Inligting

Hoe en hoekom word selle in mens-knaagdier hibriede selbiologie bestraal?

Hoe en hoekom word selle in mens-knaagdier hibriede selbiologie bestraal?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wanneer mens-knaagdierbasters gemaak word, kan die hoeveelheid menslike chromosoom in die baster deur bestraling verminder word. Waarom en presies hoe word hierdie bestralingstap uitgevoer?


Menslike selle word met X-strale bestraal (om die DNA te fragmenteer) en dan met knaagdierselle saamgesmelt. Dit is nuttig vir kartering omdat nou-gekoppelde merkers meer geneig is om in dieselfde baster te verskyn: daar is 'n laer waarskynlikheid van bestraling-geïnduseerde breek tussen die merkers omdat hulle naby mekaar is.


Proses van Cybrids Produksie | Biotegnologie

In hierdie artikel sal ons die proses van kubriedproduksie bespreek.

Dit is sitoplasmiese basters. In sibride vorm kern van een ouer en sitoplasma van albei die ouers sitoplasmiese basters. Meer presies, kubriede kan bewerkstellig word deur protoplast wat afkomstig is van een van die ouerplante te versmelt met ontkernde protoplast van ander.

Cybriede kan ook verkry word deur verskeie ander maniere soos chemiese behandeling van protoplast om metaboliese inaktivering of toediening van X-straal- of gamma-bestraling op een van die ouertipes protoplaste te veroorsaak wat lei tot inaktivering of nie-verdelende status van protoplast.

Percoll-gradiënttegniek word wyd gebruik vir die produksie van ontkernde protoplaste deur hoëspoedsentrifugering tot 35 000 × g vir 50-90 minute deur gebruik te maak van percoll (10-40%) digtheidsgradiënt.

Die geïsoleerde ontkiemde protoplast word dan gebruik om met ander protoplaste te versmelt om kubriede te bewerkstellig (Fig. 10.3). In 'n ander benadering, wanneer protoplaste saamgesmelt word, kan hul kern samesmelting ondergaan om ware baster te produseer of apart bly sonder samesmelting. As eliminasie van een van die kerne plaasvind met die behoud van die ander in 'n gemengde sitoplasma, is die resulterende produk 'n kubried.

Cybrids kan gebruik word om manlike steriliteit (deur mitochondriale genoom) of onkruiddoderweerstand (deur chloroplastgenoom) karakters oor te dra via sitoplasmiese oorgeërfde proses.

Byvoorbeeld, sitoplasma manlike steriele karakter (cms) is suksesvol oorgedra van N. tobaccum na N. sylvestris en van N. campestris na Brassica napus. Net so, van Lycopersicum esculentum tot Solarium acaule na protoplastsamesmelting.


OORSPRONKLIKE NAVORSING artikel

Timothy A. Wiles 1 , Anita Hohenstein 1,2, Laurie G. Landry 3 , Mylinh Dang 1, Roger Powell 1, Perrin Guyer 4, Eddie A. James 4 , Maki Nakayama 2,3, Kathryn Haskins 2, Thomas Delong 1 en Rocky L. Baker 2*
  • 1 Departement Farmaseutiese Wetenskappe, Universiteit van Colorado Skaggs Skool vir Farmaseutiese Wetenskappe, Aurora, CO, Verenigde State
  • 2 Departement Immunologie en Mikrobiologie, Universiteit van Colorado Skool vir Geneeskunde, Aurora, CO, Verenigde State
  • 3 Barbara Davis Sentrum vir Kinderdiabetes, Universiteit van Colorado Skool vir Geneeskunde, Aurora, CO, Verenigde State
  • 4 Departement van Translationele Navorsing, Benaroya Navorsingsinstituut by Virginia Mason, Seattle, WA, Verenigde State

Hibriede insulienpeptiede (HIP's), wat bestaan ​​uit insulienfragmente wat met ander peptiede van β-sel sekretoriese korrelproteïene saamgesmelt is, is CD4 T-sel-outo-antigene in tipe 1-diabetes (T1D). Ons het HIP's en HIP-reaktiewe CD4 T-selle breedvoerig bestudeer in die konteks van die nie-vetsugtige diabetiese (NOD) muismodel van outo-immuun diabetes en het getoon dat CD4 T-selle spesifiek vir HIP's groot bydraers tot siektepatogenese is. Daarbenewens, in die menslike konteks, kan HIP-reaktiewe CD4 T-selle gevind word in die eilandjies en perifere bloed van T1D pasiënte. Hier het ons 'n in-diepte karakterisering van die CD4 T-selreaksie op 'n C-peptied/C-peptied HIP (HIP11) in menslike T1D uitgevoer. Ons het die TCR geïdentifiseer wat uitgedruk word deur die voorheen gerapporteerde HIP11-reaktiewe CD4 T-selkloon E2, wat uit die perifere bloed van 'n T1D pasiënt geïsoleer is, en vasgestel dat dit HIP11 herken in die konteks van HLA-DQ2. Ons het ook 'n HIP11-spesifieke TCR direk in die eilandjies van 'n T1D skenker geïdentifiseer en gedemonstreer dat hierdie TCR 'n ander minimale epitoop van HIP11 herken wat deur HLA-DQ8 aangebied word. Ons het 'n HLA-DQ2-tetrameer gegenereer en getoets wat met HIP11 gelaai is wat direkte ex vivo ondervraging van CD4 T-selreaksies op HIP11 in menslike pasiënte en kontrolevakke. Met behulp van massaspektrometriese analise het ons bevestig dat HIP11 teenwoordig is in menslike eilandjies. Hierdie werk verteenwoordig 'n belangrike stap in die karakterisering van die rol van CD4 T-selreaksies op HIP's in menslike T1D.


Inleiding

Soos die veld van kankerbiologie ontwikkel het, het 'n groeiende groep werk die kritieke rol van stamagtige selle in kanker versterk. As gevolg van lank waargenome ooreenkomste tussen embrioniese ontwikkeling en onkogenese, word kanker dikwels as 'n siekte van 𠇍isregulated development” beskou (Ma et al., 2010 Reya et al., 2001). 'n Eienskap wat deur stamselle en kankerselle gedeel word, is sellulêre plastisiteit – die vermoë om oor te skakel en alternatiewe sellots aan te neem in reaksie op omgewingseine en stressors (Thong et al., 2019). Plastisiteit is van kardinale belang vir stamselle tydens embrioniese ontwikkeling, byvoorbeeld tydens gastrulasie wanneer epiblastselle die epiteel na mesenchimale oorgang (EMT) ondergaan om mesoderm te vorm wat aanleiding gee tot die mesenchiem (Kalluri en Weinberg, 2009). In volwasse stamselle speel plastisiteit 'n belangrike rol in homeostase en wondherstel. Dit word gedemonstreer deur volwasse weefsel stamselle in die lewer en derm epiteel wat getoon is om te de-differensieer of selfs trans-differensieer in seltipes van 'n ander geslag om beskadigde selle te vervang (Merrell en Stanger, 2016). Vir kankerselle in gewasse van epiteeloorsprong, is EMT plastisiteit en sy omgekeerde MET, van kardinale belang vir primêre gewasse om mesenchimale kenmerke te kan aanneem om te versprei, metastaseer en her-epiteliseer by die metastatiese plek (Tam en Weinberg, 2013) .

Opkomende bewyse dui nou daarop dat hierdie oorgange langs 'n kontinuum plaasvind eerder as as diskrete skakelaars in seltoestand. Oorgangshibriede selle wat fenotipiese merkers van veelvuldige seltoestande (epiteel/mesenchimaal en luminaal/basaal) vertoon, is deur ons en ander in beide normale en karsinogene borsweefsel geïdentifiseer (Grosse-Wilde et al., 2015 Jolly et al., 2015 Colacino et al., 2015 Colacino et al. al., 2018). Hierdie sellulêre toestande word gedefinieer deur die mede-uitdrukking van bekende merkergene, byvoorbeeld die epiteelmerker EPCAM en die mesenchimale merker VIM, of die luminale merker KRT18 en die basale/mioepiteelmerker KRT14. Boonop toon onlangse bewyse dat hierdie basterselle in metastabiele toestande bestaan, nie net as verbygaande basters nie (Jolly et al., 2016). Hierdie hibriede populasies is van besondere belang as gevolg van hul geïmpliseerde rol in die bevordering van tumorgenese, metastase en aggressiwiteit van borskanker (Jolly et al., 2015). Daar is 'n beperkte aantal studies wat hierdie basterpopulasies in die normale bors waargeneem het, en van hierdie het die lae proporsies van basterselle wat geïdentifiseer is, dit uitdagend gemaak om te karakteriseer.

In hierdie studie integreer ons veelvuldige enkelsel-RNA-volgordebepalingsdatastelle van die mens en muis om die seltoestandverspreidings van die normale melkklier (NM) deur die hele lewensloop te karakteriseer, sowel as nadat dit in 'n verrykte stamsel versteur is. staat volg in vitro kultuur deur gebruik te maak van die voorwaardelike herprogrammering (CR) metode (Liu et al., 2017). Deur 'n gekombineerde ontleding van enkelsel-RNA-volgorde-data met grootmaat menslike borskanker-transkriptomika van die Kankergenoomatlas (TCGA), ondersoek ons ​​melkstamselpopulasies en hibriede seltoestande, wat die rol van hierdie selle in melkklierontwikkeling en kanker verduidelik.


Hoe en hoekom word selle in mens-knaagdier hibriede selbiologie bestraal? - Biologie

'n Institut de Chimie Moléculaire de l'Universityé de Bourgogne, ICMUB CNRS UMR 6302, UBFC Dijon, Frankryk
E-pos: [email protected]

b Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, IPBS, Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, Frankryk

c Équipe Labellisée la Ligue Contre le Cancer 2018, Toulouse, Frankryk
E-pos: [email protected]

Abstrak

Om DNA te beskadig is 'n huidige en doeltreffende strategie om kankerselproliferasie te beveg. Talle meganismes bestaan ​​om DNA-skade teë te werk, wat gesamentlik na verwys word as die DNA-skaderespons (DDR) en wat algemeen in kankerselle gedisreguleer word. Presiese kennis van hierdie meganismes is nodig om chemoterapeutiese DNA-teikening te optimaliseer. Nuwe navorsing oor DDR het 'n reeks belowende terapeutiese teikens, proteïene en nukleïensure ontbloot, met veral toepassing via 'n benadering waarna verwys word as kombinasieterapie of kombinatoriese sintetiese dodelikheid. In hierdie oorsig gee ons 'n opsomming van die hoeksteen-ontdekkings wat daartoe gelei het dat die DNA as 'n teenkankerteiken beskou word, en die manipulasie van DDR-bane as 'n waardevolle teenkankerstrategie. Ons beskryf in detail die DDR-sein- en herstelpaaie wat geaktiveer is in reaksie op DNA-skade. Ons som dan die huidige begrip van nie-B DNA-voue, soos G-kwadruplekse en DNA-aansluitings, op wanneer hulle gevorm word en hoekom hulle 'n meer spesifieke terapeutiese teiken kan bied in vergelyking met dié van kanoniese B-DNA. Laastens voeg ons hierdie vakke saam om die nuwe en hoogs belowende chemoterapeutiese strategie uit te beeld wat verbeterde-spesifisiteit DNA-beskadigende en DDR-teikenmiddels kombineer. Hierdie oorsig beklemtoon dus hoe chemiese biologie aanleiding gegee het tot beduidende wetenskaplike vooruitgang danksy resoluut multidissiplinêre navorsingspogings wat molekulêre en selbiologie, chemie en biofisika kombineer. Ons poog om die nie-spesialisleser 'n poort na hierdie opwindende veld te bied en die spesialisleser 'n nuwe perspektief op die jongste resultate wat behaal is en strategieë wat uitgedink is.


Muise in die wêreld van stamselbiologie

Die vermoë van embrio's om te diversifiseer en van sommige volwasse weefsels om regenereer deur die lewe is direk toe te skryf aan stamselle. Hierdie selle het die vermoë om self te vernuwe - dit wil sê om te verdeel en om bykomende stamselle te skep - en om volgens 'n spesifieke geslag te differensieer. Die differensiasie van pluripotente embrioniese stamselle langs spesifieke sellyne is gebruik om die molekulêre meganismes betrokke by weefselontwikkeling te verstaan. Die dikwels eindelose vermoë van embrioniese stamselle om gedifferensieerde seltipes te genereer, plaas die veld van stamselle by die verbinding tussen ontwikkelingsbioloë, wat gefassineer is deur die eienskappe van hierdie selle, en klinici, wat opgewonde is oor die vooruitsigte om stamselle vanaf bank tot bed om degeneratiewe afwykings en beserings te behandel waarvoor daar tans geen genesing is nie. Hier beklemtoon ons die belangrikheid van muise in stamselbiologie en om die wêreld een stap nader te bring om te sien hoe hierdie selle tot stand gebring word in moderne medisyne.


Gevolgtrekkings

In ons hibriede model het ons twee komplementêre modelle vir stamselorganisasie en granulopoïese suksesvol gekombineer deur die voormalige stamselkompartement van die geslagsmodel en ooreenstemmende regulasies te vervang. Die hibriede model beskik oor 'n nuwe kombinasie van beide, 'n gedetailleerde voorstelling van stamselle en die beskrywing van latere selstadia van granulopoïese, insluitend die effek van groeifaktorsein. In die besonder, die voorstelling van stamseltoestande laat die modellering van selsiklus-afhanklike sitotoksiese effekte van chemoterapie toe. 'n Aantal kwalitatiewe en kwantitatiewe simulasies van die bastermodel het baie verskillende gedrag van die vorige en die nuwe stamselmodel aan die lig gebring. Nietemin, kwantitatiewe toepassing van die hibriede model op vier CHOP-agtige chemoterapie regimes het getoon dat die hibriede model die klinies waargenome dinamika van leukosietgetalle ewe goed verduidelik. Modelvalidering sal meer gedetailleerde eksperimentele data oor menslike HSC vereis.

Hierdie nuwe kombinasie baan die weg vir die bestudering van scenario's wat nog nie aangespreek is nie, soos hoë dosis chemoterapie, radioterapie en siek hematopoïese. Dit dien as nog 'n stap in die rigting van 'n omvattende model van hematopoïese wat modelle van stamselregulering, afstammingsverbintenis, beenmurgselpopulasies, groeifaktore en chemoterapie-aksies insluit.


INLEIDING

Normale menslike somatiese selle in kultuur het 'n eindige replikatiewe lewensduur. Na 'n beperkte aantal seldelings gaan die selle uiteindelik in die toestand van replikatiewe veroudering, waarin hulle 'n onomkeerbare groeistop toon (Tominaga) et al., 2002). Alhoewel opeenhoping van DNA-skade (Sedelnikova et al., 2004), reaksie op oksidatiewe stres (Campisi, 2001) en regulering van telomere (Harrington en Robinson, 2002) is betrokke by hierdie sellulêre verouderingsproses, huidige begrip van molekulêre besonderhede van die menslike selveroudering en die moontlike bydrae daarvan tot in vivo organismes veroudering by mense is nog onvolledig. As 'n evolusionêr bewaarde meganisme van veroudering aanvaar word (Tissenbaum en Guarente, 2002), behoort ondersoek na menslike proteïene soortgelyk aan die proteïene wat veroudering in modelorganismes beheer, 'n belowende benadering te wees.

Die stil inligting reguleerder 2 (Sir2) is 'n NAD + -afhanklike proteïen deasetylase (Imai) et al., 2000) wat die lang lewe in laer eukariote beheer soos Saccharomyces cerevisiae en Caenorhabditis elegans (Kaeberlein et al., 1999 Tissenbaum en Guarente, 2001). 'n Toename in Sir2-aktiwiteit verleng die lewensduur in hierdie organismes. In S. cerevisiae, Sir2 verleng die replikatiewe lewensduur deur onderdrukking van die vorming van ekstrachromosomale ribosomale DNA-sirkels in die nukleoli (Kaeberlein et al., 1999). Die Sir2-proteïen speel ook 'n kritieke rol in heterochromatiese genestilstelling deur regulering van histoonmodifikasies by telomere, ribosomale DNA-klusters en paringstipe lokusse (Lustig, 1998). Die NAD + afhanklikheid van Sir2 aktiwiteit dui daarop dat die beheer van lewensduur hoogs geassosieer word met metaboliese toestand. Kaloriebeperking beïnvloed nie net die metaboliese prosesse nie, maar verleng ook die lewensduur in 'n wye reeks organismes van gis tot soogdiere (Heilbronn en Ravussin, 2003 Hursting et al., 2003). Die insulien/IGF-I seinweg, 'n bemiddelaar van verouderingseffekte deur kaloriebeperking (Barbieri et al., 2003), is gekoppel aan die uitdrukking van 'n soogdier Sir2 homoloog (Cohen et al., 2004). Dit is dus moontlik dat die Sir2-gemedieerde regulering van veroudering in hoër organismes, insluitend mense, bewaar word.

Mense het sewe proteïene van die sirtuin-familie (SIRT1 tot 7) wat die katalitiese domein met Sir2 deel (Blander en Guarente, 2004 North en Verdin, 2004). SIRT1 is 'n kernproteïen met die hoogste volgorde ooreenkoms met Sir2 en 'n gis Sir2-verwante proteïen Hst1 (Frye, 2000). SIRT1 kan sellulêre stresreaksie en oorlewing moduleer deur regulering van p53 (Luo et al., 2001 Vaziri et al., 2001 Langley et al., 2002), NF-KB-sein (Yeung et al., 2004), en FOXO-transkripsiefaktore (Brunet et al., 2004 Motta et al., 2004). Studies oor SIRT1-funksie (Fulco et al., 2003 Takata en Ishikawa, 2003) en Sirt1 uitklopmuise (Cheng et al., 2003 McBurney et al., 2003b) stel die rol daarvan in soogdierontwikkeling en differensiasie voor. SIRT2 is 'n sitoplasmiese proteïen wat α-tubulien (Noord et al., 2003). SIRT3 is gelokaliseer na mitochondria en word geaktiveer deur die proteolitiese prosessering by N-terminus (Onyango et al., 2002 Schwer et al., 2002). Ten spyte van hierdie data oor SIRT1, SIRT2 en SIRT3, is dit nie bekend of hulle die replikatiewe lewensduur van menslike selle reguleer nie. Geen data was beskikbaar vir biologiese funksies of sellulêre lokalisasies van die ander vier SIRT-proteïene (SIRT4, 5, 6 en 7). Om die moontlike rolle van die Sir2-homoloë in menslike veroudering te verstaan, is 'n sistematiese ondersoek van al sewe menslike SIRT-proteïene 'n belangrike stap. In hierdie studie ondersoek ons ​​al sewe SIRT-proteïene vir hul sellulêre lokalisering, uitdrukkingsprofiele, proteïen-deasetileringsaktiwiteit en effekte op sellulêre lewensduur van menslike selle. Ons bevindinge met normale menslike selle verskaf die noodsaaklike stel data vir die toeligting van die fisiologiese funksies van menslike SIRT-proteïene.


Crossway A, Oakes JV, Irvine JM, Ward B, Knauf VC, Shewmaker CK (1986) Integrasie van vreemde DNA na mikro-inspuiting van tabak mesofil protoplaste. Mol Gen Genet 202:179–185

Deshayes A, Herrera-Estrella L, Caboche M (1985) Liposome-gemedieerde transformasie van tabak mesofil protoplaste deur 'n Escherichia coli plasmied. EMBO J 4:2731–2737

Dudits D, Fejer O, Hadlaczky G, Koncz C, Lazar GB, Horvath G (1980) Intergeneriese geenoordrag bemiddel deur plantprotoplastfusie. Mol Gen Genet 179:283–288

Evans HJ (1974) Effekte van ioniserende straling op soogdierchromosome. In: Duits J (red) Chromosome and cancer. Wiley, New York, pp 191–207

Flavell RB, O'Dell M, Hutchinson J (1981) Nukleotiedvolgorde-organisasie in plantchromosome en bewyse vir volgordetranslokasie tydens evolusie. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 45:501–508

Galun E, Aviv D (1986) Organel-oordrag. In: Weissbach A, Wessbach H (reds) Plant molecular biology. Methods in enzymology, vol 118. Academic Press, Orlando (VSA), pp 595–611

Gebhardt C, Schnebli V, King PJ (1981) Isolasie van biochemiese mutante met behulp van haploïede mesofil protoplaste van Hyoscyamus muticus. II. Auxotrofiese en temperatuursensitiewe klone. Planta 153:81–89

Gleba YY, Piven NM, Komarnitsky IK, Sytnik KM (1984) Transmissiegenetika van die somatiese hibridisasieproses in Nicotiana. 1. Hibriede en sibriede onder die regerante van gekloonde protoplast-fusieprodukte. Theor Appl Genet 69:121–128

Glimelius K, Erikson T, Grafe R, Müller AJ (1978) Somatiese hibridisering van nitraatreduktase-defekte mutante van Nicotiana tabacum deur protoplastfusie. Phisiol Plant 44:273–277

Gupta PP, Gupta M, Schieder O (1982) Korreksie van nitraatreduktase-defek in auxotrofiese plantselle deur protoplast-gemedieerde intergeneriese geenoordrag. Mol Gen Genet 188:378–383

Gupta PP, Schieder O, Gupta M (1984) Intergeneriese kerngeenoordrag tussen somaties en seksueel onversoenbare plante deur asimmetriese protoplastfusie. Mol Gen Genet 197:30–35

Harms CT (1983) Somatiese hibridisasie deur protoplastfusie. In: Potrykus I, Harms CT, Hinnen A, Hütter R, King PJ, Shillito RD (eds) Proc 6th Int Protoplast Symp, pp 69–84

Mendl RR, Alikulov ZA, Lvov NP, Müller AJ (1981) Teenwoordigheid van die molibdeen kofaktor in 'n nitraat reduktase gebrekkige mutante sellyn van Nicotiana tabacum. Mol Gen Genet 181:395–399

Mouras A, Saul MW, Essad S, Potrykus I (1987) Lokalisering deur in-situ hibridisasie van 'n lae kopie chimeriese weerstandsgeen wat in plante ingebring is deur direkte geenoordrag. Mol Gen Genet 207:204–209

Müller A, Grafe R (1978) Isolasie en karakterisering van 'n sellyn van Nicotiana tabacum gebrek aan nitraatreduktase. Mol Gen Genet 161:67–76

Murray MG, Thompson WF (1980) Vinnige isolasie van hoë molekulêre gewig plant DNA. Nucleic Acids Res 8:4321–4325

Paszkowski J, Shillito RD, Saul M, Mandak V, Hohn T, Hohn B, Potrykus I (1984) Direkte geenoordrag na plante. EMBO J 13:2717–2722

Pelletier G, Primard C, Vedel F, Chetrit P, Remy R, Rousselle P, Renard M (1983) Intergeneriese sitoplasmiese hibridisasie in Cruciferae deur protoplastfusie. Mol Gen Genet 191:244–250

Potrykus I, Harms CT, Lörz H (1979) Callusvorming vanaf selkultuurprotoplaste van mielies (Zea mays L.). Theor Appl Genet 54:209–214

Reich TJ, Iyer VN, Miki BL (1986) Doeltreffende transformasie van Alfalfa-protoplaste deur die intranukleêre mikro-inspuiting van Ti-plasmiede. Bio/Tegnologie 4:1001–1004

Rigby PWJ, Diekmann M, Rhodes C, Berg P (1977) Etikettering van deoksiribonukleïensuur tot hoë spesifieke aktiwiteit in vitro deur nick-translasie met DNA-polimerase I. J Mol Biol 113:237

Rodgers A (1979) Opsporing van klein hoeveelhede menslike DNA in mens-knaagdierbasters. J Cell Sci 38:391–403

Sala C, Biasin MG, Morandi C, Nielsen E, Parisi B, Sala F (1985) Seleksie en kern DNA-analise van selbasters tussen Daucus carota en Oryza sativa. J Plant Fisiol 118:409–419

Saul MW, Potrykus I (1984) Spesiespesifieke herhalende DNA wat gebruik word om interspesifieke somatiese basters te identifiseer. Plant Sel Rep 3:65–67

Van Montagu M, Schell J (1982) The Ti plasmids of Agrobacterium. Curr Top Microbiol Immunol 96:237–254


Stamselle en die ontwikkelende idee van sellulêre identiteit

Stamselle is maar een klas van die magdom tipes selle binne 'n organisme. Met potensiaal om self te vernuwe en kapasiteit om te differensieer, speel stamselle noodsaaklike rolle in verskeie stadiums van ontwikkeling. In die vroeë embrio verteenwoordig pluripotente stamselle stamselle vir alle weefsels, terwyl weefselbeperkte stamselle later in ontwikkeling aanleiding gee tot selle met hoogs gespesialiseerde funksies. Soos die beste verstaan ​​word in die bloed, vel en ingewande, is stamselle die sade wat weefselhomeostase en regenerasie onderhou, terwyl in ander weefsels soos die spiere, lewer, niere en longe, verskeie stam- of stamselle fakultatiewe rolle speel in weefselherstel en reaksie tot besering. Hier sal ek 'n kort perspektief verskaf oor die ontwikkelende idee van sellulêre identiteit en hoe herprogrammering en transkripsiefaktor-gemedieerde omskakelings van een seltipe na 'n ander ons aannames oor die stabiliteit van selidentiteit fundamenteel verander het, met diepgaande langtermynimplikasies vir biomediese navorsing en regeneratiewe medisyne.

1. Agtergrond en geskiedenis: van selle tot stamselle

In sy baanbrekende sewentiende-eeuse verhandeling 'Micrographia: or, Some physiological descriptions of minute bodies made by magnifying glasses' (Londen: J. Martyn en J. Allestry, 1665) beskryf Robert Hooke sy visualisering van die klein ommuurde eenhede van 'n dun gesnyde film van kurk, wat hy met 'n heuningkoek vergelyk het, en dit 'selle' gedoop het. Sowat 350 jaar later is selle welbekend as in staat om vry te lewe as hele organismes of as boustene van lewende weefsels binne hoogs komplekse wesens, en as merkwaardig smeebare en veerkragtige fundamentele eenhede van lewe.

Die twintigste eeu, waarskynlik die eeu van genetika, het begin met die verduideliking van gene as eenhede van oorerwing, halfpad deur die ontdekking van die dubbelheliks, en het afgesluit met die voltooiing van die rowwe konsep van die menslike genoomvolgorde. Alhoewel die genoomvolgorde die genetiese kode verskaf, is die hoofnavorsingsuitdaging van die een-en-twintigste eeu om te leer hoe hierdie kode deur selle gelees en geïnterpreteer word – hoe die inligting in die eensellige menslike sigoot vertaal word om die triljoen vreemde gespesialiseerde eenhede binne die menslike liggaam. Ontwikkelingsbiologie spreek baie van die vrae inherent aan die formulering van die liggaamsplan aan, maar die ontsyfering van die uitdrukking van die genetiese kode is toenemend die oorsprong van stamselbiologie, wat poog om epigenetiese regulering en sellot te verstaan. Net soos die geen die belangrikste sub-eenheid van die genoom is, is die stamsel die hoofeenheid van organisasie vir weefselvorming en homeostase.

Die konsep van ontwikkelingshiërargieë van selle, met 'n stamsel aan die bokant van hierdie hiërargie en veelvuldige gedifferensieerde nageslag wat daaruit afgelei is, het die eerste keer in die laat negentiende eeu ontstaan ​​en het 'n eksperimentele steunpilaar van die afgelope 65 jaar geword, as gevolg van die baanbrekersdefinisies van selfvernuwing van multipotensiële stamvaders van alle afstammelinge van die bloed deur Till en McCulloch in 'n reeks baanbrekerswerkstukke [1,2]. In die afbakening van die stamsel vir die bloedvormende weefsel, die hematopoietiese stamsel (HSC), Till en McCulloch het die stadium gestel vir die begrip van die ontwikkelingshiërargieë van bykomende weefsels en organe—die vel, derm, long, sperm en ander—sowel as die opkoms van heel organismes uit die pluripotente stamselle van die vroeë embrio. Om hul unieke eienskappe toe te skryf, moet 'n stamsel klonaal gedefinieer word - op enkelselvlak - vir sy vermoë om self te vernuwe en te differensieer, en gevolglik verteenwoordig stamselle maar 'n klein fraksie van selle binne die weefsels van volwasse organismes.

2. Ontwikkelingskrag van stamselle

Stamselle word gedefinieer deur hul reeks potensiële lotgevalle - 'n konsep wat 'ontwikkelingskrag' genoem word. Die sigoot is die mees ontwikkelings-uitbreidende sel, maar word selde as 'n stamsel in soogdiere beskou omdat dit in blastomere van gelyke ontwikkelingskragtigheid vir hoogstens drie seldelings klief, en dus 'n baie beperkte selfvernuwingspotensiaal manifesteer. Die sigoot en vroeë blastomere vorm al die weefsels van die eie embrio sowel as die ondersteunende buite-embrioniese weefsels—die fetale membrane en plasenta—'n unieke kapasiteit wat totipotensie genoem word. Tot op hede het niemand daarin geslaag om die sigoot of blastomere voortdurend in selkultuur te propageer nie. Embrioniese stamselle (ESC's), daarenteen, kan uit die binneste selmassa van blastosiste geïsoleer word en as onsterflike sellyne gekweek word. Wanneer muriene ESC's saamgevoeg word met vroeë blastomere of teruggekeer word na die blastocoele holte van die blastosist deur mikro-inspuiting, chimaeriseer hulle alle weefsels binne die embrio, maar tipies nie die plasenta nie, wat hul ontwikkelingsskeiding van die trofektodermale geslag weerspieël, wat sy eie meestersel het. - die trofoblastiese stamsel. ESC's word as pluripotensiaal beskou. Die ontwikkelingskragtigheid van menslike ESC's, wat om etiese redes nie deur embrio-chimerisme bepaal kan word nie, word eerder beoordeel deur die spektrum van weefseldifferensiasie waar te neem wat ontstaan ​​na onderhuidse inspuiting van selle in immuun-gekompromitteerde muise. Ongerepte ESC's produseer teratomas, ingekapselde gewasse wat bestaan ​​uit ongeorganiseerde massas gedifferensieerde weefsels. Omdat elemente van die drie primitiewe embrioniese kiemlae - ektoderm, mesoderm en endoderm - saam in hierdie gewasse bestaan, deel menslike ESC's pluripotensie met muis-ESC's.

Toe menslike ESC's die eerste keer deur Thomson beskryf is et al. [3], was daar 'n eienaardigheid wat vir byna 'n dekade grootliks ongemerk gebly het. Die mens-afgeleide selle het onder verskillende toestande gegroei, gestimuleer deur fibroblastgroeifaktor in plaas van leukemie-inhiberende faktor (LIF), wat die muis-ESC's gevoed het. Menslike ESC's blyk nie afhanklik te wees van LIF-sein nie, en ook nie om die stroomaf-paaie wat deur die LIF/gp130-reseptorkompleks gedryf word, te aktiveer nie, wat 'n duidelike fisiologiese of ontwikkelingstoestand impliseer [4]. Boonop het die kolonies van menslike ESC's platter voorgekom en was meer geneig om te sterf wanneer dit as enkelselle deurgegaan word as die muis ESC's, wat as koepelkolonies gegroei het en maklik gedissosieer en as enkelselle deurgegee kon word. Eers toe stamselle van die epiblast-stadium van muisontwikkeling geïsoleer en gekweek is, het die onderskeidings duidelik geword: menslike ESC's het meer na die epiblast-afgeleide stamselle (EpiSC's) van effens later stadium embrio's gelyk. Vandaar blyk dit dat muriene EpiSC's 'n nader ontwikkelings-ekwivalent aan menslike ESC's is as murine ESC's [5]. Kragtige onlangse pogings om menslike ESC's te isoleer onder toestande wat die muis ESC's meer naboots, het 'n groot aantal referate opgelewer wat effens verskillende toestande en toestande van 'n vermeende 'naïewe' menslike stamsel rapporteer. So 'n sel, soos die muis ESC, is in sy DNA-metilering en geenuitdrukkingspatrone nader aan die selle van die binneste selmassa van die blastosist, en word dus 'naïef' genoem [6,7], in teenstelling met die selle wat stem meer ooreen met die epiblast-stadium van soogdierontwikkeling, soos menslike ESC's of muis EpiSC's, wat as 'geprimeerde' beskou word, asof gereed is om te onderskei. Inderdaad, verskeie groepe het beweer dat hulle kombinasies van transgene of suiwer chemiese middele geïdentifiseer het om menslike geprimeerde pluripotente stamselle na hul naïewe toestand om te skakel. As sulke naïewe menslike ESC's inderdaad ingestel kan word as 'n alternatief vir klassiek-afgeleide hESC's wat sedert die eerste reëls van Thomson werk, kan daar voordele wees in terme van groeitempo's, gemak van oorgang van plaat tot plaat, en die ontvanklikheid vir pogings tot genoomredigering . Die soeke na naïewe hESC's verteenwoordig dus 'n 'heilige graal' van stamselbiologie en beloof baie interessante nuwe insigte in die metastabiele of heterogene toestand van pluripotente stamselle [8].

3. Multipotensiële stamselle

Terwyl ESC's aansienlike belangstelling wek vanweë hul veelsydige ontwikkelingsplastisiteit, en eendag van onskatbare waarde kan wees as 'n bron vir outoloë, persoonlike oorplantings van selle vir weefselherstel of regenerasie, behels die bes gevestigde bestaande selterapie tipies 'n ander klas selle wat as ' volwasse' of 'somatiese' stamselle. Anders as embrio-afgeleide stamselle, is weefselbeperkte somatiese stamselle in hul sterkte beperk tot die seltipes van die weefsel waarin hulle woon. HSCs genereer bloed, derm stamselle die voering van die ingewande en vel stamselle die epiteel voering van die liggaam. Ten spyte van vroeëre aansprake van groter plastisiteit, is somatiese stamselle hoogs beperk en trans-differensieer nie sonder aansienlike genetiese of chemiese manipulasie in vreemde seltipes of weefsels nie, en verteenwoordig nie 'herstelstelle' vir ander weefsels as hul eie nie. Die mees uitgebuitte somatiese stamsel—HSCs—kan oorgeplant word in pasiënte met verskeie bloedsiektes, kwaadaardig en geneties, nadat die pasiënt se siek bloedvormende stelsel uitgeroei is deur hoë dosis chemoterapie en bestraling. Maar bloedselle sal nie geredelik regenereer of herstel van ander weefsels soos die hart, brein, lewer of nier nadat hulle beseer of deur siekte geteister is nie. Gevolglik verteenwoordig multipotensiële stamselle hoogs waardevolle bronne vir regeneratiewe terapieë binne volwasse weefsels, maar verskaf nie 'n bron vir alle potensiële weefselterapieë in die volwassene weens hul afstamming-beperkte aard nie. Vir weefsels wat nie geredelik regenereer uit stamselpoele in die volwassene nie - soos die hart, nier, pankreas beta-selle en baie van die brein - bied slegs pluripotente stamselle wat gerig is om te differensieer langs spesifieke afstammelinge wat embrioniese ontwikkeling herkapitel, hoop vir toekomstige selvervanging terapieë.

4. Terugskakeling van gedifferensieerde somatiese selle na pluripotensie

Gedurende 'n groot deel van die geskiedenis sedert die tyd van Hooke, het selbioloë ontwikkeling as 'n eenrigting-deurgang beskou, met die omvang van 'n sel se lot wat geleidelik beperk word namate die sigoot vorder van 'n totipotente toestand na die pluripotente toestand van die binneste selmassa van die pre. -inplantingsblastosist, en uiteindelik ontaard in die meer beperkte potensiaal van weefselbeperkte selle. Uiteindelik bereik die meeste selle in die volwasse organisme 'n volledig gedifferensieerde toestand, wat stabiel en onveranderlik bly, tensy dit deur patologiese prosesse soos metaplasie of openhartige maligniteit beïnvloed word. Terwyl ons vandag verstaan ​​dat feitlik alle selle limfosiete red, die volle komplement van DNS behou soos alle ander selle, en gespesialiseerd raak deurdat dit sekere subsets van gene uitdruk terwyl hulle ander stilmaak, het vroeë denkers soos August Weissman bespiegel dat ontwikkeling deur 'n reeks voortgegaan het. van 'kwalitatiewe verdelings' waarin dogterselle verskil aangesien elkeen 'n ander stel faktore erf wat funksie spesifiseer. Later Hans Spemann proved through a series of painstaking and ingenious micromanipulations of early newt blastomere nuclei that all had equal potential to generate viable organisms, establishing the paradigm-shifting notion of nuclear equivalence. Spemann envisioned but never succeeded in performing his ‘fantastical experiment’—transplanting the nucleus of a highly differentiated cell back to the egg to test whether it would regain and manifest embryonic potential. Reporting success in precisely that fantastical experiment, Briggs and King showed in 1952 that when nuclei were transferred from the blastula stage cells of a frog embryo into a fresh egg, a third resulted in swimming tadpoles, showing that later embryonic stage cells showed nuclear equivalence. Ultimately, John Gurdon proved the full developmental potential of highly differentiated intestinal cells of the frog in generating functional organisms, thereby unequivocally establishing the principle of nuclear equivalence throughout development. Somatic cell nuclear transfer (SCNT) ultimately succeeded in proving the full developmental competency of the nuclear genome of mammalian cells of the sheep [9], and now well over a dozen distinct mammalian species. Indeed, SCNT together with directed differentiation of murine ESCs represents a classical paradigm for customized gene and cell therapy to treat genetic disease, as has been shown in murine models [10]. While nuclear transfer has ultimately succeeded in humans [11], it has proven quite cumbersome, requiring harvesting of fresh oocytes from women willing to donate to research.

The impractical technical and controversial aspects of human SCNT were bound to limit its impact. Indeed, in a major paradigm-shifting demonstration that transcription factors (TFs) play central roles in specifying cell fates, Yamanaka and colleagues [12] demonstrated that ectopic expression of four TFs normally expressed in ESCs (Oct4, Sox2, KLF4 and c-MYC) were sufficient to reset a somatic cell's differentiated state back to pluripotency. Within little more than a year, Yamanaka's group as well as Thomson's and my own applied TF reprogramming successfully to human cells, achieving the derivation of induced pluripotent stem cells (iPSC [13–15]). We used the reprogramming technology to assemble the first repository of patient-derived iPSC representing a spectrum of genetic disease, including immune-deficiency, Down's syndrome and Huntington's disease, among others [16]. Indeed, Yamanaka-style reprogramming has revolutionized the field of stem cell biology, rendering the notion that differentiated cellular state can be efficiently reprogrammed to pluripotency, ushering in a profound set of possibilities for modelling human disease and developing new drug and cell-based therapies.

5. Diverting somatic lineages directly to alternate cell fates

Inspired in part by the classical experiments of Weintraub, Lassar and colleagues which exploited ectopic expression of the MyoD TF to convert fibroblasts to muscle cells [17,18], Yamanaka's TF-based approach to reverting somatic cells to pluripotency also provoked a number of laboratories to test whether TFs might drive conversions of one somatic cell type directly to another, a process called transdifferentiation or direct conversion. Among the first laboratories to demonstrate this phenomenon was that of Doug Melton, who succeeded in converting exocrine pancreatic cells to insulin-producing beta cells by direct injection of mouse pancreas with master regulators of beta-cell fate [19]. Wernig's group later converted mouse and human fibroblasts to neurons using a similar strategy, only that TFs were engineered into fibroblasts in vitro [20,21]. Subsequently, a flood of papers have reported conversions of one somatic cell type to another via this approach (reviewed in [22]). Indeed, these experiments have further extended the concept that a cell's molecular composition and thus function are malleable and can be altered for applications in research and potentially for therapeutic purposes. But whether such cells function equivalently to their native counterparts has remained a lingering question among stem cell biologists.

6. CellNet: a metric for discerning cell identity and enhancing cell engineering

Numerous laboratories within the field of stem cell biology are consumed by attempts to convert various cell types in vitro into distinct altered states: whether directing pluripotent stem cells to differentiate along specific lineages towards specialized terminal cells, directing the conversion of one somatic cell type to another with enforced expression of TFs, or reverting differentiated somatic cells to pluripotency by expression of the Yamanaka factors. Such efforts promise to validate cultures of human cells as improved models of human pathology and physiology, and raise hopes that cell-based target validation, drug-screening and mechanistic research will be strengthened. Of some concern however, are the standards by which cells engineered in vitro are compared to native tissues for both molecular identity and physiology. Most claims that cells engineered in a dish have achieved a given cell fate equivalent to native tissues are typically founded on analysis of a small number of diagnostic markers, on limited functional assays and on global assessments of gene expression analysed by clustering algorithms that provide at best a qualitative suggestion of similarity without an objective metric of identity.

Given the momentous challenge of assessing the quality and fidelity of cells engineered in vitro, and the lack of rigorous metrics for assessing cell states, my laboratory has worked closely with that of James Collins (MIT) to generate a computational platform that defines how closely an engineered cell approaches the identity of a target cell or tissue type, and provides a set of candidate regulators of the cells' transcriptional state that require further modulation to push the engineered cells ever closer to their target. CellNet is a publicly available network-biology platform (http://cellnet.hms.harvard.edu/) written by Patrick Cahan with input from Hu Li and Edroaldo Lummertz de Rocha that has been tested extensively against both published datasets [23] and used within our own laboratory to enhance the in vitro production of several cell types [24]. At its core, CellNet is founded on the notion that cell- and tissue-specific gene regulatory networks (GRNs) are major molecular determinants of cell identity that govern both the steady-state transcriptional programme as well as cellular responses to the environment and to various contextual perturbations like disease and ageing. We reasoned that defining the status of GRNs within cells engineered in vitro would provide a robust metric of cell identity as well as a means of determining which TFs were most dysregulated, thereby providing a plausible set of candidates to be further manipulated in future experiments. Using publicly available microarray expression data and a modified version of the Context Likelihood of Relatedness algorithm [25], Cahan produced a global GRN that defines regulatory relationships among all annotated transcriptional regulators and target genes across most cell types, and then refined these relationships into cell and tissue type-specific GRNs that could be used to build a cell-type classifier. Other metrics included quantitative assessments of GRN status and a network influence score, which ranks TFs according to their effect on the GRNs.

With CellNet in hand, we evaluated the outcomes of 226 experimentally derived cell populations drawn from 56 published studies, and gleaned several overarching lessons. First, virtually all reprogrammed cells—i.e. those reverted to pluripotency by virtue of Yamanaka-style reprogramming—achieved near identity to the gold standard ESC, whether mouse or human. Second, efforts at directed differentiation of pluripotent stem cells (either ESCs or iPSCs) using morphogens and selective culture conditions in vitro achieved on average higher classification scores relative to their target tissues than experiments that endeavour to directly convert one differentiated somatic cell type directly into another via ectopic expression of master regulatory TFs [23]. These analyses indicate that reprogramming is a remarkably robust transition in cell fates, perhaps in part due to the highly selective culture conditions established for pluripotent cell types. However, when making neurons or cardiomyocytes or hepatocytes from pluripotent cells, we have much to learn before we can claim great success in deriving highly specialized cell and tissue types. Even more so, our attempts to convert differentiated fibroblasts directly into neurons or cardiomyocytes or hepatocytes without first returning to the highly plastic state of pluripotency are limited by epigenetic modifications that stabilize the fibroblast identity of the starting cells. Interestingly, a combination of transient expression of Yamanaka factors with ectopic expression of lineage specifying factors—a strategy sometimes referred to as ‘primed conversion’ [26], appears in some cases highly effective at converting one somatic cell type directly into another, and bears further exploration.

In an effort anchored by Samantha Morris in my laboratory [24], we employed CellNet's predictive features to refine the conversion of B cells into macrophages by ectopic expression of CEBP/α [27,28] and fibroblasts into hepatocytes by enforced expression of Hnf4α and FoxA TFs [29,30]. In converted macrophages, CellNet identified the persistence of B-cell-associated TFs EBF1 and Pou2af1/OBF1, and their knock-down enhanced macrophage functionality in vitro. In the hepatocyte-like cells induced from fibroblasts (iHeps), CellNet detected aberrant activation of cdx2, a hindgut-associated transcriptional regulator, as well as low-level expression of the intestinal regulators Klf4/5. Wanneer cdx2 was knocked down, the putative iHeps became more robust in their liver-like properties of albumin synthesis and urea metabolism, whereas enforced expression of Klf4/5 dampened liver marker expression and fortified intestinal identity. Taken together, these data suggested that the iHeps might in fact be poised as bi-potential progenitors of endoderm fates (‘semi-colon’). Remarkably, these ‘semi-colon’ cells could be coaxed ever closer to intestinal fates by engraftment in a murine colitis model. When the colon-engrafted cells were recovered and analysed by CellNet, they showed a high degree of colonic epithelial identity. Our laboratory is further applying CellNet to optimize our efforts to convert pluripotent stem cells along various blood lineages.

CellNet (v. 1.0) has notable limitations. CellNet was trained on microarray data, which are plentiful enough to provide adequate power to discover GRNs for many but by no means all tissues. The current version of CellNet is powered to classify a query population of cells against a panel of some 20 murine or 16 human target tissues. While many medically relevant tissues currently being investigated by researchers are included, e.g. neurons, heart, haematopoietic stem/progenitor cells, the spectrum of human cell types is vastly larger, especially when considering that the ideal training data would yield GRNs for every definable cell type at every stage of development. Furthermore, the current training data derive largely from parenchymal tissues and whole organs, which encompass many cell types, while most engineered cells are acclimated to culture in a dish. Despite these limitations, when primary cells are cultured from whole organs or tissues, purified, and then subjected to analysis via CellNet, the de-differentiation effects of cell culture and the heterogeneity of the target tissue does not compromise the utility of CellNet as a robust classifier of a cell's identity [23]. CellNet will be augmented in future versions as transcriptional profiles become available for additional target cells and tissues at multiple stages of development. Moreover, as more researchers turn to RNA sequencing as a mode of transcriptional profiling, CellNet will need to be adapted to accept these data (and such software refinement is underway). At the theoretical limit, as RNA sequencing of single cells becomes more robust, diagnostic GRNs might be discoverable for every cell type at every stage of organismal development, enabling algorithms like CellNet to define the transcriptional roadmap for human development. Such a platform would greatly facilitate efforts at directed differentiation of cell types in vitro and accelerate the capacity for stem cells to be translated for research and medical applications.

7. Prospects for the future

The definition of the cell has been refined at ever greater resolution since its first description by Hooke 350 years ago. In recent years, the capacity to reprogram and redirect cells such that they morph from one identity to another has highlighted the highly plastic and malleable nature of the genome and the fluid state of cells. Indeed, cells have assumed a chameleon-like character. Understanding the precise molecular mechanisms that define the formation, stabilization and transitions among GRNs promises to inform future efforts to engineer cells more faithfully in vitro and to diagnose and treat cellular pathology and promote repair and regeneration in vivo. Moreover, understanding GRNs as modules of cellular function offers the possibility that new types of hybrid cells with highly engineered functions might be produced for biomedical applications, the stuff of synthetic biology. Why be constrained to making a perfect hepatocyte or struggle to make a beta cell when there might be advantages to engineering a hepatocyte to perform glucose-responsive insulin secretion? It is provocative to consider what the cell will look like in another 350 years.

Mededingende belange

The author is a member of the scientific advisory boards and receives consulting fees or holds equity in the following biotechnology companies: True North, Solasia, Epizyme, Verastem, Ocata, Raze and MPM Capital. The author is an affiliate member of the Broad Institute, and an investigator of the Howard Hughes Medical Institute and the Manton Center for Orphan Disease Research.

Befondsing

The author is supported by grants from the US National Institutes of Health: R24-DK092760, RC4-DK090913, and UO1-HL100001 Progenitor Cell Biology Consortium Alex's Lemonade Stand Doris Duke Medical Foundation and Ellison Medical Foundation.


Kyk die video: Waarom is spelen met je konijn of knaagdier belangrijk? (September 2022).