. In verskeie belichamings is verbetering in uitdrukking ten minste ongeveer 1.5-voudig tot ongeveer 3-voudig of meer.

Geneties wysiging van die teikenlokus

Metodes vir die genetiese manipulering van 'n selgenoom in 'n spesifieke plek (d.w.s. teikenlokus) kan op verskeie maniere bereik word. Genetiese redigeringstegnieke is gebruik om 'n nukleïensuurvolgorde stabiel in 'n eukariotiese sel te integreer, waarin die nukleïensuurvolgorde 'n eksogene volgorde is wat nie normaalweg in sulke selle voorkom nie. Klonale uitbreiding is nodig om te verseker dat die sel nageslag die identiese genotipiese en fenotipiese eienskappe van die gemanipuleerde sellyn sal deel.In sommige voorbeelde word inheemse selle gemodifiseer deur 'n homoloë rekombinasietegniek om 'n eksogene nukleïensuurvolgorde binne SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO: 4 te integreer. In ander voorbeelde word selle verskaf wat ten minste een rekombinase-herkenningsvolgorde binne SEQ bevat ID NO:1 of SEQ ID NO: 4 gerieflik vir die integrasie van 'n eksogene nukleïensuurvolgorde of 'n geen van belang.

In sommige voorbeelde word selle verskaf wat 'n eerste rekombinase-herkenningsvolgorde en 'n tweede rekombinase-herkenningsvolgorde bevat waarin elk van die eerste en tweede rekombinase-herkenningsvolgorde gekies word uit die groep wat bestaan ​​uit LoxP, Lox511, Lox5171, Lox2272, Lox2372, Loxm2, Loxm2, Loxm2, -FAS, Lox71, Lox66 en die mutante daarvan. In hierdie geval, waar rekombinase-gemedieerde kassetuitruiling (RMCE) verlang word, is die plekspesifieke rekombinase Cre rekombinase of sy afgeleide. In ander voorbeelde word elk van die eerste en tweede rekombinase-herkenningsvolgorde gekies uit die groep wat bestaan ​​uit FRT, F3, F5, FRT mutant-10, FRT mutant+10 en die mutante daarvan, en in hierdie scenario, waar RCME verlang word, die plekspesifieke rekombinase is Flp-rekombinase of die afgeleide daarvan. In nog 'n ander voorbeeld word elk van die eerste en die tweede rekombinase-herkenningsvolgorde gekies uit die groep wat attB, attP en die mutante daarvan bevat, en in hierdie geval waar RMCE verlang word, is die plekspesifieke rekombinase phiC31-integrase of sy afgeleide .

In een aspek is metodes en samestellings vir die stabiele integrering van 'n nukleïensuurvolgorde binne SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO: 4, of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan, via homoloë rekombinasie. 'n Nukleïensuurmolekule, .d.i. geen of polinukleotied van belang, kan in die geteikende lokus (d.i. SEQ ID NO:1) ingevoeg word deur homoloë rekombinasie of deur gebruik te maak van plekspesifieke nukleasemetodes wat spesifiek volgordes by die integrasieplekke teiken. Vir homoloë rekombinasie, homoloë polinukleotiedmolekules (d.w.s. homoloë arms) in lyn en ruil 'n stuk van hul rye uit. 'n Transgeen kan tydens hierdie uitruiling ingebring word indien die transgeen deur homoloë genomiese volgordes geflankeer word. In een voorbeeld kan 'n rekombinase-herkenningsplek in die gasheerselgenoom by die integrasieplekke ingebring word.

Homoloë rekombinasie in eukariotiese selle kan vergemaklik word deur 'n breuk in die chromosomale DNA by die integrasieplek in te voer. Modelstelsels het gedemonstreer dat die frekwensie van homoloë rekombinasie tydens geen-teikening toeneem as 'n dubbelstring-breuk binne die chromosomale teikenvolgorde ingestel word. Dit kan bewerkstellig word deur sekere nukleases na die spesifieke plek van integrasie te rig. DNS-bindende proteïene wat DNS-volgordes by die teikenlokus herken, is bekend in die kuns. Geen-teikenvektore word ook aangewend om homoloë rekombinasie te fasiliteer. In die afwesigheid van 'n geen-teikenvektor vir homologie-gerigte herstel, sluit die selle gereeld die dubbelstring-breuk deur nie-homologous end-verbinding (NHEJ) wat kan lei tot delesie of invoeging van veelvuldige nukleotiede by die splitsingsplek. Indien invoegings of delesies (InDels) plaasvind, as sodanig, word 'n klein aantal nukleotiede óf ingevoeg óf lukraak op die plek van die breek uitgevee en hierdie InDels kan enige oop leesraam (ORF) van 'n geen binne die teiken verskuif of ontwrig. lokus. Dit word verstaan ​​dat die lokus wat as SEQ ID NO:1 (of SEQ ID NO:4) geïdentifiseer is, nie 'n geenkoderende streek is nie. Gevolglik word geen ontwrigting van endogene geentranskripsie in die vooruitsig gestel deur invoeging en/of verwydering by hierdie lokus nie.

Homologie-gerigte herstel (of homologie-gerigte rekombinasie) (HDR) is veral nuttig vir die invoeging of integrering van gene by die vaklokus. 'n Skenkerkonstruksie bestaan ​​uit homoloë arms afgelei van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4 soos hierin beskryf.

Geengerigte vektorkonstruksie en nukleaseseleksie is binne die vaardigheid van die vakman op wie hierdie uitvinding betrekking het.

In sommige voorbeelde herken sinkvingernukleases (ZFN'e), wat 'n modulêre struktuur het en individuele sinkvingerdomeine bevat, 'n spesifieke 3-nukleotiedvolgorde in die teikenvolgorde (bv. plek van geteikende integrasie). Sommige belichamings kan ZFN'e gebruik met 'n kombinasie van individuele sinkvingerdomeine wat op veelvuldige teikenreekse gerig is.

Transkripsie-aktiveerder-agtige (TAL) effektor nukleases (TALENs) kan ook gebruik word vir plek-spesifieke genoom redigering. TAL effektorproteïen DNA-bindende domein word tipies gebruik in kombinasie met 'n nie-spesifieke splitsingsdomein van 'n beperkingsnuklease, soos FokI. In sommige belichamings word 'n samesmeltingsproteïen wat 'n TAL-effektorproteïen-DNA-bindende domein en 'n beperkingsnuklease-splitsingsdomein bevat, aangewend om DNA by 'n teikenvolgorde binne die lokus van die uitvinding te herken en te splits (Boch J et al., 2009) Wetenskap 326:1509-1512).

RNA-geleide endonukleases (RGENs) is programmeerbare genoom-ingenieursinstrumente wat ontwikkel is uit bakteriese adaptiewe immuunmasjinerie. In hierdie stelsel - die gegroepeerde gereelde, gereelde tussenafstande kort palindromiese herhalings (CRISPR)/CRISPR-geassosieerde (Cas) immuunrespons - vorm die proteïen Cas9 'n volgorde-spesifieke endonuklease wanneer dit met twee RNA's gekomplekseer word, waarvan een teikenseleksie lei. RGENs bestaan ​​uit komponente (Cas9 en tracrRNA) en 'n teikenspesifieke CRISPR RNA (crRNA). Beide die doeltreffendheid van DNS-teiken-splyting en die ligging van die splitsingsplekke wissel na gelang van die posisie van 'n protospacer-aangrensende motief (PAM), 'n bykomende vereiste vir teikenherkenning (Chen, H. et al. J. Biol. Chem. aanlyn gepubliseer 14 Maart 2014, as Manuskrip M113.539726).

Strategieë vir die identifisering van volgordes wat uniek is vir die spesifieke teikenlokus van SEQ ID NO:1 is bekend in die kuns, maar belyning van baie van hierdie volgordes na die CHO-genoom openbaar potensiële buite-teiken-plekke met 16-17 basispaar-passing. Een voorbeeld van 20 bp Gids-RNA gekodeer deur die volgorde uiteengesit in SEQ ID NO:5 (wat ooreenstem met nukleotiede 1990-2001 van SEQ ID NO: 1) is nuttig vir RNA-geleide CRISPR/Cas-geenredigering van SEQ ID NO:1 of VOLGENS ID NO:4. 'n Plasmied wat 'n promotor bevat wat uitdrukking van die klein geleide RNA en 'n tracrRNA (byvoorbeeld SEQ ID NO:6) aandryf, sowel as wat 'n geskikte Cas9-ensiem onder beheer van 'n promotor dra, kan mede-getransfekteer word met 'n skenkervektor ( dra die geen van belang wat deur 5'- en 3'-homologie-arms geflankeer word) om geteikende integrasie deur hierdie metode te gebruik. Verskeie modifikasies en variante van die RNA-molekules bykomend tot dié wat hierbo beskryf is, is duidelik vir diegene wat op die gebied vaardig is en is bedoel om binne die omvang van die uitvinding te val.

In sommige belichamings bestaan ​​die voertuig vir die inbring, in die genoom, van 'n eksogene nukleïensuur wat 'n volgorde bevat wat vir die geen van belang of herkenningsvolgorde of geenkasset kodeer, na gelang van die geval, 'n vektor wat die eksogene nukleïensuur dra en een of meer addisionele vektore of mRNA. In een belichaming bestaan ​​die een of meer bykomende vektore of mRNA uit 'n nukleotiedvolgorde wat vir 'n plekspesifieke nuklease kodeer, insluitend maar nie beperk nie tot 'n sinkvingernuklease (ZFN), 'n ZFN dimeer, 'n transkripsie-aktiveerder-agtige effektornuklease (TALEN) , 'n TAL effektor domein samesmelting proteïen, en 'n RNA-geleide DNA endonuklease. In sekere belichamings bestaan ​​die een of meer vektore of mRNA uit 'n eerste vektor wat 'n gids-RNA, 'n tracrRNA en 'n nukleotiedvolgorde wat vir 'n Cas-ensiem kodeer, en 'n tweede vektor wat 'n skenker (eksogene) nukleotiedvolgorde bevat. Sodanige skenkervolgorde bestaan ​​uit 'n nukleotiedvolgorde wat kodeer vir die geen van belang, of die herkenningsvolgorde, of die geenkasset wat enige een van hierdie eksogene elemente bevat wat bedoel is vir geteikende invoeging. Waar mRNA gebruik word, kan die mRNA in die sel getransfekteer word deur middel van algemene transfeksiemetodes wat aan die kundige persoon bekend is en kan 'n ensiem kodeer, byvoorbeeld 'n transposase of endonuklease. Alhoewel 'n mRNA wat in die selle ingebring word verbygaande kan wees en nie in die genoom integreer nie, kan die mRNA 'n eksogene nukleïensuur dra wat nodig of voordelig is vir die integrasie om plaas te vind. In sommige gevalle word mRNA gekies om enige risiko van langdurige newe-effekte van 'n bykomende polinukleotied uit te skakel, waar slegs korttermyn uitdrukking nodig is om die gewenste integrasie van 'n GOI te bereik.

Nog ander metodes van homoloë rekombinasie is beskikbaar vir die bekwame vakman, soos BuD-afgeleide nukleases (BuDNs) met presiese DNA-binding spesifisiteite (Stella, S. et al. Acta Crystal. 2014, D70, 2042-2052). Presiese genoommodifikasiemetodes word gekies op grond van die beskikbare gereedskap wat versoenbaar is met unieke teikenvolgordes binne SEQ ID NO:1 sodat ontwrigting van die selfenotipe vermy word.

Gene-teikenkonstrukte

Die polinukleotiedvolgorde wat in die gasheergenoom geïntegreer moet word, kan enige industrieel bruikbare DNS-volgorde wees, soos 'n herkenningsvolgorde, vir die generering van sellulêre uitdrukkingstelsels. Die polinukleotiedvolgorde wat in die gasheergenoom geïntegreer moet word, kan enige terapeuties of industrieel bruikbare proteïen of proteïene kodeer soos hierin beskryf. Die identifisering van die teikenvolgorde binne die teikenlokus om die eksogene nukleïensuurvolgorde te integreer, hang af van 'n aantal faktore. Afhangende van die metode van homoloë rekombinasie wat gebruik word, is dit binne die vaardigheid van die vakman om volgordes te kies wat homoloog is aan SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO: 4. Plekspesifieke nukleasevektore, wanneer dit gebruik word, benodig addisionele komponente (sekwensiesamestellings) ) wat die spesifieke plek herken wat bedoel is vir DNS-splyting.

As sodanig inkorporeer 'n geen-teikenkonstruksie tipies sulke nukleotiedvolgordes wat die geteikende integrasie van 'n eksogene nukleïensuurvolgorde in die lokus van belang fasiliteer. In sommige belichamings bestaan ​​die konstruksie uit 'n eerste homoloë arm en 'n tweede homoloë arm. In ander belichamings bestaan ​​die konstruksie (bv. 'n geenkasset) uit homoloë arms afgelei van SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4. In sommige belichamings bestaan ​​die homologie-arms uit 'n nukleotiedvolgorde wat homoloog is aan 'n nukleotiedvolgorde teenwoordig in SEQ ID NO:1 of SEQ ID NO:4. In spesifieke belichamings bestaan ​​die konstruksie uit 'n 5' homologie-arm met die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO: 2 (wat ooreenstem met nukleotiede 1001-2001 van SEQ ID NO: 1), en 'n 3' homologie-arm met die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO: 1 NO:3 (wat ooreenstem met nukleotiede 2022-2001 van SEQ ID NO: 1). Homoloë arms, byvoorbeeld 'n eerste homoloë arm (ook genoem 5' homologie arm) en 'n tweede homoloë arm (ook genoem 3' homologie arm) is homoloog aan 'n geteikende volgorde binne die lokus. Die homoloë arms van 5' tot 3' kan 'n streek of geteikende volgorde binne die lokus uitbrei wat ten minste 1 kb, of ten minste ongeveer 2 kb, of ten minste ongeveer 3 kb, of ten minste ongeveer 4 kb, of ten minste 5 kb, of ten minste ongeveer 10 kb. In ander belichamings bestaan ​​die totale aantal nukleotiede van 'n geteikende volgorde wat vir 'n eerste en tweede homoloë arm gekies is, ten minste 1 kb, of ten minste ongeveer 2 kb, of ten minste ongeveer 3 kb, of ten minste ongeveer 4 kb, of by ten minste 5 kb, of ten minste ongeveer 10 kb. In sommige gevalle bestaan ​​die afstand tussen die 5'-homologie-arm en die 3'-homologie-arm (homolog aan die geteikende volgorde) ten minste 5 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, of ten minste 1 kb, of ten minste ongeveer 2 kb, of by ten minste ongeveer 3 kb, of ten minste ongeveer 4 kb, of ten minste 5 kb, of ten minste ongeveer 10 kb. In gevalle waar SEQ ID NO: 2 en SEQ ID NO: 3 as 5' en 3' homologie-arms gekies word, kan die afstand tussen die twee homologie-arms 20 nukleotiede wees (wat ooreenstem met nukleotiede 2002-2021 van SEQ ID NO: 1) en sulke homologie-arms kan integrasie van 'n eksogene nukleïensuurvolgorde binne 'n lokus wat SEQ ID NO: 1 bevat, bv binne nukleotiede 1990-2021 of 2002-2021 van SEQ ID NO: 1, en 'n gelyktydige delesie van nukleotiede 2002-2021 bemiddel. van SEQ ID NO: 1.

In ander belichamings bestaan ​​die konstruksie uit 'n eerste homoloë arm en 'n tweede homoloë arm, waarin die eerste en tweede homoloë arms gekombineer 'n geteikende volgorde bevat wat 'n endogene volgorde binne die lokus vervang. In nog ander belichamings bestaan ​​die eerste en tweede homoloë arms uit 'n geteikende volgorde wat integreer of invoeg binne 'n endogene volgorde binne die lokus.

Gemodifiseerde sellyne is geskep deur een of meer rekombinase-herkenningsplekke op 'n plek binne SEQ ID NO:1 te integreer. Hierdie gemodifiseerde sellyne kan ook addisionele eksogene gene insluit vir negatiewe of positiewe seleksie van die uitgedrukte geen van belang.

Die uitvinding verskaf metodes vir die wysiging van 'n CHO-sel genoom wat behels die inbring van een of meer vehikels in die sel, waarin die een of meer vehikels 'n eksogene nukleïensuur bevat wat 'n volgorde vir integrasie, 'n 5' homologie arm homoloog is aan 'n volgorde teenwoordig in die nukleotied volgorde van SEQ ID NO:1, en 'n 3' homologie-arm homoloog aan 'n volgorde teenwoordig in die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1. In sommige belichamings verskaf die metodes verder een of meer vehikels wat 'n nuklease en samestellings vir plekspesifieke DNA-splyting by die integrasieplek bevat.

Die gemodifiseerde sellyne kan as gerieflike en stabiele uitdrukkingstelsels vir rekombinase-gemedieerde kassetuitruiling (RMCE) gebruik word. 'n Nukleïensuurvolgorde wat 'n proteïen van belang kodeer, kan gerieflik geïntegreer word in die gemodifiseerde sel wat SEQ ID NO:1 of 'n uitdrukking-verbeterende fragment daarvan bevat, met ten minste een rekombinase-herkenningsplek, byvoorbeeld, deur 'n RMCE-proses.

Rekombinante uitdrukkingsvektore kan sintetiese of cDNA-afgeleide DNA-fragmente bevat wat vir 'n proteïen kodeer, operasioneel gekoppel aan 'n geskikte transkripsie- en/of translasie-regulerende element afgelei van soogdier-, virale of insekgene. Sulke regulatoriese elemente sluit in transkripsionele promotors, versterkers, volgordes wat vir geskikte mRNA ribosomale bindingsplekke kodeer, en volgordes wat die terminering van transkripsie en translasie beheer, soos hieronder in detail beskryf. Soogdier-uitdrukkingsvektore kan ook nie-getranskribeerde elemente soos 'n oorsprong van replikasie, ander 5'- of 3'-flankerende nie-getranskribeerde rye, en 5'- of 3'-nie-getranskribeerde volgordes soos splitskenker- en -ontvangerplekke bestaan. 'n Selekteerbare merkergeen om herkenning van transfektante te fasiliteer, kan ook geïnkorporeer word.

Fluorescerende merkers is geskikte selekteerbare merkergene vir die herkenning van geenkassette wat suksesvol ingevoeg en/of vervang is, na gelang van die geval. Voorbeelde van fluoresserende merkers is welbekend in die kuns, insluitend, maar nie beperk nie tot Discosoma koraal (DsRed), groen fluoresserende proteïen (GFP), verbeterde groen fluoresserende proteïen (eGFP), siano fluoresserende proteïen (CFP), verbeterde siano fluoresserende proteïen (eCFP), geel fluoresserende proteïen (YFP), verbeterde geel fluoresserende proteïen (eYFP) en verrooi fluoresserende proteïen (bv. mKate, mKate2, mPlum, mRaspberry of E2-crimson. Sien ook bv. Nagai, T., et al. 2002 Natuur Biotegnologie 20:87-90 Heim, R. et al. 23 Februarie 1995 Natuur 373:663-664 en Strack, R.L. et al. 2009 Biochemie 48:8279-81.

Transkripsie- en translasiebeheervolgordes in uitdrukkingsvektore wat nuttig is vir die transfektering van vertebraatselle kan deur virale bronne verskaf word. Byvoorbeeld, algemeen gebruikte promotors en versterkers is afgelei van virusse soos polioom, adenovirus 2, aapvirus 40 (SV40) en menslike sitomegalovirus (CMV). Virale genomiese promotors, kontrole en/of seinvolgordes kan gebruik word om uitdrukking te dryf, mits sulke kontrole volgordes versoenbaar is met die gasheersel wat gekies is. Nie-virale sellulêre promotors kan ook gebruik word (bv. die β-globien en die EF-1α promotors), afhangende van die seltipe waarin die rekombinante proteïen uitgedruk moet word.

DNA-volgordes afgelei van die SV40 virale genoom, byvoorbeeld die SV40 oorsprong, vroeë en laat promotor, versterker, splitsing, en polyadenylation plekke kan gebruik word om ander genetiese elemente te verskaf wat nuttig is vir uitdrukking van 'n heteroloë DNA volgorde. Vroeë en laat promotors is veral nuttig omdat beide maklik verkry word vanaf die SV40-virus as 'n fragment wat ook die SV40 virale oorsprong van replikasie uitmaak (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Kleiner of groter SV40-fragmente kan ook gebruik word. Tipies word die ongeveer 250 bp-volgorde wat strek vanaf die Hind III-plek na die BglI-plek geleë in die SV40-oorsprong van replikasie ingesluit.

Bisistroniese uitdrukkingsvektore wat gebruik word vir die uitdrukking van veelvuldige transkripsies is voorheen beskryf (Kim S. K. en Wold B. J., Cell 42:129, 1985) en kan in kombinasie met 'n uitdrukking-verbeterende volgorde van die uitvinding gebruik word, bv. SEQ ID NO:1, of 'n fragment daarvan. Ander tipes uitdrukkingsvektore sal ook bruikbaar wees, byvoorbeeld dié wat in U.S. Pat. No. 4,634,665 (Axel et al.) en U.S. Pat. No. 4,656,134 (Ringold et al.).

Proteïene van belang

Enige proteïen van belang wat geskik is vir uitdrukking in eukariotiese selle kan gebruik word. Die proteïen van belang sluit byvoorbeeld in, maar is nie beperk nie tot, 'n teenliggaam of antigeenbindende fragment daarvan, 'n chimeriese teenliggaam of antigeenbindende fragment daarvan, 'n ScFv of fragment daarvan, 'n Fc-fusieproteïen of fragment daarvan, 'n groeifaktor of 'n fragment daarvan, 'n sitokien of 'n fragment daarvan, of 'n ekstrasellulêre domein van 'n seloppervlakreseptor of 'n fragment daarvan. Proteïene van belang kan eenvoudige polipeptiede wees wat uit 'n enkele subeenheid bestaan, of komplekse multisubeenheidproteïene wat uit twee of meer subeenhede bestaan.

Gasheerselle en transfeksie

Die gasheerselle wat in die metodes van die uitvinding gebruik word, is soogdiergasheerselle insluitend, byvoorbeeld, Chinese hamster-ovarium (CHO) selle en muisselle. In 'n voorkeuruitvoeringsvorm verskaf die uitvinding 'n nukleïensuurvolgordefragment van SEQ ID NO:1 wat 'n uitdrukking-verbeterende volgorde in 'n CHO-sel kodeer. 'n Integrasiewebwerf kan gevind word binne SEQ ID NO:1, of enige fragment van SEQ ID NO:1. 'n Integrasieplek kan byvoorbeeld 'n rekombinase-herkenningsplek wees wat binne SEQ ID NO:1 geplaas is, of enige fragment van SEQ ID NO:1. Een voorbeeld van 'n geskikte integrasiewebwerf is 'n LoxP-werf. Nog 'n voorbeeld van 'n geskikte integrasieperseel is twee rekombinase-herkenningsterreine, byvoorbeeld, gekies uit die groep wat bestaan ​​uit 'n LoxP-terrein, 'n Lox511-perseel, 'n Lox2272-terrein, 'n Lox2372-perseel, 'n Loxm2-perseel, 'n Lox71-werf, 'n Lox66-perseel en 'n Lox5171-werf. In ander belichamings is die integrasieperseel geleë op 'n posisie binne 'n volgorde of aangrensend aan 'n posisie binne 'n volgorde gekies uit die groep bestaande uit nukleotiede wat oor posisies nommer 10-4,000 100-3,900 200-3,800 300-3,700 400-3,0600 5 3.500 600-3,400 700-3,300 800-3,200 900-3,100 1,000-3,000 1,100-2,900 1,200-2,800 1,300-2,700 1,200-2,600 1,300-2,500 1,400-2,400 1,500-2,300 1,600-2,200 1,700-2100 1,800-2050 1850-2050, 1,900-2040 1950-2,025, 1990-2021, 2002-2021 en 2,010-2,015 van SEQ ID NO:1.In sekere belichamings word die integrasieperseel by 'n posisie binne SEQ ID NO:1 of aangrensend aan 'n posisie binne SEQ ID NO:1 gekies uit die groep wat bestaan ​​uit nukleotiede wat oor posisies nommer 1990-1991, 1991-1992, 1992-1993, 1993-1994, 1995-1996, 1996-1997, 1997-1998, 1999-2000, 2001-2002, 2002-2003; 2009, 2009-2010, 2010-2011, 2011-2012, 2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016; van SEQ ID NO:1.

Die uitvinding sluit 'n soogdiergasheersel in wat getransfekteer is met 'n uitdrukkingsvektor of 'n mRNA van die uitvinding. Alhoewel enige soogdiersel gebruik kan word, is die gasheersel in een spesifieke belichaming 'n CHO-sel.

Getransfekteerde gasheerselle sluit selle in wat getransfekteer is met uitdrukkingsvektore of mRNA-molekules wat 'n volgorde bevat wat 'n proteïen of polipeptied kodeer. Uitgedrukte proteïene kan in die kweekmedium afgeskei word, afhangende van die nukleïensuurvolgorde wat gekies is, maar kan in die sel behou word of in die selmembraan gedeponeer word. Verskeie soogdierselkultuurstelsels kan gebruik word om rekombinante proteïene uit te druk. Ander sellyne wat vir spesifieke seleksie- of amplifikasieskemas ontwikkel is, sal ook bruikbaar wees met die metodes en samestellings wat hierin verskaf word, mits 'n teikenlokus met ten minste 80% homologie met SEQ ID NO:1 geïdentifiseer is. 'n Beliggaamde sellyn is die CHO-sellyn wat K1 aangedui word. Om hoë volume produksie van rekombinante proteïene te bewerkstellig, kan die gasheersellyn in die toepaslike geval vooraf by bioreaktormedium aangepas word.

Verskeie transfeksieprotokolle is in die vakgebied bekend en word in Kaufman (1988) Meth. Enzymology 185:537. Die transfeksieprotokol wat gekies word, sal afhang van die gasheerseltipe en die aard van die GOI, en kan gekies word op grond van roetine-eksperimentering. Die basiese vereistes van enige sodanige protokol is om eers DNS wat vir die proteïen van belang kodeer in 'n geskikte gasheersel in te voer, en dan om gasheerselle te identifiseer en te isoleer wat die heteroloë DNS op 'n relatief stabiele, uitdrukbare wyse geïnkorporeer het. mRNA-molekules wat proteïene kodeer wat bruikbaar is vir integrasie in die gasheerselgenoom of ander funksie kan verbygaande wees en dus tydsbeperk.

Transfeksieprotokolle sowel as protokolle vir die inbring van polipeptiede of polinukleotiedvolgordes in selle kan verskil. Nie-beperkende transfeksiemetodes sluit in chemiese gebaseerde transfektiemetodes, insluitend die gebruik van liposome nanopartikels kalsiumfosfaat (Graham et al. (1973). Virologie 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci VSA 74 (4): 1590-4 en, Kriegler, M (1991). Oordrag en uitdrukking: 'n Laboratoriumhandleiding. New York: W.H. Freeman and Company. pp. 96-97) dendrimere of kationiese polimere soos DEAE-dekstraan of poiëtilenimien. Nie-chemiese metodes sluit elektroporasie Sono-porasie en optiese transfeksie in. Deeltjie-gebaseerde transfeksie sluit in die gebruik van 'n geengeweer, magneetgesteunde transfeksie (Bertram, J. (2006) Huidige farmaseutiese biotegnologie 7, 277-28). Virale metodes kan ook vir transfeksie gebruik word. mRNA-aflewering sluit metodes in wat TransMessenger™ en TransIT® gebruik (Bire et al. BMC Biotegnologie 2013, 13:75).

Een algemeen gebruikte metode om heteroloë DNA in 'n sel in te voer, is kalsiumfosfaatpresipitasie, byvoorbeeld, soos beskryf deur Wigler et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980). DNS wat deur hierdie metode in 'n gasheersel ingebring word, ondergaan gereeld herrangskikking, wat hierdie prosedure bruikbaar maak vir kotransfeksie van onafhanklike gene.

Poliëtileen-geïnduseerde samesmelting van bakteriële protoplaste met soogdierselle (Schaffner et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163) is nog 'n nuttige metode om heteroloë DNA in te voer. Protoplast-fusieprotokolle lewer dikwels veelvuldige kopieë van die plasmied-DNS wat in die soogdiergasheerselgenoom geïntegreer is, en hierdie tegniek vereis dat die seleksie- en amplifikasiemerker op dieselfde plasmied as die GOI is.

Elektroporasie kan ook gebruik word om DNS direk in die sitoplasma van 'n gasheersel in te voer, byvoorbeeld, soos beskryf deur Potter et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161, 1988) of Shigekawa et al. (BioTechniques 6:742, 1988). Anders as protoplastfusie, vereis elektroporasie nie dat die seleksiemerker en die GOI op dieselfde plasmied is nie.

Ander reagense wat nuttig is om heteroloë DNA in 'n soogdiersel in te voer, is beskryf, soos Lipofectin™ Reagens en Lipofectamine™ Reagens (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.). Beide hierdie kommersieel beskikbare reagense word gebruik om lipied-nukleïensuurkomplekse (of liposome) te vorm wat, wanneer dit op gekweekte selle toegedien word, opname van die nukleïensuur in die selle vergemaklik.

In een belichaming word die inbring van een of meer van die polinukleotiede in 'n sel bemiddel deur elektroporasie, deur intrasitoplasmiese inspuiting, deur 'n virale infeksie, deur 'n adenovirus, deur lentivirus, deur retrovirus, deur transfeksie, deur lipied-bemiddelde transfeksie of word bemiddel. via Nucleoection™.

'n Metode vir die amplifisering van die GOI is ook wenslik vir uitdrukking van die rekombinante proteïen, en behels tipies die gebruik van 'n seleksiemerker (hersien in Kaufman supra). Weerstand teen sitotoksiese middels is die eienskap wat die meeste as 'n seleksiemerker gebruik word, en kan die resultaat wees van óf 'n dominante eienskap (bv. kan onafhanklik van gasheerseltipe gebruik word) óf 'n resessiewe eienskap (bv. nuttig in spesifieke gasheerseltipes) wat gebrekkig is in watter aktiwiteit ook al gekies word). Verskeie amplifiseerbare merkers is geskik vir gebruik in die uitdrukkingsvektore van die uitvinding (bv. soos beskryf in Sambrook, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N Y, 1989 bl 16.9-16.14).

Nuttige selekteerbare merkers vir geenamplifikasie in geneesmiddelweerstandige soogdierselle word in Tabel 1 van Kaufman, RJ, supra, getoon en sluit in DHFR-MTX-weerstand, P-glikoproteïen en veelvuldige geneesmiddelweerstand (MDR)-verskeie lipofiele sitotoksiese middels (bv. adriamisien) , kolgisien, vinkristien), en adenosiendeaminase (ADA)-Xyl-A of adenosien en 2'-deoksikoformisien.

Ander dominante selekteerbare merkers sluit in mikrobiese afgeleide antibiotika-weerstandsgene, byvoorbeeld neomisien-, kanamisien- of higromisienweerstandigheid. Daar is egter nie getoon dat hierdie seleksiemerkers versterkbaar is nie (Kaufman, R. J., supra,). Verskeie geskikte seleksiestelsels bestaan ​​vir soogdiergashere (Sambrook supra, bl 16.9-16.15). Ko-transfeksieprotokolle wat twee dominante selekteerbare merkers gebruik, is ook beskryf (Okayama en Berg, Mol. Cell Biol 5:1136,1985).

Nuttige regulatoriese elemente, voorheen beskryf of bekend in die kuns, kan ook ingesluit word in die nukleïensuurkonstrukte wat gebruik word om soogdierselle te transfekteer. Die transfeksieprotokol wat gekies word en die elemente wat vir gebruik daarin gekies word, sal afhang van die tipe gasheersel wat gebruik word. Diegene met vaardighede in die kuns is bewus van talle verskillende protokolle en gasheerselle, en kan 'n geskikte stelsel kies vir uitdrukking van 'n verlangde proteïen, gebaseer op die vereistes van die selkultuurstelsel wat gebruik word.

Ander kenmerke van die uitvinding sal duidelik word in die loop van die volgende beskrywings van voorbeeldige belichamings wat gegee word vir illustrasie van die uitvinding en nie bedoel is om dit te beperk nie.

Die volgende voorbeelde word gestel om diegene met gewone vaardighede in die kuns te verskaf hoe om die metodes en samestellings wat hierin beskryf word te maak en te gebruik, en is nie bedoel om die omvang van die uitvinding te beperk nie. Pogings is aangewend om akkuraatheid te verseker met betrekking tot getalle wat gebruik word (bv. hoeveelheid, temperatuur, ens.), maar sommige eksperimentele foute en afwykings moet in ag geneem word. Tensy anders aangedui, is dele dele volgens gewig, molekulêre gewig is gemiddelde molekulêre gewig, temperatuur is in grade Celsius, en druk is by of naby atmosferiese.

Voorbeeld 1. Identifikasie van lokus van belang en karakterisering van integrasieterreine

CHO K1-selle is getransfekteer met twee plasmiede wat teenliggaamvolgordes en selekteerbare antibiotika-weerstandsgene as selekteerbare merkers bevat. Seleksie van stabiele transfektante is uitgevoer deur selle uit te brei in die teenwoordigheid van antibiotika. Individuele selklone wat hoë vlakke van teenliggaampies uitdruk, is geïsoleer met FASTR® sorteertegnologie (sien U.S. Pat. No. 8,673,589B2). Verskeie klone wat die hoogste teenliggaam uitdrukkingsvlakke toon, is geïdentifiseer.

Die genomiese DNA van hierdie klone is gefragmenteer met Covaris Adaptive Focused Acoustics (AFA)™-tegnologie (Fisher, S. et al. 2011), Genoombiologie 12:R1). DNA-biblioteke is gegenereer (Agilent SureSelectXT #G9612A) en geïnkubeer met pasgemaakte gebiotinileerde RNA-aas (Agilent SureSelectXT #5190-4811) wat ontwerp is teen die hele plasmiedvolgorde wat in CHO-selle ingebring is. Genomiese DNA-fragmente wat plasmiedvolgordes bevat, is met magnetiese Streptavidien-krale verryk en aan Illumina MiSeq-volgordebepaling onderwerp om die plasmied-integrasieplekke te identifiseer. Fusievolgordes wat beide plasmiedvolgorde en CHO genoomvolgorde bevat, is ontleed en belyn met die CHO genoom. 'n Enkele integrasieplek is bevestig deur Southern klad analise en PCR gevolg deur volgordebepaling. Die integrasieplek met die nukleotiedvolgorde van SEQ ID NO:1 is geïdentifiseer as 'n uitdrukking hotspot (sien ook GenBank Lokus ID No. AFTD01150902.1, nt35529:39558). Die integrasieplekke is ontleed om hul geskiktheid vir verdere generering van sellyne te bepaal. Dit was wenslik dat die integrasieplekke in 'n nie-koderende streek geleë is wat nie die sel se normale genomiese masjinerie ontwrig nie, bv. translasie van proteïene, of verander die sel se fenotipe.

Van Blat-soektog (Kent W J., BLAT—die BLAST-agtige belyningsinstrument. Genoom Res. 2002 April 12(4):656-64) belyning, SEQ ID NO:1 deel baie lae homologie met muis- en menslike genoomvolgordes. Opeenvolging ontploffing van SEQ ID NO:1 teen CHO-1[ATCC]_refseq_transcript het aan die lig gebring dat die geïdentifiseerde lokusvolgorde geen koderende streke vir enige bekende gene bevat nie. Die breër volgorde van SED ID NO:4, wat SEQ ID NO:1 insluit, is ook geïdentifiseer as 'n lokus geskik vir geteikende integrasie.

Die integrasieplekvolgordes is bepaal om in nie-koderende streke van die CHO en muisgenome geleë te wees, en verder gebruik in die hieronder beskryfde eksperimente.

Voorbeeld 2. Eksogene DNA doeltreffend geïnkorporeer in gasheersel-integrasieterreine

Geteikende invoeging van eksogene gene in die spesifieke lokus van die CHO-genoom wat as SEQ ID NO:1 geïdentifiseer is, is gedoen deur gebruik te maak van 'n TALE-nuklease (TALEN). Die konstruk wat teenliggaam swaar en ligte ketting volgordes bevat wat ewekansig in die sel genoom geïntegreer is, soos in Voorbeeld 1, is geteiken deur TALEN. TALEN is geteiken op liggings binne die drie identiese Hyg-gene van die teenliggaamuitdrukkingkonstruksie (sien FIG. 1A). Die TALEN-teikensplitsingsplek vir die Hyg-volgorde was gebaseer op ZiFit.partners.org (ZiFit Targeter Weergawe 4.2). TALENs is ontwerp op grond van bekende metodes (Boch J et al., 2009 Science 326:1509-1512).

'n Skenker-mKate-vektor (sien FIG. 1B) en TALEN-koderende vektor is in die CHO-gasheerselle getransfekteer deur gebruik te maak van standaard Lipofectin protokol (LIPOFECTAMINE, Life Technologies, Gaithersburg, Md.). Selle is gekweek en stabiele klone met gewenste kenmerke is geïsoleer en volgens FACS gesorteer. Enkele integrasie in die verlangde lokus is bevestig deur Southern blot en PCR.

Voorbeeld 3. Geteikende herkombinasie van die gemanipuleerde selle by die lokus van belang deur RMCE

'n CHO-sellyn wat hoë vlakke van 'n fluoresserende geen uitdruk, bv. mKate, waarin die geen deur lox-plekke binne die lokus van belang geflankeer word, is vir isolasie geselekteer. 'n Tweede CHO-sellyn wat 'n tweede fluoresserende geen, dsRed, uitdruk, waarin die geen deur lox-plekke geflankeer word, is geleë binne 'n kontrole lokus, dit wil sê EESYR (V.S. Pat. No. 8,389,239B2, uitgereik 5 Maart 2013).

Getransfekteerde CHO-selle is aangepas om in suspensie in 'n serumvrye produksiemedium te groei. Die selle is dan getransfekteer in 'n tien sentimeter plaat met 'n skenker uitdrukkingsvektor en 'n plasmied wat Cre rekombinase kodeer. Die skenker-uitdrukkingsvektor bevat 'n geen van belang wat kodeer vir 'n Fc-fusieproteïen wat deur Lox-plekke geflankeer word (sien FIG. 3A of 3B). Selle is gekweek in kultuurmedium met 400 μg/ml higromisien vir twee weke na transfeksie, en selle wat eYFP uitdruk maar nie mKate nie (of dsRed in die geval van EESYR lokus integrasie) is geïsoleer met behulp van vloeisitometrie. Selle wat eYFP uitdruk, is uitgebrei in suspensiekulture in serumvrye produksiemedium, en mRNA-vlakke is bepaal deur qRT-PCR met behulp van standaardprosedures vir elke selpoel wat die Fc-fusieproteïen kodeer (sien FIG. 4).

Rekombinasie-uitruildoeltreffendheid (persentasie populasie van oorlewende selle wat uit die skenkerkassetmerker, d.w.s. eYFP, uitgeruil word, soos uitgeruil met die rooi merker, d.w.s. mKate of dsRed) is vergelyk tussen selpoele (Tabel 1). Hoë rekombinasie-uitruildoeltreffendheid is by elke lokus waargeneem.

Transkripsie is waargeneem teen 'n hoër tempo (1.5 maal hoër) in die selpoel met 'n gemanipuleerde LOCUS1 in vergelyking met die Kontrole Lokus (FIG. 4).

Die huidige uitvinding moet nie in omvang beperk word deur die spesifieke belichamings wat hierin beskryf word nie. Inderdaad, verskeie modifikasies van die uitvinding bykomend tot dié wat hierin beskryf word, sal duidelik word vir diegene wat op die gebied vaardig is uit die voorafgaande beskrywing en die meegaande figure. Sodanige wysigings is bedoel om binne die omvang van die aangehegte eise te val.