Inligting

Wat is die verwysing 16S rRNA?

Wat is die verwysing 16S rRNA?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Onlangs het ek op 'n feit afgekom, wat my vir baie jare nie pla nie. Die feit is dat alle universele 16S-primers geskryf word as "[FR][0-9]+" (in regex-notasie), dit wil sê hulle het 'n posisie met betrekking tot 'n verwysing. Ek het deur baie artikels gelees, waarin hierdie primers bekendgestel is, en die meeste van die tyd sê die skrywers niks anders as "E. coli 16S". In elk geval, in een geval het ek gevind dat dit in werklikheid die verwysing K12 E. coli is. Maar die probleem is dat dit 7 afsonderlike rRNA-operone het: rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnF, rrnG. Het jy 'n verwysing wat 'n spesifieke operon wys wat vir die 16S-posisienotasie gebruik word?

Wysig

Figuur 2. Hiperveranderlike streke binne die 16S rRNA geen in Pseudomonas. Die geplot lyn weerspieël fluktuasies in veranderlikheid tussen belynde 16S rRNA geenvolgordes van 79 Pseudomonas tipe stamme ... (Bodilis et al., 2012)


Soos jy korrek uitwys, is die ontwerp van 'n optimale primer-paar vir 16S-rRNA-volgordebepaling 'n moeilike saak omdat selfs die minder veranderlike streke nie dieselfde is tussen verskillende stamme en spesies nie. Sambo et al (2018) het selfs 'n bioinformatika-sagteware ontwikkel vir optimale ontwerp van primers vir 16S-rRNA-volgordebepaling vir veelvuldige bakterieë.

Ons stel hier 'n berekeningsmetode voor om die keuse van primer-stelle te optimaliseer, gebaseer op multi-objektiewe optimering, wat gelyktydig: 1) die doeltreffendheid en spesifisiteit van teikenversterking maksimeer; 2) maksimeer die aantal verskillende bakteriese 16S-volgorde wat deur ten minste een primer ooreenstem; 3) minimaliseer die verskille in die aantal primers wat by elke bakteriese 16S-volgorde pas. Ons algoritme kan op enige verlangde amplikonlengte toegepas word sonder om rekenaarprestasie te beïnvloed.

Daar is diversiteit in die 16S-rRNA-gene binne dieselfde spesie, dit wil sê die verskillende kopieë is nie presiese duplikate nie (Větrovský & Baldrian, 2013).

Větrovský & Baldrian (2013)

Interessant genoeg is die verskillende rRNA-operone in E coli het verskillende promotors en word selfs differensieel uitgedruk tydens strestoestande (Kurylo et al., 2018).

Kitahara et al. (2012) het bevind dat 16S-rRNA-gene uit grondmonsters geïsoleer is, in die plek van die oorspronklike E coli geen, kan sy groei ondersteun. Met ander woorde E coli is hoogs robuust teen mutasies in sy 16S-rRNA.

Na teenseleksie is ~200 klone van KT103-afgeleides (wat pRB103 dra waarvan die 16S rRNA-geen vervang is met vreemde gene) verkry, waaruit 33 nie-oortollige 16S rRNA-gene (A01-H03) geïdentifiseer is. Deur veelvuldige belyning van E. coli 16S rRNA en ons metagenomies herwin 16S rRNA volgordes, is gevind dat ten minste 628 (40.7%) van die 1 542 nukleotiede veranderlik was, wat dui op merkbare mutasie robuustheid van die 16S rRNA. Opvallend is dat die funksionele 16S rRNA-volgordes (behalwe A10 en F02, wat 99.0% identies was aan E. coli 16S rRNA) wat in hierdie studie verkry is, slegs 80.9-89.3% identiteit met E. coli 16S rRNA getoon het, wat heelwat laer was as die waarde wat gerapporteer is. tot dusver (Proteus vulgaris 16S rRNA, 94% identiteit met E. coli 16S rRNA)


Vir jou vraag

Maar die probleem is dat dit 7 afsonderlike rRNA-operone het: rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnF, rrnG. Het jy 'n verwysing wat 'n spesifieke operon wys wat vir die 16S-posisienotasie gebruik word?

Ek dink nie een van hulle word as die verwysing beskou nie. Die volledige E coli 16S-rRNA-volgorde wat in NCBI gerapporteer word, blyk 'n "konsensus" van verskillende gerapporteerde reekse te oorweeg:

[5], [7] bevat opgedateerde volgordedata vir die oorspronklike werk deur dieselfde laboratorium [4]. Daar was te veel verskille tussen [4] en [5], [7] om elke hersiening in ons webwerwe-tabel te lys. Die volgorde wat gewys word is van [7]. [4], [5], [7] wys op 'n aantal sitron heterogeniteite. Daar is egter onsekerheid met betrekking tot die toekenning van hierdie verskillende heterogeniteite aan spesifieke sitrone. Die RNA-metode wat deur [4], [5], [7] gebruik word, gee die gemiddelde van al die siste in die sel [7]. Die heterogeniteite word volgens hul relatiewe proporsies in hoof-, minderjarige en onbepaalde spesies geklassifiseer. Die volgorde wat gewys word, stem ooreen met die hoofspesies. Die heterogeniteite is as variasies in die terreintabel geannoteer. Dit is nie bekend watter van die residue 'c' (basis 633) of 'a' (basis 641) 'n skrapping ondergaan, wat aanleiding gee tot die minderjarige komponent 'atctg'. [7] dui op die bestaan ​​van een of twee gemuteerde sistrone onder die bekende sewe sistrone van ribosomale RNA. Met die uitsondering van 'n enkele basis delesie, is hierdie volgorde identies aan die huidige 16S rDNA volgorde vir die E.coli rRNB geen.

Die NCBI-bladsy lys ook verskillende polimorfismes en basismodifikasies in die 16S-rRNA binne en tussen verskillende stamme/"spesies".

NCBI het ook verskeie gedeeltelike rye. Toe ek nagegaan het vir P.aeruginosa en B.subtilis, Ek kon slegs een of twee volledige reekse vind (res was gedeeltelik). Verder het elke inskrywing die stam aangedui waaruit dit verkry is. Daarom neem ek aan dat daar geen enkele verwysingsvolgorde is nie.

Ek dink dat mense wel die verskillende variante oorweeg terwyl hulle filogenetiese analise doen (of bloot net na bewaarde "handtekening"-reekse vir 'n gegewe spesie soek). Ek is seker dat daar berekeningsalgoritmes is om die klassifikasie op 'n optimale manier te doen (sien Chatellier et al., 2014). Aangesien ek nie 'n kundigheid op hierdie gebied het nie, kan ek niks afdoende oor die roetine-praktyk sê nie. Trouens, daar is nog voortdurende navorsing om die analise te verbeter (byvoorbeeld Yang et al., 2016 en Sambo et al., 2018).


  • Hierdie metode is effektief om algemene groepverskille van patogene te identifiseer.
  • 16S rRNA-geenvolgordes bevat hiperveranderlike streke wat spesiespesifieke handtekeningreekse kan verskaf wat nuttig is vir bakteriese identifikasie.
  • Hierdie metode kan ook verfyn word om patogene op spesievlak te identifiseer.
  • ribosome: Groot en komplekse molekulêre masjien, gevind in alle lewende selle, wat dien as die primêre plek van biologiese proteïensintese.

Sestien S ribosomale RNA (of 16S rRNA) is 'n komponent van die 30S klein subeenheid van prokariotiese ribosome. Dit is ongeveer 1,5 kb (of 1500 nukleotiede) lank. Die gene wat daarvoor kodeer word na verwys as 16S rDNA, en word gebruik om filogenieë te rekonstrueer. Veelvuldige volgordes van 16S rRNA kan binne 'n enkele bakterie bestaan.

Figuur: Ribosomale RNA: Struktuur en vorm van die E.coli 70S ribosoom. Die groot 50S ribosomale subeenheid (rooi) en klein 30S ribosomale subeenheid (blou) word getoon met 'n 200 Ångstrom (20 nm) skaalbalk. Vir die 50S-subeenheid word die 23S (donkerrooi) en 5S (oranjerooi) rRNA's en die ribosomale proteïene (pienk) getoon. Vir die 30S subeenheid word die 16S rRNA (donkerblou) en die ribosomale proteïene (ligblou) getoon.

Die 16SrRNA-geen word vir filogenetiese studies gebruik, aangesien dit hoogs bewaar is tussen verskillende spesies bakterieë en archaea. Carl Woese het baanbrekerswerk gedoen met hierdie gebruik van 16S rRNA. Daarbenewens word mitochondriale en chloroplastiese rRNA ook geamplifiseer. Ongelukkig, terwyl primers gedefinieer kan word om hierdie geen uit enkele genome te versterk, is hierdie metode nie akkuraat genoeg om die diversiteit van mikrobiese gemeenskappe vanuit hul omgewings te skat nie. Vernaamste limiete is die gebrek aan werklike universele primers DNA-amplifikasie-vooroordele en verwysingsdatabasisseleksie het 'n impak op die annotasie van lees.

Paradoksaal genoeg is metodologiese ontkenning nou 'n reël in gepubliseerde artikels wat 16S rRNA geen amplikon opnames gebruik om onbekende mikrobiese gemeenskappe te bestudeer. In hierdie artikels word een paar primers (alhoewel baie van hulle ontwerp is, en verskillende resultate verskaf) gebruik om 'n streek van die 16S rRNA geen te versterk. Benewens hoogs bewaarde primer-bindingsplekke, bevat 16S rRNA-geenvolgordes hiperveranderlike streke wat spesie-spesifieke handtekeningvolgorde kan verskaf wat nuttig is vir bakteriële identifikasie. As gevolg hiervan het 16S rRNA geenvolgordebepaling algemeen geword in mediese mikrobiologie as 'n vinnige en goedkoop (terwyl onakkurate) alternatief vir fenotipiese metodes van bakteriële identifikasie. Alhoewel dit oorspronklik gebruik is om bakterieë te identifiseer, is daar daarna gevind dat 16S-volgordebepaling in staat is om bakterieë in heeltemal nuwe spesies, of selfs genera, te herklassifiseer. Dit is ook gebruik om nuwe spesies te beskryf wat nog nooit suksesvol gekweek is nie.


Wat is 16S rRNA

16S rRNA is 'n tipe rRNA wat verantwoordelik is vir die vorm van die klein subeenheid van die prokariotiese ribosoom. Dit is betekenisvol dat die grootte van die 16S rRNA 1542 nt is. Oor die algemeen het dit 'n strukturele rol soortgelyk aan die rRNA in die groot subeenheid om ribosomale proteïene in gedefinieerde posisies te steier. Boonop vergemaklik dit die binding van die klein subeenheid aan die groot subeenheid deur interaksie met die 23S rRNA in die groot subeenheid.

Figuur 1: 16S rRNA-struktuur

Verder bestaan ​​die driedimensionele struktuur van die 16S rRNA uit vier domeine. Die 3′ einde van die 16S rRNA bevat ook 'n ti-Shine-Dalgarno-volgorde, wat kan bind aan die Shine-Dalgarno-volgorde van die mRNA om deur die ribosoom vertaal te word. Oor die algemeen, op die mRNA, vind hierdie volgorde plaas rondom die agt basisse stroomop van die beginkodon, AUG. Aan die ander kant is 16S rRNA verantwoordelik vir die stabilisering van die paring van kodon en antikodon in die A-plek van die ribosoom.


Nuwe ribosomale RNA BLAST databasisse beskikbaar op die web BLAST diens en vir aflaai

Ons het 'n saamgestelde stel ribosomale RNA (rRNA) verwysingsvolgorde (Targeted Loci) met verifieerbare organismebronne en huidige name. Hierdie stel is van kritieke belang vir die korrekte identifisering en klassifikasie van prokariotiese (bakterieë en archaea) en swammonsters (Tabel 1). Om maklike toegang tot hierdie reekse te bied, het ons onlangs 'n aparte bygevoeg rRNA/ITS databasisse afdeling op die nukleotied BLAST-bladsy vir hierdie geteikende volgordes wat dit gerieflik maak om bronorganismes vinnig te identifiseer (Figuur 1)

Tabel 1. NCBI saamgestel geteikende rRNA volgordes nou beskikbaar as BLAST databasisse.

Figuur 1. Die databasisseleksie-kieslys op die nukleotied-nukleotied BLAST-bladsy met die rRNA/ITS databasis-radioknoppie gekies.

Die gebruik van hierdie databasisse vir identifikasie sal jou soektogte bespoedig en jou die mees insiggewende resultate verskaf. As jy jou soektog wil uitbrei om nie-gekureerde 16S rRNA-volgordes in te sluit, verander die na die Nukleotiedversameling (nr/nt) databasis. Jy wil dalk ook die Organisme filter na jou taksonomiese groep van belang.

Jy kan ook hierdie nuwe databasisse van die BLAST db FTP-gids aflaai vir gebruik in plaaslike BLAST-soektogte.


Volgende generasie 16S rRNA-volgordebepaling

Baie plekke van die menslike liggaam word gekoloniseer deur komplekse gemeenskappe van mikrobes (die "menslike mikrobioom") in beide gesondheid en verskeie siektetoestande. Hoogs diverse, polimikrobiese monsters is dikwels moeilik, of selfs onmoontlik, om volledig te karakteriseer deur tegnieke in algemene kliniese gebruik:


Figuur 1. Voorbeelde van konvensionele 16S rRNA geenvolgordebepaling resultate van 'n bakteriese isolaat en 'n polimikrobiese monster. Vir die bakteriese isolaat (bo) produseer Sanger-volgordedata 'n skoon elektroferogram wat gebruik kan word om 'n spesie-vlak taksonomiese klassifikasie te verskaf. Vir die polimikrobiese monster (onder), genereer Sanger-volgordebepaling 'n ander elektroferogram vir elke spesie teenwoordig, wat lei tot gemengde sein wat oninterpreteerbaar is.
  • Kultuurgebaseerde identifikasie maak staat op die vermoë van organismes om in vitro te groei en te repliseer. Daarom is die opsporing van kieskeurige of stadiggroeiende organismes, of dié wat onlewensvatbaar gemaak is weens prosessering (soos in formalien-gefixeerde paraffien ingebedde weefselmonsters) of tydens berging (soos anaërobe wat aan suurstof blootgestel is) beperk. Verder kan slegs 'n beperkte aantal spesies prakties deur hierdie benadering geklassifiseer word.

Figuur 2. Hoë-aangedrewe vergroting van 'n volgende generasie opeenvolgingslopie. Elke fluoresserende vlek verteenwoordig 'n individuele DNA-molekule wat volgordebepaling ondergaan. Die kleur van die kol dui die identiteit aan van die nukleotied wat tydens die huidige volgordebepalingsiklus ondervra word. Beeld van Shendure, Porreca et al. Wetenskap (2005).

In teenstelling met konvensionele benaderings, verskaf volgende-generasie DNA-volgordebepaling (alternatiewelik genoem "NGS", "hoë-deurset-volgordebepaling", "massief parallelle volgordebepaling", of "diep volgordebepaling") onafhanklike volgordedata van miljoene individuele DNA-molekules (Figuur 2), sodat elke fragment onafhanklik geklassifiseer kan word.

Hierdie unieke vermoë brei uit op die voordele van huidige molekulêre metodes deur ons in staat te stel om die organismes wat teenwoordig is binne selfs baie komplekse polimikrobiese bakteriese gemeenskappe, direk vanaf pasiëntmonsters, te katalogiseer.

Inligting oor beskikbare toetse

Ons laboratorium bied tans hoë-getroue Illumina volgende-generasie DNA-volgordebepaling van kliniese monsters wat verskeie bakteriese DNA-sjablone bevat. Metodes word bekragtig vir die doel van kliniese molekulêre diagnose en pasiëntsorg. Navorsingsdienste is ook beskikbaar - kontak ons ​​asseblief vir bykomende inligting.

Hierdie toets is beskikbaar as reflekstoetsing vir monsters wat na verwagting polimikrobies sal wees gebaseer op 'n breë reeks bakteriële PCR.

Kontak [email protected] vir besonderhede of vrae.


Kliniese verslagdoening

Na voltooiing van die toets, word 'n verslag uitgereik wat die resultate van 16S volgende generasie opeenvolging beskryf. Om 'n voorbeeldverslag te sien, klik hier of die kleinkiekie aan die linkerkant.

Vir bykomende inligting oor hoe om 'n versoek in te dien en 'n verslag te ontvang, kontak ons ​​asseblief!


Wat is die verwysing 16S rRNA? - Biologie

Hierdie opleiding sal begin met die aanbieding van 'n 16S-pyplyn (http://lotus2.earlham.ac.uk/) in 'n Galaxy-omgewing.

Dit sal die voorafverwerking moontlik maak van die data wat gaan van rou lees na taksonomiese tabelle en filogenetiese bome.

Die 2de deel van die opleiding sal 'n oorsig gee van numeriese ekologie en neem geheel en al deel aan R.

Verwerking en statistiese analise van 16S rRNA metagenomiese eksperimente met behulp van R & Lotus pyplyn.
Die volgende analitiese stappe van rou data tot oordraagbare resultate sal op die program wees:

  • Metagenomiese eksperimentbeplanning, uitvoering en analise
  • Ontleed amplikon-volgordedata met bygewerkte gereedskap en hoe om die kwaliteit van ASV's en OTU's te verhoog, wanneer om watter tegniek te gebruik
  • Na-groepering van ASV's om intra-genomiese ASV vals-positiewe te vermy
  • Werk met lae-biomassa eksperimente, die verwydering van eksogene kontaminasie in verskeie scenario's
  • Numeriese ekologie-gefokusde ontledingswerkvloei vir beide metagenomiese en amplikonvolgorde-gebaseerde studies
  • Ontleding van alfa/beta diversiteit
  • Eenveranderlike statistieke om spesies te identifiseer wat in steekproefgroepe verryk is
  • Meerveranderlike statistieke en visualisering om groepe monsters te identifiseer
  • Assessering van mikrobiese gemeenskappe gebaseer op ekologiese beginsels en spesieverspreidings

Die opleiding is bedoel vir mense wat 'n bietjie ervaring met R het. As jy geen ondervinding met R het nie, kan jy eers ons R-inleidingsopleiding volg.

Opleiers

Falk Hildebrand

Falk Hildebrand is 'n bioinformatikus met 'n passie vir mikrobiese ekosisteme, bakteriese evolusie en die ontwikkeling van rekenaarstelsels om hierdie vakke in 'n gekombineerde perspektief aan te pak. Falk het vroeg in 2019 by Earlham Institute aangesluit, waar sy nuwe Hildebrand-groep (ook by Quadram Institute) metagenomiese instrumente sal ontwikkel om bakteriese stamme teen hoë resolusies op te spoor, om hul genomiese vermoëns te voorspel en hul assosiasies met siektes te verken.

Tydens sy vroeë loopbaan het Falk by die Universiteit van Constance (Duitsland) en die Universiteit van Sussex (VK) gewerk aan bakteriële evolusie en die opsporing van uitbrake van patogene deur veranderinge in hul genome te volg. Van 'n genoomsentriese siening na 'n metagenomiese siening van hele mikrobiese ekosisteme, het hy tydens sy PhD aan die Universiteit van Brussel (België) gewerk aan bakteriese assosiasies met komplekse siektes soos IBD, vetsug en Diabetes. Hiervoor het Falk bioinformatiese pyplyne ontwikkel om 16S-data (LotuS) sowel as die statistiese hulpmiddels te verwerk.

Falk het tydens sy postdoc by EMBL Heidelberg (Duitsland) sy navorsing oor assosiasie met die menslike mikrobioom van komplekse siektes soos diabetes en Parkinson se siekte, onder andere, voortgesit. Sy belangstellings het gou ontwikkel om stamme in die metagenomiese datastelle op te spoor, asook om genome van metagenome saam te stel. Hierdie tegnieke word meestal toegepas op die dermmikrobioom van soogdiere. Nog 'n belangstelling van hom is omgewingsmetagenomika. Hy het byvoorbeeld in 2018 bewys dat meer swamme in gronde gewoonlik gekoppel is aan meer antibiotika weerstandigheid in bakterieë, en dit is waar op 'n plaaslike maar ook wêreldwye skaal.

Ezgi Özkurt

Ezgi is in Istanbul, Turkye, gebore. Sy het Molekulêre Biologie en Genetika aan die Midde-Ooste Tegniese Universiteit, Ankara gestudeer en haar B.Sc. in 2014. Sy het haar opleiding voortgesit aan die fakulteit Biologie in dieselfde universiteit waar sy haar M.Sc. diploma in 2015.

Ezgi het haar belangstelling vir evolusionêre biologie gevolg en haar studies voortgesit by die Max Planck Instituut vir Evolusionêre Biologie in Duitsland, waar sy as PhD-student in die Environmental Genomics-groep gewerk het. Sy het haar PhD-graad in 2020 verwerf.

Ezgi werk tans as 'n PostDoc in Hildebrand-groep. Haar hoofbelangstellings is metagenomiese data-analise en vertikale oordrag van mikrobiese gemeenskappe.

Joachim Fritscher

Joachim Fritscher het Bioinformatika in sy BSc en MSc studeer. Hy het aan die einde van sy MSc begin met metagenomika en het sy tesis geskryf oor 'n k-mer-gebaseerde taksonomiese klassifiseerder vir metagenomiese leeswerk deur 'n proteïenverwysing te gebruik.

Nou probeer Joachim om die k-mer-gebaseerde benadering sowel as ander metodes te gebruik om die resolusie van taksonomiese klassifikasie en SNP-oproepe tot stamvlak te verbeter. Hy streef ook daarna om nuwe metodes op biologiese data te leer en toe te pas en om dit met C++ presteer te maak.

Stefano Romano

Stefano Romano het aan die "Sapienza" Universiteit van Rome gestudeer en sy PhD voltooi aan die Max Planck Instituut vir Mariene Mikrobiologie in Bremen, Duitsland. Voordat hy na die Quadram Institute Bioscience verhuis het, het hy by die University College Cork in Ierland en by die Universiteit van Wene, Oostenryk, gewerk.

Stefano se loopbaan volg die siening van die Chinese filosoof Lao Tzu, wat gesê het "Die lewe is 'n reeks natuurlike en spontane veranderinge". Hy was betrokke by verskeie projekte wat mariene en varswater mikroörganismes, vrylewende en simbiotiese bakterieë, basiese mikrobiologiese aspekte en biotegnologiese toepassings ondersoek. Al hierdie onderwerpe het onder sy hoofbelang geval om die meganismes te verstaan ​​wat bakterieë gebruik om met hul gasheer en sy mikrobiota in 'n veranderende omgewing te kommunikeer.

By die Quadram-instituut bestudeer Stefano Romano die rol van die mens-mikrobiota in veroudering, en fokus veral op die mikrobiota-brein-derm-as om die interaksiemeganismes wat gasheer-mikrobiota-interaksie onderlê, te verstaan ​​en om hierdie bevindinge in verbeterde terapeutiese intervensies te vertaal. Hy is ook die bestuurder van die Fecal Microbiota-oorplantingsfasiliteit in samewerking tussen die Quadram Institute Bioscience en Norfolk and Norwich University Hospital.

Ángela Del Castillo Izquierdo

Ángela Del Castillo Izquierdo is 'n MSc deur Navorsing nagraadse student binne die Hildebrand-groep as deel van die Gut Microbes and Health ISP. Sy ondersoek die mikrobiese samestelling vanuit 'n multirykperspektief oor verskillende siektes. Haar navorsingsbelangstellings sluit in mikrobiese ekologie en evolusie, bevolkingsgenetika en bakteriële patogenese.

Voordat sy by QIB aangesluit het, het sy my BSc (Hons) Biologie van die Universiteit van York in 2019 ontvang, waar sy 'n projek onderneem het om die DNA-segregasiefaktore betrokke by plasmiedsegregasie te ondersoek en 'n verhandeling uit te voer wat die meganisme bestudeer wat verantwoordelik is vir die segregasie van 'n lae kopie getal plasmied in Sulfolobus solfataricus argeon by Barillà-groep

Rebecca Ansorge

Rebecca Ansorge het aan die Universiteit van Bremen, Duitsland, gestudeer waar sy 'n BSc in Biologie gedoen het, en 'n MSc in Mikrobiologie aan die Internasionale Max Planck Navorsingskool vir Mariene Mikrobiologie. Sy het in 2019 haar PhD aan die Max Planck-instituut vir Mariene Mikrobiologie verwerf en dier-mikrobe-simbiose bestudeer, meestal met behulp van metagenomika. Sy is gefassineer deur stamdiversiteit, en die implikasies daarvan in gasheer-mikrobestelsels en -interaksies.

Rebecca is tans 'n PostDoc in die Hildebrand-groep by Quadram Institute Bioscience, wat haar navorsing oor mikrobiese stamvlakvariasie en mikrobiese pangenoomdiversiteit in die menslike dermmikrobioom verdiep. Sy stel veral daarin belang om die relevansie van hierdie fynskaalse diversiteit in gesondheid en siekte te belig

Nicola Soranzo

Nicola Soranzo werk sedert 2014 by die Earlham Institute (EI) as deel van die Data Infrastructure and Algorithms-groep. Hy bestuur 'n Galaxy-webbediener wat gebruik word om grootskaalse bioinformatika-ontledings op 'n toeganklike, reproduseerbare en deursigtige manier uit te voer. Nicola werk al baie jare saam aan die oopbron-ontwikkeling van die Galaxy-platform en van Galaxy-nutsgoed en -werkvloeie.
Hy is mede-outeur van meer as 25 eweknie-geëvalueerde joernaalvraestelle en lewer gereeld opleiding vir die Carpentries en die Galaxy Training Network.
Sedert 2018 is Nicola ook Tegniese Koördineerder vir ELIXIR-UK, die UK Node van ELIXIR ('n pan-Europese organisasie wat lewenswetenskaplike hulpbronne in 'n enkele navorsingsinfrastruktuur koördineer). Daarbenewens is Nicola een van die leiers van die Galaxy Community in ELIXIR.
Voordat hy by EI aangesluit het, het Nicola 'n meestersgraad in Rekenaarwetenskap aan die Universiteit van Udine voltooi en 'n PhD in Funksionele en Strukturele Genomika by SISSA, Triëst, en het daarna vir 5 jaar aan Stelselbiologie en Galaxy by CRS4, Italië gewerk.


Pato, M. L., en Meyenburg, K. V., Cold Spring Harbor Simp. Quant. Biol., 35, 497 (1970).

Rose, T. K., Mosteller, R. D., en Yanofsky, C., J. Moi. Biol., 51, 541 (1970).

Colli, W., Smith, I., en Oishi, M., J. Mol. Biol., 56, 117 (1971).

Rosset, R., Monier, R., en Julien, J., Bul. Soc. Chim. Biol., 46, 87 (1964).

Zimmerman, R.A., en Levinthal, L., J. Mol. Biol., 30, 349 (1967).

Bremer, H., en Yuan, D., J. Mol. Biol., 38, 163 (1968).

Mueller, K., en Bremer, H., J. Mol. Biol., 38, 329 (1968).

Anderson, Z.H., Proc. Amerikaanse Nat. Acad. Wetenskap., 32, 120 (1946).

Bremer, H., en Yuan, D., Biochim. Biofis. Acta, 169, 21 (1968).


Skrywer inligting

Affiliasies

Carl R. Woese Instituut vir Genomiese Biologie, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign, Champaign, IL, VSA

Nam-Phuong Nguyen, Tandy Warnow en Bryan White

Departement Bio-ingenieurswese, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign, Champaign, IL, VSA

Departement Rekenaarwetenskap, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign, Champaign, IL, VSA

Sentrum vir Bioinformatika en Rekenaarbiologie, Universiteit van Maryland, College Park, College Park, MD, VSA


Baie van mikrobiese taksonomie en metagenomiese ontledings is deesdae gebaseer op studies van die bakteriële 16S ribosomale RNA geen (16S). 16S rRNA is 'n komponent van die 30S klein subeenheid van die prokariotiese ribosoom, wat 'n noodsaaklike geen in alle bakterieë en archaea is. Sy ooreenstemmende geen is ongeveer 1500 basisse lank, en dit het beide hoogs bewaarde en veranderlike streke, wat dit 'n ideale taksonomiese merker maak. Gewoonlik word primers wat ontwerp is om behoue ​​streke in die 16S-geen te pas, gebruik om die volledige DNA-volgorde via PCR-amplifikasie te bepaal. Die volgorde van veranderlike streke tussen die primers verskaf voldoende taksonomiese inligting om elke geamplifiseerde DNS-fragment te pas by 'n databasis van bekende 16S-volgordes en verskaf 'n vermeende identifikasie vir die organisme wat daardie DNS-fragment in sy genoom bevat het. Die meeste, indien nie almal nie, bakterieë kan gedifferensieer word deur opeenvolging van amplikone afkomstig van een van die volgende veranderlike streke: V1-V3, V3-V4 of V3-V5.

Vir studie van metagenomika het 16S-volgordebepaling groot krag, aangesien hierdie metode outomaties slegs bakteriese DNA vir amplifikasie en volgordebepaling selekteer en dit 'n uiters doeltreffende taksonomies insiggewende klein merkervolgorde verskaf om die oorvloed van elke takson te meet. Verskeie instrumente is ontwikkel vir die bepaling van 16S-metagenoomvolgorde-klassifikasie, soos SINA ingebou in SILVA, Classifier in RDP en QIIME. Die latere QIIME vou baie pakkette toe wat gebruik kan word om veelvuldige prosesse te hanteer en het dus die dominante instrument geword.

16S rRNA-volgordebepalingsdienste by Creative Biogene

Creative Biogene bied opeenvolgingdiens vir 16S rRNA geen van jou bakteriese of swam kolonies vinnig en doeltreffend. Om die mikrobiese gemeenskap in jou monster te identifiseer, verskaf ons eenstopdiens wat DNS-ekstraksie, PCR, volgordebepaling en samestelling uitvoer om jou tyd by die bank te bespaar.

Creative Biogene verskaf ook dienste van gevorderde bio-informatiese analise, insluitend i) 16S rRNA metagenoom analise ii) Taksonomiese toewysing en lees oorvloed skatting vir alle OTU's tot op spesie vlak iii) Oorvloed skatting van bakteriese en argaeale OTU's met inagneming van afstammingspesifieke kopiegetalle van merkergene . As 'n bykomende diens sal Creative Biogene ook die hoë molekulêre gewig DNS van verskeie beginmateriaal isoleer en suiwer.

Aansoeke:
• 16S rRNA geenvolgordebepaling
• 16S rRNA metagenoom analise
• DNA-isolasie en suiwering
• Bakteriële spesie-identifikasie

Voordele:
• Hoë kwaliteit
• Vinnige en betroubare ommeswaai
• Maklik toeganklike, toegewyde kliëntediens

Verwysing
1. Hao, Y., Pei, Z., Brown, S.M. (2017) Bioinformatika in mikrobioomanalise. Metodes in Mikrobiologie. 44: 1-18.

Figuur 1 Skematiese voorstelling van 16S rRNA van Escherichia coli.
(Metodes in Mikrobiologie 2017)


Beginsels en werkvloei van 16S/18S/ITS Amplicon Sequencing

Hierdie artikel wys wat 16S/18S/ITS amplicon-volgordebepaling is en hoe dit werk. Kom ons maak gereed om te leer.

16S/18S/ITS-amplifikasievolgordebepaling gebruik die volgende/derde generasie volgordebepalingsplatform en voer hoë deursetvolgordebepaling van PCR-produkte uit spesifieke streke soos 16S rDNA/18S rDNA/ITS/ funksionele gene uit. Dit oorkom die nadeel van sommige mikroörganismes wat moeilik of onmoontlik is om te kweek, en verkry die inligting van mikrobiese gemeenskapstruktuur, evolusionêre verwantskappe en mikrobiese korrelasie met omgewing in omgewingsmonsters.

Wat is 16S rDNA /18S rDNA/ITS?

  • 16s rDNA: 16S rDNA is 'n DNS-volgorde wat kodeer vir klein subeenheid rRNA van prokariote met 'n lengte van ongeveer 1542bp. Met 'n matige molekulêre grootte en lae mutasietempo, is 16S rDNA die mees gebruikte merker in die studie van bakteriële sistematiek. Die 16S rDNA-volgorde bestaan ​​uit 9 veranderlike streke en 10 konserwatiewe streke, die gekonserveerde gebied-volgordes weerspieël die genetiese verwantskappe tussen spesies, terwyl die veranderlike gebied-reekse die verskil tussen spesies weerspieël. 16S rDNA-volgordebepaling word hoofsaaklik gebruik om die diversiteit van bakterieë of archaea te ontleed.


Fig.1 16S rDNA en amplifikasie primers

  • 18S rDNA: 18S rDNA is 'n DNA-volgorde wat kodeer vir klein subeenheid rRNA van eukariotiese ribosome. Soos 16S rDNA, bestaan ​​18S rDNA-volgorde ook uit konserwatiewe streke en veranderlike streke (V1-V9, afwesigheid van V6). Onder veranderlike streke het V4 die mees volledige databasis inligting en die beste klassifikasie effek, dit is die mees gebruikte en die beste keuse vir 18S rRNA geen analise notas. 18S rDNA-volgordebepaling weerspieël die spesieverskille tussen eukariotiese organismes in gegewe monsters.


Fig.2 18S rDNA en amplifikasie primers

  • SY: ITS (Internal Transcribed Spacer) is deel van die nie-transkripsiegebied van die swam rRNA geen. Die ITS-reekse wat vir swam-identifikasie gebruik word, sluit gewoonlik ITS1 en ITS2 in. Omdat in swamme 5.8S, 18S en 28S rRNA-gene hoogs behoue ​​bly, terwyl ITS meer mutasies in die evolusionêre proses kan verdra as gevolg van minder natuurlike seleksiedruk, en uiters wye volgorde polimorfisme in die meeste eukariote vertoon. Terselfdertyd is die konserwatiewe tipe ITS relatief konsekwent binne spesies, en die verskille tussen spesies (of ooit vlekke) is duidelik. ITS volgorde fragmente is klein (350 bp en 400 bp in lengte, onderskeidelik) en maklik om te ontleed. Hulle is wyd gebruik in filogenetiese ontleding van verskillende swamme.


Fig.3 ITS en amplifikasie primers

Wat is 16S/18S/ITS-amplikoonvolgordebepaling?

16S/18S/ITS-amplikoonvolgordebepaling gebruik Illumina- of PacBio-volgordebepaling om die PCR-produkte te lees wat met geskikte universele primers van een of verskeie streke van 16S/18S/ITS versterk word. Deur die volgordevariasie en volopheid van die teikengebied op te spoor, kon die inligting van spesieklassifikasie en volopheid, bevolkingstruktuur, filogenetiese evolusie en gemeenskapsvergelyking van omgewingsmonsters verkry word.

Hoe om 'n 16S/18S/ITS amplikon-volgordebepaling uit te voer?
Kortom, die hoofstappe van 16S/18S/ITS amplikonvolgordebepaling sluit biblioteekkonstruksie, volgordebepaling en bioinformatika-analise in.

    : Ons beveel die samesmelting primer biblioteek konstruksie metode aan, dit wil sê die primers wat met die teikenvolgorde primers saamgesmelt is en die adaptor, indeks en ander volgordes word vooraf gesintetiseer, dan word die genomiese DNA teikens direk deur PCR geamplifiseer. Amplikonbiblioteke word gesuiwer en 'n ekwimolêre poel van die amplikonbiblioteke word voorberei. Die verdunning wat benodig word vir templaatvoorbereiding word bepaal en gevolg deur volgordebepaling.
  • Volgorde: Die huidige volgordebepalingplatforms sluit hoofsaaklik Illumina Miseq/HiSeq en derdegenerasie-volgordebepalingsplatform in.
    • Illumina NGS (MiSeq/HiSeq2500/HiSeq4000): As gevolg van die beperking van leeslengte, kan die NGS-platform slegs 'n enkele veranderlike streek, dubbelveranderlike streke of drievoudige veranderlike streke as die teikenstreke vir die volgordebepaling kies. By volgordebepaling kan slegs die volledig opeenvolgende Lees (Tags) vir verdere analise gebruik word, dus moet verskillende amplifikasiestreke die ooreenstemmende volgordebepalingstrategie streng volg. Byvoorbeeld, as jy V4 vir analise gekies het, is die PE250-volgordebepaling nodig, maar vir V1-V3-streke moet die volgordebepalingstrategie PE300 wees. Slegs op hierdie manier kan die volledigheid van rye verseker word. Die oorspronklike data word uitgefiltreer om lae kwaliteit leeswerk te verwyder en hoë kwaliteit skoon data te laat vir latere ontleding.
    • PacBio SMRT-volgordebepaling: Anders as NGS, kan die derdegenerasie-volgordebepalingsplatform vollengte-volgordebepaling vir 16S/18S/ITS uitvoer, en sy volgordebelyningstempo en identifikasie-akkuraatheidkoers is hoër as dié van die NGS.

    Operasionele taksonomiese eenhede (OTU's) word dikwels gebruik om groepe naverwante individue te klassifiseer. Oor die algemeen, as die ooreenkoms van verskillende 16S rDNA/18S rDNA/ITS-reekse hoër as 97% is, kan daardie rye as 'n OTU gedefinieer word. Elke OTU stem ooreen met 'n ander 16S rDNA/18S rDNA/ITS volgorde, dit wil sê, elke OTU stem ooreen met een spesie. Deur OTU-analise kan die mikrobiese diversiteit en die oorvloed van verskillende mikroörganismes in die monster geken word.

    Op grond van OTU- en spesie-annotasieresultate word monsterspesiekompleksiteitsanalise en spesieverskilontleding uitgevoer. Spesiegebaseerde analise, LDA-effekgrootte-analise en meer analise word ook verskaf.


    Fig.4 Die werkvloei van 16S/18S/ITS amplikonvolgordebepaling

    By CD Genomics kan ons kundige span met uitgebreide ervaring jou help om mikrobiese gemeenskappe ten volle te verstaan ​​en voordeel daaruit te trek. Benewens 16S/18S/ITS Amplicon Sequencing, verskaf ons ook ander mikrobiese genomika-dienste, insluitend:

    1. Michelsen, C. F., Pedas, P., Glaring, M. A., Schjoerring, J. K., & Stougaard, P. (2014) ‘Bacterial diversity in greenlandic soils as affected by potato cropping and inorganic versus organic fertilization’, Polar Biology, 37(1), 61-71.
    2. Edwards, J., Johnson, C., Santosmedellín, C., Lurie, E., Podishetty, N. K., & Bhatnagar, S., et al. (2015) ‘Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice’, Verrigtinge van die Nasionale Akademie van Wetenskappe van die Verenigde State van Amerika, 112(8), E911.
    3. Evans, C. C., Lepard, K. J., Kwak, J. W., Stancukas, M. C., Laskowski, S., & Dougherty, J., et al. (2014) ‘Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity’, Plos One, 9(3), e92193.
    4. Shehab, N., Li, D., Amy, G. L., Logan, B. E., & Saikaly, P. E. (2013) ‘Characterization of bacterial and archaeal communities in air-cathode microbial fuel cells, open circuit and sealed-off reactors’, Appl Microbiol Biotechnol, 97(22), 9885-9895.
    5. Man, K. C., Au, C. H., Chu, K. H., Kwan, H. S., & Chong, K. W. (2010) ‘Composition and genetic diversity of picoeukaryotes in subtropical coastal waters as revealed by 454 pyrosequencing’, Isme Journal, 4(8), 1053.
    6. Lie, A. A. Y., Liu, Z., Hu, S. K., Jones, A. C., Kim, D. Y., & Countway, P. D., et al. (2014) ‘Investigating microbial eukaryotic diversity from a global census: insights from a comparison of pyrotag and full-length sequences of 18s rrna genes’, Appl Environ Microbiol, 80(14), 4363-4373.
    7. Lu, L., Yin, S., Liu, X., Zhang, W., Gu, T., & Shen, Q., et al. (2013) ‘Fungal networks in yield-invigorating and -debilitating soils induced by prolonged potato monoculture’, Grondbiologie en biochemie, 65, 186-194.
    8. Orgiazzi, A., Lumini, E., Nilsson, R. H., Girlanda, M., Vizzini, A., & Bonfante, P., et al. (2012) ‘Unravelling soil fungal communities from different mediterranean land-use backgrounds’, Plos One, 7(4), e34847.
    9. Lakshmanan, V., Ray, P., & Craven, K. D. (2017) ‘Rhizosphere sampling protocols for microbiome (16s/18s/its rrna) library preparation and enrichment for the isolation of drought tolerance-promoting microbes’, Methods Mol Biol, 1631, 349-362.

    Get cutting-edge science information from CD Genomics sent straight to your inbox every month.


    Kyk die video: 16s rRNA (Oktober 2022).