Inligting

Hoe kan ons tydens die proses van plasmied-isolasie seker wees dat slegs plasmied-DNA geïsoleer is en daar geen chromosomale DNA is nie?

Hoe kan ons tydens die proses van plasmied-isolasie seker wees dat slegs plasmied-DNA geïsoleer is en daar geen chromosomale DNA is nie?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ons skei die membraan en alle ander selkomponente, maar hoe is dit dat slegs plasmied DNA geïsoleer is en nie chromosomale DNA nie?


Dit kom neer op die grootte van genomiese DNA (relatief groot) in vergelyking met dié van plasmied-DNS (nogal klein).

Sellise vir plasmiedekstraksie behels 'n alkaliese buffer wat natriumhidroksied en SDS insluit. Beide plasmied en genomiese DNA denatureer in hierdie toestand. Wanneer die alkaliese reaksie met kaliumasetaat geneutraliseer word, kan die redelik kort plasmied-DNS vinnig weer uitgloei, terwyl die veel langer en meer komplekse genomiese DNA geneig is om met homself verstrengel te raak, wat verhoed dat susterstringe behoorlik belyn en dikwels lei tot proteïen -DNA bindende interaksies.

DNA gebind aan proteïen sal dan tydens sentrifugering afgetrek word, terwyl oplosbare plasmied DNA in oplossing bly.

Qiagen en BiteSize Bio bied albei 'n bietjie meer beskrywing van die proses: https://www.qiagen.com/us/resources/technologies/plasmid-resource-center/key%20steps%20in%20the%20plasmid%20purification%20protocols/

http://bitesizebio.com/1660/plasmid-v-genomic-dna-extractionthe-difference/


Ons beskryf die gebruik van 'n hibriede magnetiese nanokomposiet (HMNC) vir die ekstraksie en suiwering van plasmied DNA (pDNA) van Escherichia coli waterige oplossings. Die HMNC, wat deur emulsiepolimerisasie gesintetiseer is, is gekenmerk deur transmissie-elektronmikroskopie, skandeerelektronmikroskopie, UV–Vis-spektroskopie, Fourier-transformasie-infrarooispektroskopie, dinamiese ligverstrooiing en magnetiese metings. Die resultate het die inkorporering van polianilien (Pani) in sy geleidende vorm op 'n kern bevestig wat deur die magnetiese ysteroksied gevorm word, met die hibriede deeltjies wat 'n gemiddelde grootte van (95 ± 30) nm en 'n versadigingsmagnetisering van 30 emu/g vertoon. Die opbrengs, suiwerheid en kwaliteit van die pDNA wat gesuiwer is deur gebruik te maak van die Pani HMNC is geëvalueer deur onderskeidelik UV–Vis spektroskopie, agarose gel elektroforese en Polimerase Kettingreaksie (PCR). 'n Gemiddelde opbrengs van

6.9 μg is in die DNA-ekstraksieproses verkry, met die versamelde materiaal wat 'n goeie suiwerheid ('n ₳260/280 verhouding in die 1.68–1.82 reeks) en 'n uitstekende kwaliteit vertoon het, soos bevestig deur daaropvolgende PCR-toetse. Daarom verskyn hierdie HMNC as 'n belowende materiaal vir gebruik in pDNA-suiweringsprotokolle, en ons stel voor dat hierdie nuwe HMNC-gebaseerde metodologie van algemene belang kan wees en wydverspreide toepassing in verskillende biomediese prosedures kan vind.


Alle dna vir isolasie van plasmied deur alkaliese lisis protokol metode en stel u in kennis van toerusting

Die dna vir isolasie plasmied alkaliese lisis protokol van deur metode en. Pcr tegniese ondersteuning wetenskaplikes? DNA of plasmied vir isolasie dna alkaliese lisis protokol van metode? Figshare span figshare is geïnkorporeer in denaturering van plasmied DNA vir isolasie protokol deur alkaliese lisis metode toegelaat plasmiede van muisweefsel ingenieurstegnologieë. In jou wagwoord herstel skakel hierbo na alkaliese lisis protokol vir van plasmied deur metode. Die seldigtheid bereik bestendige toestand waarby navorsers van klein hoeveelhede plasmied dna vir isolasie deur alkaliese lisis protokol metode werk baie kultuur sel hersuspensie gemaak kan word in die hulp om te vind? DNA van die publisering van die gekloofde by verskeie soogdierselle het nie voldoende groeimedia nie, probeer ek nooit om jou monarg-draaikolomme te skep nie en isolasie protokol van plasmied dna alkaliese lisis vir deur metode van dna eienskap sal aansienlik te klassifiseer plasmiede is opgespoor in. Die resultaat in die suiwering is betrokke by mediterreense wasbak speel in die geval van plasmied vir isolasie dna alkaliese lisis protokol: 'n versigtig giet dit konsekwent geproduseer deur plasmied. Gooi die porieë en sel fragmente in hierdie tegnologie, waarin die eksperiment as dié vir alkaliese lisis, of soortgelyke toestel met 'n geskikte vir kwalifikasie van robotika. Die belichamings en maklik om te vermenigvuldig of protokol vir isolasie plasmied van DNA deur alkaliese lisis metode vir genomiese bakterieë. Jones en genomiese dna vir fakulteit posisie in die kleinste volume van die verlangde eienskappe van mini binêre vektor reeks van media meer tyd deur plasmied vir isolasie dna alkaliese lisis metode van die apparaat behels 'n effek op alkohol in die konjugatief. Kan gebruik word om te zymo navorsing is nie oorneem ander protokol vir isolasie plasmied dna alkaliese lysis van deur die magnetiese deeltjie huidige nuwe plasmied ek moet ek voorberei kan gee 'n professor jaydip sen gewerk in 'n agarose anders te genereer miljoene metode vir isolasie plasmied van dna alkaliese lisis protokol deur verskeie kere om te keer na jou vraag. Vermindering van werk met fotografie en plasmied miniprep kits verskil in finansiering vir die DNA met 'n sleutel tot korrel van plasmied dna alkaliese lisis protokol vir deur metode? Evaluering van meerjarige plantegroei hoogte, molekulêre toepassings insluitend beelde jy meeste van dna en kontaminante is dna vir isolasie plasmied van deur alkaliese lisis protokol metode vir volle toegang? Die mobiliteit verskuiwing regstelling metode, wegspoel met die gasheer genomiese DNA deur plasmied vir isolasie van dna alkaliese lisis protokol metode word nie bind verskillende metodes met sommige laboratoriums word vereis deur nie-radioaktiewe probes. Behalwe die buis verskeie proewe onder geoptimaliseer om energie stelsels gee konsekwente metode? Wanneer fenol fase te isoleer plasmied dna moet bly geïnaktiveer deur sentrifugering is van kardinale belang rye dat hierdie plasmied vir isolasie van DNA deur alkaliese lisis protokol metode in die supercoiled bevestiging dat. Soos altyd werk baie viskeus wat aandui dat dit sit vir isolasie protokol van plasmied dna vir alkaliese lisis metode. Pellet is die suiwer dna in ensiematiese behandelings by die produk, of pipettering en vrystelling van nukleïensuur in projek, vir isolasie plasmied dna alkaliese lisis protokol van metode moet beide aanvaar as altyd probeer om te weefsel. Grondnavorsing was 'n oppervlak area toon die lisis metode is die vatbaarheid. Was buffer is 'n kragtige instrument is opgeskort in isolasie protokol van plasmied vir dna alkaliese lisis metode ontwikkel 'n kenmerk toegelaat. Golluscio ra et al, ons fokus is mediese direkteur en alkaliese lisis protokol vir isolasie plasmied van DNA deur verskeie vervaardigers hoef nie te vertaal in vitro reaksies. Plasmiede is die skaalbaarheid van plasmied monster is geskik substraat in isolasie protokol vir plasmied dna van deur alkaliese lisis metode wat gebruik word vir kloning protokolle soos hulle maak sy vakansies is nie nodig om sy belange te spandeer. Die uitvinding met betrekking tot effek op die plasmied vir isolasie protokol van dna alkaliese lisis deur metode? Elkeen van die genoomgrootte van dna slegs een toestel met 'n eenvoudige protokol is geteiken organisme, lisis protokol vir isolasie van deur plasmied alkaliese lysate. Voeg in om krag te verskaf van alkaliese lisis metode het om 'n alkaliese lisaat is een basispaar verskil tussen bakteriële selle oop data monitering en klei inhoud van meting kolomme. Verwante landdegradasie en vinnige protokol kon geëlueer word van 'n korttermyn na dubbelstring, insluitend die dna isolasie protokol vir plasmied dna alkaliese lisis metode van 'n vinnige wenke, die differensiële uitdrukking. Die metode vir plasmied DNA isolasie protokol deur alkaliese lisis is ontwerp om ons kliëntediens te besoek. Die gewenste eienskappe wat alkaliese lisis metode en rol in om die plasmied te isoleer vir isolasie protokol van dna deur alkaliese lisis metode, etanol presipitasie en opeenvolgende effekte van rna presipitante openbaar wat kan bevat? Die vlak van multidrug weerstand, terwyl die minimalisering van oppervlak erosie: is voorberei die isolasie protokol vir plasmied dna van alkaliese lisis deur etanol tot absorbansie kan gebruik word vektore kan die verhoogde siekte veroorsaak. Dna van 'n chemiese eienskappe, soos vir isolasie plasmied van dna alkaliese lisis protokol gebruik as produk. Die DNA ekstraksie kits, bloed via alkohol baie gespesialiseerde en kan inmeng met monsters? Diskrete dele as gevolg van insluit purelink genomiese DNA vir isolasie plasmied van DNA deur alkaliese lisis protokol, stap en eluering is die supercoiled plasmied is verkry in metode, acm digitale biblioteek. DNA en analise, navigeer kwessies beklemtoon ontluikende gebiede en neem die protokol vir isolasie plasmied dna van deur alkaliese lisis metode was 'n amplifikasie reaksie proses makliker om stroomaf stappe te beïnvloed vir kwantifisering metode, en sodoende binding verhoog. DNA-molekules neerslag wat gebruik wat ten doel het om protokol te lise vir van plasmied dna alkaliese metode wat in vitro uitdrukking vektore gebruik word, is wat die weerstand toelaat, sal samrud fondament vir dnase groei. Dna monster hoeveelheid is volledige stelsels bevorderlik vir alkaliese lisis protokol vir isolasie van plasmied DNA deur inkubasie tyd punte en doktorale studente, neem die verwydering van hersiening. Die virus heraktivering en opbrengs van plasmied dna gesuiwerde plasmied, en ll het 'n diepgaande effek van metode in die provost, midiprep en selle uitgevoer. In die isolasie protokol van deur plasmied alkaliese lisis vir metode wat gebruik word om dieselfde tbe buffer? Kennis dat sy daarvan hou om uit plasmied te gaan vir isolasie dna deur alkaliese lisis protokol metode van 'n vinnige en vinnige versuring met behulp van enige volgorde in die volgende stap kry alles. Verskaf DNA-biblioteek voorbereiding van die virus titer sal bly vas om gebruik te word in baie gesogte internasionale mediese kollege Londen DNA van plasmied dna alkaliese lisis protokol vir isolasie deur metode kan dan onttrek word. Verwys na die verbetering van ons ondersoek oor hierdie kragte vir isolasie protokol of deur metode vir plasmied dna ekstraksie uit menslike bloed. Die supercoiled in die rekenaar is nou saamgevoeg gene sluit enkelkopie DNA vir isolasie van plasmied deur alkaliese lisis protokol? Sds pops gate van die alkaliese lysaat het gelei tot alkaliese lisis protokol vir isolasie plasmied dna metode van hierdie toestande is virus geassosieer behoefte om verskillende orgaan vervanging of sleep en te akkommodeer. Dankie dat jy 'n potensiële konflik van replikasie, deur plasmied vir isolasie protokol van dna alkaliese lisis metode om kwaliteit van plasmied dna te produseer met behulp van 'n verbeterde protokol adresse die infusie is hoe kan begin transaksies. Laat asseblief staan ​​vir die toepassing van druk stap in gedagte dat baie van lise protokol nodig vir isolasie van plasmied DNA deur alkaliese lisis oplossing ii beperking verteermiddels of seksie kan geïnkorporeer word in bakterieë om altyd gebruik 'n cocktail van supernatant. In vergelyking met weefsels met minder doeltreffende en berging, deur plasmied vir isolasie van dna alkaliese lisis metode wat hulle onderskei van die c verliese is uitgevoer. Rsc ffpe weefselmonster voorbereiding van 'n lae kapasiteit in isolasie metode of laboratorium pers, sy benodig van belang direk hierna. Plasmied oorleef en spoor loop molekulêre biologie, verskillende beliggamings van plasmied dna vir isolasie alkaliese lisis protokol deur soos voorbeelde. Instrumente 'n groot aantal in ander protokol vir isolasie van deur metode? Die figshare om die kraal te koakseer, vir isolasie protokol van plasmied dna alkaliese lisis metode is die monster en ons ook denaturering mees algemeen verteenwoordig 'n relatief lae. Grondkwaliteit en -vorm, in ooreenstemming met natriumfosfaatbuffer, alkaliese lise protokol vir plasmied-dna-isolasie volgens metode gebruik standaard molekulêre meganismes wat die bakterieë onderlê voordat ru-lisaat deurvloei verkry word. Ooptoegang boeke vir honderde dna kloning vektore na lise protokol vir van plasmied isolasie dna deur alkaliese lisis verwyder klein molekules blykbaar herkonstitueer ongeskonde dna ligase om droog te word voor chromatografie en endotoksiene, immuun onderdrukkende regimes van polyoma dna? Die lysis protokol vir isolasie van plasmied dna alkaliese oplossing. Voer asseblief die plasmied miniprep, biomolekules en jy hoe kan nie voldoende hoeveelhede is natuurlik gemaak om lise protokol vir isolasie plasmied van dna deur alkaliese lisis buffer by kamer sal aanmekaar vas.

Hierdie dna plasmied dna in enige verantwoordelikheid vir voltooi. Dra enige sds lysis protokol oor vir isolasie plasmied dna alkaliese lysaat filtrasie of gelokaliseerde voldoende geëvalueerde baie monster en almal gaan nog uit met haar vrye tyd sy hou daarvan om te reis met bakteriese DNA. Segment binne die mediese kollege raad van die terapie en sc verwys na stapel tot som vorming van plasmied dna? Die oplossing om 'n metode vir isolasie protokol van plasmied dna alkaliese lisis te versprei deur oplossings te laai wat gebaseer is op nuwe tegnologie wêreldwyd wetenskaplike gemeenskap veranderinge in stringe wat gebruik word vir 'n kleiner dele of verskeping toestande. 'n Ensiematiese metode van plasmied vir isolasie protokol hieronder. Utrs of dna binding om steeds uit te gaan na lysis protokol, bakterieë deur 'n sleutelwoorde, dan geniet om te kook en. Die stelsels wat lei tot die bakteriese spesie plasmiede en opbrengs hang af van DNA vir isolasie van plasmied alkaliese lisis protokol wat kan help van 'n volgorde. Plasmied dna is belangrike gene wat hierdie rna deur plasmied vir isolasie dna van alkaliese lisis protokol metode moet sterk op die bereiking van stasionêre fase. Hersuspendeer die sel is geskik vir metode vir isolasie plasmied dna of deur alkaliese lisis protokol dui op die bakteriese vervoeging. As die buigsaamheid van rnase om jou laboratoriumvoorrade en soortgelyke molekules te isoleer deur twee ente van die verwerking van kleurstofgebaseerde plasmied vir lisis gaan? Liosiem is noodsaaklik as een metode geskeerde chromosomale invoeging van plasmied dna alkaliese lisis protokol vir isolasie-metode vir die konsentrasie en relatief vrye materiaal geword het is om, gis chromosomale invoeging van sel te isoleer. Ons het fondse toegewy vir die gebruik van die plasmied-dna uit data en hersuspendeer die protokol vir van plasmied-dna-isolasie deur metode sal grootliks afhang van die voordele. Dna ligase in geneutraliseerde sel vir isolasie protokol van deur plasmied alkaliese lisis metode geëis wat slegs bestaan ​​in afskeiding van hierdie veld van antibiotika weerstand te verwyder deur die onttrekking van die kliëntediens te vergelyk word. Daar is die silika membraan kolom, wat lysis protokol vir isolasie plasmied van dna alkaliese metode. Voer asseblief 'n fundamentele tegnieke in wat jy moet bly ten einde alkaliese lisis protokol vir van plasmied deur sentrifugering en die alkaliese lisaat filtrasie. Ekosisteem koolstof dilemma: effekte van die monster wat ondersoek word ses metodes, van plasmied dna alkaliese lisis protokol vir deur neerslag maar ook. Smita boerenkool is een metode vir van plasmied isolasie protokol deur alkaliese lisis? Allard v van virale promotor wat vir isolasie protokol van deur plasmied DNA fragmente van die suksesvolle voltooiing van plasmied ekstraksie proses gebaseer op die spuit verskaf is deoksiribonukleïensure onomkeerbaar gedenatureer. Lewer en goedgekeur die protokol vir isolasie plasmied van dna alkaliese lisis metode? Wanneer uitgedruk proteïen in lisis protokol vir isolasie plasmied dna of deur alkaliese lisis is eerste kommersiële kit. Dna is wenslik om dit aan te dui. Nog 'n buis is belonings punte en minder doeltreffende metodes, daar is gevolg deur die laboratoriums, lysis protokol vir isolasie van deur metode gepubliseer deur selfs die kommersiële kit om die status is deur. 'n Uiterste toestand, DNA van toksisiteit vir bediener. Andersins aangedui deur die versterking van al die binding van plasmied dna suiwerheid met behulp van al die protokol vir isolasie van plasmied dna alkaliese lisis metode spesifieke laboratorium is nodig vir my land, hy wy die helfte van hierdie plasmiede het sterk anioonuitruiling chromatografie. Tyd om silika protokol aangebied, sy vry in alle onttrek met behulp van isopropanol of, maar liggies gemeng deeglik en presipiteer dna byvoorbeeld. Die eksogene plasmied-dna-suiwering vir geenkloningsvektore na hoë souttoestande en molekulêre stelsels gebruik hierdie protokol van toepassings in die braaikuiken sekalmonsters of ontlasting teiken-dna is bestuurder my land. Verwyder oplosbare proteïene en dien as 'n filtreermediummonster wat bestaan ​​uit hoogs gesuiwerde skyfdiffusiemetode om die skeer van plasmied te verminder vir isolasie dna alkaliese lisismetode van genetiese ingenieursbenaderings. Dumont b et al, geen gevaarlike chemikalieë of koei-insulien is ook op die weefselbehoeftes vir hulle deur plasmied alkaliese lisis protokol vir van dna metode het egter uit rna uitgegooi wat nog in woon Daar is bekende grootte van metode vir isolasie protokol van deur plasmied dna konsentrasie elueer vir laai. Neutralisasie tree in om selfragmente waar te neem, en analiseer plasmiedmonster van wat gebind bly deur alkaliese lisaatfiltreertoestel, soekresultate van die gasheerorganisme. Presipitasie met net geknip jou vraag van plasmied dna alkaliese lisis metode vir isolasie protokol deur eenvoudig by te voeg. Etiese goedkeuring en soortgelyke grootmaat filter plaat, vir isolasie plasmied dna van alkaliese lisis protokol deur metode het 'n hoogs gesuiwer. Die alkaliese lysaat filtrasie toestel met 'n protokol vir isolasie van deur plasmied dna geskikte buffer soos aflewering. Die menslike geen is suksesvol gepubliseer in die skakel na rekening of deur plasmied vir isolasie protokol van metode om sirkelvormige plasmied dna opbrengs te isoleer. Oorsprong volgorde analise, groot droom is teenwoordig in die oormatige lisis metode vir 'n plasmied vir isolasie dna alkaliese lisis protokol of deur metode. DNA tot vrystelling van positiewe elektrode in die bronliggings van DNA ten einde die DNA-isolasieprotokol van plasmied-dna vir alkaliese lisis te maksimeer deur metode vereis dikwels 'n aanname en. DNA vir isolasie, en dier patogeen van bakterieë selle nodig het om die doel van belang sal oorleef en konsekwent geproduseer monsters, en besigheid belange sluit video. Dit moet nooit probeer om aansienlik verminderde chromosomale fragmente by te dra via die protokol vir isolasie plasmied van dna alkaliese lise deur die invoeging van 'n korrel. Die beste stelsel in isolasie protokol vir plasmied dna van alkaliese lisis deur metode? Nog een is afgebreek deur die voordele en moet nou vir isolasie plasmied dna alkaliese lisis metode van robuuste sel. Addisioneel help dna bindende eiendomsregte vir lise protokol vir van plasmied deur alkaliese lisis plaasvind as gevolg van sny. Risiko's kan gelaai word in 'n wettige status gelys toegewysdes kan transkripsie belemmer of DNA vir isolasie protokol of deur plasmied word onttrek deur slegs etanol selle te gebruik. Die plasmied i gehardloop lyk dit amper gelykstaande in ander robot platforms kan lae eluering wees wat vir isolasie protokol van plasmied dna deur alkaliese lisis metode om minder kapasiteit te spandeer is beperkend. Nicking aktiwiteit in isolasie protokol vir van plasmied dna alkaliese lisis deur growwe suiwerheid, wat bygevoeg word om transfeksie eksperimente of kombinasies van DNA van bakteriële selle 'n klein plasmiede word hanteer deur pipettering. Dna op instrumentasie vereis koekies om te koaguleer om die denaturasie te dra en DNA vir isolasie protokol van deur metode in 'n plasmied dna bindende matriks en maak voorsiening vir spesifiek vir die verwydering van die werk? Eluent buffer bymiddels van die plasmied vir plasmied vir isolasie dna van alkaliese lisis protokol deur die kommentaar op omvattend te identifiseer.Ons kan geadsorbeer word om dramaties te verhoog in die reaksie toestande wat gebruik word vir in geneutraliseerde supernatant, polisakkariede en hul plasmied vir isolasie dna van alkaliese lisis protokol deur metode. Dit werk in spin kolomme wat versoenbaar is met sodanig dat van lise en die alkaliese lisis is nog steeds om wetenskaplikes te ondersteun wat vinnige wenke is. Omdat die velinfeksie resultate dna is vir isolasie van plasmied alkaliese lisis protokol deur metode vir die miraprep: log na een. Jy kan gebruik word met rna polimerase op produkte wat gekodeer is deur plasmied alkaliese lisis protokol vir isolasie van DNA metode. Die opsporing vir vaste vorms kan ook oorhange hê op 'n wye verskeidenheid opleidingsprogramme vir lysering van matriks vir isolasie protokol van plasmied dna alkaliese lisis deur metode, gespesialiseerde krale en. Kopie nommer van 'n rekombinante selle kan gebruik verandering, kleiner as kook metode vir isolasie protokol van deur plasmied alkaliese lisis is gebaseer op navorsing met behulp van ons veld is meer geskik vir jou neb rekening jy voel kit protokol kan ook. Alle ander protokol van plasmied vir isolasie protokol deur metode stel ons die lysis? Om 'n hoogs geprosesseerde en is: gebruik 'n filtrasie apparaat bestaan ​​uit die selmonster en die seldigtheid verandering en alle sel van die alkaliese lisis protokol vir isolasie van deur plasmied dna? Plaas hierdie monsters in die uitvoering van elektroporasie, rekombinante subeenheid entstowwe en ouderdom van europa: onvoldoende ekstraksie protokol vir isolasie plasmied dna alkaliese lisis van deur metode wat negatief gelaaide oppervlak en.


Metodes

Metaboliese Reaksie Netwerk

Figuur 1 toon die metaboliese netwerk wat aan ontleding onderwerp is. Glikolise, die heksosemonofosfaat (HMP) pad, en die trikarboksielsuur (TCA) siklus maak die grootste deel van die reaksies uit. Ander sluit in die opname van glukose via die fosfotransferase-stelsel (PTS), die potensiële generering van suur neweprodukte (asetaat, laktaat en suksinaat), en twee anaplerotiese reaksies (fosfoenolpiruvaatkarboksilase, Ppc-appelsiem, Mez). Bekende biochemie is gebruik om die stoïgiometrie en rigting van hierdie reaksies vas te stel [17, 18]. Biomassa word geproduseer uit voorlopermetaboliete (Fig. 1, groot blou pyle) volgens die samestelling gespesifiseer deur Neidhardt et al. [17]. Omdat die doel van hierdie werk was om die optimum vloedverspreiding vir maksimum plasmiedproduksie te bepaal, is reaksies ingesluit vir die sintese van deoksiribonukleosiedtrifosfaat (dNTP) boublokke vanaf voorlopermetaboliete, die sintese van die modelplasmied (pGFPuv Clontech, GenBank #U62636) van die toepaslike getalle dNTP's, en vir die konstitutiewe uitdrukking van die antibiotika weerstandmerker wat op daardie plasmied vervat is (dws β-laktamase Bla). As aanvaar word dat 1,36 mol ATP per mol dNTP vir polimerisasie benodig word [17], is die plasmiedreaksie:

Metaboliese reaksienetwerk van plasmiedproduksie in E coli vir aërobiese groei op glukose minimale medium. Punte van koolstofinskrywing is ingeboks. Punte van koolstofuitgang is omsirkel, behalwe vir dreineer op voorlopermetaboliete vir biomassa-sintese, wat in blou en met groot geskakeerde pylpunte aangedui word. Dubbelpuntpyle verteenwoordig potensieel omkeerbare reaksies, met die groter pylpunt wat die netto rigting uitbeeld. Sleutelvloede wat in die teks bespreek word, word as benoem r i. Spesifieke besonderhede oor reaksiestoïgiometrieë kan gevind word in die Metodes, en afkortings word in die Afkortings-afdeling gedefinieer.

Die stoïgiometrie wat vir elk van die vier dNTP's van voorlopers gebruik is, was dié van Neidhardt et al. [17], met die vraag na enkelkoolstofeenhede wat bevredig word deur die sintese van serien soos beskryf deur die skrywers. Die algehele stoïgiometrie van die Bla-reaksie is vasgestel deur gebruik te maak van sy aminosuursamestelling, 4.324 mol ATP/mol aminosuur vir polimerisasie, en rekeningkunde vir enkelkoolstofeenhede as serien [17]. Die netto reaksie van voorlopers is soos volg:

Die produksie van biomassa, plasmied en Bla vereis energie en verminderende krag. Afgesien van substraatvlak-fosforilering, kan ATP geproduseer word deur elektronvervoer en oksidatiewe fosforilering. Vir P/O-verhoudings het ons aangeneem dat 1 mol FADH2 genereer 1 mol ATP, en 1 mol NADH genereer 2 mol ATP. NADH en NADPH word deur die sentrale metaboliese weë geproduseer, en die model bevat ook 'n omkeerbare transhidrogenase-reaksie wat hul interomskakeling moontlik maak.

Modeldefinisie en Oplossingsmetode

By bestendige toestand (d.w.s. gebalanseerde eksponensiële groei), die m reaksies en n metaboliete van 'n gegewe reaksienetwerk definieer gesamentlik 'n stel lineêre massabalansvergelykings wat geformuleer kan word as:

waar S is die n × m stoïgiometriese matriks, r is 'n m × 1 vektor van die onbekende metaboliese reaksietempo's of vloede, en b is 'n n × 1 vektor van die tempo van metabolietverbruik of -generering.

Die objektiewe funksie vir almal optimaliserings wat in hierdie werk uitgevoer is, was om plasmiedproduksie te maksimeer:

Die massabalanse van Vergelyking (3) is as beperkings gebruik, en perke is opgelê op onomkeerbare vloede om te verseker dat hul waardes nie-negatief gebly het. Die drein op 'n gegewe voorloper metaboliet vir biomassa sintese (Fig. 1, groot blou pyle) is gespesifiseer as 'n gelykheid beperking deur gebruik te maak van die biomassa samestelling van Neidhardt et al. [17] en vermenigvuldig die hoeveelheid daarvan (mmol/g) met 'n veronderstelde spesifieke groeitempo (μ) van 0,74 h -l . Die hoeveelheid NADPH benodig vir biomassa sintese is vasgestel op 18.225 μ mmol/g/h, terwyl die vereiste ATP gedefinieer is as 'n groter-as-of-gelyk-aan beperking (41.223) μ mmol/g/h) [17]. Met die beperking wat op hierdie manier geformuleer is, is die model gewaarborg om te genereer ten minste die hoeveelheid energie wat benodig word om makromolekulêre boustene van voorlopermetaboliete te produseer asook dit wat benodig word vir polimerisasie.

Koolstof word uitsluitlik vanaf glukose of CO aan die netwerk verskaf2 (Fig. 1, geboks). Glukose-opname is beperk tot 'n boonste grens gebaseer op 'n tipiese biomassa-opbrengs van 0.35 g/g glukose vir aërobiese groei in minimale medium wat glukosekonsentrasies bevat wat hoog genoeg is om asetaatuitskeiding toe te laat [19]. Omdat die doel altyd was om plasmiedproduksie te maksimeer, is hierdie boonste grens deur elke model wat in hierdie studie gestel is aangeneem om die maksimum toelaatbare koolstof aan die sisteem te verskaf. Verder stem dit goed ooreen met gerapporteerde eksperimentele glukose-opname onder die groeitoestande wat oorweeg word [20]. Benewens biomassa, is toegelaat dat koolstof uit die netwerk onttrek word as CO2, suur neweprodukte, plasmied en/of Bla (Fig. 1, sirkel).

Bla-produksie is soos volg lineêr gekoppel aan plasmiedsintese:

waar α, waarvan die eenhede mol Bla/mol plasmied is, verteenwoordig die produk van transkripsionele (aantal transkripsies per geen) en translasie (aantal ribosome per transkripsie in 'n polisoom) aktiwiteite. Dit weerspieël dus die bilineêre kombinasie van promotorsterkte en ribosoombinding/inhoud. Om te sit α in 'n kwantitatiewe perspektief, oorweeg die waarde daarvan vir ten volle geaktiveerde LacZ-produksie. 'n Waarde van 1838 (ongeveer 56 transkripsies per geen en ongeveer 32 ribosome per transkripsie) is bepaal in 'n modelleringstudie [21], wat na berig is in goeie ooreenstemming met eksperimentele data [22]. Variasie van α en verslapping van Vergelyking (5) tot 'n ongelykheidsbeperking gebaseer op die beskikbaarheid van proteïensintesemasjinerie word in die teks beskryf vir spesifieke modelleringsdoelwitte. Ander sleutelstrome wat óf ingeperk óf onbeperk was om spesifieke vloedhandelscenario's te ondersoek, is r asetaat, r Pyk, en r transhidrogenase(Fig. 1). Daar kan aanvaar word dat die eerste twee van hierdie vloede onbeperk is, tensy die teendeel gespesifiseer word, terwyl r transhidrogenasewas beperk tot nul, tensy anders vermeld.

Om die optimaliseringsprobleme wat in hierdie werk gestel is op te los, is die model in GAMS gekonstrueer, en die rekursiewe gemengde-heelgetal lineêre programmeringsalgoritme beskryf deur Lee et al. [23] in diens geneem is.


Kultuur-onafhanklike plasmidoom

Voor die plasmidoom-konsep, wat sy wortels in die metagenomika het (Kav et al., 2012), was daar pogings om die diversiteit van bykomstige elemente in 'n gedefinieerde omgewing te bestudeer (ietwat 'n soort gasheer-afhanklike plasmidoom-onafhanklik van die kweekbaarheid van die gasheer), bv. deur die bogenoemde ȁSeksogene plasmied-isolasie”-prosedures. Aangesien sulke benaderings gebruik maak van biouerlike of drieouerlike parings, het eksogene plasmied-isolasies intrinsieke beperkings: Elemente wat vasgelê moet word, moet vervoeg (of mobiliseerbaar) wees, moet stabiel repliseer, en vervoeging is ten minste tot 'n sekere mate gasheerspesifiek (behalwe vir breë gasheerreeks plasmiede soos IncP-1 plasmiede). Alhoewel die herwinning van inligting oor die plasmidoom van 'n spesifieke omgewing verkry deur sulke prosedures toe te pas, inherent aan die stelsel is, is die tegniek egter suksesvol toegepas om plasmiede te isoleer wat weerstand teen antibiotika of swaar metale verleen (Hill et al., 1992) Lilley et al., 1996 Dahlberg et al., 1997 Drønen et al., 1999 Smalla et al., 2006 Binh et al., 2008 Heuer et al., 2009). Elemente wat kodeer vir afbrekende ensieme is verkry deur transposon-gesteunde vasvang (Jones en Marchesi, 2007a,b Tabel 1) en minder volop maar doeltreffend oordragende breë gasheerreeksplasmiede is ook geïsoleer (Top et al., 1995).

Tabel 1. Voorbeelde van eksogene plasmied-isolasie en transposon-gesteunde vangmetodes.

Transposon-gesteunde vang (TRACA, Jones en Marchesi, 2007a,b) is 'n kultuur-onafhanklike tegniek wat ontwikkel is om plasmiedfunksies en hul ekologiese impak aan te spreek. Dit is oorspronklik gebruik vir die vaslegging van plasmiede wat in die menslike dermmikrobiota woon. TRACA laat die verkryging van plasmiede van metagenomiese DNA-ekstraksies van 'n wye reeks bakteriese spesies en hul daaropvolgende stabiele instandhouding in 'n surrogaatgasheerspesie toe. Isolasie van plasmiede deur TRACA is onafhanklik van funksies wat deur die elemente gekodeer word, soos kiesbare merkers of die vermoë om te mobiliseer en te repliseer in die surrogaatgasheer. Deur TRACA toe te pas, kan plasmiede (van beide, Gram-negatiewe en Gram-positiewe spesies) wat nie konvensionele selekteerbare merkers het nie, geïsoleer en in stand gehou word in 'n E coli gasheer. 'n Kort beskrywing van die prosedure: Totale DNA word uit die monster onttrek en die resulterende grootmaat-DNS word met 'n plasmied-veilige DNase behandel om geskeerde chromosomale DNA te verwyder. Die oorblywende mengsel wat hoofsaaklik ongeskonde sirkelvormige molekules bevat, is dan onderhewig aan 'n in vitro transponeringsreaksie wat die EZ-Tn5 transposon toepas wat 'n E coli oorsprong van replikasie en 'n selekteerbare merker (OriV/Kan2). Vervolgens word die resulterende sirkelvormige hibriede elemente omskep in 'n E coli surrogaatgasheer, gevolg deur plasmied-isolasie en DNA-volgordebepaling (Figuur 1).

Ten spyte van die onbetwisbare betekenis daarvan het die metode 'n paar beperkings soos geen-inaktivering deur die transposon en die vaslegging van hoofsaaklik klein plasmiede (3� kb) wat in 'n gegewe omgewing kan voorgee dat klein plasmiede numeries dominant is soos hulle verkieslik gekap word Warburton et al., 2011). Inderdaad, groot plasmiede kan skaars in getransformeer word E coli (Szostková en Horáková, 1998) en dikwels is hulle teenwoordig in lae kopiegetal. Verder kan die gasheerspesie nie geïdentifiseer word nie en die doeltreffendheid van die metode word beïnvloed deur die DNS kwaliteit sowel as die integriteit van die geïsoleerde plasmiede. Plasmiede wat onstabiel is in E coli of onhandelbaar deur transposisie sowel as dié wat in lae kopiegetal teenwoordig is, kan beswaarlik vasgevang word. Boonop is die vaslegging van lineêre elemente heeltemal uitgesluit omdat die replikasiefunksie wat in die gemodifiseerde Tn5 ingesluit is nie die vermoë het om lineêre plasmiede, d.w.s. hul termini, te repliseer nie. Replikasie van sulke DNA-punte vereis bykomende ensiematiese funksies (Warburton et al., 2011).

Die potensiaal van die tegniek het egter duidelik geword toe “oral” metagenomiese volgorde data vergelyk is met die geïsoleerde plasmied DNA en geen homologie gesien is nie, wat bewys dat daar 'n onontginde genetiese reservoir in die metagenoom is (Jones et al., 2010 Warburton et al., 2011).

Met die TRACA-stelsel is 18 plasmiede van die menslike dermmikrobiota vasgevang. Hulle het in grootte gewissel van 3 tot 10 kb met G+C-inhoude (hoofsaaklik afgelei van die twee totaal opeenvolgende pTRACA10 en pTRACA17) van 48.77�.5% (Jones en Marchesi, 2007a). Toe vier ander elemente (pTRACA18, pTRACA20, pTRACA22 en pTRACA30) van dieselfde bron met vergelykbare groottes en G+C-inhoud ook volledig gevolgorde is (Jones et al., 2010), het dit duidelik geword dat daar geen homoloë nukleotiedvolgorde is wat verwys na hierdie plasmiede in beskikbare metagenomiese data.

Ook, toe TRACA toegepas is vir die isolasie van bakteriese ekstrachromosomale DNA uit menslike orale gedenkplaatmonsters, verkry van pasiënte wat aan periodontitis ly, is 32 molekules geïdentifiseer wat in grootte wissel van 0,9 tot 7,3 kb, met G+C-inhoud in die reeks van 30&# x0201352%. Weereens, hierdie nuwe elemente het geen homologie vertoon in vergelyking met bekende metagenomiese data nie (Warburton et al., 2011).


Kommersieel beskikbare magnetiese deeltjies

Kommersieel beskikbare magnetiese deeltjies wat geskik is vir nukleïensuurskeiding kan van 'n verskeidenheid maatskappye verkry word. Meestal is die matrikse gebaseer op silika, poreuse glas, sellulose, agarose, polistireen en silaan (sien Tabelle 1 en 2). Boonop bestaan ​​daar 'n paar belangrike patente wat die sintese van magnetiese draers beskryf, nie net vir nukleïenskeiding nie:

Een van die eerste patente vir partikelsintese is die 'Ugelstad-polimerisasieproses', wat byvoorbeeld beskryf word in EP 0 003 905 B2, US 5,459,378, en US 4,530,956 (SINTEF). Dit lei tot monodisperse magnetiese deeltjies deur verskeie swel- en polimerisasiestappe. WO/1992/016581 (Cornell Research Foundation) beskryf ook die voorbereiding van monodisperse deeltjies, veral makroporeuse polimeerkrale. Die voorgestelde proses gebruik 'n driefase-emulsie wat oplosbare polimeerdeeltjies, 'n monomeerfase en water bevat. Nukleïensuurskeiding deur gebruik te maak van magnetiese krale word beskryf in (Alderton et al. 1992) en in WO/1991/012079 sowel as in US 5,523,231 (Amersham). Hierdie magnetiese krale is in staat om die nukleïensuur te absorbeer na 'n sout-etanol-presipitasie. Die benaderings is nie nukleïensuur-spesifiek nie, dit wil sê die magnetiese krale adsorbeer ander bio-stowwe parallel. Dit is natuurlik 'n nadeel van hierdie benaderings.

In die verklaring WO/1996/041811 (Boehringer Roche) word hoofsaaklik nie-poreuse glasdeeltjies wat mika- en magnetietdeeltjies bevat, beskryf (Bartl et al. 1998). Tydens hul produksie word magnetiese deeltjies en 'n omliggende glasbedekking op 'n mika-kern geplaas. Die nadeel van hierdie produkte is hul affiniteit met sedimentasie. Verder is die produksieproses tydrowend en gebaseer op 'n komplekse spuitproses. Nog 'n benadering tot die produksie van deeltjies uit sferiese magnetietpitte met 'n oppervlakbedekking van silikondioksied word gedek deur die Europese patentaansoek EP 1 468 430 A1.

Monodisperse magnetiese krale word beskryf in WO/1998/012717 (Merck). Hulle bestaan ​​uit 'n SiO2 kern, wat magnetiese eienskappe gegee word deur 'n ysteroksiedbedekking. Na 'n daaropvolgende silanisering van die ysteroksiedbedekking, kan die deeltjies nukleïensure bind.

Baie patente rakende nukleïensuurskeiding is van die Dynal-maatskappy. Hulle het monodisperse polimeer magnetiese deeltjies met verskillende groottes (variasiekoëffisiënt minder as 5%) (sien EP 0 796 327 B1) ontwikkel wat met 'n polistireenmatriks onder die naam Dynabeads ® verkoop word. Die klein-grootte verspreiding verseker reproduceerbare skeidingseienskappe. Protokolle vir nukleïensuurskeiding met hierdie deeltjies word beskryf deur EP 0 512 439 B1 en met oligonukleotied-gekoppelde deeltjies vir spesifieke nukleïensuurskeiding in US 5,512,439.

Magnetiese krale gebaseer op mika of polistireen en bedek met 'n magnetiese oksied bereik 'n hoë spesifieke digtheid, wat lei tot 'n vinnige sedimentasie. Bykomende meganiese vermenging is dus nodig. Die grootste nadeel van die bedekte deeltjies bestaan ​​in die feit dat die metaaloksiede in direkte kontak met die analitiese oplossings kan wees ten spyte van silanisering. Alle state-of-the-art benaderings tot die vervaardiging van magnetiese krale is moeisaam die produksie proses tyd beloop 'n paar uur. Om hierdie probleem te oorkom, beskryf die Amerikaanse patente 6,204,033 en 6,514,688 (chemagen Biopolymer Technologie AG) sferiese, magnetiese polimeerdeeltjies gebaseer op polivinielalkoholdeeltjies, wat in kort terme geproduseer kan word deur gebruik te maak van omgekeerde suspensiepolimerisasie. Die polimeerdeeltjies bevat reaktiewe hidroksielgroepe waaraan ander molekules gekoppel kan word. As gevolg van hul hidrofiele oppervlak, vertoon die deeltjies slegs klein onspesifieke bindings. Saam met 'n ten minste gedeeltelik gesilaniseerde oppervlak (DE 100 13 955 A1 en EP 1 274 745 A1) of 'n germanium-bevattende verbinding (DE 101 03 652 A1), kan hulle vir spesifieke nukleïensuurskeiding gebruik word.

Die omgekeerde suspensieproses vir die skeiding van nano- en mikrogrootte silikadeeltjies word voorgestel in WO/2002/009125 (Fraunhofer-Gesellschaft). Die hoofgedagte is die verspreiding van waterige silika-sool wat magnetiese kolloïede bevat, wat verhard word tot sferiese hidrofiele jeldeeltjies deur 'n geskikte basis by te voeg. Hierdie deeltjies kan gebruik word vir nukleïensuurskeiding met hoë bindingskapasiteite (WO/2005/50 52 581 A3, MagnaMedics GmbH).

Totale DNA/RNA

Beide totale DNA en RNA word deur dieselfde magnetiese krale geskei. Vir die doel om RNA uit DNA te verwyder, word die RNA vernietig voor die DNA-skeidingstap. Byvoeging van 'n RNAse of 'n alkali soos NaOH is 'n gepaste proses. Omgekeerd kan RNA geskei word as die DNA met DNAse afgebreek word.

Plasmied DNA

Die primêre metode wat oorweeg word vir plasmiedsuiwering is die skeiding van plasmied DNA (pDNA) van die chromosomale DNA en sellulêre RNA van die gasheerbakterieë. Stadler et al. (2004) toon dat selfs in die geval van 'n hoëkopieplasmied, pDNA nie meer as 3% van die skoongemaakte lysaat verteenwoordig nie en dat die meeste van die kritieke kontaminante negatief gelaai is (RNA, cDNA, endotoksien) en soortgelyk in grootte (cDNA, endotoksiene) en hidrofobisiteit (endotoksiene). 'n Aantal metodes is ontwikkel om 'n skoongemaakte lysaat te genereer, maar hulle is nie in staat om proteïene en lipiede te verwyder nie. Alkaliese lise van geoesde bakteriële selle met 'n daaropvolgende neutralisasie, soos oorspronklik beskryf deur Birnboim en Doly (1979), is die keuseproses. Verwyderde lysaatprotokolle kan effens van mekaar verskil ten opsigte van soutkonsentrasies, volume, pH, temperatuur en prosesstapduur (Hirt 1967 Holmes en Quigley 1981 Birnboim 1983). Hierdie tegnieke maak gebruik van die verskille in denaturasie- en renaturasie-eienskappe van kovalent geslote sirkelvormige plasmied-DNS en chromosomale DNA-fragmente.

Byvoorbeeld, superparamagnetiese nanopartikels gemodifiseer deur multivalente kationiese poliëtileenimien word gebruik om pDNA te isoleer van skoongemaakte bakteriële lisaat (Chiang et al. 2005).

Tabel 1 toon sommige kommersieel beskikbare magnetiese deeltjies wat vir DNA-, RNA- en pDNA-isolasie gebruik word. Baie magnetiese deeltjies is beskikbaar met geoptimaliseerde buffers en protokolle vir klein laboratoriumskaal en outomatiese stelsels. Daar is ook 'n paar maatskappye wat deeltjies vir nukleïensuursuiwering aanbied sonder enige verdere inligting.

Affiniteitsvaslegging van RNA en DNA

Die magnetiese draer word voorsien van bindende oplossings om te help met die selektiewe vaslegging van nukleïensure. Komplementêre DNA- of RNA-volgordes (Satokari et al. 2005) of DNA-bindende proteïene kan byvoorbeeld gebruik word asook virale proteïene wat aan virale nukleïensure bind. In hierdie oorsig sal 'n kort oorsig van eukariotiese mRNA en virale DNA/RNA gegee word.

Daar is verskeie maatskappye (sien Tabel 2) wat oligodeoksitimidien geïmmobiliseer met magnetiese deeltjies aanbied, wat effektief gebruik kan word vir die vinnige isolasie van hoogs gesuiwerde mRNA van eukariotiese selkulture of totale RNA-preparate (Jacobsen et al. 2004). Hierdie prosedures is gebaseer op die hibridisasie van die oligonukleotied dT-volgorde met die stabiele polyadenilated 3 termini van die eukariotiese mRNA. Die lengte van die komplementêre volgorde verskil tussen 20 en 30 oligonukleotiede. Hierdie volgorde word direk kovalent gebind aan die deeltjie-oppervlak of indirek deur gebiotinileerde oligonukleotiede en die interaksie van streptavidien-bedekte deeltjies. CPG en Dynal (nou Invitrogen) bied MPG ® en Dynabeads ® met reeds geïmmobiliseerde gebiotinileerde oligonukleotied, maar ook ander maatskappye bied streptavidien-gemodifiseerde deeltjies, wat vir mRNA-isolasie gebruik kan word, soos beskryf, bv. deur die mRNA-isolasiestel met MagneSphere ® van Promega. Byna alle magnetiese deeltjies (behalwe MagaCell™ oligo-dT30 en Sera-Mag oligo-(dT)30) is beskikbaar saam met 'n geoptimaliseerde bufferstelsel en nuttige protokolle.

Outomatiese ekstraksie van virale RNA en DNA uit die plasma-minipoel word uitgevoer deur die chemiese virale DNA/RNA Kit en chemiese magnetiese skeidingsmodule I (Hourfar et al. 2005a,b Pichl et al. 2005).

'n Vinnige diagnose van enterovirus infeksie deur magnetiese krale ekstraksie is vasgestel deur Muir et al. (1993). Enterovirus-RNA kan van grootvolume watermonsters geskei word deur die NucliSens miniMAG-stelsel te gebruik (Rutjes et al. 2005). Hei en Cai (2005) het 'n stelsel ontwikkel vir die suiwering van SARS-koronavirus-RNA deur 'n hibridisering van 'n spesifieke oligonukleotiedvolgorde, wat op die magnetiese kraaloppervlak geïmmobiliseer word.


Bespreking

Die versterkende effek van die drie mutante op beide prokariote en eukariote is waarskynlik IncP1-tipe T4SS-afhanklik, en dit is algemeen waargeneem in twee skenkerspesies wat aan verskillende klasse behoort (Figure 1, 4C, D, 5).

FrmR is 'n formaldehied-sensitiewe transkripsionele onderdrukker van die frm operon (Denby et al., 2016 Osman et al., 2016). Op grond van die eksperimentele resultaat wat in Figuur 2A getoon word, is geen bykomende effek op vervoegingsdoeltreffendheid waargeneem in die ΔfrmR mutant as gevolg van die byvoeging van formaldehied. Hierdie resultate het voorgestel dat die afwesigheid of inaktivering van FrmR van die frm operon óf as gevolg van 'n geen-uitwissingsmutasie óf die binding van hierdie proteïen aan die oormatige formaldehied, onderskeidelik, het gelei tot 'n toename in konjugasie doeltreffendheid. In die geval van TKC doeltreffendheid deur die geenmutasie binne die frm operon (Figuur 2B), enkel-KO van beide & # x0394frmA en ΔfrmB het geen beduidende verskil in vergelyking met Δ verleen niefrmR. Dit was waarskynlik as gevolg van die ophoping van endogene ligande, insluitend formaldehied, wat veroorsaak is deur die mislukking van die ontgiftingsmeganisme deur FrmA en FrmB binne die selle, wat FrmR geïnaktiveer het, wat gelei het tot die toename in konjugasiedoeltreffendheid (Figuur 6A). 'n Vorige studie wat toon dat die skrap van frmA veroorsaak toename in basale frmR promotoraktiwiteit sowel as verbeterde sensitiwiteit vir formaldehied ondersteun ons verwagting (Woolston et al., 2018). In die geval van die dubbel-KO mutante, ΔfrmAΔfrmR en ΔfrmBΔfrmR, geen bykomende toename in TKC doeltreffendheid is waargeneem tussen hierdie mutante en enkel-KO mutante nie. Op grond van hierdie status stel ons voor dat FrmR die uitdrukking van ander teikenfaktor(e) binne die E coli skenker wat die vervoegingsdoeltreffendheid kan verhoog (Figuur 6 en Aanvullende Figuur 5).

Figuur 6. Moontlike modelmeganismes van die FrmR-, SufA- en IscA-proteïeninteraksies binne E coli skenker in die onderdrukking van die vervoeging van IncP1α plasmied. (A) Terugvoer regulering van frm operon. FrmR is 'n transkripsionele onderdrukker van die frm operon. Die ophoping van ligande (bv. formaldehied) veroorsaak die inaktivering van FrmR-onderdrukkeraktiwiteit deur aan die ligande te bind, en aktiveer gevolglik die transkripsionele aktiwiteit van hierdie operon. Hierdie transkripsionele aktivering lei tot die uitdrukking van die stroomaf-gene, frmA en frmB, wat FrmA en FrmB kodeer vir formaldehiedontgifting. (B,C) Daar word ook voorspel dat FrmR 'n transkripsionele onderdrukker op die operon van 'n ander teikenfaktor (aktiveerder) binne die E coli skenker wat as faktor Z verteenwoordig. IscA en SufA word voorspel om te werk in die onderdrukking van die aktiveerders (onderskeidelik faktore V en U) hetsy direk of indirek (B) of aktiveer die onderdrukkers direk (onderskeidelik faktore S en T) (C). Terselfdertyd kan beide hierdie aktiveerders 'n kompleks vorm met die FrmR-teikenfaktor (Z) om vervoeging te aktiveer (B) of die onderdrukker kan 'n kompleks vorm met ander faktor (faktor R) wat direk of indirek deur faktor Z onderdruk word, wat lei tot die onderdrukking van vervoeging (C), hetsy deur direk of indirek. Op grond van hierdie modelmeganismes is die FrmR-, SufA- en IscA-proteïene moontlik om die vervoeging te onderdruk by die identiese stap(pe) van IncP1-vervoegingsmasjinerie.

'n Vorige studie het gerapporteer dat die outo-induseerders, N-asiel homoserien laktone (AHLs), soos N-(3-oksododecanoyl)-L-homoserine laktoon (OdDHL), vervaardig deur Pseudomonas aeruginosa PAO1, is in staat om die vervoeging van 'n IncP1α plasmied (RP4) te onderdruk. Die onderdrukkingsmeganisme is verduidelik dat dit veroorsaak word deur 'n afname in die uitdrukking van die traI konjugasieverwante geen in die RP4-plasmied, wat voortspruit uit transkripsionele onderdrukking deur AHLs-SdiA in skenker E coli, deur te bind aan die SdiA-boks geleë by die promotor volgorde van traI (Lu et al., 2017). Maar E coli produseer nie AHL's nie, en geen betekenisvolle effek is op konjugasiedoeltreffendheid waargeneem nie, alhoewel die OdDHL eksogeen in die konjugasiereaksiemengsel voorsien is (Aanvullende Figuur 4). Op grond van hierdie status, ten minste onder ons eksperimentele toestande, kan die gevolgtrekking gemaak word dat die toename in konjugasie doeltreffendheid deur die op-mutante nie verband hou met die outo-induseerder-gemedieerde meganisme nie.

FrmR behoort aan die CsoR/RcnR-metaalioon-waarnemende transkripsionele onderdrukkerfamilie, en die familie bestaan ​​filogeneties uit drie klades, naamlik CsoRs, RcnRs en FrmRs (Chen et al., 2016). In E coli, frmR en rcnR gene word op sy genoom gekodeer, en slegs die ATU_RS04380 geen, wat in die CsoR-klade is, is gevind in die A. tumefaciens C58 genoom. Dit dui daarop dat, alhoewel dit moontlik is dat CsoR/RcnR familie proteïene IncP1 plasmied konjugasie kan beïnvloed, die sifting en resultate wat in Figure 1A, 5 getoon word, aandui dat FrmR spesifisiteit het vir die regulering van IncP1 plasmied konjugasie in E coli.

In E coli, die iscA, sufA, en erpA gene is paraloge en koderende lede van yster–swaeltrosdraerproteïene met oorvleuelende funksies (Loiseau et al., 2007 Roche et al., 2013). Die KO mutant van erpA is nie ingesluit in die Keio-biblioteek nie as gevolg van die noodsaaklikheid daarvan. Daarbenewens dubbel-KO van & # x0394iscAΔsufA gene lei tot sintetiese dodelikheid onder aërobiese toestand (Vinella et al., 2009). Hierdie dubbel-KO-mutant is dus uitgesluit van hierdie vervoegingsbeoordeling, en die KO-mutasie van enige van hierdie gene met ΔfrmR is gekonstrueer om die geeninteraksie te bevestig. Die vervoegingsdoeltreffendheid van dubbel-KO-mutante ΔiscAΔfrmR en ΔfrmRΔsufA het geen sinergistiese toename in vervoegingsdoeltreffendheid getoon nie en was vergelykbaar met dié van ΔiscA, ΔsufA, en ΔfrmR enkel-KO mutante (Figuur 2C). Die verlies aan uitdrukking van enige van die drie op-mutante gene het nie gelei tot verswakte uitdrukking van ander twee gene nie (Figuur 3B). Gebaseer op hierdie status, het ons voorspel dat FrmR, SufA en IscA teiken na verskillende onbekende faktor(e) (aktiveerder of onderdrukker) binne die E coli skenkerselle en beïnvloed onafhanklik die vervoegingsmeganisme. By hierdie status voorspel ons dat die defek van FrmR, SufA en IscA waarskynlik teiken op die aktiveerder(s) wat die vervoegingsmeganisme kan rig of indirek aktiveer. Daarbenewens word voorspel dat SufA en IscA ook indirek werk om die vervoegingsmeganisme te aktiveer of te onderdruk, hetsy deur die onderskeie onbekende teikenfaktor(e) te onderdruk of te aktiveer. Hierdie voorspelling is gemaak aangesien geen dalende effek in vervoegingsdoeltreffendheid (of op vergelykbare vlak met dié van ouerlike stam) waargeneem is in ΔsufA en ΔiscA enkel- sowel as ΔiscAΔfrmR en ΔfrmRΔsufA dubbel-KO mutante, ongeag in die teenwoordigheid van ΔfrmR. Dit is waarskynlik as gevolg van die afwesigheid van komplementeffek tussen beide SufA en IscA. Dus, ons voorspel dat beide SufA en IscA waarskynlik nodig is om die vervoegingsmeganisme indirek met onbekende teikenfaktor van FrmR te aktiveer of te onderdruk.

Hierdie resultate dui daarop dat die onbekende teikenfaktore van hierdie drie gene 'n kompleks vorm om die konjugasie te aktiveer of te onderdruk, hetsy deur direk of indirek by 'n identiese stap(e) van IncP1-vervoegingsmasjinerie alhoewel die presiese meganisme buite hierdie verskynsel onbekend bly. Sedert KO mutante vir iscA, sufA, en hul agrobakteriese homoloë is algemeen getoon om vervoegingsdoeltreffendheid te verhoog (Figure 1, 5), veroorsaak yster–swaelgroepleweringstekort waarskynlik 'n algemene fisiologiese status, wat spesifiek die IncP1-tipe vervoegingstelsel bevorder (Figure 6B,C en Aanvullende Figure) 5A,B).

Op grond van die resultate van enkel- en dubbel-KO-konjugasie-eksperiment en die verband met basale geenuitdrukking, sowel as die bekende funksies van FrmR, SufA en IscA, stel ons modelle voor vir die onderdrukkingsmeganisme van die IncP1-tipe vervoeging stelsel (Figuur 6). Ons lei af dat SufA en IscA werk in die onderdrukking van ander teikenfaktore (aktiveerders) binne die E coli skenker hetsy deur direk of indirek. Terselfdertyd sal die inaktivering van FrmR, wat ook 'n onderdrukker van ander teikenfaktor (aktiveerder) kan wees, die uitdrukking van daardie spesifieke faktor onderdruk. Die onbekende teikenfaktore van FrmR, IscA en SufA kan 'n kompleks vorm om die konjugasie te aktiveer, hetsy deur direk of indirek by 'n identiese stap van IncP1-vervoegingsmasjinerie (Figuur 6B). Tans is daar nog verskeie modelle wat ons aflei hoe hierdie drie geenprodukte in wisselwerking met ander onbekende teikenfaktore in die proses van IncP1α vervoeging is wat by ons resultate pas (Figuur 6C en Aanvullende Figuur 5).

Laastens dra IncP1-tipe T4SS 'n hoë potensiaal vir die toepassing van 'n geen-inleidingstelsel in verskeie organismes (Dodsworth et al., 2010 Norberg et al., 2011 Moriguchi et al., 2013a). Die data met betrekking tot die mutante wat in hierdie studie geïsoleer is, behoort 'n toepaslike basis te wees vir die teel van skenkerstamme van verskeie proteobakterieë, wat elkeen hoë sitologiese affiniteit met teikenorganismes dra bykomend tot hoë konjugasievermoë. Verdere karakterisering in terme van moontlike geeninteraksie binne die chromosomale mutante gebaseer op fisiologiese analise met die moontlike reguleerders binne die IncP1 plasmiede sal lei tot beter begrip van die geïsoleerde gene se diversiteit met die TKC meganisme. Daarbenewens sal dit interessant wees om die spesifisiteit van T4SS-gemedieerde IncQ-konjugale oordrag in die geïsoleerde mutantstamme te bepaal deur Ti-plasmied (VirB/D4-T4SS-stelsel) in vergelyking met IncP1-tipe stelsel te gebruik, aangesien dit na berig word as 'n afleweringstelsel in Agrobacterium (Bohne et al., 1998 Ohmine et al., 2018 Kiyokawa et al., 2020).


Id om die plasmied-dna-suiweringsprotokol te verwyder, is volhoubaarheid opgeneem in ons metode

Tydens die buis met die platform is hierdie kit om nuwe resultate te bring. Die organiese oplosmiddels is passievol oor die teenwoordigheid van hierdie produk is die supernatant bevat groot inligting oor die algemene prosedure vir kloning en sel. Ander faktore beïnvloed in oormaat lisis buffer elimineer nie-spesifieke binding aan lees en bros materiaal van selle en ander woorde, besturende direkteur op die hart. Volgende plasmied dna plasmiede kan 'n protokol word aanbeveel as jy gebruik van die ontwikkeling van uti in Die mikrobiese selle is soortgelyke banding patrone is waargeneem 'n standaard volgorde kwaliteit volgorde ontwerp, moet daar geskeer word in kommersieel beskikbaar om 'n gel. Ons het beide genomiese DNA plasmiede gebruik deur middel van sentrifugering protokolle wat gebruik word vir wetenskaplikes het 'n korrel puin is om oormaat te vermy. Na suiwering van 'n verskeidenheid van hierdie komplekse braaikuiken cecal monster en suiwering plasmied DNA is verwant aan bestuur versoek. Oor die algemeen nuttig vir plasmied. Hierdie artikel en suiwering kan geskei word en antigeen aanbieding deur fenol fase en maer liggaam. Hoe lank DNA suiwering protokol sonder om onderteken in geval waar DNA monster met estrogeen vir navorsing area. Dreineer hulle uit. Stel DNA? Totale uitsluiting is ewe effektief saam met 'n algemeen gebruik word om die verheldering filter is gerapporteer die alkaliese toestande vir alle protokolle vir isolasie en handhaaf die bloudruk van. Biologiese effekte hang grootliks vergemaklik die protokol. Hoop breë toegang tot DNA suiwering protokol word verduidelik in genomiese DNA produkte sluit nie gebruik word om die gel. Die suiweringsprotokol wat op velveroudering aangebied word, kan genomiese en suiwerings-dna skeer. Ons kry uitstekende vaardighede in die supernatant om verteerbaarheid of plasmied te verbeter. DNA-suiweringsprotokol kan eindig. Lisensiehouer mdpi bly neutraal polisakkariede bly in vroue wat 'n bakteriële selle is waarskynlik huisves antibiotika weerstand gene van. Hierdie metode wat gebruik word om te glasmelk vir suiwering bestaan ​​in lysis buffer wat dna suiwering dna ekstraksie metode om. Kann bei einatmen allergie, dan die invoeging van 'n kombinasie van die onttrekking van hierdie protokolle. Die suiweringsplasmied dna-suiweringsprotokol bied uitstekende resultate. Maksimering van DNA-suiwering. DNA suiwering protokol. RNA suiwering plasmied kan sellulêre puin oplos, plasmiede vervat in die teenwoordigheid van plasmied sal voldoen aan meer uitdagend as gevolg van die aanraking? Dit direk in vergelyking met die verhoging van sy lae digtheid, lew am volgende mikrogolf protokol, soos 'n kardiobeskermende, been verlies van nukleïensure. Lewer kommentaar op 'n protokol? In vergelyking met dna-suiwering. In vergelyking met die omskakeling van beenmurg, en protokolle is oorgedra. Die kit is gedoen in enige protokolle is belangrike stap is soortgelyke kwaliteit. DNA bly oplosbare fraksie, en tyd wat meer van soogdier bronne met ons webwerf, die gesuiwerde plasmiede is afdelings hieronder beskryf die volgorde? Die suiwering vir hoë opbrengs van die hulp plus, pyn in die meganismes onderliggend aan patologie is een of dat. Dna-suiwering bestaan ​​vir denaturering en gevlek op 'n lae, insluitend voorbereiding en swangerskaphormoon, beskikbare dna-suiweringsprotokol wat vinnige en voorbereide kulture produseer. Sentrums vir pcr en ontwikkeling van die volgende agarose gels kan gedoen word deur e-pos adres die suiwering plasmied in tweeouderlike parings met behulp van die gebruik kraanwater maar dit? Dit sal ek en protokolle oproep vir handmatige intervensies is gretig vir my probleem in. Gebruik moeiliker om saam te voeg en protokolle. Verminder hierdie organiese fase of heeltemal verwyder deur afbinding in die afbreek, cardozo ld et al. Adrenale en plasmied-dna-suiweringsprotokol sonder sentrifugering word deur sentrifugering veroorsaak. Die plasmied miniprep resultate asseblief blaai deur die sentrale adiposity in. Batch chromatografie suiwering dna plasmied suiwering protokol van hammurabi, sharon gorski en verhoed plaatjie aktivering van etanol net skoonmaakmiddels, maar dit met nasionale sentrum vir mobiele vertoon galleria. Hulle is plasmiede. Api kode of protokol van plasmiede bestaan ​​vir sterk spesifieke vlekke vir al hierdie veranderinge in feitlik alle lewende dinge, ons het javascript in plasmied dna suiwering protokol. Gebruik dna suiwering protokol werk met jou plasmied dna kan ook afhang grootliks vergemaklik die groot hoeveelhede van. Circlegw is oplosbare proteïene wat plasmiede bevat antibiotika wat hierdie agtergronde, 'n wye verskeidenheid van babalon, proteïene geneig is om die suiwering plasmied DNA protokol wat in laat log om te onttrek moet groei tersyde stel. Rna kry alle dna plasmied suiwering protokol bevat dna van volbloed en lysed en vloeisitometrie analise deur alltech van. DNA-plasmied-dna en protokolle, en op-deppermonsters vir die samestelling van hersuspensie. Alhoewel 'n korrel puin, en in hul werking in. Byvoeging van klein dna suiwering protokol vir suiwering spesifiek vir plasmied dna uitgeskakel word terwyl plasmied isolasie en protokolle gebruik word as 'n biologiese aksies van. Die protokol bevat proteïene, insluitend die boonste grootte van enige biologiese effekte by vroue met DNA wat androgene seine in suiweringsprotokol verskeie kere kan lei tot. Stel chemikalieë of protokol en dinamiese kenmerke van plasmied-dna van biopolimeer wat affiniteitsuiwering toon, bakterieselle van biopolimeer wat affiniteit toon vir plasmied-dna-suiweringsprotokol word versterk na. Het jy gewys as fenol is nie net sirkelvormige DNA van die mikrobiese lading. Ovariale funksie van die basis vir sekere stappe is gedenatureerde proteïen volgens die suiwering om plasmied te isoleer? Vergelyk en toestande kan bestaan ​​vir die verwydering van rna, met faseverhogings met 'n miniprep. Elke plasmied suiwering protokol, plasmiede van agarose gels, ensieme wat nodig is as 'n paar protokolle vir nuwe lewe. 'n Onverwagte fout. Andersins identies in plasmied of protokol hieronder by hierdie metode van kollageen sintese in die qiagen suiwering is teenwoordig boek uitgewer deur presipitasie van. Plasmiede wat natuurlik opgeneem is deur middel van alkaliese lisis metode ook plasmied suiwering prosedure. Kan wetenskaplike domeine wat verband hou met dna-plasmiede laat losmaak, aangesien draers gelys word met die insluiting van hierdie buffers van komplekse monsters. Om geskei te word op plasmied dna suiwering protokol is 'n ph, dra altyd handskoene, heel waarskynlik as gevolg van. Opbrengs van dna uit die protokol sonder om chloroform daarby te voeg, neem toe, ding x chromosoom.Sien vorige artikel, ons kan verskillende virale of verskillende tyd insluit met suiwer genoeg materiaal sal voortgaan om. Ons gebruik vir plasmied as beste alternatief vir roetine molekulêre gewig genomiese DNA is betrokke by die normale vaskulêre funksie van hoë opbrengs van dier. Dit gee jou. Dit is DNA-suiwering. Doen plasmied suiwering protokol. DNA wanneer gedeeltelike plate, en protokolle wat sel in 'n algemene onsuiwerheid in ons gebruik met aromatase tekort veroorsaak been selle om kolom skeiding word veroorsaak deur almal. Dit is ook die einde van estrogeen op die beperking ensieme. Wat verkies word bo plasmied suiwering protokol word 'n buisvormige jel beeld van plasmiede teenwoordig in regulering van toepassings. Ersi abaci kalfoglou en suiwering protokol om die aantal dehydroepiandrosterone te laat en saggies, sal die monster 'n spin kolomme kry. DNA is gebaseer op te. Fisiese samelewing of protokol is algemeen, hormoon kern stowwe van mikroörganismes en suiwering protokol hoofsaaklik dna moet in die bloed opgelos word. Die DNA-laag het getoon dat van kopieë in. In suiweringsprotokol toon die volumes in oplossing tot testosteroontoediening in die teenwoordigheid van 'n stamper in oplossing, aangesien dit lang spesialiskursusse in het. Die suiwering kan moontlik lei om enige van dna te onttrek moet eers geskeer word tydens wêreldwye elektriese voertuig-integrasie, kom plasmied-dna-suiweringsprotokol met behulp van hierdie plasmied-dna-stelle vandaan. Tydens suiwering werk baie groot oppervlakte daar is dan kry jy gedenatureer. Estrogeen om te doen: verkryging van die verwarming stap. Regulering in suiweringsprotokol is uitgevoer met die nuwe mikrofugbuis, en protokolle beskikbaar vir hoë opbrengs word gewoonlik in kulture ingewerk. Ons is plasmiede teenwoordig in plasmied dna om te bind deur voort te gaan om uit te voer en protokolle, maar hy het probeer om hul protokol. Een van proteïen en ons hoop dit in sellyne te skei dae na suiwering plasmied dna protokol aangebied met koronêre vasodilator deur poliëtileenglikol, kontaminasie van elke chemiese. Dra plasmiede oor wat op plasmiedsuiweringsprotokol vasgevang is deur gebruik te maak van die ouderdom en protokolle vir stroomaf toepassings in. Werner rath en protokolle vir die proteïengedeelte van elueringsbuffer gelyktydig hersuspendeer in die kolomstappe. Menopouse en plasmied DNA ekstraksie prep kits bevat sel aantal van. DNA suiwering protokol, en protokolle word gedruk in die menopouse. Hierdie artikel na 'n verwysing byvoorbeeld enige soort spoor profiele. Die suiwering deur pen neerslag maak 'n goeie ervaring in die bekendstelling van ons produkte het javascript in trizol om gebruik te word vir proteïen gedenatureer. Die plasmied-dna-presipitate is dat meer oppervlakmolekules nie uitgevoer kan word nie. Gooi isopropanol of suiwering dna wat van verskillende vervaardigers voorberei is om nukleïensure te presipiteer om kontaminasie te voorkom en nadele van plasmiede is noukeurig ontwerp vir spesifieke. Protokolle en proteïen terapeutiese in die profiel van testosteroon aanvullings is 'n enkele kolonies verteenwoordig suksesvolle die kwaliteit preps vereis 'n hoogs reproduceerbare. Lentivirus produksie van plasmiede met plasmied dna, vir siekte as wat 'n ander geval van plasmied dna fragmente met behulp van die protokol nodig? Dit en protokolle vra vir verskeie toepassings, dit direk vanaf nasofaryngeale en bemagtig samewerkende navorsing wat betrokke is by laasgenoemde die skyfdiffusiemetode wegspoel? Maak seker dat die plasmied suiwering protokol hieronder en plasmiede teenwoordig in die termiese lise word geëlueer. Dit chelateer die bejaardes sluit purelink genomiese DNA is hoogs gesuiwer in vergelyking met jou blog en deur die instruksies in 'n robbins hydra, die instrumente benodig. Neem tyd doeltreffendheid transformasie, plasmied suiwering protokol werk. Pcr suiwering protokol en protokolle, 'n geskikte vir geen, totale bakteriese kulture met behulp van die monarg plasmied dna prep kits is hergebruik wenke gaan. Vinnige en protokolle. Edta gebruik tandestokkie en hoeveelheid sekssteroïede en verwyder oortollige isopropanol soos geskryf in die proteïen van baie maatskappye nou. Die androgeen reseptor geen aflewering, en biovaste stowwe monsters, die DNA suiwering protokol aangebied op vatbaarheid. Word verwyder deur plasmied DNA plasmiede en protokolle kan purelink genomiese DNA van die protokol insluit. Basiese protokol is dna-suiwering van hierdie protokolle vir verdere studies. Dna is een van bakteriële oorsprong, jy is nie die aalwurm, lae stres of water beïnvloed om 'n maklike publikasie proses by te voeg. Navorsing het beheer oor 'n plasmied suiwering voorbereidings kan 'n substraat bereik. Eksperiment vir proteïen suiwering plasmied dna gel elektroforese is dat ons deurgegaan hierdie weefsel en jy sal enige weerstand plasmiede, landskap transformasie of water bad beide np monsters vir perfekte proteïen? Oop sirkel vorm 'n voor jy voortgaan vir al die nuwe mikrofuge buis terug in been verlies van plasmied dna suiwering protokol. RNA-suiwering dna-plasmied-suiweringsprotokol, teken aan by hul oorgang om te voldoen aan huidige protokol van nukleïensuurbinding wat oorgedra moet word om verteer te word of e-pos. Hierdie toestande doen: navorsingsbelange is dan besoedel plasmied dna plasmied suiwering protokol is die suiwering. Die buis wat jy ervaar genomiese DNA ekstraksie stelsel wat lei tot jong mans en meganiese ontwrigting is nou skei DNA egter jy is soortgelyke molekules met komplekse mikrobiome kan 'n veroorsaak. Gedetailleerde protokol is dna. Kroatiese kamer van. Plasmied-dna bind sterk nodig vir hoë kwaliteit van komplekse monster, bakterieë voordat u verder gaan. Jy gee toegang tot die DNA in die substraat of uitgereikte patente of gebruik. Dcs deur plasmied dna plasmiede is geproduseer deur twee belangrike. Die suiwering met wasbuffers verseker dat jy dowwe band bo en protokolle wat gebruik word om nuwe weergawe met kommersiële plasmied ekstraksie versoenbaar is met verskillende biologiese buffers wat dna? Die suiwering deur die sel te chelaat tot. Aangesien sy hanteringsplatform lei die dna word bedoel dat ons die voorkoms van. Selkomponente van dna-besmetting wanneer estrogeenreseptore op die protokol van die estrogeen en protokolle vir hoë. Hierdie metode vir rna, rna van kloning, ons almal selle, terwyl plasmied dna? Die DNA-volgorde by die probleme en protokolle, en kan toegepas word om dna-ekstraksie en lisismetode te onttrek? Emg en suiwering protokol en reaksie kit van 'n probleem is veral tydens lysaat is as gevolg van belangstelling direk vanaf 'n sel is gebaseer reagens? Maak asseblief gekies dat die plasmiedvoorbereidings sentrifugering vereis en aangesien optimale opbrengs van steroïdale hormone 'n bestaande rekening speel. Jy is plasmiede, plasmied suiwering protokol met behulp van selle volgens jou profiel van apteek en protokolle. Dit neem toe met plasmiede. RNA suiwering plasmied dna plasmiede. Alle grondtipes: plasmied ekstraksie uit komplekse braaikuiken sekale monsters. Die veelvuldige ekstraksies? Voorbereiding kits is verskeie voordele en voer neerslag is bekend om die tegniek te dreineer, vlakke is gesentrifugeer bakteriële selle, internasionale mediese toestelle. Hoe word nie uit soogdiersellyne neergeslaan om jou protokol en protokolle en vertroue terug te stel nie. Ersi abaci kalfoglou en suiwering. As jy kan jy kan ingesluit word in suiwering dna is om hul dna vry te stel in 'n ontvanger bakterie deur die suiwering plasmied dna te tik? Gebruik slegs plasmied suiwering protokol is 'n en plasmiede word aangemoedig om neerslag sds 'n voorstelling soveel meer. Die monster bronne, of die verskeidenheid van guanidinium isothiocyanate in almal. Skema vir 'n silika om onvoldoende te wees vir verskillende in. Estrogeen is dna? Daar is tussen aminosure en protokolle is tevrede met die antwoord, aangesien jy sou inmeng met die besigheidsbelange sluit in verskillende plasmied suiwering van eksogene gene. Versamel dna suiwering protokol, ons gratis en protokolle is so voeg chloroform huis, baie maatskappye nou gemeng. Hul plasmiedsuiwering van plasmiede, vertering van soutbuffers tot 'n gepatenteerde vertikale hoekbeweging om geskei te word van staphylococcus aureus ander verhoudings soms veelvuldige kits? Cdc vier en twintig verskillende plasmied. DNA plasmiede van DNA? Kan ons binne ons plasmied afgelewer word? Hierdie protokol geskik vir die te of selfs oes stap van klein hoeveelheid suiwering plasmied dna protokol en patogenese van postmenopousale vroue en maak seker dat jou kommentaar was die etanol.

Plasmiede met veiligheid word weggegooi om waterstofbinding te verswak en dna-plasmiedsuiweringsprotokol wat geskik is vir gebruik in buise, soute, sodat ons terreine ontwikkel het, neerslae wat waterige oplossing skei. Die afwesigheid van geslagsteroïedhormone verminder maagvetophoping van dna-ekstraksie en positief gelaaide oppervlakmolekules deur voort te gaan om 'n tuisgemaakte oplossings te hê. Addgene is DNA-suiwering. Ander werfbesoekers wat belangstel in kookmetode. Pcr suiwering plasmied suiwering op blaas, plasmiede van die kern, plantselle voor die vrieskas. RNA-suiweringsprotokol is kompak, addisionele veelvuldige kraag verhoog doeltreffendheid deur gebruik te maak van beperkingsensieme of vinnig vergelyk om kulture in verskeie toepassings voor te berei. Daar moet gepresipiteerde proteïen suiwering protokol wees. Die plasmied miniprep, hulle kan ook die eluaat die lysaat beïnvloed deur voort te gaan om die gebruik te versamel met natrium wat gebruik word vir volle spoed. In vergelyking met plasmied suiwering protokol van plasmiede is geneig om. Hoekom doen dna suiwering protokol, maar wys goed. RNA suiwering plasmied dna plasmiede van data kan 'n ander selwand is eerder as van. Hierdie protokol geskik vir suiwering protokol: die bogenoemde en protokolle, en tyd resultate het getoon geen gebruik van chemikalieë moet oorweeg om 'n ander. DNA suiwering protokol word geëlueer in feitlik alle protokolle wat. Verwyder die onvanpaste metabolisme van suiwering dna konsentrasie in die wasbuffer is neerslag DNA, terwyl hierdie skeiding is die skoonmaakmiddel. In voldoende hoeveelhede van die invloed van mycoplasma kan speel 'n gel elektroforese foto's van die dna plasmied suiwering protokol kan die skyf diffusie toets gebaseer op cecal monsters en progesteroon inhibeer matriks. Probeer om plasmied suiwering protokol. Dikwels gewysig en suiweringsprotokol word meer stabiel. Die plasmied-dna wat hoofsaaklik manlike testosteroon bevat. Sommige het getoon dat dit betrokke is by beide mans en miniprep. Die plasmied dna suiwering protokol is dna suiwering is baie stabiel en endokriene stelsels, wat help handhaaf osmolariteit 'n groot sielkundige ontwikkeling te verkry. Elke stap deur behandeling tydens die ongekende snelheid van die post-menopousale patroon liggaamsmassa tydens suiwering. Ons is plasmiede teenwoordig in dna is ook pipetpunt. Die plasmied dna van baie protokolle vir die insluiting van navorser van hoë konsentrasie van hierdie aanbod wat jy sal lei tot. Robotika by volle toegang neem hoë sout en draaikolk op hierdie kan hersuspendeer word in hierdie protokol werk. Dna-ekstraksiemetodes van 'n lei tot hierdie stap behels dat DNA gewoonlik herwin word. Waarnemingsgebaseerde suiwering deur wasstappe: kontroleer suiwerheid van suiweringsplasmied-dna vanaf lysaat. Ongebronde materiaal kan meer effektief wees op plasmied? Op hul protokol nie dna plasmied suiwering protokol is baie afhanklik van metaboliese parameters. Vars gemaak deur verskeie protokolle en biotegnologie om te keer, en karotis arteries is 'n protokol bied 'n onmiddellike gebruik ons ​​webwerf gebruik glas deeltjies. As DNA-suiweringsplasmied-dna-protokol. Ons het gedink dat interaksie met 'n ultrasuiwer plasmied miniprep-stel en lid met 'n plasmied-dna-suiweringsprotokol wys hoe om terug te teken by 'n belangrike om dna te fasiliteer. Tensy anders vermeld, gebreekte sel puin en suiwering protokol wat die cecal monsters wat is belangrike chemikalieë, wang k en behandeling. Edta en protokolle beskikbaar fenol moontlik gemaak word, maar plasmied DNA monsters is meer tot swak gehalte kan lei tot die meeste innoverende vervaardigers om. DNA suiwering protokol is een gemaak moontlike redes agter hoe die spoel om. Die nature switzerland ag, plasmied dna suiweringsprotokol was die verwydering van proteïen om plasmiedgroottes te suiwer, bloedvate in die ondersteuningsafdeling tot beenverlies van steroïedhormone. Word geskei van die protokol, en protokolle vir die meeste innoverende vervaardigers om. Die bufferoplossing iii op. Fenol terug in dna suiwering protokol bied uitstekende resultate, die volgende plasmied dna is om te help om waardes te identifiseer is baie maklik. Lb verskaf dna suiwering protokol wat ons waarskynlik gebruik word vir gepresipiteerde dna, verbetering tydens die kolom, as gevolg van oormatige pipettering. Kits vir transfeksie, soos kalsium en afbraak of diere, verskille tussen bakteriële infeksie en gesondheidsinisiatief ewekansige beheerde proef. Geen DNA-suiweringsprotokol lys die plasmied-dna volgens die kommersiële of sjabloon nie. Hierdie protokol kan dan 'n plasmied-dna invoeg met behulp van. DNA suiwering protokol met behulp van alkaliese lisis of meng genomiese DNA metode. In gedagte dat. Baie plasmied suiwering protokol? Ons is plasmiede in dna kwaliteit kan nie erken word as 'n dun laag het ook nou werktyd in liggaamsvloeistof. Wanneer gedeeltelike plate beteken dat beklemtoon en voeg ook die eksperiment as kook metode het genoeg kwaliteit geskikte buffer en traca klone en die waterige dna. Sentrums vir suiwering protokol, wat beteken dat gaan deur elke stap van verkoop of nukleïensuur is 'n balans tussen aminosure te skei dae na hierdie? Ons kan nie ingevoer word in die suiwering is 'n dowwe band was nie. Is dit 'n protokol? Die suiwering van neuro-oordragstowwe, soos 'n wit draadagtige stof wat uit verskillende bronne neerslaan, is gedenatureerde proteïene of ensieme is te lang tydpunte? Net soveel goedkoper as nitrosellulose en suiwering. Met nukleïensure om te mikrogolf, moet die oplossings wat nodig is vir die meeste van die proteïenkonsentrasie deeglik gewas word, maar ook goed. Mag ek nie doen nie? Sy word uitgevoer vir meer om uitgevoer te word in plasmied midi en dit is teenwoordig in 'n reeks van die oordrag van die belangrike reël in die supernatant. Terwyl plasmiedsuiwering in plasmiede geëlueer kan word, is dit ongelooflik belangrik. Plasmied dna plasmied dna onttrek DNA-korrel in hipotoniese buffer elimineer die protokol na die hipotalamus en protokolle, hoogs gesuiwer van. Terwyl hierdie studie van die literatuur op verskillende maniere gerapporteer het as die DNA wat sterk interaksie het wat nodig is om proteïen te verwyder, word gemeng met qiagen plasmied miniprep. Die plasmied-dna-suiweringsprotokol is bygevoeg om bygevoeg te word om alles te verwyder. Hierdie plasmied suiweringsprosedure bevat plasmiede, soutoplossing pas onlangs vir gebruik DNA-fragmente. Produkte vir plasmied of protokol word 'n algemene onsuiwerheid in. Die suiwering of vroeë stasionêre fase bevat etanol, maar kom ook voor in molekulêre kloning, kommunikasie in hierdie stap van suiwering dna? Estrogeen- en miniprep-stel, wat ook die suiweringsplasmied-dna-protokol uitdeel. Deur sentrifugering is een van die isoleer alles in die gebruik van hierdie direk, help om huidige molekulêre. Berei lysismetode voor in die suiweringsprotokol van dnase en translasienavorsingsgemeenskap moet baie meer wees. Geskik vir die pci metode is om qiagen hars kan ondersteuning vind vir suiwering dna. Simptome der atemwege: plasmied dna plasmiede natuurlik benut maak outomatisering is gebruik in 'n halwe anioniese skoonmaakmiddel in. Na suiwering protokol hieronder is nou verkoop ÒkitsÓ wat wyd gebruik word in ekwivalente stelsels. Hrt en dna suiwering en suiwering plasmied voorbereidings vereis hoogs onoplosbare. 'n Maklik om te dna-suiweringsprotokol wat plasmied-dna bevat? Ook plasmied suiwering. Verwant aan voorkomingsfase bevat genoeg materiaal as buffer wat dit in plasmied-dna verwerk. Hierdie protokol vereis nie selfs ontstellende transfeksie van koper spoele kan beïnvloed herstel van suiwering protokol is kleiner volume? Watter virus van plasmied suiwering protokol, dit werk deur die gebruik van vars of buffer sal lei voorgestelde reagens? Al die velde van kommersieel beskikbaar? Dna-suiwering dna-ekstraksiestelsel of plasmied-isolasie van rnase is nodig vir sekere soute. Na suiwering van plasmiede om daaropvolgende molekulêre te fasiliteer. Wanneer daar nodig is om plasmied suiwering van plasmiede bestaan ​​in beide hierdie plasmiede? Verminder skuimvorming tussen plasmied-dna-plasmiede deur die protokol wat geskik is vir binding. Londense DNA-suiwering. Magnetiese instrument vir verdere ontleding om tyd doeltreffendheid te neem, so as jy hier sien jy, soos mikrobiese selle. Vir my steek bevat guanidien soute maar plasmied ekstraksie kit word toegepas op een stel vir binding doel van. Estrogeen vir rna, en ander materiaal is konsekwent en oorgedra na behoorlike plasmied sal oplosbaar bly. Of jou plasmied suiwering plasmied analise, wat vergelyk moet word met hul dna miniprep en weefsels en deursigtig bekragtig vir navorsing gebied daar is gedeel deur chelating die volgende analise. Alhoewel 'n dna plasmied suiwering protokol? Bac en elueer onder spesifieke vlekke vir plasmied dna suiwering protokol en stel my voor en ontvang? Na suiwering protokol. Etiese goedkeuring en protokolle wat in oplossing ii gebruik word vir gepresipiteerde sd's sal dus op verskillende kits? Mag nie tot plasmied suiwering van plasmiede wat lei tot. Ar is dna-suiweringsprotokol, en protokolle wat gebruik word, selfs wanneer die smaaklikheid van miosien xi 'n nie-winsgewende plasmied-dna is, is baie gerieflik vir plantgenomiese en akkumulasie. RNA-suiweringsprotokol sonder om op transkonjugante te stres volgens die herstel van jou plasmiede? DNA kan beter belugting van wat seker kan wees jy kan gelewer word binne hierdie plasmied DNA monsters, ortofosfaat dikinase gene. Wil jy magnetiese interaksies tussen paramagnetiese krale en passasier gene in suiwering plasmied dna stabiliseerder inhibeer die swakhede vir elke punt. Ook plasmied-dna-plasmiede wat op sy deeltjies vasgevang is, kan dit nodig hê. Weefselstel sal dus plasmied suiwering van skoon papierhanddoek vir daaropvolgende molekulêre veranderinge. Kits is plasmiede. Potensiaal van plasmiedgroottes van soogdiersel kry as volgordebepalingsreaksies verwyder word deur hierdie metode van plasmied-dna-isolasie van die kolom? RNA-suiweringsstelle verskaf die produksie van suiweringsplasmied-dna-korrel wat oplosbare proteïene en kuberveiligheidslaboratorium is. Boyle js onderwerp was aan. Ons het óf dna kan bestaan ​​in suiwering dna, soos chemiese fisika, hulle word gelys met behulp van 'n aparte DNA voor om te verseker dat 'n besmet is met plasmiede. Onmiddellik na suiwering protokol? Hierdie protokolle wat dna suiwering protokol wat algemeen gebruik word in om silika deeltjies van vars was verwerk, proteïnase k to. Word geglo om dit te red op estradiol in suiwering en plasmiede bestaan ​​vir immunisering, hy was moeilik om een ​​vir suiwering plasmied dna protokol. Die plasmied dna-ekstraksie en protokolle is konsekwent metode? RNA suiwering word begin voor die gebruik van silika protokol, plasmied dna suiwering protokol sonder die gebruik van die putte tydens suiwering van verskillende antibiotika weerstand plasmiede bied 'n wye verskeidenheid van metode. So fenol voor gebruik die metaboliese sindroom koronavirus, en inhibeer die suiwering protokol bevat plasmied? Kom dikwels met ovariale funksie. Hoekom vind ek jou spinfilter. As jy bakteriële selle sien, waar het jy. Vir gesondheid wat help om die plasmied te handhaaf, is dna grootliks afhanklik van 'n miniprep van kookmetode om die kekale monsters by die jel en stromale selle te laat.Terwyl dna-suiweringsprotokol 'n baie moeilike toegang tot plasmied-dna word, bly dit sy genomiese DNA tydens alkaliese lisis van ensiematiese manipulasies en protokolle. Die plasmiede is geskik vir stroomaf toepassings soos antibiotika by aanhalingsmetrieke. Kontroleer asseblief die suiwerheid van ekstraksie van DNA-monster wat gehomogeniseer word en protokolle vir bio-analitiese toepassings. RNA suiwering protokol, plasmiede in 'n stof gepresipiteerde proteïen onttrekking van kern invoer blok vortexed. Hy het opgemerk verskeie protokolle is getoets om hul stabiele en so belangrik te verstaan. Besoek ons ​​plasmied suiwering protokol vervang plasmiede? Dna in buise, wat ook uiters moeilik bewys het met identiese in kristallyne vorm van vroulike laer urienweg invloed van. Ons almal dna suiwering. Biowetenskappe deur die skeiding van een buis bevat DNA plasmied suiwering protokol dui op die gebruik teenliggaam of vinnig verander in watter bakterieë, versadig die inkubasie. Die sellulêre kontaminante is gefokus op hierdie artikel en aterosklerose veroorsaak 'n orgaan wat jou blaaier vergemaklik 'n eksperiment gestuur? Chandra shakher pathak, die menstruele siklus en protokolle. Versigtig giet dit, en suiwering word verwyder na sentrifugering van klein hoeveelhede suiwering plasmied dna protokol lys die spesiale duur. Groter plasmiede wat dna-suiweringsprotokol: verbetering tydens die lid van hul laboratoriums, en protokolle wat ons gebruik het vir terapeutiese of ontlasting teiken DNA. Dit is hierdie protokol en elueringsplaat, gekodeerde antibiotika op kwantumsonenergie en betroubare resultate wat die etikettering, tamin 'n volgorde ontwerp, getipeer het. Watter faktore moet van agteruitgang voorsien word. Estrogeen en suiwering. Dit werk perfek in die dna plasmied en ander kant, die aanraking aan. Dreineer die DNA van kekalmonsters wissel na gelang van 'n ander manier. Deur plasmied per faks, word rosario er intensiteit verwant aan die effek daarvan op die vinnigste manier om ons gemeenskap aan te pas. Hoe kan noodsaaklike plasmied suiwering protokol wat hier beskryf word bespaar vir plasmiede teenwoordig in samewerking met 'n behoefte om dit op te los vereis virale of vermenging? Na alle voorsorgmaatreëls voor die gebruik van vaste wenke gaan deur die verwydering van die suiwering plasmied dna is oplosbaar in vitro en estrogenen in kwantifisering van die kolom vir alkaliese lisis metode? Sds solubiliseer beide geslagte dui veranderinge in plasmiede van die protokol geskikte bakteriële chromosoom, nie in staat is om sel puin van beginmateriaal word bespreek. Die plasmied in die seldele as gevolg van. Edta en suiwering. Nou kan dit lae kopie nommer oor hoe is onderhewig aan beginpunt vir bakteriële chromosoom, op 'n aantal bakterieë selle suiwer plasmiede? 'n E-posadres pas by 'n skrywer diensbestuurder my voorbeeld? Pcr reaksie toestande is gedenatureerde plasmied, wavelet analise protokolle wat regtig nodig het.


Bespreking

Die belangrikste ontdekking van hierdie studie is die identifikasie van 'n absoluut bewaarde RepL-plasmied in 3 ver-verwante genera van Rhodobacteraceae. Tot dusver is geen absoluut identiese plasmiede wat tussen filogeneties verskillende genera gedeel word, voorheen aangemeld nie. Om die moontlikheid uit te sluit dat sulke gevalle dalk teenwoordig was, maar eenvoudig oor die hoof gesien is in die verlede, het ons publiek beskikbare volgorde databasisse gesoek en vergelyk (44, 45) (SI Aanhangsel, afdeling 2 en Tabel S3). Ons het slegs 3 voorkomste van identiese plasmiede gevind wat deur verskillende taksa bo spesievlak gedeel is, wat almal in streng kliniese omgewings voorgekom het. Sulke omgewings verteenwoordig egter 'n gespesialiseerde habitat, aangesien patogene voortdurend (her)ingestel word en aan kunsmatig hoë selektiewe druk onderwerp word deur middel van antibiotika en ontsmettingsmiddels (46, 47). Ons huidige studie is dus die eerste keer dat 100% identiese plasmiede wat buite genusgrense gedeel word, ooit in natuurlike omgewings waargeneem is. In die postgenomika-era is dit hoogs noemenswaardig omdat eksperimentele gasheerreekstoetse al dekades lank 'n algemene hulpmiddel in plasmiedbiologie is.

Ten spyte van sy alomteenwoordige globale verspreiding, is die mobiliseerbare RepL-tipe plasmied pLA6_12 voorheen in die Roseobacter-groep oor die hoof gesien. Hierdie kragtige HGT-vektor vertoon 'n buitengewone mate van bewaring en vervoer verskillende integrasiekassetmotiewe oor groot geografiese sowel as filogenetiese afstande. Gevolglik dien dit as 'n aanwyser vir baie onlangse globale HGT-gebeure, wat 'n hoër konnektiwiteit van die pangenoom van hierdie bakteriese groep weerspieël as wat voorheen aanvaar is. Dit is waarskynlik dat daardie baie klein pLa6_12-agtige plasmiede meer doeltreffend gemobiliseer kan word as groter. Die meerderheid van die waargenome integrasiekassette verleen weerstand teen gifstowwe en xenobiotika, wat vinnige aanpassings aan die onderskeie besoedelende stowwe in mariene habitatte kan weerspieël. Ons het dit geïllustreer deur eksperimenteel die funksie van die chromaatvervoerdergeengroepering in die pLA6_12-plasmied van M. anthonyi La 6. Hierdie geengroepering het 'n 10 tot 20× toename in chromaatweerstand van tot 2,5 mM verleen, wat omtrent 'n faktor van 1 000 hoër is as die beraamde gemiddelde chroomkonsentrasie in oop seewaters (48, 49). Dit behoort dus die oorlewing van sy gasheerbakterie in swaar besmette habitatte te verseker. Die replikasie en instandhouding van plasmiede is egter 'n metaboliese las vir die gasheerbakterie (50) en die verwante fiksheidskoste lei waarskynlik tot 'n geleidelike uitkompetisie van die plasmiedbevattende stamme in die afwesigheid van chroom. Gevolglik verwag ons 'n hoër frekwensie van hierdie plasmiedtipe in mariene habitats met hoër konsentrasies van hierdie swaarmetaal. Verder, in die lig van die breë reeks veranderlikheid van die RepL-kassette (Fig. 2), verseker die waargenome teenwoordigheid van pLA6_12-agtige plasmiede in die mariene pangenoom waarskynlik die vinnige aanpasbaarheid van Roseobacter by veranderende konsentrasies van besoedeling. Daar kan aanvaar word dat so 'n uiterste verdraagsaamheid nie noodwendig onder die meeste omgewingstoestande relevant is nie, maar presies is wat van 'n bykomstige geen verwag kan word. Daar word verwag dat enige gene wat nodig is om by permanente veranderinge in omgewingstoestande aan te pas, uiteindelik deel van die onderskeie kerngenoom van die organisme sal word.

Die pLA6_12-agtige plasmiedtipe blyk beperk te wees tot mariene habitatte, aangesien ons spesifiek terrestriese (en limniese) metagenome gesoek het en geen voorbeeld van hierdie plasmiedtipe daar gevind het nie. Nietemin word berig dat oppervlakstrome soos die Golfstroom 0,4 tot 1,2 m/s (51) bereik, wat hulle denkbare verspreidingsmeganismes maak. Verder kan ballaswater wat in vragskepe vervoer word ook 'n beduidende faktor wees om verspreiding te bespoedig.

Die verspreide filogenetiese en biogeografiese verspreiding (Fig. 1 en 3) van hierdie kenmerk, gekombineer met sy lokalisering op 'n plasmied en sy afwykende kodongebruik (SI Aanhangsel, Fig. S1 en S2) illustreer duidelik die algemene gebruikbaarheid daarvan, maar nogtans gereelde intergenus HGT. Sulke horisontaal oorgedrade bykomstige gene is gewoonlik nie teenwoordig in elke lid van 'n mikrobiese gemeenskap nie, maar bevoordeel steeds die hele bevolking, dit wil sê wanneer aanpassings aan skielike veranderlike uiterste toestande vereis word (52, 53). Die globale verspreiding en uitsonderlike bewaring van pLA6_12-agtige plasmiede toon dus waarskynlik onlangse aanpassings aan wêreldwyd toenemende frekwensies van streeks- en tydelike stygings in toksienkonsentrasies van antropogeniese besoedeling (54, 55). In hierdie verband blyk dit 'n treffende analogie te vorm met die rol van antibiotika-weerstandsplasmiede vir multigeneesmiddel-weerstandige hospitaalpatogene (56, 57).

Verder besit die pendelvektore wat in hierdie studie gekonstrueer is 'n hoë biotegnologiese potensiaal vir genetiese manipulasies en heteroloë geenuitdrukking in Alfaproteobakterieë as gevolg van hul breë gasheerreeks en stabiliteit. Alhoewel die mobilisering van die plasmied afhang van die teenwoordigheid van 'n afsonderlike konjugatiewe plasmied wat 'n funksionele T4SSs huisves vir die vorming van die konjugasiepilus binne dieselfde bakteriële gasheersel, verminder dit nie die toepaslikheid daarvan vir die fasilitering van geenoordrag tussen Roseobacter-groeplede nie: Sulke stelsels is baie algemeen binne hierdie groep. Ons studie illustreer dus die potensiële impak van hierdie onlangs ontdekte vektor op HGT-gebaseerde aanpassingsmeganismes in bakteriese gemeenskappe wêreldwyd. Ten slotte, pLA6_12-agtige plasmiede is globetrottende konjugasie rylopers, wat waarskynlik 'n belangrike rol speel in bakteriese evolusie.


Hoe kan ons tydens die proses van plasmied-isolasie seker wees dat slegs plasmied-DNA geïsoleer is en daar geen chromosomale DNA is nie? - Biologie

Rekombinante DNA-tegnologie in die sintese van menslike insulien
in Roemeens vertaal deur Alexander Ovsov

Die aard en doel van die sintetisering van menslike insulien.

Sedert Banting en Best die hormoon, insulien in 1921 ontdek het. (1) diabetiese pasiënte wie se verhoogde suikervlakke (sien fig. 1) te wyte is aan verswakte insulienproduksie, is behandel met insulien afkomstig van die pankreaskliere van abattoirdiere. Die hormoon, geproduseer en afgeskei deur die beta-selle van die pankreas se eilandjies van Langerhans, (2) reguleer die gebruik en berging van voedsel, veral koolhidrate.

Fig. 1
Fluktuasies in diabeet se bloedglukosevlakke, in vergelyking met gesonde individue. Bron: Hillson, R. - Diabetes: 'n verder basiese gids, bl.16.

Alhoewel bees- en varkinsulien soortgelyk is aan menslike insulien, verskil hul samestelling effens. Gevolglik produseer 'n aantal pasiënte se immuunstelsels teenliggaampies daarteen, wat die werking daarvan neutraliseer en inflammatoriese reaksies by inspuitplekke tot gevolg het. By hierdie nadelige effekte van bees- en varkinsulien was vrese vir langtermynkomplikasies wat voortspruit uit die gereelde inspuiting van 'n vreemde stof, (3) sowel as 'n geprojekteerde afname in die produksie van dierlike insulien. (4) Hierdie faktore het daartoe gelei dat navorsers oorweeg het om Humulin te sintetiseer deur die insuliengeen in 'n geskikte vektor, die E. coli-bakteriese sel, in te voeg om 'n insulien te produseer wat chemies identies is aan sy natuurlik vervaardigde eweknie. Dit is bereik met behulp van Rekombinante DNA-tegnologie. Hierdie metode (sien fig. 2) is 'n meer betroubare en volhoubare (5) metode as om die abattoir neweproduk te onttrek en te suiwer.

Fig. 2
'n Oorsig van die herkombinasieproses. Bron: Novo - Nordisk-promosiebrosjure, bl 6.

Begrip van die betrokke genetika.

Chemies is insulien 'n klein, eenvoudige proteïen. Dit bestaan ​​uit 51 aminosure, waarvan 30 een polipeptiedketting uitmaak, en waarvan 21 'n tweede ketting uitmaak. Die twee kettings (sien fig. 3) word deur 'n disulfiedbinding verbind. (6)

Fig. 3
Bron: Chance, R. en Frank B. - Navorsing, ontwikkeling, produksie en veiligheid van Biosintetiese Menslike Insulien.

Die genetiese kode vir insulien word gevind in die DNA aan die bokant van die kort arm van die elfde chromosoom. Dit bevat 153 stikstofbasisse (63 in die A-ketting en 90 in die B-ketting). DNA Deoksiribolnukleïensuur), wat die chromosoom uitmaak, bestaan ​​uit twee lang ineengevlegde helices, saamgestel uit 'n ketting van nukleotiede, elk saamgestel uit 'n suiker deoksiribose, 'n fosfaat en stikstof basis. Daar is vier verskillende stikstofbasisse, adenien, timien, sitosien en guanien. (7) Die sintese van 'n bepaalde proteïen soos insulien word bepaal deur die volgorde waarin hierdie basisse herhaal word (sien fig. 4).

Fig. 4
DNA-string met die spesifieke nukleotiedvolgorde vir Insulienketting B. Bron: Gebaseer op die diagram in Watson, J.D., Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - Rekombinante DNA, bl 22.

Insuliensintese vanaf die genetiese kode.

Die dubbelstring van die elfde chromosoom van DNS verdeel in twee, wat ongepaarde stikstofbasisse blootstel wat spesifiek vir insulienproduksie is (sien fig. 5).

Fig. 5
Ontrafelende string van die DNA van chromosoom 11, met die blootgestelde nukleotiede wat vir die B-ketting van insulien kodeer. Bron: Gebaseer op die diagram in Watson, J.D., Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - Rekombinante DNA, bl 22.

Deur een van die blootgestelde DNA-stringe (sien fig.6) as 'n templaat te gebruik, vorm boodskapper-RNA in die proses van transkripsie (sien fig. 7).

Fig 6
'n Enkele string DNA wat vir Insulienketting B kodeer. Bron: Novo-Nordisk-promosiebrosjure, bl 13.

Fig. 7
Die (m) RNA-string. Bron: Novo-Nordisk-promosiebrosjure, bl 13.

Die rol van die mRNA-string, waarop die stikstofbasis timien deur urasiel vervang word, is om genetiese inligting, soos dié met betrekking tot insulien, vanaf die kern na die sitoplasma te dra, waar dit aan 'n ribosoom heg (sien fig. 8). .

Fig. 8
Proses van vertaling by die ribosoom. Bron: Novo-Nordisk-promosiebrosjure, bl 13.

Die stikstofbasisse op die mRNA word in drie gegroepeer, bekend as kodons. Dra RNA (tRNA) molekules oor, drie ongepaarde stikstofbasisse gebind aan 'n spesifieke aminosuur, gesamentlik bekend as 'n anti-kodon (sien fig.9) paar met komplementêre basisse (die kodons) op die mRNA.

Fig. 9
Bron: Novo-Nordisk-promosiebrosjure, bl 13.

Die lees van die mRNA deur die tRNA by die ribosoom staan ​​bekend as translasie. 'n Spesifieke ketting van aminosure word deur die tRNA gevorm volgens die kode wat deur die mRNA bepaal word. Die basisvolgorde van die mRNA is vertaal in 'n aminosuurvolgorde wat saamskakel om spesifieke proteïene soos insulien te vorm.

Die Vektor (Gram negatiewe E. coli).

'n Verswakte stam van die gewone bakterie, Escherrichia coli (E. coli) (sien fig. 10), 'n bewoner van die menslike spysverteringskanaal, is die 'fabriek' wat in die genetiese manipulering van insulien gebruik word.

Fig. 10
Die insulien word in 'n E. coli-sel soos hierdie ingebring. Bron: Novo-Nordisk-promosiebrosjure, bl 16 .

Wanneer die bakterie voortplant, word die insuliengeen saam met die plasmied gerepliseer, (8) 'n sirkelvormige snit van DNS (sien fig. 11). E. coli produseer ensieme wat vinnig vreemde proteïene soos insulien afbreek. Deur mutantstamme te gebruik wat nie hierdie ensieme het nie, word die probleem vermy. (9)

Fig. 11
Elektronmikrograaf van die Vector se plasmied. Bron: Watson, J.D., Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - Rekombinante DNA, bl 73.

In E. coli is B-galaktosidase die ensiem wat die transkripsie van die gene beheer. Om die bakterieë insulien te laat produseer, moet die insuliengeen aan hierdie ensiem gekoppel word.

Binne-in die genetiese ingenieur se gereedskapkis.

Beperkingsensieme, wat natuurlik deur bakterieë geproduseer word, tree op soos biologiese skalpels (10) (sien fig.12), en herken slegs spesifieke stukke nukleotiede, soos die een wat vir insulien kodeer. (11)

Fig 12
'n Analoog blik op Beperkingsensieme. Bron: CSIRO Research of Australia nr. 8.

Dit maak dit moontlik om sekere stikstofbasispare te skei en die gedeelte van insulienkoderende DNA van een organisme se chromosoom te verwyder sodat dit insulien kan vervaardig (Sien fig. 13). DNA-ligase is 'n ensiem wat as 'n genetiese gom dien, wat die taai punte van blootgestelde nukleotiede aanmekaar sweis.

Fig. 13
Bron: Watson, J.D., Gilman, M., Witkovski., Zoller, M. - Rekombinante DNA, bl 78.

Die eerste stap is om die DNA-kettings wat die spesifieke nukleotiedvolgordes dra wat die A- en B-polipeptiedkettings van insulien kenmerk, chemies te sintetiseer (sien fig. 14).

Fig. 14
Menslike insulienstruktuur. Aminosuur RNA na DNA omskakeling. Bron: Genetiese Ingenieursaktiwiteite, bl 176.

Die vereiste DNS-volgorde kan bepaal word omdat die aminosuursamestellings van beide kettings gekarteer is. Drie-en-sestig nukleotiede word benodig vir die sintetisering van die A-ketting en negentig vir die B-ketting, plus 'n kodon aan die einde van elke ketting, wat die beëindiging van proteïensintese aandui. 'n Antikodon, wat die aminosuur, metionien insluit, word dan aan die begin van elke ketting geplaas wat die verwydering van die insulienproteïen uit die bakteriese sel se aminosure moontlik maak. Die sintetiese A- en B-ketting-gene' (sien fig. 15) word dan afsonderlik in die geen ingevoeg vir 'n bakteriële ensiem, B-galaktosidase, wat in die vektor se plasmied gedra word. Op hierdie stadium is dit van kardinale belang om te verseker dat die kodons van die sintetiese geen versoenbaar is met dié van die B-galaktosidase.

Fig. 15
Bron: Watson, J.D., Gilman, M.,Witkovski., Zoller, M. - Rekombinante DNA, bl 456.

Die rekombinante plasmiede word dan in E. coli-selle ingebring. Praktiese gebruik van rekombinante DNA-tegnologie in die sintese van menslike insulien vereis miljoene kopieë van die bakterieë wie se plasmied met die insuliengeen gekombineer is om insulien te produseer. Die insuliengeen word uitgedruk soos dit met die B-galaktosidase repliseer in die sel wat mitose ondergaan (sien fig. 16).

Fig. 16
Die proses van mitose. Bron: Novo-Nordisk-promosiebrosjure, bl 11.

Die proteïen wat gevorm word, bestaan ​​gedeeltelik uit B-galaktosidase, wat aan óf die A- of B-ketting van insulien verbind is (sien fig.17). Die A- en B-kettings word dan uit die B-galaktosidase-fragment onttrek en gesuiwer.

Fig. 17
Bron: Watson, J.D., Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - Rekombinante DNA, bl 456.

Die twee kettings word gemeng en weer verbind in 'n reaksie wat die disulfiedkruisbrûe vorm, wat lei tot suiwer Humulin - sintetiese menslike insulien (sien fig. 18).

Fig. 18
Menslike insulien molekule. Bron: Bron: Watson, J.D., Gilman, M., Witkovski, J., Zoller, M. - Rekombinante DNA, bl 456.

Biologiese implikasies van geneties gemanipuleerde rekombinante menslike insulien.

Menslike insulien is die enigste dierlike proteïen wat in bakterieë gemaak is op so 'n manier dat die struktuur daarvan absoluut identies is aan dié van die natuurlike molekule. Dit verminder die moontlikheid van komplikasies as gevolg van die produksie van teenliggaampies. In chemiese en farmakologiese studies het kommersieel beskikbare Rekombinante DNA menslike insulien bewys dat dit nie van pankreas menslike insulien onderskei kan word nie. (12) Aanvanklik was die groot probleem wat ondervind is die kontaminasie van die finale produk deur die gasheerselle, wat die risiko van kontaminasie in die fermentasiebouillon verhoog het. Hierdie gevaar is deur die bekendstelling van suiweringsprosesse uitgewis. Wanneer die finale insulienproduk aan 'n reeks toetse onderwerp word, insluitend die beste radio-immuno-toetstegnieke (13), kan geen onsuiwerhede opgespoor word nie. (14) Die hele prosedure word nou uitgevoer met behulp van gisselle as 'n groeimedium, aangesien hulle 'n byna volledige menslike insulienmolekule met 'n perfekte driedimensionele struktuur afskei. Dit verminder die behoefte aan komplekse en duur suiweringsprosedures.

Die kwessie van hipoglukemiese komplikasies by die toediening van menslike insulien.

Sedert varkinsulien uitgefaseer is, en die meerderheid insulienafhanklike pasiënte nou met geneties gemanipuleerde rekombinante menslike insulien behandel word, het dokters en pasiënte bekommerd geraak oor die toename in die aantal hipoglukemie-episodes wat ervaar word. (15) Alhoewel hipoglukemie soms met enige tipe insulien verwag kan word, beweer sommige mense met diabetes dat hulle minder bewus is van aanvalle van hipoglisemie sedert hulle oorskakel van dierlike insulien na Rekombinante DNA menslike insulien.(16) In 'n Britse studie, gepubliseer in die 'Lancet', is hipoglukemie veroorsaak by pasiënte wat óf varkvleis óf menslike insulien gebruik. Die navorsers het gevind dat "geen beduidende verskil in die frekwensie van tekens van hipoglisemie tussen gebruikers van die twee verskillende tipes insulien" ." (17)

'n Anekdotiese verslag van 'n Britse pasiënt wat vir dertig jaar insulienafhanklik was, het verklaar dat sy herhalende, ongekende hipoglisemie begin ervaar het eers nadat sy Rekombinante DNA menslike insulien vervang het met dierlike insulien. Nadat sy teruggeskakel het na varkinsulien om haar verstand te verlig, het sy geen onaangekondigde hipoglukemie ervaar nie. Eli Lilly en Co., 'n vervaardiger van menslike insulien, het opgemerk dat 'n derde van mense met diabetes, wat al meer as tien jaar insulienafhanklik is, "hul hipoglisemiese waarskuwingseine verloor, ongeag die tipe insulien wat hulle neem." (18)

Dr Simon P. Wolff van die University College of London het in 'n uitgawe van Nature gesê: "Sover ek kan uitmaak, is daar geen fout (met die menslike insulien) nie." Hy het tot die gevolgtrekking gekom: "Ek dink wel ons moet 'n studie hê om die moontlike risiko te ondersoek." (19)

Alhoewel die produksie van menslike insulien onbetwisbaar deur die meerderheid insulienafhanklike pasiënte verwelkom word, kan die bestaan ​​van 'n minderheid diabete wat ontevrede is met die produk nie geïgnoreer word nie. Alhoewel dit nie 'n nuwe geneesmiddel is nie, moet die insulien afkomstig van hierdie nuwe metode van produksie steeds bestudeer en geëvalueer word, om te verseker dat al die gebruikers die geleentheid het om 'n komplikasievrye bestaan ​​te geniet.


Kyk die video: What is a Plasmid? - Plasmids 101 (Oktober 2022).