Inligting

Pyura DNA onttrekking

Pyura DNA onttrekking



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek sukkel met genomiese DNA-onttrekking uit verskillende monsters van Pyura chilensis; die DNA word afgebreek soos op die jel gesien kan word.

Ons het nog altyd GeneJET Genomiese DNA-suiweringskit (deur ThermoFisher) gebruik en dit werk goed vir monsters van ander spesies; so die kit is nie die probleem nie.

Ons het nog altyd weefselmonsters gebruik wat in 95% Etanol gestoor is (wat met water gewas word voor DNS-ekstraksie), maar die probleem duur voort, ongeag of die monsters een dag oud of 'n paar jaar oud is. Die bergingsmetode werk blykbaar goed vir gDNA-ekstraksie van ander spesies.

Dan, my raaiskoot is dat die probleem by Pyura self is. So ek moet uitvind of óf die onttrekking óf die berging nie geskik is vir Pyura nie. Ek lees dat Pyura baie koper in het. Ons het beplan om 'n nuwe buffer te gebruik om dit te berg: sout Versadigde DMSO, wat EDTA bevat.

Ek wil graag vra of enige van julle al ooit met hierdie organisme gewerk het (en as julle het, hoe het julle dit dan reggekry om DNS daaruit te onttrek). Het jy enige voorstelle oor enige DNA-suiweringsprotokolle?

1ste baan is die leer (1kb) en laaste 3 bane met lang vaag ding in plaas van bande is my DNA monsters.


Met verwysing na jou jelfoto lyk die genomiese DNS (in die drie Pyura-monsterbane) nie erg gedegradeer nie. As die groottemerker 1 Kb-leer is, dan is die meerderheid van die DNA van hoë molekulêre grootte. Tydens ekstraksie is dit algemeen dat DNS met 'n hoë molekulêre gewig tot 'n mate "geskeer" word (meganies opgebreek in kleiner fragmente). Dit kan verskyn as die flou afwaartse smeer. Die bane kan ook ietwat oorlaai wees. Jy kan probeer om meer sagte onttrekkingstegniek te gebruik en kyk of dit tot jou bevrediging help. Enige van die wat jy noem sal werk.

Sleg afgebreekte genomiese DNA sal verskyn as 'n meer intense "smeer" naby die onderste gedeelte van die 1 Kb grootte standaard.


Dit is uit 'n gepubliseerde werk deur Segovia et al. 2017:

Mantelweefsel (0,2 g) van elke individu is gebruik om DNA te onttrek met behulp van die DNeasy Blood® & Tissue Kit (QIAGEN®, VSA) volgens die vervaardiger se instruksies. Hoeveelheid/suiwerheid van DNA is gemeet in Nanodrop 2 000 (Thermo, VSA).

Hulle het SNP-identifikasie vanaf die genoom gedoen. So ek neem aan dat hul gDNA van ordentlike gehalte sou gewees het.


Pyura DNA-ekstraksie - Biologie

Verslag van Sistematiese Dierkunde Lab Practicum, Augustus, 2010

Sitochroom c oksidase subeenheid I gedeeltelike volgorde van 'n vermeende kalanoïde kopepod verkry uit Pyura vitata (Chordata: Ascidiacea: Pleurogona: Pyuridae)

Afdeling Biologie, Departement Biologiese Wetenskappe, Skool vir Natuurwetenskappe, Hokkaido Universiteit, Sapporo 060-0810, Japan

Materiaal en metodes
'n Ascidian is subgety by Oshoro Bay, Hokkaido, Japan, ongeveer 43°12&primeN, 140°51&primeE verkry, op 31 Mei 2010 deur Shin Hayase, gefotografeer en geïdentifiseer deur Hiroshi Kajihara as Pyura vitata gebaseer op Nishikawa (1992: 600, pl. 144-1) voor vasgestel in 99% EtOH. DNA is uit die spysverteringskanaal van die monster onttrek, met behulp van die silika-metode (Boom et al. 1990) met enkele wysigings. Onttrekte DNA is opgelos in 30 &mikrol gedeïoniseerde water en is by &ndash20°C bewaar. Oorblywende morfologiese koopbewysmonster is by die Hokkaido Universiteit Museum onder die katalogusnommer ICHU22080146 gedeponeer (kontak: Dr. Hiroshi Kajihara, [email protected]).
'n Ongeveer 600-bp fragment van mitochondriale sitochroom c oksidase subeenheid I geen (COI) is geamplifiseer deur polimerase kettingreaksie (PCR) met behulp van LCO1490 (5&prime-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3&prime) en HCO2198 (5&prime-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAATCA-3&prime) (Folmer et al. 1994). 'n Warmstart-PKR is uitgevoer deur 'n termiese siklusmasjien, iCycler (Bio-Rad), in 'n 20-&mikrol reaksievolume wat 1 &mikrol templaat totale DNA (ongeveer 10&ndash100 ng) en 19 &mikrol voormengsel gemaak met 632-&mikrol gedeïoniseerde water bevat, 80-&mikrol Bv Taq Buffer (TaKara Bio), 64-&mikrol dNTP (elk 25 mM), 8-&mikrol elke onderlaag (elk 10 &mikroM), en 0.1-&mikrol TaKara Ex Taq (5 U/&mikrol,TaKara Bio). Termiese siklustoestand het bestaan ​​uit 'n aanvanklike denaturering by 95°C vir 30 sek. 30 siklusse van denaturering by 95°C vir 30 sek., uitgloeiing by 45°C vir 30 sek., en verlenging by 72°C vir 45°C vir 45°C en 'n finale vir 72 min.C.
Die PCR-produk is gesuiwer met die silika-metode (Boom et al. 1990). Beide stringe is met 'n BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) volgens die vervaardiger se protokol volgens die vervaardiger se protokol, met dieselfde primer-stel as die aanvanklike PCR-amplifikasie gebruik. Volgordebepaling is uitgevoer met ABI Prism 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Chromatogram- en volgordedata is met MEGA v4-sagteware (Tamura et al. 2007).

Resultate en bespreking
'n Totaal van 606 bp van COI-volgorde is verkry. 'n Nukleotied BLAST-soektog na hierdie volgorde by die Nasionale Sentrum vir Biotegnologie-inligting het egter aangedui dat die volgorde waarskynlik van 'n kalanoïede koppeut kom, eerder as die ascidian. Daar word tot die gevolgtrekking gekom dat daar sorg gedra moet word om spysverteringskanaal te vermy vir DNA-ekstraksie van ascidians.

Taksonomie
Filum Chordata
Klas Ascidiacea
Familie Pyuridae Hartmeyer, 1908
Genus Pyura Molina, 1782
Pyura vitata (Stimpson, 1852)
(Fig. 1)



Fig. 1. Pyura vitata (Stimpson, 1852) (ICHU22080146), syaansig.

Boom, R., Sol., C. J. A., Salimans, M. M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M. E., en van der Noordaa, J. 1990. Vinnige en eenvoudige metode vir suiwering van nukleïensure. Tydskrif vir Kliniese Mikrobiologie28: 495&ndash503.

Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R. en Vrijenhoek, R. 1994. DNA-inleiders vir amplifikasie van mitochondriale sitochroom c oksidase subeenheid I van diverse metazoïese ongewerwelde diere. Molekulêre Mariene Biologie en Biotegnologie 3: 294&ndash299.

Nishikawa, T. 1999. Chordata. Bl. 573&ndash608. In: Nishimura, S. (Red.) Gids tot seestranddiere van Japan met kleurprente en sleutels. Vol. II. Hoikusha, Osaka. xii+pls 73&ndash144+663 pp.

Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. en Kumar, S. 2007. MEGA4: Molekulêre Evolusionêre Genetika Analise (MEGA) sagteware weergawe 4.0. Molekulêre Filogenetika en Evolusie 24: 1596&ndash1599.


Bylaag
COI-volgorde van ICHU22080146 (geïdentifiseer as die ascidian Pyura vitata), alhoewel dit waarskynlik 'n kalanoïde koppeut verteenwoordig.


Hierdie kort aktiwiteit help studente om een ​​van die belangrikste molekules op die planeet, DNA, te visualiseer. Die aktiwiteit kan gedoen word met eenvoudige materiaal wat in die meeste huise voorkom. Ons gebruik piesangs, maar aarbeie of ander vrugte wat sag genoeg is om te stamp, kan ook gebruik word. Die aktiwiteit is geskryf vir studente op 'n middelskool of hoër vlak, maar met meer intensiewe leiding is hierdie aktiwiteit nuttig vir studente van enige ouderdom.

Tyd benodig: 45 minute

  • Een houer seep en sout behoort meer as genoeg te wees vir 'n groot klas om te gebruik, maar ons stel voor om twee van elk byderhand te hê vir ingeval.
  • Hierdie aktiwiteit werk oor die algemeen beter met klein groepe studente wat elkeen aan hul eie piesangonttrekking werk. Dit maak dit ook waarskynlik dat ten minste een groep baie sigbare DNA sal hê.
  • Maak seker dat jy ekstra ritssakke en ekstra koffiefilters byderhand het, ingeval enige breek.
  • As 'n koffiefilter breek en piesangpap val op die bodem van die glas, gooi dit terug in die sak, maak 'n nuwe filter vas en gooi die pap stadiger terug, laat dit dreineer terwyl jy skink.

Uitbreidings:

Wanneer dit gekombineer word met bykomende leeswerk van Ask A Biologist, of bykomende kort opdragte, kan hierdie DNS-ekstraksie-aktiwiteit aan verskeie leerstandaarde voldoen.

  • Die storie "DNA ABC's" sal studente help om die belangrikheid van DNS vir die lewe te verstaan, sowel as die chemiese en fisiese struktuur van DNS.
  • Die storiebladsy "Getting Genetics Straight" sal studente help om tussen gene en chromosome te onderskei, en allele te verstaan.
  • Vir hoërskoolleerlinge sal die storie "Beheer gene" hulle help om proteïensintese te verstaan.
  • Studente kan probeer om uit te vind hoeveel DNA in 'n volwasse menslike liggaam is. Jy kan óf die volgende inligting aan hulle verskaf, óf hulle aanlyn daarvoor laat soek:

      Sellulêr

      • Die storie "Boublokke van die lewe" sal studente help om die selstruktuur en funksie te verstaan.
      • Die storie "Selle wat in selle leef" sal studente help om die verskillende seltipes wat bestaan, te verstaan.
      1. Studente sal begryp dat klein molekules tasbaar is.
      2. Studente sal aanwysings volg en verstaan ​​dat basiese chemikalieë (soute en skoonmaakmiddels) gebruik kan word om selle en seldele af te breek en om molekules aan ander molekules te laat kleef.
      3. UITBREIDING: Studente sal 'n basiese begrip van die struktuur van DNS kry.
      4. UITBREIDING: Studente sal selle verstaan ​​en dat hulle die selmembraan en die kernmembraan uitmekaar gebreek het om die DNA te bereik.

      DNA-ekstraksie tegniek

      In hierdie eksperiment is 'n doelwit om die DNA uit 'n vrugmonster te onttrek. Sommige kennis van die wetenskaplike agtergrond agter DNS-ekstraksie is nodig om dit te doen.

      Die DNS-ekstraksieproses is 'n redelik eenvoudige biochemiese prosedure wat in drie hoofstappe verdeel kan word: oopbreek van die sel (lise), vernietig membrane binne die sel en presipiteer die DNS uit die oplossing.

      Die volgende afdelings beskryf hoe elke stap verband hou met die fisiese en biochemiese eienskappe van DNS.


      • DNA-ekstraksiebuffer: 1000 ml gedeïoniseerde water, 50 ml helder skottelgoedwasmiddel, 1 teelepel sout
      • Aarbei (ander vrugte werk ook)
      • Ziploc sak, Koffie filters en tregters
      • Proefbuise, bekers of koppies om filtraat te versamel
      • Etanol of 91% isopropylalkohol (verkoel)

      1. Voeg 'n aarbei (of helfte) by 'n Ziploc-bêresak.
      2. Voeg 10 ml van die DNS-ekstraksiebuffer by en druk die aarbei en buffer vir ongeveer een minuut fyn.
      3. Gebruik 'n tregter en koffiefilters om die aarbeisap in 'n beker te filtreer.
      4. Dra die oor filtreer na 'n proefbuis, moet jy net die proefbuis omtrent halfvol vul en vermy om enige skuim oor te dra.
      5. Gooi of drup koue alkohol stadig bo-oor die aarbeimengsel. Jy wil 'n enkele laag bo-op die aarbeimengsel hê.
      6. Wit stringe sal in die etanollaag vorm, gebruik 'n roerstaaf of tandestokkie om die stringe op te spoel.


      Inleiding

      Met duisende beskryfde spesies vorm ascidians, of see squirts (filum: Chordata, subfilum: Tunicata, klas: Ascidiacea) 'n unieke groep sessiele mariene nie-gewerwelde chordate (Shenkar en Swalla 2011 Shenkar et al. 2012). As gevolg van hul sistematiese sleutelposisie as 'n vertebrate-susterklade (Delsuc et al. 2006 Singh et al. 2009), speel ascidians 'n deurslaggewende rol in evolusionêre ontwikkelingstudies en het dit belangrike diermodelle in vergelykende genomika geword (Dahlberg et al. 2009) . Uit die ekologiese oogpunt dra hul relatief kort lewensiklus, hul vermoë om in eutrofiese (voedingstofryke) omgewings en 'n gebrek aan beduidende roofdiere by tot hul sukses in nuut-ingevoerde omgewings (Lambert 2001 Shenkar en Loya 2008). Die gevolg is dat ascidians een van die ergste mariene indringerspesies is en dat hul inbringtempo gedurende die afgelope dekade toegeneem het (Lambert 2009). Dit is dus noodsaaklik om gereedskap te ontwikkel wat ons in staat stel om nie-inheemse van inheemse spesies te onderskei en die bronpopulasies van die ingevoerde spesies vas te stel. Ongelukkig is ascidiese sistematiek berug moeilik, want spesies word meestal geklassifiseer op grond van innerlike anatomiese karakters soos gonade of ingewande lusvorm en posisies, en taksakstrukture (Monniot et al. 1991). Gevolglik kom verkeerde identifikasies van ascidiese spesies gereeld voor (Mastrototaro en Dappiano 2008 Lambert 2009). Molekulêre volgordes verskaf 'n manier om spesie-identifikasie aan te vul, veral in situasies waar tradisionele morfologie-gebaseerde diskriminasie van taksa onvoldoende is (Geller et al. 2010). Molekulêre merkers, en in die besonder mitochondriale (mt) DNA-volgordes, bied dus 'n kragtige alternatief vir die morfologiese benadering. As 'n voorbeeld, mt DNA is suksesvol gebruik om die bestaan ​​van twee kriptiese spesies in die kosmopolitiese ascidian ondubbelsinnig te demonstreer Ciona intestinalis (Iannelli, Pesole, et al. 2007). Nieteenstaande is ascidians vinnig-ontwikkelende spesies (Yokobori et al. 1999, 2005 Tsagkogeorga, Turon, et al. 2010), 'n kenmerk wat die gebruik van hul molekulêre karakters bemoeilik om hul evolusionêre geskiedenis af te lei (Delsuc et al. 2006). Meer spesifiek, ascidiese mt-genome is hiperveranderlik in byna alle genomiese kenmerke, wat byvoorbeeld uiters hoë koerse van volgorde-divergensie en ongebreidelde geenorde-herrangskikkings insluit, selfs by lae taksonomiese vlakke soos in aangebore en kriptiese spesies (Iannelli, Griggio, et al. . 2007 Gissi et al. 2010). Hierdie uiters vinnige evolusie van ascidiese mt-genome maak hul volgordeversterking 'n uitdagende taak, wat op sy beurt die skaarsheid van hierdie opeenvolgende genome verklaar. Ons het dus ten doel gehad om 'n eenvoudige en doeltreffende metode te ontwikkel waardeur volledige ascidiese mt-genome maklik verkry kan word.

      Volgende-generasie volgordebepaling (NGS) tegnologieë het dataverkryging in biologie 'n rewolusie teweeggebring. Alhoewel volgordebepalingsprotokolle oorspronklik ontwikkel is om 'n genoom of transkripsie uit 'n enkele organisme te onttrek, is dit moontlik om verskeie monsters in 'n enkele vloeisel te meng (d.w.s. multiplekse volgordebepaling) solank die volgordes van die verskillende monsters daarna geskei kan word. Standaard multipleksmetodes laat toe om tot 96 verskillende monsters saam te voeg deur strepieskodes (of etikette) tydens die DNS-biblioteekvoorbereiding in te voer (Binladen et al. 2007). Na die opeenvolgingstap word leeswerk geskei op grond van hul strepieskodeetikette, sodat samestelling vir elke monster afsonderlik uitgevoer word. Die voordeel van hierdie benadering is die moontlikheid om 'n afweging te maak tussen die totale aantal lesings beskikbaar vanaf 'n enkele NGS-lopie en die aantal leeswerk wat benodig word om 'n gewenste dekking vir elke individuele monster te verkry. Die nadeel van so 'n benadering is egter dat dit die bou van aparte genomiese biblioteke vir elke monster vereis, wat duur kan wees. Verskeie studies het voorgestel om verskeie monsters te meng sonder om hulle te strepieskodeer en die rye eers na die samestellingstap te skei (Pollock et al. 2000 McComish et al. 2010 Timmermans et al. 2010 Dettai et al. 2012). Ons verwys hier slegs na nie-teoretiese studies. In Timmermans et al. (2010), was die nasamestelling skeiding gebaseer op lokaasvolgorde, wat kort reekse (200𠄱,000 bp) is wat vir elke monster verkry is deur gebruik te maak van Sanger-volgordebepaling. In McComish et al. (2010), is die skeiding uitgevoer deur die saamgestelde contigs te vergelyk met 'n stel nouverwante verwysing mt-genome. Beide Timmermans et al. (2010) en McComish et al. (2010) se volgorde van lang polimerase kettingreaksie (PCR) geamplifiseerde fragmente wat die hele mitogenoom dek. Ongelukkig is die verkryging van lang PCR-fragmente uiters moeilik in manteldiere as gevolg van die deurdringende geenorde-herrangskikkings. Daarbenewens kan PCR artefakte soms aanleiding gee tot chimeriese mt contigs (Timmermans et al. 2010).

      In hierdie werk het ons gekies om die Illumina-platform te gebruik om totale genomiese uittreksels van verskeie spesies wat saam gemeng is, te volgorde. Dus, beide kern- en mt-DNS-fragmente van veelvuldige spesies is saam gevolgorde, en die mtDNA-volgorde is rekenaarmatig deur die samestellingstap herwin. Ons benadering is soortgelyk aan dié wat Groenenberg et al. (2012), wat die volledige mitogenoom van 'n slak verkry het deur Illumina-volgordebepaling en de novo-samestelling van die totale DNA wat uit 'n enkele museummonster onttrek is. Na aanleiding van Timmermans et al. (2010), is lokaasvolgorde hier gebruik om die mt-volgorde van elke monster te identifiseer eerder as nouverwante volgordes, soos in McComish et al. (2010), aangesien ons byvoorbeeld die eerste verteenwoordiger van 'n familie wie se filogenetiese posisie gedebatteer word, gerangskik het (bv. Corellidae Tsagkogeorga et al. 2009). Die voordeel van ons 𠇋rute force” benadering is dat dit nie afhang van spesifieke primers of verrykingsprotokolle nie en dit is blind vir mt geenorde. Deur hierdie benadering te gebruik, het ons vyf nuwe volledige mitogenome suksesvol saamgestel: Rhodosoma turcicum (Phlebobranchia: Corellidae), Botrilloides aff. leachii en Polycarpa mytiligera (Stolidobranchia: Styelidae), Halocynthia spinosa, en Pyura gangelion (Stolidobranchia: Pyuridae) (fig. 1 A en CF, onderskeidelik). Daarbenewens, met behulp van die standaard PCR en Sanger volgordebepaling benaderings, het ons die mt genoom van verkry Ascidiella aspersa (Phlebobranchia: Ascidiidae) ( fig. 1 B). Ons beskryf en bespreek ons ​​nuwe benadering tot mtDNS-volgordebepaling deur gebruik te maak van NGS-tegnologie, tesame met die kenmerke van hierdie ses nuwe ascidiese mt-genome in terme van genoomorganisasie en filogenetiese sein.

      Ascidian spesies wat in hierdie werk opeenvolgend is. (A) Rhodosoma turcicum (Coellidae), (B) Ascidiella aspersa (Ascidiidae), (C) Botrilloides aff. leachii (Styelidae), (D) Polycarpa mytiligera (Styelidae), (E) Halocynthia spinosa (Pyuridae), en (F) Pyura gangelion (Pyuridae).


      Suiwering en konsentrasie van DNA uit waterige oplossings

      Hierdie eenheid bied basiese prosedures vir die manipulering van oplossings van enkel- of dubbelstring-DNS deur suiwerings- en konsentrasiestappe. Hierdie tegnieke is nuttig wanneer proteïene of opgeloste stofmolekules uit waterige oplossings verwyder moet word, of wanneer DNS-oplossings gekonsentreer moet word. Die

      , deur gebruik te maak van fenolekstraksie en etanol (of isopropanol) presipitasie, is geskik vir die suiwering van DNA vanaf klein volumes (<0.4 ml) by konsentrasies laer as 1 mg/ml. Drie ondersteuningsprotokolle skets metodes om die fenol wat in ekstraksies gebruik word te buffer, DNS te konsentreer deur butanol te gebruik, en oorblywende organiese oplosmiddels met eter te onttrek. 'n Alternatief vir hierdie metodes is nukleïensuursuiwering met behulp van glaskrale en dit word ook aangebied. Hierdie protokolle kan ook gebruik word vir die suiwering van RNA. Die laaste twee alternatiewe protokolle word gebruik om RNA te konsentreer en DNA uit groter volumes en uit verdunde oplossings te onttrek en te presipiteer, en vir die verwydering van lae-molekulêre gewig oligonukleotiede en trifosfate.


      DNA-onttrekking uit plantblare met 'n mikronaaldpleister

      Isolasie van hoë-gehalte DNA van besmette plantmonsters is 'n noodsaaklike stap vir die molekulêre opsporing van plantpatogene. DNS-isolasie van plantselle omring deur rigiede polisakkariedselwande behels egter ingewikkelde stappe en vereis laboratoriumtoerusting. As gevolg hiervan is plant-DNS-ekstraksie tans beperk tot goed toegeruste laboratoriums en monstervoorbereiding het een van die groot struikelblokke geword vir molekulêre opsporing van plantpatogene op die terrein. Om hierdie struikelblok te oorkom, is 'n eenvoudige DNS-ekstraksiemetode uit plantblaarweefsel ontwikkel. 'n Mikronaald (MN) pleister gemaak van polivinielalkohol (PVA) kan plant- of patogene DNA van verskillende plantspesies binne 'n minuut isoleer. Tydens DNA-ekstraksie dring die polimeriese MN-pleister in plantblaarweefsel in en breek stewige plantselwande om intrasellulêre DNA te isoleer. Die onttrekte DNA is polimerase kettingreaksie (PCR) amplifiseerbaar sonder bykomende suiwering. Hierdie minimaal indringende metode is suksesvol onttrek Phytophthora infestans DNA van besmette tamatieblare. Boonop kan die MN-pleister gebruik word om DNS van ander plantpatogene direk in die veld te isoleer. Dit het dus groot potensiaal om 'n vinnige, ter plaatse monstervoorbereidingstegniek vir plantpatogeen-opsporing te word. © 2020 deur John Wiley & Sons, Inc.

      Basiese Protokol: Mikronaald-pleister-gebaseerde DNA-ekstraksie

      Ondersteuningsprotokol 1: Vervaardiging van mikronaaldpleister

      Ondersteuningsprotokol 2: Intydse PCR-amplifikasie van mikronaald-pleister-onttrekte DNA


      Verwysings

      Sinha R, Abu-Ali G, Vogtmann E, Fodor AA, Ren B, Amir A, Schwager E, Crabtree J, Ma S, Abnet CC, et al. Assessering van variasie in mikrobiese gemeenskap amplikon volgordebepaling deur die Mikrobioom Kwaliteit Beheer (MBQC) projek konsortium. Nat Biotechnol. 201735:1077–86.

      Costea PI, Zeller G, Sunagawa S, Pelletier E, Alberti A, Levenez F, Tramontano M, Driessen M, Hercog R, Jung FE, et al. Op pad na standaarde vir menslike fekale monsterverwerking in metagenomiese studies. Nat Biotechnol. 201735:1069–76.

      Die Menslike Mikrobioom Projek Konsortium. Struktuur, funksie en diversiteit van die gesonde menslike mikrobioom. Natuur. 2012486:207–14.

      Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, Nielsen T, Pons N, Levenez F, Yamada T, et al. 'n Menslike ingewande mikrobiese geenkatalogus opgestel deur metagenomiese volgordebepaling. Natuur. 2010464:59–65.

      Marotz C, Amir A, Humphrey G, Gaffney J, Gogul G, Knight R. DNA-onttrekking vir vaartbelynde metagenomika van diverse omgewingsmonsters. Biotegnieke. 201762:290–3.

      Wesolowska-Andersen A, Bahl MI, Carvalho V, Kristiansen K, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Licht TR. Keuse van bakteriese DNA-ekstraksiemetode uit fekale materiaal beïnvloed gemeenskapstruktuur soos geëvalueer deur metagenomiese analise. Mikrobioom. 20142:19.

      Franzosa EA, Morgan XC, Segata N, Waldron L, Reyes J, Earl AM, Giannoukos G, Boylan MR, Ciulla D, Gevers D, et al. Verwant aan die metatranskriptoom en metagenoom van die menslike ingewande. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111:E2329–38.

      Horz HP, Scheer S, Huenger F, Vianna ME, Conrads G. Selektiewe isolasie van bakteriese DNA van menslike kliniese monsters. J Microbiol Metodes. 200872:98–102.

      Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, Zaramela LS, Knight R, Zengler K. Verbetering van speeksel haelgeweer metagenomics deur chemiese gasheer DNA uitputting. Mikrobioom. 20186:42.

      Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C, Cooper A, Knight R, Weyrich LS. Besoedeling in lae mikrobiese biomassa mikrobioom studies: kwessies en aanbevelings. Tendense Microbiol. 201927:105–17.

      Salter SJ, Cox MJ, Turek EM, Calus ST, Cookson WO, Moffatt MF, Turner P, Parkhill J, Loman NJ, Walker AW. Reagens- en laboratoriumbesoedeling kan volgorde-gebaseerde mikrobioomontledings krities beïnvloed. BMC Biol. 201412:87.

      Glassing A, Dowd SE, Galandiuk S, Davis B, Chiodini RJ. Inherente bakteriese DNA kontaminasie van ekstraksie en volgordebepaling reagense kan interpretasie van mikrobiota in lae bakteriële biomassa monsters beïnvloed. Ingewande Pathog. 20168:24.

      Minich JJ, Zhu Q, Janssen S, Hendrickson R, Amir A, Vetter R, Hyde J, Doty MM, Stillwell K, Benardini J, et al. KatharoSeq maak 'n hoë-deurset mikrobioom-analise van lae-biomassa monsters moontlik. mSystems. 20183.

      Morales E, Chen J, Greathouse KL. Samestellingsanalise van die menslike mikrobioom in kankernavorsing. Metodes Mol Biol. 19282019:299–335.

      Dejea CM, Wick EC, Hechenbleikner EM, White JR, Mark Welch JL, Rossetti BJ, Peterson SN, Snesrud EC, Borisy GG, Lazarev M, et al. Mikrobiota-organisasie is 'n duidelike kenmerk van proksimale kolorektale kankers. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111:18321–6.

      Bullman S, Pedamallu CS, Sicinska E, Clancy TE, Zhang X, Cai D, Neuberg D, Huang K, Guevara F, Nelson T, et al. Analise van Fusobacterium volharding en antibiotika reaksie in kolorektale kanker. Wetenskap. 2017358:1443–8.

      Huseyin CE, Rubio RC, O'Sullivan O, Cotter PD, Scanlan PD. Die swamgrens: 'n vergelykende ontleding van metodes wat gebruik word in die studie van die menslike dermmikobioom. Voorste mikrobiol. 20178:1432.

      Rosenbaum J, Usyk M, Chen Z, Zolnik CP, Jones HE, Waldron L, Dowd JB, Thorpe LE, Burk RD. Evaluering van mondholte DNA ekstraksie metodes op bakteriese en swam mikrobiota. Sci Rep. 20199:1531.

      Shkoporov AN, Ryan FJ, Draper LA, Forde A, Stockdale SR, Daly KM, McDonnell SA, Nolan JA, Sutton TDS, Dalmasso M, et al. Reproduceerbare protokolle vir metagenomiese analise van menslike fekale fageome. Mikrobioom. 20186:68.

      Kim D, Hofstaedter CE, Zhao C, Mattei L, Tanes C, Clarke E, Lauder A, Sherrill-Mix S, Chehoud C, Kelsen J, et al. Optimalisering van metodes en ontduiking van slaggate in mikrobioomnavorsing. Mikrobioom. 20175:52.

      Hornung BVH, Zittink RD, Kuijper EJ. Kwessies en huidige standaarde van kontroles in mikrobioomnavorsing. FEMS Microbiol Ecol. 201995. https://doi.org/10.1093/femsec/fiz045

      Sinha R, Ahsan H, Blaser M, Caporaso JG, Carmical JR, Chan AT, Fodor A, Gail MH, Harris CC, Helzlsouer K, et al: Volgende stappe in die bestudering van die menslike mikrobioom en gesondheid in voornemende studies, Bethesda, MD, 16-17 Mei 2017. Mikrobioom 2018, 6:210.

      Sinha R, Abnet CC, White O, Knight R, Huttenhower C. Die mikrobioom kwaliteit beheer projek: basislyn studie ontwerp en toekomstige rigtings. Genoom Biol. 201516:276.


      Biologielaboratoriumverslag oor die ekstraksie van Chlorofiel

      Opsomming Hierdie eksperiment het gefokus op die onttrekking en skeiding van pigmente van Chloroplast. Vir die prosedure is groen blare in 'n mortier met 'n paar chemikalieë gemaal en die vloeistof is gefiltreer om vir verdere ontleding te gebruik. Strepe van hierdie oplossing is op 'n filtreerpapier geplaas en later, nadat dit gedroog is, in 'n baken van oplosmiddel geplaas. Hierna is die chloroplastpigmente deur die oplosmiddel in groepe van min of meer oplosbare pigmente geskei.

      Doel Hoeveel pigmenttipes is teenwoordig in 'n groen blaar? Daar word gehoop om die vier verskillende pigmenttipes van 'n blaar te kan identifiseer.

      Aangesien die filtreerpapier met die oplosmiddel die pigmente in terme van oplosbaarheid sal skei, word verwag dat 'n duidelike segmentering van elkeen sal pronk. Aangesien verskeie chemikalieë in die hele proses van hierdie laboratorium gebruik is, kon sekere veranderlikes die resultate beïnvloed het in terme van die suiwerheid van elke chemiese stof of suiwerheid van die gebruikte filtraat.

      Agtergrond Die chloroplast is basies die organel wat verantwoordelik is vir fotosintese.

      Struktureel is dit baie soortgelyk aan die mitochondria. Dit bevat 'n deurlaatbare buitenste membraan, 'n minder deurlaatbare binnemembraan, 'n tussenruimte en 'n binneste gedeelte wat die storms genoem word. Die chloroplast is egter groter as die mitochondria. Dit moet die groter grootte hê, want sy membraan is nie in Cristal gevou nie. Die binnemembraan word ook nie vir die elektronvervoerketting gebruik nie.

      Trouens, die eerste filtraat wat ons gebruik het, het nie eers genoeg pigmente bevat wat op die oplosmiddel gereageer het om enige bruikbare resultate te skep nie. Nadat die metodes vir die filtraat en papierstrook oorgedoen is, het die oplosmiddel sy werk begin doen. Binne ongeveer 10 minute het die oplosmiddel stadig in die papier opgesuig tot by die grys potloodlyn. Dan, nadat die strook gedroog het, kon 'n mens baie skaars twee duidelike kleure identifiseer, elk net 'n paar millimeter van elkeen daar: 'n blouerige groen en 'n geelgroen lyn.

      Onderwyser Glen het toe vir ons 'n skaal gegee waarop ons elke pigmentstrook met sy individuele kleur moet identifiseer, sy afstand in verhouding tot die oorsprong (die eerste lyn wat met die filtraat getrek word) moet meet en dan die REF moet bereken. Eers moes 'n mens die presiese kleur van elkeen identifiseer, dit was 'n bietjie problematies, as gevolg van die omvang van verskillende toonsoorte teenwoordig. Soos voorgestel in figuur 1 of Datatabel 2, is daar 'n vasgestelde volgorde van die verspreiding van elke kleurband. Die REF is volgens die volgende formule bereken: REF = Afstand Pigment gemigreer (mm)

      Afstand oplosmiddel front gemigreer (mm) Figuur 1 – Karoteen (oranje) – Karoteen – Psigoanalispigmente in Chloroplast – Chlorofil – Chlorofil A (blougroen) – Konklusie Chlorofil B (yel) Soos verwag het die oplosmiddel veroorsaak dat die pigmente na hul oplosbaarheidsgroepe migreer. Die geelgroen Chlorofil B was die eerste band wat ons geïdentifiseer het, het slegs mm migreer en die blougroen Chlorofil A het mm migreer. Dit het vir ons gesê dat daar slegs chlorofil in die groen blare teenwoordig was, hoewel ander studente wat hierdie eksperiment ook uitgevoer het, verskillende resultate behaal het.

      Die enigste kwessie wat genoem kan word oor die algehele laboratorium ontwerp is die kamers’ ventilasiestelsel. Nadat die bottel met die oplosmiddel oopgemaak is, het die hele kamer binne slegs 'n paar minute 'n baie intense reuk gehad wat 'n paar studente duiselig of hoofpyn laat voel het. Daar is geen werklike voorstelle vir hierdie probleem nie, behalwe om met die skool se onderhoudspan te praat en hulle te vertel om die waaiers reg te stel. Die redes vir die vreemde resultate kon slegs afgelei word as gevolg van die feit dat miskien die chemikalieë wat vir hierdie eksperiment gebruik is, nie suiwer genoeg was nie, sowel as die selfgemaakte filtraat.


      Kyk die video: Знакомство с методами выделения геномной ДНК Genomic DNA Isolation techniques overview (Augustus 2022).