Inligting

Wat is genoomwye analise en lokusspesifieke analise

Wat is genoomwye analise en lokusspesifieke analise


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek lees 'n paar artikels oor genetiese variasies en ek sien daar is twee tipes analise, een is genoomwye genetiese variasie analise en tweede een is lokus spesifieke genetiese variasie analise. Ek verstaan ​​nie wat hierdie twee, genoomwye en lokusspesifieke analise beteken nie en wat is die verskil tussen hierdie twee analises of hoekom het ons albei tipe analise nodig?


Welkom by Biology.SE!

'n Lokus (plur. loci) is 'n gebied van arbitrêre grootte op 'n chromosoom. 'n Lokus kan 'n enkele nukleotied wees of dit kan baie groter wees (soos $10^7$ terreine).

'n Genoomwye analise is dus 'n analise wat die hele genoom gelyktydig gebruik terwyl 'n lokusspesifieke analise dieselfde analise is wat op die vlak van individuele lokusse uitgevoer word.

Om 'n analogie te maak, as 'n genoomwye analise soos 'n landwye analise is, dan is 'n lokusspesifieke analise soos 'n stadspesifieke analise.

Sonder meer konteks sal dit nie moontlik wees om meer as dit te sê nie!


Biologiese roete-analise

Ramakanth Chirravuri Venkata, Dario Ghersi, in Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology, 2019

Padanalise in genoomwye assosiasiestudies

Genome Wide Association Studies (GWAS) gebruik statistiese modelle om die verband tussen variante (Single Nucleotide Polimorphisms) en fenotipes te ondersoek. Ten spyte van die debat oor statistiese betekenisvolheid teenoor biologiese relevansie in die wetenskaplike gemeenskap, was GWAS 'n belangrike bron vir die generering van nuwe hipoteses in die veld van genetika. GWAS is geneig om geskik te wees vir die opsporing van algemene variante wat met spesifieke fenotipes geassosieer word (Teslovich et al., 2010 Visscher et al., 2012). In die geval van komplekse siektes kan die assosiasie van individuele variante met spesifieke fenotipe egter uitdagend wees as gevolg van hul klein effekgroottes. Nog 'n aansienlike probleem met GWAS is dat hulle streng p-waarde drempels gebruik wat vir meervoudige hipotesetoetsing gekorrigeer word, om vals positiewe te beheer. Hierdie drempel kan soms ontslae raak van matig beduidende gene wat biologies geloofwaardige kandidate vir genotipe-fenotipe assosiasies kan verteenwoordig (Jia) et al., 2011 ).

Padanalise kan hierdie probleme aansienlik verlig deur die gekombineerde effekte van verwante enkelvariante te ondersoek, en ook deur te help met die identifisering van verwante nuwe variante wat met die fenotipes geassosieer word. Padanalise ondersoek assosiasie met die fenotipe van belang deur geenstelle in plaas van individuele gene te gebruik (Kao et al., 2016 Zhong et al., 2010). Padanalise van GWAS-studies bestaan ​​oor die algemeen uit drie stappe: (1) bepaling van geenstelle wat geskik is vir padanalise (bv. Gene Ontology (Ashburner) et al., 2000) of KEGG (Ogata et al., 1999 )) (2) die kartering van variante aan hul onderskeie gene en (3) die gebruik van statistiese modelle om assosiasies te ondersoek.


Molekulêre basis van veneuse ontoereikendheid

GEERT W. SCHMID-SCHÖNBEIN , in The Vein Book , 2007

GENETIESE MEGANISME

Genetiese koppelingsanalise het aan die lig gebring dat daar pasiënte is met familiale risikofaktore. 'n Wanbalans tussen kollageen I en kollageen III is gevind in proksimale segmente van menslike spatare saphenous are benewens fragmentasie van elastien fibrille. 144 Die proporsie kollageen tipe III is aansienlik verminder in gekweekte gladdespierselle en dermale fibroblaste afkomstig van pasiënte met spatare wat 'n tekort aan kollageen tipe III aandui. 145 So 'n tipe hermodellering van die ekstrasellulêre matriks is voorgestel as gevolg van aktivering van matriksmetalloproteïnases (MMP's). Uitdrukking van MMP-1, MMP-2, MMP-9 en weefselinhibeerder van metalloproteïnases-1 is voorgestel 146,147 met 'n moontlike wanbalans tussen hierdie ensieme en hul inhibeerders.


In situ Spyke-in beheer in elke monster

Hoë kwaliteit data word verseker selfs in nie-tradisionele organismes

Metielasieverhouding Korrelasie

Die waargenome metileringsvlakke van 'n piek-in-kontrole wat bestaan ​​uit 6 unieke dubbelstrengs sintetiese amplikone wat spesifieke DNA-metileringsvlakke het wat wissel van 0 tot 100% is hoogs gekorreleer met verwagte metileringsvlak deur gebruik te maak van konvensionele WGBS. Ontleding van stygingsbeheer met behulp van ons bioinformatiese diens verseker dat hoë kwaliteit data in elke enkele monster geproduseer word.

Bisulfiet-omskakelingsdoeltreffendheid

Bisulfiet-omsettingsdoeltreffendheid van verskeie spesies bereken met gebruik van beide nie-CpG-konteks van gDNA en in situ-spit-in-kontrole toon dat die piek-in-beheer 'n beter meting is vir bisulfiet-omsettingsdoeltreffendheid wanneer daar met nie-tradisionele organismes gewerk word wat metilering in nie- CpG konteks


Materiale en Metodes

Stamme en Genome

Stam K-10 (Li et al., 2005, 2019), Telford (Brauning et al., 2019) en S397 (Bannantine et al., 2012) is by hierdie studie ingesluit as verwysings van die belangrikste afstammelinge wat na vore gekom het tydens die evolusie van Kaart. Isolate is gepropageer op hellings van gemodifiseerde Middlebrook 7H11 aangevul met 20% (vol/vol) hitte-geïnaktiveerde pasgebore kalfserum, 2.5% (vol/vol) gliserol, 2 mM asparagien, 10% (vol/vol) Middlebrook oliesuur-albumien- dekstrose-katalase (OADC) verrykingsmedium (Becton Dickinson, Oxford, Oxfordshire, Verenigde Koninkryk), Selectatabs (kode MS 24 MAST Laboratories Ltd., Merseyside, Verenigde Koninkryk), en 2 μg ml-1 mikobaktien J (Allied Monitor, Fayette, MO, Verenigde State). Die volledige genoomvolgorde van K-10 (C-tipe, NC_002944.2), Telford (S-tipe subtipe I, NZ_CP033688.1) en S397 (S-tipe subtipe III, NZ_CP053749.1) is afgelaai vanaf die NCBI RefSeq ( O’Leary et al., 2016 Tabel 1). S397 is geannoteer met behulp van PGAP (Tatusova et al., 2016).

Tabel 1. Besonderhede van die stamme en genome wat gebruik is en inligting oor die aantal kopieë van die IS900.

In vitro IS900-RFLP

Mycobacterium avium subsp. paratuberkulose stamme is getipeer deur BstEII IS900-RFLP soos voorheen beskryf (Thibault et al., 2007). Profiele is aangewys volgens nomenklatuur wat voorheen beskryf is (Collins et al., 1997 Pavlik et al., 1999 Mobius et al., 2009). Profiele is ontleed met behulp van Bionumerics TM sagteware weergawe 7.6.3 (Applied Maths, België).

Bioinformatiese analise

IS900 Volgorde Identifikasie en in silico IS900 RFLP werkvloei

Ons het 'n in silico ontledingspyplyn vir IS900 RFLP-profilering met behulp van volledige genoomvolgordes as die inset (Figuur 1). As 'n eerste stap, almal BstEII-beperkingsplekke is in die genoom geleë met behulp van interne skrif (beskikbaar by: https://forgemia.inra.fr/public-pgba/is900-rflp-in-silico) ontwikkel met Biopython (v1.76) (Cock et al. al., 2009). IS900 kopieë in die genoomvolgorde is geïdentifiseer deur gebruik te maak van 'n blastn weergawe 2.9.0 (Altschul et al., 1990) soektog van IS900 volgorde verkry vanaf die NCBI databasis (toegangsnr. X16293) met 'n persentasie identiteit van 99% en 'n e-waarde van 1e-100 om alle vals positiewe treffers uit te sluit. Vir elke treffer, stroomop en stroomaf rye naaste aan die BstEII-beperkingswerwe is van die BstEII beperking kaart en lengte van die BstEII-fragment is bereken. 'n Jel-migrasievergelyking is voorheen met behulp van GelAnalyzer 19.1 1 bepaal en gebruik om fragmentlengte in migrasieafstand om te skakel vir verdere visualisering van die RFLP-profiel. Migrasiedata en koördinate van IS900 kopieë is in onderskeidelik .tsv- en .rflp-lêers gestoor vir visualisering van die profiel en verdere ondersoek van lokusverspreiding. Visualisering van RFLP-profiele is uitgevoer met behulp van python-biblioteek matplotlib (v3.3.0) 2 .

Figuur 1. Bioinformatiese analise pyplyn. Besonderhede van stappe wat deur die IS uitgevoer word900 RFLP in silico pyplyn. Van volledige genoomvolgordes, BstEII beperking werf en IS900 volgorde posisies is geïdentifiseer. Beide datastelle word saamgevoeg om die te onttrek BstEII-fragmentgroottes vanaf die genoomvolgorde. Vorige posisies IS900 en volgorde-oriëntasie word in 'n.rflp-lêer gestoor vir verdere ontleding. BstEII fragment groottes word omgeskakel na migrasie afstand gebaseer op berekening van 'n in vitro gelmigrasie (sien afdeling “Materiale en Metodes”) en gestoor in die .tsv-lêer vir verdere visualisering van die RFLP-profiel.

IS900 Volgorde-polimorfisme

Om IS te bevestig900 volgorde polimorfismes wat voorheen beskryf is (Semret et al., 2006 Castellanos et al., 2009), IS900 kopieë van die drie genome is onttrek en in lyn gebring met behulp van Multalin (Corpet, 1988) met die 𠇍NA” simbool vergelyking tabel. Korter IS900 kopieë in die belyning is handmatig nagegaan met Artemis sagteware weergawe 18.1.0 (Carver et al., 2008) om ontploffingsresultate te bevestig.

Mauve belyning

Synteny-belynings is met Mauve bepaal (snapshot_2015-02-13 build 0) (Darling et al., 2004). Ten einde vals aanduidings van inversies of ander herrangskikkings te vermy, is hierdie genome eers verskuif om by die dnaA geen voor Mauve-analise. Deur die volledige genoomvolgorde van elke stam te gebruik, het ons 'n 1 vs. 1 genoombelyning uitgevoer met behulp van progressiewe Mauve (Darling et al., 2010) en ook 'n belyning van die drie genoomvolgordes om verskille in genomiese organisasie te visualiseer.

Ortologie Analise

Om IS te identifiseer900 kopieë wat by ortoloë genomiese terreine tussen die genome van K-10, Telford en S397 ingevoeg is, het ons blastn-soektogte uitgevoer met behulp van as navrae, 2 000 bp stroomop en stroomaf genomiese streke wat elke IS flankeer900 kopieer. Hierdie ortoloë flankerende streke van een genoom is in lyn gebring met die twee ander genome en vergelyk om ortoloë lokusse te identifiseer. Daarom is blastn-resultate ontleed om die beste pasmaat te kies. Die beste pasmaat is gedefinieer met die volgende kriteria: (1) an e-waarde van 0 en (2) 'n minimum dekking van 80%. Vir baie flankerende streke het ontploffing slegs een resultaat opgelewer. Maar vir 'n paar ander is meer as een resultaat teruggegee. In gevalle waar die dekking van die beste resultaat onder 80% is, het ons ander resultate rondom 4 000 bp vanaf die eerste resultaat gesoek om genoomherrangskikking/verskille te identifiseer en dit saam te voeg. Ten slotte is ortoloë lokusse beskou as gekoppel aan 'n IS900 liggings as die middelpunt van die BLAST-treffer binne die 2 000 bp-streek val wat die IS flankeer900 element in die teikengenoom.

IS900 Sites Gene Ontologie Verrykingsanalise

Hierdie benadering het ten doel gehad om te bepaal of die gene naby invoegplekke verryk is vir enige spesifieke funksie. Proteïenvolgordes stroomop en stroomaf van IS900 is onttrek, indien beskikbaar, uit die RefSeq-aantekening. Funksionele annotasie is uitgevoer met behulp van eggNOG-mapper-2.0.1 (Huerta-Cepas et al., 2017) gebaseer op eierNOG-ortologiedata (Huerta-Cepas et al., 2019). Volgordesoektogte is uitgevoer met behulp van DIAMOND weergawe 2.0.5 (Buchfink et al., 2015).

Identifisering van die kandidaat-invoegplekke

Ten einde geteikende invoegplekmotiewe in die genome van te identifiseer Kaart, 10 bp van stroomop en stroomaf volgorde van elke IS900 onttrek is. Elke string van die IS-element is oorweeg en onttrekde rye is omgekeerd aangevul indien nodig. Invoegingsreekse wat delesies of duplisering bevat, is uitgesluit van die analise. Multalin (Corpet, 1988) is gebruik om stroomop en stroomaf rye in lyn te bring deur die 𠇍NA” simboolvergelykingstabel te gebruik. Die belyning van die stroomopvolgorde is uitgevoer met “gap penalty at opening” gestel op 1 en “gap penalty at extension” gestel op 0. Die belyning van die stroomafvolgorde is uitgevoer met verstekparameters. Stroomop en stroomaf IS900 flankerende streke van elke genoom is in lyn gebring met die M. avium subsp. hominissuis (Mah) 104 genoom met behulp van blastn om ortoloë streke te vind. Slegs aangrensende streke is behou. Vermeende teikenvolgordes, wat voorheen in die drie genome geïdentifiseer is, is met die hand uit die Mah 104 genoom met behulp van Artemis sagteware weergawe 18.1.0 (Carver et al., 2008) gebaseer op blastn resultate. MEME weergawe 5.3.1 (Bailey en Elkan, 1994) is gebruik om 'n vermeende teikenterreinmotief te identifiseer.


Inleiding

Aambeie is normale anale vaskulêre kussings gevul met bloed by die aansluiting van die rektum en die anus. Daar word aanvaar dat hul hoofrol by mense is om kontinensie te handhaaf1 maar ander funksies soos die waarneming van volheid, druk en waarneming van anale inhoud is voorgestel gegewe die sensoriese innervasie.2 Hemorroïdale siekte (hierna verwys as HEM) vind plaas wanneer aambeie vergroot en word simptomaties (soms geassosieer met rektale bloeding en jeuk/vuil) as gevolg van die agteruitgang of insakking van die ankerbindweefsel, die verwyding van die hemorroïdale pleksus of die vorming van bloedklonte. Ernstige vorme van HEM vereis dikwels chirurgiese behandeling en die verwydering van abnormaal vergrote en/of trombose aambeie.1 HEM-voorkoms neem toe met ouderdom en toon verbysterende syfers wêreldwyd (tot 86% voorkoms in sommige verslae),3 waarvolgens 'n groot deel van die gevalle oorbly. onopgemerk as asimptomaties of lig genoeg om self met oor-die-toonbank behandeling behandel te word. HEM verteenwoordig 'n aansienlike mediese en sosio-ekonomiese las met 'n geraamde jaarlikse koste van VS$800 miljoen in die VSA alleen, hoofsaaklik verwant aan die groot aantal aambeie wat elke jaar uitgevoer word.4

'n Aantal HEM-risikofaktore is voorgestel, insluitend menslike regop posisie. Die stywe anale verseëling wat deur die uitgebreide hemorroïdale pleksus verskaf word, kan ontwikkel het tydens menslike evolusie wat saam met permanente tweevoetigheid voorkom, soos getoon deur ons histologie-vergelyking van vier verskillende soogdiere (mens, gorilla, bobbejaan, muis aanlyn aanvullende figuur 1, aanlyn aanvullende materiaal 1 ). Ander voorgestelde risikofaktore is 'n sittende leefstyl, vetsug, verminderde dieetvesel-inname, spandeer oortollige tyd op die toilet, inspanning tydens ontlasting, strawwe opheffing, hardlywigheid, diarree, bekkenbodem disfunksie, swangerskap en natuurlike geboorte, met verskeie wat kontroversieel gerapporteer is. Die hipotetiese model wat in aanlyn aanvullende figuur 2 getoon word, som die kontemporêre konsepte met betrekking tot die patofisiologie van HEM-ontwikkeling op.5 Tot vandag is HEM-etiopatogenese swak ondersoek, en nóg die presiese molekulêre meganismes nóg die rede(s) waarom slegs sommige mense HEM ontwikkel, is bekend. . Genetiese vatbaarheid kan 'n rol speel in HEM-ontwikkeling, maar geen grootskaalse, genoomwye assosiasiestudie (GWAS) vir HEM is nog ooit uitgevoer nie. Om die bydrae van genetiese variasie tot die genetiese argitektuur van HEM te evalueer, het ons 'n GWAS-meta-analise uitgevoer in 218 920 geaffekteerde individue en 725 213 bevolkingskontroles van Europese afkoms.

Aanvullende materiaal


10.5: Kwantitatiewe Eienskap Lokus (QTL) Analise

  • Bygedra deur Todd Nickle en Isabelle Barrette-Ng
  • Professore (Biologie) by Mount Royal Universiteit en Universiteit van Calgary

Die meeste van die fenotipiese eienskappe wat algemeen in inleidende genetika gebruik word, is kwalitatief, wat beteken dat die fenotipe slegs in twee (of moontlik 'n paar meer) diskrete, alternatiewe vorms bestaan, soos óf pers óf wit blomme, óf rooi of wit oë. Daar word dus gesê dat hierdie kwalitatiewe eienskappe vertoon diskrete variasie. Aan die ander kant vertoon baie interessante en belangrike eienskappe voortdurende variasie hierdie vertoon 'n deurlopende reeks fenotipes wat gewoonlik kwantitatief gemeet word, soos intelligensie, liggaamsmassa, bloeddruk by diere (insluitend mense), en opbrengs, watergebruik of vitamieninhoud in gewasse. Eienskappe met deurlopende variasie is dikwels kompleks en toon nie die eenvoudige Mendeliaanse segregasieverhoudings (bv. 3:1) wat met sommige kwalitatiewe eienskappe waargeneem word nie. Baie komplekse eienskappe word ook sterk deur die omgewing beïnvloed. Nietemin kan daar dikwels gewys word dat komplekse eienskappe 'n komponent het wat oorerflik is, en wat dus een of meer gene moet betrek.

Hoe kan gene, wat geërf word (in die geval van 'n diploïed) as hoogstens twee variante elk, die wye reeks aaneenlopende variasie wat vir baie eienskappe waargeneem word, verklaar? Die gebrek aan 'n onmiddellik ooglopende verduideliking vir hierdie vraag was een van die vroeë besware teen Mendel se verduideliking van die meganismes van oorerwing. By verdere oorweging word dit egter duidelik dat hoe meer lokusse wat bydra tot eienskap, hoe meer fenotipiese klasse kan vir daardie eienskap waargeneem word (Figuur (PageIndex<1>)).

As die aantal fenotipiese klasse groot genoeg is (soos met drie of meer lokusse), kan individuele klasse nie van mekaar onderskei word nie (veral wanneer omgewingseffekte ingesluit word), en die fenotipe verskyn as 'n deurlopende variasie (Figuur (PageIndex< 2>)). Dus word kwantitatiewe eienskappe soms genoem poligeniese eienskappe, want daar word aanvaar dat hul fenotipes beheer word deur die gekombineerde aktiwiteit van baie gene. Let daarop dat dit nie impliseer dat elk van die individuele gene 'n gelyke invloed op 'n poligeniese eienskap het nie &ndash sommige kan 'n groot effek hê, terwyl ander slegs gering is. Verder kan enige enkele geen meer as een eienskap beïnvloed, of hierdie eienskappe kwantitatiewe of kwalitatiewe eienskappe is.

Figuur (PageIndex<2>): Hoe meer lokusse wat 'n eienskap beïnvloed, hoe groter is die aantal fenotipiese klasse wat verwag kan word. Vir sommige eienskappe is die aantal bydraende lokusse so groot dat die fenotipiese klasse in oënskynlik deurlopende variasie saamsmelt. (Oorspronklik-Deyholos-CC:AN)

Ons kan molekulêre merkers gebruik om ten minste sommige van die gene (dié met 'n groot invloed) wat 'n gegewe kwantitatiewe eienskap beïnvloed, te identifiseer. Dit is in wese 'n uitbreiding van die karteringstegnieke wat ons reeds vir diskrete eienskappe oorweeg het. 'n QTL kartering eksperiment sal ideaal begin met twee suiwer teel lyne wat baie van mekaar verskil ten opsigte van een of meer kwantitatiewe eienskappe (Figuur (PageIndex<3>)). Die ouers en al hul nageslag moet onder so na aan dieselfde omgewingstoestande as moontlik grootgemaak word, om te verseker dat waargenome variasie te wyte is aan genetiese eerder as eksterne omgewingsfaktore. Hierdie ouerlyne moet ook polimorfies wees vir 'n groot aantal molekulêre lokusse, wat beteken dat hulle verskillende allele van mekaar by honderde lokusse moet hê. Die ouerlyne word gekruis, en dan hierdie F1 individu, waarin rekombinasie tussen ouerlike chromosome plaasgevind het, is selfbevrug (of teruggekruis). As gevolg van herkombinasie (beide oorkruising en onafhanklike assortiment), is elk van die F2 individue sal 'n ander kombinasie van molekulêre merkers bevat, en ook 'n ander kombinasie van allele vir die gene wat die kwantitatiewe eienskap van belang beheer (Tabel (PageIndex<1>)).

Figuur (PageIndex<3>): Strategie vir 'n tipiese QTL-kartering-eksperiment. Twee ouers wat verskil in 'n kwantitatiewe eienskap (bv. vrugtemassa) word gekruis, en die F1 is selfbevrug (soos aangedui deur die kruis-in-sirkel-simbool). Die F2 nageslag sal 'n reeks kwantitatiewe waardes vir die eienskap toon. Die taak is dan om allele van merkers van een ouer te identifiseer wat sterk gekorreleer is met die kwantitatiewe eienskap. Byvoorbeeld, merkers van die grootvrugte ouer wat altyd teenwoordig is in grootvrugte F2 individue (maar nooit in klein-vrugte individue) is waarskynlik gekoppel aan lokusse wat vrugmassa beheer.

Tabel (PageIndex<1>) Genotipes en kwantitatiewe data vir sommige individue van die kruisings wat in Figuur (PageIndex<8>) getoon word.

Figuur (PageIndex<4>): Plotte van vrugtemassa en genotipe vir geselekteerde lokusse uit Tabel (PageIndex<1>). Vir die meeste lokusse (bv. H) toon die genotipe geen beduidende korrelasie met vruggewig nie. Vir sommige molekulêre merkers sal die genotipe egter hoogs gekorreleer wees met vruggewig. Beide D en K beïnvloed vruggewig, maar die effek van genotipe by lokus D is groter as by lokus K. (Original-Deyholos-CC:AN)

CRISPR se vinnige styging skud genoomwye sifting op

'n Werklik ontwrigtende tegnologie, CRISPR-sifting verdring rofweg sy voorgangers en verfyn homself dan, soos getoon deur sy funksionele genomika-toepassings en sy vermoë om enkelsel-transkriptomika aan te vul

Met behulp van 'n genoomskaal, verlies-van-funksie CRISPR-skerm, het wetenskaplikes van die New York Universiteit, die New York Genome Center en die Icahn School of Medicine by die berg Sinai menslike gene en geenregulerende netwerke geïdentifiseer wat deur SARS-CoV- vereis word. 2. Die wetenskaplikes het ook getoon dat onderdrukking van hierdie gene en netwerke weerstand teen virale infeksie verleen. Byvoorbeeld, verlies van RAB7A sekwestreer effektief die ACE2-reseptor binne selle, wat verhoed dat dit as 'n toegangspunt vir die virus dien. [Vince Dittmer/NYGC]

CRISPR het nuus gekry vanweë sy potensiaal as 'n vorm van geenterapie. Maar CRISPR verdien ook aandag vanweë sy bydraes tot genoomwye sifting. Alhoewel hierdie bydraes gewoonlik publieke aandag ontsnap, is dit niks minder nie as revolusionêr.

Kort nadat CRISPR-geenredigering in 2012 aan die wêreld bekend gestel is, het navorsers onder leiding van Feng Zhang, PhD, kerninstituutlid by die Broad Institute of MIT en Harvard, begin om 'n genoomskaal-verlies-van-funksie-skerm te bou wat staatmaak op die CRISPR-Cas9 nuklease in plaas van klein interfererende RNA (siRNA). 1 Toe het CRISPR-sifting vinnig verskeie verfynings begin verkry. (Vir besonderhede, sien die sybalk hieronder, "Virstel van die basiese beginsels van CRISPR-sifting.")

Teen hierdie tyd het CRISPR-sifting 'n bekende tegniek geword. Maar dit word steeds kragtiger en meer gesofistikeerd. In hierdie artikel sal ons sien hoe CRISPR-sifting vooruitgang in geneesmiddelontwikkeling, funksionele menslike genomika en basiese wetenskap moontlik maak. Ons sal ook kyk na bloulug-ontwikkelings wat CRISPR-sifting selfs meer sal laat doen.

Karakterisering van kodering en nie-koderende elemente

Neville Sanjana, PhD, wat saam met die Zhang-laboratorium aan vroeë CRISPR-skerms gewerk het, sê sy groep by die New York Genome Centre (NYGC) en New York University (NYU) ontwikkel nou geenredigeringstegnologieë vir funksionele genomika-toepassings, met die ambisieuse doelwit om die funksie van al die elemente van die menslike genoom te verstaan ​​- beide kodering en niekodering.

Die Sanjana-laboratorium het skerms ontwikkel wat meer doen as net teikengene. "[Ons het] gekyk na nie-koderende streke soos transkripsiefaktorbindingsplekke [of] niekoderende RNA's, of [by] streke diep in intergeniese ruimte wat met algemene of seldsame siektes geassosieer word," sê Sanjana. "[Sommige van hierdie werk] het gelei tot wonderlike kliniese vertaling."

Die vernaamste voorbeeld van daardie kliniese vertaling was 'n niekoderende CRISPR-skerm wat 'n streek van die genoom geïdentifiseer het wat betrokke is by die onderdrukking van fetale hemoglobien. Die skerm het gewys dat wanneer daardie nie-koderende streek versteur is, fetale hemoglobien onderdruk kon word. Hierdie bevinding het gelei tot 'n nuwe terapeutiese teiken vir sekelselsiekte (SCD) en β-talassemie, twee siektes wat volwasse hemoglobien beïnvloed. 2

"Die presiese gids-RNA van ons CRISPR-skerm is wat eintlik gebruik word vir die eerste-in-mens CRISPR-terapie," merk Sanjana op. Daardie deurbraakterapie gebruik CRISPR-Cas9-geenredigering om die BCL11A geen spesifiek in bloedstamselle, wat veroorsaak dat hulle die fetale hemoglobiengeen heraktiveer. Die gemanipuleerde selle is toe suksesvol gebruik om twee pasiënte te behandel—een met SCD (Victoria Grey), en een met β-talassemie. (Die werk is gelei deur ondersoekers van CRISPR Therapeutics en Vertex Pharmaceuticals.)

’n Groot uitdaging in geenredigeringsterapieë is om wysigings in die regte seltipes te laat plaasvind. In hierdie geval is seltipe spesifisiteit 'n produk van die wysiging van die niekoderende genoom, omdat hierdie spesifieke niekoderende streek volgens Sanjana slegs in bloedselle funksioneel is. 3

Identifisering van gasheerfaktore vir SARS-CoV-2-infeksie

Meer onlangs het Sanjana en kollegas COVID-19 aangepak deur 'n CRISPR-skerm te ontplooi om elke geen in die menslike genoom in longselle uit te slaan om gene en weë te vind wat nodig is vir SARS-CoV-2-infeksie. Sanjana verduidelik dat die doel was om verskeie aanvalpunte te vind om die SARS-CoV-2-virus te blokkeer.

Die benadering is geïnspireer deur die suksesvolle ontwikkeling van antiretrovirale cocktails vir MIV wat virale ontsnappingsmutasies voorkom. Die mutasies vind andersins plaas wanneer die virus met 'n enkele antivirale middel uitgedaag word. Vir sommige van die topkandidaatgene wat betrokke is by virale toetrede, het 'n soektog na bestaande middels wat die proteïenprodukte van hierdie gene inhibeer leeg opgekom.

"Ons het gedink, kom ons kyk of daar dalk 'n ander algemene meganisme of konvergente pad is wat ons kan teiken," onthou Sanjana. Om hierdie werk uit te voer, het Sanjana en kollegas nog 'n nuwe CRISPR-siftingsinstrument opgetel. Die instrument word genoem "verbeterde CRISPR-versoenbare indeksering van transkriptome en epitope met volgordebepaling," of ECCITE-seq. Dit neem CRISPR-sifting tot op enkelselvlak terwyl proteïene en transkripsies parallel opgespoor word.

Daardie ontleding het gewys op die cholesterolbiosintese-weg en die verhoging van intrasellulêre cholesterol as 'n potensiële blok op virale infeksie. Hierdie sleutelontdekking het 'n magdom hartsiektemedisyne oopgemaak vir potensiële hergebruik. Met die hulp van ander spanlede het Sanjana die kalsiumkanaalblokker amlopidien, 'n FDA-goedgekeurde middel, ingeskakel en gevind dat dit 'n kragtige inhiberende effek op die virus het.

Kommersialisering van CRISPR-sifting

Maatskappye wat spesialiseer in CRISPR-sifting vir geneesmiddelontdekking en -ontwikkeling maak voordeel van enkelsel-ontledingsvermoëns. Enkelsel CRISPR-analise is byvoorbeeld 'n sleuteldiens van Cellecta, wat saamgevoegde lentivirale biblioteke met strepiesgekodeerde gids RNA (gRNA) uitdrukkingskassette bied om die ontledings bekend as Perturb-seq en CROP-seq (CRISPR druppelvolgorde) moontlik te maak.

Cellecta het tegnologie ontwikkel wat saamgevoegde genetiese sifting en enkelsel-uitdrukking-analise kombineer. Met hierdie tegnologie word individuele selle met unieke strepieskodes gemerk sodat subpopulasies van selle met duidelike fenotipes geïdentifiseer kan word. Omdat die strepieskodes ontwerp is om RNA-transkripsies in die selle uit te druk, is dit moontlik om te bepaal hoe variantselle op eksperimentele toestande reageer. Die opsporing van uitgedrukte strepieskode-RNA kan uitgevoer word met verskeie uitdrukkingsprofielmetodes.

In hierdie ontledings word genetiese steurnisse (geen-uitklop- of knock-downs) toegepas, en die gevolglike fenotipes word op die vlak van die transkripsie bestudeer om genetiese funksie af te lei. Streepieskodering van die gRNA's laat toe dat die saamgevoegde versteurings ontvou en met spesifieke fenotipes geassosieer word.

"'n Tipiese gebruik is 'n eksperiment in 'n heterogene selpopulasie," sê Donato Tedesco, PhD, Cellecta se direkteur van navorsing en ontwikkeling. "As jy 'n subset van selle binne die algemene bevolking wil identifiseer wat verskillende reaksies op 'n uitklophou het, is die enigste manier om dit te doen enkelselanalise."

Hy vertel dat Cellecta se kliënte dikwels CRISPR-skerms gebruik op soek na uitklophoue wat óf antagoniseer óf sinergiseer met 'n eksperimentele geneesmiddel, in eksperimente wat daarop gemik is om die middel se werkingsmeganisme te verduidelik.

Nog 'n maatskappy wat CRISPR-keuringsdienste aanbied, is Synthego, wat saam met farmaseutiese en biotegnologie-firmas werk. Vir Robert Deans, PhD, hoofwetenskaplike beampte van Synthego, kom die enkelsel-analise-tendens in CRISPR-sifting neer op outomatisering en robotika - en baie daarvan.

Synthego het masjienleer en outomatisering toegepas om die massiewe data-uitset van hierdie tipe eksperimente te hanteer. Daardie kragtige ontleding voer terug na die sifting. Die maatskappy kan doeltreffendheid verhoog deur aspekte van gidsontwerp aan te pas en die ribonukleêre proteïenkompleks te optimaliseer.

"Die naam van die speletjie, beide in teikenidentifikasie en in redigering vir GMP, is presisie," sê Deans. "Jy verminder die kompleksiteit van die skerm. Met groter akkuraatheid en akkuraatheid vereenvoudig jou stroomaf-ondervraging.”

Hy rapporteer dat die maatskappy verlede jaar kragtige data-krasing en 'n doeltreffende vastefase-sinteseplatform gebruik het om 'n navorsingsamewerking onder leiding van die Universiteit van Kalifornië, San Francisco, te help om die studie van potensiële behandelingsteikens vir koronavirusse te versnel. Synthego het meer as 1 000 gRNA's in net twee dae gesintetiseer, en dit het hierdie gRNA's gebruik om selle te ontwerp wat meer as 300 uitklophoue ingesluit het om gasheer-koronavirus-proteïeninteraksies te skerm. Net een persoon was nodig om in die outomatisering en werkvloei te skryf.

Die samewerking wat deur Synthego bygestaan ​​is, het uitgebrei op 'n vroeëre studie, een waarin 332 hoë-vertroue SARS-CoV-2-proteïen-menslike proteïen-interaksies gekarteer is om geneesmiddelhergebruiksgeleenthede te identifiseer. 4 In die vroeëre studie is verskeie middels genoem, insluitend plitidepsin, 'n kankermiddel wat deur PharmaMar bemark word.

Om uit te brei op die vroeëre studie, het die samewerking waaraan Synthego deelgeneem het gepoog om te bepaal watter koronavirus-proteïen-menslike proteïeninteraksies (nie net dié wat SARS-CoV-2 betrek nie, maar ander koronavirusse) goeie teikens kan wees vir middels wat bedoel is om virale replikasie te blokkeer. 5 Die poging het 'n kombinasie van in vitro virus-infektiwiteitstoetse en in silico-modellering behels.

In 'n persverklaring oor die pan-koronavirale studie het Synthego 'n aanhaling ingesluit wat toegeskryf word aan Nevan J. Krogan, PhD, 'n UCSF-navorser en een van die studie se leiers: “Die akkuraatheid en reproduceerbaarheid van CRISPR was die sleutel om ons te help bestudeer hoe SARS- CoV-2 affekteer sellulêre weë en veroorsaak uiteindelik siekte, wat ons validering van belowende terapeutiese teikens verbeter wat breë beskerming teen infeksie van koronavirus kan bied.”

Beide die SARS-CoV-2- en pan-koronavirale interaktoomstudies het 'n daaropvolgende studie ingelig wat op plitidepsien gefokus het. Hierdie studie, wat Krogan onder sy ooreenstemmende outeurs ingesluit het, het aangedui dat die middel doeltreffend is teen SARS-CoV-2 omdat dit die gasheerproteïen eEF1A teiken. 6 Plitidepsien is nou die onderwerp van 'n Fase III-studie wat daarop gemik is om pasiënte wat hospitalisasie benodig vir die bestuur van matige COVID-19-infeksie in te skryf.

Verbetering van die ontleding van multimodale versteuringsskerms

’n Nuwe berekeningsbenadering om data van CRISPR-sifting te ontleed is deur NYU- en NYGC-navorsers ontwikkel. Die benadering, wat mixscape genoem word, kan die sein-tot-geraas-verhouding verbeter in studies wat die gebruik van 'n saamgevoegde CRISPR-skerm kombineer om gene te versteur, en die gebruik van multimodale enkelsel-volgordebepalingstegnologieë om mRNA en oppervlakproteïenprofiele te versamel. In wese identifiseer en verwyder mixscape verwarrende bronne van variasie.

Volgens 'n onlangse studie het die navorsers mixscape ontwikkel om hulle te help verstaan ​​hoe kankerselle die regulering van sleutelgene verander, soos die geen wat die immuunkontrolepuntmolekule PD-L1 kodeer, om opsporing te vermy en die liggaam se immuunstelsel te ontduik. 7 Voor mixscape het die navorsers gesukkel om data van 'n multimodale ECCITE-volgende skerm te interpreteer, hoofsaaklik omdat 'n subset van selle versteuring deur die skerm se gRNA's "ontsnap" het, wat baie geraas in die data geskep het.

Die studie se hoofskrywer, Efthymia Papalexi, sê die idee vir mixscape is uit die veld van beeldherkenning ontleen. Mixscape modelleer elke versteuring as 'n mengsel van verskillende selreaksies. Deur dit te doen, kan dit selle identifiseer en verwyder wat CRISPR-versteuring vrygespring het, wat navorsers in staat stel om op die ware biologiese seine te fokus.

“With this approach, we can knock out a gene, discover the molecular pathways it controls, and then associate these pathways to cellular behaviors,” Papalexi explains. For example, when applying this method in cancer cell lines, the researchers discovered that two genes frequently mutated in lung cancers—the gene for the kelch-like protein KEAP1, and the gene for the transcriptional activator NRF2—regulate the expression levels of PD-L1. This finding suggests that the genes are important in tumor development and progression.

Looking into the future of CRISPR screening

The horizon beyond these foundational CRISPR-Cas9 screening components and conditions is already being explored. The Broad Institute’s John Doench, PhD, is blazing a trail in the area of alternate Cas enzymes. The standard CRISPR-Cas9 system originates from Streptococcus pyogenes. But CRISPR systems are abundant in nature, and there are plenty of other Cas nucleases that can be exploited, says Doench, who is focusing on a protein called Cas12a from Acidaminococcus.

“It has a particularly useful property: if you want to express multiple gRNAs, you can do so from just one small transcript,” Doench points out. “Because of that, the Cas12a enzyme is particularly useful for studying combinations.”

Combinations are key to exploring synthetic lethality, where a combination of genes contribute to cell death, rather than one alone. In cancer drug discovery, synthetic lethality can link two or more genes that, individually, might not be effective targets, but when combined are lethal to cancer cells. BRCA1 en PARP are the most famous synthetic lethal pair. Doench asserts that with Cas12a, it’s now possible to screen for synthetic lethal pairs to potentially identify new cancer targets.

In addition, blue-sky variations on CRISPR screening are emerging to build upon or even replace current technologies. Those include techniques like CRISPR activation, where an enzymatically inactive Cas9 is tailored to activate gene expression, and base editor screening, where individual mutations or variants are targeted instead of genes. With that kind of fine-grained targeting, researchers could pin down the effect of a single amino acid change on a drug’s activity.

Tanaz Abid, a research associate at the Broad Institute of MIT and Harvard, readies cells for a large-scale lentiviral production run to generate a library of guide RNAs. Her work helps to maintain and enhance the Broad’s Genetic Perturbation Platform, which supports functional investigations of the mammalian genome that can reveal how genetic alterations lead to changes in phenotype.

Base editor screens could finally crack the so-called V-to-F (variants to function) challenge for the human genome, enabling a map of every possible variant of every human gene with a function. A database containing all variants with their functions could unlock the vast potential for personalized medicine.

Realizing all of these possibilities with CRISPR screening will require upgrades in other technologies. “We still need lots of good systems, and lots of good assays to read out,” Doench states. “[CRISPR screening] is one of the tools in the toolbox, but it’s by no means the only one.”

Verwysings
1. Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Wetenskap 2014 343(6166): 84–87. DOI: 10.1126/science.1247005.
2. Canver MC, Smith EC, Sher F, et al. BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis.Natuur 2015 527(7577): 192–197. DOI: 10.1038/nature15521.
3. Frangoul H, Altshuler D, Cappellini MD, et al. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia.N. Engl. J. Med. 2021 384(3): 252–260. DOI: 10.1056/NEJMoa2031054.
4. Gordon DE, Jang GM, Bouhaddou M, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing.Natuur 2020 583: 459–468. DOI: 10.1038/s41586-020-2286-9.
5. Gordon DE, Hiatt J, Bouhaddou M, et al. Comparative host-coronavirus protein interaction networks reveal pan-viral disease mechanisms.Wetenskap 2020 370(6521): eabe9403. DOI: 10.1126/science.abe9403.
6. White KM, Rosales R, Yildiz S, et al. Plitidepsin has potent preclinical efficacy against SARS-CoV-2 by targeting the host protein eEF1A.Wetenskap 2021 371: 926–931. DOI: 10.1126/science.abf4058.
7. Papalexi E, Mimitou EP, Butler AW, et al. Characterizing the molecular regulation of inhibitory immune checkpoints with multimodal single-cell screens.Nat. Genet. 2021 53(3): 322–331. DOI: 10.1038/s41588-021-00778-2.

Establishing the Basics of CRISPR Screening

Originally, CRISPR screening gained popularity as a way of avoiding some of the difficulties associated with small interfering RNA screening, such as off-target effects and incomplete protein depletion. In CRISPR screening, highly specific, permanent genetic modifications can be made that are effective at precluding the function of targeted genes.

The CRISPR-Cas9 nuclease characteristically engineers a double-strand break, which occurs at a specific target locus dictated by a single-guide RNA (sgRNA). The deployment of sgRNAs leads to frameshift mutations and, ultimately, loss-of-function mutations at targeted genes.

In many CRISPR screening experiments, lentiviral vectors are used to deliver plasmids encoding Cas9 and sgRNA, with different plasmids encoding different sgRNAs from a library of sgRNAs. Some libraries consist of sgRNAs that correspond to defined sets of targeted genes other libraries are more comprehensive.

Besides a choice of libraries, CRISPR screening presents a choice of formats: pooled or arrayed. In the pooled format, cells are transduced in bulk, and the entire sgRNA library is deployed. In the arrayed format, cells deposited in the wells of a multiwell plate are transduced individually, and individual sgRNAs are deployed.

The pooled format may be preferred when large libraries are deployed. However, care must be taken to ensure a low multiplicity of infection, or a low ratio of lentiviruses to cells, to minimize coinfection by multiple lentiviruses. Then, after transduced cells are selected, whether by viability-based positive or negative selection, next-generation sequencing is used to assess sgRNA representation, that is, whether DNA sequences encoding for different sgRNAs are depleted or enriched.

With a negative selection screen, that is, a traditional knockout screen, the point is to identify genes that are essential for survival or proliferation under certain conditions or selection pressures. If survival genes sustain a lethal mutation because they were targeted by an sgRNA, that sgRNA will not be represented in sequencing results, simply because cells with lethal mutations in sgRNA-targeted survival genes will have been unable to survive and reproduce. Typically, the degree to which an sgRNA has been “depleted” will be detected by comparing the sgRNA’s representation in a cell population spared the selection pressure, and that in a cell population subjected to the selection pressure.

With a positive selection screen, the point is to identify genes whose mutation or silencing gives cells a survival advantage over a selection pressure. For example, an sgRNA-targeted gene may be found to confer resistance to a cancer drug. In this case, the sgRNA will be represented, or “enriched,” among the cancer cells that survive drug treatment.


Erkennings

We thank Dr. Peter Gregersen for generously sharing with us GWAS data from the NARAC study, providing us with meta-analysis results and comments on our findings and manuscript. AVA, CFA, and AS were supported in part by the grant 1UL1RR029893 from the National Center for Research Resources, National Institutes of Health. CFA was also supported in part by the grant R56 LM007948-04A1 from the National Library of Medicine, National Institute of Health. LP was supported by The Swedish Research Council and by The Swedish State agency VINNOVA.


Metodes

The resources of peanut AhRLKs

All RLK full-length amino acid sequences in Arabidopsis were downloaded from UniProt (https://www.uniprot.org/) and these sequences were used as queries to perform a BLASTP search against A. duranensis RLKs by NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). These resulting sequences were then used as new queries to conduct a BLASTP search again in PEANUT GENOME RESOURSE (http://peanutgr.fafu.edu.cn/), to avoid missing potential members. The redundant entries were removed manually. Then the resulting unique sequences were analysed with both SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) [65] and NCBI’s Conserved Domains Database (CDD http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) to ensure the presence of the RLK domains in newly identified members. Only proteins containing at least one kinase domain were considered putative AhRLKs, and 1311 AhRLKs were finally obtained. The amino acid residue base, and molecular weight were predicted with ExPaSy ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/). The genome sequence, protein sequences and genome annotation of the peanut were performed according to PEANUT GENOME RESOURSE (http://peanutgr.fafu.edu.cn/).

Multiple sequence alignments and phylogenetic tree construction of AhRLKs

The full-length amino acid sequences of LRR-AhRLKs, LecRLKs and 90 Al-responsive AhRLKs defined in the previous section were aligned using ClustalX in MEGA 7 with default parameters [66]. The phylogenetic tree based on the multiple sequence alignments of peanut LRR-RLKs (Fig. 1), LecRLKs (Fig. 2) and 90 AhRLKs in response to Al stress (Fig. 6) was generated by MEGA 7. A Poisson correction model was used to account for multiple substitutions, while alignment gaps were removed with partial deletion. The statistical strength was estimated by bootstrap resampling using 1000 replicates. Based on the multiple sequence alignment and the previously reported classification of Arabidopsis thaliana, the peanut RLKs were assigned to different subfamilies and subgroups [24, 67].

Chromosomal locations and duplication analysis for peanut RLKs

The physical location of AhRLKs on the chromosomes was obtained from the PEANUT GENOME RESOURSE database (http://peanutgr.fafu.edu.cn/). All members of AhRLKs were mapped onto peanut chromosomes based on their physical positions, and chromosomal location images were produced with the online software Map Gene 2 Chromosome v2 (MG2C:http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/). The chromosome location information of the peanut was extracted from GFF files that contain the information of peanut genome annotation. BLASTP was performed to search for potential homologous gene pairs (E-value < 1e −5 ) across genomes. Information on homologous pairs was used as input to identify syntenic chains by MCScanX [68]. In addition, MCScanX was also used to identify tandem and segmental duplications in the AhRLK gene family. RLKs clustered together within 100 kb were regarded as tandem duplicated genes based on the criteria of other plants. The diagram was generated by TBtools [69]. The nonsynonymous (Ka) and synonymous (Ks) substitution ratios were calculated by Simple Ka/Ks Caculator in TBtools. The divergence time was calculated with the formula T = Ks/2r, and the r of dicotyledonous plants was 1.5*10^-8 synonymous substitutions per site per year [70]. We used the Geneconv program with default parameters to search evidence for tandem duplication cluster gene conversion (http://www.math.wustl.edu/

sawyer/geneconv/) [71]. Since GENECONV required at least three sequences for detecting gene conversion events, tandem duplication clusters that contained at least 3 genes were detected. For this program, the clustalW (CDS) alignment was used as the input. Geneconv can detect candidate fragments of directed gene conversion between gene pairs (allowing mismatch). Gene conversion events were considered as statistically significant when P < 0,05.


Kyk die video: #Diesel fuel EN 590 10 ppm (September 2022).


Kommentaar:

  1. Guri

    Hierdie onderwerp is eenvoudig onvergelykbaar :) Dit is vir my interessant.

  2. Ina

    Ek stem absoluut met jou saam. Ek dink dit is 'n goeie idee.

  3. Delmon

    Ek vra om verskoning, maar na my mening begaan u 'n fout. Kom ons bespreek. Skryf aan my in PM, ons sal kommunikeer.

  4. Deveral

    have a good time to laugh



Skryf 'n boodskap