Inligting

12.1: Sny en snoei RNA - Biologie

12.1: Sny en snoei RNA - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pre-rRNA

In E coli, die rrn operon word getranskribeer in 'n 30S-voorloper-RNA, wat 3 rRNA's en 2 tRNA's bevat.

Die segment wat 16S rRNA (klein ribosomale subeenheid) en die een wat 23S rRNA (groot ribosomale subeenheid) bevat, word geflankeer deur omgekeerde herhalings wat stamstruktuur in die RNA vorm. Die stamme word deur RNase III geklief. Daar is geen oënskynlike enkele volgorde waarby RNase III kloof nie - miskien herken dit 'n spesifieke stamstruktuur. Hierdie plus daaropvolgende splitsingsgebeurtenisse (deur 'n aktiwiteit genoem M16) genereer die volwasse 16S en 23S rRNA's. Die rRNA's word ook gemetileer.

tRNA word vrygestel deur RNases P en F en 5S rRNA word vrygestel deur RNases E en M5

In eukariote

Die aanvanklike voorloper is 47S en bevat ETS1, 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 en 28S rRNA, waar ETS = ekstrageniese getranskribeerde spasieerder en ITS = intrageniese getranskribeerde spasieerder. Spesifieke splitsingsgebeure gevolg deur metilerings genereer die volwasse produkte. Sommige rRNA-gene in sommige spesies het ook introne wat uitgesplits moet word.

Pre-tRNA in E coli

Sekwensiespesifieke splitsing deur RNases P, F, D

  1. RNase P is 'n endonuklease wat die voorloper klief om die 5'-kant van die volwasse tRNA te genereer.
  2. RNase F is 'n endonuklease wat die voorloper 3 nukleotiede verby die 3' einde van die volwasse tRNA klief.
  3. RNase D is 'n eksonuklease wat in 'n 3'- tot 5'-rigting sny om die 3'-einde of die volwasse tRNA te genereer.

Die katalitiese aktiwiteit van RNase P is in die RNA-komponent

  1. RNAse P is saamgestel uit 'n 375 nt RNA en 'n 20 kDa proteïen.
  2. Die katalitiese aktiwiteit is in die RNA. Daar word vermoed dat die proteïen in die reaksie help, maar is nie nodig vir katalise nie. Alle ensieme is nie proteïene nie!
  3. Dit was een van die eerste gevalle wat van katalitiese RNA ontdek is, en Sidney Altman het die Nobelprys hiervoor gedeel.

Die ensiem tRNA nukleotidiel oordragasevoeg CCA by die 3'-punte van pre-tRNA's.

  1. Feitlik alle tRNA's eindig in CCA, vorm die amino-aanvaarderstam.
  2. Vir die meeste prokariotiese tRNA-gene word die CCA aan die 3'-kant van die geen gekodeer.
  3. Geen bekende eukariotiese tRNA-geen kodeer die CCA nie, maar dit word eerder posttranskripsie bygevoeg deur die ensiem tRNA nukleotidieltransferase. Hierdie ensiem is teenwoordig in 'n wye verskeidenheid organismes, insluitend bakterieë, in laasgenoemde geval vermoedelik om CCA by beskadigde tRNA's te voeg.

CUT&RUNTools: 'n buigsame pyplyn vir CUT&RUN-verwerking en voetspooranalise

Ons stel CUT&RUNTools bekend as 'n buigsame, algemene pyplyn vir die fasilitering van die identifikasie van chromatien-geassosieerde proteïenbinding en genomiese voetspoorontleding vanaf teenliggaam-geteikende CUT&RUN primêre splitsingsdata. CUT&RUNTools onttrek endonuklease gesnyde terrein-inligting uit reekse van kortgeleesde fragmente en produseer enkel-lokus binding skattings, gesamentlike motief voetspore en insiggewende visualisering om die hoë-resolusie kartering vermoë van CUT&RUN te ondersteun. CUT&RUNTools is beskikbaar by https://bitbucket.org/qzhudfci/cutruntools/.


Inleiding

Onlangse jare het 'n stortvloed van data gesien wat geproduseer is deur 'n hoë deurset-kortleesvolgorde, wat algemeen genoem word Next Generation Sequencing (NGS). In die besonder, die gebruik van Illumina (voorheen bekend as Solexa) lees is deesdae die basis vir 'n reeks biologiese toepassings, beide in diagnostiese en navorsingsvelde [1,2]. Dit sluit in die De novo samestelling van genome en transkriptome en die belyning van kortlesings oor 'n bestaande verwysing [3,4], chimeriese transkripsie-opsporing [5], haplotipe-inferensie [6], metileringsopsporing [7], ens.

Terwyl De novo samestelling word hoofsaaklik gebruik om blindelings 'n onbekende genoom of transkriptoom te rekonstrueer, leesbelyning het verskeie doeleindes: wanneer die oorspronklike materiaal mRNA (RNA-seq) is, laat dit toe om vlakke van transkripsies presies te meet en om splitsingsisovorme te identifiseer [8]. In die geval van DNA-volgorde, is leesbelyning die grondslag van variantopsporing, aangesien wanpassings of gapings in die belyning openbaar, indien ondersteun deur 'n voldoende aantal leesstukke, SNP's en kort indels [9-12].

Illumina-lesings is gewoonlik 25-250 nukleotied lang reekse wat geproduseer word deur 'n omkeerbare-terminator sikliese reaksie wat geassosieer word met basisspesifieke kolorimetriese seine binne die volgordebepalingsmasjien. Lesings kan geskei word (“enkellees”) of “gepaard”, in welke geval hulle albei ledemate van dieselfde nukleotiedfragment (gewoonlik 200-1000 bp lank) verteenwoordig. Hierdie kolorimetriese seine word in basisoproepe vertaal deur 'n interne Illumina-sagteware (CASAVA), verteenwoordig in die FASTQ-formaat [13], waar elke nukleotied geassosieer word met 'n ASCII-gekodeerde kwaliteitsnommer wat ooreenstem met 'n PHRED-telling (Q) [14], wat direk vertaal word in die waarskynlikheid p dat die ooreenstemmende basisoproep verkeerd is deur die volgende vergelyking:

Q in onlangse Illumina-lopies wissel van 0 tot 41 en daarom wissel die foutkoers by elke posisie van 1 tot 0,000079433. Wat ook al die oorspronklike oorsaak van nukleotiede van lae gehalte/hoë foutkans is (bv. lugborrels, kolspesifieke seingeraas, wanfunksionele laser/lens, ens.), word die Q-waarde geënkodeer en saam met die volgorde-inligting en hierdie vertrouensinligting gestoor kan vir daaropvolgende analise gebruik word, tesame met die volgorde-inligting self.

Om die bestaan ​​van lae kwaliteit basisoproepe te ignoreer, kan in werklikheid nadelig wees vir enige NGS-analise, aangesien dit onbetroubare en potensieel ewekansige volgordes by die datastel kan voeg. Dit kan 'n relevante probleem vir enige stroomaf-ontledingspyplyn uitmaak en lei tot vals interpretasies van data. Byvoorbeeld, in genoomsamestelling lei die insluiting van lae kwaliteit leeswerk tot die generering van vals k-mere (lees substringe van vaste grootte) [15], wat op sy beurt die kompleksiteit van die daaropvolgende samestellingsproses verhoog [16].

Daar is twee maniere om lae kwaliteit nukleotiede in Illumina lees te hanteer. Die eerste benadering is daarop gemik om leeswerk te korrigeer nadat dit op mekaar geplaas is, terwyl lae-frekwensiepatrone gewysig word op grond van die mees gereelde reekse, hierdie benadering werk gewoonlik op die vlak van k-mers en word deur verskeie voorverwerkingsinstrumente, soos Quake [17] aanvaar. ] en ALLPATHS-LG [18]. Sommige genoomsamestellingsprogramme kan outonoom laaggesteunde k-mere uit die aaneenlopende generasie uitsluit, bv. ABySS [19] en ALLPATHS-LG [18]. Die leeskorreksie-benadering kan egter nie toegepas word waar volgorde-oorvloed intrinsiek nie eenvormig is nie, soos in transcriptomics (RNA-Seq) [20], metagenomics [21] of heterogene kanker DNA-monsters [22]. Ook maak 'n lae diepte van dekking leesregstellingstrategieë onuitvoerbaar, met Quake wat minstens 15x vereis [17] en ALLPATHS-LG wat 100x as optimale dekking voorstel [18].

Die tweede benadering om lae kwaliteit nukleotiede te hanteer het nie ten doel om die oorspronklike leesdatastel te verander nie, maar eerder om lae kwaliteit basisse te verwyder, om slegs lae kwaliteit streke chirurgies te probeer elimineer in 'n prosedure bekend as lees "trimming". Hierdie voorverwerkingstap is 'n nie-triviale proses, wat op verskillende maniere benader word deur verskillende algoritmes, implementerings en gereedskap, waarvan die meeste in hierdie vraestel versamel en beskryf word (Tabel 1). Die basiese beginsel van leesafkorting is om 'n opgevoede skatting van leesfouttempo's uit te voer en probeer om die langste moontlike hoë kwaliteit opvolgorde te behou.

GereedskapWeergaweSkakelTaalAlgoritme familieKan direk op gzip werkKan aan gepaarde kant werkPHRED-formaat outo-opsporingWerk aan beide lees kanteNotas
Snyaanpas1.1code.google.com/p/cutadapt/downloads/listPython en CLopende somjageengeengeenKan ook adapters, multi-threaded verwyder
ConDeTri2.2code.google.com/p/condetri/PerlVenster gebaseerja (sedert v2.2)jageengeen
ERNE-FILTER1.2sourceforge.net/projects/erne/files/C++Lopende somjajajajaKan gekombineer word met die verwydering van kontaminante, multi-draad
FASTX kwaliteit trimmer0.0.13.2hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.htmlC++Venster gebaseergeengeengeengeenDie verstek minimum leeslengte parameter (-p) is op nul gestel
PRINSEQ0:19:05sourceforge.net/projects/prinseq/files/PerlVenster gebaseergeengeengeenjaOok webkoppelvlak vir mediumgrootte data
Trimmomaties0.22www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomaticJavaVenster gebaseerjajageenjaKan ook adapters verwyder
SolexaQA1.13sourceforge.net/projects/solexaqa/files/PerlVenster gebaseer (Lopende som met -bwa opsie)geengeenjageenKan nie minimum leeslengte spesifiseer om te hou nie
Sekel1.2github.com/ucdavis-bioinformatics/sickleCVenster gebaseerjajageenja

Tabel 1. Beskikbaarheid en kenmerke van die snoeigereedskap wat in die huidige werk ondersoek is.

Snoei is breedweg aangeneem in mees onlangse NGS-studies, spesifiek voor genoomsamestelling [23], transkriptoomsamestelling [24], metagenoomrekonstruksie [25], RNA-Seq [26,27], epigenetiese studies [7] en vergelykende genomika [ 28]. Ten spyte van die gewildheid daarvan, is nóg 'n omvattende assessering van snoei-effekte op algemene NGS-ontledings nóg 'n wye vergelyking van die bestaande gereedskap tot dusver gemaak. Verskeie metodes is individueel beskryf in literatuur [16,29,30] maar die bruikbaarheid daarvan is slegs bewys in spesifieke gevalle van genoomsamestelling.

In die huidige werk beskryf ons die bestaande metodes vir Illlumina lees snoei, terwyl ons 'n nuwe geoptimaliseerde implementering van die Mott se snoei algoritme bekendstel [14]. Ons sal hierdie metodes se prestasies by verskillende Q-drempels oor drie fundamentele areas van NGS-ondersoek assesseer: De novo genoomsamestelling, RNA-kartering en genotipering (spesifiek SNP-identifikasie), met behulp van twee publiek beskikbare datastelle vir elke kategorie. Ons wys hoe biologiese interpretasie van data grootliks beïnvloed kan word deur die (gebrek aan) aanvaarding van bepaalde snoeimetode/drempelkombinasies. Boonop beïnvloed leesafkorting die gebruik van hulpbronne baie, wat berekeningstyd en gepaardgaande koste verminder. Die huidige werk sal nie fokus op ander algemeen toegepaste Illumina-leesvoorverwerkingsmetodes nie, naamlik die reeds aangehaalde leeskorreksie [17], duplikaatverwydering [31], kontaminantvolgordefiltrering [30] of adapterverwydering [32].


Pasgemaakte Python-skrifte wat vir die beskryfde NGS-data-ontledings gebruik word, is aanlyn beskikbaar via GitHub (https://github.com/sternberglab/Vo_etal_2020). Die INTEGRATE guide RNA-ontwerpinstrument en gepaardgaande dokumentasie is aanlyn beskikbaar via GitHub (https://github.com/sternberglab/INTEGRATE-guide-RNA-tool).

Dunbar, C.E. et al. Geenterapie word mondig. Wetenskap 359, eaan4672 (2018).

Gelvin, S. B. Integrasie van Agrobacterium T-DNA in die plantgenoom in. Annu. Ds Genet. 51, 195–217 (2017).

Davy, A. M., Kildegaard, H. F. & Andersen, M. R. Sel fabriek ingenieurswese. Selstelsel. 4, 262–275 (2017).

Brophy, J. A. N. et al. Gemanipuleerde integrerende en konjugatiewe elemente vir doeltreffende en induseerbare DNA-oordrag na ongedomesticeerde bakterieë. Nat. Mikrobiol. 3, 1043–1053 (2018).

Miyazaki, R. & van der Meer, J. R. 'n Nuwe groot-DNA-fragment afleweringsisteem gebaseer op integrase aktiwiteit vanaf 'n integrerende en konjugatiewe element. Appl. Omgewing. Mikrobiol. 79, 4440–4447 (2013).

Martínez-García, E. & de Lorenzo, V. Transposon-gebaseerde en plasmied-gebaseerde genetiese gereedskap vir die redigering van genome van gram-negatiewe bakterieë. Metodes Mol. Biol. 813, 267–283 (2012).

van Opijnen, T., Bodi, K. L. & Camilli, A. Tn-seq: hoë-deurset parallelle volgordebepaling vir fiksheid en genetiese interaksie studies in mikroörganismes. Nat. Metodes 6, 767–772 (2009).

Wang, H. H. et al. Genoomskaal promotoringenieurswese deur medeseleksie MAGE. Nat. Metodes 9, 591–593 (2012).

Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G. & Hof, D. L. Recombineering: 'n homoloë rekombinasie-gebaseerde metode van genetiese ingenieurswese. Nat. Protoc. 4, 206–223 (2009).

Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J. P. & Stewart, A. F. 'n Nuwe logika vir DNA-ingenieurswese met behulp van rekombinasie in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123–128 (1998).

Baba, T. et al. Konstruksie van Escherichia coli K-12 in-raam, enkelgeen uitklopmutante: die Keio-versameling. Mol. Syst. Biol. 2, 2006.0008 (2006).

Cotta-de-Almeida, V., Schonhoff, S., Shibata, T., Leiter, A. & Snapper, S. B. 'n Nuwe metode vir die vinnige generering van geengerigte vektore deur BAC's te manipuleer deur homoloë rekombinasie in bakterieë. Genoom Res. 13, 2190–2194 (2003).

Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. Eenstap-inaktivering van chromosomale gene in Escherichia coli K-12 met behulp van PCR-produkte. Proc. Natl Acad. Wetenskap. VSA 97, 6640–6645 (2000).

Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L. A. RNA-geleide redigering van bakteriese genome met behulp van CRISPR-Cas-stelsels. Nat. Biotegnologie. 31, 233–239 (2013).

Wang, K. et al. Definieer sinonieme kodon-kompressieskemas deur genoomherkodering. Natuur 539, 59–64 (2016).

Sukhija, K. et al. Ontwikkeling van 'n uitgebreide genomiese ingenieursbenadering gebaseer op herkombinasie om heteroloë gene in te klop. Escherichia coli genoom. Mol. Biotegnologie. 51, 109–118 (2012).

Wang, H. H. et al. Programmering van selle deur multipleks genoom-ingenieurswese en versnelde evolusie. Natuur 460, 894–898 (2009).

Vento, J. M., Crook, N. & Beisel, C. L. Hindernisse vir genoomredigering met CRISPR in bakterieë. J. Ind. Microbiol. Biotegnologie. 46, 1327–1341 (2019).

Jiang, Y. et al. CRISPR-Cpf1 bygestaan ​​genoom redigering van Corynebacterium glutamicum. Nat. Commun. 8, 15179 (2017).

Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Herstel van dubbelstring-breuke wat deur CRISPR-Cas9 veroorsaak word, lei tot groot delesies en komplekse herrangskikkings. Nat. Biotegnologie. 36, 765–771 (2018).

Wannier, T. M. et al. Verbeterde bakteriële herkombinasie deur parallelle proteïenontdekking. Proc. Natl Acad. Wetenskap. VSA 117, 13689–13698 (2020).

Corts, A. D., Thomason, L. C., Gill, R. T. & Gralnick, J. A. 'n Nuwe herkombinasiestelsel vir presiese genoomredigering in Shewanella oneidensis-stam MR-1 met behulp van enkelstrengige oligonukleotiede. Wetenskap. Rep. 9, 39 (2019).

Peters, J. M. et al. Maak genetiese ontleding van diverse bakterieë moontlik met Mobile-CRISPRi. Nat. Mikrobiol. 4, 244–250 (2019).

St-Pierre, F. et al. Een-stap kloning en chromosomale integrasie van DNA. ACS Synth. Biol. 2, 537–541 (2013).

Tellier, M., Bouuaert, C. C. & Chalmers, R. Mariner and the ITm superfamily of transposons. Mikrobiol. Spectr. 3, MDNA3–0033–2014 (2015).

van Opijnen, T. & Camilli, A. Transposon-insersie-volgordebepaling: 'n nuwe instrument vir stelselvlak-analise van mikroörganismes. Nat. Ds Microbiol. 11, 435–442 (2013).

Haniford, D. B. & Ellis, M. J. Transposons Tn10 en Tn5. Mikrobiol. Spectr. 3, MDNA3–0002–2014 (2015).

Goodall, E.C.A. et al. Die noodsaaklike genoom van Escherichia coli K-12. Mbio 9, e02096-17 (2018).

Chen, S. P. & Wang, H. H. 'n Gemanipuleerde Cas-transposonstelsel vir programmeerbare en plekgerigte DNA-transposisies. CRISPR J. 2, 376–394 (2019).

Bhatt, S. & Chalmers, R. Geteikende DNA-transposisie in vitro met behulp van 'n dCas9-transposase-fusieproteïen. Nukleïensure Res. 6, 7–10 (2019).

Enyeart, P. J., Mohr, G., Ellington, A. D. & Lambowitz, A. M. Biotegnologiese toepassings van mobiele groep II-introne en hul omgekeerde transkriptases: geen-teikening, RNA-volgorde en nie-koderende RNA-analise. gepeupel. DNA 5, 2 (2014).

Esvelt, K. M. & Wang, H. H. Genoomskaal ingenieurswese vir stelsels en sintetiese biologie. Mol. Syst. Biol. 9, 641 (2013).

Perutka, J., Wang, W., Goerlitz, D. & Lambowitz, A. M. Gebruik van rekenaar-ontwerpte groep II-introne om te ontwrig Escherichia coli DExH/D-boks proteïen en DNA helikase gene. J. Mol. Biol. 336, 421–439 (2004).

Karberg, M. et al. Groep II-introne as beheerbare geen-teikenvektore vir genetiese manipulasie van bakterieë. Nat. Biotegnologie. 19, 1162–1167 (2001).

Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-gekodeerde CRISPR-Cas-stelsels direkte RNA-geleide DNA-integrasie. Natuur 571, 219–225 (2019).

Peters, J. E., Makarova, K. S., Shmakov, S. & Koonin, E. V. Werwing van CRISPR-Cas-stelsels deur Tn7-agtige transposons. Proc. Natl Acad. Wetenskap. VSA 114, E7358–E7366 (2017).

Halpin-Healy, T. S., Klompe, S. E., Sternberg, S. H. & Fernández, I. S. Strukturele basis van DNA-teikening deur 'n transposon-gekodeerde CRISPR-Cas-stelsel. Natuur 577, 271–274 (2020).

Faure, G. et al. CRISPR-Cas in mobiele genetiese elemente: teenverdediging en verder. Nat. Ds Microbiol. 17, 513–525 (2019).

Peters, J. E. Geteikende transponering met Tn7-elemente: veilige terreine, mobiele plasmiede, CRISPR/Cas en verder. Mol. Mikrobiol. 112, 1635–1644 (2019).

Strecker, J. et al. RNA-geleide DNA-invoeging met CRISPR-geassosieerde transposases. Wetenskap 365, 48–53 (2019).

Chavez, M. & Qi, L. S. Terreinprogrammeerbare transposisie: die verskuiwing van die paradigma vir CRISPR-Cas-stelsels. Mol. Sel. 75, 206–208 (2019).

Hou, Z. & Zhang, Y. Invoeging van DNA met CRISPR. Wetenskap 365, 25–26 (2019).

Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J. & Wang, H. H. Metagenomiese ingenieurswese van die soogdier-dermmikrobioom in situ. Nat Meth 16, 167–170 (2019).

Stellwagen, A. E. & Craig, N. L. Vermyding van self: twee Tn7-gekodeerde proteïene bemiddel teikenimmuniteit in Tn7-transposisie. EMBO J. 16, 6823–6834 (1997).

Greene, E. C. & Mizuuchi, K. Doel immuniteit tydens Mu DNA transponering. Transpososoomsamestelling en DNA-lusvorming verbeter MuA-gemedieerde demontage van die MuB-teikenkompleks. Mol. Sel 10, 1367–1378 (2002).

Hagemann, A. T. & Craig, N. L. Tn7-transposisie skep 'n hotspot vir homoloë rekombinasie by die transposon-skenkerplek. Genetika 133, 9–16 (1993).

Lin, M.T. et al. In Metodes in Ensimologie Isotoopetikettering van Biomolekules—Etiketteringmetodes Vol. 565 (Ed. Kelman, Z.) 45–66 (Academic Press, 2015).

Hickman, A. B. & Dyda, F. DNA-transposisie by die werk. Chem. Ds. 116, 12758–12784 (2016).

Abbas, A. F., Al-Saadi, A. G. M. & Alkhudhairy, M. K. Biofilmvorming en virulensiebepalers van Klebsiella oxytoca kliniese isolate van pasiënte met kolorektale kanker. J. Gastrointest. Kanker 51, 855–860 (2019).

Kim, D.-K. et al. Metaboliese ingenieurswese van 'n roman Klebsiella oxytoca stam vir verbeterde 2,3-butaandiol produksie. J. Biosci. Bioeng. 116, 186–192 (2013).

Loeschcke, A. & Thies, S. Pseudomonas putida—'n veelsydige gasheer vir die vervaardiging van natuurlike produkte. Appl. Mikrobiol. Biotegnologie. 99, 6197–6214 (2015).

Nikel, P. I. & de Lorenzo, V. Pseudomonas putida as 'n funksionele onderstel vir industriële biokatalise: van inheemse biochemie tot transmetabolisme. Metab. Eng. 50, 142–155 (2018).

Sun, J. et al. Genoomredigering en transkripsionele onderdrukking in Pseudomonas putida KT2440 via die tipe II CRISPR-stelsel. Mikrob. Sel Feit. 17, 41 (2018).

Wirth, N. T., Kozaeva, E. & Nikel, P. I. Versnelde genoom-ingenieurswese van Pseudomonas putida deur I-SceI-bemiddelde rekombinasie en CRISPR-Cas9-teenseleksie. Mikrob. Biotegnologie. 13, 233–249 (2020).

Tsai, S. Q. & Joung, J. K. Definieer en verbetering van die genoomwye spesifisiteite van CRISPR-Cas9 nukleases. Nat. Ds Genet. 17, 300–312 (2016).

Zhang, Y. et al. Multikopie chromosomale integrasie met behulp van CRISPR-geassosieerde transposases. ACS Synth. Biol. 9, 1998–2008 (2020).

Yu, B. J. & Kim, C. Minimalisering van die Escherichia coli-genoom met behulp van die Tn5-geteikende Cre/loxP-uitsnystelsel. Nat. Biotegnologie. 20, 1018–1023 (2008).

Adiego-Pérez, B. et al. Multiplex genoom redigering van mikroörganismes met behulp van CRISPR-Cas. FEMS Microbiol. Lett. 366, fnz086 (2019).

Horlbeck, M. A. et al. Kartering van die genetiese landskap van menslike selle. Sel 174, 953–967(2018).

Bassalo, M. C. et al. Vinnige en doeltreffende een-stap metaboliese weg-integrasie in E coli. ACS Synth. Biol. 5, 561–568 (2016).

Rubin, B.E. et al. Geteikende genoomredigering van bakterieë binne mikrobiese gemeenskappe. Voordruk by bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.17.209189 (2020).

Valderrama, J. A., Kulkarni, S. S., Nizet, V. & Bier, E. 'n Bakteriële geen-aangedrewe stelsel redigeer en inaktiveer 'n hoë kopiegetal antibiotika weerstand lokus doeltreffend. Nat. Commun. 10, 5726–5728 (2019).

Duque, E. et al. Identifikasie en toeligting van in vivo funksie van twee alanien racemases uit Pseudomonas putida KT2440. Omgewing. Mikrobiol. Rep. 9, 581–588 (2017).

Aparicio, T., de Lorenzo, V. & Martínez-García, E. CRISPR/Cas9-verbeterde ssDNA-herkombinasie vir Pseudomonas putida. Mikrob. Biotegnologie. 12, 1076–1089 (2019).

Langmead, B. & Salzberg, S. L. Vinnige gaping-lees-belyning met Bowtie 2. Nat. Metodes 9, 357–359 (2012).

Rice, P. A., Craig, N. L. & Dyda, F. Lewer kommentaar op 'RNA-geleide DNA-invoeging met CRISPR-geassosieerde transposases'. Wetenskap 368, eabb2022 (2020).

Strecker, J., Ladha, A., Makarova, K. S., Koonin, E. V. & Zhang, F. Reaksie op kommentaar op 'RNA-geleide DNA-invoeging met CRISPR-geassosieerde transposases'. Wetenskap 368, eabb2920 (2020).

Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K. & Schloss, P. D. Ontwikkeling van 'n dubbelindeks-volgordebepalingstrategie en kurasiepyplyn vir die ontleding van amplikonvolgordedata op die MiSeq Illumina-volgordebepalingsplatform. Appl. Omgewing. Mikrobiol. 79, 5112–5120 (2013).

Callahan, B.J. et al. DADA2: hoë-resolusie monster afleiding van Illumina amplicon data. Nat. Metodes 13, 581–583 (2016).

McMurdie, P. J. & Holmes, S. phyloseq: 'n R-pakket vir reproduceerbare interaktiewe analise en grafika van mikrobioom-sensusdata. PLoS EEN 8, e61217 (2013).


RNA sintetiese biologie

RNA-molekules speel belangrike en diverse regulerende rolle in die sel op grond van hul interaksie met ander nukleïensure, proteïene en klein molekules. Geïnspireer deur hierdie natuurlike veelsydigheid, het navorsers RNA-molekules met nuwe biologiese funksies ontwerp. In die afgelope twee jaar het pogings in sintetiese biologie nuwe, sintetiese RNA-komponente geproduseer wat in staat is om geenuitdrukking in vivo grootliks in bakterieë en gis te reguleer, wat die weg gebaan het vir skaalbare en programmeerbare sellulêre gedrag. Onmiddellike uitdagings vir hierdie ontluikende veld sluit in om te bepaal hoe rekenaar- en gerigte-evolusie-tegnieke geïmplementeer kan word om die kompleksiteit van gemanipuleerde RNA-stelsels te verhoog, asook om te bepaal hoe sulke stelsels breedweg na soogdierstelsels uitgebrei kan word. Verdere uitdagings sluit in die ontwerp van RNA-molekules om sensors van intrasellulêre en omgewingsstimuli te wees, probes om die gedrag van biologiese netwerke en komponente van gemanipuleerde sellulêre beheerstelsels te ondersoek.


30 Sept.-Okt. 2, 2020 | 10:00 EDT | 14:00 UTC*
* Program is in ontwikkeling en onderhewig aan verandering

Aandag

Die regstreekse gedeelte van hierdie konferensie is afgehandel en alle aanbiedings is nou beskikbaar vir aankoop op aanvraag. Registrante van die regstreekse geleentheid kan enige tyd vir tot 9 maande na die geleentheid toegang tot hierdie inhoud verkry.

Gratis toegang tot inhoud op aanvraag vir wetenskaplikes van lae- en middelinkomstelande

Keystone Simposia verwelkom die wêreldwye wetenskaplike gemeenskap en poog om navorsers binne en oor dissiplines te verbind om die vooruitgang van biomediese en lewenswetenskappe te versnel. Hierdie vorm kan gebruik word vir wetenskaplikes van lae- en middelinkomstelande van alle loopbaanfases om geskiktheid te bepaal en gratis toegang te versoek tot wetenskaplike inhoud wat tydens onlangse eSimposia-geleenthede aangebied word. As jy in aanmerking kom, sal jy 'n toegangskode gestuur word vir die On Demand-inhoud van die eSimposia-geleentheid(e) van belang.

Die biochemiese modifikasies wat na transkripsie aan RNA gemaak is, die epitranskriptoom genoem, speel 'n kritieke rol in die lewe. Die ontwikkeling van nuwe tegnologie het die veld die afgelope paar jaar verander. Ons begrip van die rede vir en regulering van RNA-redigering en -modifikasies, sowel as hul rolle in menslike infeksie en siektes, word verdiep en terapeutiese toepassings kom na vore. Hierdie virtuele konferensie sal toonaangewende kundiges in RNA-redigering en -modifikasies, tegnologie-ontwikkeling en medisyne bymekaarbring om voorpuntnavorsing aan te bied en te bespreek. Ons verwag dat deelnemers aan hierdie konferensie sal baat by die leer van die voorpunt van die vinnig vorderende veld en help om die veld vorentoe te beweeg deur samewerkingsgeleenthede te skep.

Program is bedoel vir wetenskaplike navorsers en kliniese gehore.

Sluit by ons aan vir hierdie landmerk virtuele gebeurtenis, aan jou gebring deur Keystone Simposia.

Pryse:

Gereelde registrasietarief: $275 USD
Studenteregistrasiekoers: $150 USD

Sperdatums:

Beurse: Geslaag
Abstrakte voorlegging: Geslaag


'n skerper aansig van DNA-snyende ensiem

Wetenskaplikes van Howard Hughes Mediese Instituut (HHMI) het 'n portret geskep van 'n DNA-snyproteïen genaamd Cas9, 'n kragtige navorsingsinstrument wat in baie laboratoriums vir genoomredigering gebruik word.

Wetenskaplikes van Howard Hughes Mediese Instituut (HHMI) het 'n portret van 'n DNA-snyproteïen genaamd Cas9 geskep wat onthul hoe die ensiem homself hervorm wanneer dit met 'n RNA-molekule assosieer, wat 'n kanaal skep wat dit toelaat om sy DNS-teiken te vind en te klief. Die proteïen-RNA-kompleks is 'n sleutelkomponent van 'n primitiewe bakteriese immuunstelsel genaamd CRISPR, en word ook deur navorsers gebruik om spesifieke DNS-volgordes in die laboratorium te sny vir genoomredigeringstoepassings.

&ldquoHierdie proteïene was baie suksesvol om plekspesifieke genetiese veranderinge te veroorsaak in feitlik elke stelsel waarin hulle probeer is,&rdquo sê HHMI-ondersoeker Jennifer A. Doudna, een van die leiers van die studie. Die nuwe begrip van die strukturele transformasies wat Cas9 ondergaan, aangesien dit eers 'n RNA-gids teëkom en later, DNA&mdash help om te verduidelik hoe die ensiem werk en bied insig in hoe navorsers sy aktiwiteit kan beheer, sê sy.

Doudna, wat aan die Universiteit van Kalifornië, Berkeley is, het die strukturele en biochemiese ontledings van Cas9 saam met HHMI-ondersoeker Eva Nogales by die Lawrence Berkeley Nasionale Laboratorium en Emmanuelle Charpentier by Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH in Duitsland gelei. Hul werk is op 7 Februarie 2014 in die joernaal gepubliseer Wetenskap.

Baie bakterieë het 'n CRISPR-gebaseerde immuunstelsel wat gebruik word om die genome van indringer virusse en plasmiede te herken en te vernietig. In 2012 het die laboratoriums van Doudna en Charpentier getoon dat Cas9 'n DNS-snyende ensiem is wat deur RNA gelei word. Cas9 maak staat op twee kort RNA-gidsvolgordes om vreemde DNA te vind, en klief dan die teikenvolgordes en maak sodoende die indringers se gene stil.

Die proses is spesifiek en doeltreffend genoeg om virale infeksies in bakterieë af te weer, en dieselfde eienskappe het die CRISPR-stelsel 'n kragtige navorsingsinstrument gemaak. Doudna se span het die stelsel aangepas sodat dit deur 'n enkele kort RNA-molekule gelei kan word. Navorsers wat die stelsel vir genoomredigering gebruik, kan daardie RNA aanpas sodat dit Cas9 aanstuur om op 'n gewenste plek in die genoom te splits.

Vir die huidige studie het Doudna, Nogales en Charpentier saamgespan om die ensiem van nader te bekyk. &ldquoOns is baie gretig om te verstaan ​​hoe hierdie ensiem DNA so spesifiek kan herken as wat dit doen, en wat sy aktiwiteit in selle beheer,&rdquo Doudna sê. Die span het gekies om na twee weergawes van Cas9 te kyk, geneem uit verskillende spesies bakterieë. Een proteïen is ongeveer 25 persent groter as die ander, maar albei sny DNA-teikens soos aangedui deur RNA.

Martin Jinek, 'n HHMI-navorsingspesialis in Doudna se laboratorium wat nou sy eie laboratorium aan die Universiteit van Zürich lei, en Fuguo Jiang, 'n postdoktorale navorser in Doudna se laboratorium, het x-straalkristallografie gebruik om die gedetailleerde atoomstruktuur van elkeen te bepaal. van die twee Cas9-proteïene. Die mees gebruikte metode vir struktuurbepaling is x-straalkristallografie. In daardie tegniek word gekristalliseerde proteïene eers met x-straalstrale gebombardeer. Soos die x-strale van atome in die kristal weerkaats, laat hulle 'n diffraksiepatroon, wat dan ontleed kan word om die driedimensionele vorm van die proteïen te bepaal.

Toe hulle die struktuur van Cas9 bestudeer het, het die navorsers gevind dat dit van twee lobbe gemaak is, met die DNS-splitsende streke wat saam in 'n enkele lob gegroepeer is. Die veranderlike streke van die proteïene het binne die tweede lob geval, wat verantwoordelik was vir hul grootte verskille. Verdere eksperimente is nodig om te toets hoe die variasies in die tweede lob proteïenfunksie beïnvloed, maar Doudna sê die bevindinge is bemoedigend vir toepassings vir genoomredigering.

&ldquoBaie mense stel belang in of hierdie Cas9-ensiem ontwerp kan word om selfs kleiner as enige van die natuurlike variante te wees,&rdquo sê sy, en verduidelik dat sommige van die vektore wat gebruik word om Cas9 in selle in te voer, slegs klein insetsels verdra. Op grond van die vergelyking van hierdie twee strukture, dink ons ​​dat evolusie dit soort van reeds gedoen het: Dit is reeds weggekou aan een lob van die proteïen, wat weg is van waar die katalitiese terreine is. Ons dink ook dat dit moontlik kan wees om nog meer snoei te doen en 'n proteïen te genereer wat al die funksionaliteit van Cas9 behou, maar in 'n meer vaartbelynde toestand is.&rdquo

Die x-straal kristallografie studies het die navorsers 'n gedetailleerde oorsig van die Cas9 proteïen alleen gebied. Maar hulle was ook nuuskierig hoe die globulêre ensiem in wisselwerking met RNA en DNA om sy teiken te vind.

Hulle het gekies om Cas9 te visualiseer met behulp van elektronmikroskopie, 'n tegniek wat soveel strukturele detail as x-straalkristallografie kan verskaf, maar ook navorsers in staat stel om na proteïene in oplossing te kyk, waarin hulle natuurlik met ander molekules kan interaksie. Samuel Sternberg, 'n gegradueerde student in Doudna se laboratorium, en David Taylor, 'n gesamentlike nadoktorale navorser in Nogales se en Doudna se laboratoriums, het elektronmikroskopie gebruik om beelde van Cas9 alleen vas te lê, dan in samewerking met 'n RNA-gidsmolekule, en uiteindelik interaksie met DNA.

Wat hulle gevind het, verduidelik Nogales, is dat wanneer Cas9 met RNA assosieer, dit herkonfigureer, wat 'n kanaal in die middel van die proteïen vorm en homself, blykbaar, voorberei om met DNA te reageer. Inderdaad, toe die Cas9-RNA-kompleks toegelaat is om met DNS te reageer, het die navorsers die wenke van die DNS-molekule&mdash waaraan hulle proteïenmerkers geheg het vir visualisering gesien&mdash by die punte van die kanaal uitsteek. Met bykomende biochemiese eksperimente het hulle ook gewys hoe lusse in die Cas9-proteïen bydra tot DNS-herkenning, wat Cas9 in staat stel om spesifiek met klein DNS-motiewe te kommunikeer wat Doudna en kollegas onlangs gewys het Cas9 in staat stel om te begin skandering op soek na sy teikenvolgorde.

Saam bied hierdie bevindings 'n omvattende oorsig van Cas9 se struktuur en konformasieveranderinge tydens komplekse samestelling, sê die wetenskaplikes. & ldquo Onverwags, die gids RNA, wat gedink het om basies te dien as die sjabloon vir die bepaling van watter DNS gaan geklief word, is heel waarskynlik nodig om die proteïen te aktiveer deur sy bouvorm te verander, & rdquo sê Nogales. Navorsers sal hierdie funksie in gedagte moet hou as hulle van plan is om die CRISPR-stelsel vir biotegnologie-toepassings te vereenvoudig, voeg sy by. &ldquoDit is 'n minimale vereiste wat nie vergeet kan word nie.&rdquo


Kyk die video: Genetics - Central Dogma of Life - Lesson 17. Dont Memorise (September 2022).